WO2007098825A1 - Verfahren zur bearbeitung einer masse mittels eines laserstrahls und entsprechende vorrichtung - Google Patents

Verfahren zur bearbeitung einer masse mittels eines laserstrahls und entsprechende vorrichtung Download PDF

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WO2007098825A1
WO2007098825A1 PCT/EP2007/000301 EP2007000301W WO2007098825A1 WO 2007098825 A1 WO2007098825 A1 WO 2007098825A1 EP 2007000301 W EP2007000301 W EP 2007000301W WO 2007098825 A1 WO2007098825 A1 WO 2007098825A1
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optical
cutting
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PCT/EP2007/000301
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Bernd SÄGMÜLLER
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Carl-Zeiss-Microimaging Gmbh
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B23K—SOLDERING OR UNSOLDERING; WELDING; CLADDING OR PLATING BY SOLDERING OR WELDING; CUTTING BY APPLYING HEAT LOCALLY, e.g. FLAME CUTTING; WORKING BY LASER BEAM
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    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult

Definitions

  • the present invention relates to a method for processing a mass, in particular a biological mass, by means of a laser beam and a correspondingly configured device.
  • the present invention relates to a method for more effectively processing, separating and / or recovering microscopically small biological and / or non-biological objects from a mass and a device designed for this purpose.
  • the biological mass from which the objects are obtained is arranged on a support.
  • a selected biological object is separated from the surrounding further biological mass by a laser beam so that the selected biological object is dissected free from the further biological mass.
  • the thus free-prepared biological object is then with the help of a laser shot by a catapultierartigen
  • Transfer process from the carrier to a collecting device which may for example be a collecting substrate in this collecting device.
  • Carrier of the biological mass can be used, for example, a polymer film.
  • a biological object to be separated of a biological mass applied to the carrier is thus initially selected, then cut out of the biological mass and subsequently transferred by a laser-induced transport process to the collecting device.
  • biological objects are understood to mean, in particular, living or fixed biological cells, cell constituents or cell colonies which are contained in a liquid or solid biological material, such as, for example, a cell tissue, a smear, a cell culture or the like.
  • certain objects from a biological mass can be selectively removed or rejected.
  • the biological objects can be applied next to each other on a solid planar support, wherein the process of leaching or discarding can be performed within a short time and without contact.
  • the survivability and morphology of the biological objects are preserved, i.
  • the biological objects are not damaged or impaired by the separation process and the laser-induced transport process.
  • the processing of the biological mass generally takes place in such a way that first an image of the biological mass is generated and in it the object to be separated or the objects to be separated are selected.
  • a microscope arrangement is used which generates the image of the mass by means of a magnifying optical objective.
  • the positioning of the laser beam on the mass is accomplished by a corresponding relative movement of the carrier on which the mass is located and the objective.
  • the same optical objective is used to generate the image, to cut the mass and to transfer the object.
  • problems may arise if the identification of the object requires an optical objective which has a low magnification so that, for example, the overall structure and surroundings of the object can be reliably detected, but the object subsequently cut with a high degree of precision, for example because it is very close to other objects that must not be touched by the cutting line during the cutting process.
  • problems may arise when objects are identified and selected for subsequent separation, which are of very small size, so that reliable cutting and / or transferring of the object is not possible.
  • reliable identification of objects is not possible because, for example, certain structures with the predetermined magnification are not visible.
  • the inventive method for processing a mass by means of a laser beam comprises a step of generating an image of at least a part of the mass, evaluating the image to select therein at least one object of the mass, cutting the mass by irradiation with the laser beam to the selected one Separating the object from the mass; and / or transferring the selected object from the mass to a catching device, wherein generating the image and / or cutting the mass is by means of an optical objective.
  • the method further comprises a step of automatically changing the optical objective depending on the accuracy required for evaluating the image or cutting the mass.
  • the magnification of the optical lens can be adapted in an advantageous manner to the requirements of the respectively performed method step. So it is possible, for example, first with a low magnification to produce an overview image of the biological mass, and then with a higher magnification to identify objects in the mass and separated by laser irradiation of the mass. Further, if the selected object is close to another object or a region which is not to be damaged or otherwise affected by the cut line when cutting out the selected object, it is possible for the process of cutting the mass onto an optical objective To change a higher magnification, so that a more accurate positioning and focusing of the laser beam during the cutting process can take place.
  • the cutting line which preferably encloses the selected object almost completely or completely, may comprise sections which have been produced by means of differently magnifying optical lenses and thus have a different "cutting accuracy".
  • the evaluation of the image can be done automatically or manually by the user, wherein in the case that the generated image lacks the accuracy required for the evaluation of an image processing device or of the
  • an optical lens having a high magnification can be used.
  • an optical objective with a low magnification can be used.
  • the laser beam is directed to the object through the respective selected optical lens, and by activating the laser beam for a predetermined period of time, the selected object is transferred to the catching device.
  • the properties of the laser beam e.g. Power or pulse rate are preferably adjusted depending on the selected for performing the transfer optical lens.
  • the device according to the invention for processing a mass by means of a laser beam comprises a laser light source for generating a laser beam in order to cut the mass by irradiation with the laser beam and / or to transfer an object of the mass to a catching device, and imaging means for generating an image of at least one part the mass, wherein an optical objective is provided for generating the image and for directing the laser beam to the mass.
  • the device comprises at least one further optical objective and means for automatically changing the optical objective depending on the accuracy which is used to evaluate the image to select the object therein and / or to cut the mass to separate the object from the mass , is required.
  • the device is preferably designed for carrying out the method according to the invention described above.
  • the invention is explained in more detail below with reference to preferred embodiments and with reference to the accompanying drawings.
  • Fig. 1 shows a basic structure of an apparatus for realizing the present invention.
  • Fig. 2 shows an example of a biological mass.
  • FIG 3 shows a flow chart for a method according to an embodiment of the invention.
  • FIG. 4 shows a section of an image of the mass in which a cutting line with sections of different accuracy is generated in order to separate an object from the mass.
  • FIG. 5 shows a section of a further illustration of the mass, in which cutting lines are produced with increased accuracy in order to separate further objects from the mass.
  • Fig. 1 shows schematically the structure of a laser microscope system or laser microdissection system, which is designed to implement the present invention.
  • the system has a modular design and can therefore be individually adapted to different experimental requirements.
  • the illustrated laser microscope system is an inverse laser microdissection system for separation, i. Removal of biological objects, eg. As individual cells, cell colonies or cell components, from a biological material or preparation, but the invention is of course not limited to this preferred embodiment.
  • the invention can also be used with upright laser microscope systems or when working on non-biological materials.
  • a laser device 4 in which a laser light source for generating a laser beam is housed. Furthermore, in the laser device 4, an optics 5, 6 housed, which serves to couple the laser beam into a microscope 1 and tune the laser focus in the object plane to the optical focus of the microscope 1.
  • it is a pulsed UV Nitrogen laser whose wavelength z. B. 300 nm and its pulse energy is 270 mJ, for example.
  • the pulse duration is z. B. 3 ms, while the pulse rate between 1 and 1000 pulses per second is adjustable.
  • a pulse rate around 100 is used.
