CZ259297A3 - Pharmaceutical composition suitable for transfection of nucleic acid and the use of such composition for nucleic acid transfer - Google Patents
Pharmaceutical composition suitable for transfection of nucleic acid and the use of such composition for nucleic acid transfer Download PDFInfo
- Publication number
- CZ259297A3 CZ259297A3 CZ972592A CZ259297A CZ259297A3 CZ 259297 A3 CZ259297 A3 CZ 259297A3 CZ 972592 A CZ972592 A CZ 972592A CZ 259297 A CZ259297 A CZ 259297A CZ 259297 A3 CZ259297 A3 CZ 259297A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pharmaceutical composition
- composition according
- nucleic acid
- compound
- cooh
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Farmaceutická kompozice vhodná pro transfekcí nukleové kyseliny a použití této kompozice pro přenos nukleové kyse-ti-fi-y»—
Oblast techniky J Λ13, N i st ~ι Λ ,S ΑΙΑ) Qyd a vy o
Vynález se týká oblasti genové terapie a zajímá sě ~j zejména o přenos in vitro, ex vivo nebo/a in vivo genet£<g- χ| £ g kého materiálu. Vynález poskytuje novou farmaceutickou kompo- j zici vhodnou pro účinnou transfekcí buněk. Vynález se^ rox^-ú^Q něž týká použití uvedené farmaceutické kompozice. s ... .. _ |
Z ! h 9 4 i i
Dosavadní stav techniky ’ .p3 ’
Chromosomální nedostatečnosti nebo anomálie (mutace, aberantní exprese, a podobně) představují původ četných nemocí dědičného nebo nedědiěného charakteru. V tomto ohledu bylo konvenční lékařství dlouho bezmocné. V současné době, kdy dochází k rozvoji genové terapie, je naděje, že bude napříště možné korigovat uvedený typ chromosomální aberace nebo mu dokonce předcházet. Tato nová medikace spočívá v zavedení genetické informace do zasažené buňky nebo do zasaženého orgánu s cílem korigovat výše uvedenou nedostatečnost nebo anomáli anebo zde exprimovat protein zainteresovaného genu.
Hlavní překážkou při pronikání nukleové kyseliny do cílové buňky nebo do cílového orgánu je velikost a polyaniontový charakter této nukleové kyseliny, které jsou na závadu uspokojivého průchodu nukleové kyseliny skrze buněčné membrány.
Za účelem odstranění těchto překážek byly v současné době navrženy různé techniky, z nichž lze zejména uvést transfekcí holé DNA skrze plasmovou membránu in vivo (WO90/ 11092) a transfekcí DNA pomocí transfekčního vektoru.
Pokud jde o transfekcí holé DNA, je účinnost takové transfekce stále ještě nízká. Holé nukleové kyseliny mají krátkou dobu životnosti vzhledem k jejich degradaci enzymy a jejich vylučování močovými cestami.
Z toho důvodu technika navrhuje dvě principielně rozdílné strategie:
První používá přírodní vektory transfekce, kterými jsou viry. Je také navrženo používání adenovirů, oparových virů, retrovirů a sdružených adenovirů. Tyto vektory se jeví jako výhodné v samotné transfekcí, ale naneštěstí se nemůže úplně vyloučit jisté patogeního riziko, replikacenebo/a riziko imunogenní vlastní jejich virové povaze.
Druhá strategie výhodně spočívá v použití nevirových činitelů schopných podporovat přenos a expresi DNA v buňce eukariontů.
Předložený vynález se věnuje zejména této druhé metodě.
Podstata vynálezu
Chemické nebo biochemické vektory znamenají výhodnou alternativu přírodních virů zvláště pro absenci imunologické odezvy nebo virové rekombinování. Tyto vektory nemaj í patogenní schopnost, riziko multiplikace DNA uprostřed těchto vektorů není žádné. Vektor není omezem žádnou teoretickou hranicí, co se týče velikosti DNA k transfekcí.
Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce, kondenzovat transfekční DNA a podporovat buněčné vázání, stejně jako přechod skrze plazmovou membránu, případně dvě jaderné membrány.
Polyanionické části DNA přirozeně nemají žádnou afinitu pro plazmovou membránu buněk, také polyanionických. Z tohoto důvodu pro odstranění této nevýhody mají nevirové vektory všeobecně náboje polykationické.
Mezi vyvinuté syntetické vektory patří kationické polymery typu polylysin a DEAE dextran nebo ještě kationické lipidy nebo lipofektanty, které jsou nejvíce vhodné. Mají vlastnosti kondenzované DNA a podporují svou vazbu s buněčnou membránou. Tato technika dává základ principu kondenzace DNA. Díky kationickému polymeru se komplex fixuje k membráně pomocí chemické vazby mezi polymerem kationickým a ligandem receptoru membrány, který je přítomný na povrchu buňky, a který se roubuje. Jsou také popsány receptoyr transferrinu, insulinu a receptory asoaloglykoproteinů hepatocytů. Syntetické vektory dnes navrhované jsou ještě daleko, aby byly známy stejně jako virové vektory. Tyto mají za důsledek nedostatečnou kondenzace DNA. S obtížnostmi se můžeme znovu setkat při penetraci DNA do buněčného jádra. Další nevýhody jsou přímo spojené s povahou kationických polymerů použitých lipofektantů.
Předložený vynález navrhuje řešení těchto problémů. Přesněji, předložený vynález se vztahuje k farmaceutické ompozici použité pro transfekci nukleové kyseliny. Tato kompozice se vyznačuje tím, že obsahují výše uvedenou nukleovou kyselinu, činitel transfekce a sloučeninu účinkující na úrovni kondenzace výše uvedené nukleové kyseliny. Výše uvedená sloučenina může být odvozená zcela nebo částečně od histonu, nukleolinu, proptaminu nebo/a jejich derivátů.
transfekčního vyplývájícím,
Neočekávaně se ukázalo, že přítomnost takovýchto sloučenin v kompozici značně dovolí snížit množství činitele s příznivým důsledkem, z toho bez jakéhokoliv snížení aktivity transfekce výše uvedené sloučeniny. Naopak, tyto látky dokonale umožňují transfekci.
Ve smyslu vynálezu sloučeniny působící na úrovni kondenzace nukleové kyseliny zahrnují sloučeniny zhušt ující nukleovou kyselinu, přímo nebo nepřímo. Tyto sloučeniny mohou působit přímo na úrovni transfektové nukleové kyseliny nebo působit na úrovni přidaných sloučenin, které jsou přímo dodávány při kondenzaci této nukleové kyseliny. Přednostně působí na úrovni nukleové kyseliny. Podle realizačního modelu vynálezu, sloučenina účinkující na úrovni kondenzace nukleové kyseliny je tvořena zcela nebo částečně peptidovými motivy (KTPKKAKKP) SEQ ID N°1 nebo/a (ATPAKKAA) SEQ N°2 nebo jejich deriváty, počet motivů se může pohybovat mezi 2 a 10. Ve struktuře látek podle vynálezu tyto motivy mohou být opakovány kontinuálně nebo nekontinuálně. Mohou být mezi sebou odděleny vazbami biochemické povahy, např. vazby tvořené jedenou nebo několika aminokyselinami nebo vazbami chemické povahy.
Podle vynálezu je zvláště výhodný výběr sloučenin jako jsou peptidy nebo pseudopeptidy (mající pevážně aminokyseliny basického charakteru jako je lysin, histidin nebo arginin) v rámci předloženého vynálezu. Tyto sloučeniny mohou mít strukturu skládaného listu β. Basické aminokyseliny jsou specificky zahrnuty ve vazbě peptid - nukleová kyselina. Tyto aminokyseliny mají podíl na vybudování ionických vodíkových můstků mezi dvěma postranními řetězci příznivými pro kondenzaci nukleové kyseliny. Pokud se týká struktury skládaného listu β, tato struktura je charakterisována snadnější přístupností k majoritním svazkům karboxylů a atomů vodíků, které z části svého charakteru akceptoru a donoru přednostně podporují tvorbu vazeb se zahuštěnou nukleovou kyselinou. Jedná se zvláště o histon, nukleolin, protamin nebo/a jejich deriváty nebo jen o jejich část.
Histony a protaminy jsou proteiny kationické povahy. Jsou odpovědné za kondenzaci DNA in vivo, netranskribuji DNA určitého viru. Histony mohou být použity v rámci předloženého vynálezu. Jedná se zvláště o histony Hl, H2a, H3 a H4. Co se týče nukleolinu, jedná se o nukleární protein, u kterého se předpokládá, že má synergický účinek během kondenzace DNA ve srovnání s histonem Hl. V rámci předloženého vynálezu se může výhodně jednat o sloučeninu s peptidovou sekvencí odvozenou od N-koncové oblasti nukleolinu se sekvencí (ATPAKKAA)2 (COOH) (SEQ ID N°3) .
Sloučenina podle vynálezu je odvozena od histonu Hl, zvláště od C-koncové oblasti a odpovídá sekvenci (KTPKKAKKP) 2 (COOH) (SEQ ID N°4 ) .
Z těchto sloučenin podle vynálezu se mohou citovat následující oligopeptidy: ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) (SEQ ID N°5) a KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA (COOH) (SEQ ID N°6) jako výhodné.
Co se týče sekvencí odvozených od protaminů mohou se v rámci předloženého vynálezu citovat zejména následující oligopeptidy: SESEYYRQRQRSRRRRRRR(COOH) (SEQ ID N°7) a RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) (SEQ ID N°8) .
Ve smyslu předloženého vynálezu termín odvozený popisuje všechny peptidy, pseudopeptidy (peptidy zahrnující části nebiochemické) nebo proteiny odlišné od proteinů nebo peptidu braných v úvahu, získaných jedním nebo více modifikacemi povahy genetické nebo/a chemické. Modifikacemi genetické povahy nebo chemické povahy se mohou chápat všechny mutace, substituce, vynechání, přídavek nebo/a modifikace jednoho nebo více residuí určitého proteinu. Modifikace chemická zahrnuje všechny modifikace peptidu tvořené chemickou reakcí nebo chemickým roubováním molekuly biochemické nebo nebiochemické na jakémkoliv počtu residuí proteinu.
Genetická modifikace zahrnuje všechny peptidové sekvence, jejichž hybrid DNA s těmito sekvencemi nebo fragmenty má naznačenou aktivitu. Tyto deriváty mohou být tvořeny různě. Zvětšováním afinity polypeptidů k ligandům, zlepšování úroveň jejich produkce, zvětšování jejich resistence k proteázám, zlepšování nebo/a přímo vložením nových farmakologických vlastností nebo/a biochemických. Mezi výslednými deriváty adice se mohou citovat např. peptidické sekvence obsahující heterologickou část vázanou na konec. Termín odvozený zahrnuje také homologickou sekvenci proteinu, produkty dalších zdrojů buněk zejména buněk lidského původu nebo jiných organizmů mající aktivitu stejného typu. Homologické sekvence mohou být získány hybridizací odpovídající DNA. Hybridizace může být uskutečněna z banky nukleových kyselin, které se používají jako sonda nativní sekvence nebo fragmenty v konvenčních podmínkách (Maniatis a ostatní), (všeobecná technika molekulární biologie).
V realizačním modelu kompozice předloženého vynálezu zvláštně výhodně zahrnují dále sloučeninu, dovolující orientovat se na přenos nukleové kyseliny. Tato složka může být složkou extracelulární, která dovoluje orientovat přenos kyseliny nukleové skrze určitý typ buněk nebo určitou požadovanou tkáň (nádorové buňky, hepatické buňky, buňky hematopoetické). Může se také jednat o složky intracelulární, dovolující orientovat přenos nukleové kyseliny skrz určitá oddělení buněk (mitochondrie, jádro atd.).
