CN1860223A - 细胞培养和繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养方法，包括制备具有层叠结构的碳基基体的步骤，所述基体由至少两个多孔材料层组成，该多孔材料层基本相互重叠并结合，在所述层间形成能够流通的空隙；或者所述基体由至少一个多孔材料层组成，该多孔材料层自身排列或折叠，在保持其形状的同时，使得在材料层的至少两个重叠部分之间形成能够流通的空隙。然后所述方法包括用活和/或增殖生物材料装填基体并使该负载的基体与液体介质接触。

Description

细胞培养和繁殖方法
本发明涉及用于培养细胞的方法，包括提供具有层叠结构的碳基载体/基体的步骤，所述载体/基体由至少两个多孔材料层组成，该多孔材料层基本相互叠置并且在所述层间存在能够流通的空隙；或者由至少一个多孔材料层组成，该多孔材料层在保持其形状的同时自身卷起或者排列成在材料层的至少两个相互叠置部分之间存在能够流通的空隙；所述方法还包括用活的和/或能增殖的(能存活的)生物材料装填载体，以及使该负载的载体与液体介质接触。
在生物反应器工艺技术中，同时增加所用基体材料的表面积已经成为常用方法。现有系统主要利用颗粒、绒屑、圆片或圆盘、毛细管、网状物、珠等形式的无序结构，其中所用的材料主要由陶瓷或聚合物构成。这些系统通常具有大的压力降并且对于体积产率而言表面积有限。而且，通常对成型体的尺寸存在限制(压力降、重量、成本、封装变化等)，这使得难以在技术上放大工艺。另外，在使用或灭菌期间聚合物趋向于经历化学或物理变化。而且，当存在无序填充(packings)时，不能一直保证一致均匀的营养供应和可再生装填。死空间和沿着容器壁的偏向流导致不同的代谢条件，这可以影响敏感蛋白的产品特性，例如它们的折叠。
工业规模的反应要求高通量并且受经济因素的限制。为了能够从细胞混合物中更好分离代谢产物或为了随后能够利用它们，将细胞或细胞培养物固定在固体基体上。这导致环境介质与诸如对剪切力敏感的细胞的隔离。例如，如果利用膜作为成型体的壁，并且使用十字形几何体，则可以将气体代谢产物连续带给细胞而没有气泡，和/或使得在膜的一侧富集所需的代谢产物。这有助于营养供应、代谢物的交换和工艺参数的测量，并且导致工艺的明显增强。细胞培养物的固定还允许具有连续供料和收获产物的连续工艺管理。
另外，利用固定化细胞培养物的方法允许高细胞密度，从而具有较高的反应速率，因而使得更小尺寸的系统成为可能，并且产率可以急剧增加。例如对于发酵过程，来自遗传修饰的哺乳动物细胞系的固定化细胞培养物可以实现比利用悬浮细胞培养物更高的反应速率。
具体与“活催化单元”结合时，重要的是要注意：基体是生物相容性的，灭菌方便，为细胞提供良好的粘附基底，并且允许以保护细胞的方式进行固定化过程。而且，基体必须适应不同细胞培养物或细胞的需要。在这点上，孔尺寸和基体组成起着重要作用。已经有一些固定细胞培养物或细胞的方法。
例如，德国专利ED 693 11 134描述了具有固定化乳酸菌的生物反应器，其中细菌被施加到多孔基体。基体由多个疏松结合的微颗粒或微纤维基质构成。优选纤维素或人造纤维及其衍生物。优选用聚苯乙烯来实施附聚。
国际专利WO 01/19972描述了一种固定化方法，其中细胞培养物与聚合物前体结合并通过随后聚合物的交联而固定。
如在国际专利WO 94/10095中所描述，细胞培养物还可以被固定在开孔“矿物”蓬松材料上。实例包括膨胀粘土、膨胀页岩、熔岩、浮岩、珍珠岩和砖屑。
另外，国际专利WO 00/06711描述了细胞培养物和酶在作为基体材料的硅藻土上的固定。
欧洲专利1270533描述了与颗粒和圆盘形式的无定形聚合阴离子晶间相混合的结晶陶瓷氧化物的用途。
上述方法具有一定缺点。这些基体基质不能够以任何期望的方式来修饰，或者基体材料具有较低的生物相容性，或固定化涉及高损失。
例如，通过交联聚合物前体/细胞混合物将细胞培养物固定在聚合物基质中通常导致聚合物反应期间许多细胞培养物死亡，这是由于毒性反应产物或离析物例如交联剂所造成。此外，交联聚合物通常是可溶胀的，因此不具有尺寸的稳定性，并引起流动条件的变化，从而在细胞中产生机械应力。
本发明的目的是提供高生物相容性、柔性的可用基体。该基体可以适应以目标方式固定存活(活)和/或可繁殖(能够增殖)的生物材料的具体应用。此外，本发明的另一个目的是提供利用上述基体的细胞培养方法。该方法优选适用于实验室规模和/或工业规模。
发明内容
上述问题通过独立权利要求的特征解决。优选实施方案来自于从属权利要求中特征的组合。
在最一般性的方面中，本发明描述了用于固定进行化学和/或生物反应的生物材料的多孔碳基体的用途。为此描述了利用载有生物材料的多孔载体/基体材料的细胞培养方法。通过本发明还可以获得装载生物材料的适当碳基载体/基体。
根据本发明的问题解决方案包括在有序的碳填充物上培养细胞培养物的方法，有利的是流体以目标流动方式流过所述碳填充物时，具有负载比压降(load specificpressure drop)。本发明基体的有序碳填充物一方面为细胞培养物的营养产生了具有最高表面积/体积比率的均匀流动条件，另一方面还有利地实现了细胞培养物和介质的隔离。基体优选在相互叠置的材料层之间或者其各个部分之间具有通道结构。通过改变流道直径和通道壁厚和/或材料层厚度，可以以根据本发明的灵活方式为每一种应用确立基体中的最优条件。例如可以通过下列方法确立流量比：在流动方向上改变通道几何形状(例如波纹通道)，改变直径和改变碳表面的表面特性例如膜特性、粗糙度、孔隙率、亲水性、疏水性、亲油性、疏油性、pH、用活性成分和/或催化剂浸渍等，以将它们调节至所需的培养条件。
因此在本发明基体材料的两层之间或其各部分之间的中间区内和/或流通道内保证了限定的均匀供应条件以及基体材料的基体条件，使得细胞培养物在很高细胞密度下总能建立它们的最佳生长条件。本发明基体还可以容易地安装在壳体或容器中，并以单个或几个组合在一起的筒(cartridges)的形式在细胞培养和繁殖方法的工业反应器和实验室规模的反应器中使用。根据本发明，因而保证了以相同方法生产的每一个筒的流动和基体条件完全可重复，这代表对例如药品部门中的批准过程的巨大简化。
在本文的发明方法中可以通过下列几种方式来完成本发明基体和容易固定在其上的细胞培养物与介质之间的相互作用：
