CS271321B2

CS271321B2 - Method of isosilybine-free silybine production

Info

Publication number: CS271321B2
Application number: CS858379A
Authority: CS
Inventors: Rolf Dr Madaus; Klaus Dr Gorler; Hartwig Dr Soicke
Original assignee: Madaus Ag
Priority date: 1984-11-22
Filing date: 1985-11-20
Publication date: 1990-09-12
Also published as: YU181285A; LU86164A1; PT81531A; GB2167746A; YU43690B; SE8505488D0; IE852927L; DK189491A; CA1337125C; HUT40115A; ES549119A0; CS837985A2; NO160206C; JPH0678228B2; CH660008A5; DK189491D0; NL8503136A; BE903694A; DK537685A; MX172175B

Description

Vynález se týká způsobu silibininu, který je prostý isosilybinu, a který má cenné farmakologické vlastnosti. Uvedená sloučenina se používá jako léčivo.

Ostropestřec mariánský - Silybum marianum (L.) Gaertn. (Carduus marianus L.) je Již od starověku známou léčivou rostlinou. Z flavolignanů vyskytujících se v plodech této rostliny byla izolována R. MÍinsterem jedna složka zvaná silybin (srov. Dissertation R. Mijnster, Munchen, 1966). Chemická struktura této sloučeniny byla vysvětlena A. Pelterem a R. Hánselem, srov. Tetrahedron Letters, Londýn, sv. 25, str. 2911-2916 (1968). ' □e známo, že silybin, nazývaný dříve také Jako silymarin I, je cenným jaterním terapeutikem (srov. DE-AS 17 67 666). Technický způsob výroby silybinu (tj. silymarinu I) se popisuje například v DE-AS 19 23 082.

□iž v r. 1974 se H. Wagner, P. Diesel a M.Seitz, Arzneimittelforschung, sv. 24 (4), str. 466 až 471, pokud jde o silybin domnívali, že existuji dva polohové isomery, tj. silybin a isosilybin. Tuto domněnku upřesnili a experimentálně potvrdili A. Arnone, L. Merlini a A. Zanarotti, Oournal Chemical Society Chem. comm., 1979, sv. 16, str. 696/97. Podle toho sestává známý silybin ze dvou různých sloučenin, tj. sloučenin dále uvedených strukturních vzorců A a B:

(B) isosilybin

Z těchto strukturních vzorců je patrno, že se u těchto sloučenin jedná o polohové isomery. Sloučenina vzorce A se nově podle nomenklatury INN označuje jako silibinin.

Tohoto označeni se používá také zde pro sloučeninu vzorce A.

CS 271321 82

Obě shora uvedené sloučeniny А а В byly dosud připraveny a odděleny jen v analytických množstvích a o farmakologických účincích těchto sloučenin není nic známo.

Úkolem předloženého vynálezu bylo tudíž vypracovat způsob výroby silibininu, který by byl prost isosilybinu a dále pak připravit farmaceutické přípravky, které by obsahovaly silibinin.

