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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Präparation einer Zielstruktur innerhalb einer Probe bzw. eines Objektes.
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In der korrelativen Mikroskopie ist es ein häufiger Wunsch, eine Zielstruktur in einer dicken Probe am Lichtmikroskop auszuwählen und dieselbe Struktur in anderen Mikroskopmodalitäten wie beispielsweise elektronenmikroskopisch oder röntgenmikroskopisch weiter zu analysieren.
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Im Gegensatz zum Lichtmikroskop kann ein Elektronenmikroskop nur oberflächennahe Bereiche einer Probe erfassen. Befindet sich eine Zielstruktur, also ein Bereich einer Probe, dessen mikroskopische Analyse bei einer vorgegebenen Untersuchungsaufgabe von besonderem Interesse ist, tiefer in der Probe, muss sie vor der elektronenoptischen Untersuchung aus der Probe herauspräpariert werden. Für eine Beobachtung im Rasterelektronenmikroskop (SEM) ist es beispielsweise notwendig, dass sich die Zielstelle weniger als 100 nm unterhalb der Probenoberfläche befindet.
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Die Präparation einer Zielstruktur bis auf wenige Mikrometer genau ist äußerst anspruchsvoll. Die hauptsächliche Gefahr ist, dass die gewünschte Struktur nicht mehr auffindbar ist, nachdem ein Schnitt stattgefunden hat, weil sich die Beobachtungsbedingungen verändern oder Kräfte auf die Probe einwirken, so dass die Struktur verschoben wird. Daher ist es notwendig, dass die Beobachtungsbedingungen während des Schneidevorganges möglichst konstant bleiben, insbesondere die Position der Probe relativ zu dem Mikroskopobjektiv. Ein weiteres Problem ist die Bestimmung der z-Position, also der Position in Beobachtungsrichtung, an der die Probe geschnitten werden soll. Die Brechzahl der zu untersuchenden Probe ist initial unbekannt, so dass die genaue z-Position der Zielstruktur über die optische Weglänge nur grob abgeschätzt werden kann. In der Praxis muss man sich daher mit vielen dünnen Schnitten langsam an die Zielstelle annähern.
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In der
US 2009/0091566 A1 wird ein Lichtmikroskop mit angebauter Schneidevorrichtung beschrieben, um große Probenvolumina dreidimensional abzubilden. Zur großflächigen xy-Abbildung wird der Mikroskoptisch verfahren und ein Kachelbild aufgenommen. Unterschiedliche z-Ebenen werden durch die angebaute Schneidevorrichtung abgetragen. Hierzu wird die Probe mittels Tischbewegung in die Schneidevorrichtung gefahren und abgetragen. Anschließend wird die abgetragene Probe unter das Mikroskopobjektiv bewegt und kann weiter mikroskopiert werden. In der
DE 10 2009 022 912 A1 wird weiterhin ein integriertes System aus einem so genannten single plane illumination Mikroskop (SPI-Mikroskop) und einer Probenschneidvorrichtung beschrieben. Hier wird die genaue z-Lage der Zielstruktur dadurch bestimmt, dass die zu untersuchende Probe nur in einer Ebene beleuchtet wird, so dass nur in dieser Ebene Fluoreszenz angeregt wird. Nachteilig ist dabei die Beschränkung auf die relativ aufwendigen und teuren SPI-Mikroskope.
