Verfahren zur Kalibrierung einer Laserablenkeinrichtung eines
Lasermikrodissektionssystems und Lasermikrodissektionssystem
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kalibrierung einer
Laserablenkeinrichtung eines Lasermikrodissektionssystems und ein
Lasermikrodissektionssystem gemäß den Oberbegriffen der unabhängigen
Patentansprüche.
Stand der Technik
Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre (siehe z.B. Isenberg, G. et al.: Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method. Journal of Microscopy, Band 107, 1976, Seiten 19-24) und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt.
Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einem Objekt („Probe",„Präparat") isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt des Objekts mit dem Laserstrahl, durch den dieses kaum verändert wird. Die spezifische Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen (siehe z.B. Bancroft, J.D. und Gamble, M.: Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier Science, 2008, Seite 575, Kapitel„Laser Microdissection").
Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einem Objekt mittels eines Infrarotoder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus dem Objekt auch zusammen mit einer anhaftenden Membran
ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten Laser Capture Microdissection wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich des Objekts und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben katapultierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
Die vorliegende Erfindung kommt hierbei insbesondere bei den Verfahren zum Einsatz, bei denen ein Dissektat aus einem Objekt herausgetrennt und in einem darunter angeordneten Dissektatauffangbehälter aufgefangen wird. Insbesondere ist die
Erfindung für kontaktfreie Auffangsysteme für Dissektate geeignet.
Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion, wie sie beispielsweise aus der WO 98/14816 A1 bekannt sind, weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren
Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf das Objekt fokussiert, das auf einem motorischautomatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie wird dadurch erzeugt, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um das Objekt relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter anderem den Nachteil, dass das Objekt während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da dieses sich im Gesichtsfeld bewegt und dessen Bild ggf. verschwommen erscheint.
Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw.
Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt über ein feststehendes Objekt zu lenken. Derartige
Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders
vorteilhaftes Lasermikrodissektionssystem, das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im Laserstrahlengang aufweist, ist
beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 beschrieben.
In beiden Fällen, also sowohl in Lasermikrodissektionssystemen, in denen der
Mikroskoptisch verfahren wird, als auch in Lasermikrodissektionssystemen, die eine Laserablenkeinrichtung aufweisen, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in dem Objekt erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreihung derartiger Löcher bzw.
Vertiefungen, gegebenenfalls mit Überlappung.
Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen verwendet werden, die anschließend beispielsweise
unterschiedlichen diagnostischen Analyseverfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifisch Tumorzellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und auf spezifische Metaboliten oder Proteine zu untersuchen. Hierbei muss sichergestellt
sein, dass kein oder möglichst wenig Material aus unerwünschten und ggf. störenden Bereichen des untersuchten Objekts in ein Untersuchungsgefäß gelangt und damit eine entsprechende Analyse stört. Dies gilt auch für Lasermikrodissektionssysteme, die für molekularbiologische Untersuchungen verwendet werden, beispielsweise für bekannte COMET-Assays.
Entscheidend für erfolgreiche und kontaminationsfreie
Lasermikrodissektionsexperimente ist daher die Genauigkeit des verwendeten Lasers. Je genauer der Laser beispielsweise anhand vorgegebener Schnittlinien schneiden oder punktgenau über einen interessierenden Bereich geführt werden kann, desto sauberer kann entsprechendes Material gewonnen werden.
Der Laser eines Lasermikrodissektionssystems bzw. eine entsprechende
Laserablenkeinrichtung muss daher möglichst genau kalibriert werden, damit
Positionsvorgabewerte, die Sollpositionen für die Auftreffpunkte des Lasers auf der Probe angeben, und die sich ergebenden Positionsistwerte, also die tatsächlichen Auftreffpunkte, möglichst wenig voneinander abweichen.
Gängige Kalibrationsverfahren sind jedoch häufig nicht ausreichend zuverlässig bzw. exakt und/oder für einen Benutzer sehr aufwendig durchzuführen.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Kalibrierung einer Laserablenkeinrichtung eines Lasermikrodissektionssystems und ein Lasermikrodissektionssystem mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vor. Bevorzugte Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Vorteile der Erfindung
Die Erfindung geht von einem an sich bekannten Verfahren zur Kalibrierung einer in einer Auflichteinrichtung eines Mikroskops eines Lasermikrodissektionssystems angeordneten Laserablenkeinrichtung aus. Mittels der Laserablenkeinrichtung wird ein mittels einer Lasereinheit des Lasermikrodissektionssystems erzeugter und mittels der Auflichteinrichtung durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops geführter Laserstrahl auf eine mittels Ansteuersignalen an die Laserablenkeinrichtung definierte Position in einer Objektebene des Mikroskopobjektivs gelenkt. Ein entsprechendes
Lasermikrodissektionssystem weist ferner eine digitale Bilderfassungseinheit mit einem Bildauswertungsmodul auf.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, ein Kalibrationsobjekt in die Objektebene des Mikroskopobjektivs einzubringen. Anschließend wird die Laserablenkeinrichtung mit ersten, auf Grundlage von Positionsvorgabewerten unter Verwendung von ersten Kalibrationswerten berechneten Ansteuersignalen angesteuert. Durch Aktivieren des Laserstrahls wird bei oder jeweils nach der Ansteuerung mit den Ansteuersignalen, die insbesondere auch zu Signalfolgen zusammengefasst werden können, zumindest eine Kalibrationsmarkierung auf dem Kalibrationsobjekt erzeugt. Das Kalibrationsobjekt wird anschließend mittels der digitalen Bilderfassungseinheit erfasst und es werden mittels des Bildauswertungsmoduls Positionsistwerte der wenigstens einen
Kalibrationsmarkierung ermittelt. Auf Grundlage einer Beziehung der
Positionsvorgabewerte und der Positionsistwerte zueinander werden zweite
Kalibrationswerte bestimmt.