-利用介质的运动使介质流过基体/筒(例如利用活塞、压力、泵等)，
-基体/筒在介质中运动，
-基体/筒运动的同时，介质穿过对应管线(lines)(例如通过液压)。
由于碳的高化学和物理稳定性，用本领域技术人员熟悉的常规灭菌方法来对本发明基体进行灭菌毫无问题。由于细胞在基体碳表面上快速且以粘着和/或粘附方式形成群落，并因而在形成间隔的意义上所述细胞基本与环境介质隔离，因此这允许例如细胞培养物最优生长。这使得可以利用均匀和可控的营养供应以及改善的代谢物处理和细胞培养产物收获来实现极高的细胞密度。
根据工艺特征，本发明因此涉及包括下列步骤的培养细胞的方法：
a)提供具有层叠结构的碳基载体/基体，其包含：
i)至少两个多孔材料层，所述多孔材料层基本相互叠置并且在所述层间存在能够流通的空隙；或者
ii)至少一个多孔材料层，该多孔材料层在保持其形状的同时自身卷起或者排列成在材料层的至少两个相互叠置部分之间存在能够流通的空隙；和
b)用活的和/或能增殖的生物材料装填载体；
c)使该负载的载体与流体介质接触。
关于产物，本发明的上述问题的解决方案涉及具有层叠结构的多孔碳基载体/基体，其包含
i)至少两个多孔材料层，所述多孔材料层基本相互叠置并且在所述层间存在能够流通的空隙；或者
ii)至少一个多孔材料层，该多孔材料层在保持其形状的同时自身卷起或者排列成在材料层的至少两个相互叠置部分之间存在能够流通的空隙；
包含活和/或能够增殖的固定化生物材料。
附图说明
图1示意性表示具有层叠结构的本发明基体的实施方案。
图2示意性表示具有圆形对向流动区域(oncoming flow area)的本发明圆柱形基体的实施方案。
图3示意性表示根据优选实施方案的用于实施本发明细胞培养方法的装置。
图4示意性表示根据替代优选实施方案的用于实施本发明细胞培养方法的另一装置。
图1表示具有层叠结构的本发明载体/基体的实施方案。透视图1A中所示的基体1包含多个相互叠置的交替材料层2、3，其中第一材料层2被粘附在具有任选结构的，例如波纹或折叠的材料层3上，材料层3设置在第一材料层2上使得在材料层2和3之间形成空隙，该空隙包含多个流体能够平行流过的通道4。对于最简单的空隙，图1A的基体可以设想成波纹形纸板组(cardboard stack)。如果具有结构的材料层交替排列成相互具有例如90°的角度偏差，则得到如图1B中所示的基体，流体可以在通道4、4’中的交叉图案中流过该基体。这种基体基本上在其端面开口，并且由于波纹结构层交叉排列，使得这种基体具有两个可能的相互偏置的流通方向。作为结构材料层的替代实施方案，根据本发明也可以将两个或更多基本平坦的材料层2、3相互叠置，如图1C中所示，其中这些材料层中的两个通过隔离元件5连接到一起，从而在材料层2、3中间提供多个流体流经的通道4。
图2表示本发明载体/基体的另一实施方案。图2A中圆柱形基体的顶视图表示以螺旋形状卷起的波纹材料层7。这种卷绕产生大量的面积，通过这种卷绕材料层7上的另一部分8’在接下来的卷绕中置于材料层的部分8上，使得在部分8和8’之间存在中间通道9。如图2B所示，基体6具有圆柱结构，这是由于卷绕或卷起具有波纹结构的平片而获得。相应基体可以被卷起，例如通过将波纹纸板卷起以形成圆柱状成型体。通过使所得相应波纹纸板材料碳化，而形成具有多个通道9的圆柱状成型体6，流体沿该圆柱体的高度方向流过这些通道。这得到具有圆形端面的圆柱形基体7，流体可以基本单向流过该圆形端面(图2A)。
图3表示用于实施根据本发明细胞培养方法的装置和/或反应器10的优选实施方案的示意图。例如图2中所示圆柱体或图1中所示块状的载体/基体11置于适当的支架12上，例如反应器容器13中的带孔板。这种反应器容器13经平衡管线14连接到平衡和储存容器15，该容器15含有流体介质16例如培养基。反应器容器13可以利用适当的装置17而相对于平衡容器15上下移动。在反应器容器13向下运动时，介质16流出平衡容器15、经过管线14进入反应器容器13，使得基体11完全或部分浸没在培养基中，这取决于反应器容器13相对于储存容器15中流体液面的垂直定位。通过反应器容器13规则地上下移动，基体11循环地浸入培养基16中，使得介质16流过基体11。可以任选地将反应器容器13气密密封并且可以任选地用惰性气体填充反应器容器13中介质上方的气体空间，其中可以任选地提供压力平衡装置。通过上下移动反应器容器，介质16移入到基体11的流道中从而能够为微生物或细胞或细胞组织均匀提供水分、营养等。同时，由固定在基体11上的微生物、细胞或其它生物材料产生的代谢物可以由介质16从基体11中带走。这些代谢物积累在介质16中并可以通过抽提或类似分离方法连续或不连续地经平衡管线14或储存容器15从介质16中除去。
图4表示用于实施利用交替压力原理工作的本发明细胞培养方法的装置的另一实施方案。例如图2中所示基体的圆柱体部分形式或图1中所示块状的本发明载体/基体22置于具有两个相互叠置的腔室20、21的反应器容器19中。该基体22具有径向钻孔，通过该孔利用压差输入23可以将压缩空气引入到位于下反应器腔室20中的置换空间24中。反应器容器19的两个腔室20、21通过可渗透的反应器隔离物25相互隔离，隔离物25可以是例如带孔的底，基体22置于其上。对于反应器的运行，下反应器腔室20充满流体介质26例如微生物或细胞的液体培养基，使得液体液面保持低于反应器隔离物25。如果经过压差输入23将压缩空气引入置换室24，然后根据浸没式罩原理(immersion bell principle)，部分液体培养基26被置换到下反应器腔室20中并被迫向上通过反应器隔离物25，使得基体22接触液体培养基26。上反应器腔室中存在的过压通过上反应器腔室21中的压力平衡开口27释放。通过规则或不规则地将下反应器腔室20置于压力下然后经过压差输入23将压力释放至置换空间24中，用液体培养基26淹没基体22。在此过程中，基体22可以完全或部分浸入培养基26中。
具体实施方式
载体/基体
当用作细胞培养物或细胞载体/基体材料时，本发明的碳基载体/基体具有优异的生物相容性；它们没有有毒排放物，具有尺寸稳定性并且根据它们的设计例如孔尺寸、内部结构和外部形状而用途极为广泛。