  • the nitrogen laser emits a laser beam with a fixed laser energy.
  • accurate laser energy adjustability is required.
  • a Abschwhariatorrad 5 is arranged perpendicular to the laser beam path. This attenuator wheel is rotated by a DC motor which can be controlled via a potentiometer knob (not shown) to adjust the laser energy accordingly.
  • the laser focus can also be adjusted independently of the microscope focus, i. the focal point of the laser can be
  • Purpose is a stepping motor is provided, which moves the lenses 6 shown in Fig. 1.
  • the focusing or the stepping motor can in turn by a
  • Potentiometerkopf be controlled. Furthermore, an automated focusing is provided.
  • the laser beam is coupled into the microscope 1 via a plurality of coated beam splitters and deflected toward an optical objective 18.
  • the diameter of the laser beam occurring on the object plane is significantly dependent on the numerical aperture of the objective 18.
  • a lens with a relatively high numerical aperture allows laser beam diameter of less than 1 micron.
  • the laser microscope system shown in Fig. 1 is configured with a mechanism for automatically changing the lens 18.
  • This may in particular be a turret mechanism, although of course other mechanisms for automatically changing the lens 18 may be used.
  • automatically replaceable lenses 18 are provided with magnifications of 2x, 5x, 10x, 2Ox, 4Ox, 63x and 100x. These lenses 18 are designed to have a high transmission for the laser wavelength used so that energy losses are minimized.
  • the guided through the lens 18 laser beam finally hits a motorized and computer-controlled microscope or support table 3, on which a slide is arranged with a biological mass to be processed. Above the support table 3 there is also a motorized and computer-controlled collecting device 2.
  • the microscope stage 3 and the collecting device 2 allow exact positioning with a precision in the nanometer range and an automatic implementation of micromanipulation processes.
  • the motorized microscope stage 3 can be moved along two linear axes (x and y direction).
  • stepper motors are preferably provided so that typically a minimum step size of 20 nm is ensured.
  • the object support means located on the support table 3 can thus be positioned with very high accuracy relative to the optical axis of the objective 18.
  • the collecting device 2 serves to capture biological objects transferred from the support table 3 or the object carrier.
  • the motorized collecting device 2 can also be moved both in the x and in the y direction.
  • a mobility in z-direction is provided.
  • stepper motors are provided, which typically have the same precision as the stepper motors of the support table 3.
  • the microscope 1 is equipped with a camera, in particular a CCD camera, which receives the area of the support table 3, which is provided for receiving the object carrier means.
  • the camera picks up the image via the objective 18 of the microscope 1.
  • the video signal of the camera is supplied to a computer system 7, which may be, for example, a commercially available personal computer.
  • the video signal is processed, for example, by means of a so-called frame grabber card and converted into an image in a digital format, which is suitable for further processing in the computer system 7.
  • a digitally configured camera so that a digital video signal is generated which is directly suitable for further processing in the computer system 7.
  • the of the Camera recorded images can be displayed in real time on a screen 8 of the computer system 7.
  • the computer system 7 also has the function of a control system.
  • the computer system 7 has a corresponding interface card, which generates control signals, via which an automatic control of the laser device 4, the microscope 1, the collecting device 2 and the support table 3 is possible.
  • control signals via which an automatic control of the laser device 4, the microscope 1, the collecting device 2 and the support table 3 is possible.
  • input means such as a keyboard 9 or a computer mouse 10
  • the computer system 7 may have the function of an image recognition system to enable automated identification and selection of objects.
  • a correspondingly designed image recognition and image analysis software is provided.
  • the method includes generating an image of at least a portion of the biological mass. Such a figure 20 is shown by way of example in FIG.
  • the figure shows various structures, which may be single cells, cell colonies, cell components or the like.
  • these structures are selected as objects, the biological mass cut by irradiation with the laser beam to separate the selected object or objects from the biological mass, and the selected object or objects by irradiation transferred to the laser beam to the collecting device 2.
  • the accuracy required to evaluate the image or to cut the mass as well as the accuracy required to transfer the selected object or objects, it will automatically switch between the different lenses 18.
  • An example of the basic procedure of the method is shown schematically in FIG.
  • a first step 100 an overview image of the biological mass is generated with a lens which has a comparatively low magnification in the
  • step 110 in the areas identified in step 100, a re-imaging of the biological mass at a higher magnification in the range of ten times to 100 times magnification occurs.
  • lenses 18 with a magnification of 20x, 63x or 100x can be used here.
  • an automatic change of the lens 18 and a subsequent refocusing takes place.
  • the lens change can be initiated manually by the user or an automatic change of the lens can be manually suppressed by the user.
  • the automatic change of the lens is initiated by the image recognition system.
  • Step 110 may be repeated with successively higher magnification lenses 18 until the accuracy needed to evaluate the image is achieved. The step 110 thus enables an evaluation with an increased information content compared to the overview image of the step 100.
  • step 120 a repeated evaluation is carried out, in which optionally other criteria are used than in the evaluation of step 110.
  • the structures identified and selected in step 110 may be subjected to a repeated identification. This could be done, for example, a further investigation by means of fluorescence or autofluorescence.
  • supplementary data could be superimposed on the image, eg vibration spectroscopy data or data of an image in the infrared range with principal component analysis.
  • step 120 becomes dependent changed from the required accuracy for the evaluation of the lens 18 and optionally again generates an image.
  • the method may be continued with a renewed execution of step 110, for example if the checking evaluation of step 120 results in deviations from the evaluation of step 110. Step 120 thus forms a verification or rectification stage.
  • step 130 processing of the biological mass by means of the laser beam is carried out by cutting out the identified and selected objects from the biological mass and transferring them to the collecting device 2.
  • an automatic change of the objective 18 takes place depending on the accuracy required for cutting the biological mass.
  • an adaptation to the required accuracy can also be carried out during the final transfer of the selected objects by laser irradiation by an automatic change of the objective 18. The procedure for cutting out the selected objects and then transferring the objects will be explained below by way of example with reference to FIGS. 4 and 5.
  • FIG. 4 shows a detail of a biological mass image in which different identified structures 30, 32, 42, 44 and 46 can be seen, with structures 30, 32, 42, 44 and 46 identified in the manner previously discussed were.
  • the structures 30, 42 and 46 were selected for further processing, i. These selected objects are to be cut out of the biological mass and transferred to the collecting device 2.
  • the problem here is that the structures 42 and 46 are closely adjacent to the structure 30.
  • the method provides to generate the portions of a cut line S for cutting out the object 30 which are closely adjacent to the objects 42 and 46 using a correspondingly selected lens 18, so that for this portion By selecting a higher magnification also a higher cutting accuracy is possible.
  • a lens 18 with a lower magnification is used, so that, on the one hand, a large area is available for processing and, on the other hand, a higher cutting speed can be achieved.
  • the detail of the picture, which can be displayed by means of the objective 18 with a higher magnification, is designated by A in FIG.
  • the sections of the section line S, which are generated by means of a lens 18 at a lower magnification, for example, 20x or 40x magnification are shown in Fig. 4 as a solid line, while the portions of the section line S, which by means of a lens 18 with higher magnification, such as 63x or 100x magnification, are shown as dotted line lower strength.