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Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Präparation einer zu untersuchenden Zielstruktur in einer Probe bereitzustellen, das die Nachteile des Standes der Technik überwindet.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren zur Präparation einer zu untersuchenden Zielstruktur bzw. Zielstelle in einer Probe dadurch gelöst, dass gezielt in nur wenigen Schritten die Zielstruktur mit hoher Genauigkeit präpariert wird, indem nach der Abbildung der Zielstruktur im Fokus einer eine z-Achse aufweisenden Mikroskopoptik ein erster Anschnitt der Probe quer zu der z-Achse in einem Probenbereich oberhalb oder unterhalb der Zielstruktur zur Erzeugung einer ersten Referenzfläche (F1) durchgeführt wird und nach der Abbildung der ersten Referenzfläche (F1) im Fokus der Mikroskopoptik durch Umfokussieren von der Zielstruktur auf diese erste Referenzfläche die dafür notwendige Relativbewegung zwischen Probe und Mikroskopoptik als erste optische Weglänge (z1) zwischen der Zielstruktur und der ersten Referenzfläche ermittelt wird, anschließend eine zweite Referenzfläche (F2) parallel zur der ersten Referenzfläche durch Schneiden der Probe quer zu der z-Achse im Probenbereich zwischen der Zielstruktur und der ersten Referenzfläche erzeugt und eine mechanische Weglänge (d12) zwischen der ersten Referenzfläche und der zweiten Referenzfläche ermittelt wird, anschließend die zweite Referenzfläche (F2) im Fokus der Mikroskopoptik durch Umfokussieren von der ersten Referenzfläche (F1) auf die zweite Referenzfläche (F2) abgebildet und die notwendige Relativbewegung zwischen der ersten Referenzfläche (F1) und der zweiten Referenzfläche (F2) als weitere optische Weglänge (z12) ermittelt wird, anschließend eine mittlere Brechzahl (n) der Probe ermittelt wird, die das Verhältnis der weiteren optischen Weglänge (z12) zu der mechanischen Weglänge (d12) angibt gemäß der Gleichung n = d12/z12, anschließend der ungefähre mechanische Abstand (dz2) der Zielstelle von der zweiten Referenzfläche (F2) durch Multiplikation des Differenzwertes aus optischer Weglänge (z1) und weiterer optischer Weglänge (z12) mit der ermittelten mittleren Brechzahl (n) gemäß der Gleichung dz2 = n·(z1 – z12) und anschließend die Zielstruktur durch Schneiden der Probe in einem ungefähren Abstand (dz3) von der Zielstruktur präpariert wird, wobei der ungefähre Abstand (dz3) sich ergibt aus dem ungefähren mechanischen Abstand (dz2) der Zielstruktur von der zweiten Referenzfläche (F2) abzüglich eines Sicherheitswertes, dessen Größe davon abhängt, wie genau die Zielstelle für die jeweilige Untersuchungsaufgabe präpariert werden muss.
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Die z-Achse der Mikroskopoptik gibt die Richtung an, aus der die Probe mit der Mikroskopoptik abgebildet wird und entspricht im Allgemeinen der optischen Achse der Mikroskopoptik.
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Vorteilhaft ist vorgesehen, dass noch weitere Referenzflächen (F3, F4, ... Fn) durch Schneiden der Probe quer zu der z-Achse erzeugt und weitere optische Weglängen (z13, z14, ... z1n) sowie weitere mittlere Brechzahlen (n1, n2, ... nX) ermittelt werden, um den ungefähren mechanischen Abstand (dzn) der Zielstelle von der zuletzt erzeugten Referenzfläche (F3, F4, ... Fn) gemäß der Gleichung dzn = ñ·(z1 – (z12 + z13 + ... z1n)), wobei ñ eine Teilbrechzahl (ñ) der Probe ist und durch Bildung des Mittelwertes aus den jeweils ermittelten mittleren Brechzahlen gemäß der Gleichung ñ = (n + n1 + ... nX)/X erhalten wird. Dadurch, dass die Teilbrechzahl (ñ) aus mehreren mittleren Brechzahlen der Probe zusammengesetzt ist, entspricht die Teilbrechzahl genauer der Gesamtbrechzahl der Probe und ermöglicht deswegen eine genauere Berechnung des ungefähren Abstandes der zuletzt erzeugten Referenzfläche zu der Zielstruktur.
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Bevorzugt ist vorgesehen, dass die erzeugten Referenzflächen zur besseren Sichtbarmachung angefärbt werden. Aufgrund des dadurch verbesserten Kontrastes wird dadurch insbesondere eine automatische Fokussierung auf die Referenzflächen erleichtert.