此外，本发明的多孔体容易灭菌并通常为微生物、细胞培养物和细胞以及活/或能增殖生物材料提供良好的粘附性基体。由于这些特性，可以调整这些碳基多孔体以符合各种应用的要求。多孔基体优选主要由无定形和/或热解和/或玻璃状的碳构成，所述碳优选选自活性碳、烧结活性碳、无定形、结晶或部分结晶碳、石墨、热解碳材料、碳纤维、或金属或非金属的碳化物、碳氮化物、碳氧化物或氧碳氮化物(oxycarbonitride)及其混合物或者类似的碳基材料。本发明的多孔碳基载体/基体尤其优选基本由碳构成的热解材料。
任选但尤其优选通过原料的热解/碳化来生产载体/基体，所述原料在无氧气氛中高温转化成上述的碳基材料。用于本发明基体的碳化的适当原料包括例如聚合物、聚合物膜、纸、浸渍或涂覆的纸、纺织物、无纺织物、涂层陶瓷盘(coated ceramic disks)、棉絮、棉签、棉球、纤维素材料、或诸如豌豆(peas)、小扁豆(lentils)、菜豆(beans)等豆类(legumes)、以及坚果、干果等、以及基于这些材料生产的生坯。
用于本发明内容中的术语“碳基”理解为具有超过1重量％碳含量(在用金属改性之前)的所有材料，特别是超过50重量％，优选超过60重量％，尤其优选超过70重量％，例如超过80重量％并且特别是超过90重量％。在具体优选实施方案中，本发明的碳基载体/基体具有95-100重量％的碳含量，特别是95-99重量％。
优选载体/基体具有多个相互叠置的材料层，每一层均形成流体能够流过的空隙。优选每一个空隙均包括通道类结构，例如基本平行、交叉或网状排列的多个通道。由于在基体材料层上提供的多个隔离元件，使得通道类结构可以相互间隔一定的距离排列，这样保证了一定的间距。通道即通道类结构优选具有约一纳米到约一米的平均通道直径，特别是约一纳米到约十厘米，优选十纳米到十毫米并最优选五十纳米到一毫米。两个邻接材料层之间的距离将具有基本相等的尺寸。
本发明载体/基体尤其优选涉及成以下方式：第一材料层和第二材料层之间的通道和所述第二材料层和第三材料层之间的邻接层中的通道基本排列在相同方向上，使得基体整体上具有在优选方向上流体能够流过的通道层。作为替代方案，基体也可以设计成以下方式：第一材料层和第二材料层之间的通道相对于所述第二材料层和第三材料层之间的邻接层中的通道排列成具有大于0°小于90°、优选30°-90°，尤其优选45°-90°角度的偏置，使得基体具有以一定角度相互交替偏置的通道层。
本发明基体中的通道或通道类结构基本在通道两端开口，使得本发明的载体整体具有夹层结构，即，多孔材料层和空隙交替的层叠设计，优选它们之间的流体能够流过的通道层。根据本发明，通道即通道类结构可以在沿它们的纵向线型延伸，或者它们可以具有波纹、曲折或锯齿花纹并可以在两个材料层之间的空隙内相互平行或交叉延伸。
可以根据具体预定应用来选择并且修改本发明载体/基体的外形和尺寸。载体/基体可以具有选自下列形状的外形：例如细长形如圆柱形、多边形柱状例如三角柱状或条状，或者可以是片状或多边形，例如正方形、立方形、四面体、锥体、八面体、十二面体、二十面体、菱面体、棱柱形、或球形、中空球或圆柱形、透镜状、或盘状或环状。
对于预定的应用，可以以适当方式将根据本发明的基体形成为所需要的尺寸，例如形成体积为1mm3-1m3的载体/基体，优选体积为10cm3-1m3。在需要的情况下，还可以形成更大尺寸的基体或者甚至还可以形成更小微型尺寸的基体。本发明并不限于某些尺寸的基体。基体可以具有的最长外尺寸为约1nm-1000m，优选约0.5cm-50m，尤其优选约1cm-5m。
为此，例如可以将波纹材料层以螺旋方式卷成圆柱体。这种基体设计成：将任选波纹、压花(embossed)或其它结构的材料层在保持其形状的同时螺旋排列，使得在材料层的至少两个相互叠置的部分之间形成能够让流体流过的中间区，优选具有多个通道类结构或通道。
通过卷起可以将相互叠置的几个材料层成形为圆柱形载体。
本发明的多孔材料层和/或通道壁或本发明载体/基体材料层之间隔离元件的平均孔径为约1nm-10cm，优选10nm-10mm，尤其优选50nm-1mm。多孔材料层任选是半透性的并且通常具有3埃-10cm、优选1nm-100μm，最优选10nm-10μm的厚度。任选为半透性的多孔材料层的平均孔径是0.1埃-1mm，优选1埃-100μm，最优选3埃-10μm。
在本发明载体/基体的优选实施方案中，在载体/基体材料层的一面或两面形成结构，优选在两面。材料层的优选结构由压花槽纹(embossed groove patterns)或以其它方式引入的槽或通道状沟(recesses)的花纹组成，所述槽或通道状沟相互基本等距离排列在材料层的整个表面上。槽纹可以与材料层的外边缘平行，或可以相对于外边缘以任意的角度排列，或者可以具有锯齿花纹或波纹。此外，如果在两面形成结构，则材料层可在两面具有相同的槽纹，或具有不同的槽纹。对于所构建的多孔材料层，优选在其两面均匀互补，即在材料层一面上的槽沟对应于材料层另一面轮廓的相应隆起。载体中的材料层优选排列成两个相邻材料层的槽纹相互基本平行。
另外，材料层可以排列如下：两个相邻材料层的槽纹以一定的角度相交，使得当材料层相互叠置时，在相邻材料层槽结构的交叉隆起边缘的点处产生多个接触点。由于对应于相交槽纹的接触点的许多点的连接，从而得到具有显著增加的机械稳定性的基体。具体地，以下列方式选择槽纹：当两个材料层相互叠置时，在两个相邻的材料层之间的中间区产生通道或网络结构，该通道或网络结构对应于多个通道或管，并且在载体/基体中保证适当的流阻。本领域技术人员将知道如何适当选择槽纹并使其形成所需的尺寸。在根据本发明载体/基体中，压纹材料层中常规槽结构在中间空隙中导致了通道状或管状结构，可以调整该通道状或管状结构的截面积以适应各个预定的应用。
作为槽或通道压纹的替代方案，也可以将材料层预形成为波纹，或将它们摺状折叠。当相互平坦叠置几个这种材料层时，得到从载体/基体的端面看时的蜂巢结构，该结构作为通道结构在材料层平面方向上延伸。当这种预形成的材料层被卷起时，产生圆柱形基体，该基体截面具有沿圆柱体纵向延伸的多个螺旋式排列的通道。这种圆柱体/盘基本在两端面截面区上是开口的。
另外，还可以在材料层之间交替或另外提供和/或引入隔离元件。对应的隔离元件用于在材料层之间保证足够大的空隙，通道在其中延伸，并且这保证了模块具有适当低的流阻。对应的隔离元件可以是中间层、网络结构形式的多孔、开孔片材料，或者是在材料层中心或边缘排列的隔板(spacers)，这在材料层之间保证了一定的最小距离。