Positionsvorgabewerte gibt ein Benutzer an, beispielsweise mittels einer
Computermaus oder einer anderen geeigneten Eingabeeinrichtung auf einem
Computerbildschirm. Es handelt sich i.d.R. um Positionssollwerte, die Positionen angeben, an denen der Laserstrahl bzw. ein durch ein Mikroskopobjektiv erzeugter Fokuspunkt des Laserstrahls auf einem Objekt auftreffen soll. Aus diesen
Positionsvorgabewerten werden auch in herkömmlichen
Lasermikrodissektionssystemen die Ansteuersignale für die Laserablenkeinrichtung berechnet. Die Laserablenkeinrichtung wird mit entsprechenden Ansteuersignalen beaufschlagt.
Unter Ansteuersignalen werden hier sämtliche Signale verstanden, die eine Ablenkung eines Laserstrahls mittels der erläuterten Laserablenkeinheit in beliebigen Richtungen gegenüber einer Achse des Mikroskopobjektivs und damit auch in der Objektebene, bzw. auf diese bezogen, ermöglichen. Bewegungsumfang und
Bewegungsgeschwindigkeit sind hier ggf. durch die technischen Grenzen eines entsprechenden Lasermikrodissektionssystems festgelegt. Ansteuersignale können beispielsweise numerische Ansteuerwerte für eine Steuereinheit, die der
Laserablenkeinheit zugeordnet ist, und/oder analoge oder digitale Signale für die Aktoren einer entsprechenden Laserablenkeinheit, z.B. Schritt- oder Piezomotoren einer Keilplattenanordnung, umfassen.
Positionsistwerte geben die tatsächlichen Auftreffpunkte des Lasers an, die sich aus einer entsprechenden Ansteuerung ergeben, und die unvermeidlich zumindest in gewissem Umfang von den Positionsvorgabewerten abweichen. Ziel einer
entsprechenden Kalibration ist es dabei, Kalibrationswerte bereitzustellen, die die Abweichungen zwischen den Positionsvorgabewerten und den sich ergebenden Positionsistwerten weitestgehend reduzieren. Die Kalibrationswerte gehen dabei in die Berechnung der Ansteuersignale ein.
Zur Kalibration wird eine Beziehung der Positionsvorgabewerte und der
Positionsistwerte zueinander, beispielsweise eine Differenz der Elemente von
Wertetupeln, die zur Positionsbeschreibung eingesetzt werden, verwendet. Die eigentliche Kalibration umfasst, aus einer derartigen Beziehung Werte
(Kalibrationswerte) für eine Transformationsvorschrift zu ermitteln, mittels derer die Positionsvorgabewerte und die Positionsistwerte zur Deckung gebracht werden können. Die Kalibrationswerte können dann an beliebiger Stelle in einem
Berechnungsverfahren für die Berechnung der Ansteuersignale zum Einsatz kommen. Beispielsweise können diese (entsprechend bekannter Vorsteuerungsverfahren) bereits mit den Positionsvorgabewerten verrechnet werden, so dass die Berechnung der Ansteuersignale mit entsprechend angepassten Positionsvorgabewerten erfolgt. Ein Kalibrationsverfahren kompensiert also im Rahmen des hier vorgeschlagenen Verfahrens eine Abweichung zwischen Soll- und Istwerten durch eine geeignete Rechenvorschrift. Im einfachsten Fall kann es sich hierbei lediglich um eine Addition bzw. Subtraktion von Koordinatenwerten handeln, wodurch die entsprechenden Koordinaten einheitlich verschoben werden. In Fällen, in denen mehrere
Kalibrationsmarkierungen auf einem Kalibrationsobjekt angebracht werden, und in denen sich unterschiedliche Abweichungen der Kalibrationsmarkierungen bzw. der anhand dieser ermittelten Positionsistwerte von den Positionsvorgabewerten ergeben, ist es hingegen ggf. erforderlich, über den gesamten betrachteten Bereich eine angepasste, ggf. interpolierende Rechenvorschrift anzuwenden, die eine möglichst exakte Transformation sämtlicher Werte ermöglicht.
Die Erfindung geht also von einem an sich bekannten Lasermikrodissektionssystem aus. Ein derartiges Lasermikrodissektionssystem umfasst ein Mikroskop, das eine Auflichteinrichtung, ein Mikroskopobjektiv und eine Lasereinheit aufweist, wobei ein Strahlengang eines Laserstrahls der Lasereinheit durch die Auflichteinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv verläuft und eine Objektebene des Mikroskopobjektivs an einem einstellbaren Schnittpunkt schneidet, der mittels Ansteuersignalen an die Laserablenkeinrichtung vorgegeben wird.
Die Erfindung kommt dabei insbesondere in sogenannten kontaktfreien Lasermikrodissektionssystemen zum Einsatz. Diese zeichnen sich dadurch aus, dass ein Dissektat nicht an Membranen und dergleichen angeheftet wird, sondern aufgrund der Schwerkraft aus dem Objekt nach unten fällt. Das Objekt ist dabei in
Aufrechtsystemen an der Unterseite eines Objektträgers angeordnet und wird durch den Objektträger hindurch von dessen Oberseite aus bearbeitet.