Předmětem předloženého vynálezu je tudíž způsob výroby silibininu vzorce

z vysušených ploco ostropestřce mariánského (Silybum marianum L. Gaertn.) zbavených hlavního množství mastného oleje tím, že se buňky plodů otevřou vysokým mechanickým tlakem, poté se vylisovaný zbytek obsahující zbytkový obsah 5 až 10 % oleje důkladně extrahuje ethylacetátem, ethylacetát se odpaří, potom se získaný odparek v množství % hmotnostní rozpustí ve spodní fázi tvořené methanolem a vodou ternární směsi roz pouštědel, sestávající z 95 dílů hmotnostních methanolu, 5 dílů hmotnostních vody a 100 dílů hmotnostních petroletheru o teplotě varu 40 až 60 °C, к odstranění vločkovitých částic pevné látky se směs odstředí za vzniku čirého roztoku a v tomto rozpouštědlovém systému se odparek (označovaný též jako suchý zbytek) podrobí protiproudému roztřepávání, přičemž se udržuje celkový objemový poměr horní fáze vůči dolní fázi 1:1 a potom se z odtékající spodní fáze odpařením ve vakuu к suchu izoluje 70 až 80 % směs polyhydroxylenylchromanonů, to jest silymarin I až IV neboli silymarin skupiny I až IV, ve formě nahnědlého prášku, jehož podstata spočívá v tom, že se získaný nahnědlý prášek suspenduje ve trojnásobném až pětinásobném množství hmotnostním metha nolu, získaná suspenze se za míchání zahřívá nolu odstraní za sníženého tlaku, koncentrát poté se přitom vyloučený produkt odfiltruje, к varu, potom se zhruba 1/3 až 2/3 methase ponechá v klidu za teploty místnosti, jednou až třikrát se promyje malým množstvím studeného methanolu, tedy hmotnostním množstvím methanolu představujícím

1/50 množství methanolu použitého к suspendování, vysuší se, za zahřívání se rozpustí ve 40- až 60-násobném hmotnostním množství ethylacetátu, к roztoku se přidá aktivní uhlí a roztok se vyčeři za varu pod zpětným chladičem, potom se aktivní uhlí odfiltruje, filtrát se za sníženého rátu se za intenzivního ponechá v klidu několik filtrováním vyloučeného tlaku zahustí na přibližně 1/10 míchání přidá asi 1/10 objemu koncentrátu methanolu, hodin, účelně produktu se směs rozmíchá pomocí intenzivního míchání enerpůvodního objemu, ke koncentsměs se až 12 hodin, za teploty místnosti, před odgickým míchadlem, odfiltrovaný produkt se jednou až třikrát promyje malým množstvím ethylacetátu, tedy vždy 1/50 hmotnostního množství, vztaženo na množství methanolu použitého к suspendování, a provede se vysušení ve vakuu.

Silibinin prostý isosilybinu se dá připravit také tím, že se

a) jeden hmotnostní díl nahnědlého prášku, na který se dále budou vztahovat veškerá udávaná množství, suspenduje v 0,7 až 1,5 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceCS 271321 B2 ného vodou, a získaná suspenze se ponechá v klidu jeden až dva dny a poté se sraženina odf iltruj e,

b) získaná sraženina se promyje 0,07 až 0,15 dilu hmotnostního studeného ethylacetátu nasyceného vodou a vysuší se při teplotě 30 až 50 °C ve vakuu,

c) tento produkt se za zahříváni к varu rozpustí ve 30 až 50 dílech hmotnostních absolutního (bezvodého) ethylacetátu, poté se na roztok působí 0,2 až 0,4 dílu hmotnostního aktivního uhlí po dobu 2 hodin za varu pod zpětným chladičem, směs se zfiltruje a filtrát se zahustí při teplotě 30 až 50 °C na 1/12 objemu rozpouštědla, které bylo použito к rozpouštění,

d) ke koncentrátu se přidá 0,5 až 0,0 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou, vyloučený silibinin se po 5 až 10 hodinách odfiltruje a

e) silibinin se suspenduje v 0,9 až 1,0 dílu hmotnostního technického ethylacetátu, suspenze se znovu zfiltruje, zbytek na filtru se vysuší ve vakuu při teplotě 30 až 50 °C, předběžně vysušený produkt se rozemele a znovu se vysuší ve vakuu při teplotě 30 až 50 °C.

Nahnědlý prášek popřípadě surový silymarin, který se používá ve stupni a) jako výchozí látka, je směsi silymarinů I až IV. Působením ethylacetátu, který je nasycen vodou, na surový silymarin dochází v podstatě к oddělení hlavních podílů silymarinů II až IV (silibinin je představován silymarinem I) a 20 až 30 % doprovodných látek v surovém silymarinů jakož i části isosilybinu. Tímto způsobem se získá ve stupni b) surový silibinin s výtěžkem vždy podle kvality surového silymarinů od 80 do 85 % (vztaženo na obsah silibininu v surovém silymarinů) a s obsahem 80 až 84 %.