本发明的载体/基体具有中间层或通道或通道层，这些中间层或通道或通道层在通道或层两端基本是开口的。本发明基体在材料层的末端或边缘或者在通道的进口或出口处对流体是未密封或封闭的。
尤其优选通过下列方式来保证材料层相互之间的间隔：由于适当形成所需尺寸的槽压纹、折叠或波纹和以一定角度交叉的两个邻接材料层的槽纹、折叠纹或波纹，因此在结构的交叉隆起边缘的点处得到邻接材料层之间的多个接触点。这保证沿着材料层中的沟道形成多个通道类结构形式的空隙。同样，这还可以通过不同宽度材料层的交替折叠或波纹来实现。
而且，也可以以一定的间隔排列材料层，使得在材料层上交替提供具有不同深度的槽压纹或折叠或波纹，这导致了各个槽边缘隆起不同高度，因此，与可利用的槽边缘的总数量相比，以适当方式从整体上减少了在槽结构、波纹结构或折叠结构的相交边缘点处邻接材料层之间的接触点数量。通过在这些点处连接材料层，保证了载体/基体的足够强度并且保证了良好的流阻。
尤其优选的是，模块结构被用作多孔载体/基体，通过基于纤维、纸、织物或聚合物材料的任选构造、压纹、预处理和折叠的片材料的碳化来生产该结构。根据本发明的载体/基体由碳基材料成，并且任选对应于通过含碳原材料热解制得的碳复合材料，并且基本为一种碳陶瓷和/或碳基陶瓷。例如可以通过在高温下热解或碳化纸状原材料来生产这种材料。相应的生产方法、尤其是碳复合材料的生产方法在国际专利申请WO 01/80981中有描述，具体在其中的第14页第10行到第18页第14行，并且该方法可应用于本申请中。还可以根据国际专利申请WO 02/32588中所述的方法来生产根据本发明的碳基基体，具体在其中的第6页第5行到第24页第9行。通过引用将这些国际专利申请的公开内容全部并入本文。
如在德国专利ED 103 22 182中所描述，通过适当预制的聚合物膜或三维排列或折叠的聚合物膜组(packet)的热解，也可以获得根据本发明的载体，通过引用将ED 103 22 182所公开的内容全部并入本文。
根据在上述专利申请中描述的热解方法，根据本发明载体/基体的特别优选实施方案也可以通过波纹纸板的碳化来具体生产，在碳化前以适当的方式将波纹纸板层相互叠置固定，由此产生流体可流过的开口载体。
另外，还通过下列方式来生产圆柱形优选载体：根据前述现有技术的方法卷起或卷绕纸或聚合物层或纸或聚合物组以形成平行或交叉流动排列的圆柱体、管或杆状物并随后将其热解。在最简单的情况中，这些“卷绕体”包括槽形、压纹、折叠或波纹状多孔材料层，通过将这种片状前体卷起从而将所述多孔材料层卷绕成圆柱体，并在卷起后碳化。所得到的圆柱形载体/基体包含在截面上以螺旋或蜗牛状形式卷起的多孔材料层，在载体/基体的绕组(windings)之间，空隙或通道基本在圆柱体高度方向上延伸，空隙或通道的横截面用作具有最低流阻的对向流动区域。同样，相互叠置的两个或多个材料层前体可以被卷起并随后碳化以形成载体/基体。另外，尤其优选相互交替叠置的至少两个材料层，一个是波纹层，另一个基本平坦(覆盖层)；这防止在卷起形成圆柱体时发生的波纹和/或槽逐渐相互滑入，因而形成通道状结构的之间空隙保持通畅。下文实施例1描述了这种圆柱形成型部件。
根据本发明的载体/基体可以任选改性以适应预定应用的物理和/或化学-生物特性。碳基材料基本上是高度生物相容性物质，这些物质形成用于细胞、微生物或组织的理想基体。可以在本发明基体内和/或外表面上进行改性以使其至少部分亲水、疏水、亲油或疏油，其方法是例如通过用氟化物处理、用聚对二甲苯处理(parylenation)、通过用促进微生物生长的物质、培养基、聚合物等涂覆或浸渍所述载体/基体。
尤其优选用选自有机和无机物质或化合物的其它物质来改性载体/基体的特性。优选的物质是铁、钴、铜、锌、锰、钾、镁、钙、硫或磷的化合物。可以利用这些附加化合物的掺入来促进基体上某些微生物或细胞的生长。而且，用烃类、脂类、嘌呤、pyromidine、嘧啶、维生素、蛋白质、生长因子、氨基酸和/或硫源或氮源浸渍或涂覆载体/基体也适合促进生长。另外，下列物质可用于促进细胞生长：双膦酸盐(例如利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、ibandronates、唑来瞵酸、氯膦酸、依替膦酸、阿仑磷酸、替鲁膦酸)、氟化物(例如氟代膦酸二钠、氟化钠)；降钙素、dihydrotachystyrene以及所有生长因子和细胞因子(表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子b(TGF-b)、转化生长因子a(TGF-a)、红细胞生成素(Epo)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、肿瘤坏死因子-b(TNF-b)、干扰素-g(INF-g)、单核细胞趋化蛋白、成纤维细胞刺激因子-1、组胺、纤维蛋白或纤维蛋白原、内皮素-1、血管紧张素II、胶原、溴隐亭、二甲麦角新碱、氨甲蝶呤、四氯化碳、硫代乙酰胺、乙醇)。
例如通过下列方法可以使载体/基体中流动条件适应例如所需的培养条件：改变流动方向上的通道几何形状(例如波纹通道)，改变直径和任选改变碳表面的表面特性例如膜特性、粗糙度、空隙率、亲水性、疏水性、亲油性、疏油性、pH，用活性成分和/或催化剂浸渍等。
装载和细胞培养
通过根据本发明的方法，载体/基体载有活和/或可增殖生物材料。生物材料优选包括单细胞或多细胞微生物、真菌、孢子、病毒、植物细胞、细胞培养物或组织、或动物或人细胞、细胞培养物或组织，或其混合物。装载优选导致生物材料的大量固定。
尤其优选使用组织形成或非组织形成的哺乳动物细胞、藻类、细菌来进行装载，具体为遗传修饰的生产活性成分的细菌，原代细胞(primary cell)培养物例如真核组织，比如骨、软骨、肝脏、肾脏以及异种、异源、同源或自体细胞和细胞类型，以及任选遗传修饰细胞系和尤其是神经组织。
通过常规方法可以将生物方法应用于载体/基体。实例包括将载体/基体浸入到细胞材料的溶液或悬液中、用细胞材料溶液或悬液喷射载体/基体、用流体介质灌输使之接触载体/基体等。装载后任选所需的孵育时间以使固定化生物材料完全渗透载体/基体。
