KR20060054362A - 세포 배양 및 육종 방법 - Google Patents

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예르겐 쿤스트만
안드레아스 반
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블루 멤브레인스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 실질적으로 서로 포개져서 연결되어 있고 층 사이에 유체 통로로서 작용할 수 있는 갭을 갖는 2개 이상의 다공성 물질 층으로 이루어지거나 유체 통로로서 작용할 수 있는 갭이 물질 층의 2개 이상의 포개진 부분 사이에 형성되도록, 이의 형태를 유지하면서 그 자체 위에 배열되거나 폴딩된 하나 이상의 다공성 물질로 이루어진 적층 구조를 갖는 탄소계 기질을 제조하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다, 이어서 당해 방법은 기질에 생존 및/또는 증식하는 생물학적 물질을 로딩하는 단계 및 로딩된 기질을 유체 매질과 접촉시키는 단계를 포함한다.
세포 배양 방법, 다공성 물질 층, 지지체

Description

세포 배양 및 육종 방법{CELL CULTIVATION AND BREEDING METHOD}
본 발명은 필수적으로 층 서로간의 정상부에 배열되어 있고 층 사이에 유체 통과가능한 상호 공간이 존재하는 2개 이상의 다공성 물질 층, 또는 이의 형태를 유지하면서 그 자체가 감아 올라가거나 유체 통과가능한 상호 공간이 서로 정상부에 있는 물질 층의 2개 이상의 부분 사이에 위치하는 방식으로 배열된 하나 이상의 다공성 물질 층으로 이루어진 적층 구조를 갖는 탄소계 지지체/기질을 제공하는 단계; 및 생존하고/하거나 증식할 수 있는(생존성) 생물학적 물질을 당해 지지체에 로딩하는 단계 및 로딩된 지지체를 유체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
그동안, 생물반응기 공정 기술에서, 표면적을 증가시키기 위해 기질 물질을 사용하는 것은 확립된 관행이 되었다. 과거에 유용한 시스템은 주로 과립, 솜, 웨이퍼 또는 디스크 형태, 털 모양, 그물 모양등의 무정형 구조를 사용하였고 여기서 사용되는 물질은 주로 세라믹 또는 중합체로 만들어진다. 당해 시스템은 일반적으로 고수율을 위한 압력 강하가 크고 표면적이 제한된다. 여기에서 다시 성형체의 크기에 대한 한계(압력 강하, 중량, 비용, 팩키징 변화등)로 인해, 당해 공정을 기술적으로 스케일-업 하기가 어렵다. 또한, 중합체는 사용동안에 또는 멸균 동안에 화학적 또는 물리적으로 변화하는 경향이 있다. 또한, 무정형의 팩킹이 있는 경우, 균일한 균질의 영양물 공급 및 재현가능한 충전이 항상 보장될 수 는 없다. 용기 벽에 따른 사공간(dead space) 및 바람직한 유동은 상이한 대사적 조건을 유발하여 예를 들어, 폴딩(folding)과 같은 민감성 단백질의 생성물 성질에 영향을 줄 수 있다.
산업적 규모상의 반응은 처리량이 높아야만 하고 저렴해야 한다. 세포 혼합물로부터 우수하게 대사 생성물을 분리하거나 또는 이들이 후속적으로 재활용될 수 있도록 하기 위해서는 세포 또는 세포 배양물을 고형 기질상에 고정화한다. 이것은 예를 들어, 전단 응력에 민감한 세포로부터 주변 매질을 분리시킨다. 예를 들어 막이 성형체 벽으로서 사용되는 경우 및 십자 모양이 사용되는 경우, 이것은 가스 대사 생성물을 기포 없이 연속으로 세포에 주입할 수 있게 해주고/거나 막의 한쪽 측면상에 목적하는 대사 생성물을 축적시킨다. 이것은 영양물 공급, 대사물 교환 및 공정 계수의 측정을 촉진시키고 공정을 상당히 강화시킨다. 고정화 세포 배양은 또한 연속적인 공급 및 생성물의 수거와 함께 연속적인 공정 조작을 가능하게 한다.
또한, 고정화 세포 배양물을 사용하는 방법은 세포 밀도를 높여 비교적 반응 속도를 높이고, 따라서 보다 작은 크기의 시스템이 가능하며 수율은 급격히 증가할 수 있다. 유전학적으로 변형된, 예를 들어 발효 공정을 위해 변형된 포유동물 세 포주 기원의 고정화 세포 배양을 사용하여 현탁 세포 배양 보다 높은 반응 속도를 성취한다.
특히, "생존성 촉매 단위(viable catalytic unit)"와 연계하여 기질은 생물적합성이고 용이하게 멸균될 수 있으며 세포에 대한 우수한 접착 기반을 제공하고 고정화 공정이 세포를 보호하는 방식으로 수행된다는 것을 주지한다는 것은 중요하다. 또한, 기질은 상이한 세포 배양 또는 세포의 요구에 맞게 채택되어야만 한다. 이와 관련하여, 공극 크기 및 기질 조성이 특정 역할을 한다. 이미 세포 배양물 또는 세포를 고정화하는 몇몇 방법이 존재한다.
예를 들어, 독일 특허 제 693 11 134호는 고정화된 락트산 세균을 사용하는 생물반응기를 기재하고 있고 여기서 세균은 다공성 기질에 적용된다. 기질은 다수의 느슨하게 연결된 미세입자 또는 미세섬유의 매트릭스로 이루어진다. 셀룰로스 또는 레이온 및 이의 유도체가 바람직하다. 응집작용은 바람직하게 폴리스티렌으로 수행된다.
국제 공개 공보 WO 제01/19972호는 세포 배양물이 중합체 전구체와 배합되고 후속적인 중합체의 가교결합에 의해 고정화된 고정화 방법을 기재하고 있다.
세포 배양물은 또한 국제 공개 공보 WO 제94/10095호에 기재된 바와 같은 개방 공극 "미네랄(mineral)" 대용량 물질상에 고정화될 수 있다. 이의 예는 팽창된 점토, 팽창된 혈암, 용암, 속돌, 진주암 및 벽돌 조각을 포함한다.
추가로, 국제 공개 공보 WO 제00/06711호는 기질 물질로서 규조토상에 세포 배양물 또는 효소를 고정화하는 방법을 기재하고 있다.
유럽 특허 제1270533호는 과립 및 디스크 형태로 무정형 다가음이온성 상호과립 상과 혼합된 결정 산화 세라믹의 용도를 기재하고 있다.
상기 언급된 방법은 특정 단점을 갖고 있다. 예를 들어, 기질 매트릭스는 임의의 목적하는 방식으로 변형시킬 수 없거나, 기질 물질은 생물적합성이 보다 낮거나, 고정화는 큰 손실을 유발한다.
중합체 전구체/세포 매트릭스를 가교결합시킴에 의한 중합체 매트릭스내 세포 배양물의 고정화는 흔히, 예를 들어, 가교결합제와 같은 독성 반응 생성물 또는 추출물(educt)로 인해 중합체 반응 동안에 배양된 많은 세포를 사멸시킨다. 또한, 가교결합된 중합체는 흔히 팽윤될 수 있고 따라서 부피적 안정성이 없고 유동 조건을 변화시켜 세포내 기계적 스트레스를 유발한다.
본 발명의 목적은 생존성(생존하는) 및/또는 증식가능한(증식할 수 있는) 생물학적 물질을 고정화시키기 위해 표적화된 방식으로 특정 응용에 사용될 수 있는 고도로 생물적합성인 융통성있게 사용가능한 기질을 가용하게 하는 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 언급된 기질을 사용하는 세포 배양 방법을 가용하게 하는 것이다. 당해 방법은 바람직하게 연구실 규모 및/또는 산업적 규모로 사용하기에 적합할 수 있다.
발명의 요약
상기 정의된 바와 같은 문제점은 독립항의 특성에 의해 해결된다. 바람직한 양태는 종속항에 특정된 특성의 조합으로부터 유래된다.