Sloučenina je vázána kovalentním způsobem nebo způsobem nekovalentním v kompozici polle vynálezu. Sloučenina může být taaké vázána k nukleové kyselině. Podle modelu vynálezu výše uvedená sloučenina je vázána přes doplňkovou heterogení část vázanou k jednomu z jeho konců. Tyto části mohou být zejména peptidy typu fusogen pro uskutečnění buněčné transfekce, může se říci, pro uskutečnění průchodu transfekčního prostředku nebo jeho různých složek skrz membrány. Může se jednat o ligand buněčného receptorů, který je přítomný na povrchu buňky jako např. cukr, transferrin, insulin nebo protein asialo-orosomukoid. Může se také jednat o ligand intracelulárního typu, jako označení buněčného umístění, který přednostně shromažďuje transfektovou DNA uprostřed j ádra.
Mezi cílovými složkami použitými v rámci vynálezu se mohou citovat cukry, peptidy, hormony, vitaminy, cytokiny, oligonukleotidy, lipidy nebo sekvence nebo části jatečného odpadu, dovolující specifické vázání s odpovídajícími receptory. Jedná se o cukry nebo/a peptidy takové jako jsou protilátky nebo části protilátek, buněčné receptorové ligandy nebo jejich části, receptory nebo části receptorů atd. Může se také jednat o ligandy receptorů faktorů vývoje, receptorů cytokinas, receptorů buněčných nebo receptorů proteinů adhese. Mohou se také citovat receptory transferrinu, HDL a LDL. Cílové složky mohou také být cukry dovolující vázat lecitin jako receptor asialoglykoproteinových nebo část fragmentu Fab protilátek, dovolující vázat receptor fragmentu Fc imunoglobulinu.
Jako příklad tohoto typu vázáni se může uvést v rámci předloženého vynálezu sloučenina typu Hl-nls a zvláště peptid mající sekvenci PKKKRKV-bAla- (KTPKKAKKP) 2 (COOH) (SEQ ID N°9) Sloučeniny podle vynálezu a zvláště všechny odvozené od histonu, protaminu nebo nukleolinu mohou být dále polyglykosylované, sulfonované nebo fosforylované nebo/a roubované na komplexní cukry nebo na liofilní činidlo jako je např. polyuhlíkový řetězec nebo deriváty cholesterolu.
Kompozice podle vynálezu mohou samozřejmě zahrnovat zhuštěnou kyselinu nukleovou různé povahy. Mohou být také spojovány sloučeniny typu histonu ke sloučeninám typu nukleolinu.
Sloučenina podle vynálezu je přítomna v dostatečném množství pro zhuštění nukleové kyseliny podle vynálezu. Poměr látka : nukleová kyselina (vyjádřeno hmotnostně) může se pohybovat v hodnotách mezi 0,1 a 10 a zejména mezi 0,3 a 3.
Co se týče činitele transfekce přítomného v kompozici podle vynálezu, tento je zvláště vybrán mezi kationickými polymery a lipofektanty.
Podle předloženého vynálezu kationtový polymer je sloučeninou všeobecného vzorce (I):
•N-(CH2)r(I) ve kterém
R může znamenat atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce:
(CH2)n-N n znamená celý počet, pohybující se mezi 2 a 10
-p a q jsou celá čísla se součtem p a q takovým, že molekulová hmotnost polymeru pohybuje mezi 100 a 107 Da.
Je pochopitelné, že ve vzorci (I) hodnota n se může pohybovat mezi různými motivy p. Vzorec (I) seskupuje zároveň homopolymery a heteropolymery.
Ve vzorci (I) n se pohybuje v hodnotách 2 a 5. Zvláště polymery polyethyleniminu (PEI) a polypropyleniminu (PPI) vykazují vynikající vlastnosti. Polymery podle předloženého vynálezu jsou ty, jejichž molekulová hmotnost se pohybuje mezi 103 a 5 x 106. Jako příklad můžeme uvést polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 50 000 Da (PEI50K) nebo polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 800 000 Da (PEI800K).
PEI50K nebo PEI800K jsou obchodně dostupné. Jiné polymery obecného vzorce (I) mohou být popsány v FR 9408735. Optimální podmínky vynálezu, tj. optimálního poměru polymer : nukleová kyselina jsou určeny druhem jednotlivých zastoupených látek, tak např. molární poměr R = aminy polymeru : fosfáty nukleové kyseliny. Tento poměr se pohybuje v hodnotách mezí 0,5 a 50, přesněji mezi 5 a 30. Zvláště výhodné výsledky jsou získány za použití 5 až 25 ekvivalentů aminů polymeru k množství fosfátů nukleové kyseliny.
Co se týče zvláště lipofektantu, jako lipofektant se chápe sloučenina ve smyslu vynálezu lipidového charakteru, která je aktivní vzhledem k transfekci nukleové kyseliny do buněk. Všeobecně jde o molekuly, obsahující alespoň jednu lipofilní oblast vázanou nebo nevázanou v hydrofilní oblasti. V této skupině sloučenin mohou být lipidy schopné tvořit lipisomy jako je POPC, fosfatidilserin, fosfatidilcholin, cholesterol, maleimimidofenylbutyrylfosfatidylethanolamin, laktosylceramid v přítomnosti nebo nepřítomnosti polyethylenglykolu tvoří latentní liposomy nebo v přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek nebo ligandu tvoří imunoliposomy nebo cílové liposomy.
Podle vynálezu lipidový činitel vytváří kationickou oblast. Tato kationická oblast, oblast kationického náboje, je schopná vázat se reversibilním způsobem na nukleovou kyselinou, s negativním nábojem. Tato interakce pevně zhušfuje nukleovou kyselinu. Lipofilní oblast sčítá tyto ionické interakce v prostředí externí vody, když se znovu se pokryje nukleofilními částmi tvořící lipidovou vrstvu.
Bylo také zjištěno, že kationický lipid s pozitivním nábojem, N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamonium chlorid (DOTMA), interferuje ve formě liposomu nebo peptidových kapes, spontáně s DNA, která má negativní náboj za vzniku komplexu lipid-DNA. Tento komplex je schopný vázat se k buněčné membráně a umožňuje také intracelulární odevzdání DNA. Od DOTMA jsou navrženy další kationícké lipidy. Lipofilní skupina je připojená k aminoskupině prostřednictvím ramene nazvaného spacer. Mezi těmito sloučeninami se mohou uvést zvláště ty, které obsahují lipofilní skupinu dvou mastných kyselin nebo jsou ovozeny od cholesterolu, obsahující v případě potřeby amino skupinu nebo kvarterní amoniovou skupinu. DOTAP, DOBT nebo ChOTB mohou být uvedeny jako representanty této kategorie kationických lipidů. Další látky jako DOSC a ChSC se vyznačují přítomností cholinové skupiny na místo kvarterní amoniové skupiny. Byla také popsána kategorie kationických lipidů jako jsou lipopolyaminy. V tomto typu sloučenin kationická skupina je representována zbytkem L-5karboxysperminu, který obsahuje čtyři amoniové skupiny, dvě primární a dvě sekundární.
Lipofektanty jsou účinné zejména pro transfekci endokrinních primárních buněk. Lipofektanty, které vyhovují vynálezu mohou také být vybrány z množiny lipopolyaminů, jejichž oblast polyaminu odpovídá všeobecnému vzorci (II),
H2N-(-(CH)m-NH-)n-H ve kterém m je celý počet vyšší nebo rovný 1 a n je celý počet vyšší nebo rovný 1, m se může měnit pro různé uhlíkaté skupiny obsažené mezi dvěma aminovými skupinami, jeho hodnota se pohybuje mezi 2 a 6 včetně a n se pohybuje v hodnotách 1 a 5 včetně. Oblast polyaminová je tvořena sperminem, therminem nebo jejich analogy, u kterých jsou zachované vazebné vlastnosti k DNA. Je-li lipofilní oblast je tvořena uhlovodíkovým řetězcem nasyceným nebo nenasyceným, cholesterolem, přírodním lipidem nebo lipidem syntetickým je schopná tvořit lamelární fáze nebo hexagonální, vázané kovalentním způsobem v hydrofilní oblasti.
EP 394 111 popisuje další lipopolyaminy všeobecného vzorce (III) v rámci předloženého vynálezu, ve kterém R je zejména zbytek všeobecného vzorce (R:R2) N-CO-CH-NH-CO-.
Jako příklad těchto lipopolyaminů se může uvést dioktadekylamidoglycylspermin (DOGS) a 5-karboxysperminamid palmitoylfosfatidylethanolaminu (DPPES).
Lipopolyaminy popsané v FR 94 14596 mohou také být výhodně použity jako činitel transfekce podle vynálezu. Tyto sloučeniny jsou představeny všeobecným vzorcem (IV), ve kterém R představuje
kde
- X a X' znamenají, nezávisle jeden na druhém, atom kyslíku, methylenovou skupinu -(CH2)q-, kde q odpovídá hodnotám 0, 1, nebo 3, nebo amino-skupinu -NH- nebo -NR'-, kde R'znamená alkylovou skupinu, obsahující 1 až 4 atomy uhlíku
- Y a Y'znamenaj£, nezávisle jeden na druhém, methylenovou skupinu, karbonylovou skupinu nebo skupinu C=S,
- R3) R4 a R5znamenají, nezávisle jeden na druhém, atom vodíku nebo alkylovou skupinu, případné substituovanou nebo nesubstituovanou, obsahující 1 až 4 atomy uhlíku , p se může pohybovat mezi 0 a 5
- Rs představuje derivát cholesterolu nebo alkylamino skupinu NR3R2, kde Rx a R2 znamenají, nezávisle jeden na druhém, alifatickou skupinu, nasycenou nebo nenasycenou, lineární nebo rozvětvenou, obsahující 12 až 22 atomů uhlíku.
Může se jednat o sloučeniny např.
2,5-bis-(3-aminopropylamino)-pentyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)-acetát a
1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)-acetát (řečeno viz dále lipolyamin A).
EP 394 111 a FR 94 145 95 popisují také postup použitelný pro přípravu odpovídajících lipopolyaminů.
Nové lipopolyaminy, zhodnocené také v oblasti předloženého vynálezu, byly popsány v FR 95/134 90. Jako představitelé této skupiny lipopolyaminů se mohou uvést tyto následující lipopolyaminy:
lipopolyamin B:
{H2N (CH2) 3} 2N (CH2) 4N { (CH2) 3NH2} (CH2) 3NHCH2COGlyN [ (CH2) 17 - CH3 ] 2 (RP120525) lipopolyamin C:
H2N(CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COGlyN [ (CH2) 18] 2 (RP120535) lipopolyamin D:
H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COArgN [ (CH2) 18] (RP120535)
V rámci předloženého vynálezu se s výhodou také mohou použít dooktadecylamidoglycylspermin (DOGS),
5-karboxyspermylamid palmitoylfosfatidylethanolaminu (DPPES), 2,5-bis-(3-aminopropylamino)-pentyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)-acetát ,
1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmethoxy)-acetát {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{ (CH2)3NH2} (CH2) 3NHCH2COGlyN [ (CH2) 17-CH3] 2,
H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COGlyN [ (CH2) 18] 2 nebo
H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COArgN [ (CH2) ie ] .
Pro získání optimálního účinku přípravků podle vynálezu poměry polyaminu a nukleové kyseliny jsou přednostně určeny druhem, kde poměr R pozitivních nábojů činitele transfekce k negativním nábojům nukleové kyseliny se pohybuje v hodnotách mezi 0,1 a 1, zvláště mezi 0,5 a 6.
Přítomnost sloučenin podle vynálezu v kompozici transfekce výhodně dovoluje značně snížit množství činitele transfekce. Snížila se také sledovaná toxicita při použití lipopolyaminů podle vynálezu, např. to bylo pozorováno u transfekce buněk citlivých na původ činitele transfekce jako jsou např. krvetvorné buňky. Jak ukazují příklady dále uvedené, schopnost transfektovat kompozice podle vynálezu je vyšší k těm, které jsou transfektované klasickými činitely.