  • Cut out of the object 30 is thus avoided. Furthermore, it can be prevented that when cutting out of the object 30 parts of the objects 42 and 46 are accidentally cut out, so that as a result, a higher purity of the separated biological material is achieved.
  • the cutting line S can be generated in such a way that the biological mass and the laser beam are moved relative to each other by means of the support table 3, so that the laser beam describes a closed or approximately closed line around the object 32, wherein at the transitions between the sections Cutting line, which are generated with different magnifying lenses 18, an automatic change of the lens 18 used takes place.
  • FIG. 5 shows the same section of an image of the mass which corresponds to a time after the object 30 has been transferred to the collecting device 2.
  • FIG. 5 another sectional lines S 'and S' shown, through which the objects are to be 42 and 46, respectively excised from the biological material.
  • the laser beam is again directed to a corresponding target point of the objects 42 and 46 and activated for a predetermined period of time, so that the objects 42 and 46 are transferred to the catching device 2 by catapulting
  • the small size of the objects 42 and 46 this is done by means of the higher magnifying lens 18.
  • the parameters for generating the laser beam eg power or pulse frequency, are adapted to the magnification of the lens 18 used.
  • FIGS. 4 and 5 provide, by way of example, the use of two objectives 18 with different magnifications.
  • two objectives 18 with different magnifications.
  • even finer gradations can be provided by using a larger number of different objectives.
  • such lenses are used which are also already used in generating the images in the method according to FIG. 3.
  • the following table shows, by way of example, the cutting widths which are achieved for a biological mass on a polymer film for objectives of different magnifications.
  • the "outside” cutting width means the distance of the cut from edge to edge, including an area where the film is thrown or deformed
  • “inside” indicates the width of the cut in the biological mass.
  • the latter value is crucial for the separation of the mass. Taking into account the fact that the objects to be separated can be structures whose diameter is less than 10 ⁇ m, a considerable improvement in the selectivity is achieved, for example, by changing the objective from 40 ⁇ magnification to 63 ⁇ magnification ,

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls sowie eine entsprechend ausgestaltete Vorrichtung. Das Verfahren beruht darauf, eine Abbildung zumindest eines Teils der Masse zu erzeugen, die Abbildung auszuwerten, um darin mindestens ein Objekt (30, 42, 46) der Masse auszuwählen, und die Masse durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl zu schneiden, um das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) von der Masse zu separieren, und/oder das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) von der Masse zu einer Auffangvorrichtung zu transferieren, wobei das Erzeugen der Abbildung und/oder das Schneiden der Masse mittels eines optischen Objektivs (18) erfolgt. Um die Genauigkeit des Verfahrens zu verbessern, ist dabei vorgesehen, das optische Objektiv automatisch abhängig von der zum Auswerten der Abbildung oder zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit zu wechseln. Dabei können insbesondere Schnittlinien (S) um das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) herum erzeugt werden, die mittels unterschiedlich vergrößernder optischer Objektive erzeugt wurden und somit unterschiedliche Schnittbreiten aufweisen.

Description

Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls und entsprechende Vorrichtung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bearbeitung einer Masse, insbesondere einer biologischen Masse, mittels eines Laserstrahls sowie eine entsprechend ausgestaltete Vorrichtung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur effektiveren Bearbeitung, Separierung und/oder Gewinnung von mikroskopisch kleinen biologischen und/oder nicht biologischen Objekten aus einer Masse und eine zu diesem Zweck ausgestaltete Vorrichtung.
Für eine Vielzahl von biologischen Untersuchungen ist es erforderlich, einzelne Zellen, Zellkolonien, Zellbestandteile oder vergleichbare Strukturen aus einer Masse, wie zum Beispiel einem Zellverband, einem Gewebe oder einem histologischen Gewebepräparat, herauszupräparieren. Dies kann beispielsweise mit mechanischen Mikrowerkzeugen z.B. Mikrokapillaren oder Mikronadeln, erfolgen. Eine solche Vorgehensweise ist jedoch mühsam und es besteht eine Kontaminationsgefahr für die herausgelösten Objekte. Ferner bestehen bei einem solchen Verfahren Probleme hinsichtlich der Präzision, Automatisierbarkeit und Reproduzierbarkeit.
In der WO 97/29355 A der Anmelderin wurde daher ein neuartiges Verfahren zum Sortieren und zur Gewinnung von einzelnen biologischen Objekten vorgeschlagen.
Für dieses Verfahren ist die biologische Masse, aus welcher die Objekte gewonnen werden, auf einem Träger angeordnet. Ein ausgewähltes biologisches Objekt wird von der umgebenden weiteren biologischen Masse durch einen Laserstrahl abgetrennt, so dass das ausgewählte biologische Objekt von der weiteren biologischen Masse freipräpariert ist. Das somit freipräparierte biologische Objekt wird anschließend mit Hilfe eines Laserschusses durch einen katapultierartigen
Vorgang von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung transferiert, wobei es sich bei dieser Auffangvorrichtung beispielsweise um ein Auffang substrat handeln kann. Als
Träger der biologischen Masse kann beispielsweise eine Polymerfolie verwendet werden. Ein zu separierendes biologisches Objekt einer auf dem Träger aufgebrachten biologischen Masse wird somit zunächst ausgewählt, dann aus der biologischen Masse ausgeschnitten und anschließend durch einen Laser-induzierten Transportprozess zu der Auffangvorrichtung transferiert. Unter „biologischen Objekten" werden im Rahmen der vorliegenden Anmeldung vor allem lebende oder fixierte biologische Zellen, Zellbestandteile oder Zellkolonien verstanden, welche in einem flüssigen oder festen biologischen Material, wie zum Beispiel einem Zellgewebe, einem Abstrich, einer Zellkultur oder dergleichen enthalten sind.
Mit Hilfe des zuvor beschriebenen Verfahrens können bestimmte Objekte aus einer biologischen Masse gezielt herausgelöst oder ausgesondert werden. Die biologischen Objekte können nebeneinander auf einem festen planaren Träger aufgebracht sein, wobei der Vorgang des Herauslösens oder Aussonderns innerhalb kurzer Zeit und berührungslos durchgeführt werden kann. Die Überlebensfähigkeit und Morphologie der biologischen Objekte bleibt erhalten, d.h. die biologischen Objekte werden durch den Abtrennprozess und den Laser-induzierten Transportprozess nicht geschädigt oder beeinträchtigt.
Bei dem zuvor genannten Verfahren erfolgt die Bearbeitung der biologischen Masse allgemein derart, dass zunächst eine Abbildung der biologischen Masse erzeugt wird und darin das zu separierende Objekt oder die zu separierenden Objekte ausgewählt werden. Zu diesem Zweck wird eine Mikroskopanordnung verwendet, welche mittels eines vergrößernden optischen Objektivs die Abbildung der Masse erzeugt. Bei der anschließenden Bearbeitung der Masse mittels des Laserstrahls sowie für das Transferieren des Objekts von der Masse zu der Auffangvorrichtung wird der
Laserstrahl durch das optische Objektiv auf die Masse gerichtet. Die Positionierung des Laserstrahls auf der Masse erfolgt durch eine entsprechende relative Bewegung des Trägers, auf welchem sich die Masse befindet, und des Objektivs. Es wird somit für das Erzeugen der Abbildung, das Schneiden der Masse sowie für das Transferieren des Objekts dasselbe optische Objektiv verwendet.