가장 일반적은 측면에서, 본 발명은 화학적 및/또는 생물학적 반응을 위한 생물학적 물질을 고정화하기 위한 다공성 탄소계 지지체의 용도에 관한 것이다. 생물학적 물질이 로딩된 다공성 지지체/기질 물질을 사용한 세포 배양 방법이 기재되어 있다. 생물학적 물질이 로딩된 적합한 탄소계 지지체/기질은 또한 본 발명을 통해 가용하게 된다.
본 발명에 따른 문제의 해결책은 정돈된 탄소 팩킹상에서, 유리하게 로딩 특이적 압력 강하와 함께 당해 팩킹을 통해 표적화된 유체가 유동하도록 하는, 세포 배양물을 배양하는 방법을 포함한다. 한편, 본 발명의 기질의 정돈된 팩킹은 세포 배양물에 대한 영양 공급을 목적으로 가장 높은 표면적 대 용적 비를 갖는 균일한 유동 조건을 산출하면서 또한 격막을 통해 세포 배양물과 배지를 유리하게 분리시킨다. 당해 기질은 바람직하게 서로 정상부에 또는 각각의 부분에 배열된 물질 층 사이에 채널형 구조를 갖는다. 유동 채널 직경 및 채널 벽 두께 및/또는 물질 층 두께를 다양하게 하여 각각의 응용을 위해 본 발명에 따른 유동적 방식으로 기질내 최적의 조건이 확립될 수 있다. 유동 비율은 예를 들어, 유동 방향에서 채널 구조를 다양하게 하고(예를 들어, 주름진 채널) 직경, 및 탄소 표면의 표면 성질(예를들어, 막 성질, 강도, 다공성, 친수성, 소수성, 친유성, 소유성, pH)을 다양하게 하고 활성 성분 및/또는 촉매를 함침시키는 등 이들을 요구되는 배양 조건에 맞게 조정하기 위해 설정될 수 있다.
따라서, 기질 물질의 기질 조건 뿐만 아니라 한정된 균일 공급 조건은 물질의 2개의 층 또는 이의 부분 사이에 중간 면적 내에서 및/또는 본 발명의 기질의 유동 채널내에서 보장되어 세포 배양은 항상 매우 높은 세포 밀도에서 이의 최적의 성장 조건을 유지할 수 있다. 본 발명의 기질은 또한 하우징(housing) 또는 용기(container)내에 용이하게 설치될 수 있고 이러한 형태로 독립적으로 또는 산업적 반응기 또는 연구실 규모의 반응기에서 함께 조합되어 세포 배양 및 육종 방법을 위해 카트리지로서 사용된다. 본 발명에 따라, 동일한 방식으로 제조된 각각의 카트리지에 대한 유동 및 기질 조건의 절대 재현성은 따라서 보장되고 이것은 예를 들어 약제 분야에서 의 승인 절차를 매우 단순화시킨다.
본 발명의 기질(substrate) 및 이의 위에 용이하게 고정화되는 세포 배양물과 예를 들어 배지(medium)와의 상호작용은 여러 방식으로, 예를 들어,
- 배지의 이동(예를 들어, 피스톤, 압력, 펌프등을 수단으로)에 의해 배지의 기질/카트리지를 통한 유동,
- 배지내 기질/카트리지의 이동 및
- 상응하는 라인을 통해 배지와 함께 기질/카트리지의 이동(예를 들어, 정수압에 의해)에 의해 본 발명의 방법에서 성취될 수 있다.
탄소의 높은 물리화학적 안정성 덕택으로 일반적으로 당업자에게 친숙한 통상적인 멸균 방법으로 본 발명의 기질을 멸균시키는데는 문제가 없다. 이것은 예를 들어, 세포가 기질의 탄소 표면상에 부착하여 및/또는 접착하여 신속하게 콜로니를 형성함에 따라서 필수적으로 하나의 구획을 형성하여 주변 배지와 분리될 수 있기때문에, 배양되는 세포가 최적으로 성장할 수 있게 해준다. 이것은 극히 높은 세포 밀도를 성취할 수 있도록 하여 균일하고 제어가능한 영양물 공급 및 대사물의 개선된 처분 및 배양 생성물의 수거를 가능하게 한다.
따라서, 공정 측면에 따라, 본 발명은,
a) i) 필수적으로 서로 정상부 위에 배열되고 이 사이에 유체 통과가능한 상호 공간이 존재하는 2개 이상의 다공성 물질 층, 또는
ii) 이의 형태를 유지하면서 그 자체가 감아 올라가거나 유체 통과가능한 상호 공간이 서로 정상부에 있는 물질 층의 2개의 이상의 부분 사이에 존재하는 방식으로 배열된 하나 이상의 다공성 물질 층을 포함하는 적층 구조를 갖는 탄소계 지지체/기질을 제공하는 단계;
b) 생존하고/또는 증식할 수 있는 생물학적 물질을 지지체에 로딩하는 단계; 및
c) 로딩된 지지체를 유체 매질와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
생성물에 관하여, 상기 문제점에 대한 본 발명의 해결책은,
i) 필수적으로 서로 정상부 위에 배열되고 이 사이에 유체 통과가능한 공간이 존재하는 2개 이상의 다공성 물질 층, 또는
ii) 이의 형태를 유지하면서 그 자체가 감아 올라가거나 유체 통과가능한 상호 공간이 서로 정상부에 있는 물질 층의 2개의 이상의 부분 사이에 존재하는 방식으로 배열된 하나 이상의 다공성 물질 층을 포함하는 적층 구조를 갖고 생존(생존 가능한)하고/또는 증식할 수 있는(성장 가능한) 고정화된 생물학적 물질을 포함하는 다공성 탄소계 지지체/기질을 포함하는 것이다.
도 1은 적층 구조를 갖는 본 발명의 기질의 양태를 도식적으로 나타낸다.
도 2는 환형 접근 유체 면적을 갖는 본 발명의 실린더형 기질의 양태를 도식적으로 나타낸다.
도 3은 바람직한 양태에 따른 본 발명의 세포 배양 방법을 수행하기 위한 장치를 도식적으로 나타낸다.
도 4는 또 다른 바람직한 양태에 따른 본 발명의 세포 배양 방법을 수행하기 위한 또 다른 장치를 도식적으로 나타낸다.
도 1은 적층 구조를 갖는 본 발명의 지지체/기질의 양태를 보여준다. 도 1a에서 투시도로 나타낸 기질(1)은 서로 정상부위에 배열된 물질(2, 3)의 다중 반복 층을 포함하고 제 1 물질층(2)는 임의로 구조화된, 예를 들어, 이의 위에 배열된 주름지거나 플리트(pleat)한 물질 층에 접착되어 유체가 평행하게 통과할 수 있는 다수의 채널(4)를 포함하는 물질 층(2 및 3) 사이에는 상호 공간이 형성된다. 가장 단순한 공간에서, 도 1a의 기질은 층을 이루는 주름진 마분지로서 추측될 수 있다. 구조화된 물질 층이 서로에 대해 90°각의 교차하는 오프셋으로 배열되는 경우, 그 결과는 유체가 채널(4, 4')에서 교차 패턴으로 통과할수있는 도 1b에 나타낸 것과 같은 기질이다. 당해 기질은 필수적으로 이의 말단면에서 개방되어 있고 주름진 구조층의 십자형 배열로 인해 서로에 대해 기질 오프셋을 통해 2개의 가능 한 방향을 갖는다. 구조화된 물질 층의 또 다른 층으로서, 필수적으로 2개 이상의 편평한물질층(2, 3)이 또한 도 1c에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 서로 상부위에 배열 될 수 있고 이들 2개의 층은 스페이서(5)에 의해 함께 연결되어 있어 유체가 통과하는 다수의 채널(4)가 물질층(2, 3)사이의 상호 공간내에 제공된다.