Surový silibinin je - jak již bylo popsáno ve stavu techniky - představován směsí isosilybinu a silibininu v poměru asi 1 : 4.

Ve stupních c) až e) dochází к oddělování hlavních podílů isosilybinu od silibininu jakož i zbytku dalších shora uvedených složek.

Zvláštní výhodou tohoto dělicího postupu je použití pouze jednoho jediného rozpouštědla, tj. ethylacetátu, ovšem s různými podíly vody. Přitom je podstatné používat ve stupni c) bezvodého ethylacetátu a ve stupni d) ethylacetátu, který je nasycen vodou. Postupem podle předloženého vynálezu se získá silibinin ve výtěžku 79 až 85 % (vztaženo na silibinin v surovém silibininu) a s obsahem 96 až 98 % silibininu.

Zvláště výhodné provedeni postupu podle vynálezu spočívá v tom, že se

a) jeden díl hmotnostní nahnědlého prášku suspenduje v 0,9 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou, suspenze se ponechá v klidu po dobu 48 hodin při teplotě místnosti a získaná sraženina se odfiltruje,

b) sraženina se promyje 0,09 dílu studeného ethylacetátu nasyceného vodou a suší se 48 hodin ve vakuu při teplotě 40 °C,

c) získaný produkt se rozpustí za zahříváni к varu ve 36 dílech hmotnostních absolutního ethylacetátu, roztok se zahřívá s 0,36 dílu hmotnostního aktivního uhlí po dobu 2 hodin к varu pod zpětným chladičem, směs se zfiltruje a filtrát se zahustí ve vakuu při teplotě 50 °C na 1/12 objemu rozpouštědla, které bylo použito к rozpuštěni,

d) ke koncentrátu se při teplotě místnosti přidá 0,6 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou, směs se ponechá 12 hodin v klidu při teplotě místnosti a vyloučený produkt se odfiltruje,

e) tento produkt se dvakrát suspenduje vždy v 1,8 dílu hmotnostního technického ethylacetátu a suspense se vždy zfiltruje, zbytek na filtru se předběžné suší 24 hodin ve vakuu při teplotě 40 °C, potom se rozemele a dále se suší 48 hodin ve vakuu při teplotě 40 °C.

Bylo zjištěno, že silibinin, který je prostý isosilybinu, je velmi vhodný pro farmaceutické účely. S překvapením bylo zjištěno, že má podstatné výhody oproti dalším známým složkám extraktu ostropestřce mariánského (Silybum marianum). 3e zvláště vhodný к léčení cirhózy jater a toxicko-metabolických poškození jater. Tento silibinin může být používán také preventivně, takže se uvedená poškození dokonce vůbec nedostaví.

Vynález se rovněž týká léčiv, která obsahuji silibinin. Tato léčiva se používají většinou systemicky, například ve formě pilulek, kapsli, roztoků, spolu s obvyklými nosiči a popřípadě společně s obvyklými pomocnými látkami. Denní dávka pro dospělé pacienty činí asi 50 až 500 mg, vždy podle stavu pacientů a podle závažnosti příznaků choroby.

Následující příklady blíže objasňuji postup podle vynálezu. Jeho rozsah však v žádném případě neomezují.