碳基基体尤其适合于固定和繁殖所有类型的微生物和组织培养物，特别是细胞组织。在这些过程中，微生物和/或细胞培养物在基体上形成集群并且可通过流通的中间层和/或中间层中的流道为微生物和/或细胞培养物提供液体或气体营养，同时可以使液体流过载体/基体从而轻易地将代谢物移除。此外，主要固定在载体/基体上的微生物和细胞可得到保护以免被排出和免受可能有害环境例如机械应力的影响。
而且，根据本发明还可将几个具有不同微生物、细胞培养物或组织培养物的基体浸入含有诸如反应介质和任选离析物的反应混合物中，并因此允许反应介质通过它们而不导致基本固定在基体上的微生物、细胞或组织培养物混合。
相应载体/基体任选地安装在适当的壳体中以形成载有不同微生物或任选不同细胞培养物的筒(cartridge)系统，该载体/基体可以浸入单培养基中用于再生或活性成分生产并且可以作为单个筒用于收获并为此打开，或者可以连续地移去产物，在一定时间后从培养基中移去。基体或含有基体的壳体和/或筒可任选地设计成使得它们必须被破坏以释放活性成分或它们可以通过可逆过程打开或封闭。优选将筒设计成可逆性开启和封闭。
根据本发明，载体/基体可以任选地置于适当壳体中，或置于适当的容器中或容器上，所述容器选自化学反应器或生物反应器，例如烧瓶、瓶、特别是细胞培养瓶、滚瓶、转瓶、培养管、细胞培养室、细胞培养皿、培养板、吸管帽、snap盖玻片、低温管、搅拌反应器、固定床反应器、管式反应器等。
在装载生物材料之前、期间或之后，使载体/基体与流体介质接触。装载前与装载后的流体介质可以任选是不同的介质。术语“流体介质”包括任意流体、气体、固体或液体，例如水、有机溶剂、无机溶剂、超临界气体、常规基体气体、固体或气体物质的溶液或悬液、乳液等。介质优选选自液体或气体、溶剂、水、气体或液体或固体反应离析物和/或产物、酶、细胞和组织的液体培养基、它们的混合物等。液体培养基的实例包括例如来自Cell Concepts的RPMI1640、PFHM II、来自GIBCO的杂种瘤SFM和/或CD杂种瘤等。这些物质可以带血清或不带血清使用，比如带或不带氨基酸例如L-谷氨酰胺的胎牛血清介质。流体介质也可以与生物材料混合，例如给载体/基体接种。
通过将载体/基体或含有它的壳体或容器完全或部分浸入流体介质中可以完成接触。基体还可以固定在适当反应器中使得流体介质可以流过它们。在此一个重要的标准是所有封闭气泡可由基体材料润湿和可从基体材料中移除。在此抽空、排气和/或冲洗操作可以是必需的并且可以根据需要来使用。
在载体/基体和流体介质第一次接触后，优选随后加入生物材料，即通常的液体形式，例如作为溶液、悬液、乳液等，尤其优选加入到流体介质自身中，通常在无菌条件下进行。对于本发明的基体，通常存在对介质环境的澄清，通常澄清几个小时，常常在大约两个小时后，所述介质环境由于细胞而具有一定的不透明性。
优选载体/基体在含有生物材料的溶液、乳液或悬液中浸泡1秒-1000天的一段时间或者用它来接种，优选在无菌条件下，从而使得材料有机会扩散进入多孔体并在此形成群落。也可以通过喷射等方法实施接种。
可以移动或搅拌流体介质例如培养基从而为微生物保证最可能均匀的生命环境以及营养的供应。这可以通过上述各种方法来完成，例如通过在介质中移动载体/基体或移动介质通过载体/基体。这通常在充足的时间内来实施以允许生物材料的生长、再生或充分的代谢活动。
然后收获代谢物即增殖细胞。由于细胞和环境介质以这种方法可以轻易地相互分离，因此本文中在载体/基体表面上固定化培养是所需的简化。细胞良好附着在载体/基体并在洗掉介质后可以通过适当方法移除，任选用适当方法清洗介质。
收获代谢产物后，例如通过从介质中提取，如果希望或需要，载体/基体可以净化、灭菌和重新用于相同或不同生物材料的再装载。对于随后负载基体的再利用，也可以利用冷藏将它们与生物材料一起保存。
生物反应器
优选用一个(或多个)基体来实施本发明方法，在装载生物材料之前或之后将该基体引入到适当的壳体、容器或反应器或反应器系统中。优选通过至少部分填充壳体、容器或反应器和/或反应器系统使基体与壳体、容器或反应器和/或反应器系统中的介质接触。
在一个实施方案中优选以下列方式发生与介质的接触：使得基体连续或不连续地随壳体、容器或反应器和/或反应器系统中的介质一起运动。为此，容器通常连接到经进料装置而充满介质的储存容器，如果需要，提供附加移除装置以将介质连续或不连续地运入并通过容器。作为替代方案，也可以利用壳体、容器或反应器和/或反应器系统中的适当装置来移动载体/基体，利用适当装置用流体介质部分或完全填充所述壳体、容器或反应器和/或反应器系统。
此外，载体/基体可以连续或不连续、任选完全或部分浸入壳体、容器或反应器和/或反应器系统中使得流体介质可以流过它。为此，可以通过在介质中移动载体/基体来完成流体介质流过载体/基体。作为替代方案，可以通过使介质在载体/基体中移动来完成流体介质流过载体/基体，例如利用适当搅拌器装置、泵系统、气动介质升高装置(pneumatic medium lifting device)等。用生物材料装载载体/基体后，优选加入营养和/或优选随着生物材料一起连续或不连续地去除代谢产物。
在根据本发明的方法中，用对应于预定应用的适量生物材料装载和/或接种载体/基体。优选装载和/或接种材料的方式是使得载体/基体含有10-5重量％-99重量％、优选10-2重量％-80重量％、至少优选1重量％-50重量％的细胞，基于装载后的载体/基体总重量。相对于其单独重量，载体/基体尤其优选含有多达106倍的细胞培养物，并且具有1-1023个细胞/ml载体/基体体积的细胞密度。
本发明方法特别适合培养和任选再生神经组织。在此特别有利的是，由于可以调整基体的导电性以及施加脉冲电流，本发明的碳基基体特别能适应和适合培养神经组织。
根据本发明，基体可以用于在常规反应器系统中培养，例如没有连续控制技术的被动系统，例如组织培养板、组织培养瓶、滚瓶，以及具有供气和参数(酸度、温度)自动调节的主动系统，即在最广泛意义上的具有测控技术的反应器系统。
此外，通过提供适当设备，本发明的输送体还可以用作反应器系统，例如用于灌注培养基和气体交换的连接，具体还包括对应系列反应器系统和组织培养物的模块设计。
根据本发明，优选用包含至少一个上述载体/基体的反应器和/或反应器系统来实施细胞培养方法，由此该反应器和/或反应器系统选自烧瓶、瓶、特别是细胞培养瓶、滚瓶、转瓶、培养管、细胞培养室、细胞培养皿、培养皿、低温管、搅拌反应器、固定床反应器、管式反应器。尤其优选包含本发明载体/基体的滚瓶或在壳体中包含本发明载体/基体的筒。