도 2는 본 발명의 지지체/기질의 또 다른 양태를 보여준다. 도 2a에서 실린더형 기질(6)의 상면도는 주름진 물질층(7)이 나선 형태로 감겨 올라감을 보여준다. 이러한 나선 형태는 물질층(7)상에서 다른 부분(8')가 다음으로 감기는 물질 층 부분(8)에 의지하여 중간 채널(9)가 부분(8 및 8')사이에 형성되도록 하는 수단으로 다수의 면적이 수득되도록 한다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 기질(6)은 주름진 구조를 갖는 편평한 쉬트가 나선형으로 상승하거나 감겨 상승한다는 사실로 인해 실린더형 구조를 갖는다. 상응하는 기질은 실린더형 몸체를 형성하도록 주름진 마분지를 감아 올림에 의해 상향으로 감길 수 있다. 수득한 주름진 마분지 물질을 탄소화하여 실린더형 몸체(6)이 형성될 수 있고 이것은 실린더 높이 방향으로 이들을 통과하는 다수의 채널(9)를 갖고 있다. 이로써 유체가 필수적으로 일방향으로 통과할 수 있는 환형 말단면을 갖는 실린더형 기질(7)이 형성된다(도 2a).
도 3은 본 발명에 따른 세포 배양 방법을 수행하기 위한 장치 및/또는 반응기(10)의 바람직한 양태에 대한 도식적 다이아그램을 보여준다. 예를 들어, 도 2에 도해된 바와 같은 실린더형 또는 도 1에 도해된 바와 같은 블록형의 지지체/기질(11)은 예를 들어, 반응 용기(13)에서 천공된 플레이트인 적합한 홀더(12)에 의지한다. 이러한 반응 용기(13)은 균등라인(14)를 통해 유체 매질(16), 예를 들어, 배지를 함유하는 균등한 저장 용기(15)에 연결되어 있다. 반응 용기(13)은 적합한 장치(17)을 수단으로 균등한 용기(15)에 대해서 상하로 이동할 수 있다. 반응 용기(13)의 하향 이동에서, 배지(16)은 라인(4)를 통해 저장 용기(15)로부터 반응 용기(13)으로 유출되어 기질(11)은 저장 용기(15)내 유체 수준에 대한 반응 용기(13)의 수직 정렬에 따라 부분적으로 또는 완전히 침지된다. 반응 용기(13)가 일정하게 상하로 이동함으로써 기질(11)은 순환식으로 배지(16)에 침지되어 기질(11)은 이를 통해 유동하는 배지(16)을 갖게된다. 반응 용기(13)은 임의로 공기밀착식으로 밀봉될 수 있고, 반응 용기(13)내 배지 위의 가스 공간은 임의로 불활성 가스로 충전될 수 있으며, 여기서, 임의의 압력 균등화 장치가 장착될 수 있다. 반응 용기를 상하로 이동시킴에 의해 배지(16)는 수분, 영양물등이 균일하게 미생물 또는 세포 또는 세포 조직으로 이동할 수 있도록 해주는 방식으로 기질(11)의 유동 채널로 이동한다. 동시에, 기질(11)상에 고정화된 미생물, 세포 또는 기타 생물학적 물질에 의해 생성되는 대사물은 배지(16)에 의해 기질(11)로부터 이동될 수 있다. 이들 대사물은 배지(16)에 축적하고 균등 라인(4) 또는 저장 용기(15)를 통해 예를 들어, 추출 또는 유사한 분리 방법에 의해 연속적으로 또는 간헐적으로 배지(16)으로부터 제거될 수 있다.
도 4는 교차 압력 원리에 의해 작동하는 본 발명의 세포 배양 방법을 수행하기 위한 장치(18)의 또 다른 양태를 나타낸다. 예를 들어, 도 2에 나타낸 바와 같은 기질의 실린더 부분 형태 또는 도 1에 나타낸 바와 같은 블록 형태의 본 발명의 지지체/기질(22)는 하나의 위에 다른 것이 배열된 2개의 챔버(20, 21)을 갖는 반응 용기(19)에 위치한다. 당해 기질(22)은 방사상 보링 구멍을 갖고 이를 통해 압축 공기가 차등 압력 투입구(23)를 통해 보다 하부의 반응 챔버(20)에 위치한 배출 공간(24)으로 도입될 수 있다. 반응 용기(19)의 2개의 챔버(20, 21)는 투과성 반응기 칸막이(25)에 의해 서로 분리되어 있고, 당해 칸막이는 천공된 기저일 수 있고 예를 들어, 이의 위에 기질(22)가 놓여있다. 반응기의 작동을 위해, 보다 하부의 반응기 챔버(20)는 유체 매질(26), 예를 들어, 미생물 또는 세포용 액체 배지로 충전되어 액체 수위가 반응기 칸막이(25) 보다 낮게 유지된다. 압축 공기가 차등 압력 투입구(23)를 통해 배출 방(24)으로 도입되는 경우, 이어서 액체 배지(26)의 일부는 침지 벨 원리에 따라 보다 하부의 반응기 챔버(20)로 배출되고 반응기 칸막이(25)를 통해 강제로 상승되어 기질(22)은 액체 배지(26)과 접촉하게 된다. 상부 반응기 챔버에 우세한 과도한 압력은 상부 반응기 챔버(21)에서 압력 균등화 개방구(27)를 통해 해제된다. 규칙적으로 또는 불규칙적으로 하부의 반응기 챔버(20)에 압력을 적용함에 이어서 차등 압력 투입구(23)를 통해 배출 공간(24)로 압력을 해제함에 의해 기질(22)를 액체 배지(26)과 접촉시킨다. 이로써 기질(22)은 완전히 또는 부분적으로 배지(26)로 침지될 수 있다.
발명의 상세한 설명
지지체/기질
본 발명의 탄소계 지지체/기질(carbon-based supporting body)은 세포 배양 또는 세포에 대한 지지체/기질 물질로서 사용되는 경우 생물적합성이 우수하고, 이 들은 독성 방출이 없으며, 입체적 안정성을 갖고, 공극 크기, 내부 구조 및 외형과 같은 이의 디자인 측면에서 매우 다재다능하다.
또한, 본 발명의 다공성 몸체는 용이하게 멸균화되고 일반적으로 생존하고/하거나 증식할 수 있는 생물학적 물질 뿐만 아니라 미생물, 세포 배양 및 세포에 대한 우수한 접착 기질을 제공한다. 이러한 특성들 때문에, 탄소 기반의 이들 다공성 몸체는 가공되어 다양한 응용에 따른 요구조건을 충족시킬 수 있다. 다공성 기질은 바람직하게 주로 무정형 및/또는 열분해 및/또는 유리질 탄소로 이루어져 있고 바람직하게 활성탄, 소결된 활성탄, 무정형 결정 또는 부분적인 결정 탄소, 흑연, 열분해 탄소성 물질, 탄소 섬유 또는 카바이드, 탄질화물, 금속 또는 비금속의 옥시탄화물 또는 옥사탄질화물 뿐만 아니라 이의 혼합물 또는 유사한 탄소계 물질로부터 선택된다. 본 발명의 다공성 지지체/기질은 특히 바람직하게, 필수적으로 탄소로 이루어진 열분해 물질이다.
지지체/기질은 특히, 임의로 바람직하게는 무산소 대기의 고온하에 상기 언급된 탄소계 물질로 전환되는 출발 물질의 열분해/탄소화에 의해 제조된다. 본 발명의 기질의 탄소화를 위해 적합한 출발 물질은 예를 들어, 중합체, 중합체 필름, 종이, 침지되거나 피복된 종이, 직물, 부직포, 피복된 세라믹 디스크, 면화 탄 솜, 탄 솜 막대, 탄 솜 펠렛, 셀룰로스 물질 또는 예를 들어, 땅콩, 렌즈콩(lentile), 콩등과 같은 콩과류 또는 견과류, 무수 과일등 뿐만 아니라 이들 물질을 기초로 제조된 그린웨어(greenware)를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 용어 "탄소계(carbon-based)"는 탄소 함량(금 속으로 임의로 변형시키기 전에)이 1중량% 이상, 특히 50중량% 이상, 바람직하게는 60중량% 이상, 특히 바람직하게는 70중량% 이상, 예를 들어, 80중량% 이상 및 특히 90중량% 이상인 모든 금속을 언급하는 것으로 이해된다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 탄소계 지지체/기질은 탄소 함량이 95 내지 100중량%, 특히, 95 내지 99중량%이다.