Příklad 1

Výroba silibininu prostého isosilybinu:

500 g směsi polyhydroxyfenylchromanonu (silymarin I až IV = silymarin I. až IV. skupiny; obsah asi 70 %), která byla získána podle sloupce 8, řádků 14 až 19 DE-AS 19 23 082, na který se zde odkazuje, se suspenduje ve 2 kg methanolu, což odpovídá asi 2,53 litru a tato suspenze se zahřívá za míchání po dobu 15 minut к varu. Ze získaného roztoku lze tímto způsobem po tomto čase získat již určitý podíl vyloučeného silibininu. Potom se ve vakuu odpaří 0,75 až 1,25 kg, tj. asi 0,96 až 1,58 litru methanolu, a zbytek se ponechá v klidu po dobu 10 až 28 dnů při teplotě místnosti. Vyloučený silibinin se odfiltruje a dvakrát se promyje vždy 50 ml studeného methanolu. Po vysušeni při teplotě 40 °C ve vakuu se izolovaný surový silibinin dále čisti následujícím způsobem:

g surového silibininu se za zahřívání rozpustí ve 3 litrech technického ethylacetátu. Potom se к získanému roztoku přidá 20 g aktivního uhlí a směs se míchá další 2 hodiny za varu pod zpětným chladičem. Potom se směs zfiltruje na čirý roztok a tento roztok se zahusti při teplotě 50 °C za sníženého tlaku na objem asi 250 ml. Koncentrát se míchá po dobu 15 minut za použití přístroje U1tra-Turrax a za mícháni se přidá 25 ml methanolu. Potom se směs ponechá v klidu přes noc při teplotě místnosti. Silybin, který se přitom vyloučí, se před odfiltrováním znovu míchá ještě 5 minut rovněž za použiti přístroje U1tra-Turrax. Odfiltrovaná sraženina se dvakrát promyje vždy 50 ml ethylacetátu, potom se vysuší ve vakuové sušárně přes noc při teplotě 40 °C. Produkt se potom rozemele a vysuší se při teplotě 40 *C ve vakuové sušárně během 48 hodin.

Přiklad 2

Výroba silibininu prostého isosilybinu kg směsi polyhydroxyfenylchromanonu (silymarin I až IV = silymarin I. až IV.skupiny; obsah asi 70 %) ve formě nahnědlého prášku, označovaný také jako surový silymarin, který byl získán podle sloupce 8, řádků 14 až 19 DE-AS 19 23 082, na který se zde odkazuje, se suspenduje v 1 litru ethylacetátu nasyceného vodou po dobu 30 minut za použiti zařízeni U1tra-Turrax. Po 48 hodinách stání při teplotě místnosti se sraženina odfiltruje, promyje se 100 ml studeného ethylacetátu, který je nasycen vodou, a suší se při teplotě 40 °C ve vakuu. Výtěžek tohoto meziproduktu, tj. surového silibininu, činí vždy podle kvality surového silymarinu 80 až 85 %, vztaženo na obsah silibininu v surovém silymarinu - při obsahu 80 až 84 %.

Surový silibinin se za varu rozpustí ve 40 litrech absolutního ethylacetátu, potom se získaný roztok vaří po dobu 2 hodin spolu s 360 g aktivního uhlí pod zpětným chladičem, směs se zfiltruje a filtrát se zahustí na objem 3330 ml při teplotě 50 °C ve vakuu. К tomuto roztoku se za intenzivního míchání přidá při teplotě místnosti 667 ml ethylacetátu nasyceného vodou. Po 1 až 3 hodinách poté začne docházet ke krystalizaci silibininu. Po stáni přes noc se vyloučený silibinin oddělí filtraci, dvakrát se suspenduje vždy v 1200 ml technického ethylacetátu během 5 až 10 minut, suspenze se znovu zfiltruje a předběžně se vysuší během 24 hodin za teploty 40 °C ve vakuu. Po rozemleti se produkt dále suší po dobu 48 hodin za teploty 40 °C ve vakuu.

CS 271321 02

Výtěžek silibininu, vztaženo na silibinin v surovém silibininu, Činí 79 až 85 % při obsahu 96 až 98,5 % silibininu, vždy podle kvality surového silibininu.