V kompozici podle předloženého vynálezu nukleová kyseliny může být stejně tak i ribonukleová. Může se jednat o sekvence přírodního původu nebo uměle připravenou genomickou DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybridové sekvence nebo syntetické sekvence nebo semisyntetické. Tyto nukleové kyseliny mohou být původu lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virového atd. Mohou být také získány všemi odborníky známými technikami, zejména tříděním bank, chemickou syntézou nebo metodami smíšenými zahrnujícími modifikaci chemickou nebo enzymovou. Mohou být inkorportovány do vektorů jako je plazmidový vektor.
Deoxyribonukleové kyseliny mohou být jednoduché nebo dvojvláknové. Tyto deoxyribonukleové kyseliny mohou kodovat terapeutické geny řídící sekvenci transkripce nebo replikace, sekvence antimediátorová a vazebné oblasti k dalším částem buněk atd.
Ve smyslu vynálezu se nazývají terapeutickými geny všechny geny obsahující proteiny, které mají terapeutický účinek. Kódované proteinové produkty mohou být proteiny, peptidy atd. Tyto proteinové produkty mohou být homologické vůči cílové buňce (může se říci, že produkt je vyjádřen v cílové buňce, v případě, že není přítomna žádná patologie). V tom případě exprese proteinu dovoluje např. zmírnit nedostatečnou expresi v buňce nebo expresi neaktivního proteinu nebo slabě aktivního z důvodu modifikace nebo ještě přeexprimování uvedeného proteinu. Terapeutický gen může být také kódován mutací buněčného proteinu mající stabilní modifikovanou aktivitu. Proteinové produkty mohou být také heterologické vůči cílové buňce, V tom případě exprimovaný protein může být např. doplněn nebo vnesen nedostatečnou aktivitou v buňce, která nedovoluje bojovat proti patologii nebo stimulovat imunitní odpověď.
Mezi terapeutickými produkty ve smyslu předloženého vynálezu se mohou citovat zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony TNF atd. (FR 9203120), faktory růstu, jejich prekursory, enzymy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin odpovídající proteinům obsaženým v metabolismu lipidů typu apolipoprotein vybranými mezi apolipoproteiny A-I. A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a enzymy metabolismu jako např. lipoproteinová lipasa, jaterní lipasa, lecitin cholesterol acyltransferasa, 7 alpha cholesterol hydroxylasa, fosfatasa nebo ještě proteiny přenosu lipidů jako je protein přenosu esterů cholesterolu a protein přenosu fosfolipidů proteinu vazeb HDL nebo receptor vybraný nypř. mezi receptory LDL, receptory chylomikron-remmantu a receptory skavengeru, dystrifinu nebo minidystrofinu (FR 9111947) protein GAX, protein CFTR spojený s geny potlačujícími nádory: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev atd. (FR 93 04745) geny kódující faktory implikovány do koadulace: Faktory VII, VIII, IX, geny účinkující při opravě DNA, sebevražebné geny (thymid kinasa, cytosin deaminasa) atd.
Terapeutický gen může také být gen nebo sekvence antimedátorová, jehož/jejíž exprese v cílové buňce dovoluje kontrolovat expresi genu nebo transkripci buněčné mRNA. Tato sekvence může být transkribována v cílové buňce komplementární RNA. Může blokovat jejich transdukci v proteinu podle popsané techniky v EP 140 308. Antimediátorová sekvence obsahuje také sekvence kódující ribosomy, které jsou schopné výběrové zničit RNA (EP 321 201).
Jak se uvádí výše, nukleová kyselina může obsahovat jeden nebo více genů kódujících antigenový peptid, schopný generovat u člověka nebo zvířete imunitní odpoved''. Pro tento model jsou charakteristické vakcíny, imunoterapeutická léčba aplikovaná na člověka nebo na zvíře, zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovinám. Může se jednat zejména o specifické antigenové peptidy viru Epstein Barr, viru HIV, viru hepatitidy B (EP 185 573), viru pseudovztekliny a specifické nádory (EP 259 212).
Nukleová kyselina obsahuje zejména sekvence dovolující expresi terapeutického genu nebo/a genu obsahujícího gen kódující antigenový peptid v buňce nebo požadovaném orgánu. Může se jednat o sekvence, které jsou přirozeně odpovědné za expresi zkoumaného genu, jsou-li sekvence schopné fungovat v infikované buňce. Může se také jednat o sekvenci různého původu (odpovědnou za expresi dalších proteinu nebo stejných syntetických). Zejména se může jednet o sekvenci iniciátoru eukariontních genů nebo virů. Např. může se jednat o iniciátory sekvencí buněčného genomu nebo genomu viru. V tom ohledu lze citovat např. iniciátory genů E1A, MLP, CMV, RSV atd. Tyto sekvence exprese mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, regulačních sekvencí atd.
Z jiného hlediska nukleové kyseliny mohou také zahrnovat zvláště proti toku terapeutického genu, signál sekvence řídící syntézu terapeutického produktu sekrekčním způsobem cílové buňky. Tento signál sekvence může být signál sekvence přírodně terapeutického produktu, ale může se také jednat o všechny další sekvence základního signálu nebo signálu umělého.
Kompozice podle vynálezu obsahují dále jeden nebo více neutrálních lipidů. Tyto látky jsou zvláště výhodné, zejména, v případě kdy poměr R je slabý. Přídavek neutrálního lipidu dovoluje zlepšovat tvorbu nukleolipidových částí a překvapivě podporuje penetraci částí do buňky za destabilizace membrány. Použitě neutrální lipidy v rámci předloženého vynálezu jsou lipidy se dvěma mastnými řetězci.
Zvláště výhodné je použití přírodních lipidů nebo syntetických zwiterionového typu nebo bez náboje za fyziologických podmínek. Může se jednat o lipidy zvolené z množiny zahrnující dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE), oleoylpalmitoylfosfatidylethanolamin (POPE), di-stearoyl, palmitoyl, mirystoylfosfatidylethanolamin a jejich 1- až 3násobné N-methylované deriváty , fosfatidylglyceroly, diglyceroly,diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy (zejména sfingomyeliny) nebo ještě asialogangliosidy (zejména asialoGMl a GM2).
Tyto různé lipidy mohou být získány, jak syntézou, tak extrakcí např. z orgánů (např. mozek) nebo vajec dobře známými klasickými technikami. Zvláště extrakce přírodních lipidů může být prováděna prostřednictvím organických rozpouštědel (viz Lehninger, Biochemie).
Kompozice podle vynálezu jsou uvedeny v činnost činitelem transfekce: lipofektantem, který obsahuje 0,1 až 20 ekvivalentů neutrálních lipidů pro jeden ekvivalent lipopolyaminu. Nejvýhodnější je ekvivalent 1 až 5. V případě, že transfekční činitel je kationický polymer, kompozice podle vynálezu obsahují kromě kationického polymeru (ve dříve citovaném poměru: 0,1 až 20 molárních ekvivalentů) neutrální lipid pro jeden molární ekvivalent fosfátu nukleové kyseliny. Nejvýhodnější je opět ekvivalent 1 až 5.
Kompozice podle vynálezu se mohou dělit na skupiny z pohledu podávání léku. Kompozice se podávají topikálně, rektálně, vaginálně, parenterálně, transškárově, orálně, kůží, podkožně, nitrožilně, intramuskulárně, intraokulárně, intranazálně atd. Farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují farmaceuticky přijatelně vehikulum pro injektování, zejména pro přímé injektování na úrovni požadovaného orgánu nebo pro podávání topikální (na kůži nebo sliznici). Může se jednat zvláště o přípravky zejména sterilovaná voda roztoky nebo suché roztok se používá dovoluj ící sérum sterilní izotonické lyofilizované. Jako nebo fyziologické injektovat farmaceutické kompozice. Dávka použití nukleové kyseliny pro injektaci, stejně jako počet podávání může být být upraveno v závislosti na úloze a způsobu podávání. Kompozice mohou být výhodně použity pro transfekci velkého počtu typu buněk jako např. krvetvorných buněk, buněk melanomů, karcinomů a sarkomů, buněk hladkého svalstva, neuronů a astrocytů.
Předložený vynález předkládá také metodu zvláště výhodnou pro léčení nemocí používající transfekcí in vitro, ex vivo nebo in vivo kyselinu nukleovou hodící se k opravě výše jmenované nemoci ve spojení s činitelem transfekce typu kationického polymeru nebo lipofektantu. Taková kompozice je předem definována. Kompozice podle vynálezu jsou zvláště zajímavé svojí biodisponibilitou a svojí vysokou úrovní transfekce.
Předložený vynález se týká také použití kompozicí tvořených zcela nebo částečně peptidovými motivy (KTPKKAKKP) nebo/a (ATPAKKAA). Počet těchto motivů se může měnit mezi 2 a 10 .
Předložený vynález pokrývá také všechna použití oligopeptidů vybraných mezi (ATPAKKAA) 2 (COOOH) , (KTPKKAKKP) 2 (COOH) , ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) , KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH) , SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH), a RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) pro uskutečnění přenosu in vitro, ex vivo a nebo in vivo nukleové kyseliny výše uvedeného oligonukleotidu.
Následující příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoli směru omezovaly jeho rozsah.
Příklady provedení vználevu
Materiál a metody
1. Plazmidy použité pro přenos genu in vivo
Aktivita kompozice je určena plazmidy, které obsahují gen kódující luciferasu (Luc).
Jedná se zejména o plazmidy pCMVluc, pXL 2621, pXL 2622, které obsahují gen kódující luciferasu (vektor pGL2, Promega) pod aktivátorem cytomegaloviru (CMV) výtažek pCDNA3 (Invitrogen). pCMV luc a pXL2622 se odvozují od vektoru pGL2, pXL 2622 vektoru pGL2, a v těchto vektorech iniciátor SV40 byl umístěn aktivátorem CMV. Plazmidy jsou všeobecné získávány technickým srážením v PEG (Ausubel) a skladovány v Tris 10 mM EDTA lmM pH 8 při 4°C a při koncentraci prostředí 10 μρ ADN na μΐ.
2. Kompozice použité podle vynálezu Η: KTPKKAKKPKTPKKAKKP(COOH) 18 AA
N: ATPAKKAATPAKKAA(COOH) 16 AA nls-H: PKKKRKV-bAla-KTPKKAKKPKTKKAKKP(COOH) 26 AA
PR1: RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR 21AA
PR2 : SRSRYYRQRQRSRRRRRR jsou připraveny následujícími postupy:
2.IN: ATPAKKAATPAKKAA(COOH)
Tyto oligopeptidy se syntetizují ve formě soli kyseliny trifluoroctové prostřednictvím syntézy peptidů Applied Biosystem 431A na pryskyřici HMP (Applied Biosystem) metodou FMOC. Po syntéze se peptid izoluje z pryskyřice během 90 minut v přítomnosti roztoku voda / TFA v poměru 1 / 19. Po filtraci, se roztok zahustí na vakuové odparce, pak se peptid dvakrát srazí přídavkem etheru butylmethylnatého z roztoku v TFA. Usazenina se promývá etherem butylmethylnatým a pak se suší. Peptid se rozpustí v 5ml vody, filtruje a čistí na nepřímé fázi HPLC na koloně C18 100 A (Biorad RSL). Peptid se čistí pomocí gradientu 0 až 25% acetonitrilu, 0,07% TFA ve vodě 0,07%TFA. Čistota získaného peptidů je 95% a jeho rozpustnost ve vodě je 100 mg / ml.
2.2 nsl: PKKKRKV
Tyto oligopeptidy se syntetizují ve formě soli kyseliny trifluoroctové podle protokolu popsaného níže za použití (pro štěpení) roztoku: voda / TFA / fenol / ethandithiol / thioanisol v poměru 2/40/3/1/2 (objem / objem). Čistota získaného peptidů je 95% a jeho rozpustnost ve vodě je 100 mg / ml při pH 2,1.