바람직하게, 지지체/기질은 하나가 또 다른 하나 위에 배열된 다수의 물질층을 갖고, 이러한 층은 상호공간을 형성하여 이를 통해 유체가 통과할 수 있다. 바람직하게, 각각의 상호공간은 채널형 구조를 포함하고, 예를 들어, 다수의 채널이 필수적으로 평행하게, 교차하여 또는 네트워크로 배열된다. 채널형 구조는 기질 물질 층상에 거리가 확보되도록 제공된 다수의 스페이서 요소로 인해 서로 특정 거리로 격리되도록 배열될 수 있다. 채널, 즉 채널형 구조는 바람직하게 약 1나노미터 내지 약 1미터 범위의 평균 채널 직경을 갖고 특히, 약 1 나노미터 내지 약 10센티미터, 바람직하게는 10 나노미터 내지 10밀리미터 및 가장 바람직하게는 50나노미터 내지 1밀리미터의 범위에서 평균 채널 직경을 갖는다. 2개의 인접한 물질층간의 거리는 필수적으로 동일한 치수를 갖는다.
본 발명의 지지체/기질은 특히 바람직하게 제 1 및 제 2 물질 층 사이의 채널과 제 2 및 제 3 물질 층 사이의 인접한 층에서의 채널이 필수적으로 동일한 방향으로 배열되고, 전반적으로 기질이 채널 층을 가져 이를 통해 유체가 바람직한 방향으로 통과할 수 있도록 디자인된다. 또한, 기질은 이것이 제 1 및 제 2 물질 층 사이에서 서로에 대해 특정 각도에 의해 교차하는 오프셋은 제 2 물질층과 제 3 물질층 사이에 인접한 층내 채널에 대해 0 내지 90°, 바람직하게는 30°내지 90°및 특히 바람직하게는 45°내지 90°의 각도에서의 오프셋과 함께 배열된다.
당해 채널, 즉, 본 발명의 기질내 채널형 구조는 필수적으로 채널 양쪽 말단에서 개방되어 있어 본 발명의 몸체는 대체로 샌드위치형의 구조, 즉 다공성 물질 및 상호 공간의 층 반복에 의한 적층된 디자인, 바람직하게는 이들 사이에 유체가 통과할 수 있는 채널 층을 갖고 있다. 채널, 즉 채널형 구조는 본 발명에 따라 종축 방향으로 직선으로 확장될 수 있거나, 이들은 주름지거나 굴곡지거나 지그재그 패턴을 가질 수 있고, 평행하거나 2개의 물질 층 사이에 상호공간내에 서로 교차할 수 있다.
본 발명의 지지체/기질의 외곽 형태 및 크기는 특정 의도된 응용에 따라 선택되거나 채택될 수 있다. 지지체/기질은 예를 들어, 실린더형과 같은 연장된 형태, 삼각형 원주와 같은 다각형 원주 형태 또는 막대 형태로부터 선택되는 외형을 가질 수 있거나, 쉬트 또는 다각형, 예를 들어, 사각형, 입방형, 사면체, 피라미드형, 팔면체, 십이면체, 다면체, 편능형, 프리즘형 또는 구형, 속빈 구형 또는 실린더형, 렌즈형 또는 디스크형 또는 환형일 수 있다.
본 발명의 기질은 의도된 응용과 관련하여 적합한 방식의 크기일 수 있고, 예를 들어, 지지체/기질 용적 범위는 1mm3, 바람직하게는 약 10cm3 내지 1m3이다. 이것이 요구되는 경우, 기질은 또한 보다 큰 크기이거나 심지어 보다 작은 마이크로 크기일 수 있고, 본 발명은 기질의 특정 크기로 제한되지 않는다. 기질은 약 1nm 내지 1000m, 바람직하게는 약 0.5cm 내지 50m, 특히 바람직하게는 약 1cm에서 5m 범위로 가장 긴 외곽 크기를 가질 수 있다.
이를 위해, 예를 들어, 주름진 물질층이 나선 패턴으로 감겨서 상승하여 실린더 몸체를 형성할 수 있다. 당해 기질은 이의 형태를 유지하는 방식으로 임의로 주름지거나 엠보싱(embosing)되거나 다른 구조를 갖는 하나의 물질 층이 나선으로 배열되어 하나 위에 다른 것이 배열되어 있는 2개 이상의 물질 층 부분 사이에 중간 영역을 형성함으로써 유체가 중간 영역을 통해 통과할 수 있도록 하여 다수의 채널형 구조 및/또는 채널을 갖도록 디자인된다.
하나 위에 다른 하나가 배열된 여러 물질 층은 이들이 감기면서 상승함에 의해 당해 실린더형 지지체/기질을 형성하는 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 지지체/기질의 물질 층 사이에 다공성 물질층 및/또는 채널 벽 및/또는 스페이서 요소들은 평균 공극 크기의 범위가 약 1nm 내지 10cm, 바람직하게는 10nm 내지 10mm 및 특히 바람직하게 50nm 내지 1mm일 수 있다. 다공성 물질층은 임의로 반투과성이고 일반적으로 두께가 3Å 내지 10cm, 바람직하게는 1nm 내지 100㎛ 및 가장 바람직하게는 10nm 내지 10㎛이다. 다공성, 임의로 반투과성 층의 평균 공극 직경은 0.1Å 내지 1mm, 바람직하게는 1Å 내지 100㎛ 및 가장 바람직하게는 3Å 내지 10㎛이다.
본 발명의 지지체/기질의 바람직한 양태에서, 지지체/기질의 물질 층은 한 측면 또는 양 측면상에, 바람직하게는 양 측면에서 구조를 형성한다. 물질층의 바람직한 구조는 엠보싱 그루브 패턴 또는 달리, 물질층 전체 표면에 걸쳐 서로로부 터 필수적으로 동일 거리로 이격되어 배열된 그루브 및/또는 채널 오목형과 함께 도입된 패턴의 형태로 이루어진다. 그루브 패턴은 물질층의 외곽 가장자리에 대해서 평행하게 유지될 수 있거나 이에 대해 임의의 각도로 배열될 수 있거나 지그재그 패턴 또는 주름진 패턴을 가질 수 있다. 또한, 양 측면상에 구조를 형성하는 경우 물질층은 양 측면상에 동일한 그루브 패턴을 가질 수 있거나 상이한 그루브 패턴을 가질 수 있다. 다공성 물질층은 이들이 2개의 측면상에 균일하게 상보성이되도록 구조를 형성하는 것이 바람직한데 즉, 물질의 한 측면상의 그루브 오목형은 물질층의 또 다른 측면상의 프로필에서 상응하는 볼록형에 상응한다. 물질층은 바람직하게 2개의 인접한 물질층의 그루브 패턴이 필수적으로 서로에 대해 평행하게 유지되도록 기질내에 배열된다.
또한, 물질층은 2개의 인접한 물질층이 한 각도에서 교차하여 물질층이 하나 위에 또 다른 하나가 축적되는 경우, 인접한 물질층의 그루브 구조의 볼록한 가장자리를 교차하는 지점에서 인접한 물질층 사이에 다수의 접촉점이 생성되는 방식으로 배열될 수 있다. 이로써 교차하는 그루브 패턴 접촉점에 따른 많은 지점에서 연결되는 덕택으로 기계적 안정성이 확실히 증가된 기질을 수득하게 된다. 그루브 구조는 특히, 2개의 물질층이 하나 위에 또 다른 하나가 배열되는 경우, 채널형 또는 네트워크 구조가, 다수의 채널 또는 튜브에 상응하고 지지체/기질내 적합한 유체 저항성, 바람직하게는 가능한한 가장 낮은 유체 저항성을 확보하는, 2개의 인접한 물질층 사이에 중간 영역에 형성되는 방식으로 선택된다. 당업자는 그루브 패턴 및 크기를 적절히 선택하는 방법을 잘 알고 있다. 본 발명의 지지체/기질에서, 엠보싱 물질 층에 통상적인 그루브 구조는 교차 영역이 특정 의도된 목적으로 채택될 수 있는 중간 공간에서 채널형 구조 및/또는 튜브형 구조를 유도할 수 있다.