Produkovaný silibinin, vyrobený způsobem jak podle přikladu 1, tak podle přikladu 2, má tyto fyzikálně chemické parametry:

H-NMR	/pyridi	.n-d_, Э	100	MHz/:
§ /PP	m/
3,79		• s			3H	0CH₃
3,8-4,	2	m			1H	CH₂-0H
4,25-4	,40	m			1H	2 Ή
5,05		d	(0=11	Hz)	1H	3H
5,39		d	(□« 8	Hz)	1H	3'H
5,48		d	(□«11	Hz)	ih'	2H
6,41		d	(□= 2	Hz)	1H	6H
6,51		d	(□= 2	-Hz)	1H	8H
7,1-7,	6				6H	a rom.

b) ¹³C-NMR /pyridin-dg, 25,18 MHz/:

C atom J* /ppm/

198,43

168,85

165,06

163,75

149,89

148,82

4' 145,05

3' 144,71

1' 131,33

Klinické pokusy se silibininem:

Toxická poškozeni jater nabyla v posledních desetiletích na mimořádně značném významu. Nejčastější příčinou poškození je jako dosud alkohol.

Kontrolovanými studiemi bylo možno zjistit vyšší účinnost silibininu vůči simulované terapii (placebo) nebo dalším srovnávacím terapiím. Při dvakrát opakované studii byl u 66 náhodně zvolených pacientů s játry poškozenými toxickým účinkem alkoholu, testován účinek silibininu (n » 31) a srovnáván s účinkem placeba (n » 35).

Statisticky vyhodnocené výsledky ukazují, že silibinin významně převyšuje placebo. Nápadná je přitom podstatně kratší doba hojení oproti placebu. Při druhé opět dvakrát opakované slepé studii se 76 pacienty, z nichž bylo 39 ošetřeno silibininem a 37 bylo podrobeno pouze kontrolní terapii, byly zjištěny velmi významné rozdíly ve prospěch silibininu .

Při toxických účincích narkózy na játra v souvislosti s operacemi břišních orgánů bylo možno prokázat, že podání silibininu před operací podstatně sníží pooperační zvýšeni jaterních enzymů v krvi. Rovněž dnes stále častěji se vyskytující poškození jater vyvolané určitými léky, je možno účinně potlačit podáním silibininu. Tuto skutečnost bylo možno prokázat na příkladu hepatózy vyvolané fenylhydantoinem, při němž se přes další podáni bezpodmínečně nutného medikamentu zabraňujícího křečím, při současné aplikaci silibininu veškeré laboratorní hodnoty během krátké doby normalizovaly.

DalŠí_pokusy u nemocných se schizofrenii a s těžkými poškozeními jater podáním chlorpromazinu vykazují rovněž positivní účinek silibininu.

Další pokusy se týkají zamezení účinku například chloroqulnu nebo asparaginázy na poškození jater.

CS 271321 в

U poškození jater v důsledku choroby z povoláni bylo možno и všech ošetřených pacientů podstatně zlepšit patologicky zvýšené jaterni nálezy, nezávisle na dotyčné příčině nebo na možných přídavných onemocněních.

Kromě toho existuje dostatek důkazů, že silibinin způsobuje podstatná zlepšeni také v případě chronicky zánětlivých jaternich onemocnění a při cirhóze jater. Tak například byli pacienti s cirhózou jater, kteří byli náhodně vybráni, sledováni při dlouhodobé studii dvojitým pokusem, při němž byl silibinin testován vůči placebu. Kritériem pro hodnocení terapeutického úspěchu byla především doba přežití. Zde vykazoval silibinin značnou převahu oproti placebu.