Die Verwendung desselben optischen Objektivs für das Erzeugen der Abbildung, für das Schneiden der Masse sowie zum Transferieren des Objekts ist jedoch mit bestimmten Problemen verknüpft. Beispielsweise können Probleme auftreten, wenn zur Identifizierung des Objekts ein optisches Objektiv benötigt wird, welches eine geringe Vergrößerung aufweist, damit beispielsweise die Gesamtstruktur und das Umfeld des Objekts sicher erkannt werden können, das Objekt jedoch im Anschluss mit einer hohen Präzision auszuschneiden ist, da es beispielsweise sehr nahe an weiteren Objekten liegt, die bei dem Ausschneidevorgang von der Schnittlinie nicht berührt werden dürfen. Weiterhin können Probleme bestehen, wenn Objekte identifiziert und zum anschließenden Separieren ausgewählt werden, die nur eine sehr geringe Größe aufweisen, so dass ein zuverlässiges Ausschneiden und/oder Transferieren des Objekts nicht möglich ist. Schließlich ist es auch möglich, dass mit dem optischen Objektiv eine zuverlässige Identifikation von Objekten nicht möglich ist, weil beispielsweise bestimmte Strukturen mit der vorgegebenen Vergrößerung nicht erkennbar sind.
Angesichts der oben genannten Probleme liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls sowie eine entsprechend ausgestaltete Vorrichtung zu schaffen, welches eine verbesserte Genauigkeit, eine höhere Zuverlässigkeit und eine hohe Flexibilität hinsichtlich der Art und Struktur der zu separierenden Objekte bietet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 sowie durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 12. Die abhängigen Patentansprüche definieren bevorzugte oder vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls umfasst einen Schritt zum Erzeugen einer Abbildung zumindest eines Teils der Masse, ein Auswerten der Abbildung, um darin mindestens ein Objekt der Masse auszuwählen, ein Schneiden der Masse durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl, um das ausgewählte Objekt von der Masse zu separieren, und/oder ein Transferieren des ausgewählten Objekts von der Masse zu einer Auffangvorrichtung, wobei das Erzeugen der Abbildung und/oder das Schneiden der Masse mittels eines optischen Objektivs erfolgt. Erfindungsgemäß umfasst das Verfahren darüber hinaus einen Schritt zum automatischen Wechseln des optischen Objektivs abhängig von der zum Auswerten der Abbildung oder zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit.
Auf diese Weise wird erreicht, dass die Vergrößerung des optischen Objektivs auf vorteilhafte Weise an die Erfordernisse des jeweils durchgeführten Verfahrensschritts angepasst werden kann. So ist es beispielsweise möglich, zunächst mit einer geringen Vergrößerung eine Übersichtsabbildung der biologischen Masse zu erzeugen, um dann anschließend mit einer höheren Vergrößerung Objekte in der Masse zu identifizieren und durch Laserbestrahlung von der Masse zu separieren. Weiterhin ist es möglich, wenn das ausgewählte Objekt sich eng benachbart zu einem weiteren Objekt oder einem Bereich befindet, welcher durch die Schnittlinie beim Ausschneiden des ausgewählten Objekts nicht beschädigt oder anderweitig beeinträchtigt werden soll, für den Vorgang des Schneidens der Masse auf ein optisches Objektiv mit einer höheren Vergrößerung zu wechseln, so dass eine genauere Positionierung und stärkere Fokussierung des Laserstrahls während des Schneidevorgangs erfolgen kann. Gleichzeitig ist es in unkritischen Bereichen der Schnittlinie, d.h. wenn sich in der Nähe der Schnittlinie keine solchen weiteren Objekte oder Bereiche befinden, auf ein optisches Objektiv mit einer geringeren Vergrößerung zu wechseln, so dass eine erhöhte Schnittgeschwindigkeit erreicht werden kann. Folglich kann die Schnittlinie, welche das ausgewählte Objekt vorzugsweise annähernd vollständig oder vollständig umschließt, Abschnitte aufweisen, welche mittels unterschiedlich vergrößernder optischer Objektive erzeugt wurden und somit eine unterschiedliche „Schnittgenauigkeit" aufweisen.
Das Auswerten der Abbildung kann automatisiert oder manuell durch den Benutzer erfolgen, wobei in dem Fall, dass der erzeugten Abbildung die zum Auswerten erforderliche Genauigkeit fehlt, von einer Bildverarbeitungseinrichtung oder von dem
Benutzer entsprechend ein automatischer Wechsel des optischen Objektivs veranlasst wird. Anschließend wird erneut eine Abbildung mit einer höheren
Vergrößerung erzeugt, und daran eine erneute oder ergänzende Auswertung vorgenommen. Diese Vorgänge können wiederholt werden, bis die erforderliche
Genauigkeit, insbesondere im Hinblick auf die im Anschluss durchzuführenden
Laser-Bearbeitungsschritte, erreicht ist.
Nach dem Auswerten der Abbildung oder der Abbildungen kann ein automatischer Wechsel des optischen Objektivs auf die zum Schneiden der Masse geeignete
Vergrößerung erfolgen. Darüber hinaus können auch abhängig von der zum
Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit während des Schneidevorgangs automatische Wechsel des optischen Objektivs vorgenommen werden. In diesem
Zusammenhang ist es zum einen möglich, die verschiedenen Abschnitte der Schnittlinie entsprechend ihrer Reihenfolge entlang der Schnittlinie zu erzeugen, wobei an den Übergängen zwischen den verschiedenen Abschnitten der Schnittlinien jeweils ein entsprechender automatischer Wechsel des optischen Objektivs erfolgt. Weiterhin ist es möglich, zunächst die zu einem optischen Objektiv mit einer bestimmten Vergrößerung gehörenden Abschnitte der Schnittlinie zu erzeugen, dann einen automatischen Wechsel des optischen Objektivs vorzunehmen, und anschließend die zum nunmehr verwendeten optischen Objektiv gehörenden Abschnitte der Schnittlinie zu erzeugen, und so weiter. In dem letzteren Fall kann die Anzahl von erforderlichen Objektivwechseln verringert werden.
Darüber hinaus ist es auch vorteilhaft, einen automatischen Wechsel des optischen Objektivs abhängig von der zum Transferieren des Objekts erforderlichen Genauigkeit vorzunehmen. So kann beispielsweise zum Transferieren eines Objekts mit nur geringer Größe ein optisches Objektiv mit einer hohen Vergrößerung verwendet werden. Umgekehrt kann für ein vergleichsweise großes Objekt ein optisches Objektiv mit einer geringen Vergrößerung verwendet werden.