그루브 또는 채널의 엠보싱에 대한 대안으로서, 또한 물질층은 미리 형성된 주름을 가질 수 있거나 이들은 아코디언 주름을 가질 수 있다. 다수의 당해 물질층이 하나의 정상부 위에 하나가 편평하게 배열되는 경우, 당해 결과는 지지체/기질의 말단면으로부터 보이는 바와 같이 채널 구조로서 물질층 평면의 방향으로 진행하는 벌집 구조이다. 당해 미리 형성된 물질층이 상향으로 감기는 경우, 당해 결과는 횡단면이 실린더의 종축 방향을 따라 연장하는 나선으로 배열된 다수의 채널을 갖는 실린더형 기질이다. 당해 실린더/디스크는 필수적으로 양 말단의 횡단면에서 개방되어 있다.
또한, 스페이서 요소들은 또한 물질층 사이에서 반복적으로 또는 추가로 제공되고/되거나 도입될 수 있다. 상응하는 스페이서 요소들은 채널이 진행하고 모듈의 적합한 낮은 유체 저항성을 보장하는 물질층 사이에 충분히 큰 상호 공간을 확보하는 작용을 한다. 상응하는 스페이서 요소들은 중앙에 또는 물질층 모서리에 배열된 중간층, 네트워크 구조 또는 스페이서 형태의 다공성, 개방 공극의 편평한 쉬트 구조여서 물질층 사이에 특정 최소 거리를 확보한다.
본 발명의 지지체/기질은 채널 및/또는 층의 양 말단이 필수적으로 개방되어 있는 중간층 및/또는 채널 및/또는 채널층을 갖는다. 본 발명의 기질은 물질층의 말단 및 모서리에서 및/또는 채널의 입구 또는 출구에서 유체에 대해 밀봉되거나 폐쇄되어 있지 않다.
물질층 서로에 대한 공간은 특히 바람직하게 인접하는 물질층 사이에 다수의 접촉점이 특정 각도로 2개의 인접하는 물질층의 그루브 패턴, 플리트 패턴 또는 주름진 패턴의 엠보싱, 플리팅 또는 주름지거나 교차되는 적합한 크기의 그루브로인해 구조의 볼록 모서리의 교차점에서 수득된다는 사실에 의해 보장된다. 이것은 다수의 채널형 구조 형태의 상호 공간이 물질층내 오목한 부분을 따라 형성되는 것을 보장한다. 유사하게 이것은 또한 상이한 폭의 물질층에서 반복적인 접힘 또는 주름을 통해 성취될 수 있다.
또한, 물질층은 또한 상이한 깊이로 반복적인 엠보싱 또는 플리팅 및/또는 주름진 그루브가 물질층상에 제공되어 상이한 높이의 개별 그루브 모서리를 볼록하게 하여 그루브 구조, 주름진 구조 또는 플리트된 구조의 모서리를 교차하는 지점에서 인접하는 물질층 사이에 다수의 접촉이 가용한 총수의 그루브 모서리와 비교하여 적합한 방식으로 전반적으로 감소되도록 이격된 거리로 배열될 수 있다. 이들 지점에서 물질층을 연결시켜 지지체/기질의 적당한 강도가 확보되고 우수한 유체 저항성이 확보된다.
특히, 모듈 구조가 다공성 지지체/기질로서 사용되어 당해 구조가 섬유, 종이, 직물 또는 중합체 물질을 기본으로 하는 임의로 구조화된, 엠보싱된, 전처리되고 플리트된 쉬트의 탄소화에 의해 생성되는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 지지체/기질은 탄소계 물질로 이루어지고 임의로 또한 탄소성 출발 물질의 열분해에 의해 생성되는 탄소 혼성 물질 및 필수적으로 탄소 세라믹 및/또는 탄소계 세라믹 유형에 상응한다. 당해 물질은 예를 들어, 고온에서 열분해 및/또 는 탄소화에 의해 종이형 출발 물질로부터 출발하여 생성될 수 있다. 상응하는 제조 방법, 특히 또한 탄소 혼성 물질에 대한 방법은 국제 특허 공보 제 01/80981호, 특히, 제14면 10행에서 제18면 14행에 기재되어 있고 본 경우에 적용될 수 있다. 본 발명의 탄소계 기질은 또한 국제 공개 공보 제 02/32558호, 특히 제6면 5행에서 제24면 9행에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 이들 국제 특허원의 기재 내용은 본원에서 완전히 참조로서 인용된다.
본 발명의 기질은 또한 이의 내용이 본원에 참조로서 인용되는 독일 특허 제 103 22 182호에 기재된 바와 같이 적합하게 미리 조립된 중합체 필름 및/또는 3차원적으로 배열되거나 접혀진 중합체 필름 팩킷의 열분해에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 지지체/기질의 바람직한 양태는 특히, 이전의 특허원에 기재된 열분해 방법에 따라 주름진 마분지의 탄소화에 의해 제조될 수 있고 이에 의해 주름진 마분지 층은 탄소화전에 적합하게 확보되어 유체가 통과할 수 있는 개방 몸체를 수득할 수 있다.
또한, 바람직한 기질은 이전의 선행 기술 분야에 언급된 방법에 따라 평행하게 배열되거나 유체 횡단을 위해 배열된 실린더형 몸체, 튜브 또는 막대를 형성하기 위해 종이 또는 중합체 필름 또는 축적된 종이 또는 중합체 필름 층을 상향으로 감거나 나선형으로 만들어 실린더형으로 수득된다. 가장 단순한 경우의 이들 "나선 몸체(coiled body)"는 상향으로 나선형으로 되어 당해 쉬트형 전구체를 감아 실린더를 형성함에 이어서 상향으로 감은 후 탄소화되는 그루브된, 엠보싱된, 플리트된 또는 주름진 다공성 물질층을 포함한다. 수득한 실린더형 지지체/기질은 횡단 면에서 나선으로 또는 나선관 톱니바퀴 처럼 상향으로 감겨진 다공성 물질 층을 포함하고 상호공간 및/또는 채널은 필수적으로 지지체/기질의 굴곡 사이에 실린더 높이 방향으로 연장하고 횡단면은 가장 낮은 유체 저항성을 갖는 입수 유체 영역으로서 작용한다. 단순하게, 하나 위에 또 다른 하나가 배열된 2개 이상의 물질층 전구체는 또한 상향으로 감기고 이어서 탄소화되어 지지체/기질을 형성할 수 있다. 하나 위에 또 다른 하나 반복적으로 배열된 하나가 주름진 층이고 또 다른 하나가 필수적으로 편평한 층(덮개 층)인 2개 이상의 물질층이 또한 특히 바람직하고 이것은 주름 및/또는 그루브가 실린더를 형성하기 위해 상향으로 감기는 경우 서로의 방향으로 미끄러지는 것을 차단하고 따라서, 채널형 구조를 형성하는 상호 공간이 개방된채로 유지된다. 하기 실시예 1은 당해 실린더형 몸체를 기재하고 있다.
본 발명의 지지체/기질은 임의로 의도된 응용에 맞도록 물리화학적 성질을 조정하기 위해 변형될 수 있다. 탄소계 물질은 기본적으로 세포, 미생물 또는 조직에 대해 이상적인 기질을 형성하는 고도로 생물적합성 기질이다. 본 발명의 기질은 예를 들어, 불소화, 파릴렌화에 의해 또는 지지체/기질을 미생물 증식을 촉진하는 물질, 배지, 중합체등으로 피복시키거나 함침시킴에 의해 적어도 부분적으로 친수성, 소수성, 친유성 또는 소유성이되도록 내부 및/또는 외부 표면이 변형될 수 있다.