Mittels der Auflichteinrichtung wird also ein Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten des Objekts verwendet wird, auf dieses fokussiert.
Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit Objekten verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt werden. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem dient daher nicht zur Gewinnung von Objekten sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die Erfindung auch mit Objekten, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, z.B. mit Ausstrichen, Mazeraten usw.
Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Objekten eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines
Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, ggf. dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom
unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener
Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach objektabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen Kriterien, eingerichtet sind. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen nicht auf Lasermikrodissektionssysteme übertragen.
Mikrotome umfassen ferner keine Mikroskope, in deren Beobachtungsstrahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird daher in Mikrotomen auch niemals durch ein Mikroskopobjektiv, das auch zur Betrachtung verwendet wird, auf ein Objekt, z.B. einen Gewebeblock, fokussiert.
Der Mikroskoptisch ist in Lasermikrodissektionssystemen mit einer
Laserablenkeinrichtung, wie erfindungsgemäß eingesetzt, bezüglich der x-y-Richtung (also in den Richtungen senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs) beim Heraustrennen des Dissektats, also während des Dissektiervorgangs, gegenüber dem Mikroskopobjektiv feststehend angeordnet.
Im Gegensatz zu Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des
Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch (Scanningtisch), der insbesondere bei stark vergrößernden Objektiven eine hohe Positioniergenauigkeit besitzen muss, um präzise Schnitte zu ermöglichen, erweisen sich
Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserablenkeinrichtung als einfacher und kostengünstiger in der Herstellung und besitzen Präzisionsvorteile.
Die Laserablenkeinrichtung weist in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei dicke, gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um eine optische Achse drehbare gläserne Keilplatten („Glaskeile") auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der gläsernen
Keilplatten ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel. Am Ausgang der Laserablenkeinrichtung weist der
Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der gläsernen Keilplatten einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle
Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs. Der Schnittpunkt des Laserstrahls mit der Objektebene ist damit einstellbar.
Eine derartige Laserablenkeinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserablenkeinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern,
Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupillenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille trifft. Bei der Mikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV-taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Weitere Vorteile einer derartigen Laserablenkeinrichtung mit Keilplatten sind beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 genannt.
Besonders vorteilhaft ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wenn für die
Positionsvorgabewerte, die Positionsistwerte und/oder die Kalibrationswerte Planar- und/oder Polarkoordinaten in einer Bezugsebene verwendet werden. Als Bezugsebene kann beispielsweise die Objektebene, eine Oberfläche eines Objekts, eine Oberfläche eines Objekttischs und/oder jede andere reale oder virtuelle Ebene des
Lasermikrodissektionssystems verwendet werden. Entsprechende Planar- und/oder Polarkoordinaten beziehen sich jeweils auf einen Bezugspunkt, der fest in der
Bezugsebene liegt oder in einer festen räumlichen Beziehung zu dieser steht. Unter Planarkoordinaten werden hier übliche x-y-Koordinaten („Rechts- und Hochwerte" oder entsprechende Angaben) verstanden, die sich auf den jeweiligen Bezugspunkt beziehen. Polarkoordinaten definieren hingegen eine Position im Raum (bzw. hier in der Bezugsebene) über einen Winkel und einen Abstand zu dem jeweiligen
Bezugspunkt. Dem Benutzer müssen die Planar- und Polarkoordinaten nicht notwendigerweise in Rohform präsentiert werden. Entsprechende Planar- und/oder Polarkoordinaten können vielmehr auch systemintern aus Benutzervorgaben, beispielsweise aus Linien, welche der Benutzer mittels einer Computermaus um einen interessierenden Bereich eines digital dargestellten Objekts definiert, berechnet werden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht aufgrund der automatischen Erkennung mittels des Bildauswertungsmoduls der digitalen Bilderfassungseinheit und der
Laserstrahlsteuerung mittels der Laserablenkeinheit eine automatische Kalibrierung des Laserstrahls ohne Benutzereingriff. Fehlbedienungen durch den Benutzer werden hierdurch unmöglich, die Kalibrierung des Laserstrahls wird aufgrund der objektiven und nachvollziehbaren Mustererkennung deutlich genauer als in herkömmlichen Verfahren bzw. Lasermikrodissektionssystemen, wie sie beispielsweise der EP 1 186 879 A1 zugrunde liegen.
In herkömmlichen Verfahren bzw. Lasermikrodissektionssystemen wird der Laser bzw. dessen Laserablenkeinrichtung manuell anhand von Referenzkreuzen kalibriert. Diese manuelle Kalibrierungsmethode umfasst, wie die vorliegende Erfindung, auf einem Kalibrierobjekt Kalibrationsmarkierungen zu erzeugen. Diese müssen jedoch anschließend manuell anhand eines digitalen Bildes mithilfe einer Computermaus markiert werden. Dieses Verfahren ist nicht absolut zuverlässig und hängt vom jeweiligen Anwender, dessen Erfahrung und dem genauen Ermitteln der
Kalibrationsmarkierungen ab. Hierdurch ergeben sich unter Umständen stark
abweichende Kalibrierungen, die insbesondere im Hinblick auf eine Reproduzierbarkeit und Zertifizierbarkeit eines entsprechenden Verfahrens, beispielsweise in der medizinischen Diagnostik, nachteilig sind. Zudem kosten Wiederholungen der
Kalibrierung aufgrund fehlerhafter Kalibrierungen unnötig Zeit.