另外，还可以适当修饰本发明基体以促进器官发生，例如用蛋白聚糖、胶原、组织盐例如羟基磷灰石等来修饰，具体可用上述生物可降解和/或可吸收的聚合物来修饰。还优选通过浸渍和/或吸附生长因子、细胞因子、干扰素和/或粘附因子来修饰本发明基体。适当的生长因子的实例包括PDGF、EGF、TGF-α、GFG、NGF、红细胞生成素、TGF-β、IGF-I和IGF-II。适当细胞因子包括例如IL-1-α和-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13。适当干扰素包括例如INF-α和INF-β、INF-γ。适合的粘附因子实例是纤连蛋白、层粘素、玻璃粘连蛋白、胎球蛋白、聚-D-赖氨酸等。
本发明载体/基体的细胞密度可以是1-1023个细胞/ml体积，在具体反应器体积中，优选多达102，优选105，尤其多达109细胞/ml。
反应器和/或反应器系统可用连续或间歇式运行。本发明载体/基体可以在这些系统中具有半透性隔离层。没有半透性隔离层的基体可安装在反应器中的容器中，优选含有半透性隔离层。在这种情况下，容器优选设计成使得通过半透性隔离层控制反应器中流体介质与容器内部之间的质量交换。半透性隔离层可以具有与接触多孔载体/基体外表面的半透性隔离层一样的隔离性能。
对于具有半透性隔离层或在具有半透性隔离层的容器中基体的用途，搅拌容器反应器优选间歇式运行，其中半透性隔离层仅允许离析物和反应介质的质量交换，同样，对于没有任何隔离层的本发明基体也如此。这些搅拌容器反应器通常装备搅拌器并任选地装备连续离析物加入器。基体任选地浸入容器内部的流体介质中，该容器任选地含有半透性分隔层。如果使用相对较小的载体/基体，当浸入介质中时优选将它们安置在容器或壳体中。容器允许任选地经过半透性分隔层与介质接触，但是防止基体的不受控分布于反应器中。
反应空间中的流优选是湍流并且层流边界膜优选尽可能薄。良好的对流对于保持梯度是必需的。必须一直提供足够量的离析物。本领域技术人员将理解，那些产生充分和良好对流的方法可适用于本发明。
本领域技术人员将理解，由于扩散路径的减少，随着湍流的增加(增加Re数)质量传递变得更快。扩散路径越短和浓度梯度越大，则在内部和外部空间之间的质量传递越快。本领域技术人员将理解，最大反应速度是由质量传递决定而不是由反应速率决定，因此转化速率直接取决于质量传递。仅在特殊的情况下，反应速率本身比质量传递更慢，因此反应速率受实际反应的限制而不受质量传递的限制。
作为替代方案，可以利用连续加工处理。连续加工处理的优点在于可以连续或不连续地向离析物供应流体介质并且产物可以连续或不连续地收回。对于该实施方案，优选没有半透性分隔层的载体/基体。作为含有半透性分隔层基体的替代方案，将不具有半透性分隔层的基体固定在容器或壳体中，然后引入到含有半透性分隔层的容器中。优选的反应器包括连续运行的搅拌容器反应器、管式反应器和任选流化床反应器。
反应器保留时间根据反应而变化并取决于反应速率。本领域技术人员将根据具体反应来调整保留时间。离析物流优选可以再循环，提供适当的测量和控制装置以控制例如介质中的温度、pH值、营养浓度或离析物浓度。产物可以连续或非连续地从循环流移除。
根据本发明的载体/基体可以牢固地锚定在搅拌容器或管式反应器中或者松散地漂浮在介质中，或者位于浸没在反应介质的容器或箱中。如果载体/基体自由漂浮在介质中，则必须在反应器出口提供装置以保证这些载体/基体不能离开搅拌罐。例如可以将滤网安装在出口。根据本发明的载体/基体优选布置在多孔容器或壳体内以浸没在反应混合物中，任选地为所述多孔容器或壳体提供半透性分隔层。该实施方案所提供的优点还在于当搅拌容器为其它反应所需或需要更换时可容易地移除基体。
在本发明的另一个实施方案中，反应器设计为管式反应器。在该实施方案中优选使用具有细长设计的基体，特别是如实施例1所示的卷曲圆柱体。这些基体自由排列在管式反应器中或塞在容器中。在管式反应器的一端，引入离析物/反应介质混合物，同时在管式反应器的另一端，移除主要产物/反应介质混合物。当介质流过管式反应器时，介质连续流过载体/基体。本领域技术人员可以根据发生的反应来调整管式反应器的长度以及反应介质的流速及其相关的保留时间。本领域技术人员将理解，可以另外为管式反应器装配挡板从而引起湍流。对于如上说明的连续工作搅拌反应器，希望流动具有最高可能的Re数，从而使层流边界层最小化并减少扩散路径。挡板可以任选地是特定形式的多孔载体/基体。作为替代实施方案，可以引入另外的成型部件来用作挡板。
本领域技术人员将理解，除了上述基本形式的反应器，改进型反应器也可用于本发明细胞培养方法而不偏离本发明的实质。
下面基于各个优选方面的示意图来更详细地说明本发明。这并不意味着将本发明限制为一定的形式或排列。
现在基于下面实施例进一步说明本发明，这些实施例不是限制性的。
实施例
实施例1：
对于作为本发明细胞培养方法中载体/基体材料的预定应用，将每单位面积质量为100g/m2和干层厚度为110μm的含天然纤维的聚合物复合材料卷起以形成长度为150mm和直径为70mm的成型体。通过成型波纹，由大约8米长平坦材料生产具有3mm平均通道直径的径向封闭流道，随后将这种单层波纹结构横向卷起并保持这种形式。在氮气气氛下在800℃将这些成型体碳化48小时，向末端加入空气以改进多孔性。发生了61重量％的重量损失。得到的材料在水中具有7.4的pH值和具有在弱酸性范围中的缓冲区。由这种碳化材料切割成的约60mm直径和20mm厚度的圆盘具有如下特性：
1700m2/m3的表面积-体积比、0.6m2/m3自由流动横截面；由于开口结构和20mm的流通道长度，导致在试验条件下测不出水流过材料期间的可测量的压力损失。
这些圆盘被安装在根据图4的交变压力装置中，使得500ml培养基和150ml细胞悬液可在无菌条件下流过每一个圆盘。细胞悬液含有产生抗志贺菌毒素的杂交瘤FLT2MAB的细胞系，并已知在悬液中是非贴壁、非粘附性生长。
为了比较，在其它相同条件和相同进料速率和/或装载下使用没有基体和没有碳材料的对应装置。在30秒的循环中液体介质通过筒，即，使它循环，即载体/基体每30秒就被浸入液体培养基中。