Zum Transferieren des ausgewählten Objekts wird vorzugsweise der Laserstrahl durch das jeweils ausgewählte optische Objektiv auf das Objekt gerichtet, und durch Aktivieren des Laserstrahls für eine vorgegebene Zeitdauer wird das ausgewählte Objekt zu der Auffangvorrichtung transferiert. Die Eigenschaften des Laserstrahls, z.B. Leistung oder Pulsfrequenz, werden vorzugsweise abhängig von dem zur Durchführung des Transferiervorgangs ausgewählten optischen Objektivs angepasst.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls umfasst eine Laserlichtquelle zum Erzeugen eines Laserstrahls, um durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl die Masse zu schneiden und/oder ein Objekt der Masse zu einer Auffangvorrichtung zu transferieren, und Abbildungsmittel zum Erzeugen einer Abbildung zumindest eines Teils der Masse, wobei zum Erzeugen der Abbildung und zum Richten des Laserstrahls auf die Masse ein optisches Objektiv vorgesehen ist. Erfindungsgemäß umfasst die Vorrichtung mindestens ein weiteres optisches Objektiv und Mittel zum automatischen Wechsel des optischen Objektivs abhängig von der Genauigkeit, welche zum Auswerten der Abbildung, um darin das Objekt auszuwählen, und/oder zum Schneiden der Masse, um das Objekt von der Masse zu separieren, erforderlich ist.
Die Vorrichtung ist vorzugsweise zur Durchführung des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens ausgestaltet. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
Fig. 1 zeigt einen prinzipiellen Aufbau einer Vorrichtung zur Realisierung der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 zeigt beispielhaft eine Abbildung einer biologischen Masse.
Fig. 3 zeigt ein Ablaufdiagramm für ein Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Fig. 4 zeigt einen Ausschnitt einer Abbildung der Masse, bei welcher eine Schnittlinie mit Abschnitten unterschiedlicher Genauigkeit erzeugt wird, um ein Objekt von der Masse zu separieren.
Fig. 5 zeigt einen Ausschnitt einer weiteren Abbildung der Masse, bei welcher Schnittlinien mit erhöhter Genauigkeit erzeugt werden, um weitere Objekte von der Masse zu separieren.
Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau eines Laser-Mikroskop-Systems oder Laser- Mikrodissektionssystems, welches zur Implementierung der vorliegenden Erfindung ausgestaltet ist. Das System ist modular aufgebaut und kann somit an unterschiedliche experimentelle Anforderungen individuell angepasst werden. Bei dem dargestellten Laser-Mikroskop-System handelt es sich insbesondere um ein inverses Laser-Mikrodissektionssystem zum Separieren, d.h. Herauslösen von biologischen Objekten, z. B. einzelnen Zellen, Zellkolonien oder Zellbestandteilen, aus einem biologischen Material bzw. Präparat, wobei die Erfindung jedoch selbstverständlich nicht auf diese bevorzugte Ausgestaltung beschränkt ist. Die Erfindung kann beispielsweise auch mit aufrechten Laser-Mikroskop-Systemen oder bei der Bearbeitung nichtbiologischer Materialien angewendet werden.
Wesentlicher Bestandteil des in Fig. 1 dargestellten Systems ist eine Laservorrichtung 4, in der eine Laserlichtquelle zur Erzeugung eines Laserstrahls untergebracht ist. Des Weiteren ist in der Laservorrichtung 4 eine Optik 5, 6 untergebracht, welche dazu dient, den Laserstrahl in ein Mikroskop 1 einzukoppeln und den Laserfokus in der Objektebene auf den optischen Fokus des Mikroskops 1 abzustimmen. Im vorliegenden Fall handelt es sich um einen gepulsten UV- Stickstofflaser, dessen Wellenlänge z. B. 300 nm und dessen Pulsenergie z.B. 270 mJ beträgt. Die Pulsdauer beträgt z. B. 3 ms, während die Pulsfrequenz zwischen 1- 1000 Impulse pro Sekunde einstellbar ist. Vorzugsweise wird eine Pulsfrequenz um 100 verwendet.
Der Stickstofflaser emittiert einen Laserstrahl mit einer festen Laserenergie. Für eine präzise Laser-Mikromanipulation und Laser-Mikrodissektion ist eine genaue Einstellbarkeit der Laserenergie erforderlich. Aus diesem Grund ist ein Abschwächerrad 5 senkrecht zum Laserstrahlpfad angeordnet. Dieses Abschwächerrad wird von einem Gleichstrommotor gedreht, welcher über einen Potentiometerknopf (nicht dargestellt) gesteuert werden kann, um somit die Laserenergie entsprechend einzustellen.
Neben der Einstellung der Laserenergie kann auch der Laserfokus unabhängig von dem Mikroskopfokus eingestellt werden, d.h. der Brennpunkt des Lasers kann in z-
Richtung relativ zur Objektebene des Mikroskops 1 verschoben werden. Zu diesem
Zweck ist ein Schrittmotor vorgesehen, der die in Fig. 1 gezeigten Linsen 6 bewegt.
Die Fokussierung bzw. der Schrittmotor kann wiederum durch einen
Potentiometerknopf gesteuert werden. Weiterhin ist auch eine automatisierte Fokussierung vorgesehen.
Der Laserstrahl wird über mehrere beschichtete Strahlteiler in das Mikroskop 1 eingekoppelt und zu einem optischen Objektiv 18 hin abgelenkt. Der Durchmesser des auf der Objektebene auftretenden Laserstrahls ist maßgeblich von der numerischen Apertur des Objektivs 18 abhängig. Ein Objektiv mit einer relativ hohen numerischen Apertur ermöglicht Laserstrahldurchmesser von weniger als 1 μm.
Das in Fig. 1 dargestellte Laser-Mikroskopsystem ist mit einem Mechanismus zum automatischen Wechsel des Objektivs 18 ausgestaltet. Dabei kann es sich insbesondere um einen Revolvermechanismus handeln, wobei selbstverständlich auch andere Mechanismen zum automatischen Wechsel des Objektivs 18 verwendet werden können. Insbesondere sind automatisch auswechselbare Objektive 18 mit Vergrößerungen von 2x, 5x, 10x, 2Ox, 4Ox, 63x und 100x vorgesehen. Diese Objektive 18 sind derart ausgestaltet, dass sie einen hohe Durchlässigkeit für die verwendete Laserwellenlänge aufweisen, so dass Energieverluste minimiert werden. Der durch das Objektiv 18 geführte Laserstrahl trifft schließlich auf einen motorisierten und computergesteuerten Mikroskop- oder Trägertisch 3, auf dem ein Objektträgermittel mit einer zu bearbeitenden biologischen Masse angeordnet ist. Oberhalb des Trägertisches 3 befindet sich eine ebenfalls motorisierte und computergesteuerte Auffangvorrichtung 2. Der Mikroskoptisch 3 und die Auffangvorrichtung 2 ermöglichen eine exakte Positionierung mit einer Präzision im Nanometerbereich sowie eine automatische Durchführung von Mikromanipulationsvorgängen.
Der motorisierte Mikroskoptisch 3 ist entlang zweier linearer Achse (x- und y- Richtung) verfahrbar. Zu diesem Zweck sind vorzugsweise Schrittmotoren vorgesehen, so dass typischerweise eine minimale Schrittgröße von 20 nm gewährleistet wird. Das auf dem Trägertisch 3 befindliche Objektträgermittel kann somit mit sehr hoher Genautigkeit relativ zu der optischen Achse des Objektivs 18 positioniert werden.