Die vorliegende Erfindung bietet besondere Vorteile, wenn zur Kalibrierung des Laserstrahls bzw. der Laserablenkeinrichtung zumindest zwei, jedoch insbesondere drei oder mehr Kalibrierpunkte in Form von Kalibrationsmarkierungen verwendet werden. In bekannten Kalibrationsverfahren werden typischerweise vier Kalibrierkreuze zur manuellen Kalibrierung der softwaregestützten Laserstrahlsteuerung durch eine entsprechende Laserablenkeinrichtung eingesetzt. Hierzu wird zunächst ein Kreuz an einer bestimmten Position, konventionsgemäß oben rechts im Sichtfeld, durch den Laser in ein geeignetes Objekt, das im Fokus des Lasers und damit des
Mikroskopobjektivs liegt, geschnitten. Dieses Kreuz wird anschließend mittels der Maus oder eines Touchscreens manuell mittig markiert. Anschließend wird ein weiteres Kreuz mithilfe des Lasers an einer weiteren Position (oben links) in das Objekt geschnitten. Wiederum wird das zweite Kreuz manuell wie das erste markiert. Die genannten Schritte werden anschließend mit vom Laser geschnittenen Kreuzen an weiteren Positionen (unten rechts und unten links), jeweils mit entsprechender manueller Markierung, wiederholt. Ein derartiges Verfahren wird durch die vorliegende Erfindung vereinfacht und präzisiert.
Durch die Erfindung wird es möglich, die in dem Kalibrationsobjekt erzeugten
Kalibrationsmarkierungen vollautomatisch zu erkennen und einen pixelgenauen Mittelpunkt zu berechnen. Dieser kann automatisch für die Kalibrierung gespeichert und weitergegeben werden. Das erläuterte Verfahren ist durch die automatische Berechnung und Weitergabe an eine Lasermikrodissektionssteuersoftware der Laserfokus- und/oder der Laserablenkeinheit sehr genau.
Eine Vereinfachung ergibt sich, wenn der Bereich für die jeweilige Erkennung der Kalibrationsmarkierungen (z.B. von Laserkreuzen oder Laserpunkten) vorab eingegrenzt wird. Hierbei kann, wie beispielsweise auch in Figur 4 veranschaulicht, nur die Mitte des Sichtfelds für einen festen Laser und/oder zunächst der obere rechte, dann der obere linke, anschließend der untere rechte und der untere linke Bereich des Sichtfelds für die Erkennung verwendet werden, wenn dort jeweils zuvor eine
Kalibrationsmarkierung angebracht wurde. Dies reduziert Fehler.
Wie erwähnt, ergeben sich besonders gute Kalibrationsgenauigkeiten dann, wenn zumindest drei Kalibrationsmarkierungen auf dem Kalibrationsobjekt erzeugt und Positionsistwerte hiervon ermittelt werden.
Die Genauigkeit der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Kalibration kann nochmals gesteigert werden, wenn ein spezielles Kalibrationsobjekt mit einer durch den
Laserstrahl bearbeitbaren, auf einem Objektträger aufgebrachten Beschichtung verwendet wird. Eine derartige Beschichtung kann beispielsweise - im Gegensatz zu einem später zu bearbeitenden Objekt - derart ausgewählt werden, dass mittels des Laserstrahls eine möglichst feine Linie, die gleichzeitig einen ausreichenden Kontrast bei Bestrahlung durch den Laserstrahl bereitstellt, erzeugt werden kann. Eine derartige Beschichtung kann auch mit geeigneten foto- und/oder thermoreaktiven Pigmenten versehen sein, die aufgrund einer Bestrahlung durch den Laser ihre Farbe wechseln. Dies ermöglicht die Erzeugung von farbigen Kalibrationsmarkierungen, die in einer entsprechenden Bilderfassungseinheit bzw. einem Bilderkennungsmodul einer derartigen Bilderfassungseinheit einfach, z.B. durch farbselektive
Erkennungsvorschriften, erkannt werden können.
Bei hierbei verwendbaren Kalibrationsobjekten handelt es sich beispielsweise um einfarbige Kalibrationsslides. Hierbei kann beispielsweise ein ansonsten leerer Objektträger mit einer laserbearbeitbaren Membran zum Einsatz kommen. Die
Membran ist vorteilhafterweise mit einer farbigen Beschichtung versehen, die durch die Laserbearbeitung entfernt oder entfärbt werden kann, um mehr Kontrast zu erhalten. Im einfachsten Fall kann eine entsprechende Membran beispielsweise von einem Benutzer mit einer geeigneten Farbschicht versehen werden. Auch andere, mit einer regelmäßigen oder einfarbigen Oberfläche versehene Proben bieten sich für eine schnelle automatische Kalibrierung an, da diese für die vorteilhafterweise
vorgenommene automatische Musterauswertung am leichtesten zu verarbeitende Bildinformationen liefern.
Foto- und/oder thermoreaktive Pigmente können beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe sein, die sich mit Laserstrahlung im UV- oder IR-Bereich anregen lassen. Auf diese Weise ist beispielsweise eine Laserkalibrierung in unterschiedlichen Beleuchtungsarten (Hellfeld, Phasenkontrast, Fluoreszenz, vgl. EP 1 719 998 B1 ) möglich. Ferner können spezielle Objekte verwendet werden, die auf der Oberfläche farblich unterschiedlich beschaffen sind und mit schwarzer oder anderer Farbe (z.B. einer durch einen
Benutzer angebrachten Farbschicht) überdeckt sind. Die farbliche Auswahl kann hier
beispielsweise der Ausgangsposition des Mikroskoptischs bzw. des Objektträgers auf dem Tisch angepasst werden. Hierbei können beispielsweise unterschiedliche freigelegte Farben zur Identifizierung der Reihenfolge der Kalibrationsmarkierungen bzw. deren Formen verwendet werden, was wiederum Zeit spart.