带基体的样品具有自发定量固定的细胞(先前混浊上层清液在大约4小时后变清)并且没有再发现悬液的混浊。在7天的培养期内，细胞密度增加七倍直到每毫升1.8×107个细胞。平均培养寿命的MAB生产从最初50μg/ml增加到350μg/ml而没有任何蛋白水解性降解的迹象。25天后十二个样品仍全部存活，之后培养中断。这表明根据本发明的载体/基体导致接触抑制的中断，即使细胞密度较高。甚至在低温保存和解冻之后，在加入新鲜培养基后MAB生产同时恢复。
在比较实验中，6个培养物中仅一个生存到第11天。
实施例2：横向几何形状
对于作为细胞培养系统的载体/基体材料的预定应用，将每单位面积质量为100g/m2和干层厚度为110μm的含天然纤维的聚合物组合物形成长度为300mm、宽度为150mm和高度为50mm的成型体并固定这种形状。由于折叠平坦材料然后将这些单层波纹结构的每一层以90°偏置层压，从而产生具有3mm平均通道直径的径向封闭的流道。在氮气气氛下在800℃将这些成型体碳化48小时，在末端加入空气以改进多孔性。发生了61重量％的重量损失。得到的材料在水中具有7.4的pH值和具有弱酸性的缓冲区。
利用喷水切割，生产直径为35mm和厚度为40mm的这种含碳材料的圆柱形基体，其特性如下：
1700m2/m3表面积-体积比、0.6m2/m3自由流动横截面，由于开口结构和20mm的流通道长度，导致在试验条件下测不出水流过材料期间的可测量的压力损失。
这些圆盘置于辐射交联的保护性壳中并连接形成160毫米长的串(strands)。将该串中的每一个均插入常规2升滚瓶中并在无菌条件下装入500ml液体培养基和150ml细胞悬液。细胞悬液含有产生抗志贺菌毒素的杂交瘤FLT2MAB的细胞系，并已知在悬液中是非贴壁、非粘附性生长。
为了比较，在其它相同条件和装载下使用没有碳材料的对应装置。
在滚瓶装置上转动滚瓶。
带载体/基体的样品表现出自发定量固定的细胞(先前混浊上层清液在大约4小时后变清)并且没有再发现悬液的混浊。在7天的培养期内，细胞密度增加七倍直到每毫升1.8×107个细胞。平均培养寿命的MAB生产从最初50μg/ml增加到350μg/ml而没有任何蛋白水解性降解的迹象。25天后十二个样品仍全部存活，之后培养中断。这表明根据本发明的载体/基体导致接触抑制的中断，即使细胞密度较高。甚至在低温保存和解冻之后，在加入新鲜培养基后MAB生产同时恢复。
在比较实验中，6个培养物中仅一个生存到第11天。
实施例3：
对于作为细胞培养系统的载体/基体材料的预定应用，将每单位面积质量为100g/m2和干层厚度为110μm的含天然纤维的聚合物复合材料卷成长度为150mm和直径为70mm的成型体。对此，通过平坦材料的压花和随后的折叠，再将这种单层波纹结构卷起(参见实施例1)，从而得到具有3mm平均通道直径的径向封闭的S或波形流道。在氮气气氛下在800℃将这些成型体碳化48小时，向末端加入空气以改进多孔性。发生了61重量％的重量损失。产生的材料在水中具有7.4的pH值和具有弱酸性的缓冲区。
这种碳材料的约60mm直径和20mm厚度的圆盘具有如下特性：
2500m2/m3表面积-体积比，0.3m2/m3自由流动横截面，由于开口结构和20mm的流通道长度，导致在试验条件下测不出水流过材料期间的可测量的压力损失。
这些圆盘被安装在根据图3的装置中，使得500ml培养基和150ml细胞悬液在无菌条件下可以流过每一个圆盘。细胞悬液含有产生抗志贺菌毒素的杂交瘤FLT2MAB的细胞系，并已知在悬液中是非贴壁、非粘附性生长。
为了比较，在其它相同条件和相同进料速率和/或装载下使用没有基体和没有碳材料的对应装置。
在30秒的循环中液体介质通过筒，即，使它循环，即载体/基体每30秒就被浸入液体介质中。
带载体/基体的样品具有自发定量固定的细胞(先前混浊上层清液在大约4小时后变清)并且没有再发现悬液的混浊。在7天的培养期内，细胞密度增加七倍直到每毫升1.8×107个细胞。平均培养寿命的MAB生产从最初50μg/ml增加到350μg/ml而没有任何蛋白水解性降解的迹象。25天后十二个样品仍全部存活，之后培养中断。这表明根据本发明的载体/基体导致接触抑制的中断，即使细胞密度较高。甚至在低温保存和解冻之后，在加入新鲜培养基后MAB生产同时恢复。
实施例4：
碳化后将实施例1的圆盘浸渍在含有10％聚乙烯砒咯烷酮的水溶液中然后再干燥。接着将筒安装在根据实施例1的装置中并用培养基和细胞进行培养。发现筒的湿润行为被改善并且仅在两个小时后就固定了细胞(先前混浊的上层清液澄清)。
实施例5：
将实施例1的圆盘安装在根据图3的包含两个容器的装置中，所述两个容器通过底部中心的对应管线相互连接。
根据实施例1用培养基和细胞来培养这种容器系统。选择容器结构使得在静止位置时碳圆盘仍被流体覆盖。等细胞完全固定后，机械地抬升容器以及碳圆盘使得液体能够通过对应管线流入第二液体容器中并且碳圆盘不再浸入液体中。然后降低容器以回到静止位置。整个过程的循环时间是30秒。这种循环的优点在于通过升高和降低筒而消耗移动介质所需的力并因此不需要接触介质。
在7天的培养期内，细胞密度增加七倍直到每毫升1.8×107个细胞。平均培养寿命的MAB生产从最初50μg/ml增加到350μg/ml而没有任何蛋白水解性降解的迹象。25天后十二个样品仍全部存活，之后培养中断。这表明根据本发明的载体/基体导致接触抑制的中断，即使细胞密度较高。甚至在低温保存和解冻之后，在加入新鲜培养基后MAB生产同时恢复。
实施例6：
将实施例1的圆盘安装在根据图3的包含两个容器的装置中，所述两个容器通过底部中心的对应管线相互连接。
根据实施例1用培养基和细胞来培养这种容器系统。选择容器结构使得在静止位置时碳圆盘刚被流体覆盖。等细胞完全固定后，机械地降低容器以及碳圆盘使得液体能够通过对应管线流出第二液体容器中并且能够流过碳圆盘。然后升高容器以回到静止位置。整个过程的循环时间是30秒。这种循环的优点在于通过升高和/或降低筒而消耗移动介质所需的力并因此不需要接触介质。
在7天的培养期内，细胞密度增加七倍直到每毫升1.8×107个细胞。平均培养寿命的MAB生产从最初50μg/ml增加到350μg/ml而没有任何蛋白水解性降解的迹象。25天后十二个样品仍全部存活，之后培养中断。这表明根据本发明的载体/基体导致接触抑制的中断，即使细胞密度较高。甚至在低温保存和解冻之后，在加入新鲜培养基后MAB生产同时恢复。

