ES2427136T3 - Métodos y medios para el tratamiento de la osteoartritis - Google Patents

Métodos y medios para el tratamiento de la osteoartritis Download PDF

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Abstract

Un método para identificar in-vitro un compuesto que induce la estimulación anabólica de condrocitos, quecomprende - poner en contacto un compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidosseleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 126 y 127; y - medir una propiedad del compuesto-polipéptido relacionada con la estimulación anabólica de condrocitosen donde, preferentemente, dicho polipéptido está en una preparación libre de célula in vitro o dichopolipéptido está presente en una célula de mamífero.

Description

Métodos y medios para el tratamiento de la osteoartritis
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con el campo de la investigación medicinal, la fisiología de los cartílagos y enfermedades que involucran la degeneración del tejido de cartílago. Más específicamente, la invención se relaciona con métodos y medios para identificar compuestos que estimulan los procesos anabólicos en condrocitos y que inducen típicamente la síntesis de cartílago. La invención se relaciona además con los compuestos que son útiles en el tratamiento de la osteoartritis.
El cartílago es un tejido avascular compuesto en gran medida de células específicas de cartílago, condrocitos, proteoglicanos y proteínas de colágeno, son proteínas estructurales que proporcionan resistencia estructural al tejido conectivo, tal como piel, hueso y cartílago. El colágeno II, junto con la proteína colágeno IX, forma una "aleación biológica", que se moldea en una estructura similar a la fibrilla y se organiza en una red precisa, lo que proporciona cartílago con gran resistencia mecánica. Los condrocitos en el cartílago articular normal ocupan aproximadamente 5% del volumen de tejido, mientras que la matriz extra-celular constituye 95% restante del tejido. Los condrocitos secretan los componentes de la matriz, que a su vez proporcionar a los condrocitos con un medio ambiente adecuado para su supervivencia bajo estrés mecánico.
La desintegración del cartílago articular, que es parte de las articulaciones y que protege los extremos de los huesos, hace que los huesos se rocen, lo que conduce a dolor y pérdida de movimiento. La desintegración del cartílago además puede ser el resultado de un desequilibrio en la síntesis del cartílago (anabólico) y los procesos de degradación (catabolismo) del cartílago. A diferencia de la mayoría de los tejidos, el cartílago no se auto-repara después de la lesión. La incapacidad del cartílago de auto-repararse después de lesión, enfermedad, o cirugía es un factor limitante en la rehabilitación de las superficies articulares degradadas y las lesiones al cartílago del menisco.
Hay muchas enfermedades que implican la degeneración del cartílago. La artritis reumatoide y la osteoartritis están entre las más destacadas. La osteoartritis (además conocida como OA, o como artritis de desgaste y desgarro) es la forma más común de artritis y se caracteriza por la pérdida de cartílago articular, frecuentemente asociada con la hipertrofia del hueso. La enfermedad afecta principalmente las manos y articulaciones que soportan peso tales como las rodillas, caderas y vértebras. Este proceso reduce el cartílago mediante un fenómeno llamado apoptosis, o muerte celular programada. Cuando el área de superficie ha desaparecido debido a la reducción, hay un grado I de osteoartritis; cuando el área de superficie tangencial ha desaparecido, hay un grado dos de osteoartritis. Hay otros niveles de degeneración y destrucción, que afectan las capas profundas y calcificadas que lindan con el hueso subcondral.
Las manifestaciones clínicas del desarrollo de la afección osteoartritis son: aumento del volumen de la articulación, dolor, crepitación y discapacidad funcional que, gradual y regularmente, dificulta primero la ejecución de caminatas largas y los movimientos de flexión y extensión forzados, en dependencia de la articulación afectada, y después surge dolor y limitación de los esfuerzos mínimos, así como dolor en reposo que interrumpe el sueño. Si la afección persiste sin corrección y/o terapia, la articulación se destruye, lo que lleva al paciente a la cirugía de reemplazo importante con prótesis total, o a la discapacidad.
Se han desarrollado métodos terapéuticos para la corrección de las lesiones del cartílago articular que aparecen durante la enfermedad osteoartrítica, pero hasta el momento ninguno de ellos ha sido capaz de lograr la regeneración del cartílago articular in situ e in vivo.
DESARROLLOS REPORTADOS
La osteoartritis es difícil de tratar. Actualmente, no está disponible ninguna cura y el tratamiento se centra en aliviar el dolor y prevenir que la articulación afectada se deforme. Los tratamientos comunes incluyen el uso de fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (NSAID), que frecuentemente se usan para aliviar el dolor, mientras que los inhibidores específicos de la COX-2 se usan para aliviar el dolor severo. Se cree que los medicamentos tales como glucosamina y condroitina mejoran el propio cartílago. Estos tratamientos pueden ser relativamente exitosos, pero no está disponible una cantidad sustancial de datos de investigación.
En casos severos, puede ser necesario el reemplazo de articulaciones. Esto es especialmente válido para las caderas y las
rodillas. Si una articulación es extremadamente dolorosa y no se puede remplazar, se puede fundir. Este procedimiento detiene el dolor, pero resulta en la pérdida permanente de la función de la articulación, lo que hace difícil caminar y flexionar.
El tratamiento que tiene 74% a 90% de eficacia y produce excelentes resultados es el trasplante de condrocitos autólogos cultivados, al tomar material celular condral del paciente, enviarlo a un laboratorio donde se siembra en un medio adecuado para su proliferación, y, una vez que se logra un volumen suficiente después de un período variable que puede durar desde semanas a meses, transportarlo en un envase especial e implantarlo en el tejido dañado para cubrir los defectos del tejido.
Otro tratamiento incluye la instilación intra-articular de Hylan G-F 20 (Synvisc, Hyalgan, Artz etc.), una sustancia que mejora temporalmente la reología del líquido sinovial, lo que produce una sensación casi inmediata de libre circulación y una marcada reducción del dolor. Los efectos residuales de esta sustancia actúan sobre los receptores sinoviales lo que causa una reducción del dolor que dura varias semanas e incluso meses. Sin embargo, este efecto aislado es contraproducente para el curso de la enfermedad y para la viabilidad del cartílago porque, como enmascara los síntomas, la articulación se usa con más intensidad y su destrucción se acelera ya que el problema original no se corrige y el cartílago articular dañado no se restaura.
Otros métodos informados incluyen .la aplicación de injertos tendinoso, periostal, fascial, muscular, o pericondral; la implantación de fibrina o condrocitos cultivados; la implantación de matrices sintéticas, tales como colágeno, fibra de carbono; la administración de campos electromagnéticos . Todos estos han informado de resultados mínimos e incompletos con formación de reparación, pero no de tejido regenerativo, lo que resulta en un tejido de mala calidad que no puede soportar la carga pesada ni permite la restauración de una función articular con movimiento normal.
La estimulación de los procesos anabólicos, el bloqueo de los procesos catabólicos, o una combinación de estos dos, puede resultar en la estabilización del cartílago, y tal vez incluso la reversión del daño, y por lo tanto prevenir la progresión adicional de la enfermedad. Diversos desencadenantes pueden estimular la estimulación anabólica de condrocitos. El factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I) es el factor de crecimiento anabólico predominante en fluido sinovial y estimula la síntesis tanto de proteoglicanos y de colágeno. Además se ha demostrado que los miembros de la familia de la proteína morfogenética de hueso (BMP), en particular BMP2, BMP4, BMP6, y BMP7, y los miembros de la familia del factor de crecimiento transformante humano-b (TGF-ob) pueden inducir la estimulación anabólica de condrocitos (Chubinskaya y Kuettner, 2003). Recientemente se identificó un compuesto que induce la estimulación anabólica de condrocitos (US 6,500,854; EP 1.391211). Sin embargo, la mayoría de estos compuestos muestran efectos secundarios severos y, en consecuencia, existe una gran necesidad de compuestos que estimulen la diferenciación de condrocitos sin efectos secundarios severos.
La presente invención se refiere a la relación entre la función de las proteínas seleccionadas identificadas por los presentes inventores (de aquí en adelante denominadas como "DIANAS") y la estimulación anabólica de condrocitos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método para identificar compuestos que inducen procesos de síntesis de cartílago, que conducen a la estimulación anabólica de condrocitos, que comprende poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la sec. con núm. de ident.: 101-128 y 401-594, o un fragmento funcional o derivado de esta, bajo condiciones que permiten a dicho polipéptido unirse al compuesto, y medir una propiedad del compuesto-polipéptido relacionada con la estimulación anabólica de condrocitos.
La presente invención se refiere además a agentes inhibidores de la expresión, composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos, métodos para la producción in vitro de tejido de cartílago, y células huésped que expresan dichos agentes.
Aspectos del presente método incluyen el ensayo in vitro de compuestos por medio del uso del polipéptido de una DIANA, y ensayos celulares en donde la inhibición de la DIANA se sigue mediante la observación de indicadores de eficacia, que incluyen el colágeno tipo II, alfa-1 (col2a1) y niveles de agrecano.
Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento o prevención de una afección que implica la desdiferenciación de condrocitos y/o la pérdida de espesor del cartílago, en un sujeto que padece o es susceptible a la misma, mediante la administración de una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un inhibidor de la DIANA para mejorar la formación de cartílago.
Un aspecto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica para usar en dicho método en donde dicho inhibidor comprende un polinucleótido seleccionado del grupo de un polinucleótido antisentido, una ribozima, y un ARN interferente pequeño (ARNip), en donde dicho inhibidor comprende una secuencia de ácido nucleico complementario a, o diseñado a partir de, una secuencia de polinucleótido de origen natural que codifica un polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la sec. con núm. de ident.: 101-128 y 401-594, o un fragmento de estas.
Otro aspecto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la DIANA para mejorar la formación de cartílago, o su sal, hidrato, solvato, o profármaco de este, farmacéuticamente aceptable, en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los presentes polinucleótidos y compuestos inhibidores de la DIANA son útiles además para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de afecciones que implican la desdiferenciación de los condrocitos y/o la pérdida de espesor del cartílago.
Además, la invención también se relaciona con los métodos de diagnóstico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Cuantificación de la expresión de Col2a1 en condrocitos humanos primarios 12 días después de la infección con los virus indicados. Figura 2: Ejemplo de los resultados del tamizaje duplicado para la expresión de Col2a1 de parte de la genoteca SilenceSelect. Figura 3 (A-N): Cuantificación de la expresión de Col2a1 en condrocitos humanos primarios 12 días después de la infección con los virus indicados. Figura 4: Cuantificación de la tinción con azul de alciano en condrocitos primarios humanos, 12 días después de la infección con los virus indicados, en comparación con las células no infectadas. Figura 5 (A-N): Cuantificación de la expresión de agrecano en condrocitos humanos primarios 12 días después de la infección con los virus indicados.
Figura 6 (A-K): Análisis sobre el objetivo con diferentes construcciones dirigidas a los genes indicados . El análisis sobre la diana se evalúa mediante la detección de la expresión de Col2a1 en condrocitos humanos primarios 12 días después de la infección con los virus indicados. Los datos se representan como unidades de luminiscencia. Los diferentes umbrales correspondientes a los diferentes volúmenes de infección se indican como una línea. El aumento de los volúmenes de infección conduce a un aumento del umbral.
Figura 7 (A-L): Análisis de GAG en condrocitos en cultivo de células en alginato 10 días después de la infección. Los datos se representan como los niveles de GAG relativos al promedio del control 1 de KD y el control 2 de KD, Ad-ARNip estaba dirigido a PTGER4 y GRM7 respectivamente. Dos puntos de datos individuales se muestran para cada condición.
Figura 8 (A-L): Análisis de hidroxiprolina sobre condrocitos en cultivo de células en alginato 10 días después de la infección. Los datos se representan como los niveles de hidroxiprolina relativos al promedio del control 1 de KD y el control 2 de KD, el Ad-ARNip estaba dirigido a PTGER4 y GRM7 respectivamente. Dos puntos de datos individuales se muestran para cada condición.
Figura 9 (A-L): El análisis del marcador de ARNm sobre condrocitos en cultivo de células en alginato 10 días después de la infección. Las células se infectan con cualquiera de los dos virus que sobreexpresan Ad5/ALPL y Ad5/BMP2, y con un Ad-ARNip dirigido al gen indicado. Los datos se representan como los niveles de ARNm relativos al control de ALPL.
Descripción detallada
Los siguientes términos se usan en la presente de acuerdo con las siguientes definiciones:
El término "agente" significa cualquier molécula, que incluye, polipéptidos, polinucleótidos y moléculas pequeñas.
El término "estimulación anabólica de condrocitos" debe entenderse como la inducción de la condrogénesis o como la inducción o la mejora de la actividad anabólica de condrocitos. La estimulación anabólica se lleva a cabo, por ejemplo, por estimulación de la síntesis de los componentes del cartílago, o la inducción de la síntesis de los componentes que se requieren para la síntesis del cartílago. La "estimulación anabólica de condrocitos " además se puede entender como un proceso en el que se induce la expresión de la proteína Gla (MGP) de la matriz. La estimulación anabólica de condrocitos se puede entender además como la inducción de la expresión de la proteína sensible a ácido retinoico derivada de cartílago (CD-RAP), como la inducción de la expresión de la proteína de la matriz oligomérica del cartílago (COMP), como la
inducción de la expresión de agrecano 1 (agc1, además denominado proteína 1 del núcleo de proteoglicano de sulfato de condroitina, o CSPG1), o incluyendo la síntesis de colágeno II, además conocido como colágeno, tipo II, alfa-1 (col2a1), colágeno de cartílago, condrocalcina, y colágeno, tipo xi, alfa-3 (col11 a3).
El término "ácido nucleico antisentido" se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótido que interactúa mediante el apareamiento de bases con una secuencia de ácido nucleico complementaria específica implicada en la expresión de la diana de tal manera que la expresión del gen se reduce. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico específica implicada en la expresión del gen es una molécula de ADN genómico o molécula de ARNm que codifica (una parte de) el gen. La molécula de ADN genómico puede comprender regiones reguladoras del gen, o la secuencia codificante del gen maduro.
El término "ensayo" significa cualquier proceso que se usa para medir una propiedad específica de un compuesto. Un "ensayo de tamizaje" significa un proceso que se usa para caracterizar o seleccionar compuestos en base a su actividad a partir de una colección de compuestos.
El término "afinidad de unión" es una propiedad que describe cuán fuertemente dos o más compuestos se asocian entre sí en una relación no covalente. Las afinidades de unión se pueden caracterizar cualitativamente, (tales como "fuerte", "débil", "alta", o "baja") o cuantitativamente (tal como, medición de la KD).
El término "vehículo" significa un material no tóxico que se usa en la formulación de composiciones farmacéuticas para proporcionar un medio, volumen y/o forma usable de una composición farmacéutica. Un vehículo puede comprender uno o más materiales tales como un excipiente, estabilizador, o una solución acuosa de pH amortiguado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen ingredientes de amortiguadores acuosos o sólidos que incluyen fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS™.
El término "complejo" significa la entidad creada cuando dos o más compuestos se unen entre sí.
El término "compuesto" se usa en la presente invención en el contexto de un "compuesto de prueba" o un "compuesto candidato de fármaco" descrito en relación con los ensayos de la presente invención. Como tal, estos compuestos comprenden compuestos orgánicos o inorgánicos, derivados sintéticamente o de fuentes naturales. Los compuestos incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos tales como polinucleótidos, lípidos o análogos de hormonas que están caracterizados por pesos moleculares relativamente bajos. Otros compuestos de prueba orgánicos biopoliméricos incluyen péptidos que comprenden de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 aminoácidos y polipéptidos más grandes que comprenden de aproximadamente 40 a aproximadamente 500 aminoácidos, tales como anticuerpos o conjugados de anticuerpos.
El término 'complementario a una secuencia de nucleótidos " en el contexto de oligonucleótidos y métodos antisentido, debe entenderse como suficientemente complementario a tal secuencia como para permitir la hibridación a esa secuencia en una célula, es decir, bajo condiciones fisiológicas.
El término "afección" o "enfermedad" significa la presentación manifiesta de los síntomas (es decir, la enfermedad) o la manifestación de indicadores clínicos anormales (por ejemplo, indicadores bioquímicos). Alternativamente, el término "enfermedad" se refiere a un riesgo genético o ambiental de o la propensión a desarrollar tales síntomas o indicadores clínicos anormales.
El término "contacto" o "poner en contacto" significa reunir al menos dos porciones, ya sea en un sistema in vitro o en un sistema in vivo.
El término "desdiferenciación" se refiere a un proceso general en donde los condrocitos se diferencian a partir de un fenotipo celular que sintetiza los componentes del cartílago. Tales componentes incluyen, pero sin limitarse a, colágeno II, agrecano 1, versicano, proteína de enlace, perlecano, SZP/lubricina, biglicano (DS-PGI), decorina (DS-PGII), epificano (DS-PGIII), fibromodulina, lumicano, CILP, lectina tipo C, fibronectina, PRELP, COMP (trombospondina-5), trombospondina-1 y -3, CMP (matrilin-1), matrilin-3, lectina tipo C, fibronectina, condroadherina, tenascina-C, fibrilina, elastina, gp-391YKL-40, proteína de
la matriz Gla/MGP, pleiotrofina, condromodulina-I/SCGP, condromodulina-II, CD-RAP, condrocalcina, PARP, lisozima, y fosfolipasa A2.
El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de un compuesto o agente que provocará la respuesta biológica o médica de un sujeto que busca un doctor en medicina u otro clínico. Particularmente, con respecto a la inducción de la estimulación anabólica de condrocitos, el término "cantidad eficaz" se pretende que signifique una cantidad eficaz de un compuesto o agente promotor de la diferenciación que provocará un aumento biológicamente significativo en los niveles de marcadores de condrocitos, representativo para el proceso de un aumento en el anabolismo de condrocitos.
término "ácido nucleico expresable" significa un ácido nucleico que codifica para una molécula proteica, una molécula de ARN , o una molécula de ADN.
El término "endógeno" significa un material que un mamífero produce naturalmente. Endógeno en referencia al término "proteasa", "quinasa", o receptor acoplado a la proteína G ("GPCR") significa que un mamífero lo produce naturalmente (por ejemplo, y sin limitación, un humano). Por el contrario, el término no endógeno en este contexto significa que un mamífero no lo produce de manera natural (por ejemplo, y sin limitación, un humano). Ambos términos se pueden utilizar para describir ambos sistemas "in vivo" e "in vitro". Por ejemplo, sin una limitación, en un enfoque de tamizaje, la DIANA endógena o no endógena puede ser en referencia a un sistema de tamizaje in vitro. Como un ejemplo adicional y no de limitación, cuando el genoma de un mamífero se ha manipulado para incluir una DIANA no endógena, es viable el tamizaje de un compuesto candidato por medio de un sistema in vivo.
El término "expresión" comprende tanto la expresión endógena y la sobreexpresión por transducción.
El término "agente inhibidor de la expresión" significa un polinucleótido diseñado para interferir selectivamente con la transcripción, traducción y/o expresión de un polipéptido o proteína específico que normalmente se expresa dentro de una célula. Más particularmente, "agente inhibidor de la expresión" comprende una molécula de ADN o ARN que contiene una secuencia de nucleótidos idéntica a, o complementaria a, al menos aproximadamente 17 nucleótidos secuenciales dentro de la secuencia del polirribonucleótido que codifica para un polipéptido o proteína específica. Las moléculas inhibidoras de la expresión ilustrativas incluyen ribozimas, moléculas de ARNip de cadena doble, moléculas de ARNip de cadena sencilla autocomplementaria, construcciones antisentido genético, y moléculas antisentido de ARN sintético con esqueletos estabilizados modificados.
El término "ácido nucleico expresable" significa un ácido nucleico que codifica para una molécula proteica, una molécula de ARN, o una molécula de ADN.
El término 'antisentido genético' como se usa en la presente invención se refiere a la incorporación de construcciones antisentido complementarias a las secuencias de los genes en el genoma de una célula. Tal incorporación permite la síntesis continua de la molécula antisentido.
El término "hibridación" significa cualquier proceso por el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria mediante el apareamiento de bases. El término "complejo de hibridación" se refiere a un complejo formado entre dos secuencias de ácido nucleico en virtud de la formación de enlaces de hidrógeno entre bases complementarias. Un complejo de hibridación se puede formar en solución (por ejemplo, análisis de C0t o R0t) o formarse entre una secuencia de ácido nucleico presente en solución y otra secuencia de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido (por ejemplo, papel, membranas, filtros, chips, pasadores o láminas de vidrio, o cualquier otro sustrato adecuado al cual se han fijado las células o sus ácidos nucleicos). El término "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones que permiten la hibridación entre polinucleótidos y los polinucleótidos reivindicados. Las condiciones rigurosas se pueden definir por la concentración de sal, la concentración del disolvente orgánico, por ejemplo, formamida, la temperatura, y otras condiciones bien conocidas en la materia. Particularmente, reducir la concentración de sal, aumentar la concentración de formamida, o subir la temperatura de hibridación puede aumentar el rigor.
El término "inhibir" o "inhibidor", en relación al término "respuesta" significa que una respuesta se reduce o previene en presencia de un compuesto a diferencia de en ausencia del compuesto.
El término "inhibición" se refiere a la reducción, regulación descendente de un proceso o la eliminación de un estímulo para un proceso que resulta en la ausencia o minimización de la expresión de una proteína o polipéptido.
El término "inducción" se refiere a la inducción, regulación ascendente, o estimulación de un proceso que resulta en la expresión de una proteína o polipéptido, y que además puede resultar en un cambio celular fenotípico.
El término "ligando" significa una molécula endógena de origen natural, específica para un receptor endógeno, de origen natural.
El término "sales aceptables farmacéuticamente" se refiere a las sales de adición de ácido inorgánico y orgánico no tóxicas, y sales de adición de base, de los compuestos de la presente invención. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos útiles en la presente invención.
El término "polinucleótido" significa un ácido polinucleico, en forma de cadena sencilla o doble, y en la orientación sentido o antisentido, los ácidos polinucleicos complementarios que se hibridan a un ácido polinucleico particular bajo condiciones rigurosas, y los polinucleótidos que son homólogos en al menos aproximadamente 60 por ciento de sus pares de base, y con mayor preferencia 70 por ciento de sus pares de bases, son común, con la máxima preferencia 90 por ciento, y en una modalidad especial 100 por ciento de sus pares de base. Los polinucleótidos incluyen ácidos polirribonucleico, ácidos polidesoxirribonucleico, y análogos sintéticos de estos. Los polinucleótidos se describen por secuencias que varían en longitud, en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 5000 bases, preferentemente aproximadamente 100 a aproximadamente 4000 bases, con mayor preferencia aproximadamente 250 a aproximadamente 2500 bases. Una modalidad preferida de polinucleótido comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 bases de longitud. Una modalidad especial de polinucleótido es el poliribonucleótido de aproximadamente 10 a aproximadamente 22 nucleótidos, más comúnmente descrito como ARN interferentes pequeños ARNs (siARN). Otra modalidad especial son los ácidos nucleicos con esqueletos modificados tales como ácido nucleico peptídico (PNA), polisiloxano, y 2'-O-(2-metoxi) etilfosforotioato, o que incluyen residuos de ácido nucleico de origen no natural, o uno o más sustituyentes de ácidos nucleicos, tales como metilo-, tio-, sulfato, benzoilo-, fenilo-, amino-, propilo-, cloro-, y metanocarbanucleósidos, o una molécula indicadora para facilitar su detección .
El término "polipéptido" se refiere a proteínas (tales como las DIANAS), moléculas proteicas, fracciones de proteínas, péptidos y oligopéptidos.
El término 'ribozimas' como se usa en la presente invención se refiere a moléculas de ARN catalítico capaces de clivar otras moléculas de ARN en enlaces fosfodiéster de una manera específica a la secuencia.
El término "solvato" significa una asociación física de un compuesto útil en esta invención con una o más moléculas de disolvente. Esta asociación física incluye enlace hidrógeno. En ciertos casos, el solvato podrá aislarse, por ejemplo, cuando se incorporan una o más moléculas disolventes en la estructura reticular cristalina del sólido cristalino. "Solvato" abarca los solvatos en fase de solución y los aislables. Los solvatos representativos incluyen hidratos, etanolatos y metanolatos.
El término "sujeto" incluye los humanos y otros mamíferos.
El término "tratar" significa una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de, y de ese modo aliviar un trastorno, enfermedad o afección, que incluyen uno o más síntomas de tal trastorno o afección. Por consiguiente, "tratar" se refiere al tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas. Aquellos necesitados de tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como aquellos en los cuales el trastorno debe prevenirse. El término relacionado "tratamiento," como se usa en la presente invención, se refiere al acto de tratar un trastorno, síntoma, enfermedad o afección, como se define el término "tratar" anteriormente.
El término 'vectores' se refiere además a los plásmidos así como a los vectores virales, tales como los virus recombinantes,
o el ácido nucleico que codifica el virus recombinante.