Allgemein handelt es sich bei einem Kalibrationsobjekt um ein Objekt, auf dem entsprechende Kalibrationsmarkierungen erzeugt werden können. Hierbei kann es sich um später bearbeitete Objekte handeln, wobei die Kalibrationsmarkierungen insbesondere in Bereichen erzeugt werden, die in einer anschließenden Analyse nicht benötigt werden, oder um spezielle„Kalibrationsslides".
In einem erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafterweise punktförmige, kreisförmige und/oder (faden-)kreuzförmige Kalibrationsmarkierungen auf dem
Kalibrationsobjekt erzeugt werden. Die Erzeugung punktförmiger
Kalibrationsmarkierungen ist insbesondere bei feststehenden Lasern möglich und vorteilhaft. Die Formen von Kalibrationsmarkierungen, beispielsweise kreisförmige, kreuz- und/oder fadenkreuzförmige Kalibrationsmarkierungen, können in ein entsprechendes Bildauswertungsmodul„eingelernt" werden, was eine besonders zuverlässige und schnelle Erkennung erlaubt.
In einer vorteilhaften Weiterbildung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren, die zweiten Kalibrationswerte zur Berechnung von Ansteuersignalen auf Grundlage von Positionsvorgabewerten in einem Nachkalibrationsbetrieb des
Lasermikrodissektionssystems zu verwenden. Ein„Nachkalibrationsbetrieb" ist der reguläre Betrieb eines solchen Lasermikrodissektionssystems, beispielsweise zur routinemäßigen Untersuchung bzw. Bearbeitung biologischer bzw. medizinischer Objekte. Ein derartiger Nachkalibrationsbetrieb kann solange durchgeführt werden, bis, beispielsweise aufgrund von sich verschlechternden Qualitätskriterien, eine erneute Kalibration erforderlich wird. In diesem Fall können die„zweiten" Kalibrationswerte durch neu ermittelte („dritte" usw.) Kalibrationswerte ersetzt werden.
Wie bereits erläutert, kann das Ermitteln der Positionsistwerte der wenigstens einen Kalibrationsmarkierung mittels des Bildauswertungsmoduls die Verwendung wenigstens einer digitalen Mustererkennungsvorschrift umfassen. Entsprechende Mustererkennungsvorschriften sind grundsätzlich bekannt und beispielsweise in der US 2007/ 0066967 A1 offenbart.
Die erläuterten Bilderkennungsvorschriften, zu denen im Detail auf die erwähnte US 2007/0066967 A1 verwiesen wird, können beispielsweise auch eine
Shadingkorrektur, eine Graubildverarbeitung, eine Umsetzung in ein Binärbild, eine Binärbildverarbeitung, eine Segmentation und eine Bestimmung von Objektmerkmalen, beispielsweise der Kalibrationsmarkierungen und weitere aus dem Bereich der
Bildverarbeitung bekannte Verfahren umfassen.
Insbesondere wird ein elektronisches Bild zumindest eines Bildausschnitts eines Objekts aufgenommen, und anschließend bildanalytisch untersucht. In der genannten US 2007/0066967 A1 wird zumindest ein auszuschneidendes Dissektat automatisch ermittelt und eine Sollschnittlinie um dieses automatisch bestimmt. Diese Technik wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf eine Kalibrationsmarkierung übertragen und zur Ermittlung der Positionsistwerte verwendet.
Bildanalytische Verfahren basieren gewöhnlich auf einer Merkmalsanalyse. Bei dieser Vorgehensweise nutzt man die Tatsache, dass jedes Bildelement, im vorliegenden Fall eine Kalibrationsmarkierung, über eine gewisse Anzahl individueller Merkmale erkannt und klassifiziert werden kann. Merkmale können z.B. Größen wie Fläche, Umfang und Durchmesser aber auch Masse, Textur, Farbe, Form etc. sein. Indem man einen geeigneten Satz von Merkmalen auswählt, kann man ein Bildelement klassifizieren und gegen andere Bildelemente abgrenzen.
Diesen geeigneten Satz von Merkmalen trägt man gewöhnlich in einem n- dimensionalen Merkmalsraum auf, wie im Detail in der genannten Druckschrift beschrieben. Beispielsweise kann ein Merkmalsraum mit den Merkmalen Farbe, Fläche und Durchmesser gewählt werden. Die verwendeten Merkmalsräume können im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezielt an die Kalibrationsmarkierungen angepasst werden und umgekehrt. Bildelemente mit vergleichsweise wenig Farbe und einem kleinen Durchmesser und einer kleinen Fläche werden dann z.B. durch ein erstes Merkmalscluster klassifiziert. Hiervon werden Bildelemente, die durch ein anderes Merkmalscluster erfasst werden, unterschieden. Beispielsweise können letztere vergleichsweise viel Farbe und einen geringen Durchmesser sowie eine kleine Fläche aufweisen. Zusätzliche Bildelemente können durch ein nochmals anderes
Merkmalscluster beschrieben werden und verfügen beispielsweise über weniger Farbe und einen großen Durchmesser sowie eine große Fläche usw. Die erläuterte
Erzeugung der Kalibrationsmarkierungen, insbesondere unter Verwendung der erläuterten Formen, ggf. Farben und der Beschichtung des Kalibrationsobjekts,
vereinfacht die Unterscheidung der Kalibrationsmarkierungen von anderen
Bildelementen, die ebenfalls auf entsprechenden Kalibrationsobjekten vorhanden sind.