Die Auffangvorrichtung 2 dient dazu, von dem Trägertisch 3 bzw. dem Objektträgermittel transferierte biologische Objekte aufzufangen. Die motorisierte Auffangvorrichtung 2 kann ebenfalls sowohl in x- als auch in y-Richtung verfahren werden. Zusätzlich ist eine Verfahrbarkeit in z-Richtung vorgesehen. Zu diesem Zweck sind Schrittmotoren vorgesehen, welche typischerweise dieselbe Präzision wie die Schrittmotoren des Trägertisches 3 aufweisen.
Das Mikroskop 1 ist mit einer Kamera, insbesondere einer CCD-Kamera ausgestattet, welche den Bereich des Trägertisches 3, welcher zur Aufnahme des Objektträgermittels vorgesehen ist, aufnimmt. Insbesondere nimmt die Kamera das Bild über das Objektiv 18 des Mikroskops 1 auf. Das Videosignal der Kamera wird einem Computersystem 7 zugeführt, bei welchem es sich beispielsweise um einen handelsüblichen Personal Computer handeln kann.
In dem Computersystem 7 wird das Videosignal beispielsweise mittels einer so genannten Framegrabber-Karte verarbeitet und zu einer Abbildung in einem digitalen Format konvertiert, welches zur weiteren Verarbeitung in dem Computersystem 7 geeignet ist. Selbstverständlich ist es auch möglich, einen digital ausgestaltete Kamera zu verwenden, so dass ein digitales Videosignal erzeugt wird, welches direkt zur weiteren Verarbeitung in dem Computersystem 7 geeignet ist. Die von der Kamera aufgenommenen Bilder können in Echtzeit auf einem Bildschirm 8 des Computersystems 7 dargestellt werden.
Das Computersystem 7 hat weiterhin die Funktion eines Steuersystems. Zu diesem Zweck verfügt das Computersystem 7 über eine entsprechende Schnittstellenkarte, welche Steuersignale erzeugt, über welche eine automatische Ansteuerung der Laservorrichtung 4, des Mikroskops 1 , der Auffangvorrichtung 2 und des Trägertisches 3 möglich ist. Zur Einstellung bzw. Auswahl dieser Funktionen sind für Computersysteme übliche Eingabemittel, wie beispielweise eine Tastatur 9 oder eine Computermaus 10, vorgesehen. Weiterhin kann das Computersystem 7 die Funktion eines Bilderkennungssystems aufweisen, um eine automatisierte Identifizierung und Auswahl von Objekten zu ermöglichen. Zu diesem Zweck ist eine entsprechend ausgestaltete Bilderkennungs- und Bildanalysesoftware vorgesehen.
Nachfolgend soll ein mit dem oben beschriebenen System durchzuführendes Verfahren zur Bearbeitung einer biologischen oder nicht biologischen Masse näher erläutert werden. Im Allgemeinen handelt es sich bei den beschriebenen Verfahrensschritten um automatisch durchgeführte Vorgänge, welche durch das Computersystem 7 durchgeführt oder gesteuert werden. Gegebenfalls werden jedoch auch Vorgänge manuell eingeleitet oder durchgeführt.
Das Verfahren beinhaltet ein Erzeugen einer Abbildung zumindest eines Teils der biologischen Masse. Eine solchen Abbildung 20 ist beispielhaft in Fig. 2 dargestellt.
In der Abbildung zeigen sich verschiedenartige Strukturen, bei welchen es sich um einzelne Zellen, Zellkolonien, Zellbestandteile oder dergleichen handeln kann. Im Verlauf des Verfahrens werden eine oder mehrere dieser Strukturen als Objekte ausgewählt, die biologische Masse durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl geschnitten, um das ausgewählte Objekt oder die ausgewählten Objekte von der biologischen Masse zu separieren, und das ausgewählte Objekt oder die ausgewählten Objekte durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert. Abhängig von der zum Auswerten der Abbildung oder zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit sowie abhängig von der zum Transferieren des ausgewählten Objekts oder der ausgewählten Objekte erforderlichen Genauigkeit wird automatisch zwischen den verschiedenen Objektiven 18 gewechselt. Ein Beispiel für den grundlegenden Ablauf des Verfahrens ist schematisch in Fig. 3 dargestellt.
In einem ersten Schritt 100 wird eine Übersichtsabbildung der biologischen Masse mit einem Objektiv erzeugt, welches eine vergleichsweise geringe Vergrößerung im
Bereich von einfacher bis fünffacher Vergrößerung aufweist. Zur Erzeugung der
Übersichtsabbildung können auch mehrere Abbildungen mosaikartig oder kachelartig zusammengesetzt werden. Durch Auswerten der Übersichtsabbildung werden darin
Bereiche identifiziert, die Strukturen enthalten, für welche eine genauere Auswertung vorgenommen werden soll. Weiterhin können auch bereits unmittelbar in der
Übersichtsabbildung zu bearbeitende Objekte identifiziert und ausgewählt werden, wenn die Art der Objekte dies zulässt.
Im Schritt 110 erfolgt in den in dem Schritt 100 identifizierten Bereichen eine erneute Abbildung der biologischen Masse mit einer höheren Vergrößerung im Bereich von zehnfacher bis 100-facher Vergrößerung. Insbesondere können hier Objektive 18 mit einer 20-fachen, 63-fachen oder 100-fachen Vergrößerung eingesetzt werden. Zu diesem Zweck erfolgt ein automatischer Wechsel des Objektivs 18 und eine anschließende Refokussierung. Bei rechnerunterstützer manueller Auswertung der Abbildung kann der Objektivwechsel manuell von dem Benutzer veranlasst werden oder ein automatischer Wechsel des Objektivs von dem Benutzer manuell unterdrückt werden. Bei automatisierter Auswertung der Abbildung auf Basis einer Bilderkennung wird der automatische Wechsel des Objektivs durch das Bilderkennungssystem veranlasst. Der Schritt 110 kann mit sukzessive höher vergrößernden Objektiven 18 wiederholt werden, bis die zum Auswerten der Abbildung erforderliche Genauigkeit erreicht ist. Der Schritt 110 ermöglicht somit eine Auswertung mit einem gegenüber der Übersichtsabbildung des Schritts 100 gesteigerten Informationsgehalt.
Im Schritt 120 erfolgt eine wiederholte Auswertung, bei welcher gegebenenfalls andere Kriterien zugrunde gelegt werden als bei der Auswertung des Schritts 110. Insbesondere können die in dem Schritt 110 identifizierten und ausgewählten Strukturen einer nochmaligen Identifizierung unterworfen werden. Hierbei könnte beispielsweise eine weitere Untersuchung mittels Fluoreszenz oder Autofluoreszenz erfolgen. Weiterhin könnten ergänzende Daten der Abbildung überlagert werden, z.B. Schwingungsspektroskopiedaten bzw. Daten einer Abbildung im Infrarotbereich mit Hauptkomponentenanalyse. Auch im Rahmen des Schritts 120 wird abhängig von der zur Auswertung erforderlichen Genauigkeit das Objektiv 18 gewechselt und gegebenenfalls erneut eine Abbildung erzeugt. Abhängig von dem Ergebnis des Schritts 120 kann das Verfahren mit einer erneuten Ausführung des Schritts 110 fortgesetzt werden, z.B. wenn die überprüfende Auswertung des Schritts 120 Abweichungen von der Auswertung des Schritts 110 ergibt. Der Schritt 120 bildet somit eine Überprüfungs- oder Rektifikationsstufe.