El término "células de vertebrados" significa las células derivadas de animales que tienen estructura de vertebrados, que incluyen peces, aves, reptiles, anfibios, marsupiales, y especies de mamíferos. Las células preferidas se derivan de especies de mamíferos, y las células más preferidas son las células humanas. Las células de mamífero incluyen felino, canino, bovino, equino, caprino, ovino, porcino, murino, tales como ratones y ratas, y conejos.
La invención del solicitante se basa en la relación de la DIANA con la estimulación anabólica de los condrocitos Como se señaló anteriormente, la presente invención se basa en el descubrimiento de los presentes inventores de que las DIANAS son factores en la regulación ascendente y/o inducción de procesos anabólicos de condrocitos. El término "DIANA"
o "DIANAS" significa que las proteínas identificadas de acuerdo con el ensayo descrito más abajo están implicadas en la inducción de la estimulación anabólica de condrocitos. Las DIANAS preferidas se identifican como sec. con núms. de ident..
5 101-128 y 401-594 en la Tabla 1A. La Tabla 1A enumera las secuencias de polipéptidos, polinucleótidos y diana silenciadas de la presente invención. La Tabla 1 B enumera fragmentos ilustrativos de las proteínas transmembrana DIANAS. La Tabla 1C enumera secuencias diana KD ilustrativas útiles en la práctica del agente inhibidor de la expresión de la presente invención.
Tabla 1A
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen diana Acceso al GenBank Nombre Clase ADN proteín a Núm. de sec. KD
H33025
CCTGAATGTGACTGT GGAC (sec. con núm. de ident.: 209) DGKB -INCENP NM_020238 NM_004080 NM_145695 Diacilglicerol quinasa, beta 90kDa / antígenos de la proteína del centrómero interno 135/155kDa Quinasa 1 2 3 101 102 103 202-209
H33032 ) 332
GACTGACTGGCCTGA AGGC (sec. con núm. de ident.: 210) ICK NM_016513 NM_014920 quinasa de la célula intestinal (tipo MAK) Quinasa 4 5 104 105 210-217
H33034
GATCTACACCACCTT CATC (sec. con núm. de ident.: 219) GPCR103 AF411117 NM_198179 Receptor acoplado a la proteína G 103 GPCR 6 7 106 107 218-225
H33041
GGTGTATGGGCTCAT GTAC FZD1 NM_003505 homólogo 1 rizado (Drosophila) GPCR 8 108 226-232
(sec. con núm. de ident.: 226)
H33056
AGAACTGGGTGATGA CAGC ELA1 NM_001971 elastasa 1, pancreática Proteasa 9 109 233-240
(sec. con núm. de ident.: 234)
240
H33061.
ATGAACTCTGTGATC CAGC (sec. con núm. de ident.: 241) USP9Y NM_004654 proteasa específica de ubiquitina 9, ligada a Y (tipo fat facets, Drosophila) Proteasa 10 110 241-248
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen diana Acceso al GenBank Nombre Clase ADN proteín a Núm. de sec. KD
H33082
TTGGAATTCCAGTGT ACCC (sec. con núm. de ident.: 250) DUSP11 NM_003584 fosfatasa 11 de especificidad dual (interactúa con el complejo 1 ARN/RNP) Fosfatasa 11 111 249-256
H330383
GCTAGTTATCGCCTA CCTC (sec. con núm. de ident.: 257) DUSP3 N_004090 fosfatasa 3 de especificidad dual (fosfatasa de virus vaccinia relacionada con VH1) Fosfatasa 12 112 257-263
H33096
AGATTCCAGATGCAA CCCC (sec. con núm. de ident.: 266) JAK1 SK185 -MM_002227 Quinasa Janus 1 (una proteína tirosina quinasa) Quinasa 13 14 113 114 264-272
107
CTGAACTACTGGTAC AGCC ABCG1 NM_016818 casete de unión a ATP, sub-familia G (WHITE), miembro 1 Transportado r 15 115 273-280
(sec. con núm. de ident.: 275)
NM_004915 16 116
NM_207174 17 117
NM_207627 18 118
NM_207628 19 119
NM_207629 20 120
NM_207630 21 121
H33130
GCGAATTCCACCAGC ATTC (sec. con núm. de ident. SLC26A8 NM_052961 familia de vehículo de soluto 26, miembro 8 Transportado r 22 122 281-293
H33192
ACATTGACCAGGAAG TGAC (sec. con núm. de ident.: 296) 3GTLA4 NM_178312 NM_178311 NM_080920 actividad tipo glutamiltransferas a-gamma 4 Enzima 23 24 25 123 124 125 294-300
H33217
GAAGCTGAATTAGGG CTTC (sec. con núm. de ident.: 302) PDE1A NM_005019 NM_001003683 fosfodiestreasa 1A, calmodulinadependiente PDE 26 27 126 127 301-308
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen diana Acceso al GenBank Nombre Clase ADN proteín a Núm. de sec. KD
H33279
GAAGCCATCTCCGAC AATC (sec. con núm. de ident.: 310) SLC15A2 NM_ 021082 familia de vehículo de soluto 15 (H+/transportador de péptido), miembro 2 Transportado r 28 128 309-315
Tabla1B
Acceso
Nombre Segmento de proteína Segmento de proteína de Sec ID
AF411117
GPR103 Dominio extracelular 401
AF411117
GPR103 Dominio transmembrana 402
AF411117
GPR103 Dominio intracelular 403
AF411117
GPR103 Dominio transmembrana 404
AF411117
GPR103 Dominio extracelular 405
AF411117
GPR103 Dominio transmembrana 406
AF411117
GPR103 Dominio intracelular 407
AF411117
GPR103 Dominio transmembrana 408
AF411117
GPR103 Dominio extracelular 409
AF411117
GPR103 Dominio transmembrana 410
AF411117
GPR103 Dominio intracelular 411
AF411117
GPR103 Dominio transmembrana 412
AF411117
GPR103 Dominio extracelular 413
NM_198179
GPR103 Dominio extracelular 414
NM_198179
GPR103 Dominio transmembrana 415
NM_198179
GPR103 Dominio intracelular 416
NM_198179
GPR103 Dominio transmembrana 417
NM_198179
GPR103 Dominio extracelular 418
NM_198179
GPR103 Dominio transmembrana 419
NM_198179
GPR103 Dominio intracelular 420
NM_198179
GPR103 Dominio transmembrana 421
NM_198179
GPR103 Dominio extracelular 422
NM_198179
GPR103 Dominio transmembrana 423
NM_198179
GPR103 Dominio intracelular 424
NM_198179
GPR103 Dominio transmembrana 425
NM_198179
GPR103 Dominio extracelular 426
NM_198179
GPR103 Dominio transmembrana 427
NM_198179
GPR103 Dominio intracelular 428
Acceso
Nombre Segmento de proteína Segmento de proteína de Sec ID
NM_003505
FZD1 Dominio extracelular 429
NM_003505
FZD1 Dominio transmembrana 430
NM_003505
FZD1 Dominio intracelular 431
NM_003505
FZD1 Dominio transmembrana 432
NM_003505
FZD1 Dominio extracelular 433
NM_003505
FZD1 Dominio transmembrana 434
NM_003505
FZD1 Dominio intracelular 435
NM_003505
FZD1 Dominio transmembrana 436
NM_003505
FZD1 Dominio extracelular 437
NM_003505
FZD1 Dominio transmembrana 438
NM_003505
FZD1 Dominio intracelular 439
NM_003505
FZD1 Dominio transmembrana 440
NM_003505
FZD1 Dominio extracelular 441
NM_003505
FZD1 Dominio transmembrana 442
NM_003505
FZD1 Dominio intracelular 443
NM_016818
ABCG1 Dominio extracelular 444
NM_016818
ABCG1 Dominio transmembrana 445
NM_016818
ABCG1 Dominio intracelular 446
NM_016818
ABCG1 Dominio transmembrana 447
NM_016818
ABCG1 Dominio extracelular 448
NM_016818
ABCG1 Dominio transmembrana 449
NM_016818
ABCG1 Dominio intracelular 450
NM_016818
ABCG1 Dominio transmembrana 451
NM_016818
ABCG1 Dominio extracelular 452
NM_016818
ABCG1 Dominio transmembrana 453
NM_016818
ABCG1 Dominio intracelular 454
NM_016818
ABCG1 Dominio transmembrana 455
NM_016818
ABCG1 Dominio extracelular 456
NM_016818
ABCG1 Dominio transmembrana 457
NM_016818
ABCG1 Dominio intracelular 458
NM_004915
ABCG1 Dominio extracelular 459
NM_004915
ABCG1 Dominio transmembrana 460
NM_004915
ABCG1 Dominio intracelular 461
N_004915
ABCG1 Dominio transmembrana 462
NM_004915
ABCG1 Dominio extracelular 463
Acceso
Nombre Segmento de proteína Segmento de proteína de Sec ID
NM_004915
ABCG1 Dominio transmembrana 464
NM_004915
ABCG1 Dominio intracelular 465
NM_004915
ABCG1 Dominio transmembrana 466
NM_004915
ABCG1 Dominio extracelular 467
NM_004915
ABCG1 Dominio transmembrana 468
NM_004915
ABCG1 Dominio intracelular 469
NM_004915
ABCG1 Dominio transmembrana 470
NM_004915
ABCG1 Dominio extracelular 471
NM_004915
ABCG1 Dominio transmembrana 472
NM_004915
ABCG1 Dominio intracelular 473
NM_207174
ABCG1 Dominio extracelular 474
NM_207174
ABCG1 Dominio transmembrana 475
NM_207174
ABCG1 Dominio intracelular 476
NM_207174
ABCG1 Dominio transmembrana 477
NM_207174
ABCG1 Dominio extracelular 478
NM_207174
ABCG1 Dominio transmembrana 479
NM_207174
ABCG1 Dominio intracelular 480
NM_207174
ABCG1 Dominio transmembrana 481
NM_207174
ABCG1 Dominio extracelular 482
NM_207174
ABCG1 Dominio transmembrana 483
NM_207174
ABCG1 Dominio intracelular 484
NM_207174
ABCG1 Dominio transmembrana 485
NM_207174
ABCG1 Dominio extracelular 486
NM_207174
ABCG1 Dominio transmembrana 487
NM_207174
ABCG1 Dominio intracelular 488
NM_207627
ABCG1 Dominio extracelular 489
NM_207627
ABCG1 Dominio transmembrana 490
NM_207627
ABCG1 Dominio intracelular 491
NM_207627
ABCG1 Dominio transmembrana 492
NM_207627
ABCG1 Dominio extracelular 493
NM_207627
ABCG1 Dominio transmembrana 494
NM_207627
ABCG1 Dominio intracelular 495
NM_207627
ABCG1 Dominio transmembrana 496
NM_207627
ABCG1 Dominio extracelular 497
NM_207627
ABCG1 Dominio transmembrana 498
Acceso
Nombre Segmento de proteína Segmento de proteína de Sec ID
NM_207627
ABCG1 Dominio intracelular 499
NM_207627
ABCG1 Dominio transmembrana 500
NM_207627
ABCG1 Dominio extracelular 501
NM_207627
ABCG1 Dominio transmembrana 502
N_207627
ABCG1 Dominio intracelular 503
NM_207628
ABCG1 Dominio extracelular 504
NM_207628
ABCG1 Dominio transmembrana 505
NM_207628
ABCG1 Dominio intracelular 506
NM_207628
ABCG1 Dominio transmembrana 507
NM_207628
ABCG1 Dominio extracelular 508
NM_207628
ABCG1 Dominio transmembrana 509
NM_207628
ABCG1 Dominio intracelular 510
NM_207628
ABCG1 Dominio transmembrana 511
NM_207628
ABCG1 Dominio extracelular 512
NM_207628
ABCG1 Dominio transmembrana 513
NM_207628
ABCG1 Dominio intracelular 514
NM_207628
ABCG1 Dominio transmembrana 515
NM_207628
ABCG1 Dominio extracelular 516
NM_207628
ABCG1 Dominio transmembrana 517
NM_207628
ABCG1 Dominio intracelular 518
NM_207629
ABCG1 Dominio extracelular 519
NM_207629
ABCG1 Dominio transmembrana 520
NM_207629
ABCG1 Dominio intracelular 521
NM_207629
ABCG1 Dominio transmembrana 522
NM_207629
ABCG1 Dominio extracelular 523
NM_207629
ABCG1 Dominio transmembrana 524
NM_207629
ABCG1 Dominio intracelular 525
NM_207629
ABCG1 Dominio transmembrana 526
NM_207629
ABCG1 Dominio extracelular 527
NM_207629
ABCG1 Dominio transmembrana 528
NM_207629
ABCG1 Dominio intracelular 529
NM_207629
ABCG1 Dominio transmembrana 530
NM_207629
ABCG1 Dominio extracelular 531
NM_207629
ABCG1 Dominio transmembrana 532
NM_207629
ABCG1 Dominio intracelular 533
Acceso
Nombre Segmento de proteína Segmento de proteína de Sec ID
NM_207630
ABCG1 Dominio extracelular 534
NM_207630
ABCG1 Dominio transmembrana 535
NM_207630
ABCG1 Dominio intracelular 536
NM_207630
ABCG1 Dominio transmembrana 537
NM_207630
ABCG1 Dominio extracelular 538
NM_207630
ABCG1 Dominio transmembrana 539
NM_207630
ABCG1 Dominio intracelular 540
NM_207630
ABCG1 Dominio transmembrana 541
NM_207630
ABCG1 Dominio extracelular 542
NM_207630
ABCG1 Dominio transmembrana 543
NM_207630
ABCG1 Dominio intracelular 544
NM_207630
ABCG1 Dominio transmembrana 545
NM_207630
ABCG1 Dominio extracelular 546
NM_207630
ABCG1 Dominio transmembrana 547
NM_207630
ABCG1 Dominio intracelular 548
NM_052961
SLC26A8 Dominio intracelular 549
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 550
NM_052961
SLC26A8 Dominio extracelular 551
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 552
NM_052961
SLC26A8 Dominio intracelular 553
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 554
NM_052961
SLC26A8 Dominio extracelular 555
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 556
NM_052961
SLC26A8 Dominio intracelular 557
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 558
NM_052961
SLC26A8 Dominio extracelular 559
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 560
NM_052961
SLC26A8 Dominio intracelular 561
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 562
NM_052961
SLC26A8 Dominio extracelular 563
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 564
NM_052961
SLC26A8 Dominio intracelular 565
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 566
NM_052961
SLC26A8 Dominio extracelular 567
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 568
Acceso
Nombre Segmento de proteína Segmento de proteína de Sec ID
NM_052961
SLC26A8 Dominio intracelular 569
NM_052961
SLC26A8 Dominio transmembrana 570
NM_052961
SLC26A8 Dominio extracelular 571
NM_021082
SLC15A2 Dominio intracelular 572
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 573
NM_021082
SLC15A2 Dominio extracelular 574
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 575
NM_021082
SLC15A2 Dominio intracelular 576
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 577
NM_021082
SLC15A2 Dominio extracelular 578
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 579
NM_021082
SLC15A2 Dominio intracelular 580
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 581
NM_021082
SLC15A2 Dominio extracelular 582
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 583
NM_021082
SLC15A2 Dominio intracelular 584
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 585
NM_021082
SLC15A2 Dominio extracelular 586
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 587
NM_021082
SLC15A2 Dominio intracelular 588
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 589
NM_021082
SLC15A2 Dominio extracelular 590
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 591
NM_021082
SLC15A2 Dominio intracelular 592
NM_021082
SLC15A2 Dominio transmembrana 593
NM_021082
SLC15A2 Dominio extracelular 594
Tabla 1C
DIANA
Nombre ARNip_Nombre Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
ABCG1
A150100-ABCG1_v5 NM_004915_idx1797 AGTGGATGTCCTACATCTC 273
A150100-ABCG1_v6 NM_004915_idx500 ATCATGCAGGATGACATGC 274
A150100-ABCG1_v7 NM_004915_idx1481 CTGAACTACTGGTACAGCC 275
A150100-ABCG1_v10 NM_004915_idx872 CAGCTTTACGTCCTGAGTC 276
A150100-ABCG1_v11 NM_004915_idx1067 TCAGACCACAAGAGAGACC 277
A150100-ABCG1_v12 NM_004915_idx1789 GTACCTACAGTGGATGTCC 278
A150100-ABCG1_v8 NM_016818_idx603 TGGTCAAGGAGATACTGAC 279
DIANA
Nombre ARNip_Nombre Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
A150100-ABCG1_v9 NM_016818_idx718 CCCTCCAGTCATGTTCTTC 280
DGKB
A150100-DGKB_v1 NM_004080_idx104 TTCCATGGTAATGGTGTGC 202
A150100-DGKB_v2 NM_004080_idx1064 CCTGAATGTGACTGTGGAC 209
A150100-DGKB_v3 NM_004080_idx2398 CCGAAGCAAGGAATAATCC 203
A150100-DGKB_v10 NM_145695_idx466 TATGTTTCGCCTTTATGAC 204
A150100-DGKB_v11 NM_145695_idx654 GGATTCAAGGAGGAATGAC 205
A150100-DGKB_v12 NM_145695_idx870 CTCCCTCTTGCATCAAGAC 206
A150100-DGKB_v13 NM_145695_idx1387 AAATCCTCGTCAGGTTTAC 207
A150100-DGKB_v14 NM_145695_idx1729 AGTGCCTTACAGTATCATC 208
DUSP11
A150100-DUSP11_v1 NM_003584_idx427 CAGAGGATTTGCCAGAAAC 249
A150100-DUSP11_v2 NM_003584_idx743 TTGGAATTCCAGTGTACCC 250
A150100-DUSP11_v3 NM_003584_idx945 CAGAGACACCATCTCCCTC 251
A150100-DUSP11_v4 NM_003584_idx885 ACCCAGACCCAAAGTTTGC 252
A150100-DUSP11_v5 NM_003584_idx221 AAGGTGGAAAGACTATCTC 253
A150100-DUSP11_v6 NM_003584_idx420 TATAAACCAGAGGATTTGC 254
A150100-DUSP11_v7 NM_003584_idx836 GTATAATCTACATCAGATC 255
A150100-DUSP11_v8 NM_003584_idx933 CCACATGTTTACCAGAGAC 256
DUSP3
A150100-DUSP3_v1 NM_004090_idx425 GCTAGTTATCGCCTACCTC 257
A150100-DUSP3_v2 NM_004090_idx300 GACACACAGGAGTTCAACC 258
A150100-DUSP3_v3 NM_004090_idx176 GCTGCAGAAACTAGGCATC 259
A150100-DUSP3_v4 NM_004090_idx248 TGCCAACTTCTACAAGGAC 260
A150100-DUSP3_v5 NM_004090_idx299 CGACACACAGGAGTTCAAC 261
A150100-DUSP3_v6 NM_004090_idx458 GATGGACGTCAAGTCTGCC 262
A150100-DUSP3_v7 NM_004090_idx4305 ACAGGAGTTCAACCTCAGC 263
ELA1
A150100-ELA1_v1 NM_001971_idx754 TAATGTCATCGCCTCCAAC 233
A150100-ELA1_v2 NM_001971_idx162 AGAACTGGGTGATGACAGC 234
A150100-ELA1_v3 NM_001971_idx421 CAACAGTCCCTGCTACATC 235
A150100-ELA1_v4 NM_001971_idx280 GATCGTGGTGCATCCATAC 236
A150100-ELA1_v5 NM_001971_idx230 GCGTGGATTACCAGAAGAC 237
A150100-ELA1_v6 NM_001971_idx459 TAACAACAGTCCCTGCTAC 238
A150100-ELA1_v7 NM_001971_idx669 CCATTGCTTGGTGAATGGC 239
A150100-ELA1_v8 NM_001971_idx692 ATTCTCTCCATGGAGTGAC 240
FZD1
A150100-FZD1_v10 NM_003505_idx1323 GGTGTATGGGCTCATGTAC 226
A150100-FZD1_v11 NM_003505_idx2058 CATCGTCATCGCCTGCTAC 227
A150100-FZD1_v9 NM_003505_idx2007 GCTCATGGTGCGCATTGGC 228
DIANA
Nombre ARNip_Nombre Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
A150100-FZD1_v12 NM_003505_idx229 GTACCTTATGACGCTGATC 229
A150100-FZD1_v13 NM_003505_idx3317 ACCTGGTATGGGTTTGGCC 230
A150100-FZD1_v14 NM_003505_idx3883 ATGTGTGCAGGTCTACTGC 231
A150100-FZD1_v15 NM_003505_idx2704 TTATTTAGGGCGGTTTAAC 232
GGTLA4
A150100-GGT1_v8 NM_080839_idx451 ACTGGCCATCATCTACAAC 294
A150100-GGTLA4_v5 NM_080920_idx292 TGCTCACCTGTCTGTGGTC 295
A150100-GGTLA4_v6 NM_080920_idx702 ACATTGACCAGGAAGTGAC 296
A150100-GGTLA4_v7 NM_080920_idx411 TGGATGACTTCAGCTCTAC 297
A150100-GGT1_v10 NM_178311_idx629 CTACAACCTCTGGTTCGGC 298
A150100-GGT1_v11 NM_178311_idx707 CACGACAGTGGAGAGAAAC 299
A150100-GGTLA4_v8 NM_178311_idx287 GTTCTACATGCCGGATGAC 300
GPR103
A150100-GPR103_v5 AF411117_idx611 AGGCACCAGGGACTTGTGC 218
A150100-GPR103_v6 AF411117_idx820 GATCTACACCACCTTCATC 219
A150100-GPR103_v7 XM_172359_idx288 TGGTGTTCTACGTGGTGAC 220
A150100-GPR103_v8 AF411117_idx136 TGTTAGGCGCCTGCATTGC 221
A150100-GPR103_v10 AF411117_idx424 CAACATCTTTATCTGCTCC 222
A150100-GPR103_v11 AF411117_idx662 CGAAGGGCTTTCACAATGC 223
A150100-GPR103_v12 AF411117_idx106 GTACTACGTTGTAGCCCAC 224
A150100-GPR103_v9 AF411117_idx186 TGCAGGCGCTTAACATTAC 225
ICK
A150100-ICK_v1 NM_016513_idx870 GACTGACTGGCCTGAAGGC 210
4150100-ICK_v2 NM_016513_idx1665 GCAGCACTATTTGAAGCAC 211
A150100-ICK_v3 NM_016513_idx588 GCCTGAGAACCTCCTCTGC 212
A150100-ICK_v10 NM_016513_idx1027 ACAGCTAGTCAGGCACTTC 213
A150100-ICK_v11 NM_016513_idx1707 TATAAGAAATGGCATACTC 214
A150100-ICK_v12 NM_016513_idx1754 CTAATCCATGGTCTAGTTC 215
A150100-ICK_v8 NM_016513_idx504 GTCTGCTATAAGGAATATC 216
A150100-ICK_v9 NM_016513_idx713 AAGTACTCCTGAGGTCTAC 217
JAK1
A150100-JAK1_v1 oKD271 TTGGCATGGAACCAACGAC 264
A150100-JAK1_v2 oKD270 CCTCTTTGCCCTGTATGAC 265
A150100-JAK1_v7 oKD272 AGATTCCAGATGCAACCCC 266
A150100-JAK1_v8 SK185_idx1743 CATGAGCCAGCTGAGTTTC 267
A150100-JAK1_v9 SK185_idx142 GTGGAAGTGATCTTCTATC 268
A150100-JAK1_v12 NM_002227_idx1351 TGGCTGTCATGGTCCAATC 269
A150100-JAK1_v13 NM_002227_idx2512 CCGCTGCATGAACTATGAC 270
A150100-JAK1_v14 NM_002227_idx3093 TTGGAGACTTCGGTTTAAC 271
DIANA
Nombre ARNip_Nombre Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
A150100-JAK1_v15 NM_002227_idx3269 TGTGATTCAGATTCTAGTC 272
PDE1A
A150100-PDE1A_v5 NM_005019_idx913 AGGTATCATGCACTGGCTC 301
A150100-PDE1A_v6 NM_005019_idx1382 GAAGCTGAATTAGGGCTTC 302
A150100-PDE1A_v7 NM_005019_idx1709 CTGGTGGACATCATTCAGC 303
A150100-PDE1A_v10 NM_005019_idx1413 TTTGTGATCGGAAGTCAAC 304
A150100-PDE1A_v11 NM_005019_idx1601 ATTGCTGATGCACTAAGAC 305
A150100-PDE1A_v12 NM_005019_idx754 CAGATATGATCTTATCAAC 306
A150100-PDE1A_v13 NM_005019_idx887 ACTGTGCATTACATAATGC 307
A150100-PDE1A_v9 NM_005019_idx1073 CACGTGAGTGCAGCTTATC 308
SLC15A2
A150100-SLC15A2_v1 NM_021082_idx457 AGTCCTATCATTGATCGGC 309
A150100-SLC15A2_v2 NM_021082_idx121 GAAGCCATCTCCGACAATC 310
A150100-SLC15A2_v3 NM_021082_idx1166 ATGGCTGTTGGTATGATCC 311
A150100-SLC15A2_v4 NM_021082_idx1575 CCGTGAGGTTTGTTAACAC 312
A150100-SLC15A2_v5 NM_021082_idx423 TTGGGTGCCTTACCAATAC 313
A150100-SLC15A2_v6 NM_021082_idx1136 CTCCAAGTGTGGAATTAAC 314
A150100-SLC15A2_v7 NM_021082_idx1534 GCATGATGGTAAAGGATAC 315
SLC26A8
A150100-SLC26A8_v10 NM_052961_idx1925 TTCTGCAACTGTGATGATC 281
A150100-SLC26A8_v11 NM_052961_idx2288 GTACACTACGTGGATTCAC 282
A150100-SLC26A8_v2 NM_052961_idx923 GCGAATTCCACCAGCATTC 283
A150100-SLC26A8_v3 NM_052961_idx1761 TCTTCCAGTGCTGCAGCTC 284
A150100-SLC26A8_v4 NM_052961_idx2693 TCAGAACAAGAGGCTGGGC 285
A150100-SLC26A8_v5 NM_052961_idx1228 GAAGATTGCCAGTCTTCAC 286
A150100-SLC26A8_v6 NM_052961_idx457 GATTCCTCCTCTCAACATC 287
A150100-SLC26A8_v7 NM_052961_idx936 GCATTCTAGTATTTCTAAC 288
A150100-SLC26A8_v8 NM_052961_idx1249 TTACAGTGTCAATTCCAAC 289
A150100-SLC26A8_v9 NM_052961_idx1723 TGATTATCGGGAGATCATC 290
A150100-SLC26A8_v12 NM_052961_idx338 GAATGGATGTGTATGTATC 291
A150100-SLC26A8_v13 NM_052961_idx1105 TGACATGATTCCTTATAGC 292
A150100-SLC26A8_v14 NM_052961_idx1446 TCTACACACTGCCAAATGC 293
USP9Y
A150100-USP9Y_v1 NM_004654_idx5651 ATGAACTCTGTGATCCAGC 241
A150100-USP9Y_v2 NM_004654_idx1600 AGGTTGGCTAGTGGATCTC 242
A150100-USP9Y_v3 NM_004654_idx2636 AAGTGGGTAATTCCTGCTC 243
A150100-USP9X_v4 NM_021906_idx1189 CGAATGGCAGAATGGATAC 244
A150100-USP9X_v5 NM_004654_idx7911 TCTGGCAGGTTGCATATTC 245
A150100-USP9Y_v4 NM_004654_idx1489 CTGCAAGTTTCATATCTAC 246
DIANA
Nombre ARNip_Nombre Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
A150100-USP9Y_v5 NM_004654_idx2820 ATAGCATCAGATTGTATGC 247
A150100-USP9Y_v6 NM_004654_idx5731 TTTACACGATGATATGTTC 248
La presente invención se refiere a un método para ensayar compuestos que inducen la estimulación anabólica de condrocitos, que comprende poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de los polipéptidos de sec. con núm. de ident.: 101-128 ("DIANAS") o un fragmento funcional de estos, bajo condiciones que permiten que dicho polipéptido se una al compuesto, y detectar la formación de un complejo entre el polipéptido y el compuesto. Un medio preferido de medición de la formación del complejo es determinar la afinidad de unión de dicho compuesto a dicho polipéptido.