Zur Erkennung der Kalibrationsmarkierungen kann ferner auch ein Überlagerungsund/oder Subtraktionsbild aus Einzelbildern vor und nach der Erzeugung der
Kalibrationsmarkierungen verwendet werden, wodurch sich die
Kalibrationsmarkierungen auch dann schnell auffinden lassen, wenn ihre Form nicht bekannt ist. Ferner kann ein entsprechendes Überlagerungs- und/oder Subtraktionsbild zur Berechnung eines exakten Mittelpunkts eines Laserfokus genutzt werden.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der vorliegenden Erfindung kann auch während der Kalibrierung anhand der Kalibrationsmarkierung und/oder deren Form der Laser automatisch eingestellt werden. Diese Einstellung umfasst sämtliche einstellbaren Laserparameter, zumindest jedoch Laserenergie, Schnittgeschwindigkeit, Apertur und/oder Frequenz. Je nach Auswertung von Form und Struktur der
Kalibrationsmarkierungen können die einzelnen Parameter angepasst werden.
Beispielsweise kann weniger Energie und eine kleine Apertur bei zu breiten Linien der Kalibrationsmarkierungen und eine langsame Geschwindigkeit bei„gekrümmten" Linien, welche aufgrund zu hoher Laserführungsgeschwindigkeit auftreten können, verwendet werden. Die Einstellung der Apertur eines entsprechenden Lasers ist beispielsweise aus der DE 100 18 255 C1 bekannt.
Die zuvor erläuterten Merkmale und Vorteile betreffen in gleicher Weise ein
erfindungsgemäß vorgeschlagenes Lasermikrodissektionssystem. Dieses weist ein Mikroskop mit einer Auflichteinrichtung zum Führen eines mittels einer Lasereinheit des Lasermikrodissektionssystems erzeugten Laserstrahls durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops und eine Laserablenkeinrichtung zum Ablenken des Laserstrahls in einem durch Ansteuersignale definierten Umfang auf. Das
Lasermikrodissektionssystem weist ferner eine digitale Bilderfassungseinheit mit einem Bildauswertungsmodul auf.
Das Lasermikrodissektionssystem ist erfindungsgemäß mit einer
Kalibrationsanordnung zur Kalibration der Laserablenkeinrichtung versehen. Diese ist dafür eingerichtet, die Laserablenkeinrichtung mit ersten Ansteuersignalen, welche auf Grundlage von Positionsvorgabewerten und unter Verwendung von ersten
Kalibrationswerten berechnet werden, durch Erzeugen zumindest einer
Kalibrationsmarkierung auf einem in einer Objektebene des Mikroskopobjektivs eingebrachten Kalibrationsobjekt mittels des Laserstrahls, durch anschließendes
Erfassen der wenigstens einen Kalibrationsmarkierung mittels der digitalen
Bilderfassungseinheit, durch Ermitteln von Positionsistwerten der wenigstens einen Kalibrationsmarkierung mittels des Bildauswertungsmoduls, und durch Bestimmen zweiter Kalibrationswerte auf Grundlage einer Beziehung der Positionsvorgabewerte und der ermittelten Positionsistwerte eingerichtet.
Insbesondere ist ein derartiges Lasermikrodissektionssystem zur Durchführung eines Verfahrens wie zuvor erläutert eingerichtet.
Mittels des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems können im Gegensatz zum Stand der Technik sehr viel genauer gewünschte Einzelzellen oder
Geweberegionen (Zellverbände) eines Objekts in ein Auffanggefäß überführt und gezielt untersucht werden. Die Einzelzellen oder Geweberegionen können eindeutig bestimmten Bereichen des Objekts zugeordnet werden, Kontaminationen sind aufgrund der deutlich erhöhten Schnittgenauigkeit des Lasers reduziert. Bei dem Objekt kann es sich beispielsweise um einen Schnitt eines festen Gewebes, um einen Aus- oder Abstrich, beispielsweise einen mikroskopischen Schnitt durch ein Organ, um adhärente Zellkulturen und dergleichen handeln.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung und Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.
Figur 1 zeigt schematisch ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann.
Figur 2 zeigt schematisch ein Verfahren zur Kalibrierung einer
Laserablenkeinrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
Figur 3 zeigt schematisch Kalibrationsmarkierungen zur Kalibrierung einer
Laserablenkeinrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
Figur 4 zeigt schematisch ein Verfahren zur Kalibrierung einer
Laserablenkeinrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und nicht wiederholt erläutert.
Ausführungsform(en) der Erfindung
ln Figur 1 ist ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung eines
erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Ein Koordinatensystem, anhand dessen die nachfolgend erwähnten Achsen bzw. Richtungen x, y und z veranschaulicht sind, ist in der Figur 1 mit 1 10 bezeichnet.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem
Mikroskopfuß 1 1 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte
Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Diese kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die
Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden. Zur Durchlichtbeleuchtung und zur Einstellung geeigneter Kontrastbzw. Beobachtungsverfahren kann eine Kondensoreinheit 90 vorgesehen sein.