지지체/기질의 성질은 특히 바람직하게 유기 및 무기 물질 또는 화합물로부터 선택되는 기타 물질을 사용하여 변형될 수 있다. 바람직한 물질은 철, 코발트, 구리, 아연, 망간, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 황 또는 인 화합물이다. 이들 추가 화 합물의 혼입은 예를 들어, 기질상에서 특정 미생물 또는 세포의 성장을 촉진시키기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 탄수화물, 지질, 푸린, 피로미딘, 피리미딘, 비타민, 단백질, 성장 인자, 아미노산 및/또는 황 공급원 또는 질소 공급원을 사용한 지지체/기질의 함침 또는 피복은 또한 성장을 촉진시키는데 적합하다. 또한, 세포 성장을 자극하기 위해 하기의 물질들이 사용될 수 있다: 비스포스포네이트(예를 들어, 리세드로네이트, 파미드로네이트, 이반드로네이트, 졸레드론산, 클로드론산, 에티드론산, 알렌드론산, 틸루드론산), 불소화물(인산불소이나트륨, 불소화나트륨); 칼시티노닌, 디하이드로타키스티렌 뿐만 아니라 모든 성장 인자 및 사이토카인(상피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 형질전환 성장 인자 b(TGF-b), 형질전환 성장 인자 a(TGF-a), 에리트로포이에틴(Epo), 인슐린형 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린형 성장 인자 II(IGF-II), 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 2(IL-2), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 8(IL-8), 종양 괴사 인자 a(TNF-a), 종양 괴사 인자 b(TNF-b), 인터페론 g(INF-g), 단핵구 화학주성 단백질, 섬유모세포 자극 인자 1, 히스타민, 피브린 또는 피브리노겐, 엔도텔렌 1, 안지오텐신 II, 콜라겐, 브로모크립틴, 메티세르기데, 메토트렉세이트, 사염화탄소, 티오아세트아미드, 에탄올).
지지체/기질내 유동 조건은 상호공간의 기하학적 구조 또는 유동 방향의 채널(예를 들어, 주름진 채널)을 다양하게 하거나 직경 및 임의로 또한 막 성질, 강도, 다공성, 친수성, 소수성, 친유성, 소유성, pH와 같은 세포 표면의 표면 성질을 다양하게 하거나 활성 성분 및/또는 촉매등으로 함침시킴에 의해 요구되는 배양 조 건으로 조정될 수 있다.
로딩 및 세포 배양
본 발명에 따른 방법에 의해, 지지체/기질에는 생존하고/하거나 증식할 수 있는 생물학적 물질이 로딩된다. 생물학적 물질은 바람직하게 단세포, 다세포 미생물, 진균류, 포자, 바이러스, 식물 세포, 세포 배양물 또는 조직 또는 동물 또는 사람 세포, 세포 배양물들 또는 조직 또는 이의 혼합물을 포함한다. 당해 로딩은 바람직하게 생물학적 물질을 상당히 고정화시킨다.
로딩은 바람직하게, 조직 형성 또는 비조직 형성 포유동물 세포, 조류, 세균, 특히, 활성 성분을 생산하는 유전학적으로 변형된 세균, 진핵 조직, 예를 들어, 골, 연골, 간, 신장과 같은 1차 세포 배양물 뿐만 아니라, 외인성, 동종성, 동계열성 또는 자가 세포 및 세포 유형 및 임의로 또한 유전학적으로 변형된 세포주 및 특히 또한 신경 조직으로 수행된다.
생물학적 방법은 통상적인 방법에 의해 지지체/기질에 적용될 수 있다. 이의 예는 지지체/기질을 세포 물질의 용액/현탁액중에 침지시키는 방법, 지지체/기질에 세포 물질 용액 또는 현탁액을 분무시키는 방법, 유체 매질을 지지체/기질과 접촉시키는 방법등을 포함한다. 로딩 후에 고정화된 생물학적 물질이 지지체/기질에 완전히 침투되도록 임의의 처리 시간이 필요하다.
탄소계 기질은 특히, 모든 유형의 미생물 및 조직 배양물, 특히 세포 조직을 고정화시키고 증식시키기는데 적합하다. 이들 과정에서, 미생물 및/또는 세포 배 양물은 기질상에 콜로니를 형성하고 유체 통과 중간층 및/또는 중간층내 유체 채널을 통해 액체 또는 기체 영양물을 공급받을 있고 대사물은 지지체/기질을 통과하는 유체 유동과 함께 용이하게 제거될 수 있다. 또한, 지지체/기질상에 대부분 고정화된 미생물 및 세포는 방출되는 것으로부터 및 기계적 스트레스와 같은 가능한 해로운 환경 영향으로부터 보호받을 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 상이한 미생물, 세포 배양물 도는 조직 배양물을 갖는 여러 기질을 예를 들어, 반응 매질 및 임의로 추출물을 포함하는 반응 혼합물로 침지시킴에 따라서 반응 매질이 대부분 기질상에 고정화된 미생물, 세포 또는 조직 배양물을 혼합시키는 것 없이 이들을 통과하도록 할 수 있다.
상이한 미생물 또는 임의로 상이한 세포 배양물이 로딩된 카트리지 시스템을 형성하기 위해 적합한 하우징내에 임의로 설치된 상응하는 지지체/기질을 증식 또는 활성 성분 생산을 위해 단일 배지내에 침지시킬 수 있고, 수거를 위한 개별 카트리지로서 특정 시간 후에 배지로부터 제거되고 당해 목적을 위해 개방되거나 생성물은 연속적으로 제거될 수 있다. 기질 또는 기질을 포함하는 하우징 및/또는 카트리지는 임의로 또한 이들이 활성 성분을 방출하도록 파괴되거나 이들이 가역적 과정으로 개방되거나 폐쇄될 수 있도록 디자인될 수 있다. 당해 카트리지는 바람직하게 가역적으로 개방되고 재폐쇄되도록 디자인된다.
본 발명에 따라, 지지체/기질은 임의로 적합한 하우징내에 또는 화학적 또는 생물학적 반응을 위한 반응기, 예를 들어, 플라스크, 병, 특히, 세포 배양 플라스크, 롤러 병, 회전 병, 배양 튜브, 세포 배양 챔버, 세포 배양 접시, 배양 플레이 트, 피펫 캡, 스냅 커버 접시, 냉동 튜브, 교반 반응기, 고정된 베드 반응기, 연관식 반응기 등으로부터 선택되는 적합한 용기내 또는 이의 위에 배열될 수 있다.
생물학적 물질로 로딩하기 전, 동안 또는 로딩 후, 지지체/기질은 유체 매질와 접촉하게 된다. 유체 매질는 임의로, 로딩 후와 로딩전에 상이한 배지일 수 있다. 용어 "유체 매질(fluid medium)"은 임의의 유액, 기체, 고체 또는 액체, 예를 들어, 물, 유기 용매, 무기 용매, 초임계 기체, 통상적인 기질 기체, 고체 또는 기체 물질의 용액 또는 현탁액, 에멀젼 등을 포함한다. 당해 매질은 바람직하게 액체 또는 기체, 용매, 물, 기체 또는 액체 또는 고체 반응 추출물 및/또는 생성물, 효소, 세포 및 조직용 액체 배지, 이의 혼합물 등으로부터 선택된다.
액체 배지의 예는 예를 들어, RPMI 1640(Cell Concept), PFHM II, 하이브리도마 SFM 및/또는 CD 하이브리도마(GIBCO) 등을 포함한다. 이들은 L-글루타민과 같은 아미노산이 존재하거나 아미노산이 없는 태아 소 혈청과 같은 혈청과 함께 또는 혈청 없이 사용될 수 있다. 유체 매질은 또한 예를 들어, 지지체/기질을 접종하기 위해 생물학적 물질과 혼합될 수 있다.