Más particularmente, la invención se refiere un método para identificar un agente que induce la estimulación anabólica de condrocitos, el método que comprende adicionalmente:
(a)
poner en contacto una población de células de condrocitos con uno o más de dichos compuestos que exhibe afinidad de unión para dichas DIANAS, y
(b)
medir una propiedad del compuesto-polipéptido relacionada con la estimulación anabólica de condrocitos.
La propiedad del compuesto-polipéptido anterior está relacionada con la estimulación anabólica de condrocitos, y es un fenómeno medible elegido por la persona de experiencia ordinaria en la materia. La propiedad medible puede ser por ejemplo, la afinidad de unión para un dominio de péptido del polipéptido DIANA o el nivel de cualquiera de un número de niveles de los marcadores bioquímicos de aumento del anabolismo de condrocitos. La estimulación anabólica de condrocitos por ejemplo, se puede medir mediante la medición del nivel de proteínas y otras moléculas que se inducen durante el proceso de diferenciación, tales como componentes clave de cartílago normal. Particularmente, se mide la inducción del componente proteico principal del cartílago, el colágeno II.
Adicionalmente, las propiedades del compuesto-polipéptido relacionadas con la estimulación anabólica de condrocitos se miden en células C20/A4; T/C-28a2; T/C-28a4; C-28/12; Ch-4,8,N; Ch-8-OA; TC6; MCT;MC615; IRC; RCS2; Hig82; y D1 ORL UVA (D1). Sin embargo, tales propiedades además se miden en sistemas de células no condrocitos. Por ejemplo, los ensayos de uniónin situ que determinan la afinidad de los compuestos para unirse a los polipéptidos de la invención se realizan por medio del uso de cualquier tipo de célula que exprese el polipéptido. La expresión del polipéptido es exógena o endógena. Además, cuando la propiedad del compuesto-polipéptido es la activación de una ruta biológica, cualquier célula que contiene los componentes celulares de la ruta se usa para medir la propiedad del compuesto-polipéptido. Por ejemplo, la inducción de col2a1 o agrecano en los condrocitos es indicativa de la estimulación anabólica de condrocitos. Específicamente, las células no condrocitos se pueden diseñar para contener una molécula indicadora activada por los promotores de col2a1 o agrecano. De esta manera un no condrocito se puede usar para medir una propiedad indicativa de la estimulación anabólica de condrocitos.
La invención se refiere a un método para identificar un compuesto que induce y/o aumenta la estimulación anabólica de condrocitos, dicho método comprende las etapas de: cultivar una población de células que expresan un polipéptido de cualquiera de los enumerados en la Tabla 1A, o un fragmento o derivado funcional de este; determinar un primer nivel de diferenciación condrogénica en dicha población de células; exponer dicha población de células a un compuesto, o una mezcla de compuestos; determinar el nivel de diferenciación condrogénica en dicha población de células durante o después de la exposición de dicha población de células al compuesto, o la mezcla de compuestos; e identificar el compuesto que induce y/o aumenta la diferenciación condrogénica.
La invención además se refiere a un método para identificar un compuesto que disminuye la expresión y/o actividad de cualquiera de los polipéptidos enumerados en la Tabla 1A, dicho método comprende las etapas de: cultivar una población de células que expresan dicho polipéptido, o un fragmento, o un derivado de este; determinar un primer nivel de expresión y/o actividad de dicho polipéptido; exponer dicha población de células a un compuesto, o una mezcla de compuestos; determinar el nivel de expresión y/o actividad de dicho polipéptido durante o después de la exposición de dicha población de células al compuesto, o la mezcla de compuestos; e identificar el compuesto que disminuye la expresión y/o actividad de dicho polipéptido. Si la actividad del polipéptido no es fácilmente medible, la identificación del compuesto se puede beneficiar de una etapa extra que comprende exponer dicha población de células a un agonista de dicho polipéptido. Además, los métodos de la presente invención pueden comprender la etapa de introducir un gen que codifica cualquiera de
los polipéptidos enumerados en la Tabla 1A, en dicha población de células. Para los propósitos de alto rendimiento puede ser beneficioso tener el gen integrado de forma estable en el genoma de dichas células.
En una modalidad preferida, el nivel de (re-)diferenciación de condrocitos se determina por la medición del nivel de expresión de un gen marcador, en donde un gen marcador preferido codifica el colágeno tipo II, alfa-1 (col2a1) o agrecano. Para la estimulación anabólica adecuada, se prefiere que se aumente la expresión y/o actividad de col2a1 o agrecano.
La presente invención proporciona en una modalidad particular métodos para identificar compuestos nuevos, en donde el polipéptido es un GPCR. Si es así , la expresión y/o actividad de dicho GPCR preferentemente se determina por la medición del nivel de un segundo mensajero. Los segundos mensajeros preferidos son AMP cíclico, Ca2+ o ambos. Típicamente, el nivel del segundo mensajero se determina con un gen indicador bajo el control de un promotor que es sensible al segundo mensajero, en donde se prefiere que el promotor sea un promotor sensible al AMP cíclico, un promotor sensible a NF-KB, un promotor sensible a NF-AT, y en donde el gen indicador se selecciona del grupo que consiste de: fosfatasa alcalina, GFP, eGFP, dGFP, luciferasa y o-ogalactosidasa.
En otra modalidad particular, la invención proporciona métodos para identificar nuevos compuestos, en donde el polipéptido es una quinasa o una fosfatasa. Preferentemente, la actividad de dicha quinasa o fosfatasa se determina midiendo el nivel de fosforilación de un sustrato de dicha quinasa o fosfatasa.
En aún otra modalidad particular, la invención proporciona métodos para identificar nuevos compuestos, en donde el polipéptido es una proteasa. Preferentemente, la actividad de dicha proteasa se mide determinando el nivel de clivaje de un sustrato de dicha proteasa.
Los métodos para determinar los niveles de segundo mensajero, el uso de los genes indicadores y promotores sensibles a segundos mensajeros así como ensayos de fosfatasa y ensayos de proteasa se conocen bien en la materia y no se detallan adicionalmente en la presente invención.
En una modalidad preferida, el compuesto que inhibe el polipéptido exhibe una afinidad de unión al polipéptido de a lo sumo 10 micromolar.
En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido DIANA comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 101-128 y 401-594 (Tablas 1A y 1B). En una modalidad de la invención especialmente preferida, el polipéptido DIANA comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 101-128 (Tabla 1A).
En dependencia de la elección del técnico con experiencia, el presente método de ensayo se puede diseñar para funcionar como una serie de mediciones, cada una de las cuales se diseña para determinar si el compuesto candidato a fármaco claramente actúa sobre el polipéptido para de ese modo inducir la estimulación anabólica de condrocitos. Por ejemplo, un ensayo diseñado para determinar la afinidad de unión de un compuesto al polipéptido, o fragmento de este, podría ser necesario, pero no suficiente, para determinar si el compuesto de prueba sería útil para aumentar el espesor medio del cartílago cuando se administra a un sujeto. Sin embargo, tal información de unión sería útil en la identificación de un conjunto de compuestos de prueba para su uso en un ensayo que mediría una propiedad diferente, más arriba en la ruta bioquímica, tal como la síntesis de componentes del cartílago, ensayado por la medición de la cantidad de colágeno II. Tal segundo ensayo se puede diseñar para confirmar que el compuesto de prueba, que tiene afinidad de unión por el polipéptido, en realidad induce la estimulación anabólica de condrocitos. Los controles adecuados deben estar siempre en su lugar para asegurarse contra las lecturas de falsos positivos.
El orden de tomar estas mediciones, no se cree que es crítica para la práctica de la presente invención, que se puede practicar en cualquier orden. Por ejemplo, uno puede realizar primero un ensayo de tamizaje de un de un conjunto de compuestos para los cuales no se conoce información respecto a la afinidad de unión de los compuestos por el polipéptido. Alternativamente, uno puede tamizar un conjunto de compuestos identificados como que tienen afinidad de unión para un dominio del polipéptido, o una clase de compuestos identificados como que son un inhibidor del polipéptido. Sin embargo, para que el presente ensayo sea significativo para el uso final de los compuestos candidatos a fármacos, es necesaria una medición de los niveles de colágeno II o agrecano. Los estudios de validación que incluyen controles, y mediciones de afinidad de unión a los polipéptidos de la invención son, sin embargo, útiles en la identificación de un compuesto útil en cualquier aplicación terapéutica o de diagnóstico.
La afinidad de unión del compuesto con el polipéptido DIANA se puede medir por métodos conocidos en la materia, tales
como por medio del uso de biosensores de resonancia de plasmón superficial (Biacore), por análisis de unión de saturación con un compuesto marcado (por ejemplo el análisis de Scatchard y Lindmo), por espectrofotómetro UV diferencial, ensayo de polarización de fluorescencia, sistema lector de placa de obtención de imágenes de fluorométricas (FLIPR®), la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, y la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia. La afinidad de unión de compuestos además se puede expresar en la constante de disociación (Kd) o como IC50 o EC50. La IC50 representa la concentración de un compuesto que se requiere para la inhibición de 50% de la unión de otro ligando al polipéptido. La EC50 representa la concentración requerida para obtener 50% del efecto máximo en cualquier ensayo que mide la función de la DIANA. La constante de disociación, Kd, es una medida de lo bien que un ligando se une al polipéptido, que es equivalente a la concentración de ligando requerida para saturar exactamente la mitad de los sitios de unión en el polipéptido. Los compuestos con una alta afinidad de unión tienen bajos valores de Kd, IC50 y EC50, es decir, en el intervalo de 100 nM a 1 pM; una moderada a baja afinidad de unión se refiere a altos valores de Kd, IC50 y EC50, es decir, en el intervalo micromolar.
El presente método de ensayo además se puede practicar en un ensayo celular, una célula huésped que expresa la DIANA puede ser una célula con expresión endógena o una célula que sobre-expresa la DIANA, por ejemplo, por transducción. Cuando la expresión endógena del polipéptido no es suficiente para determinar una línea de base que se pueda medir fácilmente, uno lo puede usar por medio de células huésped que sobreexpresan la DIANA. La sobreexpresión tiene la ventaja de que el nivel de los productos finales del sustrato DIANA es más alto que el nivel de actividad por expresión endógena. Por consiguiente, la medición de tales niveles por medio del uso de técnicas actualmente disponibles es más fácil. En tales ensayos celulares, la actividad biológica de la DIANA se puede medir por seguimiento de la producción de la síntesis de componentes del cartílago.
La presente invención se refiere además a un método para identificar un compuesto que induce la estimulación anabólica de condrocitos, que comprende:
(a)
poner en contacto un compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 101-128 y 401-594;
(b)
determinar la afinidad de unión del compuesto al polipéptido;
(c)
poner en contacto una población de células de mamífero que expresan dicho polipéptido con el compuesto que exhibe una afinidad de unión de al menos 10 micromolar; e
(d)
identificar el compuesto que induce la síntesis de proteínas que son un constituyente del cartílago normal y/o que se requieren para la formación de cartílago.
Para los propósitos de alto rendimiento, se pueden usar genotecas de compuestos tales como genotecas de fragmentos de anticuerpos, genotecas de péptidos de presentación en fago, genotecas de péptidos (por ejemplo, LOPAP™, Sigma Aldrich), genotecas de lípidos (BioMol), genotecas de compuestos sintéticos (por ejemplo, LOPAC™, Sigma Aldrich) o genotecas de compuestos naturales (Specs, TimTec).
Los compuestos candidatos a fármacos preferidos son compuestos de bajo peso molecular. Los compuestos de bajo peso molecular, es decir, con un peso molecular de 500 dalton o menos, es probable que tengan una buena absorción y permeación en los sistemas biológicos y por consiguiente, es más probable que sean candidatos a fármacos exitosos que los compuestos con un peso molecular por encima de 500 dalton (Lipinski y otros, (1997)). Péptidos comprenden otra clase preferida de compuestos candidatos a fármacos. Los péptidos pueden ser excelentes candidatos a fármacos y hay múltiples ejemplos de péptidos comercialmente valiosos, tales como las hormonas de la fertilidad y los inhibidores de agregación de plaquetas. Los compuestos naturales son otra clase preferida de compuesto candidato a fármaco. Tales compuestos se encuentran en y se extraen de fuentes naturales, y los que después de eso se pueden sintetizar. Los lípidos son otra clase preferida de compuesto candidato a fármaco.
Otra clase preferida de compuestos candidatos a fármacos es un anticuerpo. La presente invención además proporciona anticuerpos dirigidos contra una DIANA. Estos anticuerpos se pueden producir de manera endógena para unirse a la DIANA dentro de la célula, o se añaden al tejido para unirse al polipéptido DIANA presente fuera de la célula. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales. La presente invención incluye anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla, y humanizados, así como fragmentos FAb y los productos de una genoteca de expresión de FAb y fragmentos Fv y los productos de una genoteca de expresión de Fv.
En ciertas modalidades, los anticuerpos policlonales se pueden usar en la práctica de la invención. El técnico con experiencia conoce métodos para preparar anticuerpos policlonales. Se pueden levantar anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, por una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el
agente inmunizante y/o adyuvante se inyecta en el mamífero por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Los anticuerpos además se pueden generar contra la proteína o polipéptido DIANA intacto, o contra un fragmento, derivados que incluyen conjugados, u otro epítopo de la proteína o polipéptido DIANA, tales como la DIANA incrustada en una membrana celular, o una genoteca de regiones variables de anticuerpos, tales como una genoteca de presentación en fagos.
Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen pero sin limitarse a hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintética). Alguien con experiencia en la materia sin experimentación excesiva puede seleccionar el protocolo de inmunización.
En algunas modalidades, los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por medio del uso de métodos conocidos en la materia. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden ser "humanizados" para prevenir que el huésped monte una respuesta inmune contra los anticuerpos. Un "anticuerpo humanizado" es uno en que las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y/o otras porciones de los marcos del dominio variable ligero y/o pesado se derivan de una inmunoglobulina no humana, pero las restantes porciones de la molécula se derivan de una o más inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos humanizados además incluyen anticuerpos que se caracterizan por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera sin modificar
o una cadena ligera quimérica donadora o aceptora, o viceversa. La humanización de los anticuerpos puede realizarse por métodos conocidos en la materia (ver, por ejemplo Mark y Padlan, (1994) "Capítulo 4. Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113, Springer-Verlag, Nueva York). Animales transgénicos pueden usarse para expresar los anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos humanos pueden producirse además por medio del uso de varias técnicas conocidas en la materia, que incluyen genotecas de exhibición de fago (Hoogenboom y Winter, (1991) J. Mol. Biol. 227:381-8; Marks y otros (1991). J. Mol. Biol. 222:581-97). Las técnicas de Cole, y otros y Boemer, y otros están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole, y otros (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77; , Boemer y otros (1991). J. Immunol., 147(1):86-95).
Las técnicas conocidas en la materia para la producción de anticuerpos de cadena sencilla se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla contra los polipéptidos y proteínas DIANA de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes se conocen bien en la materia. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de cadena ligera de inmunoglobulina y cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc para prevenir el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente; los residuos de cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo de aminoácido o se eliminan con el fin de prevenir el entrecruzamiento.
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes y preferentemente por una proteína o receptor o subunidad del receptor de la superficie de la célula. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por un dominio de la DIANA; y la otra es para otro dominio de la misma o diferente DIANA.
Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos se conocen en la materia. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada / cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, (1983) Nature 305:537-9). Debido a la distribución aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. Las etapas de cromatografía de afinidad por lo general logran la purificación de la molécula correcta. Procedimientos similares se describen en Trauneeker, y otros (1991) EMBO J. 10:3655-9.
De acuerdo con otra modalidad preferida, el método de ensayo usa un compuesto candidato a fármaco identificado como que tiene una afinidad de unión para una DIANA, y/o ya se ha identificado como que tiene actividad de regulación descendente tal como una actividad antagonista con respecto a una o más DIANAS.
La presente invención se refiere además a un método para inducir la estimulación anabólica de condrocitos que comprende poner en contacto dichas células con un agente inhibidor de la expresión que comprende una secuencia de polinucleótido
que complementa al menos aproximadamente 17 nucleótidos del polirribonucleótido que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 1-28. En una modalidad preferida el agente inhibidor de la expresión comprende una secuencia de polinucleótido que complementa una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 202-315.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para inducir la estimulación anabólica de condrocitos, que comprende poner en contacto dicha célula con un agente inhibidor de la expresión que inhibe la traducción en la célula de un polirribonucleótido que codifica un polipéptido DIANA. Una modalidad particular se refiere a una composición que comprende un polinucleótido que incluye al menos una cadena antisentido que funciona para aparear el agente con la DIANA del ARNm DIANA, y de ese modo regular de manera descendente o bloquear la expresión del polipéptido DIANA. El agente inhibidor preferentemente comprende el polinucleótido antisentido, una ribozima, y un ARN interferente pequeño (ARNip), en donde dicho agente comprende una secuencia de ácido nucleico complementario a, o diseñado de, una secuencia de polinucleótido de origen natural que codifica una porción de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 101-128. En una modalidad preferida el agente inhibidor de la expresión es complementario a una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 1-28. En una modalidad especialmente preferida el agente inhibidor de la expresión es complementario a una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 202-315.
Una modalidad de la presente invención se refiere a un método en donde el agente inhibidor de la expresión se selecciona del grupo que consiste de ARN antisentido, oligodesoxinucleótido antisentido (ODN), una ribozima que cliva el polirribonucleótido que codifica para la sec. con núm. de ident.: 101-128, un ARN interferente pequeño (ARNip, preferentemente ARNhc) que es suficientemente complementario a una porción del polirribonucleótido que codifica para la sec. con núm. de ident.: 101-128, de forma tal que el ARNip, preferentemente ARNhc, interfiere con la traducción del polirribonucleótido DIANA a polipéptido DIANA. Preferentemente el agente inhibidor de la expresión es un ARN antisentido, ribozima, oligodesoxinucleótido antisentido, o ARNip, preferentemente ARNhc, complementario a una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 1-28. En una modalidad especialmente preferida el agente inhibidor de la expresión es complementario a una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 202-315.
Una modalidad especial de la presente invención se refiere a un método en donde el agente inhibidor de la expresión es un ácido nucleico que expresa el ARN antisentido, oligodesoxinucleótido antisentido (ODN), una ribozima que cliva el polirribonucleótido que codifica para la sec. con núm. de ident.: 101-128, un ARN interferente pequeño (ARNip), preferentemente ARNhc) que es suficientemente complementario a una porción del polirribonucleótido que codifica para la sec. con núm. de ident.: 101-128, de forma tal que el ARNip., preferentemente ARNhc, interfiere con la traducción del polirribonucleótido DIANA a polipéptido DIANA. Preferentemente la secuencia de nucleótido es complementaria a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 1-28. En una una modalidad especialmente preferida la secuencia de nucleótidos es complementaria a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 202-315.
La regulación descendente de la expresión del gen por medio del uso de ácidos nucleicos antisentido se puede lograr a nivel de traducción o transcripción. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención son preferentemente fragmentos de ácidos nucleicos capaces de hibridar específicamente con todo o parte de un ácido nucleico que codifica un polipéptido DIANA o el correspondiente ARN mensajero. Adicionalmente, los ácidos nucleicos antisentido se pueden diseñar que disminuyan la expresión de la secuencia de ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido DIANA por la inhibición de corte y empalme de su transcrito primario. Cualquier longitud de la secuencia antisentido es adecuada para la práctica de la invención con tal de que sea capaz de regular de manera descendente o bloquear la expresión de un ácido nucleico que codifica para una DIANA. Preferentemente, tal secuencia antisentido es al menos aproximadamente 17 nucleótidos de longitud. La preparación y el uso de ácidos nucleicos antisentido, el ADN que codifica el ARN antisentido y el uso de oligos y la genética antisentido se conocen en la materia.
Una modalidad de agente inhibidor de la expresión es un ácido nucleico que es antisentido al ácido nucleico que comprende la sec. con núm. de ident.: 1-28. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, ADN) se puede introducir en las células in vitro, o administrar a un sujeto in vivo, como terapia génica para inhibir la expresión celular de ácidos nucleicos que comprenden la sec. con núm. de ident.: 1-28. Los oligonucleótidos antisentido comprenden preferentemente una secuencia de aproximadamente 17 a aproximadamente 100 nucleótidos y con mayor preferencia los nucleótidos antisentidos que comprenden de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nucleótidos. Los ácidos nucleicos antisentido se pueden preparar de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las sec. con núm. de ident.: 1-28.
Los ácidos nucleicos antisentido son preferentemente oligonucleótidos y pueden consistir enteramente de desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleótidos modificados, o alguna combinación de ambos. Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser oligonucleótidos sintéticos. Los oligonucleótidos se pueden modificar químicamente, si se desea, para mejorar la estabilidad y/o selectividad. Dado que los oligonucleótidos son susceptibles a la degradación por las nucleasas intracelulares, las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, el uso de un grupo azufre para reemplazar el oxígeno libre del enlace fosfodiéster. Esta modificación se denomina enlace de fosforotioato. Los oligonucleótidos antisentido fosforotioato son solubles en agua, polianiónicos, y resistentes a las nucleasas endógenas. Adicionalmente, cuando un oligonucleótido antisentido fosforotioato hibrida a su sitio DIANA, el dúplex RN202-315NA activa la enzima ribonucleasa endógena (RNasa) H, que cliva el componente de ARNm de la molécula híbrida.