Am Mikroskopfuß 1 1 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder
Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touchscreen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrachtungsund/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann.
Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Ein Objekt, das sich auf einem Objektträger (hier ohne Bezeichnung) auf einem Objekthalter 50 befindet, beispielsweise ein auf dem Objektträger aufgebrachter Schnitt, kann hierdurch in eine Objektebene 51 eines Objektivs 41 gebracht werden. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein.
Von dem Objekt in der Objektebene 51 ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang eines Beobachtungsstrahlengangs a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten Auskoppeleinrichtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des
Beobachtungslichts, beispielsweise um 60 °, ausgekoppelt und mittels eines
Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des
Beobachtungslichts kann in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 eingekoppelt und bildgebend erfasst werden. Der Bilderfassungseinheit 63 kann, vor Ort, in einer Steuereinheit 82 oder einem Steuerrechner 81 (siehe unten) oder in anderer räumlicher Anordnung, ein Bildauswertungsmodul 64 zugeordnet sein.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist eine Lasereinheit 70 mit einer
Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich
beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl b wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Umlenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 auf das Objekt in der Objektebene 51 fokussiert.
Bei dem Lasermikrodissektionssystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl b auf das Objekt in der Objektebene 51 auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Versteileinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y- Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der Versteileinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann.
Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere motorisierte Funktionen des
Lasermikrodissektionssystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81 , der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen.
Für die Lasermikrodissektion kann insbesondere eine Laserablenkeinrichtung 73 vorgesehen sein. Mittels der Laserablenkeinrichtung 73 kann der Laserstrahl b gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel 71 und dem zweiten
Umlenkspiegel 72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel 72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teiler ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf das Objekt in der Objektebene 51 fokussiert. Eine Ablenkung mittels einer Laserablenkeinrichtung 73 ist im Detail in der EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass hier unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls b bzw. zur Positionierung des Objekts in der
Objektebene 51 gegenüber dem Laserstrahl b zum Einsatz kommen können. Die Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt.
Im dargestellten Beispiel weist die Laserablenkeinrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilplatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden.
Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Aktoren 734 gedreht werden, die mit entsprechenden Ansteuersignalen beaufschlagt werden können und entsprechend die Zahnräder 733 antreiben. Die Aktoren 734 können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur am rechten Aktor 734 gezeigt). Eine durch die Positonsgeber 735 erfasste Position kann an die Steuereinheit 80 übermittelt werden.
In Figur 2 ist ein Verfahren gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in Form eines schematischen Ablaufplans dargestellt und insgesamt mit 200 bezeichnet. Das Verfahren 200 ist in einem hierfür eingerichteten
Lasermikrodissektionssystem, beispielsweise dem in Figur 1 gezeigten
Lasermikrodissektionssystem 100, implementiert.
Das Verfahren geht von einem Schritt 210 aus, in dem sich ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem in einem unkalibrierten Zustand befindet. In diesem unkalibrierten Zustand kann, wie mehrfach zuvor erläutert, nicht sichergestellt werden, dass die zuvor erläuterten Positionsvorgabewerte und Positionsistwerte einander im erforderlichen Umfang entsprechen. Um dies zu gewährleisten, wird das
Kalibrationsverfahren 200 durchgeführt.
In einem Schritt 220 werden hierzu, beispielsweise mittels einer Steuereinheit 80, die erwähnten Positionsvorgabewerte 21 vorgegeben. Es handelt sich hierbei um
Sollwerte, die eine Wunschposition des Laserstrahls in der Objektebene 51 des Mikroskopobjektivs 41 angeben. In dem Schritt 220 werden auch die
Positionsvorgabewerte 21 mit„ersten" Kalibrationswerten 22, die beispielsweise aus einem Kalibrationsdatenspeicher 20 abgerufen werden, verrechnet. Bei den in Schritt 220 verwendeten Kalibrationsdaten 22 kann es sich beispielsweise um
standardmäßige Kalibrationsdaten handeln, wie sie typischerweise für ein
entsprechendes Lasermikrodissektionssystem zum Einsatz kommen, oder um
Kalibrationsdaten, die nach längerem Betrieb eines entsprechenden
Lasermikrodissektionssystems 100 vorliegen. In Schritt 220 werden aus den
Positionsvorgabewerten 21 und den Kalibrationswerten 22 Ansteuersignale 23 berechnet und an eine Laserablenkeinheit, beispielsweise die Laserablenkeinheit 73 des in Figur 1 gezeigten Lasermikrodissektionssystems ausgegeben. Hierbei kann es sich insbesondere auch um entsprechende Signalfolgen von Ansteuersignalen 23 handeln, die eine kontinuierliche und/oder schrittweise Ablenkung des Lasers in der Laserablenkeinheit 73 bewirken. Gleichzeitig (nicht dargestellt) wird ein
entsprechender Laser kontinuierlich oder gepulst aktiviert, so dass mittels des
Laserstrahls zumindest eine Kalibrationsmarkierung auf einem Kalibrationsobjekt, das in eine Objektebene 51 des Mikroskopobjektivs 41 eingebracht ist, erzeugt werden kann. Nach der erfolgreichen Abarbeitung des Schritts 220, durch die eine
Wunschanzahl entsprechender Kalibrationsmarkierungen auf dem Kalibrationsobjekt erzeugt wurde, wird das Verfahren in einem Schritt 230 fortgesetzt.