Srovnání účinku silibininu a isosilybinu a silybinu (směs, silibininu a isosilybinu) na modelu toxikace myši phalloidinem a praseodymem po intravenózni aplikaci

Antihepatotoxický účinek silibininu, isosilybinu a silybinu ve formě N-methylglukaminových solí byl testován v dávkách 50 a 100 mg l<g”^, vztaženo na silibinin, na modelu toxikace phalloidinem a praseodymem na myši po intravenózni aplikaci. Aplikace testované látky byla prováděna 1 hodinu před podáním phalloidinu popřípadě 1 hodinu před a 6 hodin, 24 hodin a 48 hodin po podání praseodymu. Vyhodnocovány byly při toxikaci phalloidinem doba přežiti a při toxikaci praseodymem různé parametry séra a jater 72 hodin po intoxikaci. .

Při intoxikaci phalloidinem činila doba přežití po podání silibininu u obou dávek 100 %, zatímco při použiti ostatních látek nepřekročila doba přežiti 40 % u neošetřených poškozených kontrolních exemplářů.

Isosilybin se ukázal v souvislosti s intoxikací praseodymem jako nesnášenlivý, takže dávku 100 mg/kg bylo nutno rozdělit do dvou dílčích aplikací.

Claims

PŘEDMĚT

VYNÁLEZU

1. Způsob výroby silibininu prostého isosilybinu, vzorce I z vysušených plodů ostropestřce mariánského (Silybum marianum L. Gaertn.) zbavených hlavního množství mastného oleje tím, ze se buňky plodů otevřou vysokým mechanickým tlakem, poté se vylisovaný zbytek obsahující ještě 5 až 10 % zbytku oleje důkladné extrahuje ethylacetátem, ethylacetát se odpaří, potom se získaný odparek v množství 2 % hmotnostních rozpustí ve spodní fázi tvořené methanolem a vodou ternární směsi rozpouštědel z 95 dílů hmotnostních methanolu, 5 dílů hmotnostních vody a 100 dílů hmotnostních

CS 271321 ΰ'2 petroletheru o teplotě varu 40 až 60 °C, к odstraněni vločkovitých částic pevné látky se směs odstředí za vzniku čirého roztoku a v tomto rozpouštědlovém systému se suchý zbytek podrobí v protiproudu roztřepáváni, přičemž se udržuje celkový objemový poměr horní fáze vůči dolní fázi 1:1 a potom se z odtékající spodní fáze odpařením ve vakuu к suchu izoluje 70 až 80 % směs polyhydroxyfenylchromanonů, to jest silymarinu I až IV neboli silymarin skupiny I až IV, ve formě nahnědlého prášku, vyznač uj Ιοί se tím, že se získaný nahnědlý prášek suspenduje v trojnásobném až pětinásobném hmotnostním množství methanolu, získaná suspenze se za míchání zahřívá к varu, potom se 1/3 až 2/3 methanolu odstraní za sníženého tlaku, koncentrát se ponechá v klidu za teploty místnosti, potom se vyloučený produkt odfiltruje, jednou-až třikrát se promyje methanolem, vždy v hmotnostním množství představujícím 1/50 methanolu použitého к suspendování, vysuší se, zahřeje na teplotu varu se 40- až 60-násobným množstvím ethylacetátu к rozpuštění, к roztoku se přidá aktivní uhlí a roztok se vyčeři za varu pod zpětným chladičem, potom se aktivní uhlí odfiltruje, filtrát se za sníženého tlaku zahusti na 1/10 původního objemu, ke koncentrátu se za intenzivního mícháni přidá 1/10 objemu koncentrátu methanolu, směs se potom ponechá v klidu 8 až 12 hodin za teploty místnosti, před odfiltrováním vyloučeného produktu se směs rozmíchá pomoci intenzivního mícháni, odfiltrovaný produkt se jednou až třikrát promyje ethylacetátem vždy v hmotnostním množství 1/50 množství methanolu použitého к suspendováni a vysuší se ve vakuu.
2. Způsob výroby silibininu svrchu uvedeného vzorce I, prostého isosilybinu, podle bodu 1, z vysušených plodů ostropestřce mariánského (Silybum marianum L. Gaertn.) zbavených hlavního množství mastného oleje tím, že se buňky otevřou vysokým mechanickým tlakem, potom se vylisovaný zbytek obsahující ještě 5 až 10 % zbylého oleje důkladně extrahuje ethýla сеcátem, ethylacetát se odpaří, potom se získaný odparek v množství 2 % hmotnostní rozpustí ve spodní fázi tvořené methanolem a vodou ternárni rozpouštědlové směsi z 95 dílů hmotnostních methanolu, 5 dílů hmotnostních vody a 100 dílů hmotnostních petroletheru o teplotě varu 40 až 60 °C, к odstranění vločkovitých částic pevné látky se směs odstředí za vzniku čirého roztoku a v tomto rozpouštědlovém systému se suchý zbytek podrobí v protiproudu roztřepáváni, přičemž se udržuje celkový objemový poměr horní fáze vůči dolní fázi 1:1 a poté se z odtékající spodní fáze odpařením ve vakuu к suchu izoluje 70 až 80% směs polyhydroxyfenylchromanonu, to znamená silymarinu I až IV neboli silymarinu skupiny I až IV, ve formě nahnědlého prášku, vyznačující se tím, že se