Adicionalmente, se pueden sintetizar oligonucleótidos antisentido con enlaces de fosforamidita y poliamida (péptido). Estas moléculas deben ser muy resistentes a la degradación por nucleasas. Además, se pueden añadir grupos químicos al carbono 2' de la porción de azúcar y el carbono 5 (C-5) de las pirimidinas para mejorar la estabilidad y facilitar la unión del oligonucleótido antisentido a su sitio DIANA. Las modificaciones pueden incluir 2'-desoxi-, O-pentoxi, O-propoxi, O-metoxi, fluoro, fosforotioatos metoxietoxi, bases modificadas, así como otras modificaciones conocidas por aquellos con experiencia en la materia.
Otro tipo de agente inhibidor de la expresión que reduce los niveles de DIANAS es la ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico (enzimas de ARN) que tienen dominios catalíticos y de unión al sustrato separados. La secuencia de unión al sustrato combina la complementariedad de nucleótidos y, posiblemente, interacciones de enlace que no son de hidrógeno con su secuencia DIANA. La porción catalítica cliva el ARN DIANA en un sitio específico. El dominio del sustrato de una ribozima se puede diseñar para dirigirlo a una secuencia de ARNm específica. La ribozima reconoce y después se une a un ARNm DIANA mediante el apareamiento de bases complementarias. Una vez que se une al sitio DIANA correcto, la ribozima actúa enzimáticamente para cortar el ARNm DIANA. El clivaje del ARNm por una ribozima destruye su capacidad para dirigir la síntesis del polipéptido correspondiente. Una vez que la ribozima ha clivado su secuencia DIANA, se libera y puede repetidamente unirse y clivar en otros ARNAms.
Las formas de las ribozimas incluyen un motivo cabeza de martillo, un motivo horquilla, un virus de la hepatitis delta, el motivo del intrón del grupo I o del ARN de la RNasa P (en asociación con una secuencia guía de ARN) o el motivo VS de ARN de Neurospora. Las ribozimas que poseen una estructura de cabeza de martillo o de horquilla se preparan fácilmente ya que estas moléculas de ARN catalítico se pueden expresar dentro de las células a partir de promotores eucariotas (Chen, y otros. (1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9). Una ribozima de la presente invención se puede expresar en células eucariotas a partir del vector ADN adecuado. Si se desea, la actividad de la ribozima se puede aumentar por su liberación a partir del transcrito primario por una segunda ribozima (Ventura, y otros. (1993) ácido nucleicos Res. 21:3249-55).
Las ribozimas se pueden sintetizar químicamente por la combinación de un oligodesoxirribonucleótido con un dominio catalítico de ribozima (20 nucleótidos) flanqueado por las secuencias que se hibridan al ARNm DIANA después de la transcripción. El oligodesoxirribonucleótido se amplifica por medio del uso de secuencias de unión al sustrato como cebadores. El producto de la amplificación se clona en un vector de expresión eucariota.
Las ribozimas se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en ADN, ARN, o vectores virales. La transcripción de las secuencias de ribozimas se impulsan a partir de un promotor para la ARN polimerasa I (pol (I), ARNpolimerasa II (pol II), o ARN-polimerasa III (pol III) eucariotas. Los transcritos de los promotores pol II o pol III se expresan en niveles altos en todas las células; los niveles de un promotor pol II dado en un tipo de célula dado dependerán de las secuencias reguladoras de los genes cercanos . Además se usan promotores de ARN-polimerasa procariota, siempre que la enzima ARN polimerasa procariota se exprese en las células adecuadas (Gao y Huang, (1993) Nucleic Acids Res. 21:286772). Se demostró que las ribozimas expresadas a partir de estos promotores pueden funcionar en células de mamífero (Kashani-Sabet, y otros (1992) Antisense Res. Dev. 2:3-15).
Un agente inhibidor particularmente preferido es un ARN interferente pequeño (ARNip, preferentemente ARNhc). El ARNip, preferentemente ARNhc, media el proceso de silenciamiento génico después de la transcripción por ARN de cadena doble (ARNbc) que es homólogo en secuencia al ARN silenciado. El ARNip de acuerdo con la presente invención comprende una cadena sentido de 17-25 nucleótidos complementaria u homóloga a una secuencia de nucleótidos contiguos de 17-25 seleccionados del grupo de secuencias descritas en la sec. con núm. de ident.: 1-28, preferentemente del grupo de secuencias descritas en la sec. con núm. de ident.: 202-315, y una cadena antisentido de 17-23 nucleótidos complementarios a la cadena sentido. Las secuencias ilustrativas se describen como secuencias complementarias a las sec. con núm. de ident.: 202-315. El ARNip más preferido comprende cadenas sentido y anti-sentido que son 100 por ciento
complementarias entre sí y la secuencia del polinucleótido DIANA. Preferentemente el ARNip además comprende una región de bucle que une la cadena sentido y antisentido.
Una molécula de polinucleótido ARNip de cadena sencilla auto-complementaria de acuerdo con la presente invención comprende una porción sentido y una porción antisentido conectada por un enlazador de región de bucle. Preferentemente, la secuencia de la región de bucle tiene 4-30 nucleótidos de largo, con mayor preferencia 5-15 nucleótidos de largo y con la máxima preferencia 8 nucleótidos de largo. En una modalidad más preferida la secuencia enlazadora es UUGCUAUA (sec. con núm. de ident.: 201). El ARNip de cadena sencilla auto-complementaria forma bucles de horquillas y son más estables que el ARNbc ordinario. Adicionalmente, son más fáciles de producir a partir de vectores.
Los análogos al ARN antisentido, el ARNip se puede modificar para confirmar la resistencia a la degradación nucleolítica, o para mejorar la actividad, o para mejorar la distribución celular, o para mejorar la captación celular, tales modificaciones pueden consistir de enlaces internucleosídicos modificados, bases de ácidos nucleicos modificadas, azúcares modificados y/o enlace químico del ARNip a una o más porciones o conjugados. Las secuencias de nucleótidos se seleccionan de acuerdo con las normas de diseño de ARNip que dan una mejor reducción de las secuencias DIANA en comparación con las secuencias de nucleótidos que no cumplan con estas reglas de diseño de siRNA (Para una discusión de estas reglas y ejemplos de la preparación de siRNA, el documento WO 2004094636, publicado el 4 de noviembre de 2004, y UA 20030198627, se incorporan por este medio como referencia).
La presente invención además se refiere a composiciones, y métodos que usan dichas composiciones, que comprenden un vector de expresión de ADN capaz de expresar un polinucleótido capaz de inducir la estimulación anabólica de condrocitos y descrito anteriormente como un agente de inhibición de la expresión.
Un aspecto especial de estas composiciones y métodos se refiere a la regulación descendente o bloqueo de la expresión de un polipéptido DIANA por la expresión inducida de un polinucleótido que codifica una proteína de unión intracelular que es capaz de interactuar con el polipéptido DIANA. Una proteína de unión intracelular incluye cualquier proteína capaz de interactuar selectivamente, o unirse, con el polipéptido en la célula en la que se expresa y neutralizar la función del polipéptido. Preferentemente, la proteína de unión intracelular es un anticuerpo neutralizante o un fragmento de un anticuerpo neutralizante que tiene afinidad de unión por un epitopo del polipéptido DIANA de sec. con núm. de ident.: 101128 y 401-594. Con mayor preferencia, la proteína de unión intracelular es un anticuerpo de cadena sencilla.
Una modalidad especial de esta composición comprende el agente inhibidor de la expresión seleccionado del grupo que consiste de ARN antisentido, oligodesoxinucleótido antisentido (ODN), una ribozima que cliva el polirribonucleótido que codifica para la sec. con núm. de ident.: 101-128, y un ARN interferente pequeño (ARNip) que es suficientemente homólogo a una porción del polirribonucleótido que codifica para la sec. con núm. de ident.: 101-128, de forma tal que el ARNip interfiere con la traducción del polirribonucleótido DIANA al polipéptido DIANA,
El polinucleótido que expresa el agente inhibidor de la expresión se incluye preferentemente dentro de un vector. El ácido polinucleico se enlaza operativamente a señales que permiten la expresión de la secuencia del ácido nucleico y se introduce en una célula que utiliza, preferentemente, construcciones del vector recombinante, que expresarán el ácido nucleico antisentido una vez que el vector se introduce en la célula. Una variedad de sistemas basados en virus están disponibles, que incluyen los sistemas de vectores adenoviral, retroviral, asociado a adenovirus, lentiviral, virus del herpes simple o un sendavirus, y todos se pueden usar para introducir y expresar la secuencia de polinucleótido para los agentes inhibidores de la expresión en las células DIANA.
Preferentemente, los vectores virales usados en los métodos de la presente invención son deficientes de replicación. Tales vectores deficientes de replicación por lo general empaquetarán al menos una región que es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones se pueden eliminar (entera o en parte), o se pueden hacer no funcionales por cualquier técnica conocida por una persona con experiencia en la materia. Estas técnicas incluyen el retiro total, sustitución, deleción o adición parcial de una o más bases para una región esencial (para la replicación). Tales técnicas se pueden realizar in vitro (sobre el ADN aislado) o in situ, por medio del uso de las técnicas de manipulación genética o por tratamiento con agentes mutagénicos. Preferentemente, el virus deficiente de replicación retiene las secuencias de su genoma, que son necesarias para encapsular, las partículas virales.
En una modalidad preferida, el elemento viral se deriva a partir de un adenovirus. Preferentemente, el vehículo incluye un vector adenoviral empaquetado en una cápsida adenoviral, o una parte funcional, derivada, y/o análoga de esta. La biología del adenovirus además es comparativamente conocida a nivel molecular. Muchas herramientas para los vectores adenovirales se han desarrollado y se continúa el desarrollo, así hacen de una cápsida adenoviral un vehículo preferido para
la incorporación en una genoteca de la invención. Un adenovirus es capaz de infectar una gran variedad de células. Sin embargo, diferentes serotipos adenovirales tienen diferentes preferencias por las células. Para combinar y ampliar la población de células DIANA que una cápsida adenoviral de la invención puede penetrar en una modalidad preferida, el vehículo incluye proteínas de fibra adenoviral a partir de al menos dos adenovirus. Las secuencias de proteínas de fibra preferidas son serotipo 17, 45 y 51. Las técnicas o construcción y expresión de estos vectores quiméricos se describen en las solicitudes de patente publicada de los Estados Unidos 20030180258 y 20040071660, por este medio incorporadas como referencia.
En una modalidad preferida, el ácido nucleico derivado de un adenovirus incluye el ácido nucleico que codifica una proteína tardía adenoviral o una parte funcional, derivada, y/o análoga de esta. Una proteína tardía adenoviral, por ejemplo una proteína de fibra adenoviral, se puede usar favorablemente para dirigir el vehículo a cierta célula o inducir la entrega mejorada del vehículo a la célula. Preferentemente, el ácido nucleico derivado de un adenovirus codifica para prácticamente todas las proteínas tardías adenovirales, lo que permite la formación de la cápsida adenoviral y las partes funcionales completas, análogas, y/o derivadas de estas. Preferentemente, el ácido nucleico derivado de un adenovirus incluye el ácido nucleico que codifica el adenovirus E2A o una parte funcional, derivada, y/o análoga de este. Preferentemente, el ácido nucleico derivado de un adenovirus incluye el ácido nucleico que codifica al menos una región de la proteína E4 o una parte funcional, derivada, y/o análoga de esta, que facilita, al menos en parte, la replicación de un ácido nucleico derivado de adenovirus en una célula. Los vectores adenovirales usados en los ejemplos de esta solicitud son ilustrativos de los vectores útiles en el presente método de tratamiento de la invención.
Ciertas modalidades de la presente invención usan sistemas de vectores retrovirales. Los retrovirus son virus de integración que infectan las células en división, y su construcción es conocida en la materia. Los vectores retrovirales se pueden construir a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como, MoMuLV ("virus de la leucemia murina de Moloney" MSV ("virus del sarcoma murino de Moloney"), HaSV ("virus del sarcoma de Harvey"); SNV ("virus de la necrosis del bazo"); RSV ("virus del sarcoma de Rous") y virus Friend. Los sistemas de vectores lentivirales además se pueden usar en la práctica de la presente invención.
En otras modalidades de la presente invención, se utilizan virus adeno-asociados ("AAV"). Los virus AAV son virus de ADN de relativamente pequeño tamaño que se integran, en una manera estable y sitio-específica, en el genoma de las células infectadas. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celular, y no parecen estar implicados en patologías humanas.
En la construcción del vector, los agentes polinucleótidos de la presente invención pueden estar enlazados a una o más regiones reguladoras. La selección de la región o regiones reguladoras adecuadas es una cuestión de rutina, dentro del nivel de experiencia ordinaria en la materia. Las regiones reguladoras incluyen promotores, y pueden incluir potenciadores, supresores, etc.
Los promotores que se pueden usar en los vectores de expresión de la presente invención incluyen tanto promotores constitutivos y promotores regulados (inducibles). Los promotores pueden ser procariotas, o eucariotas en dependencia del huésped. Entre los promotores procariotas (que incluye los bacteriófagos) útiles para la práctica de esta invención están los promotores lac, lacZ, T3, T7, lambda Pr, P1, y trp. Entre los promotores eucariotas (que incluye los virales) útiles para la práctica de esta invención están los promotores ubicuos (por ejemplo, HPRT, vimentina, actina, tubulina), promotores de filamentos intermedios (por ejemplo, desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP), promotores de genes terapéuticos (por ejemplo, tipo MDR, CFTR, factor VIII), promotores específicos de tejido (por ejemplo, promotor de la actina en las células del músculo liso, o los promotores activos en las células endoteliales Flt y Flk), que incluyen regiones de control de la transcripción animal, que exhiben especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de la elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift, y otros, (1984) Cell 38:639-46; Omitz, y otros, (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, (1987) Hepatology 7:425-515); región control del gen de insulina que es activo en las células beta pancreáticas (Hanahan, (1985) Nature 315:115-22), región control del gen de inmunoglobulina que es activo en células linfoides (Grosschedl, y otros (1984) Cell 38:647-58; Adames, y otros (1985) Nature 318:533-8; Alexander, y otros (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-44), región control del virus del tumor mamario en ratón que es activo en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder, y otros (1986) Cell 45:485-95), región control del gen de albúmina que es activo en el hígado (Pinkert, y otros (1987) Genes and Devel. 1:268-76), región control del gen de alfa-fetoproteina que es activo en hígado (Krumlauf, y otros (1985) Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer, y otros (1987) Science 235:53-8), región control del gen de alfa 1-antitripsina que es activo en el hígado (Kelsey, y otros (1987) Genes and Devel., 1: 161-71), región control del gen beta-globina que es activo en células mieloides (Mogram, y otros (1985) Nature 315:338-40; Kollias, y otros (1986) Cell 46:89-94), región control del gen de la proteína básica mielina que es activo en células oligodendrocitos en el cerebro (Readhead, y otros (1987) Cell 48:703-12), región control del gen de cadena ligera 2
de miosina que es activo en el músculo esquelético (Sani, (1985) Nature 314.283-6), y región control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que es activo en el hipotálamo (Mason, y otros (1986) Science 234:1372-8).
Otros promotores que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen promotores que se activan preferentemente en las células en división, promotores que responden a un estímulo (por ejemplo, el receptor de la hormona esteroide, el receptor del ácido retinoico), moduladores transcripcionales regulados por tetraciclina, los promotores inmediatamente temprano del citomegalovirus, LTR retroviral, metalotioneína, SV-40, E1a, y MLP.
Sistemas de vectores adicionales incluyen los sistemas no virales que facilitan la introducción de agentes polinucleótidos en un paciente. Por ejemplo, un vector ADN que codifica una secuencia deseada se puede introducir in vivo por electroporación. Los lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades encontradas con la transfección mediada por liposomas se pueden usar para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador(Felgner, y otros, (1987) Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos 84:7413-7); ver Mackey, y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:8027-31; Ulmer, y otros (1993) Science 259:1745-8). El uso de lípidos catiónicos puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos cargados negativamente, y además promover la fusión con membranas celulares cargadas negativamente (Felgner y Ringold, (1989) Nature 337:387-8). Compuestos lipídicos y composiciones particularmente útiles para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en las publicaciones de la patente internacional documento WO 96/17823 y documento WO 95/18863, y en la patente de los Estados Unidos núm. 5,459,127. El uso de la electroporación para introducir genes exógenos en los órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas y dirigir la transfección a tipos celulares particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, por ejemplo, páncreas, hígado, riñón y cerebro. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas para el propósito de dirigir. Los péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y proteínas, por ejemplo, anticuerpos, o moléculas no peptídicas, se podrían acoplar químicamente a liposomas. Otras moléculas son útiles además para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, por ejemplo, un oligopéptido catiónico (por ejemplo, publicación internacional de patente documento WO 95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión al ADN (por ejemplo, publicación de la patente internacional documento WO 96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, publicación de la patente internacional documento WO 95/21931).
Es además posible introducir un vector ADN in vivo como un plásmido ADN desnudo (ver Pat. de Estados Unidos núms. 5,693,622, 5,589,466 y 5,580,859). Los vectores ADN desnudos para propósitos terapéuticos se pueden introducir en las células huésped deseadas por métodos conocidos en la materia, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, el uso de una pistola génica, o el uso de un transportador de vector ADN (ver, por ejemplo, Wilson, y otros, (1992) J. Biol. Chem. 267:963-7; Wu y Wu, (1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4; Hartmut, y otros, solicitud de patente Canadiense núm. 2,012,311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams, y otros (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88:2726-30). Receptor-mediated DNA delivery approaches can also be used (Curiel, y otros (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-54; Wu y Wu, (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32).
La presente invención además proporciona composiciones biológicamente compatibles, para mejorar la formación de cartílago que comprenden una cantidad eficaz de uno o más compuestos identificados como inhibidores de la DIANA, y/o los agentes inhibidores de la expresión como se ha descrito anteriormente.
Una composición biológicamente compatible es una composición, que puede ser sólida, líquida, gel, u otra forma, en que el compuesto, polinucleótido, vector, y anticuerpo de la invención se mantiene en una forma activa, por ejemplo, en una forma capaz de efectuar una actividad biológica. Por ejemplo, un compuesto de la invención tendría actividad agonista inversa o antagonista sobre la DIANA; un ácido nucleico sería capaz de replicar, traducir un mensaje, o hibridar con un ARNm complementario de una DIANA; un vector sería capaz de transfectar una célula DIANA y la expresión del antisentido, anticuerpo, ribozima o ARNip como se ha descrito anteriormente; un anticuerpo se uniría a un dominio del polipéptido DIANA.
Una composición biológicamente compatible preferida es una solución acuosa que está amortiguada por medio del uso de, por ejemplo, tris-, fosfato, o amortiguador HEPES, que contiene iones de sal. Por lo general, la concentración de iones de sal será similar a los niveles fisiológicos. Soluciones biológicamente compatibles pueden incluir agentes estabilizantes y conservantes. En una modalidad más preferida, la composición biocompatible es una composición farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones se pueden formular para la administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, subcutánea, e intraocular. La administración parenteral significa que incluye inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraarterial o técnicas de infusión. La composición se puede administrar parenteral en formulaciones de dosificación unitaria que contienen portadores, adyuvantes y vehículos estándar, bien conocidos, no tóxicos, aceptables fisiológicamente como se desea.
Una modalidad particularmente preferida de la presente invención de composición es una composición farmacéutica que mejora la formación de cartílago que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la expresión como se ha descrito anteriormente, en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otra modalidad preferida es una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una afección de una disminución sistémica o local del espesor medio del cartílago, o una susceptibilidad a la afección, que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de la DIANA o agonista inverso para mejorar la formación de cartílago, sus sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, solvatos, o profármacos de este, en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral se pueden formular por medio del uso de vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la materia en dosificaciones adecuadas para la administración oral. Tales vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones, y similares, para la ingestión por el paciente. Las composiciones farmacéuticas para uso oral se pueden preparar combinando los compuestos activos con un excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los auxiliares adecuados, si se desea, para obtener el núcleo de las tabletas o grageas. Los excipientes adecuados son rellenos de carbohidratos o proteínas, tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa, u otras plantas; celulosa, tales como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetil-celulosa de sodio; gomas que incluyen arábiga y tragacanto; proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes o solubilizadores, tales como el polivinil pirrolidona reticulado, agar, ácido algínico o una sal de éstos, tal como alginato de sodio. Los núcleos de grageas se pueden usar en combinación con recubrimientos adecuados, tales como soluciones concentradas de azúcar, que además pueden contener goma arábiga, talco, polivinil-pirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Colorantes o pigmentos se pueden añadir a las tabletas o los recubrimientos de grageas para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad del compuesto activo, es decir, la dosificación.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen las cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerina o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener ingredientes activos mezclados con rellenos o aglutinantes, como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquido, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores.
Las preparaciones inyectables estériles preferidas pueden ser una solución o suspensión en un solvente o diluyente no tóxico parenteralmente aceptable. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución salina tamponada, solución salina isotónica (por ejemplo fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio; calcio o magnesia, o mezclas de estas sales), solución de Ringer, dextrosa, agua, agua estéril, glicerina, etanol, y combinaciones de los mismos 1,3-butanodiol y los aceites fijos estériles se emplean convenientemente como solventes o medio de suspensión. Cualquier aceite fijo suave se puede emplear incluyendo mono-o di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso además en la preparación de los inyectables.
El medio de composición además puede ser un hidrogel, que se prepara a partir de cualquier homo- o hetero-polímero biocompatible o no citotóxico, tal como un polímero de ácido poliacrílico hidrófilo que puede actuar como una esponja de absorción de fármaco. Algunos de ellos, tales como, en particular, los obtenidos a partir de etileno y/o óxido de propileno están disponibles comercialmente. Un hidrogel se puede depositar directamente sobre la superficie del tejido a tratar, por ejemplo, durante la intervención quirúrgica.
Las modalidades de composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un vector viral recombinante deficiente de replicación que codifica el agente inhibidor del polinucleótido de la presente invención y un potenciador de la transfección, tal como el poloxámero. Un ejemplo de un poloxámero es el Poloxámero 407, que está disponible comercialmente (BASF, Parsippany, NJ) y es un poliol biocompatible, no tóxico. I. Un poloxámero impregnado con virus recombinantes se puede depositar directamente sobre la superficie del tejido a tratar, por ejemplo durante una intervención quirúrgica. El poloxámero posee prácticamente las mismas ventajas que el hidrogel mientras que tiene una viscosidad menor.
Los agentes activos inhibidores de expresión pueden encerrarse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de entrega de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de
albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16ta edición, Osol, A. Ed.
Pueden prepararse las preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, dichas matrices son en forma de artículos conformados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilo-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente de los Estados Unidos 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, acetato de etilenovinilo no-degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™. (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de las moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan las proteínas durante períodos de tiempo más corto. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un período largo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que resulta en un a pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales se pueden concebir para la estabilización en función de los mecanismos involucrados. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre estando en la formación del enlace intermolecular S-S mediante el intercambio de tio-disulfuro, la estabilización se podría lograr mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, mediante aditivos apropiados, y el desarrollo de las composiciones específicas de la matriz del polímero.
Como se definió anteriormente, la dosis terapéuticamente eficaz significa la cantidad de proteína, polinucleótido, péptido, o sus anticuerpos, agonistas o antagonistas, que alivia los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y toxicidad de estos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de la dosis de efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación, LD50/ED50. Las composiciones farmacéuticas que exhiben índices terapéuticos grandes son preferidas. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios animales se usan para formular un intervalo de dosificaciones para uso humano. La dosis de estos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente, y la ruta de administración.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en los ensayos de cultivos celulares o en modelos animales, generalmente ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal se usa además para alcanzar un intervalo de concentración deseable y la ruta de administración. Tal información se puede usar después para determinar dosis útiles y vías de administración en humanos. La dosificación exacta se escoge por el médico individual en vistas del paciente a tratar. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de la porción activa o para mantener el efecto deseado. Factores adicionales que pueden tomarse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, edad, peso y género del paciente; dieta, duración deseada del tratamiento, método de administración, tiempo y frecuencia de administración, combinación(s) de fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de vida media y tasa de eliminación de la formulación particular.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con esta invención se pueden administrar a un sujeto por una variedad de métodos. Se pueden añadir directamente a los tejidos DIANA, en conjunto con lípidos catiónicos, empaquetadas dentro de liposomas, o entregadas a las células DIANA por otros métodos conocidos en la materia. La administración localizada a los tejidos deseados se puede hacer por inyección directa, absorción transdérmica, catéter, bomba de infusión o endoprótesis. El ADN, los complejos ADN/vehículo, o las partículas de virus recombinante se administran localmente en el sitio de tratamiento. Las vías alternativas de entrega incluyen, pero sin limitarse a, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inhalación de aerosol, oral (forma de tableta o píldora), tópica, sistémica, ocular, intraperitoneal y/o entrega intratecal. Ejemplos de la entrega y administración de ribozima se proporcionan en Sullivan y otros, documento WO 94/02595.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden entregar como un bolo sólo, infusión en el tiempo o a la vez administrados como un bolo y la infusión en el tiempo. Aquellos con experiencia en la materia pueden emplear diferentes formulaciones para los polinucleótidos que para las proteínas. Del mismo modo, la entrega de polinucleótidos o polipéptidos será específica para células particulares, afecciones, localizaciones, etc.