Claims (27)

1.培养细胞的方法，包括下列步骤：
a)提供具有层叠结构的碳基载体，所述载体包含：
i)至少两个多孔材料层，所述多孔材料层基本相互叠置并且在所述层间存在能够流通的空隙；或者
ii)至少一个多孔材料层，该多孔材料层在保持其形状的同时自身卷起或者排列成在所述材料层的至少两个相互叠置部分之间存在能够流通的空隙；和
b)用活的和/或能增殖的生物材料装填载体；
c)使所述负载的载体与流体介质接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体包含多个材料层，并且在每两个相互叠置的材料层之间存在至少一个空隙。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，每两个材料层之间或一个卷起的材料层的每两个部分之间的所述空隙具有相互基本平行延伸的多个通道。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，相互基本平行排列的每个所述通道的平均通道直径为约1nm-约1m，特别是约1nm-约10cm，优选10nm-10mm，尤其优选50nm-1mm。
5.根据权利要求3或4中任意一项所述的方法，其特征在于，第一材料层和第二材料层之间的每一通道相对于所述第二材料层和第三材料层之间的邻接层中的通道以一定角度偏置排列，所述角度大于0°小于90°、优选30°-90°、尤其优选45°-90°，使得所述载体具有以一定角度相互交替偏置的通道层。
6.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所述基本平行延伸的通道在层内是线型、波状、曲折或锯齿形的。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所述多孔材料层和/或通道壁的平均孔尺寸为约1nm-1Ocm，优选10nm-10mm，尤其优选50nm-1mm。
8.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，将模块结构用作多孔载体，所述模块结构通过基于纤维、纸、织物或聚合物材料的任选结构、轧制、压纹、预处理和/或折叠的片材料的碳化来生产。
9.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所述生物材料选自单细胞或多细胞微生物、真菌、酵母、孢子、植物细胞、细胞培养物或组织或动物和/或人细胞、细胞培养物或组织，或其混合物。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，装载所述载体导致生物材料相当广泛地固定在所述载体之中和/或之上。
11.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所述介质选自液体或气体、溶剂、水、气体或液体或固体的反应离析物和/或产物、酶、细胞和组织的液体培养基、其混合物等。
12.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所述载体置于适当壳体中，或置于适当容器之中或之上，所述容器选自用于化学或生物反应的反应器，例如烧瓶、瓶特别是细胞培养瓶、滚瓶、转瓶、培养管、细胞培养室、细胞培养皿、培养板、吸管帽、snap盖玻片、低温管、搅拌反应器、固定床反应器、管式反应器等。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，通过至少部分填充所述容器使得所述载体与所述流体介质接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述载体在所述容器中的介质中移动。
15.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述容器利用进料装置连接到充满介质的供给容器，还任选地提供移除装置以使介质连续或不连续地进入并通过所述容器。
16.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，流体介质连续或者不连续地流过载体，所述载体任选浸在容器中。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，通过移动介质中的载体使流体介质流过所述载体。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，通过移动载体中的介质使流体介质流过所述载体。
19.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，连续或不连续地利用所述介质提供营养和/或利用所述介质去除代谢物。
20.前述权利要求中任意一项所述的多孔碳基载体，包含活的和/或能够增殖的固定化生物材料。
21.根据权利要求20所述的载体，其特征在于，所述生物材料选自单细胞或多细胞微生物、酵母、真菌、孢子、植物细胞、细胞培养物或组织或动物和/或人细胞、细胞培养物或组织，或其混合物。
22.根据权利要求20或21所述的载体，其由活性碳、烧结活性碳、无定形、结晶或部分结晶碳、石墨、热解含碳材料、碳纤维、或金属或非金属的碳化物、碳氮化物、碳氧化物和/或氧碳氮化物及其混合物组成。
23.根据权利要求20-22中任意一项所述的载体，其特征在于，所述载体含有10-5重量％-99重量％、优选10-2重量％-80重量％、最优选1重量％-50重量％的细胞，以负载的载体的总重量计。
24.培养细胞的反应器，包含根据权利要求20-23的一个或多个载体。
25.根据权利要求24所述的反应器，选自用于化学或生物反应的反应器，例如烧瓶、瓶特别是细胞培养瓶、滚瓶、转瓶、培养管、细胞培养室、细胞培养皿、培养板、吸管帽、snap盖玻片、低温管、搅拌反应器、固定床反应器和管式反应器。
26.转瓶，包含权利要求20-23中任意一项的载体。
27.筒，包含位于壳体中的权利要求20-26中任意一项的载体。
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