a) 1 díl hmotnostní získaného nahnědlého prášku, na který se budou vztahovat dále udávaná množství, suspenduje v 0,7 až 1,5 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou, a získaná suspenze se ponechá v klidu jeden až dva dny a poté se sraženina od- f ilt ruj e,

b) získaná sraženina se promyje 0,07 až 0,15 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou a vysuší se za teploty 30 až 50 °C ve vakuu,

c) tento produkt se zahříváním к varu rozpustí ve 30 až 50 dílech hmotnostních absolutního ethylacetátu, potom se na roztok působí 0,2 až 0,4 dílu hmotnostního aktivního uhlí po dobu 2 hodin za varu pod zpětným chladičem, směs se zfiltruje a filtrát se zahustí za teploty 30 až 50 °C na 1/12 objemu rozpouštědla, kterého bylo použito к rozpouš t ění,

d) ke koncentrátu se přidá 0,5 až 0,8 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou, vyloučený silibinin se po 5 až 10 hodinách odfiltruje a

e) silibinin se suspenduje v 0,9 až 1,8 dílu hmotnostního technického ethylacetátu, suspenze se znovu filtruje, zbytek na filtru se vysuší ve vakuu za teploty 30 až 50 C, předběžně vysušený produkt se rozemele a znovu vysuší ve vakuu za teploty 30 až 50 °C.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se

a) jeden díl hmotnostní nahnědlého prášku suspenduje v 0,9 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou, suspenze se ponechá v klidu po dobu 48 hodin za teploty místnosti a získaná sraženina se odfiltruje,

b) sraženina se promyje 0,09 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou a suší se ve vakuu 48 hodin za teploty 40 °C,

c) získaný produkt se rozpustí za zahříváni к varu ve 36 dílech hmotnostních absolutního ethylacetátu, roztok se zahřívá s 0,36 dílu hmotnostního aktivního uhlí po dobu 2 hodin к varu pod zpětným chladičem, směs se zfiltruje a filtrát se zahustí ve * o / vakuu za teploty 50 C na 1/12 objemu rozpouštědla, které bylo použito к rozpouštěni,

d) ke koncentrátu se za teploty místnosti přidá 0,6 dílu hmotnostního ethylacetátu nasyceného vodou, směs se ponechá 12 hodin v klidu za teploty místnosti a vyloučený produkt se odfiltruje,

e) získaný produkt se dvakrát suspenduje vždy v 1,8 dílu hmotnostního technického ethylacetátu a suspenze se vždy zfiltruje, zbytek na filtru se předběžně suší 24 hodin ve vakuu za teploty 40 °C, potom se rozemele a dále se suší po dobu 48 hodin ve vakuu za teploty 40 °C.