Anschließend erfolgt in dem Schritt 130 eine Bearbeitung der biologischen Masse mittels des Laserstrahls, indem die identifizierten und ausgewählten Objekte aus der biologischen Masse ausgeschnitten und zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert werden. Im Rahmen des Schritts 130 erfolgt ein automatischer Wechsel des Objektivs 18 abhängig von der zum Schneiden der biologischen Masse erforderlichen Genauigkeit. Weiterhin kann auch beim abschließenden Transferieren der ausgewählten Objekte durch Laserbestrahlung durch einen automatischen Wechsel des Objektivs 18 eine Anpassung an die dabei erforderliche Genauigkeit vorgenommen werden. Die Vorgehensweise beim Ausschneiden der ausgewählten Objekte und anschließenden Transferieren der Objekte soll nachfolgend anhand von Fig. 4 und 5 beispielhaft erläutert werden.
Fig. 4 zeigt einen Ausschnitt aus einer Abbildung der biologischen Masse, in welchem unterschiedliche identifizierte Strukturen 30, 32, 42, 44 und 46 zu erkennen sind, wobei die Strukturen 30, 32, 42, 44 und 46 wurden auf die vorhergehend erläuterte Weise identifiziert wurden. Die Strukturen 30, 42 und 46 wurden zur weitergehenden Bearbeitung ausgewählt, d.h. diese ausgewählten Objekte sollen aus der biologischen Masse ausgeschnitten und zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert werden.
Hierbei zeigt sich jedoch das Problem, dass die Strukturen 42 und 46 eng benachbart zu der Struktur 30 liegen. Aus diesem Grund sieht das Verfahren vor, den oder die Abschnitte einer Schnittlinie S zum Ausschneiden des Objekts 30, welcher bzw. welche eng benachbart zu den Objekten 42 und 46 sind, unter Verwendung eines entsprechend ausgewählten Objektivs 18 zu erzeugen, so dass für diesen Abschnitt durch Auswahl einer höheren Vergrößerung auch eine höhere Schnittgenauigkeit möglich ist. In den übrigen Abschnitten der Schnittlinie S wird hingegen mit einem Objektiv 18 mit geringerer Vergrößerung gearbeitet, so dass zum einen eine große Fläche zur Bearbeitung verfügbar ist und zum anderen eine höhere Schnittgeschwindigkeit erreicht werden kann. Der Ausschnitt der Abbildung, welcher mittels des Objektivs 18 mit höherer Vergrößerung darstellbar ist, ist in Fig. 4 mit A bezeichnet. Die Abschnitte der Schnittlinie S, welche mittels eines Objektivs 18 mit geringerer Vergrößerung, z.B. 20-facher oder 40-facher Vergrößerung erzeugt werden, sind in Fig. 4 als durchgezogene Linie dargestellt, während die Abschnitte der Schnittlinie S, welche mittels eines Objektivs 18 mit höherer Vergrößerung, z.B. 63-facher oder 100-facher Vergrößerung erzeugt werden, als gepunktete Linie geringere Stärke dargestellt sind.
Durch Verwendung eines Objektivs 18 mit höherer Vergrößerung in unmittelbarer Nähe der Objekte 42 und 46 wird erreicht, dass die Schnittlinie S in diesem Bereich eine geringere Breite aufweist. Eine Beschädigung der Objekte 42 und 46 beim
Ausschneiden des Objekts 30 wird somit vermieden. Weiterhin kann verhindert werden, dass beim Ausschneiden des Objekts 30 versehentlich Teile der Objekte 42 und 46 mit ausgeschnitten werden, so dass im Ergebnis auch eine höhere Reinheit des separierten biologischen Materials erzielt wird.
Die Schnittlinie S kann derart erzeugt werden, dass die biologische Masse und der Laserstrahl mittels des Trägertisches 3 derart relativ zueinander bewegt werden, so dass der Laserstrahl einen geschlossenen oder annähernd geschlossenen Linienzug um das Objekt 32 herum beschreibt, wobei an den Übergängen zwischen den Abschnitten der Schnittlinie, welche mit unterschiedlich vergrößernden Objektiven 18 erzeugt werden, ein automatischer Wechsel des verwendeten Objektivs 18 erfolgt. Alternativ ist es möglich, zunächst die Abschnitte der Schnittlinie S zu erzeugen, welche mittels des geringer vergrößernden Objektivs 18 erzeugt werden, und anschließend die Abschnitte der Schnittlinie S zu erzeugen, welche mittels des höher vergrößernden Objektivs 18 erzeugt werden, oder umgekehrt. Bei letzterer Vorgehensweise wird die Anzahl der erforderlichen Objektivwechsel minimiert. Im Anschluss an einen automatischen Wechsel des Objektivs 18 erfolgt allgemein eine automatische Refokussierung des Laserstrahls auf die Objektebene.
Nach Erzeugung der Schnittlinie S um das Objekt 30 herum wird der Laserstrahl auf einen Zielpunkt des Objekts 30 gerichtet und für eine vorgegebene Zeitdauer aktiviert, so dass das ausgeschnittene bzw. freipräparierte Objekt 30 durch einen katapultierartigen Vorgang zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert wird. Zu diesem Zweck wird allgemein ein geringer vergrößerndes Objektiv 18 verwendet, z.B. mit 20- facher oder 40-facher Vergrößerung. Fig. 5 zeigt denselben Ausschnitt einer Abbildung der Masse, welche einem Zeitpunkt entspricht, nachdem das Objekt 30 zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert wurde. In Fig. 5 sind weitere Schnittlinien S' und S" dargestellt, durch welche die Objekte 42 bzw. 46 aus der biologischen Masse herauspräpariert werden sollen. Aufgrund der engen Nachbarschaft zueinander und zu der Struktur 44 ist für die Schnittlinien S' und S" eine Erzeugung mit einem höher vergrößernden Objektiv 18, z.B. mit 63-facher oder 100-facher Vergrößerung, vorgesehen. Dies ist in Fig. 5 durch gepunktete Linien um die Objekte 42 und 46 herum veranschaulicht.
Nach Erzeugung der Schnittlinien S' und S" wird wiederum der Laserstrahl jeweils auf einen entsprechenden Zielpunkt der Objekte 42 und 46 gerichtet und für eine vorbestimmte Zeitdauer aktiviert, so dass die Objekte 42 und 46 durch einen katapultierartigen Vorgang zu der Auffangvorrichtung 2 transferiert werden. Aufgrund der geringen Größe der Objekte 42 und 46 erfolgt dies jedoch mittels des höher vergrößernden Objektivs 18. Die Parameter zur Erzeugung des Laserstrahls, z.B. Leistung oder Pulsfrequenz, werden an die Vergrößerung des verwendeten Objektivs 18 angepasst.