In dem Schritt 230 wird mittels einer digitalen Bilderfassungseinheit, beispielsweise der digitalen Bilderfassungseinheit 63 des in Figur 1 gezeigten
Lasermikrodissektionssystems 100, das Kalibrationsobjekt 52, das in die Objektebene 51 des Mikroskopobjektivs 41 eingebracht ist, digital erfasst. Mittels eines der digitalen Bilderfassungseinheit 63 zugeordneten Bildauswertungsmoduls 64 werden hierbei Positionsistwerte 24 der wenigstens einen Kalibrationsmarkierung 53 ermittelt. Diese werden in Schritt 230 mit den Positionsvorgabewerten 21 in Beziehung gesetzt.
Beispielsweise wird eine x- und y-Abweichung in der Objektebene zwischen den Positionsvorgabewerten 21 und den Positionsistwerten 24 bestimmt. Auf dieser Grundlage werden nunmehr neue („zweite") Kai ib rationswerte 25 ermittelt und in den Kalibrationsdatenspeicher 20 übertragen. Hierbei werden beispielsweise die ursprünglichen („ersten") Kalibrationswerte 22 mit den neu ermittelten („zweiten") Kalibrationswerten 25 überschrieben.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 befindet sich damit in einem kalibrierten Zustand, der in Schritt 240 veranschaulicht ist. In diesem Schritt 240 werden zur Lasermikrodissektion ebenfalls entsprechende Positionsvorgabewerte 21 ,
beispielsweise mit der Steuereinheit 80, vorgegeben, nunmehr jedoch mit den neu ermittelten Kalibrationswerten 25 verrechnet. Auf dieser Grundlage berechnete Ansteuersignale (hier ohne Bezeichnung) können an die Laserablenkeinrichtung 73 ausgegeben werden und bewirken eine verbesserte Übereinstimmung zwischen den Positionsvorgabewerten und den Positionsistwerten.
In Figur 3 sind alternative Formen von Kalibrationsmarkierungen 53 auf
Kalibrationsobjekten 52 stark vergrößert dargestellt. Figur 3A zeigt dabei eine punktförmige Kalibrationsmarkierung 53, die beispielsweise in der Mitte eines
Kalibrationsobjekts 52 erzeugt wird, wenn, wie ebenfalls zuvor erläutert, ein
feststehender Laserstrahl eingesetzt wird. In Figur 3B ist eine Kalibrationsmarkierung 53, die mittels einer Laserablenkeinrichtung 73 erzeugbar ist, und die im dargestellten Beispiel eine Kreuzform aufweist, dargestellt. Eine beispielsweise in einer digitalen Bilderfassungseinheit 63 bzw. in einem Bildauswertungsmodul 64 einer derartigen
digitalen Bilderfassungseinheit 63 implementierte Bildauswerteroutine, beispielsweise geeignete parametrierte digitale Auswertemittel, können zur Erkennung
entsprechender Formen von Kalibrationsmarkierungen 53 auf Kalibrationsobjekten 52 eingerichtet sein. Eine charakteristische Form, wie die Kreuzform, die in Figur 3B dargestellt ist, erleichtert die Erkennung. Ferner kann mittels einer entsprechenden Form besonders einfach ein durch diese definierter Bezugspunkt, hier beispielsweise der Mittelpunkt M, definiert werden.
In Figur 4 sind in den Teilfiguren 4A bis 4D aufeinander folgende Teilschritte eines Verfahrens gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schematisch dargestellt. In sämtlichen Teilfiguren 4A bis 4D sind, wie in den Teilfiguren 3A und 3B der Figur 3 mittels einer digitalen Bilderfassungseinheit 63 erfasste
Kalibrationsobjekte 52 ausschnittsweise dargestellt.
In dem in Figur 4A dargestellten ersten Teilschritt wird in einer oberen rechten Ecke des Kalibrationsobjekts 52 eine entsprechende Kalibrationsmarkierung 53 angebracht. Ein durch ein Bildauswertungsmodul 64 ausgewerteter Bereich ist hier mit 640 bezeichnet und gestrichelt umfasst. Innerhalb des Bereichs 640 wertet ein
Bildauswertungsmodul die vorliegenden Bilddaten mit der darin enthaltenen
Kalibrationsmarkierung 53 aus und bestimmt auf dieser Grundlage einen
Positionsistwert. Der Positionsistwert kann beispielsweise in Form von x- und y- Bildkoordinaten, die bei einem entsprechend geeichten Bildauswertungsmodul definierten Koordinaten des Kalibrationsobjekts 52 entsprechen, angegeben werden. Ist der Teilschritt, der in Figur 4A dargestellt ist, erfolgreich abgeschlossen, und sind Positionsistwerte 24 der Kalibrationsmarkierung 53 erfasst, kann das Verfahren mit entsprechenden Teilschritten an beliebigen Positionen des Kalibrationsobjekts 52 fortgesetzt werden.
Beispielsweise wird in dem in Figur 4B dargestellten Teilschritt eine weitere
Kalibrationsmarkierung 53 im linken oberen Bereich des Kalibrationsobjekts erzeugt und (vgl. Erfassungsbereich 640) erfasst und ausgewertet. Entsprechendes gilt auch für die in den Figuren 4C und 4D dargestellten Teilschritte, die in entsprechender Weise durchgeführt werden. Durch die Vierfachkalibration werden besonders zuverlässige Kalibrationswerte erhalten, die beispielsweise in den in Figur 2 gezeigten Kalibrationsdatenspeicher 20 geschrieben werden können.