Como se ha discutido anteriormente, los virus recombinantes se pueden usar para introducir ADN que codifica agentes polinucleótidos útiles en la presente invención. Los virus recombinantes de acuerdo con la invención generalmente se formulan y administran en forma de dosis de entre aproximadamente 104 y aproximadamente 1014 pfu. En el caso de los AAVs y los adenovirus, se usan preferentemente las dosis de aproximadamente 106 a aproximadamente 1011 pfu. El término pfu ("unidad formadora de placa") corresponde al poder infectivo de la suspensión de viriones y se determina por infección de un cultivo de células adecuado y la medición del número de placas formadas. Las técnicas para determinar el título de pfu de una solución viral están bien documentadas en la materia anterior.
La presente invención además proporciona métodos para mejorar la formación de cartílago, que comprenden la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de la invención inhibidor de la expresión. Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método de tratamiento o prevención de una enfermedad que implica la estimulación anabólica de condrocitos, que comprende administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica que mejora la formación de cartílago como se describe en la presente invención.
Ejemplos de enfermedades que implican la estimulación anabólica de condrocitos que son tratables por medio del uso de los medios y métodos de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a osteoartritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis reumatoide juvenil, artritis gotosa, artritis séptica o infecciosa, artritis reactiva, distrofia simpática refleja, algodistrofia, síndrome de Tietze o condritis costal, fibromialgia, osteocondritis, artritis neurogénica o neuropática, artropatía, formas endémicas de la artritis como la artrosis deformante endémica, enfermedad de Mseleni y enfermedad de Handigodu; degeneración resultante de la fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia y espondilitis anquilosante. Además, las personas que padecen de malformaciones congénitas del cartílago, que incluyen condrolisis hereditaria, condrodisplasias y pseudoacondrodisplasias, es probable que se beneficien de los programas que resultan en la estimulación anabólica de los condrocitos, y estas enfermedades por lo tanto además se pueden tratar por medio del uso de los métodos y medios de la presente invención. Los ejemplos no limitativos de enfermedades relacionadas con malformaciones congénitas del cartílago son microtia, anotia, y condrodisplasia metafisaria.
Los polipéptidos o polinucleótidos empleados en los métodos de la presente invención pueden estar libres en solución, fijados a un soporte sólido, sobre una superficie celular, o localizados intracelularmente. Para realizar los métodos es factible inmovilizar ya sea el polipéptido de la presente invención o el compuesto para facilitar la separación de los complejos de las formas no complejadas del polipéptido, así como para acomodar la automatización del ensayo. La interacción (por ejemplo, la unión de) del polipéptido de la presente invención con un compuesto se puede lograr en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En una modalidad, se puede proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite que el polipéptido se una a una matriz. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención puede ser etiquetado con "His", y posteriormente adsorbido sobre placas de microtitulación Ni-NTA, o fusiones de ProtA con los polipéptidos de la presente invención se pueden adsorber a IgG, que después se combinan con el lisado de células (por ejemplo, (35S-etiquetado) y el compuesto candidato, y la mezcla se incuba en condiciones favorables para la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH). Después de la incubación, las placas se lavan para eliminar cualquier etiqueta no unida, y la matriz se inmoviliza. La cantidad de radiactividad se puede determinar directamente, o en el sobrenadante después de la disociación de los complejos. Alternativamente, los complejos se pueden disociar de la matriz, separar por SDS-PAGE, y el nivel de la proteína de unión a la proteína de la presente invención se puede cuantificar a partir del gel por medio del uso de técnicas electroforéticas estándar.
Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices además se pueden usar en el método de identificación de compuestos. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención o el compuesto se puede inmovilizar al utilizar la conjugación de biotina y estreptavidina. Las moléculas de proteína biotinilada de la presente invención se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) por medio del uso de técnicas bien conocidas en la materia (por ejemplo, el kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.), y se inmovilizan en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos reactivos con los polipéptidos de la presente invención pero que no interfieren con la unión del polipéptido al compuesto se pueden derivatizar a los pocillos de la placa, y el polipéptido de la presente invención se puede atrapar en los pocillos por conjugación con el anticuerpo. Como se describió anteriormente, las preparaciones de un compuesto candidato marcado se incuban en los pocillos de la placa que presenta el polipéptido de la presente invención, y se puede cuantificar la cantidad de complejo atrapado en el pozo.
Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para la producción in vitro de tejido de cartílago, que comprende las etapas de contactar las células de condrocito con una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias complementarias a las sec. con núm. de ident.: 1-28,
preferentemente seleccionada del grupo que consiste de secuencias complementarias a las sec. con núm. de ident.: 202315 por un tiempo suficiente para re-diferenciar los condrocitos, y producir así una matriz cartilaginosa.
En una modalidad preferida, el método comprende las etapas de:
(a)
aplicar células de condrocito en un sustrato para formar un sustrato celular,
(b)
introducir un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias complementarias a las sec. con núm. de ident.: 1-28, preferentemente seleccionada del grupo que consiste de secuencias complementarias a las sec. con núm. de ident.: 202-315, por un tiempo suficiente para rediferenciar las células de condrocito, y producir así una matriz cartilaginosa.
La invención así proporciona un método para producir un sustrato con una matriz cultivada encima, cuya matriz se puede usar para el suministro de implantes de soporte de carga, que incluyen prótesis de articulaciones, tales como articulaciones artificiales de rodilla y articulaciones de dedos, y los implantes maxilofaciales. Se puede usar además para los dispositivos especiales de cirugía, tales como espaciadores, o relleno de cartílago, y para su uso en el aumento, la obliteración o reconstitución de defectos del cartílago y el cartílago dañado o perdido.
La presente invención además se refiere a una combinación de un implante de soporte de carga (preferentemente recubierto con una matriz como se describió anteriormente) con un relleno de cartílago que comprende una matriz como la descrita.
El método de la invención además es muy adecuado en relación con la cirugía de revisión, es decir, cuando los dispositivos quirúrgicos previos requieren reemplazo.
Las células adecuadas son las células de las células madre, que incluyen células de las células madre mesenquimales y particularmente las células precursoras de condrocitos. Las células madre mesenquimales, y especialmente las células precursoras condrocitos se encuentran que son muy eficaces en el proceso de producción de cartílago cuando se toman a partir de su entorno original. Adicionalmente, las células derivadas a partir de biopsias de cartílago de un sujeto se pueden cultivar y utilizar con la presente invención.
Las células madre mesenquimales se pueden aplicar directamente sobre el sustrato o se pueden multiplicar favorablemente en ausencia del sustrato antes de aplicarse sobre el sustrato. En este último modo, las células todavía son en gran parte multipotentes después de la multiplicación y, para el propósito de la invención, todavía se refieren como indiferenciadas. Posteriormente, las células se dejan diferenciar. La diferenciación se puede inducir o potenciar por la presencia de inductores adecuados, tales como las proteínas morfogenéticas de hueso (BMP2; BM4; BMP7), factor de crecimiento transformante beta (TGFbeta), CDMP1 y CDMP2. Inductores de diferenciación especialmente adecuados son los agentes inhibidores de la expresión de la presente invención.
El uso de células madre mesenquimales proporciona varias ventajas. En primer lugar, su diferenciación inferior implica una mayor velocidad de proliferación y permite dirigir y controlar mejor la eventual funcionalidad. Por otra parte, cultivar estas células no sólo produce la matriz del cartílago requerido que contiene componentes orgánico e inorgánico, sino que además resulta en la presencia, en el medio de cultivo y en la matriz, de varios factores que son esenciales para el crecimiento del tejido y para la adaptación al tejido vivo existente. Además, el medio de cultivo puede ser una fuente de factores activos tales como factores de crecimiento, para su uso en relación con el proceso de implantación. Además, tales células indiferenciadas están frecuentemente disponibles en grandes cantidades y más convenientemente que por ejemplo, las células maduras del cartílago, y exhiben una morbilidad inferior durante la recuperación. Por otra parte, las células indiferenciadas se pueden obtener del paciente al que se destina el implante. El cartílago resultante a partir de estas células es autólogo para el paciente y por lo tanto no se inducirá ninguna respuesta inmune. Se pueden producir matrices tan gruesas como 100 µm como resultado del uso de células indiferenciadas.
El sustrato sobre el cual las células indiferenciadas se puede aplicar y cultivar puede ser un metal, tal como titanio, aleación de cobalto/cromo o acero inoxidable, una superficie bioactiva tal como un fosfato de calcio, superficies de polímeros, tales como polietileno, y similares. Aunque menos preferido, material de silíceo tal como cerámica de vidrio, se puede usar además como sustrato. Los más preferidos son los metales, tales como titanio, y fosfatos de calcio, aunque el fosfato de calcio no es un componente indispensable del sustrato. El sustrato puede ser poroso o no poroso. Las células pueden aplicarse a una tasa de por ejemplo, 103 -106 por cm2, particularmente 104 -2 X 105 células por cm2.
El medio de cultivo que se usa en el método de acuerdo con la invención puede ser un medio de cultivo conocido
comúnmente tal como MEM (medio esencial mínimo). Favorablemente, el medio puede ser un medio condicionado. En este contexto, un medio condicionado se entiende que es un medio en donde se han incubado previamente células similares, lo que hace que el medio contenga factores tales como polipéptidos, secretados por las células que son importantes para el crecimiento y la diferenciación de las células.
Las células se cultivan durante un tiempo suficiente para producir una capa de matriz, por ejemplo, una capa de matriz que tiene un espesor de al menos 0.5 µm, particularmente a partir de 1 hasta 100 µm, más particularmente de 10-50 µm. Las células se pueden poner en contacto con el medio de cultivo durante por ejemplo, 2-15 semanas, particularmente 4-10 semanas.
La producción de la matriz, cuando se aplica sobre un sustrato, resulta en un continuo o casi continuo recubrimiento que cubre el sustrato durante al menos 50%, particularmente al menos 80% de su área de superficie.
En otro aspecto adicional de la invención, la invención proporciona un método para diagnosticar una afección patológica que implica la desdiferenciación de condrocitos, dicho método comprende las etapas de: determinar la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de los genes que codifican los polipéptidos enumerados en la Tabla 1A en una muestra de ADN genómico; comparar la secuencia de la etapa (a) con la secuencia de ácido nucleico de un sujeto sano; e identificar cualquier diferencia(s) relacionada con la afección patológica. Tales diferencias se pueden comprobar adicionalmente en ensayos in vitro de aplicación de los genes de marcadores similares como se describe en la presente invención. Tales ensayos revelarán el papel del gen o su polipéptido codificado en los procesos de estimulación anabólica de condrocitos. Si se identifican tales mutaciones este conocimiento se puede aprovechar adicionalmente en los kits de pruebas para el diagnóstico de enfermedades similares.
Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para diagnosticar una afección patológica que implica la estimulación anabólica de condrocitos o una susceptibilidad a la afección en un sujeto, que comprende determinar la cantidad de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 101-128 y 401-594 en una muestra biológica, y comparar la cantidad con la cantidad del polipéptido en un sujeto sano, en donde un aumento de la cantidad del polipéptido en comparación con el sujeto sano es indicativo de la presencia de la afección patológica. Claramente, los niveles de actividad y/o expresión de los genes diana como se describe en la presente invención pueden tener un efecto sobre la estimulación anabólica de condrocitos. Queda por determinar en qué nivel la actividad se debe elevar para diagnosticar la enfermedad. Sin embargo, por comparación de los niveles encontrados en los pacientes, los individuos sin síntomas e individuos claramente sanos, la persona con experiencia puede determinar fácilmente estos niveles pertinentes. Dado que la persona con experiencia es ahora consciente de que polipéptidos se deben controlar, la presente invención proporciona nuevas herramientas para ensayos de prueba para tales diagnósticos. Una enfermedad prominente que se puede controlar, comprobar y diagnosticar por medio del uso del conocimiento proporcionado por la presente invención es la osteoartritis.
La velocidad de estimulación anabólica de los condrocitos típicamente se puede medir por determinación de la deposición de cartílago, o los componentes del cartílago, o la matriz extracelular que contiene cartílago producido por los condrocitos, en el medio. Un ELISA basado en células, ensayos enzimáticos, u otras técnicas generales conocidas en la materia se pueden usar para medir los componentes del cartílago, como los descritos en Walsh G., Proteins: Biotechnology and Biochemistry. John Wiley and Sons, 2001.
La invención se ilustra adicionalmente en las siguientes figuras y ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo1. Desarrollo de un método de tamizaje de alto rendimiento para la detección de colágeno tipo II, alfa-1 (col2a1)
Principio del ensayo:
Los condrocitos articulares humanos normales (NHAC) que crecen en cultivos bi-dimensionales se desdiferencian y gradualmente cesan de sintetizar cartílago. Ellos se pueden rediferenciar en condrocitos anabólicos, activos en presencia de los factores adecuados (por ejemplo. BMP2). Se desarrolló un ensayo para tamizar tales factores por el control de los niveles de colágeno tipo II, alfa-1 (col2a1), un constituyente mayoritario del cartílago normal. Los NHAC se siembran en placas de 384 pozos y 1 día después de cultivar en la placa se infectan con adenovirus ARNip (Ad-ARNip) a partir de la colección SilenceSelect (ver WO 03/020931). La deposición de Col2a1 se determina 14 días después del comienzo de la infección (14 dpi).
Virus de Control
Ad-BMP2; descrito en WO 03/018799 BMP4; Adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la pre-proteína de la proteína 4 de longitud completa morfogenética del hueso (ver NP_570912). Ad-LacZ; denominado como pIPspAdApt6-lacZ en WO 02/070744 Ad-eGFP; denominado como plPspAdApt6-eGFP en WO 02/070744 Ad-Vacío; descrito en WO 02/070744
Desarrollo del ensayo
Los NHAC se aislaron a partir de donantes que murieron de causas no relacionadas, y se obtuvieron después de consentimiento informado (Cambrex, Verviers, Bélgica).
En una serie de experimentos, que se llevaron a cabo en placas de 384 pozos, se optimizaron varios parámetros: densidad de siembra de las células, multiplicidades de infección (MOI) de los virus controles (Ad-BMP2 o Ad-eGFP), duración de la infección, toxicidad, eficiencia de infección (por medio del uso de Ad-eGFP) y el día de la lectura.
Por medio del uso de Ad-BMP2 (sobre-expresión de BMP2) como un control positivo del desarrollo del ensayo, el siguiente protocolo resultó en el mayor intervalo dinámico para el ensayo con la menor desviación estándar en la señal de fondo:
Los NHAC se siembran en el día 0 a 1500 células/pozo de una placa de 384 pozos en 60µl de DMEM/F12 (InVitrogen), que contiene 10% de suero fetal de ternera inactivado por calor (FBS-HI) y Pen/Strep) y se infectan el día siguiente con 2.5 µl de Ad-virus-control (Ad-BMP2 o Ad-eGFP; esto corresponde a una MOI supuesta de 2000). Después de 7 días, se añaden 10 µl de 50 µg/ml 2-Fosfo-L-ácido ascórbico en medio de cultivo del ensayo a cada pozo. La regulación ascendente de Col2a1 se lee a 10 dpi: El medio se retira con un VacuSafe; se añaden 50 µl de MeOH helado con un multigota y se retira inmediatamente con un VacuSafe; se añaden 80 µl de MeOH helado con un multigota para fijar las células, y las placas se incuban por 20 min a -20°C; el MeOH se retira con u n VacuSafe; las placas se secan al aire por 20 min, seguido por 2 lavados con 80 µl de solución salina amortiguada con fosfato (PBS); se añaden 75 µl de amortiguador de bloqueo (0.1% caseína en PBS) y las placas se incuban por al menos 2 h a temperatura ambiente (TA); el amortiguador de bloqueo se retira; las células se lavan con 25 µl de amortiguador EC (20 mM fosfato sódico, 2mM EDTA, 400 mM NaCl, 0.2% BSA, 0.05% CHAPS, 0.4% caseína, 0.05% NaN3, pH 7) y 35 µl del anticuerpo primario (colágeno II Ac-2 Neomarcadores. Número de catálogo MS-235-P) diluido 1/450, 1/225 en amortiguador C (20 mM fosfato sódico, 2 mM EDTA, 400 mM NaCl, 1% BSA, pH 7)) se añaden con una pipeta multicanal; las placas se incuban durante la noche a 4°C; se r etira el anticuerpo primario; las células se lavan dos veces con 80 µl de PBST (0.5% Tween 20 en PBS) y una vez con 80 µl de PBS; se añaden 35 µl del anticuerpo secundario (Inmunoglobulinas de carnero anti-ratón/HRP. DAKO. Número de catálogo P0477; diluido 1/2000 en amortiguador C) con una pipeta multicanal; las placas se incuban a temperatura ambiente por 1 h; el anticuerpo secundario se retira y las células se lavan dos veces con 80 µl de PBST y una vez con 80 µl de PBS; se añaden 50 µl de sustrato luminol y después de 5 minutes la lectura se determina en un luminómetro.
Después de la optimización del ensayo (ver Figura 1), se prepara una placa control de 384 pozos que contiene virus de control positivo (BMP2 y BMP4) y virus neutros (eGFP; lacZ y vacío, ver figura 1). Alícuotas de la placa control se preparan y congelan a -20°C. Una placa control se descongela y se usa en todos los lotes de tamizaje.
Ejemplo2. Tamizaje de 9216 vectores ARNip adenovirales en el ensayo de condrogénesis
El protocolo optimizado para el tamizaje de la genoteca SilenceSelect corre como sigue: en el día 0, los condrocitos primarios humanos propagados se siembran en placas de 384 pozos, tratadas con TC, de fondo plano, blancas Greiner con fondo claro (Número de catálogo 781080) en 60 µl de medio a una densidad de 1500 células por pozo. Un día más tarde, se transfieren 2.5 µl de virus Ad-ARNip a partir de cada pozo de la colección SilenceSelect™ (WO 03/020931), almacenados en placas de 384 pozos (título estimado de 1 x 109 partículas virales por ml) con el auxilio de un dispensador de 96/384 canales (Tecan Freedom 200 equipado con TeMO96, TeMO384 y RoMa, Tecan AG, Suiza) a pozos individuales de la placa de 384 pozos que contiene los condrocitos. La placa control se corre bajo las mismas condiciones que la placa de alícuotas de la colección SilenceSelect. Todos los virus Ad-ARNip se tamizan en duplicado en placas de ensayo independientes. Después de la infección, las placas se incuban a 37°C. Siete días después de la infección el medio que contiene los adenovirus se remplaza por medio fresco. Trece días después de la infección, las cantidades de las deposiciones de col2a1 por pozo se determinan con el método de ELISAc. Un resultado típico de placa de tamizaje de 384 pozos se representa en la figura 2.
El tamiz duplicado se repite una vez. Los virus Ad-ARNip se nominan como aciertos si al menos dos puntos de datos de los cuatro probados (tamizados dos veces en duplicado) marcan por encima del umbral. El umbral se establece en el promedio más 2.5 veces la desviación estándar de todos los puntos de datos por placa.
Se aislaron un total de 282 aciertos que marcaron por encima del umbral, lo que representa 274 genes independientes. Un ejemplo representativo se proporciona en la Figura 2, en la cual "la desviación estándar de los tiempos" de los puntos de datos duplicados se indican en el eje-X y el eje-Y. El umbral (2.5 veces la desviación estándar) se indica por líneas discontinuas. Los valores negativos indican puntos de datos que marcaron más abajo del promedio.
Los resultados para algunos de los genes se muestran en la figura 3. Una inducción clara de los niveles de colágeno II se observa a partir de la infección del Ad-ARNip dirigido al gen indicado. Los datos se representan como unidades ligeras relativas (rlu) en correlación a los niveles de colágeno II.
Ejemplo3. Propagación de aciertos
Los 282 aciertos de Ad-ARNip se someten a análisis adicionales para establecer su potencial terapéutico para inducir estimulación anabólica de condrocitos. Una primera etapa implica un control de calidad en los Ad-ARNip seleccionados para análisis adicionales (este ejemplo). Las siguientes etapas son el tamizaje de las dianas en otros ensayos para validar su papel en la estimulación anabólica de condrocitos tales como la inducción de agrecano, otro constituyente principal del cartílago además del colágeno (Ejemplo 4), la habilidad de inducir estimulación anabólica en condrocitos de otros donantes (Ejemplo 5), la inducción de un perfil de marcador correcto en cultivos de condrocitos en tri-dimensionales (Ejemplo 11), la presencia de modificaciones post-traduccionales en agrecano (Ejemplo 9) y colágeno II (Ejemplo 10) en cultivos tridimensionales de condrocitos, el desarrollo de Ad-ARNip adicionales dirigidos a los transcritos identificados (Ejemplo 7), y la confirmación de que los genes correspondientes se expresan realmente en los condrocitos residentes (Ejemplo 12).
Para propagar los 282 aciertos del ensayo de condrogénesis, 2.25 x 104 células PerC6.E2A se siembran en 200 µl de DMEM que contiene 10% FCS no inactivado por calor en cada pozo de una placa de 96 y se incuban durante la noche a 39°C en una incubadora humidificada a 10% CO 2. Posteriormente, se añade 1 ol de lisado crudo a partir de las soluciones madre de adenovirus ARNip en tubos matriz y la incubación continúa a 34°C en una incubadora humidifica da a 10% CO2 por 7 días. Todos los aciertos se propagan en duplicado en dos placas independientes. Los dos lisados se agrupan y las alícuotas se congelan a -20°C.
Los Ad-ARNip propagados se re-tamizan a tres MOI en el ensayo de condrogénesis en duplicado (ver Ejemplo 1). Los Ad-ARNip tienen que marcar al menos una vez por encima del umbral (promedio + 2.5 veces desviación estándar) para pasar esta etapa de control de la calidad.
Ejemplo4. Inducción de agrecano
Se desarrolla un segundo ensayo para tamizar por factores anabólicos de condrocitos por el control de los niveles de agrecano, otro constituyente mayoritario del cartílago. En este ensayo, los glicosaminoglicanos en el agrecano se tiñen con azul de alciano. Los NHAC se siembran en placas de 384 pozos y un día después de cultivar en la placa se infectan con Ad-ARNip individuales de la colección SilenceSelect™. La deposición de agrecano se determina 14 días después de la infección. Por medio del uso de Ad-BMP2 como un control positivo, confirmamos en una serie de experimentos que varios parámetros optimizados para el ensayo de ELISAc para ColII son además aplicables para el ensayo de azul de alciano para agrecano. Estos parámetros incluyen la densidad de siembra de las células, MOI de los virus de control, duración de la infección, y el día de lectura.
Los NHAC se siembran en el día 0 a 1500 células/pozo de una placa-negra de 384 pozos con fondo claro en 60 µl de DMEM/F12, que contiene 10% FBS-HI y Pen/Strep y y se infectan el día siguiente con 2.5 µl de Ad-BMP2 o Ad-eGFP; a una MOI de 2000. Después de 7 días, se añaden 10 µl de 50 µg/ml 2-Fosfo-L-ácido ascórbico en medio de cultivo del ensayo a cada pozo. La regulación ascendente de agrecano se lee a 10dpi con tinción de azul de alciano: El medio se retira con un VacuSafe; se añaden 50 µl de MeOH helado con un multigota y se retira inmediatamente con un VacuSafe; se añaden 80 µl of MeOH helado con un multigota para fijar las células, y las placas se incuban por 20 min a -20°C; el MeOH se retira con un VacuSafe; las placas se secan al aire por 20 min. Después de lavar una vez con 80 µl de PBS; se añaden 80 µl de amortiguador de tinción con 0.05% azul de alciano (0.05% azul de alciano, Sigma, número de catálogo S-2889; 0.4 M MgCl2/25 mM acetato sódico, pH5.5) y las placas se incuban durante la noche a TA. El día siguiente las células se lavan posteriormente en 80 µl de 3% ácido acético, 25% etanol/3% ácido acético, y 50% etanol/3% ácido acético. Las soluciones se añaden con un multigota y se retiran con un Vacusafe. Después de remplazar 50% etanol/3% ácido acético con 70% etanol/3% ácido acético, cada pozo individual se fotografía con una cámara SONY CCD, las imágenes se analizan por medio del uso de un algoritmo Galapagos de cuantificación de azul de alciano que se basa en la separación de la señal azul mediante un procedimiento de umbral de color después de un filtro de reducción del ruido. . La cantidad de tinción azul, la
5 cual es proporcional al contenido de agrecano se expresa en unidad pixel (ver Figura 4).