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Vorteilhaft ist weiterhin vorgesehen, dass die Anfärbung der Referenzflächen simultan erfolgt, während die Referenzflächen durch Schneiden erzeugt werden. Schneiden und Färben erfolgen somit in einem Schritt, wodurch sich eine Zeitersparnis ergibt.
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In einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens ist vorgesehen, dass die Abbildung der Zielstruktur und/oder der Referenzflächen durch Fluoreszenzanregung erfolgt. Dadurch, dass somit bevorzugt der gesamte Präparationsvorgang mittels Fluoreszenzkontrast verfolgt werden kann, erhält ein Anwender die Möglichkeit, nach einem ersten Schnitt das Ergebnis zu prüfen und bei Bedarf mit weiteren Schritten die Zielstelle noch genauer in die Nähe der Probenoberfläche zu bringen.
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Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht auch darin, dass mit nur wenigen Schnitten die Zielstruktur im Probenvolumen erreicht wird, so dass Beschädigungen der Zielstruktur vermieden werden.
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Die Aufgabe wird weiter gelöst mit einer Vorrichtung zur Präparation einer zu untersuchenden Zielstruktur. Diese umfasst eine eine z-Achse aufweisende Mikroskopoptik zur optischen Abbildung der Zielstruktur im Volumen der Probe, eine Schneideinrichtung zum Schneiden der Probe quer zu der z-Achse, eine Bewegungseinheit, um eine Relativbewegung zwischen Probe und Mikroskopoptik parallel zu der z-Achse und um eine Relativbewegung zwischen Probe und Schneideinrichtung parallel zu der z-Achse durchzuführen, und eine mit der Bewegungseinrichtung verbundene Auswerteeinrichtung, wobei die Bewegungseinrichtung die Wegstrecken der Relativbewegungen als optische und mechanische Weglängen erfasst und an die Auswerteeinrichtung übergibt, und die Auswerteeinrichtung erfindungsgemäß eingerichtet ist, um aus den erfassten Weglängen eine mittlere Brechzahl der Probe sowie den ungefähren mechanischen Abstand der Zielstruktur von einer Referenzfläche der Probe zu ermitteln.
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Bevorzugt sind die Schneideinrichtung und die Mikroskopoptik fest zueinander justiert verbunden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Schneideinrichtung mit einem strukturierten Schneidmesser versehen. Bei der Strukturierung kann es sich beispielsweise um eine Riffelung handeln. Wird die Probe mit einem solchen strukturierten Schneidmesser geschnitten, erfährt eine damit erzeugte Schnittfläche der Probe, insbesondere auch eine Referenzfläche, eine ebensolche Strukturierung. Dies erleichtert die Fokussierung der Mikroskopoptik auf die Schnittfläche.
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Vorzugsweise kann das Schneidmesser der Schneideinrichtung mit Farbstoff bedeckt sein, der beim Schneiden der auf die Schnittfläche übertragbar ist.
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Dies ist besonders vorteilhaft für eine automatische Fokussierung. Bevorzugt kann dazu vorgesehen sein, dass das Schneidelement dazu nach jedem Schneidvorgang wieder zu einem Farbstoff-Reservoir bewegt wird, um für den nächsten Schnitt einsatzbereit zu sein.
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Die Bewegungseinheit kann insbesondere durch einen verfahrbaren Mikroskoptisch gebildet sein. Alternativ oder auch zusätzlich kann die Bewegungseinheit der Schneideinrichtung angegliedert sein. Alternativ oder auch zusätzlich kann die Bewegungseinheit auch der Mikroskopoptik angegliedert sein.
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Falls die Bewegungseinheit der Schneideinrichtung angegliedert ist, kann die Probe durch eine Bewegung der Schneide oder der Schneideinrichtung geschnitten werden. Bei dieser Art des Schneidens ist es möglich, Verschiebungen der Zielstruktur während des Schneidens zu detektieren. Das ist beispielsweise für eine automatische Nachführung der Probe vorteilhaft, um die Zielstruktur beispielsweise bei schneidbedingten Verschiebungen quer zur z-Achse immer im Blickfeld der Mikroskopoptik zu halten, so dass das Schneiden unter ununterbrochener Beobachtung durchgeführt werden kann.