2.3 Η: KTPKKAKKPKTPKKAKKP(COOH) a nls-H: PKKKRKV-bAlaKTPKKAKKPKTKKAKKP(COOH)
Tyto oligopeptidy se syntetizují ve formě soli kyseliny trifluoroctové podle protokolu popsaného níže. Pro tvorbu těchto oligapeptidů pryskyřice se rozdělila na dvě části. První část je určena pro syntézu H. Štěpení se provádí roztokem: TFA / fenol / ethandithiol / thioanisol / voda v poměru 40/3/1/2/2 (objem / objem). Čistota získaného peptidů je 90% a jeho rozpustnost ve vodě je 10 mg / ml při pH 2,1. Druhá část pryskyřice se použije pro syntézu nls-bAla-H. Roztok pro štěpení je stejný jako při přípravě H. Čistota získaného peptidů je 95% a jeho rozpustnost ve vodě je 10 mg / ml při pH 2,1.
2.4 PR1: RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR a PR2: SRSRYYRQRQRSRRRRRR
Tyto oligopeptidy se syntetizují ve více etapách na je se pryskyřice chránící skupiny pevné fázi podle techniky BocBenzyle. Použi Boc-L-Arg(Tos)Pam (0,48 meq / g) . Odstranění a vázání se provádí následujícím způsobem:
1- 55% TFA v dichlormethanu (DCM)
2- 55% TFA v dichlormethanu
3- dichlormethan
4- DMF
5- vázání
6- DMF
7- dichlormethan
1x2 mn
1x30 mn x lmn x lmn x lmn x lmn
V každé etapě se použije 10 ml roztoku na jeden gram pryskyřice. Vázání všech aminokyselin (v trojnásobném nadbytku) se provádí v DMF v přítomnosti BOP, Hobt a DIEA. Každá etapa vázání se kontroluje ninhydrinovým testem.
Konečný peptid je znovu získán z pryskyřice a zcela odchráněn kyselinou fluorovodíkovou. Používá se 10 ml kyseliny fluorovodíkové na gram pryskyřicového peptidu při 0°C během 45 minut v přítomnosti para- kresolu a ethandithiolu. Po odpaření kyseliny fluorovodíkové se směs promývá etherem v kyselině fluorovodíkové, pak se sráží etherem a suší.
3. Lipofektanty
Lipopolyamin A:
1,3-bis-(3-amino-propylamino)-2 propyl-(dioktadekyl-karbamoylmethoxy)-acetát (RP115335)
Lipopolyamin B:
(H2N(CH2) 3}2N (CH2) 4N{ (CH2) 3NH2} (CH2) 3NHCH2COGlyN [ (CH2) 17-CH3] 2 (RP120525)
Lipopolyamin C;
H2N(CH2) 3NH(CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COGlyN [ (CH2) 18] 2 (RP120535) lipopolyamin D:
H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COArgN [ (CH2) ia] (RP12 0 5 31)
Příklad 1
Přenos nukleové kyseliny do buněk NIH 3T3 in vitro
Tento příklad popisuje přenos nukleových kyselin in vitro prostřednictvím kompozice podle vynálezu, který obsahuje nukleovou kyselinu, sloučeninu podle vynálezu a lopopolyamin. Přenos se provádí za různých podmínek, různého pufru a různého pH.
μΐ směsi kompozice se připraví následovně;
- 0,5 μρ plazmové DNA pCMV-luc, 0,25 μg sloučeniny podle vynálezu v roztoku pufru mM dioktadekylamidoglycylspermin (DOGS) v poměru X, který je určen v každém pokusu
- 2-5.104 buněk NIH3T3 se inkubuje s předchozí směsi při 37°C pod atmosférou 5% CO2 po dobu 4 hodin. Buňky se potom promyjí a opět vloží do kultivačního media po dobu 48 hodin v prostředí 10% sera (DMEM 10% SVF) . Buněčná kultura se potom lýzuje v 50 μΐ pufru (Promega) a znovu získá odstředěním (20 000 g během 5 minut).
Aktivita luciferasy se měří ve 4 μΐ vzorku za přídavku
20 | μΐ substrátu | (Promega) | Odečítání | se | provádí na |
luminometru LKB v | j ednotkách | RLU (relative | lights units) za | ||
20 | sekund. | ||||
Výsledky jsou | i uvedeny v | Tabulce 1 a 2. | |||
3 . | Zahušťováni | ve 15 0 | mM NaCl, | 10 | mM HEPES |
(N-(2-hydroxyethyl)piperazin-Ν'-(2-ethyl)sulfonová kyselina při pH 7,1
Tabulka 1:
DOGS/DNA | bez přípravku (RLU) | s H (RLU) |
0,8 X | 32 | 850 |
1,8 X | 220 | 23 700 |
3 X | 5 400 | 21 750 |
4. Zhušťováni v 5% D-glukosy, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES (pH 7,2)
Tabulka 2:
DOGS/DNA | bez látky (RLU) | s H (RLU) | s N (RLU) |
0,8 X | 880 | 44 000 | 1 450 |
1, 8 X | 6 600 | 156 500 | - |
3 X | 22 000 | 297 500 | 90 300 |
V těchto příkladech jsou uvedeny výsledky, které byly získány při spojení zahuštěné sloučeniny s DOGS podle vynálezu. Ukázalo se, že je možné snížit množství DOGS bez jakéhokoliv negativního vlivu na transfekci odpovídajících látek.
Přiklad 2
Zkouška transfekce v přítomnosti neutrálního lipidu μΐ směsi kompozice se připraví následovně:
- 0,5 pg plazmové DNA pCMV-luc, 0,25 μρ látky podle vynálezu v roztoku pufru 150 mM NaCl, 10 mM fosforečnanový pufr pH 7,4 mM dioktadekylamidoglycylspermin (DOGS) v poměru X, který je určen v každém pokusu v přítomnosti dioleoylfosfatidylethanolaminu (DOPE). Použitý poměr DOGS / DOPE je 1 / 2.
V tomto případě se 40 mM ethanolického roztoku DOGS smíchá se stejným objemem dioleoylfosfatidylethanolaminu (DOPE) připravený ve směsi chloroform / ethanol (1 / 5) . Pro jeden ekvivalent DOGS přípravek obsahuje dva ekvivalenty DOPE.
- 10s buněk NIH3T3 se inkubuje s předchozí směsí při 37°C pod atmosférou 5% CO2 po dobu 4 hodin. Buňky se potom promyjí a opět vloží do kultivačního media po dobu 48 hodin v prostředí 10% sera (DMEM 10% SVF).
Buněčná kultura se potom lýzuje v 50 μΐ pufru (Promega) a znovu získá odstředěním (20 000 g během 5 minut).
Aktivita luciferasy se měří ve 4 μΐ vzorku za přídavku 20 μΐ substrátu (Promega). Odečítání se provádí na luminometru LKB v jednotkách RLU (relative lights units) za 20 sekund.
Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3.
Tabulka 3:
DOGS/DNA | bez látky (RLU) | s H (RLU) | s nls-H (RLU) |
0,8 X | 24 | 3 175 | 760 |
1, 8 X | 19 | 7 410 | 2 380 |
3 X | 1 800 | 39 500 | 52 800 |
Tyto výsledky potvrzují pozorování v příkladu 1. V přítomnosti basických látek podle vynálezu a zvláště H, je možné snížit o polovičku množství lipofektantu.
Příklad 3:
Změna poměru přípravků podle vynálezu / DNA
3.1: V přítomnosti přípravku DOGS
1. 10μ1 směs přípravku se připraví následovně:
-0,75 μ9 plazmové DNA pCMV-luc a sloučenina podle vynálezu v roztoku pufru 5% D-glukosy 150mM NaCl s 10 mM HEPES (pH zahuštovčího roztoku je 7,2)
-40 mM dioktadekylamidoglycylspermin (DOGS) v poměru 1,8 X -2-4.105 buněk NIH3T3 jsou inkubovány s předchozí směsí při 3 7°C pod atmosférou 5% CO2 po dobu 4 hodin. Buňky se potom promyjí a opět vloží do kultury po dobu 48 hodin v prostředí 10% sera (DMEM 10% SVF).
hodin po transf ekci buňky se lýzují, , v 100 μΐ pufru (Promega) a znovu získají odstředěním (20 OOOg během 5 minut).
Aktivita luciferasy se měří v 5 μΐ vzorku za přídavku 25 μΐ substrátu (Promega). Odečítání se provádí na luminometru LKB v jednotkách RLU (relative lights units) za 20 sekund.
Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 4.
Tabulka 4:
PEP / ADN | s H | s H-nls | s N |
hmotnost/obj em | (RLU) | (RLU) | (RLU) |
0 | 2 150 | 2 150 | 2 150 |
0,25 | 3 000 | 38 000 | 35 00 |
0,5 | 45 000 | 100 000 | 35 000 |
1 | 84 000 | 105 000 | 13 000 |
2 | 105 000 | 200 000 | 20 000 |
3.2: V přítomnosti DOGS / DOPE 1,8 X
Postupuje se stejně jako v protokolu dříve popsaném v 3.1. Pro transfekci se použije 40 mM roztok 1,8X dioktadekylamidoglycylsperminu (DOGS) v přítomnosti dioleoylfosfatidylethanolaminu (DOPE), DOGS / DOPE v poměru 1 / 2 připravené podle příkladu 2.
Tabulka 5 shrnuje získané výsledky.
Tabulka 5:
látka / DNA hmotnost/objem | H (RLU) | H-nls (RLU) | N (RLU) |
0 | 580 | 580 | 580 |
0, 25 | 13 00 | 5 600 | 7 600 |
0,5 | 11 000 | 18 500 | 1 800 |
1 | 14 100 | 36 000 | 13 600 |
2 | 16 500 | 58 000 | 14 100 |
Příklad 4
Změna poměru přípravků podle vynálezu / DNA, DOGS je nahrazen jinými látkami
3.1: V přítomnosti 1,3-bis-(3-aminopropylamino)2propyl-(dioktadekyl-karbamoylmethoxy)-acetátu (lípopolyaminu A)
1. 10μ1 směs přípravku se připraví následovně:
-0,55 μ9 plazmové DNA pCMV-luc a látka podle vynálezu v roztoku pufru 150mM NaCl
-1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2propyl-(dioktadekylkarbamoylmethoxy) -acetát v uvedeném poměru
-2-5.104 buněk NIH3T3 jsou inkubovány s předchozí směsí při 3 7°C pod atmosférou 5% CO2 po dobu 4 hodin. Buňky se potom promyjí a opět vloží do kultury po dobu 48 hodin v prostředí 10% sera (DMEM 10% SVF).
hodin po transfekci se buňky lýzuj i v 100 μΐ pufru (Promega) a znovu získají odstředěním (20 OOOg během 5 minut).
Aktivita luciferasy se měří v 10 μΐ vzorku za přídavku μΐ substrátu (Promega). Odečítání se provádí na luminometru Berthold lumat 9501<R> v jednotkách RLU (relative lights units) za 10 sekund.
Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 6.
Tabulka 6:
LIPOFEKTANT | bez látky .106 RLU | s H . 106 RLU | s nls-H . 106 RLU | ||||
látka / DNA | |||||||
0 | 0,5 | 1 | 2 | 0,5 | 1 | 2 | |
1,8X | 3,9 | 30,4 | 32,7 | 4,1 | 52,4 | 58,5 | 39,3 |
3X | 8,9 | 41,5 | 61,3 | 16,6 | 64,1 | 60,4 | 49,2 |
6X | 6,2 | 23,6 | 22,3 | 15,6 |
4.2: V přítomnosti PEI 800K
1. Postupuje se podle protokolu popsaného v 4,1 za použití lipofektantu PEI 800K. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 7.