지지체/기질 또는 이를 보유하는 하우징/용기를 유체 매질에 완전히 또는 부분적으로 침지시켜 접촉시킬 수 있다. 기질은 또한 유체 매질이 이들을 통과할 수 있도록 적합한 반응기에 정착될 수 있다. 여기에서 중요한 판단 기준은 습윤성 및 기질 물질로부터 임의의 밀봉된 공기 방울을 제거하는 능력이다. 배출, 탈기 및/또는 세정 작업은 여기에 필요할 수 있고 요구되는 바와 같이 사용될 수 있다.
지지체/기질과 유체 매질간의 제 1 접촉 후, 이어서 생물학적 물질을 일반적 으로 멸균 조건하에 바람직하게, 즉 일반적으로 액체 형태, 예를 들어, 특히 바람직하게는 유체 매질 자체내의 용액, 현탁액, 에멀젼으로서 첨가된다. 본 발명의 기질을 사용하여 세포로 인해 불투명한 매질 환경을 세정하고 일반적으로 몇시간 후 흔히, 약 2시간 후 세정한다.
지지체/기질은 바람직하게 1초에서 1000일동안 생물학적 물질을 함유하는 용액, 에멀젼 또는 현탁액중에 침지시키거나 임의로 멸균 조건하에 이것으로 접종하여 물질이 다공성 몸체로 확산하고 거기에서 콜로니를 형성할 기회를 부여할 수 있다. 접종은 또한 분무 방법 등에 의해 수행될 수 있다.
유체 매질, 예를 들어, 배지는 가능한한 가장 균일한 생존 환경 및 영양물을 미생물에 공급하기 위해 이동되거나 진탕될 수 있다. 이것은 상기 지적된 바와 같이, 예를 들어, 매질내 지지체/기질을 이동시키거나 매질이 지지체/기질을 통과하도록 함에 의해 다양한 방법을 통해 성취될 수 있다. 이것은 일반적으로 생물학적 물질의 성장, 생식 또는 적당한 대사 활성을 허용하는 충분한 시간동안 수행된다.
이어서, 대사물, 즉, 증식된 세포는 수거한다. 여기 지지체/기질 표면상에서의 고정화된 배양은 세포 및 주위 배지가 당해 방식으로 서로 용이하게 분리될 수 있기때문에 요구되는 바와 같이 단일화되어 있다. 세포는 지지체/기질에 잘 부착하고 매질을 세척한 후, 임의로 적합한 수단으로 이를 세정한 후 적합한 수단으로 제거될 수 있다.
예를 들어, 매질로부터 추출시킴에 의해 대사 산물을 수거한 후, 요구되거나 필요한 바와 같이 지지체/기질은 정제되고 멸균되고 동일하거나 상이한 생물학적 물질을 사용하여 재로딩하기 위해 재활용될 수 있다. 로딩된 기질의 후속 재활용을 위해, 이들은 또한 생물학적 물질과 함께 냉동보존함에 의해 보존될 수 있다.
생물반응기
본 발명의 방법은 바람직하게, 생물학적 물질을 로딩하기 전 또는 후에 적합한 하우징, 용기 또는 반응기 또는 반응기 시스템으로 도입되는 하나 이상의 기질로 수행된다. 기질은 바람직하게 적어도 부분적으로 하우징 용기 또는 반응기 및/또는 반응기 시스템을 충전시킴에 의해 하우징, 용기 또는 반응기 또는 반응기 시스템내 유체 매질과 접촉하게 된다.
매질과의 접촉은 바람직하게 기질이 연속적으로 또는 불연적으로 하우징, 용기 또는 반응기 및/또는 반응기 시스템내 매질과 함께 이동하는 방식으로 하나의 양태로 발생한다. 이를 위해, 용기는 일반적으로 공급 장치를 통해 매질로 충전된 저장 용기와 연결되고 경우에 따라 추가의 제거 장치가 제공되어 매질을 연속적으로 또는 불연속적으로 용기내로 이동시키고 용기를 통과하도록 한다. 또한, 지지체/기질은 또한 적합한 장치를 수단으로 유체 매질로 부분적으로 또는 완전히 충전된 하우징, 용기 또는 반응기 및/또는 반응기 시스템내에서 적합한 장치를 수단으로 이동될 수 있다.
또한, 지지체/기질은 연속적으로 또는 불연속적으로 하우징, 용기 또는 반응기 및/또는 반응기 시스템내 완전히 또는 부분적으로 침지시켜 유체 매질이 이를 통과할 수 있도록 할 수 있다. 이를 수행하는데 있어서, 지지체/기질을 통한 유체 매질의 이동은 매질내 지지체/기질을 이동시킴에 의해 성취될 수 있다. 또한 지지체/기질을 통한 유체 매질의 이동은 예를 들어, 적합한 진탕기 장치, 펌프 시스템, 유압 매질 리프팅 장치 등에 의해 지지체/기질내 매질을 이동시킴에 의해서 성취될 수 있다. 지지체/기질에 생물학적 물질을 로딩한 후, 바람직하게 영양물을 첨가하고/하거나 대사 산물을 바람직하게 생물학적 물질과 함께 연속적으로 또는 불연속적으로 제거한다.
본 발명에 따른 방법에서, 지지체/기질에 의도된 목적에 상응하는 적합한 양의 생물학적 물질을 로딩하고/하거나 접종한다. 당해 물질은 바람직하게 지지체/기질이 로딩된 지지체/기질의 총 중량을 기준으로 10-5 중량% 내지 99중량%, 바람직하게는 10-2중량% 내지 80중량%, 최소한 바람직하게 1 내지 50중량%의 세포를 함유하도록 로딩된다. 지지체/기질은 특히 바람직하게 세포 밀도가 지지체/기질 용량 ml당 1 내지 1023세포일 뿐만 아니라 단지 이의 중량의 106 배 이하의 양으로 세포 배양물을 함유한다.
본 발명의 방법은 특히, 신경조직을 배양하고 임의로 재생시키기에 적합하다. 특히, 여기에서, 본 발명의 탄소계 기질은 또한 특히 몸체의 전도성이 용이하게 조정되고 신경 조직을 배양하기 위해 펄스된 전류가 용이하게 적용됨으로 융통성 있고 적합하다.
본 발명에 따라, 당해 기질은 통상적인 생물반응기 시스템, 예를 들어, 기체 투입구 및 자동 조정 계수(산도, 온도)를 갖는 능동 시스템, 즉 가장 광범위한 의 미에서 측정 및 조절 기술을 갖는 반응기 시스템 뿐만 아니라 조직 플레이트, 조직 병, 롤러 병과 같은 연속 조절 기술이 없는 수동 시스템과 같은 통상적인 생물반응기 시스템에서 배양하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 비히클 몸체는 또한 관류를 위한 배지와 기체 교환과의 연결장치, 특히 또한 상응하는 일련의 반응기 시스템 및 조직 배양에서의 모듈 디자인을 포함하는 적합한 장치를 제공함에 의해 반응기 시스템으로서 작동할 수 있다.
본 발명에 따라, 상기된 바와 같이 하나 이상의 지지체/기질을 포함하는 반응기 및/ 또는 반응기 시스템과 함께 세포 배양 방법을 수행하는 것이 바람직하고 여기서, 반응기 및/또는 반응기 시스템은 플라스크, 병, 특히 세포 배양 병, 롤러 병, 회전 병, 배양 튜브, 세포 배양 챔버, 세포 배양 접시, 배양 접시, 냉동 튜브, 진탕 반응기, 고정화된 베드 반응기, 관형태의 반응기로부터 선택된다. 본 발명의 지지체/기질을 포함하는 롤러 병 또는 하우징내 본 발명의 지지체/기질을 포함하는 카트리지가 특히 바람직하다.