Die anhand von Fig. 4 und 5 erläuterten Bearbeitungsvorgänge sehen beispielhaft die Verwendung von zwei Objektiven 18 mit unterschiedlicher Vergrößerung vor. Selbstverständlich können hinsichtlich der erforderlichen Schnittgenauigkeit auch feinere Abstufungen vorgesehen sein, indem eine größere Anzahl unterschiedlicher Objektive verwendet wird. Vorzugsweise werden beim Ausschneiden und Transferieren der Objekte solche Objektive verwendet, welche auch bereits beim Erzeugen der Abbildungen in dem Verfahren gemäß Fig. 3 verwendet werden.
In der nachfolgenden Tabelle sind beispielhaft die Schnittbreiten angegeben, welche für eine biologische Masse auf einer Polymerfolie für Objektive unterschiedlicher Vergrößerung erreicht werden.
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
In der Tabelle bedeutet die mit „außen" bezeichnete Schnittbreite den Abstand des Schnitts von Rand zu Rand einschließlich eines Bereichs, in welchem sich die Folie aufwirft bzw. verformt. Mit „innen" ist die Breite des Schnitts in der biologischen Masse bezeichnet. Der letztere Wert ist für die Durchtrennung der Masse ausschlaggebend. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass es sich bei den zu separierenden Objekten um Strukturen handeln kann, deren Durchmesser weniger als 10 μm beträgt, wird somit beispielsweise durch einen Wechsel des Objektivs von 40-facher Vergrößerung auf 63-fache Vergrößerung eine erhebliche Verbesserung der Trennschärfe erreicht.
Wird die biologische Masse einschließlich der Polymerfolie auf einem Objektträger der Dicke 0,17 mm gehalten, werden die in der nachfolgenden Tabelle beispielhaften Daten erreicht.
Figure imgf000016_0002
Es ist erkennbar, dass auch in diesem Fall der Wechsel des Objektivs zu einer höheren Vergrößerung zu einer erheblichen Verbesserung der Trennschärfe führt.
Es versteht sich, dass die oben angegebenen Werte abhängig sind von der Art der verwendeten Objektive und den zur Erzeugung des Laserstrahls verwendeten Parametern. Weiterhin ist auch die Art der zum Halten der biologischen Masse verwendeten Folie und die Art des verwendeten Objektträgers von Bedeutung. Es zeigt sich jedoch allgemein, dass durch einen Wechsel des Objektivs zu einer höheren Vergrößerung eine verbesserte Schnittgenauigkeit, d.h. eine geringere Breite der Schnittlinie, erreicht werden kann.

Claims

PAT E N TA N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls, umfassend die Schritte:
Erzeugen einer Abbildung (20) zumindest eines Teils der Masse, Auswerten der Abbildung (20), um darin mindestens ein Objekt (30, 42, 46) auszuwählen, und Schneiden der Masse durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl, um das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) von der Masse zu separieren, und/oder
Transferieren des ausgewählten Objekts (30, 42, 46) von der Masse zu einer Auffangvorrichtung (2), wobei das Erzeugen der Abbildung (20) und/oder das Schneiden der Masse mittels eines optischen Objektivs (18) erfolgt, gekennzeichnet durch einen Schritt zum automatischen Wechseln des optischen Objektivs (18) abhängig von der zum Auswerten der Abbildung (20) oder zum Schneiden der Masse erforderlichen Genauigkeit.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei zum Schneiden der Masse der Laserstrahl mittels des optischen Objektivs (18) auf die Masse fokussiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei nach dem automatischen Wechsel des optischen Objektivs (18) der Schritt zum Erzeugen einer Abbildung (20) mit einem höher vergrößernden optischen Objektiv (18) wiederholt wird, bis die zum Auswerten der Abbildung (20) erforderliche Genauigkeit erreicht ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Schneiden der Masse Steuersignale erzeugt werden, welche eine automatisierte relative Bewegung der Masse und des Laserstrahls bewirken, um so in der Masse eine Schnittlinie (S, S', S") hervorzurufen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei eine Schnittlinie (S, S', S")erzeugt wird, welche das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) im Wesentlichen vollständig umschließt.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei der automatische Wechsel des optischen Objektivs (18) im Verlauf der relativen Bewegung der Masse und des Laserstrahls erfolgt, so dass die Schnittlinie (S) Abschnitte aufweist, welche mittels unterschiedlich vergrößernder optischer Objektive (18) erzeugt wurden.
7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Schnittlinie abschnittsweise erzeugt wird, indem der automatische Wechsel des optischen Objektivs (18) erst dann erfolgt, wenn alle Abschnitte der Schnittlinie (S) erzeugt sind, für welche die Erzeugung mittels dieses optischen Objektivs (18) vorgesehen ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-7, wobei die Vergrößerung des zu einem Abschnitt der Schnittlinie (S) gehörenden optischen Objektivs (18) abhängig von einem Abstand des ausgewählten Objekts (30, 42, 46) zu einem benachbarten Objekt (30, 32, 42, 44, 46) der Masse im Bereich dieses Abschnitts gewählt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transferieren des ausgewählten Objekts (30, 42, 46) zu der Auffangvorrichtung (2) mittels des Laserstrahls erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei zum Transferieren des ausgewählte Objekts (30, 42, 44, 46) der Laserstrahl durch das optische Objektiv (18) auf das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) gerichtet wird und durch Aktivieren des Laserstrahls für eine vorgegebene Zeitdauer das ausgewählte Objekt (30, 42, 46) zu der Auffangvorrichtung (2) transferiert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, umfassend einen automatischen Wechsel des optischen Objektivs (18) abhängig von der zum Transferieren des ausgewählten Objekts (30, 42, 46) erforderlichen Genauigkeit.
12. Vorrichtung zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls, umfassend: eine Laserlichtquelle (4) zum Erzeugen eines Laserstrahls, um durch Bestrahlung mit dem Laserstrahl die Masse zu schneiden und/oder ein Objekt (30, 42, 46) der Masse zu einer Auffangvorrichtung (2) zu transferieren, und
Abbildungsmittel (1 ) zum Erzeugen einer Abbildung (20) zumindest eines TeIs der Masse, wobei die Vorrichtung zum Erzeugen der Abbildung (20) und zum Richten des Laserstrahls auf die Masse ein optisches Objektiv (18) umfasst, gekennzeichnet durch mindestens ein weiteres optisches Objektiv (18) und
Mittel zum automatischen Wechsel des zum Erzeugen der Abbildung bzw.
Richten des Laserstrahls auf die Masse verwendeten optischen Objektivs (18) abhängig von der Genauigkeit, welche zum Auswerten der Abbildung (20), um darin das Objekt (30, 42, 46) auszuwählen, und/oder zum Schneiden der Masse, um das
Objekt (30, 42, 46) von der Masse zu separieren, erforderlich ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die optischen Objektive (18) der Vorrichtung unterschiedliche Vergrößerungen aufweisen.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Vorrichtung wenigstens ein optisches Objektiv (18) mit einer Vergrößerung im Bereich von einfacher bis zehnfacher Vergrößerung umfasst.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-14, wobei die Vorrichtung wenigstens ein optisches Objektiv (18) mit einer Vergrößerung im Bereich von 60-facher bis 100-facher Vergrößerung umfasst.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-15, wobei die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-11 ausgestaltet ist.
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