Los aciertos propagados a partir del Ejemplo 3 se usan para transducir células NHAc a tres MOI en duplicado en el ensayo de condrogénesis (ver Ejemplo 1). Los Ad-ARNip tienen que marcar en duplicado en al menos un MOI por encima del umbral (promedio + 2.5 x desviación estándar) para pasar este ensayo secundario. En total, 101 de 282 aciertos pasaron el
10 ensayo de azul de alciano para agrecano (ver Tabla 1). Los resultados para algunos de los genes se muestran en la figura
5. Los valores representan la salida numérica del algoritmo descrito y se correlacionan con los niveles de tinción de azul de alciano. Una inducción clara de los niveles de agrecano se observa a partir de la infección del Ad-ARNip dirigido al gen indicado. El Ad-ARNip dirigido a FZD1 no parece inducir tinción de azul de alciano. Tabla 1 Perspectiva de las 101 secuencias diana y sus respectivas sec. con núms. de ident. (316-416) correspondientes a
15 los genes que codifican los diferentes polipéptidos involucrados en la diferenciación condrogénica. Se proporcionan además los números de GenBank y los símbolos de los genes diana (nombres generales).
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
H33-006
PCTK2 NM_002595 PCTAIRE proteína quinasa 2 Quinasa 316
H33-007
RYK SK340 - NM_002958 Tirosina quinasa tipo receptor RYK Quinasa 317
H33-008
NTRK1 NM_002529 tirosina quinasa neurotrófica, receptor, tipo 1 Quinasa 318
H33-009
CDK2 N_052827 NM_001798 quinasa 2 dependiente de ciclina Quinasa 319
H33-010
PCK1 NM_002591 fosfoenolpiruvato y carboxiquinasa 1 (soluble) Quinasa 320
H33-011
NEK4 SK256 - NM_003157 Quinasa 4 relacionada con NIMA (gen a nunca en mitosis) Quinasa 321
H33-013
MAPKAP NM_004635 Proteína quinasa 3 activada Quinasa 322
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
K3 por proteína quinasa activada por mitógeno
H33-020
UMP-CMPK NM_016308 UMP-CMP quinasa Quinasa 323
H33-025
DGKB NM_020238- Diacilglicerol quinasa, beta Quinasa 324
INCENP
N_004080 90kDa / antígenos de la
NM_145695 proteína del centrómero interno 135/155kDa
H33-027
ROCK1 NM_005406 Proteína quinasa 1 que contiene espiral-enrollada, asociada a Rho Quinasa 325
H33-028
PRKCN SK489 - NM_005813 proteína quinasa C, nu Quinasa 326
H33-031
PLK4 -STK18 SK341 - NM_014264 serina/treonina quinasa 18 (STK18) / quinasa 4 tipo polo (Drosophila) Quinasa 327
H33-032
ICK NM_016513NM_014920 quinasa de la célula intestinal (tipo MAK) Quinasa 328
H33-034
GPR103 AF411117NM_198179 Receptor acoplado a la proteína G 103 GPCR 329
H33-036
CCR2 NM_000647 receptor 2 de la quimocina (motivo C-C) GPCR 330
H33-040
FPRL2 NM_002030 tipo receptor de formil péptido 2 GPCR 331
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
H33-041
FZD1 NM_003505 homólogo 1 rizado GPCR 332
(Drosophila)
H33-042
P2RY10 NM_198333 NM_014499 receptor puninérgico P2Y, acoplado a proteína G, 10 GPCR 333
H33-044
EMR3 NM_152939 NM_032571 tipo receptor de hormona 3, tipo mucina, que contiene módulo tipo egf GPCR 334
H33-049
PROZ NM_003891 glicoproteína de plasma dependiente de vitamina K, proteína Z Proteasa 335
H33-054
THRB NM_000461 receptor de hormona tiroidea, beta (homólogo 2 del oncogen (verb-a) viral de la leucemia eritroblástica, aviar) NHR 336
H33-056
ELA1 NM_001971 elastasa 1, pancreática Proteasa 337
H33-058
COL7A1 N_000094 colágeno, tipo VII, alfa 1 (epidermolisis bulosa, distrófica, dominante y recesiva) No clasificado 338
H33-059
CPZ NM_003652 Carboxipeptidasa Z Proteasa 339
H33-061
USP9Y NM_004654 proteasa específica de Proteasa 340
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
ubiquitina 9, ligada a Y (tipo fat facets, Drosophila)
H33-063
CST3 N_000099 cistatina C (hemorragia cerebral y angiopatía amiloide) No clasificado 341
H33-065
LNPEP NM_005575 leucil/cistinil aminopeptidasa Proteasa 342
H33-066
NLGN1 NM_014932 neuroligin 1 Enzima 343
H33-068
KLK10 NM_145888 NM_002776 kalikreina 10 Proteasa 344
H33-069
LOC119 795 XM_061692 similar a la glutamil aminopeptidasa (aminopeptidasa A); gp160 Proteasa 345
H33-070
LOC124 NM_178453 similar a serina proteasa Proteasa 346
221
distal intestinal
MGC522
82
H33-072
OVTN -LOC159 938 XM_089945 NM_198185 (similar a) oviductina proteasa Proteasa 347
H33-073
LOC206 008 -RNF150 XM_116274 XM_371709 similar a proteína KIAA1214 / proteína de dedo de anillo 150 Proteasa 348
H33-074
LOC220 213 XM_166659 similar a la evidencia:NASproteína hipotética-putativa Proteasa 349
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
H33-076
XYLB NM_005108 homólogo de xiluloquinasa (H. influenzae) Quinasa 350
H33-080
PTEN NM_000314-BC038293 -AF017999 proteína putativa homóloga de tirosina fosfatasa Fosfatasa 351
H33-081
PTPN23 NM_015466 proteína tirosina fosfatasa, tipo no-receptor 23 / proteína tirosina fosfatasa TD14 Fosfatasa se 352
H33-082
DUSP11 NM_003584 fosfatasa 11 de especificidad dual (interactúa con el complejo 1 ARN/RNP) Fosfatasa se 353
H33-083
DUSP3 NM_004090 fosfatasa 3 de especificidad dual (fosfatasa de virus vaccinia relacionada con VH1) Fosfatasa se 354
H33-084
SLC24A 1 NM_004727 familia de vehículo de soluto 24 (intercambiador sodio/potasio/calcio), miembro 1 Canal de iones 355
H33-092
GABRP NM_014211 receptor de ácido gammaaminobutírico (GABA) A, pi Canal de iones 356
H33-095
RAF1 NM_002880 homólogo 1 del oncógeno viral de leucemia murina vraf-1 Quinasa 357
H33-096
JAK1 SK185 - NM_002227 Quinasa Janus 1 (una proteína tirosina quinasa) Quinasa 358
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
H33-098
LOC167 XM_094437 proteína hipotética Quinasa 359
359
NM_153361 MGC42105
MGC421
05
H33-102
PKD1L3 LOC162 163 XM_091397NM_181536 similar a proteína KIAA1879 / tipo enfermedad 1 de riñón poliquístico 3 GPCR 360
H33-104
RPS6KA 3 NM_004586 quinasa de proteína ribosomal S6, 90kDa, polipéptido 3 Quinasa 361
H33-105
RBKS NM_022128 riboquinasa Quinasa 362
H33-107
ABCG1 NM_016818 NM_004915 casete de unión a ATP, subfamilia G (WHITE), miembro 1 Transportad or 363
H33-108
DPYD NM_000110 dihidropirimidina deshidrogenasa Enzima 364
H33-110
TNFRSF 9 N_001561 superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 9 Otra con farmacobilid ad o secretada 365
H33-114
TNFSF1 4 NM_172014 superfamilia del factor de Otra con 366
NM_003807 necrosis tumoral (ligando), miembro 14 farmacobilid ad o secretada
H33-117
GAPDS NM_014364 gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa, específica de testis Enzima 367
H33-118
RDH11 N_016026 retinol deshidrogenasa 11 Enzima 368
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
(todo-trans y 9-cis)
H33-120
PRKAG3 NM_017431 proteína quinasa,activada por AMP, subunidad gamma 3 no catalítica Quinasa 369
H33-130
SLC26A 8 NM_052961 familia de vehículo de soluto 26, miembro 8 Transportad or. 370
H33-138
B4GALT 5 NM_004776 UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactosiltransferasa, polipéptido 5 Enzima 371
H33-145
LOC125 836 XM_064820 similar a la aldosa reductasa (E.C.1.1.1.21) Enzima 372
H33-147
GNPNAT 1 NM_198066 glucosamina-fosfato Nacetiltransferasa 1 Enzima 373
H33-152
CYP17A 1 NM_000102 citocromo P450, familia 17, subfamilia A, polipéptido 1 Citocromo P450 374
H33-158
MAGI-3 No_152900NM_020965 relacionada con la guanilato quinasa asociada a membrana Quinasa 375
H33-161
LOC138 967 XM_071222 similar a citocromo P450 1A1 Citocromo P450 376
H33-167
ADORA1 NM_000674 receptor de adenosina A1 GPCR 377
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
H33-168
OPRK1 NM_000912 receptor opioide, kappa 1 GPCR 378
H33-175
CTSC NM_148170 NM_001814 catepsina C Proteasa 379
H33-180
H105E3 NM_015922 tipo esteroide deshidrogenasa dependiente de NAD(P) Enzima 380
H33-182
LOC256 XM_171056 similar a la serina/treonina- Quinasa 381
519 proteína quinasa putativa D1044.3 en el cromosoma III
H33-186
LOC123 XM_063593 similar a la subunidad Enzima 382
326 PDSW NADH-ubiquinona oxidoreductasa (Complejo I-PDSW) (CI-PDSW)
H33-188
ACYP1 XM_370768NM_203488N_001107 (similar a) acilfosfatasa 1, tipo (común) de eritrocito Fosfatasa 383
H33-190
KCNJ14 NM_170720 NM_013348 canal rectificador de entrada de potasio, subfamilia J, miembro 14 Canal de iones 384
H33-191
PPP3CC S46622 proteína Fosfatasa 3 (antes Fosfatasa 385
NM_005605 2B), subunidad catalítica, isoforma gamma (calcineurina A gamma)
H33-192
GGTLA4 NM_178312 NM_178311 actividad tipo glutamiltransferasa-gamma Enzima 386
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
N_080920 4
H33-202
PIK4CA NM_058004 fosfatidilinositol 4-quinasa, catalítica, polipéptido alfa Quinasa 387
H33-204
TPP2 NM_003291 tripeptidil peptidasa II Proteasa 388
H33-205
CST11 NM_130794 cistatina 11 No clasificado 389
H33-208
GRIK4 NM_014619 receptor de glutamato, ionotrópico, kainato 4 Canal de iones 390
H33-209
ARHGEF 16 NM_014448 Factor intercambiador de guanina Rho (GEF) 16 Otra con farmacobilid ad o secretada 391
H33-210
STK23 NM_014370 serina/treonina quinasa 23 Quinasa 392
H33-213
SLCO1A 2 XM_372282 familia transportadora de Proteasa 393
CRLF2
NM_134431 anión orgánico de vehículo
NM_022148
de soluto, miembro 1A2/
N_021094 factor 2 tipo-receptor de citoquina
H33-217
PDE1A NM_005019 fosfodiestreasa PDE 394
1A, dependiente de calmodulina
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
H33-219
PPP1R1 2B N_032105 NM_002481 proteína fosfatasa 1, subunidad reguladora (inhibidora)12B Fosfatasa 395
H33-222
ACAD8 NM_014384 familia de la acil-Coenzima A deshidrogenasa, miembro 8 Enzima 396
H33-223
PTPRN NM_002846 proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, N Fosfatasa 397
H33-230
KCNG1 NM_172318NM_002237 canal de potasio regulado por voltaje, subfamilia G, miembro 1 Canal de iones 398
H33-236
LOC220 763 XM_055551 similar a la proteína de choque térmico HSP 90beta (HSP 84) (HSP 90) Quinasa 399
H33-237
SPOCK2 NM_014767 sparc/osteonectina, proteoglicanos (testican) 2 dominios tipo cwcv y kazal Enzima 400
H33-238
PTPN13 NM_080685 proteína tirosina fosfatasa, Fosfatasa 401
NM_080684
tipo no-receptor 13
NM_080683
(fosfatasa asociada a APO
NM_006264 1/CD95(Fas))
H33-239
GABRG1 NM_173536 receptor ácido gammaaminobutírico (GABA) A, gamma 1 Canal de iones 402
H33-243
DPP3 NM_005700 dipeptidilpeptidasa 3 Proteasa 403
H33-245
LYPLA3 NM_012320 lisofosfolipasa 3 (fosfolipasa lisosomal A2) Enzima 404
Acierto ID
Secuencia diana KD Símbolo del gen Acceso al GenBank Nombre Clase Secuencia diana KD sec. con núm. de ident.
H33-251
CTSE NM_148964 NM_001910 catepsina E Proteasa 405
H33-253
SULT1B 1 NM_014465 familia sulfotransferasa, citosólica, 1B, miembro 1 Enzima 406
H33-255
KLKB1 N_000892 kalikreina B, plasma (factor de Fletcher) 1 Proteasa 407
H33-258
SENP7 NM_020654 proteasa específica sentrin/SUMO Proteasa 408
H33-259
PTPRR NM_002849 proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, R Fosfatasa 409
H33-261
LOC169 014 XM_095455 similar a la proteína quinasa 6 activada por mitógeno (quinasa 3 regulada por señal extracelular) (ERK-3) (isoforma p97 de MAP quinasa) (p97-MAPK) Quinasa 410
H33-263
ABCD1 XM_372940 casete de unión a ATP, sub- Transportad 411
LOC388
XM_370972 familia D (ALD), miembro 1 / or.
253
NM_000033 similar a la proteína de
LOC391
Adrenoleucodistrofia (ALDP)
403
H33-264
ABCA7 N_033308 NM_019112 Casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1) , miembro 7 Transportad or. 412
H33-269
GPR110 NM_153840 Receptor acoplado a la proteína G 110 GPCR 413
Acierto ID
Secuencia diana Símbolo Acceso al Nombre Clase Secuencia
KD
del gen GenBank diana KD sec. con
núm. de
ident.
H33-276
ACPT NM_080791 - Fosfatasa ácida, testicular Fosfatasa 414
NM_033068 -
N_080789
H33-279
SLC15A 2 NM_021082 familia de vehículo de soluto 15 (H+/transportador de péptido), miembro 2 Transportad or. 415
H33-295
PPIH NM_006347 peptidil prolil isomerasa H (cicldeilina H) Enzima 416
Ejemplo5. Dependencia del donante
Los 282 aciertos identificados por el ensayo ELISAc para el CoIII se someten adicionalmente a una prueba de dependencia
5 del donante para demostrar que la inducción de la producción de CoIII por un acierto dado no se restringe a un solo donante. Adicionalmente al donante de 11 años (donante I) que se usó previamente, se obtienen los NHAC a partir de múltiples donantes con edades de 24 (donante II), 41 (donante III), y 50 (donante IV), después del consentimiento informado (Cambrex, Verviers, Bélgica). Las células se siembran como se describe en los Ejemplos 1 y 3. Los Ad-ARNip propagados se usan para transducir células NHAc de estos diferentes donantes a tres MOI en duplicado en el ensayo de condrogénesis
10 (ver Ejemplos 1 y 3). Los Ad-ARNip tienen que marcar al menos una vez por encima del umbral (promedio + 2.5 veces desviación estándar) para pasar este ensayo de dependencia del donante.
De 101 aciertos que pasaron el ensayo de azul de alciano para agrecano, 97 marcaron positivo en el Donante IV. De los restantes 4, 1 marcó positivo en el Donante II. Los otros 3 no marcaron en los otros donantes probados. Adicionalmente, 40 15 de los 101 aciertos marcaron positivo en los tres donantes adicionales. Estos resultados demuestran que 98 de estos 101 aciertos funcionan en una manera no dependiente del donante. Las excepciones son H33-145; H33-182; y H33-263 (ver Tabla 1). Se indican en esta Tabla 1 los símbolos de los genes diana, número de acceso del Gene Bank, y clase de farmacobilidad de los genes que corresponden a las secuencias diana. Los resultados para algunos de los genes se muestran en la Tabla 2. Estos datos muestran que apagar los niveles de ARN de los genes indicados induce niveles de
20 colágeno II en al menos dos donantes. Los valores representan las desviaciones estándar de los tiempos de fondo.
Tabla 2: Datos de la perspectiva de dependencia del donante. N=2 para cada condición. Todos los datos se representan como veces de desviación estándar del fondo. Todos los valores por encima de 2.5 se consideran positivos y son sombreados en gris
Ejemplo 6. Control de calidad de los Ad-ARNip diana:
Los Ad-ARNip diana se propagan por medio del uso de derivados de células PER.C6© (Crucell, Leiden, Holanda) al nivel de placa de 96 pozos, seguido por el re-tamizaje de estos virus a varios MOI en el ensayo primario (ver Ejemplo 1) y mediante la secuenciación de ARNip codificado por los virus Ad-ARNip diana. Las células PER.E2A se siembran en placas de 96 pozos a una densidad de 40,000 células por pozo en 180 µl de medio PER.E2A. Las células después se incuban durante la 10 noche a 39°C en una incubadora humidificada 10% C0 2. Un día más tarde, las células se infectan con 1 µl de lisado de células crudo a partir de soluciones madre de SilenceSelect que contienen Ad-ARNip diana. Las células se incuban adicionalmente a 34°C, 10% CO 2 hasta la aparición de efecto citopático (como se revela por el hinchamiento y redondeo de las células, típicamente 7 días después de la infección). El sobrenadante se recoge y el lisado de virus crudo se trata con proteinasa K: se añaden 12 µl de lisado crudo a 4 µl de amortiguador de lisis (amortiguador de expansión de alta fidelidad 1x 15 con MgCl2 (Roche Molecular Biochemicals, Núm de cat. 1332465) suplementado con 1 mg/ml de proteinasa K (Roche Molecular Biochemicals, Núm de cat. 745 723) y 0.45% Tween-20 (Roche Molecular Biochemicals, Núm de cat. 1335465)
en tubos de PCR estériles. Estos se incuban a 55°C por 2 h seguido por una etapa de inactivación de 15 min a 95°C. Para la reacción de PCR, se añade 1 µl de lisado a una mezcla maestra de PCR compuesta de 5 µl de amortiguador de expansión de alta fidelidad 10x con MgCl2, 0.5 µl de mezcla de dNTP (10 mM para cada dNTP), 1 µl de cebador directo (solución madre de 10 mM, secuencia: 5' CCG TTT ACG TGG AGA CTC GCC, sec. con núm. de ident.: 29), 1 µl de cebador inverso (solución madre de 10 mM, secuencia: 5' CCC CCA CCT TAT ATA TAT TCT TTC C, sec. con núm. de ident.: 30), 0.2 µl de ADN polimerasa de expansión de alta fidelidad (3.5 U/µl, Roche Molecular Biochemicals) y 41.3 µl de H2O. El PCR se realiza en un sistema de PCR PE Biosystems GeneAmp 9700 como sigue: la mezcla de PCR (50 µl en total) se incuba a 95°C por 5 min; cada ciclo corre a 95°C por 15 seg, 55°C por 30 seg, 68°C por 4 min, y se repite por 3 5 ciclos. Se realiza una incubación final a 68°C por 7 min. Se mezclan 5 µl de la mezcla de PCR con 2 µl de amortiguador de carga del gel 6 x, cargado en un gel de agarosa al 0.8% que contiene 0.5 µg/µl de bromuro de etidio para visualizar los productos de amplificación. El tamaño del fragmento amplificado se estima a partir de una escalera de ADN estándar que se carga en el mismo gel. El tamaño esperado es ~ 500 bp. Para el análisis de secuencia, las construcciones de ARNip expresadas por los adenovirus diana se amplifican por PCR usando cebadores complementarios a secuencias del vector que flanquean el sitio SapI del plásmido pIPspAdapt6-U6. La secuencia del fragmento de PCR se determina y compara con la secuencia esperada. Se encontró que todas las secuencias eran idénticas a la secuencia esperada.
Ejemplo 7: Evaluación del efecto sobre la diana de las secuencias de ARNip identificadas.
Para evaluar si las secuencias de ARNip identificadas realmente aumentan los niveles de colágeno II y agrecano mediante el apagado del ARNm diana, se identifica una segunda secuencia de ARNip que ejerce el mismo efecto.
Un número de secuencias de ARNip adicionales que se dirigen a las secuencias de los aciertos se diseñan e incorporan en adenovirus de acuerdo al documento WO 03/020931. Después de producir estos adenovirus, los Ad-ARNip se infectan a diferentes volúmenes (1.5 ol, 5 ol y 15 ol) en los condrocitos y se evalúa su efecto en el colágeno II como se describió en el Ejemplo 1. El umbral (promedio + 2.5 desviación estándar) se calcula para todos los volúmenes. Si un virus marca por encima del umbral para uno o más de los diferentes volúmenes de infección, se considera positivo. Los resultados sobre las diana se muestran en la Figura 6. Estos resultados indican que se puede identificar al menos un ARNip adicional, que se dirige a la secuencia del acierto. Esto remarca el efecto sobre al diana de las secuencias de ARNip que se identificaron durante el tamizaje de la genoteca Silence Select.
Ejemplo 8. Desarrollo de un sistema de cultivo en alginato tri-dimensional para un análisis cuantitativo del marcador para cartílago estable y la evaluación de la síntesis de glicosaminoglicanos (GAG) e hidroxiprolinas (Hip).
Principio del ensayo:
Los condrocitos articulares humanos normales (NHACs) que crecen en cultivos tri-dimensionales son capaces de mantener un "estado diferenciado" según se mide por la expresión de colágeno tipo II y agrecano. Condrocitos desdiferenciados que se cultivan en un sistema bi-dimensional por un número limitado de pases pueden volver a un estado diferenciado cuando se transfieren a un sistema de cultivo tri-dimensional. Este sistema se estableció para probar la capacidad de adenovirus ARNip (Ad-ARNip) 1) de inducir un patrón de expresión de ARNm que se correlaciona con condrocitos anabólicos activos y 2) de inducir la modificación de proteína del colágeno tipo II (hidroxiprolinas) y agrecano (glicosaminoglicanos) involucrados en la estabilidad del cartílago. Los NHAC del cartílago normal se cultivan en un sistema de cultivo bi-dimensional por dos o tres pases con el propósito de expandir las células. Las células se transducen con adenovirus ARNip individuales (Ad-ARNip) en el sistema de cultivo bidimensional y tres días más tarde se transfieren al sistema de cultivo en alginato tri-dimensional. Después de 10 días en el cultivo en alginato, se pueden evaluar diversos parámetros (por ejemplo análisis del marcador de ARNm y modificaciones de las proteínas).
Procedimiento del ensayo
Por medio del uso de Ad-BMP2 (BMP2: "fuerte" inductor de colágeno II) y Ad-BMP7 (BMP7: "débil" inductor de colágeno II) como controles positivos y Ad-ALPL como control negativo se establece el siguiente protocolo (para el análisis de marcador de ARNm y la evaluación de modificación de proteínas): Después de dos o tres pases en condiciones de cultivo en monocapa los NHAC se siembran a 2.10E+06 células/frasco T175 en 30 ml de medio de crecimiento de condrocitos (Cambrex) y se transducen el día siguiente con virus de control (Ad-BMP2, Ad-BMP4, Ad-BMP7, Ad-ALPL) por medio del uso de una MOI de 2000. Después de tres días, las células se tripsinisan por medio del uso del paquete de reactivos de condrocitos (Cambrex) y se lavan una vez con 155 mM cloruro sódico/20 mM Hepes pH 7.4 (Cambrex). Las células se resuspenden a una densidad de 2x106 células/ml en 1.2% alginato sódico (Cambrex). La suspensión de células se transfiere a
una jeringa unida a una aguja calibre 21-22 y se expelen en forma de gotas en 102 mM cloruro cálcico/5 mM Hepes pH 7.4 (1 ml y 5 ml respectivamente en placas de 24-pozos y 6-pozos) Se producen cinco y 50 perlas por pozo respectivamente en las placas de 24-pozos y 6-pozos. Las placas que contienen las perlas de alginato se incuban por 10 minutos con agitación suave cada 2 minutos. La solución de cloruro de calcio se aspira con un sistema Vacusafe y las perlas se lavan tres veces con la solución de cloruro de sodio por medio del uso del Vacusafe y una vez con DMEMF/12 suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS-HI) y 1% penicilina/estreptomicina. Las perlas de alginato se resuspenden finalmente en 0.5 ml y 3 ml (respectivamente en las placas de 24-pozos y 6-pozos) de DMEMF/12 suplementado con 10% suero fetal de ternera inactivado por calor (FBS-HI), 1% penicilina/estreptomicina y 25 µg/ml de ácido ascórbico (Fluka, Sigm101-128 y 401-594Idrich). Los cultivos en alginato se incuban en una incubadora humidificada a 37°C y 5% CO2 durante 10 días y se refresca el medio cada 48/72h.