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Alternativ kann die Schneideinrichtung fest anordnet sein und eine in Ihrer Lage zur der Mikroskopoptik justierte Schneide aufweisen.
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Die Schneideinrichtung kann so eingestellt sein, dass Schnitte entweder parallel zur optischen Achse mittels einer z-Bewegung der Bewegungseinheit oder senkrecht zur optischen Achse mittels einer xy-Bewegung der Bewegungseinheit erfolgen.
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Alternativ kann die Schneideinrichtung auch einen abtragenden oder schneidenden Laser umfassen. Bei Verwendung eines Lasers würde die Arbeitswellenlänge des Lasers bevorzugt aus dem Strahlengang der Mikroskopoptik herausgefiltert.
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Alternativ ist es außerdem denkbar, dass die Schneideinrichtung durch eine Ätzeinrichtung verwirklicht ist, die den Probenabtrag durch einen chemischen Ätzvorgang ermöglicht.
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Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Mikroskopoptik in ein invers aufgebautes Mikroskop integriert ist. Auf diese Weise kann das Schneiden der Probe „jenseits” der Zielstelle, also nicht wie im Allgemeinen im Falle eines aufrechten Mikroskopaufbaus zwischen Zielstruktur und Mikroskopoptik, sondern zwischen Zielstelle und der der Mikroskopoptik abgewandten Oberfläche der Probe, erfolgen. Vorteilhaft wird so die kontinuierliche Beobachtung der Schneidvorgänge ermöglicht. Ein weiterer Vorteil eines solchen Aufbaus besteht darin, dass die Beobachtungsbedingungen für die Zielstruktur weitgehend unverändert bleiben, weil zwischen Mikroskopoptik und Zielstruktur kein Probenabtrag erfolgt.
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Vorzugsweise kann die Mikroskopoptik in ein Konfokalmikroskop, insbesondere ein Laser-Scanning-Mikroskop integriert sein. Damit wird vorteilhaft die Abbildung von Zielstrukturen auch in größeren Probentiefen ermöglicht. Insbesondere in der sogenannten korrelativen Mikroskopie kann, wenn eine Zielstruktur in einer voluminösen Probe, beispielsweise einem Harzblöckchen, tiefer sitzt und diese Zielstruktur an einem optischen Mikroskop ausgewählt wird, um sie in einem anderen Mikroskopiesystem weiter zu analysieren, diese Zielstruktur gezielt mit wenigen Schnitten mit hoher Genauigkeit unter mikroskopischer Beobachtung herauspräpariert werden, um die Bilddaten des weiteren Mikroskopiesystems mit den Bilddaten des optischen Mikroskops zu korrelieren.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines in Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispieles näher erläutert.
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Es zeigen:
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1 einen schematischen Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der z-Position für die Präparation einer Probe;
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2 eine perspektivische Darstellung einiger Elemente eines inversen Mikroskops mit Schneidvorrichtung zum Schneiden senkrecht zur optischen Achse;
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3 eine perspektivische Darstellung einiger Elemente eines Auflichtmikroskops mit Schneidvorrichtung zum Schneiden senkrecht zur optischen Achse.