Tabulka 7:
PEI 800K | bez látky . 106 RLU | H . 106 RLU | nls-H . 10s RLU | ||||
amin polymeru / fosfát DNA | látka | / DNA | |||||
0 | 0,5 | 1 | 2 | 0,5 | 1 | 2 | |
6 | 7,7 | 4,9 | 7 | 12,3 | 4 | 7,3 | 8,8 |
9 | 5 | 8 | 11,6 | 4 | 16,3 | 11 | 12,1 |
12 | 7,5 | 11,3 | 17,1 | 1,2 |
Příklad 5
Přenos in vivo do svalových buněk
Odpovídající pokusy jsou popsány v následujícím textu: Prostředky se injektují do holeního svalu myši C57 bl6 nebo
0F1 (starší než 8 týdnů).
DNA se zředí na koncentraci 0,5 mg / ml roztokem 150 mM NaCl, obsahujícím 5% D-glukosy. Před injekcí koncentrace peptidů je 1 mg v 1 ml vody. K tomuto roztoku se přidá DNA v dostatečném množství pro dosaženíurčitého poměru (hmotnost / hmotnost). Doba inkubace před injektací je alespoň 20 minut při okolní teplotě.
Vyhodnocení výsledků: Dva dny po injekci se sval odebere, rozseká v 750 μΐ pufru (Promega E153A), přidá k aprotininu (Sigma). Odebraný vzorek se homogenisuje v drtičce (Heidolf) a 10 μΐ se odebere na měření aktivity luciferasy. Toto měření se provádí luminometrem Lumat 9501 (Berthold) během 10 sekund po přídavku 50 μΐ substrátu obsahujícího luciferasu (Promega) k 10 μΐ vzorku. Šum pozadí před přídavkem substrátu se úplně odečte a aktivita se vyjádří v RLU (relative light units).
μΐ (20 μΐ ADN) se injektuje v přítomnosti 5 mM HEPES o pH 7,4 roztoku, potom se přidá lipopolyamin C(RPR 120535) v množství 0,01 nmol / μΐ ADN 20 minut před injektací.
Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 8.
Tabulka 8:
peptid / DNA hmotnost / hmotnost | (průměr) RLU | (odchylka) RLU | počet zvířat |
bez peptidů | 15 228 125 | 14 618 681 | 6 |
nsl-H, 0,025 hmotnost/hmotnost +lipopolyamin C | 42 722 500 | 66 485 348 | 6 |
Tyto výsledky potvrzují příznivý efekt spojení lipopolyaminu se zahuštěnou látkou podle vynálezu na transfekci nukleové kyseliny in vivo ve svalu.
Příklad 6:
Přenos nárokované kompozice in vivo do nádorových buněk
Pokusy se provádějí na dospělých myších samic C57/BL 6 (starších 8 týdnů), které mají nádor typu 3LL (Lewis Lung carcinoma). Tyto objekty jsou získány pasážováním nádoru a jejich implantováním ze zvířete na zvíře pod kůži v úrovni boku.
Roztok pro injektaci se připraví následujícím způsobem. DNA je nejdříve rozpuštěna v pufru, potom se přidá peptid a po 20 minutách se přidá silně koncentrovaný roztok kationických lipidů (20 nebo 40 mM) a směs se míchá. Po přidání všech těchto složek směs obsahuje DNA, peptid a kationický lipid, 150 mM NaCl, 5% D-glukosu a 5 mM MES o pH 6,2. V případě dvou posledních sérií s lipopolyaminem C (RPR 120 535), jako vehikulum pro injektování se používá 75 mM NaCl a 150 mM NaCl a 5% D-glukosa. Injektace se provádí po 20 až 30 minutách od přípravy roztoku.
V Tabulkách 9 a 10 je uvedeno složení kompozice, která se injektuje do nádoru 7 dní po implantaci. U myší se provádí anestesie před injektaci pomocí směsi 130 mg Ketaminu a 4 mg Xylazinu na jeden kilogram myši.
Dva dny po injekci se tkáň odebere, rozseká v 500 μΐ pufru (Promega Cell Lysis Buffer E153 A) . Po odstředění (20 OOOg během 10 minut) se odebere 10 ml vzorku ke stanovení aktivity liciferasy. Toto měření se provádí luminometrem Lumat LB 9501 (Berthold) během 10 sekund po přídavku 50 μΐ substrátu obsahujícího luciferasu (Promega Luciferase Assay Substráte).
Aktivita se vyjádří v jednotkách RLU (relative light units).
Tabulka 9 uvádí výsledky získané v přítomnosti rozdílných lipopolyaminu A, B, C nebo D a Tabulka 10 uvádí výsledky získané v přítomnosti PEI.
Tabulka 9:
plasmid | peptid | kationický lipid | výsledek RLU/nádor | počet zvířat | ||||
μυ/ nádor | [DNA] μ9/μΐ | ref . | pept/ DNA w/w | ref. | nmol/ μρ DNA | průměr | odchylka | |
20 | 2 | 0 | 0 | 5 | ||||
20 | 2 | A | 1,8 | 142 300 | 121 418 | 5 | ||
20 | 2 | H | 1 | 1,8 | 301 730 | 243 166 | 5 | |
30 | 2 | 3 | 99 775 | 128 726 | 6 | |||
30 | 2 | H | 1 | 3 | 1 340 460 | 1 771 624 | 5 | |
7,5 | 0,5 | A | 3 | 88 712 | 49 314 | 5 | ||
7,5 | 0,5 | H | 1 | 3 | 383 313 | 234 713 | 6 | |
7,5 | 0,5 | H | 1,5 | 3 | 618 025 | 530 774 | 6 | |
15 | 1 | H | 1 | 3 | 1 017 372 | 966 141 | 5 | |
10 | 0,5 | H | 1,5 | C | 3 | 679 258 | 414 286 | 9 |
10 | 0,5 | H | 1,5 | D | 3 | 395 433 | 219 333 | 10 |
18,75 | 0,25 | C | 2 | 222 700 | 126 036 | 6 | ||
18,75 | 0,25 | Pr 2 | 0,5 | 2 | 1 046 050 | 612 401 | 6 | |
20 | 0,5 | C | 4 | 806 467 | 887 206 | 6 | ||
20 | 0,5 | H | 1 | c | 4 | 1 348 233 | 1 674 106 | 6 |
Tabulka 10:
plasmid | peptid | polyethylen imin | výsledek RLU/nádor | počet zvířat | ||||
inj ekt. mn. | [DNA] pg/μΐ | ref . | pept/ DNA V/,Zw | vel. | Eq | průměr | odchylka | |
20 | 2 | 0 | 0 | 5 | ||||
20 | 2 | 800 K | 9 | 54 350 | 52 989 | 5 | ||
50 | 2 | 800 K | 9 | 7 783 | 16 803 | 6 | ||
50 | 2 | Hl | 1 | 800 K | 9 | 62 230 | 71 462 | 5 |
50 | 2 | 800 K | 12 | 6 733 | 16 493 | 6 | ||
50 | 2 | Hl | 1 | 800 K | 12 | 72 700 | 150 300 | 5 |
40 | 2 | 800 K | 18 | 470 | 1 051 | 5 | ||
40 | 2 | Hl | 1 | 800 K | 18 | 82 608 | 104 443 | 6 |
40 | 2 | 800 K | 24 | 1 630 | 3 645 | 5 | ||
40 | 2 | Hl | 800 K | 24 | 45 750 | 63 942 | 5 | |
10 | 0,5 | Hl | 1,5 | D | 12 | 14 152 | 16 946 | 11 |
10 | 0,5 | Hl | 1,5 | C | 12 | 12 942 | 22 853 | 11 |
Příklad 7
Přenos nukleové kyseliny in vitro do buněk 3LL
Tento příklad popisuje přenos nukleových kyselin in vitro (na buněčné kultuře) prostřednictvím kompozice podle vynálezu, které obsahují nukleovou kyselinu, sloučeninu podle vynálezu vybranou z množiny derivátů protaminů a lipopolyaminů v 75 mM roztoku NaCl.
μΐ směsi se připraví následujícím postupem:
-0,5 pg plazmové DNA pCMV-luc, 0,5 pg PR1 nebo PR2 látky podle vynálezu v roztoku 75 mM NaCl
-Lipopolyamin C (RPR 120535), jeho množství se udává v Tabulce 11 pro každý pokus
-1.105 buněk 3LL (v 250 μΐ kultivační půdy DMEM s 10% séra telecího plodu) jsou inkubovány s předchozí směsí při 37°C pod atmosférou 5% CO2 po dobu 4 hodin. Přidá se 500 μΐ kultivační půdy a buňky jsou znovu uvedeny ke kultivaci. Příští den se buňky promyjí a opět vloží na dobu 24 hodin do stejného kultivačního media, které obsahuje 10% sera telecího plodu.Buňky se potom lýzují v 100 μΐ pufru (Promega).
Aktivita luciferasy se měří po přidání 50 μΐ substrátu (Promega). Odečítá se na luminometru LB v jednotkách RLU (relative lights units) za 10 sekund.
Výsledky pokusů s PR1 a PR2 jsou shrnuty v Tabulce 11 a .
Tabulka 11:
Lipopolyamin C/DNA | bez přípravku (RLU) | s PR2 (RLU) |
4X | 107 289 | 447 214 |
SX | 77 396 | 1 182 641 |
8X | 14 512 | 729 285 |
Tabulka 12:
Lipopolyamin C/DNA | bez přípravku (RLU) | s PR2 (RLU) |
4X | 12 037 | 6 304 |
6X | 901 | 113 113 |
8X | 328 | 294 743 |
Příklad 8
Injektace zahuštěných peptidů podle vynálezu bez lipopolyfektantu do nádorů in vivo.
-myši typu Swiss/nude dospělé samice
-experimentální indukované nádory po injekci 107 buněk 3T3 HER2 podkožní cestou
-injektování směsi kompozice 7 až 12 dni po injekci buněk. Zahuštěný nebo nezahuštěný roztok DNA s peptidem se injektuje přímo do nádoru stříkačkou typu Hamilton.
-dva dny po injekci se odbere nádorová tkáň, která se drtí a homogenizuje v 750 μΐ pufru (Promega Cell Lysis Buffer E153 A) . Po odstředěni (20 OOOg během 10 minut) , se odebere 10 μΐ vzorku, který slouží k posouzení aktivity luciferasy měřením luminiscenční emise získané po smísení s 50 μΐ reagentu (Promega Luciferase Assay Substráte) v luminometru Lumat LB 9501 (Berthold), integruje se 10 sekund.
Výsledná aktivita je vyjádřena v jednotkách RLU (Relative Lights Units).
Protokol: 0,5 mg / ml DNA se rozpustí v roztoku, který obsahuje soli, pufr a glukosu ve konečném množství, které je zmíněno v Tabulce výsledků. Před injektací koncentrace peptidů je 1 mg v 1 ml vody. K roztoku se přidá DNA v dostatečném množství pro dosažení určitého poměru hmotnost / hmotnost. Před injektací se roztok inkubuje alespoň 20 minut při teplotě prostředí. Dávka pro myš je 20 μΐ injekčního roztoku, který obsahuje 10 μΐ DNA.
Tabulka 13:
pufr | peptid | Výsledek RLU / nádor | počet zvířat | ||
NaCl/glu/ MES nebo HEPES 5 mM | ref. | peptid/DNA w/w | průměr | odchylka | |
150/HEPES | 1 689 938 | 1 388 072 | 6 | ||
nls-H | 0,02 | 6 819 100 | 5 860 709 | 6 | |
150/5/HEP ES | 369 563 | 577 901 | 6* | ||
nls-Hl | 0,1 | 1 654 313 | 2 145 147 | 6* | |
nls-Hl | 0,02 | 4 031 000 | 1 007 896 | 6* | |
931 275 | 214 229 | 4 | |||
H | 0,1 | 3 420432 | 1 285 704 | 6 |
*: myši uspalé směsí Imalgen + Rompun (130 mg / kg Ketaminu, 4 mg / kg Xylasinu, cestou intraperitoneální).