Por cada transducción de adenovirus, se generan 60 perlas de alginato: 2x5 perlas se cultivan en placas de 24 pozos para la evaluación de GAGs/Hips y 50 perlas se cultivan en un pozo individual de una placa de 6 pozos para la determinación del patrón de expresión de ARNm.
Virus de Control
Ad-BMP2; descrito en WO 03/018799 Ad-BMP7; adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la pre-proteína de la proteína 7 de longitud completa morfogenética del hueso (NP_001710). Ad-BMP4; adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la pre-proteína de la proteína 4 de longitud completa morfogenética del hueso (ver NP_570912). Ad-ALPL; adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la fosfatasa alcalina de longitud completa de hígado/hueso/riñón (NP_000469).
Ejemplo 9: Efecto de apagar los genes diana en los condrocitos incrustados en las perlas de alginato, en los niveles de glicosaminoglicanos (GAG).
Los condrocitos se infectan e incrustan en las perlas de alginato de acuerdo al Ejemplo 8. Después de 10 días en cultivo las perlas de alginato se tratan con papaína para solubilizar los glicosaminoglicanos antes de la cuantificación: Las perlas que se cultivaron en placas de 24 pozos se lavan una vez con 50 mM amortiguador fosfato pH 6.5 y se incuban por 3 a 4 h a 65°C con 250 µl/pozo del mismo amortiguador que con tiene 2 mM EDTA, 2 mM L-cisteína y 126 µg/ml papaína (Sigma). La digestión completa de las perlas se evalúa por observación microscópica. Las digestiones de papaína se congelan a -20°C hasta que se realiza la cuantificación de glicosaminoglicanos. Los GAGs que se producen por los condrocitos primarios en el sistema de cultivo en alginato se miden por medio del uso del ensayo de Blyscan™ (Biocolor Ltd, Newtownabbey, Irlanda del Norte).
Principio del ensayo de Blyscan
El ensayo de Blyscan es un método cuantitativo de unión a colorante para el análisis de los GAG sulfatados. La etiqueta colorante que se usa en el ensayo es 1,9-dimetilmetileno azul que se emplea bajo condiciones que producen una etiqueta específica para los componentes polisacáridos sulfatados de los proteoglicanos y/o las cadenas de glicosaminoglicanos sulfatados libres de proteínas. El agrecano es el proteoglicano predominante en el cartílago articular, representa ± 90% de los proteoglicanos del cartílago. Está compuesto de un núcleo central de proteína unido a ± 50 cadenas de keratan sulfato y ± 100 de sulfato de condroitina conocidas como GAGs requeridas para la función biológica y la estabilidad del agrecano.
Descripción del ensayo
Las digestiones de papaína generadas después de cultivar los condrocitos por 10 días en perlas de alginato (Ejemplo 7) se diluyen en agua 1:100, 1:200 si las células se transdujeron originalmente con los controles positivos y 1:50, 1:100 si se transdujeron con los controles negativos. Esta etapa de dilución permite valores de lectura dentro del intervalo estándar del ensayo. Los GAG estándar proporcionados por el fabricante contienen 100 µg/ml de sulfato de condroitina 4 purificada de tráquea bovina. Este estándar se corre en duplicado a cuatro concentraciones que corresponden a 1, 2, 3 y 5 µg de GAGs. Los estándares y los controles se diluyen individualmente en un volumen final de 100µl en tubos eppendorf. Se añade un mililitro del reactivo colorante Blyscan a cada tubo y se incuban por 30 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Cuando se forman, los complejos GAG-colorante se vuelven insolubles y después se separan del colorante no unido soluble en exceso restante por centrifugación (10000 x g por 10 minutos). El sobrenadante se desecha la inversión y drenaje cuidadoso del contenido de los tubos. Se añade un mililitro del reactivo de disociación Blyscan a cada tubo y se
incuban por una hora a una hora y media con agitación continua. Este reactivo trae el colorante unido al GAG de vuelta a la solución. El contenido de GAG de las muestras ensayadas se determina espectrofotométricamente por la cantidad del colorante que se recupera a partir de los GAG en la muestra de prueba. Se añaden doscientos microlitros de las soluciones de disociación del colorante a los pozos de una placa de 96 pozos y la lectura se realiza en un lector de placas automático ajustado a una longitud de onda dual (656 y 450 nm).
Las concentraciones de GAGs medidas en el ensayo de Blyscan se normalizan al contenido de ADN al realizar un ensayo fluorimétrico de Hoechst en las mismas digestiones de papaína. El reactivo colorante Hoechst 33342 (Molecular Probes), un colorante bisbenzimidasol que se une a las regiones en el ADN ricas en adenina/timina. Las digestiones de papaína se diluyeron 1:1.7 y 1:3.3 en amortiguador TE, esta etapa de dilución permite valores de lectura dentro del intervalo del ensayo. ADN purificado de timo de ternera (Sigm101-128 y 401-594Idrich) se usa como ADN estándar: la solución madre inicial (2 µg/ml) se diluye secuencialmente en amortiguador TE para obtener el siguiente intervalo de concentraciones: 1.5, 1.0, 0.75, 0.50, 0.2 µg/ml. Las muestras estándar y de prueba se diluyen en TE a un volumen final de 100 µl y se añaden a una placa de 96 pozos. Se añaden cien microlitros del reactivo colorante Hoechst 33342 a los pozos, la lectura se realiza en un lector de microplacas multifuncional (Fluostar Galaxy, BMG Labtechnologies GmbH) con una longitud de onda de excitación establecida a 360nm y una longitud de onda de emisión establecida a 440 nm.
Cuando las concentraciones de GAG se normalizan al contenido de ADN los valores resultantes expresados como la relación concentración de GAG (µg/ml) /concentración de ADN (µg/ml) se usan para calcular la ventana del ensayo. Esta ventana se calcula como la relación GAG Ad-BMP2 normalizado (o Ad-BMP4) GAG Ad-ALPL normalizado.
El efecto de apagar los 14 genes diana en los niveles de GAG se evalúa como se describe. Los resultados se muestran en la Figura 7. Los resultados se expresan como veces que se inducen los niveles de GAG comparado al promedio de los valores de GAG normalizados obtenidos para dos adenovirus apagados controles negativos (Ad-PTGER4 y Ad-GRM7). Apagar el ARNm de los genes respectivos resulta en un aumento de los niveles de GAG.
Virus de Control
Ad-BMP2: descrito en documento WO 03/018799 Ad-BMP4: Adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la pre-proteína de la proteína 4 de longitud completa morfogenética del hueso (ver NP_570912). Ad-ALPL: Adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la fosfatasa alcalina de longitud completa de hígado/hueso/riñón (NP_000469). Ad-PTGER4: Adenovirus Ad5 dE1/E2A que comprende la secuencia de ARNip CCATGCCTATTTCTACAGC (sec. con núm. de ident.: 31) para apagar el ARNm del receptor 4 de prostaglandina E. Ad-GRM7: Adenovirus Ad5 dE1/E2A que comprende la secuencia de ARNip TCAGTAACAGCTCCCAGAC (sec. con núm. de ident.: 32) para apagar el ARNm del receptor 7 de glutamato metabotrópico.
Ejemplo 10: Análisis cuantitativo de hidroxiprolinas (Hips).
En el cartílago articular, aproximadamente el 95% del colágeno es colágeno tipo II. Sus polímeros son las fibrillas que forman el marco cohesivo básico del tejido. La biosíntesis del colágeno involucra varias modificaciones post-traduccionales únicas que incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina. Estas modificaciones son cruciales para la estabilidad y resistencia del colágeno a las enzimas proteolíticas.
Los condrocitos se infectan e incrustan en las perlas de alginato de acuerdo al Ejemplo 8. Después de 10 días en cultivo las perlas de alginato se tratan con papaína: Las perlas que se cultivaron en placas de 24 pozos se lavan una vez con 50 mM amortiguador fosfato pH 6.5 y se incubaron por 3 a 4h a 65°C con 250 µl/pozo del mismo amortiguador qu e contiene 2 mM EDTA, 2 mM L-cisteína y 126 µg/ml papaína (Sigma). La digestión completa de las perlas se evalúa por observación microscópica. Las digestiones de papaína se congelan a -20°C hasta que se realiza la cuantificación de hidroxiprolina.
La evaluación de hidroxiprolina en las digestiones de papaína se realiza por HPLC después de hidrólisis ácida y derivatización de las muestras por FMOC (9-fluorenilmetil cloroformiato). Este método se describe en "Bank RA, Jansen EJ, Beekman B y Te Koppele JM. (1996) Amino acid analysis by reverse-phase high performance liquid chromatography: Improved derivatisation and detection conditions with 9-fluorenylmethyl chloroformate. Anal Biochem. 240 (2): 167-176.
El efecto de apagar los 14 genes diana en los niveles de hidroxiprolina se evalúa como se describe. Los resultados se muestran en la Figura 8. Los resultados se expresan como veces que se induce en comparación con el promedio de las
concentraciones de Hip medidas para los dos controles KD (Ad-PTGER4 y AD-GRM7). Apagar el ARNm de los genes respectivos resulta en un aumento de los niveles de hidroxiprolina
Virus de Control
Ad-BMP2; descrito en WO 03/018799 Ad-BMP4; adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la pre-proteína de la proteína 4 de longitud completa morfogenética del hueso (ver NP_570912). Ad-ALPL: Adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la fosfatasa alcalina de longitud completa de hígado/hueso/riñón (NP_000469). Ad-PTGER4: Adenovirus Ad5 dE1/E2A que comprende la secuencia de ARNip CCATGCCTATTTCTACAGC (sec. con núm. de ident.: 33) para apagar el ARNm del receptor 4 de prostaglandina E. Ad-GRM7: Adenovirus Ad5 dE1/E2A que comprende la secuencia de ARNip TCAGTAACAGCTCCCAGAC (sec. con núm. de ident.: 34) para apagar el ARNm del receptor 7 de glutamato metabotrópico.
Ejemplo 11: Análisis cuantitativo de marcadores para el cartílago estable.
Principio general del ensayo:
Los fenotipos de los condrocitos se pueden categorizar por patrones característicos de la expresión de genes. Se usan técnicas de RT-PCR cuantitativo para controlar el patrón de expresión de un conjunto de moléculas marcadores claves para definir qué fenotipo se induce en los condrocitos. Los marcadores positivos incluyen colágeno tipo II y FGFR3, que se expresan típicamente por los condrocitos del cartílago. Los marcadores negativos incluyen (1) colágenos tipos I y III para condrocitos desdiferenciados o tipo fibroblasto, un fenotipo que además se puede inducir por el ácido retinoico o la interleucina-1; (2) colágeno X, PTHLH y ALK-1 para condrocitos hipertróficos que se encuentran en la zona calcificada del cartílago adulto y la zona hipertrófica baja del cartílago de la placa de crecimiento fetal; y (3) MMP13 como enzima proteolítica involucrada en la degradación del cartílago. Los condrocitos funcionales del cartílago deben expresar altos niveles de marcadores positivos pero niveles bajos o no detectables de los marcadores negativos.
Descripción del ensayo
Los condrocitos se infectan e incrustan en las perlas de alginato de acuerdo al Ejemplo 8. Después de 10 días en cultivo las perlas de alginato se tratan con 55 mM citrato sódico (Cambrex) para recuperar los condrocitos a partir de las perlas de alginato y cosechar el ARN: El medio de incubación se retira de las placas de 6 pozos con el Vacusafe y se añaden 5 ml de 55 mM citrato sódico a cada pozo y se incuban por15 minutos a temperatura ambiente. Las perlas parcialmente solubilizadas se mezclan gentilmente y se transfieren a un tubo FALCON, los pozos se enjuagan una vez con 2 ml de solución de citrato sódico para recoger las perlas remanentes y liberar las células. Los tubos se colocan sobre sus lados y se mezclan gentilmente cada 2-3 minutos hasta que las perlas se solubilizan completamente (+/- 15 minutos). Los tubos se centrifugan a 1000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se desecha y el precipitado se re-suspende en 2 ml de solución de citrato sódico y se deja por 5 minutos. Se añaden seis mililitros de 155 mM cloruro sódico/20 mM Hepes pH 7.4 (Cambrex) a cada tubo antes de una centrifugación de 5 minutos a 210 g. El precipitado celular se lisa en 180 µl de amortiguador de lisis SV40 (kit de extracción de ARN total Promega SV40) y se congela a -20°C hasta que se realiza el aislam iento de ARN con el kit de extracción de ARN total Promega SV40 de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ARN purificado se cuantifica por medio del uso del reactivo ribogreen (Molecular Probes) y ARN de levadura (Ambion) como ARN estándar.
El ARN purificado a partir de los condrocitos transducidos con adenovirus controles y cultivados por 10 días en el sistema de cultivo 3-dimensional en alginato se usa en una reacción de transcripción inversa (RT). El ARN se diluye primero en agua (Life Technologies-Invitrogen, Breda, Holanda) en dependencia de la concentración inicial de la muestra: Para una concentración de ARN más abajo de 25 ng/ml, las muestras se usan sin diluir, para concentraciones de ARN entre 25 y 50 ng/ml las muestras se diluyen 1:2.5, para concentraciones de ARN entre 50 y 100 ng/ml las muestras se diluyen1:5 y para concentraciones de ARN entre 100 y 160 ng/ml las muestras se diluyen 1:10. Se añaden dos microlitros de ARN diluido/no diluido a 5 µl de una mezcla de reacción que consiste de: amortiguador RT Taqman 1x, 5 mM MgCl2, 500 µM dNTPs (2.5 mM cada uno), 2.5 µM hexámeros Ryom, 0.4 U/µl de inhibidor de ARNasas y 1.25 U/µl de transcriptasa inversa MultiScribe (todos los reactivos se adquieren a partir de Applied Biosystems). La reacción de PCR se realiza en un Termo Ciclador Peltier-200 (BIOzym, Lygraaf, Holanda) como sigue: la mezcla total de PCR (60 µl) se incuba 10 minutos a 25°C seguido por 30 minutos a 48°C, seguido por 5 minutos a 95°C. Ca da reacción corre en paralelo con un control que no contiene ningún inhibidor de ARNasa o transcriptasa inversa.
La transcripción inversa es seguida por un PCR cuantitativo para la amplificación específica de los genes marcadores positivos y negativos seleccionados, GAPDH se incluye como el control endógeno. Se añaden 5 microlitros de ADNc (a partir de la reacción RT) a 20 µl de la mezcla de reacción de PCR que consiste de: mezcla maestra 1X Brilliant® SYBR®
5 Green QPCR (Sratagene Europe, Amsterdam, Holanda), 300 µM de cada cebador directo e inverso (tabla 3) (excepto por GAPDH y ALK-1, que se usan a 100 µM) (Life Technologies-Invitrogen, Breda, Holanda) y 300 nM de colorante de referencia (Stratagene) (diluido 1:100 en H2O). La mezcla de PCR (25 µl) se incuba por 10 minutos a 95°C seguido por 40 ciclos: 15 segundos a 95°C seguido por 1 minuto a 6 0°C en el sistema de detección de secuencia ABI PRI SM® 7000 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk A/D Ijssel, Holanda).
Tabla 3: Secuencias de cebadores para los marcadores positivos y negativos:
Cebador
Gen Secuencia de cebador Sec. con núm. de ident.
Directo
Colágeno 2a1 L10347 GGCAATAGCAGGTTCACGTACA 35
Inverso
Colágeno 2a1 L10347 CGATAACAGTCTTGCCCCACTT 36
Directo
FGFR3 NM_000142 ACGGCACACCCTACGTTACC 37
Inverso
FGFR3 NM_000142 TGTGCAAGGAGAGAACCTCTAGCT 38
Directo
BMP-2 NM_001200 CCAACACTGTGCGCAGCTT 39
Inverso
BMP-2 NM_001200 AAGAATCTCCGGGTTGTTTTCC 40
Directo
ALK-1 NM_000020 CAGTCTCATCCTGAAAGCATCTGA 41
Inverso
ALK-1 NM_000020 TTTCCCACACACTCCACCAA 42
Directo
colágeno 10a1 NM_000493 TGGAGTGTTTTACGCTGAACGAT 43
Inverso
colágeno 10a1 NM_000493 CCTCTTACTGCTATACCTTTACTCTTTATGG 44
Directo
colágeno 1A1 NM_000088 TGCCATCAAAGTCTTCTGCAA 45
Inverso
colágeno 1A1 NM_000088 CGCCATACTCGAACTGGAATC 46
Directo
colágeno 3a1 NM_000090 CACTATTATTTTGGCACAACAGGAA 47
Inverso
colágeno 3a1 NM_000090 AGACACATATTTGGCATGGTTCTG 48
Directo
MMP13 NM_002427 CAAGGGATCCAGTCTCTCTATGGT 49
Inverso
MMP13 NM_002427 GGATAAGGAAGGGTCACATTTGTC 50
Directo
PTHLH NM_002820 GCTCGGTGGAGGGTCTCA 51
Inverso
PTHLH NM_002820 CTGTGTGGATTTCTGCGATCA 52
Directo
GAPDH NM_002046 CATCCATGACAACTTTGGTATCG 53
Inverso
GAPDH NM_002046 AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT 54
Los resultados se expresan para cada gen marcador probado como la expresión relativa en la muestra (transducción con 15 adenovirus probado) vs el control (adenovirus control apagado) (Expresión relativa = 2ddCt, donde ddCt = dCtmuestra KD - dCtKD control y dCt = Ctmuestra - CtGAPDH). Los resultados para los 14 genes se muestran en la Figura 9. El apagado del ARNm de los genes respectivos resulta en la expresión de los marcadores positivos, mientras los niveles de los marcadores negativos son bajos o no detectables.
20 Virus de Control
Ad-BMP2; descrito en WO 03/018799 Ad-ALPL: Adenovirus Ad5 dE1/E2A que median la expresión de la fosfatasa alcalina de longitud completa de hígado/hueso/riñón (NP_000469).
Ejemplo 12: Expresión de ADNc en cartílago humano
A partir de la identificación de un modulador de la síntesis de cartílago, es de gran importancia evaluar si el modulador se expresa en el tejido y las células de interés. Esto se puede lograr por la medición de los niveles de ARN y/o proteína. En 5 años recientes, los niveles de ARN se cuantificaron mediante de tecnologías de PCR en tiempo real, por el cual el ARN primero se transcribe a ADNc y después la amplificación de los ADNc de interés se controla durante una reacción de PCR cuantitativa. La gráfica de amplificación y el valor de Ct resultante son indicadores de la cantidad de ARN transcrito específico presente en la muestra. Los valores de Ct se determinan en presencia o ausencia de la etapa de transcriptasa inversa (+RT vs -RT). Una señal de amplificación en las condiciones -RT indica la ocurrencia de productos de PCR no
10 específicos que se originan a partir del ADN genómico. Si el valor Ct +RT es 3 valores Ct más alto que el valor Ct -RT Ct, entonces el ARN que se investiga está presente en la muestra.
Para evaluar si los polipéptidos de los genes identificados en el ensayo anterior se expresan en cartílago humano, se realiza una PCR en tiempo real con cebadores específicos para los polinucleótidos ("Ensayo bajo solicitud" de Applied Biosystems) 15 en ARN total de cartílago humano (Clinomics Biosciences). Se analizan 2 muestras de pacientes sin osteoartritis y 2 muestras con osteoartritis.
En resumen, 40 ng de ARN se transcriben a ADN por medio del uso de la enzima Transcriptasa Inversa MultiScribe (50 U/µl) (Applied BioSystems). El ADNc resultante se amplifica con polimerasa AmpliTaq Gold DNA (Applied BioSystems)
20 durante 40 ciclos por medio del uso de un sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7000. La amplificación del transcrito se detecta mediante SybrGreen que resulta en una señal fluorescente a partir de intercalarse en la doble cadena del ADN.
El ARN total aislado a partir de cartílago humano se analiza por la presencia de los transcritos que se enumeran en la Tabla 25 4 mediante PCR cuantitativo en tiempo real.
Para los genes enumerados en la Tabla 5 los valores Ct obtenidos indican que ellos se detectan en todas las muestras de ARN. El ARN ELA1 no se detecta en el análisis de PCR en tiempo real, lo que remarca la necesidad del análisis de un paciente adicional.
Tabla 4: valores Ct
DIANA
Cartílago Normal Cartílago OA
Ct muestra 1 Ct muestra 2 Ct muestra 1 Ct muestra 2
PDE1A
30.8 28.5 30.7 30.2
GPR103
33.1 33.3 38.4 37.4
JAK1
26.2 24.1 27 26
ICK
36.3 33.8 36.1 35.5
DGKB
28.5 26.7 29.7 28.7
DUSP3
27.1 24.2 27 27.1
DUSP11
28.8 27.5 29.9 29.2
SLC26A8
36.13 34.04 37.12 37.22
SLC15A2
32.5 28.1 34.7 32.9
ABCG1
29.7 28 31.1 29.5
FZD1
28.1 25.4 34.1 27.1
ELA1
40 40 40 39.1
Ejemplo 13: Identificación de pequeñas moléculas que inhiben la actividad quinasa diana.
Se tamizan compuestos para la inhibición de la actividad de las dianas que son polipéptidos de quinasas. La afinidad de los compuestos por los polipéptidos se determina en un experimento que detecta cambios en las condiciones de reacción después de la fosforilación. Los polipéptidos quinasa DIANA se incuban con sus substratos y ATP en un amortiguador adecuado. La combinación de estos compuestos resulta en la fosforilación in vitro del sustrato. Las fuentes de compuestos incluyen genotecas de tamizaje disponibles comercialmente, péptidos en una genoteca de presentación de fagos o una genoteca de fragmentos de anticuerpos, y compuestos que demostraron tener afinidad de unión por una quinasa DIANA.
Los polipéptidos quinasa DIANA se pueden preparar en un número de maneras en dependencia de si el ensayo se correrá mediante el uso de células, fracciones de células o bioquímicamente en proteínas purificadas. Los polipéptidos se pueden aplicar como péptidos completos o como fragmentos de polipéptidos, que todavía comprenden actividad catalítica quinasa DIANA.
La identificación de pequeñas moléculas que inhiben la actividad de los polipéptidos quinasa DIANA se realiza por la medición de cambios en los niveles de sustrato fosforilado o ATP. A partir de que el ATP se consume durante la fosforilación del sustrato, sus niveles correlacionan con la actividad quinasa. La medición de los niveles de ATP mediante reacciones quimoluminiscentes por lo tanto representa un método para medir la actividad quinasa. in vitro (Perkin Elmer). En un segundo tipo de ensayo, los cambios en los niveles de sustrato fosforilado se detectan con agentes fosfoespecíficos y se correlacionan a la actividad quinasa. Estos niveles se detectan en solución o después de la inmovilización del sustrato en una placa de microtitulación u otro vehículo. En solución, el sustrato fosforilado se detecta mediante transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) entre el sustrato etiquetado con Eu y un anticuerpo fosfoespecífico etiquetado con APC (Perkin Elmer), mediante polarización fluorescente (FP) después de la unión de un anticuerpo fosfoespecífico al sustrato fosforilado etiquetado fluorescentemente (Panvera), mediante un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado (ALPHA) por medio del uso del sustrato fosforilado y el anticuerpo fosfoespecífico, ambos acoplados a perlas ALPHA (Perkin Elmer) o por medio del uso del reactivo de unión a IMAP que detecta específicamente grupos fosfato y así alivia el uso del anticuerpo fosfoespecífico (Molecular Devices). Alternativamente, el sustrato se inmoviliza directamente o por medio del uso de estreptavidina-biotina en una placa de microtitulación. Después de la inmovilización, el nivel de sustrato fosforilado se detecta por medio del uso de un ELISA clásico donde la unión del anticuerpo fosfoespecífico se controla ya sea mediante una enzima como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP) que se acoplan directamente al anticuerpo fosfoespecífico o se acoplan al anticuerpo secundario. La actividad enzimática correlaciona con los niveles de sustrato fosforilado. Alternativamente, la unión del anticuerpo fosfoespecífico etiquetado con Eu al sustrato fosforilado inmovilizado se determina mediante energía de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) (Perkin Elmer). Adicionalmente, el sustrato se puede recubrir en placas FLASH (Perkin Elmer) y se detecta la fosforilación del sustrato por medio del uso de ATP etiquetado con 33P o anticuerpo fosfoespecífico etiquetado con 125I.