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Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Präparation einer zu untersuchenden Zielstruktur in einer Probe wird in 1 beschrieben. Zur genauen Präparation der Zielstruktur 2 der zu untersuchenden Probe 1 wird die Zielstruktur 2 im Volumen der Probe 1 zunächst im Fokus einer Mikroskopoptik unter Fluoreszenzanregung abgebildet. Anschließend wird die Probe quer zur z-Achse der Mikroskopoptik oberhalb der Zielstruktur 2 angeschnitten. Dadurch wird eine erste Referenzfläche F1 erzeugt. Diese Referenzfläche F1 wird nachfolgend im Fokus der Mikroskopoptik durch Umfokussieren von der Zielstruktur 2 auf die erste Referenzfläche F1 abgebildet. Dabei wird die dazu notwendige Relativbewegung zwischen Probe 1 und Mikroskopoptik in z-Richtung als optische Weglänge z1 erfasst. Anschließend erfolgt ein zweiter Schnitt in einem Abstand d12 vom ersten Schnitt quer zu der z-Achse der Mikroskopoptik im Probenbereich zwischen der Zielstruktur 2 und der ersten Referenzfläche F1. Die z-Position wird so gewählt, dass immer noch ein sicherer Abstand zur Zielstruktur 2 bestehen bleibt. Dadurch wird eine zweite Referenzfläche F2 parallel zur ersten Referenzfläche F1 erzeugt. Diese zweite Referenzfläche F2 wird nachfolgend im Fokus der Mikroskopoptik 3 abgebildet. Die dafür notwendige relative z-Bewegung zwischen der ersten Referenzfläche F1 und der zweiten Referenzfläche F2 wird als weitere optische Weglänge z12 ermittelt. In einem weiteren Verfahrensschritt wird über das Verhältnis von optischen zu mechanischen Weglängen eine Abschätzung einer mittleren Brechzahl n der Probe 1 mit n = d12/z12 vorgenommen. Mittels der abgeschätzten mittleren Brechzahl n wird der ungefähre mechanische Abstand (dz2) der Zielstruktur (2) von der zweiten Referenzfläche (F2) gemäß der Gleichung dz2 = n·(z1 – z12) berechnet. In einem abschließenden Verfahrensschritt wird ein weiterer Schnitt in einem ungefähren Abstand dz3 von der Zielstruktur 2 zur Präparation der Zielstruktur 2 durchgeführt., wobei der ungefähre Abstand dz3 sich ergibt aus dem ungefähren mechanischen Abstand dz2 der Zielstruktur 2 von der zweiten Referenzfläche F2 abzüglich eines Sicherheitswertes, dessen Größe davon abhängt, wie genau die Zielstelle für die jeweilige Untersuchungsaufgabe präpariert werden muss.
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In 2 ist das Schneiden der Probe senkrecht zur optischen Achse mittels eines inversen Mikroskops dargestellt und in 3 das Schneiden der Probe 1 senkrecht zur optischen Achse eines Auflichtmikroskops, wobei die in Einzelheiten jeweils nicht näher dargestellten Mikroskope konfokale Systeme in Form von Laserscanningmikroskopen sind. Die Probe 1 wird mittels einer Lichtquelle des Mikroskops beleuchtet und mittels der Mikroskopoptik 3 abgebildet. Die optische Achse der Abbildung ist dabei, wie auch aus 1 ersichtlich, als z-Achse bezeichnet und die durchzuführenden Schnitte erfolgen durch eine Probenbewegung entlang der xy-Achse, d. h. senkrecht zur Beobachtungsachse. Die Probe 1 wird dazu so vorbereitet, dass die Zielstruktur 2 unter geeigneter Anregung fluoresziert und damit beobachtbar und auswählbar ist. Die relative Lage einer nicht näher in Einzelheiten dargestellten Schneideinrichtung mit dem messerförmig ausgebildeten Schneidelement 5 ist zu der Zielstruktur 2 derart positionierbar, dass die vorzunehmenden Schnitte gezielt einige Mikrometer von der ausgewählten Zielstruktur 2 der zu untersuchenden Probe 1 entfernt platzierbar sind, wobei der Schneidvorgang durch eine relative Bewegung zwischen Schneidelement 5 und Probe 1 erfolgt. In dem Beispiel der 2 bewegt die Bewegungseinrichtung 4 die Probe 1 gegen das feststehende Schneidelement 5 der Schneideinrichtung. Das Schneiden der Probe 1 erfolgt also durch Bewegung der Bewegungseinrichtung 4, die in dem Beispiel der 2 als Mikroskoptisch, auf