Seznam sekvencí (1) Všeobecné informace
(i) podavatel: | ||
(A) | Jméno: RHONE POULENC RORER S. , | |
(B) | Ulice: 20, Avenue | Raymond Aron |
(C) | Město: Antony | |
(D) | Země: Francie | |
(E) | Směrovací číslo: | 92165 |
(F) | Telefon: 40 91 69 | 22 |
(H) | Fax: (1) 40 91 72 | 96 |
(ii) název vynálezu: Prostředky obsahující aminové kyseliny, jejich příprava a použití (iii) počet sekvencí: 9 (iv) způsob luštění počítačem:
(A) Typ nosiče .· tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) systém využití: PC-DOS/MS-DOS
3Ί (D) logika: Patentr Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys 5 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 8 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Ala Thr Pro Ala Lys Lys Ala Ala 5 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 16 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
Ala Thr Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Thr Pro Ala Lys Lys 5 10
Ala Ala (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 18 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro Lys Thr Pro Lys Lys 5 10
Ala Lys Lys Pro (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala 5 10
Lys Lys Pro (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 26 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Lys Lys Ala Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Ala Ala Lys Pro
10
Lys Lys Ala Pro Lys Ser Pro Ala Lys Ala Lys Ala 15 20 25 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 18 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Ser Arg Ser Arg Tyr Tyr Arg Gin Arg Gin Arg Ser Arg Arg
10
Arg Arg Arg Arg (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 21 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
Arg Arg Arg Leu His Arg Ile His Arg Arg Gin His Arg Ser 5 10
Cys Arg Arg Arg Lys Arg Arg
20 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 9:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 26 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
Claims (22)
1. Farmaceutická kompozice vhodná pro transfekci nukleové kyseliny a obsahující kromě uvedené nukleové kyseliny transfekční činidlo a alespoň jednu sloučeninu působící v úrovni kondenzace uvedené nukleové kyseliny, vyznačená t í m , že uvedená sloučenina je tvořena zcela nebo částečně peptidovými motivy (KTPKKAKKP) nebo/a (ATPAKKAA) opakujícími se kontinuálně nebo nekontinuálně, přičemž počet těchto motivů se může pohybovat mezi 2a 10, nebo je tvořena oligopeptidem zvoleným z množiny zahrnující SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) a RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH).
2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že peptidové motivy mohou být mezi sebou odděleny vazbami biochemické povahy typu aminokyselin nebo/a chemické povahy.
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, v y z n a čená tím, že se jedná o vazby tvořené jednou nebo několika aminokyselinami.
4. Farmaceutická kompozice podle nároku 3, v y z n a čená tím, že sloučenina je odvozena od histonu H1.
5. Farmaceutická kompozice podle nároku 4, v y z n a čená tím, že sloučenina je odvozena od C-koncové oblasti histonu H1.
6. Farmaceutická kompozice podle nároku 4 nebo 5, v y SUBSTITUTE SHEET značená tím, že se výhodně jedná o oligopeptid zvolený z množiny zahrnující (KTPKKAKKP)(COOH), ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) a KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH).
7. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků
1 až 3,vyznačená tím, že sloučenina je odvozena od N-koncové oblasti nukleolinu.
8. Farmaceutická kompozice podle nároku 7, vyznačená tím, že se jedná o peptid (ATPAKKAA)2(COOH).
9. Farmaceutická kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že uvedená sloučenina má strukturu skládaného listu beta.
10. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 9,vyznačená tím, že uvedená sloučenina je navíc sdružená s ligandem buněčného receptoru.
11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, v y z n a čená tím, že se jedná o celek nebo část histonu H1 sdružený nebo sdruženou se signální sekvencí jádrové lokali zace.
12. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, v y z n a čená tím, že se jedná o peptid PKKKRKV-bAla-(KTPKKAKKP )2(COOH).
13. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 12,vyznačená tím, že uvedená sloučenina je
SUBSTiTU jl navíc sdružena s peptidem typu fusogenu podporujícího buněčnou transfekci uvedené kompozice.
14. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 13,vyznačená tím, že uvedená sloučenina je navíc polyglykosylovaná, sulfonovaná, fosforylovaná nebo/a naroubovaná na komplexní cukry nebo na lipofilní činidlo.
15. Farmaceutická kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že transfekčním činidlem je kationtový polymer nebo lipofektant.
16. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, v y z n a čená tím, že lipofektantem je lipid schopný tvořit lipisomy, latentní liposomy, imunoliposomy nebo cílové lípo somy.
17. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, v y z n a čená tím, že katíontovým polymerem je výhodně sloučenina obecného vzorce I
N-(CH2)r(I) ve kterém R může znamenat atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce (CH2)n-Npčičemž n znamená celé číslo mezi 2 a 10, p a q znamenají celá čísla a součet p+q má takovou hodnotu, že střední mole kulová hmotnost polymeru leží mezi 100 a 107 r, .J i 'Ί 'λ'
v.
Λ zly •HEET
18. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, vy z na čená tím, že kationtový polymer je zvolen z množiny zahrnující polyethylenimin (PEI) a polypropylenimin (PPI).
19. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, v y z n a čená tím, že polymer je zvolen z množiny zahrnující polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 50 000 (PEI50K) a polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 800 000 (PEI800K).
20. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, v y z n a čená tím, že lipofektant obsahuje alespoň jednu polyamínovou oblast obecného vzorce II
H_N-(-(CH) -NH-) -Η (II)
2 i m n i
ve kterém m znamená celé číslo větší nebo rovné 2 a n znamená celé číslo větší nebo rovné 1, přičemž hodnota m se může měnit pro různé uhlíkaté skupiny obsažené mezi dvěma aminovými skupinami, která je kovalentně vázaná k lipofilní oblasti typu nasyceného nebo nenasyceného uhlovodíkového řetězce cholesterolu, nebo přírodní nebo syntetický lipid schopný tvořit lamelární nebo hexagonální fáze.
21. Farmaceutická kompozice podle nároku 20, vyznačená tím, že polyaminová oblast je tvořena sperminem, therminem nebo některým z jejich analogů, u kterých jsou zachovány jejich vazebné vlastnosti k nukleové kyselině.
22. Farmaceutická kompozice podle nároku 20, vyznačená tím, že lipofektant obsahuje alespoň jednu lipofilní oblast obecného vzorce IV
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9501865A FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1995-02-17 | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
PCT/FR1996/000248 WO1996025508A1 (fr) | 1995-02-17 | 1996-02-15 | Compositions contenant des acides nucleiques, preparation et utilisation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ259297A3 true CZ259297A3 (en) | 1997-11-12 |
CZ293269B6 CZ293269B6 (cs) | 2004-03-17 |
Family
ID=9476267
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19972592A CZ293269B6 (cs) | 1995-02-17 | 1996-02-15 | Farmaceutická kompozice vhodná pro transfekci nukleové kyseliny a použití této kompozice pro přenos nukleové kyseliny |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5945400A (cs) |
EP (1) | EP0809705B1 (cs) |
JP (1) | JPH11500431A (cs) |
KR (1) | KR19980702200A (cs) |
AT (1) | ATE313642T1 (cs) |
AU (1) | AU706643B2 (cs) |
BR (1) | BR9607383A (cs) |
CA (1) | CA2211162A1 (cs) |
CZ (1) | CZ293269B6 (cs) |
DE (1) | DE69635609T2 (cs) |
FI (1) | FI973363A (cs) |
FR (1) | FR2730637B1 (cs) |
HU (1) | HU223263B1 (cs) |
IL (1) | IL117144A0 (cs) |
NO (1) | NO973745L (cs) |
SK (1) | SK281543B6 (cs) |
WO (1) | WO1996025508A1 (cs) |
ZA (1) | ZA961255B (cs) |
Families Citing this family (162)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6331524B1 (en) | 1994-12-09 | 2001-12-18 | Genzyme Corporation | Organ-specific targeting of cationic amphiphile / DNA complexes for gene therapy |
US5939401A (en) * | 1994-12-09 | 1999-08-17 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules |
US6383814B1 (en) | 1994-12-09 | 2002-05-07 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules |
US5948767A (en) * | 1994-12-09 | 1999-09-07 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphile/DNA complexes |
FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
WO1996041606A2 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | Therexsys Limited | Improved pharmaceutical compositions for gene therapy |
FR2741066B1 (fr) | 1995-11-14 | 1997-12-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques |
FR2756491B1 (fr) * | 1996-11-29 | 1999-01-08 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition transfectante utile en therapie genique associan t a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exog ene, un agent de transfection non viral et non plasmidique |
FR2750704B1 (fr) | 1996-07-04 | 1998-09-25 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production d'adn therapeutique |
CN1181422A (zh) * | 1996-10-31 | 1998-05-13 | 上海市肿瘤研究所 | 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体 |
CZ299055B6 (cs) | 1996-12-06 | 2008-04-09 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Izolovaný polypeptid kódovaný genem podobným genupro lipázu, prostredek mající fosfolipázovou úcinnost, farmaceutický prostredek, izolovaný imunizacní peptid a nukleová kyselina, biologicky aktivní prostredek, vektor, rekombinantní bunka, prostredek |
US7008776B1 (en) * | 1996-12-06 | 2006-03-07 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol |
US6884430B1 (en) | 1997-02-10 | 2005-04-26 | Aventis Pharma S.A. | Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles |
US6638502B1 (en) | 1997-04-28 | 2003-10-28 | Gencell Sas | Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors |
FR2763943B1 (fr) * | 1997-05-28 | 1999-07-09 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules |
US6875606B1 (en) | 1997-10-23 | 2005-04-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Human α-7 nicotinic receptor promoter |
FR2774394B1 (fr) * | 1998-01-30 | 2002-04-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composes transfectants sensibles aux conditions reductrices, compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs applications |
CN1289371A (zh) * | 1998-01-30 | 2001-03-28 | 阿文蒂斯药物股份有限公司 | 对还原条件敏感的转染化合物,含有它们的药物组合物及其应用 |
US6225456B1 (en) | 1998-05-07 | 2001-05-01 | University Technololy Corporation | Ras suppressor SUR-5 |
US6506889B1 (en) | 1998-05-19 | 2003-01-14 | University Technology Corporation | Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods |
KR20010101116A (ko) * | 1998-12-03 | 2001-11-14 | 추후제출 | 신규 핵산 전달제, 이를 함유하는 조성물 및 용도 |
FR2786700B1 (fr) * | 1998-12-03 | 2002-12-06 | Aventis Pharma Sa | Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs utilisations |
US6441156B1 (en) * | 1998-12-30 | 2002-08-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Calcium channel compositions and methods of use thereof |
ES2366100T3 (es) * | 1999-02-22 | 2011-10-17 | Georgetown University | Inmunoliposomas dirigidos mediante un fragmento de anticuerpo para la administración sistémica de genes. |
US9034329B2 (en) * | 1999-02-22 | 2015-05-19 | Georgetown University | Preparation of antibody or an antibody fragment-targeted immunoliposomes for systemic administration of therapeutic or diagnostic agents and uses thereof |
US7780882B2 (en) * | 1999-02-22 | 2010-08-24 | Georgetown University | Simplified and improved method for preparing an antibody or an antibody fragment targeted immunoliposome for systemic administration of a therapeutic or diagnostic agent |