Las moléculas pequeñas se tamizan al azar o se preseleccionan en base a la clase de fármaco, (es decir, inhibidores de quinasas conocidos), o a partir de los resultados del tamizaje virtual de ligandos (VLS). VLS usa tecnología de acoplamiento virtual para probar un gran número de pequeñas moléculas en sílico por su unión al polipéptido de la invención. Las pequeñas moléculas se añaden a la reacción de las quinasas y su efecto en los niveles de sustrato fosforilado se mide con una o más de las tecnologías descritas anteriormente.
Las pequeñas moléculas que inhiben la actividad quinasa se identifican y posteriormente se prueban a diferentes concentraciones. Los valores IC50se calculan a partir de estas curvas de dosis respuesta. Los aglutinadores fuertes tienen una IC50 en el intervalo nanomolar o incluso picomolar. Los compuestos que tienen una IC50 de al menos 10 micromoles o mejor (nmol a pmol) se aplican en el ensayo de colágeno II para comprobar su efecto en la inducción de estimulación anabólica de condrocitos.
Ejemplo 14: Tamices de ligandos para GPCR DIANA.
Ejemplo 14 A: Tamiz de genes reporteros.
Las células de mamíferos tales como Hek293 o CHO-K1 se transfectan establemente con un plásmido que contiene el gen de la luciferasa bajo el control de un promotor dependiente de AMPc (elementos CRE) o se transducen con un adenovirus que contiene un gen de la luciferasa bajo el control de un promotor dependiente de AMPc. Adicionalmente construcciones reporteras se pueden usar con el gen de la luciferasa bajo el control de un promotor dependiente de Ca2+(elementos NF-AT)
o un promotor controlado por el NF-KB activado. Estas células, que expresan la construcción reportera, se transducen después con un adenovirus que contiene el ADNc de un GPCR DIANA. Cuarenta (40) horas después de la transducción las células se tratan con lo siguiente:
a) un agonista para el receptor y tamizado contra una larga colección de compuestos de referencia que comprenden péptidos (LOPAP, Sigma Aldrich), lípidos (Biomol, TimTech), carbohidratos (Specs), compuestos naturales (Specs, TimTech), compuestos químicos pequeños (Tocris), genotecas de tamizaje disponibles comercialmente, y compuestos que se ha demostrado que tienen afinidad de unión por un polipéptido, que comprenden una secuencia de amino ácidos seleccionada a partir de un grupo que consiste de las sec. con núms. de ident. de los GPCR DIANA; o b) una larga colección de compuestos de referencia que comprenden péptidos (LOPAP, Sigma Aldrich), lípidos (Biomol, TimTech), carbohidratos (Specs), compuestos naturales (Specs, TimTech), compuestos químicos pequeños (Tocris), genotecas de tamizaje disponibles comercialmente, y compuestos que se demuestra que tienen afinidad de unión por un polipéptido, que comprenden una secuencia de amino ácidos seleccionada a partir de un grupo que consiste de las sec. con núms. de ident. de los GPCR DIANA.
Los compuestos, que decrecen el aumento inducido por el agonista en la actividad luciferasa o la actividad constitutiva, se consideran antagonistas o agonistas inversos para un GPCR DIANA. Estos compuestos se tamizan nuevamente para verificación y se tamizan por su efecto en la estimulación anabólica de los condrocitos. Los compuestos se tamizan además para verificar su unión a GPCR. Los ensayos de unión y actividad reportera se pueden realizar esencialmente en cualquier orden para tamizar los compuestos.
Adicionalmente, las células que expresan el gen reportero NF-AT se pueden transducir con un adenovirus que contiene el ADNc que codifica la subunidad a de G15 o subunidades Ga quiméricas. G15 es una proteína G promiscua de la clase Gq que se acopla a muchos GPCRs diferentes y como tal re-dirige sus señales hacia la liberación de los almacenes de Ca2+ intracelular. Las subunidades G alfa quiméricas son miembros de la familia Gs y Gi/o por lo que los últimos 5 residuos Cterminales se remplazan por aquellos de Gaq, estas proteínas G quimérica además redirigen la señalización de AMPc a la señalización de Ca2+.
Ejemplo 14 B: Tamiz FLIPR.
Las células de mamífero tales como Hek293 o CHO-K1 se transfectan establemente con una construcción de plásmido de expresión que contiene el ADNc de un GPCR DIANA. Las células se siembran, crecen, y se seleccionan hasta que se pueden obtener suficientes células estables. Las células se cargan con un fluoróforo dependiente de Ca2+ tal como Fura3 o Fura4. Después de lavar el exceso de fluoróforo las células se tamizan contra una larga colección de compuestos de referencia que comprenden péptidos (LOPAP, Sigma Aldrich), lípidos (Biomol, TimTech), carbohidratos (Specs), compuestos naturales (Specs, TimTech), compuestos químicos pequeños (Tocris), genotecas de tamizaje disponibles comercialmente, y compuestos que se demuestra que tienen afinidad de unión por un polipétido que comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de sec. con núms. de ident. de los GPCR DIANA, al añadir simultáneamente un agonista (alternativamente no se necesita añadir un agonista si se usa la actividad constitutiva del receptor) y un compuesto a las células. La activación del receptor se mide como un aumento casi instantáneo en la fluorescencia debido a la interacción del fluoróforo y el Ca2+ que se libera. Los compuestos que reducen o inhiben el aumento en la fluorescencia inducido por el agonista (o la fluorescencia constitutiva) se consideran antagonistas o agonistas inversos para el receptor contra el que se tamizan. Estos compuestos se tamizan nuevamente para medir la cantidad de estimulación anabólica de los condrocitos así como la unión a GPCR DIANA.
Ejemplo 14 C: AequoTamiz.
Las células CHO, que expresan establemente Apoaequorina se transfectan establemente con una construcción de plásmido que contiene el ADNc de un GPCR DIANA. Las células se siembran, crecen, y se seleccionan hasta que se pueden obtener suficientes células estables. Las células se cargan con coelenterazina, un cofactor para apoaequorina. A partir de la activación del receptor los almacenes de Ca2+ intracelulares están vacíos y la aequorina reaccionará con la coelenterazina en un proceso de emisión de luz. La luz emitida es una medida para la activación del receptor. La CHO, que expresa de forma estable ambos la apoaequarina y el receptor se tamiza contra una larga colección de compuestos de referencia que comprenden péptidos (LOPAP, Sigma Aldrich), lípidos (Biomol, TimTech), carbohidratos (Specs), compuestos naturales (Specs, TimTech), compuestos químicos pequeños (Tocris), genotecas de tamizaje disponibles comercialmente, y compuestos que se demuestra que tienen afinidad de unión por un polipétido que comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de sec. con núms. de ident. de los GPCR DIANA, al añadir simultáneamente un agonista (alternativamente no se necesita añadir un agonista si se usa la actividad constitutiva del receptor) y un compuesto a las células. La activación del receptor se mide como un destello de luz casi instantáneo debido a la interacción de la apoaequorina, coelenterazina,y el Ca2+ que se libera. Los compuestos que reducen o inhiben el aumento en la luz inducido por el agonista o la actividad constitutiva se consideran antagonistas o agonistas inversos para el receptor
contra el cual se tamizaron. Estos compuestos se tamizan nuevamente para medir la cantidad de estimulación anabólica de los condrocitos así como la unión a GPCR DIANA.
Adicionalmente, las células CHO que expresan establemente el gen de la apoaequorina se transfectan establemente con una construcción de plásmido que contiene el ADNc que codifica la subunidad a de G15 o las subunidades G aquiméricas. G15 es una proteína G promiscua de la clase Gq que se acopla a muchos GPCRs diferentes y como tal redirige sus señales hacia la liberación de los almacenes de Ca2+ intracelular. Las subunidades G alfa quiméricas son miembros de la familia Gs y Gi/o por lo que los últimos 5 residuos C-terminales se remplazan por aquellos de Gaq, estas proteínas G quimérica además redirigen la señalización de AMPc a la señalización de Ca2+.
Ejemplo 14 D: Tamizaje para compuestos que se unen a los polipéptidos GPCR (experimento de desplazamiento)
Los compuestos se tamizan por la unión a los polipéptidos GPCR dianas. La afinidad de los compuestos a los polipéptidos se determina en un experimento de desplazamiento. En breve, los polipéptidos GPCR se incuban con un ligando etiquetado (radioetiquetado, etiquetado fluorescente) que se conoce se une al polipéptido y con un compuesto no etiquetado. El desplazamiento del ligando etiquetado del polipéptido se determina por la medición de la cantidad de ligando etiquetado que todavía se asocia con el polipéptido. La cantidad asociada con el polipéptido se grafica contra la concentración del compuesto para calcular los valores de IC50. Estos valores reflejan la afinidad de unión del compuesto a su DIANA, es decir los polipéptidos GPCR diana. Los aglutinadores fuertes tienen una IC50 en el intervalo nanomolar o incluso picomolar. Los compuestos que tienen una IC50 de al menos 10 micromoles o mejor (nmol a pmol) se aplican en el ensayo de estimulación anabólica de condrocitos para comprobar su efecto en la osteogénesis. Los polipéptidos GPCR diana se pueden preparar en un número de maneras en dependencia de si el ensayo se corre en células, fracciones de células o bioquímicamente en proteínas purificadas.
Ejemplo 14 E: Tamizaje por compuestos que se unen a GPCR diana (ensayo de tamizaje de GPCR genérico)
Cuando un receptor de proteína G se activa constitutivamente, se une a la proteína G (Gq, Gs, Gi, Go) y estimula la unión del GTP a la proteína G. La proteína G después actúa como GTPasa y lentamente hidroliza el GTP a GDP, por lo cual el receptor, bajo condiciones normales, se desactiva. Sin embargo, los receptores constitutivamente activados continúan el intercambio de GDP a GTP. Un análogo no-hidrolizable del GTP, [35S]GTPyS, se puede usar para controlar el aumento de la unión a las membranas que expresan constitutivamente receptores activados. Se informó que el [35S]GTPyS se puede usar para controlar el acoplamiento de la proteína G a las membranas en ausencia y presencia de ligando. Además, un enfoque preferido es el uso de una proteína de fusión GPCR-G. La estrategia para generar una proteína de fusión GPCR dianaproteína G es bien conocida por aquellos conocidos en la materia. Las membranas que expresan la proteína de fusión GPCR diana-proteína G se preparan para usarse en la identificación directa de compuestos candidatos como agonistas inversos. Las membranas homogenizadas con proteína de fusión GPCR diana-proteína G se transfieren en una placa de 96 pozos. Una herramienta de pasador se usa para transferir un compuesto candidato en cada pozo más [3sS]GTPyS, seguido por la incubación en un agitador por 60 minutos a temperatura ambiente. El ensayo se detiene por centrifugación de las placas a 4000 RPM por 15 minutos a 22°C. Las placas después se aspiran y se lee después la reactividad.
Ejemplo 14 F: Estudio de unión receptor ligando en la superficie celular.
El receptor se expresa en células de mamíferos (Hek293, CHO, COS7) por la transducción adenoviral de las células (ver Estados Unidos 6,340,595). Las células se incuban con ambos ligandos etiquetados (iodado, tritiado, o fluorescente) y el compuesto no etiquetado a diferentes concentraciones, en el intervalo de 10 pM a 10 µM (3 horas a 4°C. : 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 y 0.2% BSA, ajustada a pH 7.4). Las mezclas de reacción se aspiran en filtros de cristal GF/B tratados con PEI por medio del uso de un cosechador de células (Packard). Los filtros se lavan dos veces con amortiguador helado (25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, ajustado a pH 7.4). Se añade el centelleante (MicroScint-10; 35 µl) a los filtros secos y los filtros se cuentan en un contador de centelleo (Packard Topcount). Los datos se analizan y grafican por medio del uso del sofware Prism (GraphPad Sdetware, San Diego, Calif.). Las curvas de competencia se analizan y se calculan los valores de IC50. Si uno o más puntos de datos no caen dentro del intervalo sigmoidal de la curva de competencia o cerca del intervalo sigmoidal se repite el ensayo y las concentraciones del ligando etiquetado y del compuesto no etiquetado se adaptan para tener más puntos de datos cerca de o en el intervalo sigmoidal de la curva.
Ejemplo 14 G: Estudios de unión receptor ligando en preparaciones de membrana.
El aislamiento de las preparaciones de membrana a partir de células de mamíferos (Hek293, CHO, COS7) que sobreexpresan el receptor se hace como sigue: El medio se aspira de las células transducidas y las células se cosechan en 1 x PBS por un raspado suave. Las células se centrifugan (2500 rpm 5 min) y resuspenden en 50 mM Tris pH 7.4 (10 x 106 células/ml). El precipitado de células se homogeniza por sonicación 3 x 5 seg (UP50H; sonotrodo MS1; máx amplitud: 140 µm; máx espesor de energía sónica: 125W/cm2). Las fracciones de membrana se preparan por centrifugación 20 min a velocidad máxima (13,000 rpm ~15,000 a 20,000g o rcf). El precipitado resultante se resuspende en 500 µl 50 mM Tris pH
7.4 y se sonica nuevamente por 3 x 5 sec. La fracción de membrana se aísla por centrifugación y finalmente se resuspende en PBS. Los valores de competencia de unión y derivación de IC50se determinan como se describió anteriormente.
Ejemplo 14 H: Tamiz de internalización (1)
La activación de una ruta de transducción de señales asociada a GPCR comúnmente lleva a la translocación de moléculas de transducción de señales específicas del citoplasma a la membrana plasmática o del citoplasma al núcleo. Norak desarrolló su ensayo de transflúor que se basa en la translocación inducida por el agonista del complejo receptor-�arrestina-GFP del citosol a la membrana plasmática y posteriormente la internalización de este complejo, que ocurre durante la desensibilización del receptor. Un ensayo similar usa receptor etiquetado con GFP en lugar de �-arrestina. Las células Hek293 se transducen con un vector GPCR diana que traduce para una proteína de fusión GPCR diana-eGFP. 48 después de la transducción, las células se colocan en un medio fresco libre de suero por 60 minutos y un ligando por 15, 30, 60 o 120 minutos a 37°C y 5% CO 2. Después de los tiempos de exposición indicados, las células se lavan con PBS y se fijan con 5% paraformaldehído por 20 minutos a temperatura ambiente. La fluorescencia de GFP se visualiza con un microscopio Zeiss con una cámara digital. Este método tiene como objetivo la identificación de compuestos que inhiben la translocación mediada por ligando (mediada por la actividad constitutiva) de la proteína de fusión a compartimentos intracelulares.
Ejemplo 14 I: Tamiz de internalización (2)
Existen diversas variaciones en los ensayos de translocación por medio del uso de la complementación de la �-arrestina y la enzima �-gatactosidasa y ensayos basados en BRET con el receptor como donante de energía y la �-arrestina como aceptor de energía. Además se usan anticuerpos específicos por el receptor etiquetados con colorantes sensibles al pH para detectar la translocación del receptor inducida por el agonista a lisosomas acídicos. Todos los ensayos de translocación se usan para tamizar ligandos que actúan tanto como agonistas como antagonistas.
Ejemplo 14 J: Ensayo de melanóforo (Arena Pharmaceutical)
El ensayo de melanóforo se basa en la habilidad de GPCRs de alterar la distribución de los melanosomas que contienen melanina en melanóforos de Xenopus. La distribución de los melanosomas depende del receptor exógeno que se acopla ya sea a Gi/o o Gs/q. La distribución de los melanosomas (dispersos o agregados) se detecta fácilmente por la medición de la absorción de la luz. Este tipo de ensayo se usa para tamices tanto de compuestos agonistas como antagonistas.
Ejemplo15: Identificación de pequeñas moléculas que inhiben actividad proteasa.
Se tamizan compuestos para la inhibición de la actividad de los polipéptidos de la presente invención. La afinidad de los compuestos a los polipéptidos se determina en un experimento que detecta cambios en los niveles de sustrato clivado. En breve, los polipéptidos de la presente invención se incuban con sus sustratos en un amortiguador adecuado. La combinación de estos compuestos resulta en el clivaje del sustrato.
Los polipéptidos se pueden aplicar como polipéptidos completos o como fragmentos de polipéptidos, que todavía comprenden la actividad catalítica del polipéptido de la invención.
El clivaje del sustrato puede seguirse de varias maneras. En un primer método, la proteína sustrato se etiqueta fuertemente con un colorante fluorescente, como la fluoresceína, lo que resulta en un apagado de la señal fluorescente. El clivaje del sustrato, sin embargo, libera fragmentos individuales que contienen menos etiquetado fluorescente. Esto resulta en una pérdida del apagado y la generación de una señal fluorescente, que correlaciona con los niveles del sustrato clivado. El clivado de la proteína, que resulta en fragmentos de péptidos pequeños, se puede medir además por medio del uso de polarización fluorescente (FP). Alternativamente, el clivaje del sustrato se puede detectar además por medio del uso de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET): un péptido sustrato se etiqueta en ambos lados con un apagador y una molécula fluorescente, como DABCYL y EDANS. A partir del clivaje del sustrato ambas moléculas se separan lo que resulta en una señal fluorescente que correlaciona con los niveles de sustrato clivado. Adicionalmente, el
clivaje de un sustrato péptido puede además generar un nuevo sustrato para otra reacción enzimática, que después se detecta mediante un método fluorescente, quimoluminiscente o colorimétrico.
Las moléculas pequeñas se tamizan al azar o se preseleccionan en base a la clase de fármaco, es decir, proteasas o a partir de los resultados del tamizaje virtual de ligandos (VLS). VLS usa tecnología de acoplamiento virtual para probar un gran número de pequeñas moléculas en sílico por su unión al polipéptido de la invención. Las pequeñas moléculas se adicionan a la reacción proteolítica y su efecto en los niveles de sustrato clivado se mide con las tecnologías descritas.
Las pequeñas moléculas que inhiben la actividad proteasa se identifican y posteriormente se prueban a diferentes concentraciones. Los valores IC50 se calculan a partir de estas curvas de dosis respuesta. Los aglutinadores fuertes tienen una IC50 en el intervalo nanomolar o incluso picomolar. Los compuestos que tienen una IC50 de al menos 10 micromoles o mejor (nmol a pmol) se aplican en el ensayo de secreción de beta amiloide para comprobar su efecto en la secreción y procesamiento de beta amiloide.
Ejemplo 16: Identificación de pequeñas moléculas que inhiben la actividad fosfodiesterasa.
Se tamizan compuestos para la inhibición de la actividad de los polipéptidos de la presente invención. La afinidad de los compuestos por los polipéptidos se determina en un experimento que detecta cambios en los niveles de sustrato o producto. En breve, los polipéptidos de la presente invención se incuban con sus sustratos en un amortiguador adecuado. La combinación de estos componentes resulta en la conversión del sustrato en su producto.
Los polipéptidos se pueden aplicar como polipéptidos completos o como fragmentos de polipéptidos, que todavía comprenden la actividad catalítica del polipéptido de la invención.
La conversión de AMPc o GMPc en AMP o GMP se puede seguir 1) por la determinación de los niveles de AMPc o GMPc por medio del uso de por ejemplo ELISA. La tecnología de tamiz alfa, tecnología fluorescente resuelta en el tiempo, IMAP 2) por la determinación de los niveles de los productos AMP y GMP por medio del uso de un ensayo colorimétrico. La base de este último ensayo es el clivaje del AMPc o
GMPc por una fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos. El nucleótido- 5' liberado se cliva aún más en nucleósido y fosfato por la enzima 5'-nucleotidasa. El fosfato liberado debido al clivaje enzimático se cuantifica por medio del uso del reactivo BIOMOL GREEN™ en un ensayo de malaquita verde modificado.
Las moléculas pequeñas se tamizan al azar o se preseleccionan en base a la clase de fármaco, es decir, PDE o a partir de los resultados del tamizaje virtual de ligandos (VLS). VLS usa tecnología de acoplamiento virtual para probar un gran número de pequeñas moléculas en sílico por su unión al polipéptido de la invención. Las pequeñas moléculas se añaden a la reacción de PDE y su efecto en los niveles de nucleótidos cíclicos se mide con las tecnologías descritas.
Las pequeñas moléculas que inhiben la actividad PDE se identifican y posteriormente se prueban a diferentes concentraciones. Los valores IC50 se calculan a partir de estas curvas de dosis respuesta. Los aglutinadores fuertes tienen una IC50 en el intervalo nanomolar o incluso picomolar. Los compuestos que tienen una IC50 de al menos 10 micromoles o mejor (nmol a pmol) se aplican en ensayos que evalúan la actividad anabólica de los condrocitos. Esto se puede lograr por la determinación de los niveles de col2a1 y agrecano producidos por los condrocitos.
Referencias
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<SEC. CON NÚM. DE IDENT.:433; PRT; Homo sapiens> 20 EDRVVCNDKFAEDGARTVAQGTKKEGC
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25 <SEC. CON NÚM. DE IDENT.:436; PRT; Homo sapiens> YFHLAAWAVPAIKTITILALGQV
<SEC. CON NÚM. DE IDENT.:437; PRT; Homo sapiens> DGDVLSGVCFVGLNNVDALRGFV
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<SEC. CON NÚM. DE IDENT.:439; PRT; Homo sapiens> RIRTIMKHDGTKTEKLEKLM
<SEC. CON NÚM. DE IDENT.:440; PRT; Homo sapiens> VRIGVFSVLYTVPATIVIACYFY
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5 <SEC. CON NÚM. DE IDENT.:442; PRT; Homo sapiens> FTVFMIKYLMTLIVGITSGFWIW
<SEC. CON NÚM. DE IDENT.:443; PRT; Homo sapiens> SGKTLNSWRKFYTRLTNSKQGETTV
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<SEC. CON NÚM. DE IDENT.:594; PRT; Homo sapiens> PVKTEDMRGPADKHIPHIQGNMIKLETKKTKL
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> GALAPAGOS N.V.
<120> MÉTODOS Y MEDIOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA OSTEOARTRITIS
<130> 4/2KP12/31B
<140>
<141> 2005-06-21
5 <150> US 60/581,568
<151> 2004-06-21
<160> 478
<170> PatentIn versión 3.3
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
<220>
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
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<210> 450
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 467 19 gccgacagtg gtgcactac
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 470 19 accaatatgc ctaccttcc
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<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 471 19 actgtatccc agcagtccc
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<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 472 19 aagctgaaca taaccttgc
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<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 473 19 ttgaatagct cggtgtccc
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<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 474 19 gtggaaggca agatcttcc
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 475 19 tgtatggctg gtcgatcac
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 476 19 gctgcgacaa cttctgttc
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<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 477 19 gcccacggtc ttccactac
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético <400> 478 gactgaatca ggccttccc 19

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para identificar in-vitro un compuesto que induce la estimulación anabólica de condrocitos, que comprende
    -
    poner en contacto un compuesto con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 126 y 127; y -medir una propiedad del compuesto-polipéptido relacionada con la estimulación anabólica de condrocitos
    en donde, preferentemente, dicho polipéptido está en una preparación libre de célula in vitro o dicho polipéptido está presente en una célula de mamífero.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en donde dicha propiedad es afinidad de unión de dicho compuesto a dicho polipéptido.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido se presenta en una célula de mamífero y dicha propiedad es la activación de una ruta biológica que produce un marcador bioquímico indicativo de la estimulación anabólica de los condrocitos, dicho marcador biológico se selecciona preferentemente a partir de un grupo que consiste de colágeno tipo II, alfa-1 (col2a1) y agrecano.
  4. 4.
    El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho compuesto se selecciona a partir de un grupo que consiste de compuestos de una genoteca de tamizaje disponible comercialmente y compuestos que tienen una afinidad de unión por un polipéptido que comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 126 y 127.
  5. 5.
    El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido está en una preparación libre de célula in vitro y dicho compuesto es un péptido en una genoteca de presentación de fago o una genoteca de fragmento de anticuerpo.
  6. 6.
    Un método para el diagnóstico de una afección patológica que involucra una disminución sistémica o local en el espesor medio del cartílago (m) o una susceptibilidad a la afección en un sujeto, que comprende determinar una primera cantidad de polipéptido que comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 126 y 127 presente en una muestra biológica que se obtiene de dicho sujeto, y comparar dicha primera cantidad con los intervalos de cantidades del polipéptido que se determinan en la población de sujetos sanos, en donde un aumento de la cantidad de polipéptido en dicha muestra biológica comparada al intervalo de cantidades determinadas para los sujetos sanos es indicativa de la presencia de la afección patológica.
  7. 7.
    Un método para el diagnóstico de una afección patológica que involucra la desdiferenciación de condrocitos, dicho método comprende las etapas de:
    -
    determinar la cantidad de polipéptido de sec. con núms. de ident. 126 o 127 en una muestra; y
    -
    comparar la cantidad determinada en la etapa (a) con la cantidad de dicho polipéptido en una muestra de un individuo sano;
    en donde un aumento al comparar con la muestra del individuo sano es indicativo del inicio o presencia de dicha afección patológica, dicha afección patológica preferentemente es osteoartritis.
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