dem die Probe fixiert vorliegt, dargestellt ist, relativ zu der fest angebrachten und zu der Mikroskopoptik 3 justierten Schneide 5 der Schneideinrichtung. Die Bewegungseinrichtung 4 kann Verfahrwege, insbesondere in z-Richtung, und hierbei insbesondere optische Weglängen und mechanische Weglängen, erfassen und ist mit einer Auswerteeinrichtung 6 verbunden. Die Auswerteeinrichtung 6 kann aus den von der Bewegungseinrichtung 4 erfassten Weglängen eine mittlere Brechzahl der Probe 1 sowie den ungefähren mechanischen Abstand der Zielstruktur 2 von einer Referenzfläche (F1, F2, ... Fn) der Probe berechnen. Außerdem kann die Auswerteeinrichtung die Bewegungseinrichtung so ansteuern, dass diese die Probe so relativ zu dem Schneidelement 5 platziert, dass zur Präparation der Zielstelle mittels des Schneidelements 5 ein Schnitt in einem ungefähren Abstand dz3 von der Zielstruktur 2 durchgeführt werden kann. Die Schneideinrichtung 5 ist mit dem Konfokalmikroskop justierbar mechanisch verbunden. Das messerförmig ausgebildete Schneidelement 5 weist Strukturierungen auf, zur Erleichterung der Fokussierung des Mikroskopobjektivs 3 auf die Schnittflächen, insbesondere bei einer automatischen Fokussierung. Die Schnitt- und/oder Probenoberflächen der zu untersuchenden Probe 1 sind ebenfalls mit Farbstoff eingefärbt, der beim Schneiden der Probe 1 auf die Probenoberfläche übertragen wird, so dass sowohl die Zielstruktur 2 in der Tiefe im Fluoreszenzkontrast sichtbar und verfolgbar ist als auch eine Messung des Abstandes zwischen momentaner Probenoberfläche 1 und Zielstruktur 2 im Fluoreszenzkontrast ermöglicht wird. Über eine Abstandsmessung im Lichtmikroskop zwischen momentaner Probenoberfläche 1 und der Zielstruktur 2 wird die korrekte Position des Schneidelementes 5 zur Probe 1 bestimmt und eingestellt. Für die Einfärbung von Schnitt-/und Probenoberflächen wird das Schneidelement 5 nach jedem Schneiden zu einem Farbstoffreservoir bewegt.
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In dem Ausführungsbeispiel entsprechend den 2 und 3 erfolgt das Schneiden der zu untersuchenden Probe 1 senkrecht zur optischen Achse mittels einer x, y-Bewegung des Mikroskoptisches 4 und/oder der Bewegungseinrichtung, wobei vom Mikroskopobjektiv 3 aus gesehen jenseits der Zielstruktur 2 geschnitten wird. Dies ist vorteilhaft, da sich dann nicht die Beobachtungsbedingung (optische Weglänge) verändert und die Zielstruktur 2 beim Schneiden nicht durch das Schneidelement 5 abgeschattet wird. Vorteilhaft ist hierbei entsprechend 2 die Verwendung eines inversen Mikroskops.
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Die Erfindung beschränkt sich nicht auf die Ausführungsbeispiele, sondern ist in den angewandten Verfahren und den Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens variabel. Sie umfasst insbesondere auch Varianten, die durch Kombination von in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung beschriebenen Merkmale bzw. Elementen gebildet werden können. Alle in der vorstehenden Beschreibung erwähnten sowie aus den Zeichnungen entnehmbaren Merkmale sind weitere Bestandteile der Erfindung, auch wenn sie nicht besonders hervorgehoben und in den Ansprüchen erwähnt sind.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Probe
- 2
- Zielstruktur
- 3
- Mikroskopoptik
- 4
- Bewegungseinrichtung
- 5
- Schneidelement
- 6
- Auswerteeinrichtung
- F1
- erste Referenzfläche
- F2
- zweite Referenzfläche
- F3
- dritte Referenzfläche
- z1
- optische Weglänge
- z12
- weitere optische Weglänge
- d12
- mechanische Weglänge entsprechend dem Abstand zwischen der ersten und der zweiten Referenzfläche
- dz2
- ungefährer mechanischer Abstand der Zielstruktur von der zweiten Referenzfläche
- dz3
- Sicherheitsabstand von der Zielstruktur
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 2009/0091566 A1 [0005]
- DE 102009022912 A1 [0005]