GB9918670D0 (en) | 1999-08-06 | 1999-10-13 | Celltech Therapeutics Ltd | Biological product |
ATE289630T1 (de) * | 1999-09-09 | 2005-03-15 | Curevac Gmbh | Transfer von mrnas unter verwendung von polykationischen verbindungen |
CA2390716A1 (en) * | 1999-09-24 | 2001-04-05 | Alan D. King | Process for enhancing electric field-mediated delivery of biological materials into cells |
ATE511856T1 (de) | 2000-03-13 | 2011-06-15 | Cornell Res Foundation Inc | Blockieren der leukozytenemigration und entzündung durch störung mit cd99/hec2 |
US20040033600A1 (en) | 2001-03-21 | 2004-02-19 | Palli Subba Reddy | Ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
US20030212022A1 (en) * | 2001-03-23 | 2003-11-13 | Jean-Marie Vogel | Compositions and methods for gene therapy |
GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
US20040110928A1 (en) * | 2000-04-12 | 2004-06-10 | Andrea Crisanti | Peptide conjugates for drug delivery |
IL151348A0 (en) | 2000-04-13 | 2003-04-10 | Univ Rockefeller | Enhancement of antibody-mediated immune responses |
US6696038B1 (en) | 2000-09-14 | 2004-02-24 | Expression Genetics, Inc. | Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent |
US20040142474A1 (en) * | 2000-09-14 | 2004-07-22 | Expression Genetics, Inc. | Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent |
FR2814370B1 (fr) * | 2000-09-22 | 2004-08-20 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau |
US8105825B2 (en) | 2000-10-03 | 2012-01-31 | Intrexon Corporation | Multiple inducible gene regulation system |
US7060442B2 (en) | 2000-10-30 | 2006-06-13 | Regents Of The University Of Michigan | Modulators on Nod2 signaling |
ES2359625T3 (es) | 2000-12-28 | 2011-05-25 | Wyeth Llc | Proteina protectora recombinante de. |
US20030125239A1 (en) * | 2001-02-02 | 2003-07-03 | Andrea Crisanti | Compositions for drug delivery |
WO2002063026A1 (en) * | 2001-02-08 | 2002-08-15 | Geneporter, Inc. | Complexes and components thereof for introducing polynucleotides into eukaryotic cells |
AU2002248500B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-12-13 | Intrexon Corporation | Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
US7531326B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-05-12 | Intrexon Corporation | Chimeric retinoid X receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
DK1456346T3 (da) | 2001-02-20 | 2012-05-29 | Intrexon Corp | Nyt inducerbart genekspressionssystem baseret på ecdysonreceptor/invertebrat-retinoid-x-receptor |
EP1373470B1 (en) | 2001-02-20 | 2013-04-24 | Intrexon Corporation | Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
DK1499349T3 (da) | 2001-03-02 | 2010-04-06 | Univ Rockefeller | Rekombinante hybrid-allergenkonstrukter med reduceret allergenitet, der bibeholder det naterulige allergens immunogenitet |
US8216585B2 (en) * | 2001-05-25 | 2012-07-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeted particles and methods of using the same |
WO2002100435A1 (en) * | 2001-06-11 | 2002-12-19 | Centre Hospitalier Universitaire De Montreal | Compositions and methods for enhancing nucleic acid transfer into cells |
FR2829136B1 (fr) * | 2001-08-29 | 2006-11-17 | Aventis Pharma Sa | Derives lipidiques d'aminoglycosides |
CA2820170C (en) | 2001-09-26 | 2016-07-05 | Intrexon Corporation | Whitefly ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof |
US7563879B2 (en) | 2001-09-26 | 2009-07-21 | Intrexon Corporation | Leafhopper ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof |
US20040023910A1 (en) * | 2001-09-28 | 2004-02-05 | Zhiming Zhang | Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas |
MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
CN1308643C (zh) | 2002-01-17 | 2007-04-04 | 阿尔法·拉瓦尔股份公司 | 包括沉入式蒸发器的壳体 |
US7037520B2 (en) * | 2002-03-22 | 2006-05-02 | Baylor College Of Medicine | Reversible masking of liposomal complexes for targeted delivery |
US7375093B2 (en) | 2002-07-05 | 2008-05-20 | Intrexon Corporation | Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
BR0314751A (pt) | 2002-09-27 | 2005-07-26 | Powderject Res Ltd | Partìculas adequadas para suprimento a partir de um dispositivo de suprimento, receptáculo de dosagem para um dispositivo de suprimento, dispositivo de suprimento mediado por partìcula, processo para a preparação de partìculas adequadas para suprimento a partir de um dispositivo de suprimento, e, métodos de imunização por ácido nucleico e de terapia genética |
JP2006517790A (ja) * | 2003-01-09 | 2006-08-03 | インヴィトロジェン コーポレーション | ポリペプチド−核酸複合体の細胞の送達および活性化 |
US7304161B2 (en) * | 2003-02-10 | 2007-12-04 | Intrexon Corporation | Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex |
US7456315B2 (en) | 2003-02-28 | 2008-11-25 | Intrexon Corporation | Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
WO2005010157A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-03 | Cedars-Sinai Medical Center | Use of pleiotrophin in the diagnosis, treatment and prevention of disease |
US20090123468A1 (en) | 2003-10-24 | 2009-05-14 | Gencia Corporation | Transducible polypeptides for modifying metabolism |
WO2005056752A2 (en) | 2003-10-24 | 2005-06-23 | Gencia Corporation | Methods and compositions for delivering polynucleotides |
US8062891B2 (en) | 2003-10-24 | 2011-11-22 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants |
US20090208478A1 (en) * | 2003-10-24 | 2009-08-20 | Gencia Corporation | Transducible polypeptides for modifying metabolism |
US8133733B2 (en) | 2003-10-24 | 2012-03-13 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues |
US8507277B2 (en) | 2003-10-24 | 2013-08-13 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides |
US7432057B2 (en) | 2004-01-30 | 2008-10-07 | Michigan State University | Genetic test for PSE-susceptible turkeys |
ES2353604T3 (es) | 2004-04-20 | 2011-03-03 | Galapagos N.V. | Métodos, composiciones y ensayos de compuestos para inhibir la producción de proteína beta-amiloide. |
CA2562833A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-11-03 | Galapagos N.V. | Methods, agents, and compound screening assays for inducing differentiation of undifferentiated mammalian cells into osteoblasts |
US7935510B2 (en) | 2004-04-30 | 2011-05-03 | Intrexon Corporation | Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
EP2256198A1 (en) | 2004-06-14 | 2010-12-01 | Galapagos N.V. | Methods for identification, and compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases |
EP1771582A4 (en) | 2004-06-18 | 2008-04-16 | Univ Duke | MODULATORS OF ODOR RECEIVERS |
ES2427136T3 (es) | 2004-06-21 | 2013-10-29 | Galapagos N.V. | Métodos y medios para el tratamiento de la osteoartritis |
US7604798B2 (en) | 2004-07-15 | 2009-10-20 | Northwestern University | Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei |
WO2006020071A2 (en) | 2004-07-16 | 2006-02-23 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Vaccines against aids comprising cmv/r-nucleic acid constructs |
US7485468B2 (en) | 2004-10-15 | 2009-02-03 | Galapagos Bv | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases |
US7964571B2 (en) | 2004-12-09 | 2011-06-21 | Egen, Inc. | Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases |
US9034650B2 (en) | 2005-02-02 | 2015-05-19 | Intrexon Corporation | Site-specific serine recombinases and methods of their use |
US9006487B2 (en) * | 2005-06-15 | 2015-04-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Amine-containing lipids and uses thereof |
US8088382B2 (en) | 2005-07-05 | 2012-01-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Methods of inhibiting transendothelial migration of neutrophils and monocytes with anti-CD99L2 antibodies |
US7666584B2 (en) | 2005-09-01 | 2010-02-23 | Philadelphia Health & Education Coporation | Identification of a pin specific gene and protein (PIN-1) useful as a diagnostic treatment for prostate cancer |
MX2008014362A (es) | 2006-05-15 | 2008-11-27 | Univ Georgetown | Preparacion de inmunoliposomas dirigidos a anticuerpos o a fragmentos de anticuerpos para la administracion sistemica de agentes terapeuticos o de diagnostico y usos de los mismos. |
KR100857389B1 (ko) | 2006-06-30 | 2008-09-11 | (주)아모레퍼시픽 | Ap-grr 펩티드 또는 ap-grr 펩티드를 포함하는펩티드사슬 및 이를 포함하는 약물전달담체 |
BRPI0714981A2 (pt) | 2006-07-28 | 2013-08-13 | Sanofi Aventis | composiÇço, mÉtodo para fazer a mesma a qual compreende um inibidor que inibe a atividade de uma proteÍna do complexo iii, um veÍculo e um membro da superfamÍlia da fator de necrose de tumor, mÉtodo para conduzir um ensaio para determinar se um composto É um inibidor de atividade de supressço de tnf de uma proteÍna do complexo iii e uso de um composto |
JP5407862B2 (ja) * | 2006-10-04 | 2014-02-05 | サントル・ナシオナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィーク(セーエヌエールエス) | siRNAおよび脂質性4,5−二置換2−デオキシストレプタミン環アミノグリコシド誘導体を含む組成物ならびにその用途 |
AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
WO2008137993A1 (en) | 2007-05-08 | 2008-11-13 | Duke University | Compositions and methods for characterizing and regulating olfactory sensation |
WO2008153801A1 (en) | 2007-05-29 | 2008-12-18 | Intrexon Corporation | Chiral diachylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
CA2690685A1 (en) | 2007-06-20 | 2008-12-24 | Galapagos N.V. | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of bone and joint degenerative diseases |
US20090069266A1 (en) | 2007-06-27 | 2009-03-12 | Northwestern University | Methods and compositions for nucleic acid transfer into cells |
CA2692546C (en) * | 2007-07-09 | 2018-03-13 | Esther H. Chang | Methods for generating immune response using cationic-liposome-mediated nucleic acid delivery |
US9144546B2 (en) | 2007-08-06 | 2015-09-29 | Clsn Laboratories, Inc. | Nucleic acid-lipopolymer compositions |
EP2185730A4 (en) | 2007-08-23 | 2010-10-27 | Intrexon Corp | METHOD AND COMPOSITIONS FOR SICKNESS DIAGNOSIS |
WO2009036368A2 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Nitto Denko Corporation | Drug carriers |
CA2698460C (en) * | 2007-09-17 | 2015-11-24 | Rohm And Haas Company | Compositions and methods for the modification of physiological responses in plants |
JP2010540534A (ja) | 2007-09-28 | 2010-12-24 | イントレキソン コーポレーション | 生体治療分子の発現のための治療遺伝子スイッチ構築物およびバイオリアクター、ならびにその使用 |
EP2042193A1 (en) | 2007-09-28 | 2009-04-01 | Biomay AG | RNA Vaccines |
KR101655487B1 (ko) | 2007-10-08 | 2016-09-08 | 인트렉손 코포레이션 | 가공된 수지상 세포 및 암의 치료를 위한 이의 용도 |
FR2928373B1 (fr) | 2008-03-05 | 2010-12-31 | Centre Nat Rech Scient | Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene. |
EP2352828B1 (en) | 2008-09-11 | 2015-02-25 | Galapagos N.V. | Method for identifying compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of cf-associated mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator |
AU2009313615B2 (en) | 2008-11-05 | 2012-11-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (BHS) disease |
CN104910025B (zh) | 2008-11-07 | 2019-07-16 | 麻省理工学院 | 氨基醇类脂质和其用途 |
WO2010096561A1 (en) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof |
EP2398481A2 (en) | 2009-02-19 | 2011-12-28 | Galapagos N.V. | Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation |
WO2010094732A1 (en) | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Biofocus Dpi B.V. | Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation |
US20120004160A1 (en) | 2009-02-19 | 2012-01-05 | Glaxo Group Ltd. | Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation |
WO2010112569A1 (en) | 2009-03-31 | 2010-10-07 | Robert Zimmermann | Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor |
EP2414830A2 (en) | 2009-03-31 | 2012-02-08 | Robert Zimmermann | Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor |
US8663930B2 (en) | 2009-04-01 | 2014-03-04 | Galapagos Nv | Methods and means for treatment of osteoarthritis |
JP5822822B2 (ja) | 2009-04-17 | 2015-11-24 | ニューヨーク ユニバーシティ | Tnfファミリー受容体を標的とし、tnf作用を拮抗するペプチド、その組成物、方法および使用 |
WO2011015573A1 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Galapagos Nv | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases |
WO2011015572A1 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Galapagos Nv | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases |
US9186370B2 (en) | 2010-03-19 | 2015-11-17 | University Of South Alabama | Methods and compositions for the treatment of cancer |
TWI688395B (zh) | 2010-03-23 | 2020-03-21 | 英翠克頌公司 | 條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途 |
ES2850973T3 (es) | 2010-08-23 | 2021-09-01 | Wyeth Llc | Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis |
WO2012032489A1 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens |
CA2819552C (en) | 2010-12-09 | 2023-09-26 | Institut Pasteur | Mgmt-based method for obtaining high yield of recombinant protein expression |
EP2492279A1 (en) | 2011-02-25 | 2012-08-29 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Rapid immunogen selection method using lentiviral display |
SG10201600912SA (en) | 2011-03-04 | 2016-03-30 | Intrexon Corp | Vectors conditionally expressing protein |
WO2012135025A2 (en) | 2011-03-28 | 2012-10-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Conjugated lipomers and uses thereof |
WO2012135696A2 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | University Of South Alabama | Methods and compositions for the diagnosis, classification, and treatment of cancer |
EP2546358A1 (en) | 2011-07-15 | 2013-01-16 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Methods and reagents for efficient control of HIV progression |
US9127040B2 (en) | 2011-09-20 | 2015-09-08 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Regulation of sodium channels by PLUNC proteins |
WO2013053765A1 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | A non-human animal model of mucosa-associated lymphoid tissue (malt) lymphoma |
KR102272498B1 (ko) | 2011-10-27 | 2021-07-06 | 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 약물 캡슐화 마이크로스피어를 형성할 수 있는, n-말단 상에 관능화된 아미노산 유도체 |
NO2788478T3 (cs) | 2011-12-09 | 2018-01-20 | ||
WO2013103401A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | University Of South Alabama | Methods and compositions for the treatment of cancer |
NZ628449A (en) | 2012-03-09 | 2016-04-29 | Pfizer | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
EP2698377A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-02-19 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants |
JP6446377B2 (ja) | 2013-03-08 | 2018-12-26 | ファイザー・インク | 免疫原性融合ポリペプチド |
EP2972381A2 (en) | 2013-03-14 | 2016-01-20 | Galapagos NV | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition |
WO2014139884A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Galapagos Nv | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrosis |
US20160054304A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-02-25 | Galapagos Nv | Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases |
MX361717B (es) | 2013-03-15 | 2018-12-14 | Intrexon Corp | Diacilhidrazinas que contienen boro. |
WO2014193800A2 (en) | 2013-05-28 | 2014-12-04 | The Johns Hopkins University | Aptamers for the treatment of sickle cell disease |
CA2923129C (en) | 2013-09-08 | 2020-06-09 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
KR101605421B1 (ko) | 2014-03-05 | 2016-03-23 | 국립암센터 | B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도 |
EP3164379A1 (en) | 2014-07-02 | 2017-05-10 | Massachusetts Institute of Technology | Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof |
WO2016044390A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Intrexon Corporation | Boron-containing diacylhydrazine compounds |
MX2017010117A (es) | 2015-02-06 | 2018-05-17 | Univ North Carolina Chapel Hill | Casetes optimizados de expresión del gen humano del factor viii de coagulación y su uso. |
BR112017017460A2 (pt) | 2015-02-19 | 2018-04-10 | Pfizer Inc. | composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas |
TW201710503A (zh) | 2015-06-12 | 2017-03-16 | 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 | 新穎多核苷酸、載體、醫藥組成物以及其用途 |
AU2016278970B2 (en) | 2015-06-19 | 2020-10-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones and their use in compositions for delivering an agent to a subject or cell |
ES2907486T3 (es) | 2015-09-24 | 2022-04-25 | Univ North Carolina Chapel Hill | Métodos y composiciones para reducir metástasis |
CA3001590A1 (en) | 2015-10-10 | 2017-04-13 | Intrexon Corporation | Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12 |
WO2017147128A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Peptide inhibitors of calcium channels |
MX2019005235A (es) | 2016-11-09 | 2019-12-05 | Intrexon Corp | Constructos de expresion de frataxina. |
JP6661797B2 (ja) | 2016-11-22 | 2020-03-11 | 株式会社東芝 | 核酸凝縮ペプチド、核酸凝縮ペプチドセット、核酸送達キャリア、核酸送達方法、細胞作製方法、細胞検出方法及びキット |
CN110234658B (zh) | 2017-01-31 | 2024-03-12 | 辉瑞大药厂 | 脑膜炎奈瑟菌组合物及其使用方法 |
WO2019110817A1 (en) | 2017-12-08 | 2019-06-13 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Bioluminescent screening test for detecting cell cytolysis |
EP3539975A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-18 | Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron | Micropeptides and uses thereof |
KR20210043623A (ko) | 2018-08-10 | 2021-04-21 | 주식회사 유틸렉스 | Hla-dr에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포 |
CN114174327A (zh) | 2019-03-08 | 2022-03-11 | 黑曜石疗法公司 | 用于可调整调控的cd40l组合物和方法 |
WO2020212756A2 (en) | 2019-04-18 | 2020-10-22 | Genkin Dmitry Dmitrievich | Reprogramming of polymorphonuclear leukocytes |
CN115210250A (zh) | 2020-01-08 | 2022-10-18 | 黑曜石疗法公司 | 用于可调节性调控转录的组合物和方法 |
EP3885440A1 (en) | 2020-03-26 | 2021-09-29 | Splicebio, S.L. | Split inteins and their uses |
WO2023242436A1 (en) | 2022-06-17 | 2023-12-21 | Danmarks Tekniske Universitet | Allergy vaccines based on consensus allergens |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0140308B2 (en) | 1983-10-20 | 2001-10-17 | The Research Foundation Of State University Of New York | Regulation of gene expression by employing translational inhibition utilizing mRNA interfering complementary RNA |
FR2573436B1 (fr) | 1984-11-20 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins |
FR2602790B1 (fr) | 1986-08-13 | 1990-06-01 | Transgene Sa | Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante |
MC2115A1 (fr) | 1987-12-15 | 1991-07-05 | Gene Shears Pty Ltd | Ribozynes |
US5354844A (en) * | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
EP1026253B2 (en) | 1989-03-21 | 2012-12-19 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate |
FR2645866B1 (fr) | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi |
FR2646161B1 (fr) | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi |
US5286634A (en) | 1989-09-28 | 1994-02-15 | Stadler Joan K | Synergistic method for host cell transformation |
JP3222461B2 (ja) * | 1990-05-18 | 2001-10-29 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 新規タンパク質―ポリカチオン結合体 |
FR2681786A1 (fr) | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
FR2688514A1 (fr) | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
ATE260679T1 (de) * | 1992-04-03 | 2004-03-15 | Univ California | Selbstorganisierendes system zur verabreichung von polynukleotiden enthaltend ein amphiphatisches peptid |
US5334761A (en) | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
US5631237A (en) | 1992-12-22 | 1997-05-20 | Dzau; Victor J. | Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes |
FR2704234B1 (fr) | 1993-04-22 | 1995-07-21 | Centre Nat Rech Scient | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique. |
SG54115A1 (en) | 1993-04-27 | 1998-11-16 | Gerber Scient Products Inc | Thermal printing apparatus with improved power supply |
FR2704556B1 (fr) | 1993-04-30 | 1995-07-13 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants et leur utilisation en thérapie génique. |
FR2722506B1 (fr) | 1994-07-13 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations |
FR2727679B1 (fr) | 1994-12-05 | 1997-01-03 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques |
FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
-
1995
- 1995-02-17 FR FR9501865A patent/FR2730637B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-02-15 BR BR9607383A patent/BR9607383A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-02-15 HU HU9801207A patent/HU223263B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-02-15 DE DE69635609T patent/DE69635609T2/de not_active Revoked
- 1996-02-15 JP JP8524719A patent/JPH11500431A/ja not_active Ceased
- 1996-02-15 AT AT96904146T patent/ATE313642T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-15 EP EP96904146A patent/EP0809705B1/fr not_active Revoked
- 1996-02-15 SK SK1118-97A patent/SK281543B6/sk unknown
- 1996-02-15 CZ CZ19972592A patent/CZ293269B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-02-15 KR KR1019970705595A patent/KR19980702200A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-02-15 CA CA002211162A patent/CA2211162A1/fr not_active Abandoned
- 1996-02-15 IL IL11714496A patent/IL117144A0/xx unknown
- 1996-02-15 AU AU48353/96A patent/AU706643B2/en not_active Ceased
- 1996-02-15 WO PCT/FR1996/000248 patent/WO1996025508A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-02-15 US US08/894,339 patent/US5945400A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-17 ZA ZA961255A patent/ZA961255B/xx unknown
-
1997
- 1997-08-14 NO NO973745A patent/NO973745L/no not_active Application Discontinuation
- 1997-08-15 FI FI973363A patent/FI973363A/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-05-06 US US09/306,044 patent/US6200956B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0809705A1 (fr) | 1997-12-03 |
BR9607383A (pt) | 1997-11-25 |
AU706643B2 (en) | 1999-06-17 |
FR2730637A1 (fr) | 1996-08-23 |
US5945400A (en) | 1999-08-31 |
WO1996025508A1 (fr) | 1996-08-22 |
DE69635609T2 (de) | 2006-09-14 |
SK281543B6 (sk) | 2001-04-09 |
CZ293269B6 (cs) | 2004-03-17 |
EP0809705B1 (fr) | 2005-12-21 |
KR19980702200A (ko) | 1998-07-15 |
IL117144A0 (en) | 1996-06-18 |
MX9706016A (es) | 1997-11-29 |
NO973745D0 (no) | 1997-08-14 |
JPH11500431A (ja) | 1999-01-12 |
FI973363A0 (fi) | 1997-08-15 |
AU4835396A (en) | 1996-09-04 |
HU223263B1 (hu) | 2004-04-28 |
SK111897A3 (en) | 1998-02-04 |
ZA961255B (en) | 1996-08-27 |
NO973745L (no) | 1997-08-14 |
ATE313642T1 (de) | 2006-01-15 |
US6200956B1 (en) | 2001-03-13 |
FI973363A (fi) | 1997-08-15 |
HUP9801207A3 (en) | 2000-12-28 |
CA2211162A1 (fr) | 1996-08-22 |
FR2730637B1 (fr) | 1997-03-28 |
DE69635609D1 (de) | 2006-01-26 |
HUP9801207A2 (hu) | 1998-08-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ259297A3 (en) | Pharmaceutical composition suitable for transfection of nucleic acid and the use of such composition for nucleic acid transfer | |
US6172048B1 (en) | Composition containing nucleic acids, preparation and uses | |
EP0861228B1 (fr) | Lipopolymamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques | |
FI119738B (fi) | Nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta sisältävä koostumus ja käytöt | |
AU5714296A (en) | Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell | |
JP2002515418A (ja) | 肝細胞を標的とするポリエチレングリコール接合ポリ−l−リシンのポリマー遺伝子キャリヤー | |
US6372720B1 (en) | Liposome fusion and delivery vehicle | |
AU720697B2 (en) | Pharmaceutical composition which is useful for the transfection of nucleic acids, and uses thereof | |
Anwer et al. | Synthetic glycopeptide-based delivery systems for systemic gene targeting to hepatocytes | |
MXPA97006016A (en) | Composition containing nucleic acids, preparation and use | |
RU2377247C2 (ru) | Молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки днк в клетки гормон-чувствительных опухолей (варианты) | |
CN118271403A (zh) | 一种六支链树状大分子多肽及其制备方法和应用 | |
AU737314B2 (en) | Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same | |
RU2611399C1 (ru) | Меченые дендримерные пептиды | |
MXPA98001920A (en) | Pharmaceutical composition useful for the transfection of nucleic acids and its u | |
CZ20002713A3 (cs) | Činidlo pro přenos nukleové kyseliny citlivé k redukujícím podmínkám, farmaceutické » přípravky obsahující toto činidlo a použití činidla |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20050215 |