또한, 본 발명의 기질은 또한 예를 들어, 프로테오글리칸, 콜라겐, 조직 염, 예를 들어, 하이드록시아파타이트 등과 함께, 특히, 상기 언급된 생분해성 및/또는 흡수성 중합체와 함께 기관발생을 촉진하기 위해 적당히 변형될 수 있다. 본 발명의 기질은 또한 추가로 바람직하게, 성장 인자, 사이토카인, 인터페론 및/또는 첨가 인자의 함침 및/또는 흡착에 의해 변형된다. 적합한 성장 인자의 예는 PDGF, EGF, TGF-α, GFG, NGF, 에리트로포이에틴, TGF-β, IGF-I 및 IGF-II를 포함한다. 적합한 사이토킨은 예를 들어, IL-1-α및 IL-1-β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13을 포함한다. 적합한 인터페론은 예를 들어, INF-α 및 INF-β, INF-γ를 포함한다. 적합한 접착 인자의 예는 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 페투인, 폴리-D-라이신 등을 포함한다.
본 발명의 지지체/기질의 세포 밀도는 용적, 특히 반응기 용적 ml당 1 내지 1023 세포 범위, 바람직하게 ml당 102 이하, 바람직하게 105 이하, 특히 109 이하의 세포 범위일 수 있다.
반응기 및/또는 반응기 시스템은 연속적으로 또는 배치식으로 작동될 수 있다. 본 발명의 지지체/기질은 이들 시스템내에 반투과성의 분리 층을 가질 수 있다. 반투과성 분리 층이 없는 기질은 바람직하게 반투과성 분리 층을 포함하는 반응기의 용기에 설치될 수 있다. 당해 경우에, 용기는 바람직하게 반응기내 유체 매질과 용기의 내관간의 물질 교환이 반투과성 분리층을 통해 조절되도록 디자인된다. 반투과성 분리층은 다공성 지지체/기질의 외곽 표면과 접촉된 반투과성 분리 층과 동일한 분리 성질을 가질 수 있다.
반투과성 분리 층을 갖는 기질 또는 단지 추출물 및 반응 매질과 관련해서 물질 교환을 허용하는 반투과성 분리 층을 갖는 용기내에 있는 기질의 사용을 위해, 배치로 작동되는 진탕된 용기 반응기가 바람직하고 또한 본 발명의 기질에 대한 임의의 분리층이 없다. 이들 진탕된 용기 반응기에는 일반적으로 진탕기 및 임의로 연속 추출물 공급 장치가 장착되어 있다. 기질(들)은 임의로 임의로 반투과성 분리 층을 갖는 용기내에서 유체 매질에 침지시킨다. 비교적 소량의 지지체/기 질이 사용되는 경우, 이들은 바람직하게 매질로 침지되는 경우 컨테이너 또는 하우징내에 수용된다. 용기는 임의로 반투과성 분리층을 통해 매질과의 접촉을 허용하지만 반응기내 기질이 비조절적으로 분포하는 것을 차단한다.
반응 공간내 유체는 바람직하게 난류이고 층류 경계 필름은 바람직하게 가능한한 박층이다. 농도 기울기를 유지하기 위해, 우수한 환류 효과가 필요하다. 추출물은 항상 충분한 양으로 공급되어야만 한다. 당업자는 우수하고 완전한 환류를 유도하는 장치가 또한 본 발명에 적합할 수 있음을 인지할 것이다.
당업자는 물질 수송이 난류(Re 수 증가)의 증가와 함께 확산 경로가 감소하여 보다 신속해짐을 숙지하고 있을 것이다. 확산 경로가 짧아질수록 농도 기울기는 보다 증가하고 내부 공간과 외부 공간간에 물질 수송이 보다 신속해진다. 당업자는 대부분의 반응 속도가 물질 수송에 의해 결정되는 것이지 반응율에 의한 것이 아니고 따라서 반응 속도는 질량 수송과 직비례함을 숙지하고 있을 것이다. 단지 예외적인 경우에, 반응 속도 자체는 물질 수송보다 느리고 따라서 반응 속도는 물질 수송이 아닌 실질적인 반응에 의해 제한된다.
즉, 연속 공정 처리가 또한 사용될 수 있다. 연속 공정 처리는 추출물이 유체 매질과 함께 연속적으로 및 불연속적으로 공급될 수 있고 생성물이 연속적으로 또는 불연속적으로 제거될 수 있다는 잇점을 가져다 준다. 이러한 양태에 대해, 반투과성 분리 층이 없는 지지체/기질이 바람직하다. 반투과성 분리층을 갖는 기질에 대한 대용으로서, 반투과성 분리층을 갖는 반응기로 도입되는 경우 반투과성 분리 층을 갖지 않는 기질을 용기 또는 하우징에 고정화시켜 사용할 수 있다. 바 람직한 반응기는 연속적으로 작동되는 교반 용기 반응기, 관형태의 반응기 및 임의로 또한 유동화 베드 반응기를 포함한다.
반응기 체류 시간은 반응에 따라 다양하고, 생물학적 반응 속도에 의존한다. 당업자는 특정 반응에 따라 체류 시간을 조정한다. 추출물 스트림은 바람직하게 순환내에서 수행될 수 있고, 이에 따라 적합한 측정 장치 및 조절 장치가 제공되어, 예를 들어, 매질내 온도, pH, 영양물 농도 또는 추출물 농도를 조절한다. 연속적으로 또는 불연속적으로 순환 스트림으로부터 생성물을 제거할 수 있다.
본 발명의 지지체/기질은 진탕 용기 또는 관형 반응기내에 고정적으로 부착될 수 있거나 이들은 매질내에서 느슨하게 부유할 수 있거나 이들은 반응 매질에 침지된 용기 또는 하우징에 포함될 수 있다. 이들 몸체가 매질내에서 자유롭게 부유하는 경우, 반응기 출구에서 특정 장치가 구비되어 있어 이들 몸체가 반응기를 벗어날 수 없도록 한다. 예를 들면, 스크린(screen)이 출구에 고정시킬 수 있다. 본 발명의 지지체/기질은 바람직하게 반응 혼합물중에 침지시키기 위한 임의로 반투과성 분리 층이 제공된 다공성 용기 또는 하우징내에 배열되어 있다. 이러한 양태는 또한 진탕 용기가 다른 반응에 요구되거나 보충이 필요한 경우 기질이 용이하게 제거될 수 있다는 잇점을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 반응기는 관형 반응기로 디자인된다. 이러한 양태에서, 연장된 디자인을 갖는 기질, 특히, 실시예 1에 지적된 바와 같은 나선형 실린더 몸체가 바람직하게 사용된다. 이들 기질은 관형 반응기에서 자유롭게 배열되어 있거나 이들은 용기내에 다발로 연결되어 있다. 관형 반응기의 한쪽 말단에 서, 추출물 반응 매질 혼합물이 도입되는 반면 관형 반응기의 또 다른 말단에서는 필수적으로 생성물 반응 매질 혼합물이 제거된다. 매질은 관형 반응기를 통해 유동하면서, 지지체/기질을 통해 연속적으로 매질이 유동한다. 관형 반응기의 길이 및 유체 매질의 유속 및 연합된 체류 시간은 발생하는 반응에 따라 당업자에 의해 조정된다. 당업자는 관형 반응기에는 추가로 배플(baffle)이 장착되어 난류를 유도할 수 있다는 사실을 인지할 것이다. 연속적으로 작동되는 진탕 반응기에 대해 상기 설명된 바와 같이, 가능한한 가장 높은 Re 수를 갖는 유체는 층류 경계 층을 최소화하고 확산 경로를 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 배플은 임의로 특정 형태의 다공성 지지체/기질에 존재할 수 있다. 대안으로서, 추가의 성형체가 또한 도입되어 배플로서 작용할 수 있다.
당업자는 상기된 기본 유형의 반응기 뿐만 아니라 변형된 유형의 반응기가 또한 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 세포 배양 방법을 위해 사용될 수 있다는 사실을 인지할 것이다.
본 발명은 지금부터 각각의 바람직한 측면에서 그래프 다이아그램을 기준으로 하기에서 보다 상세하게 설명될 것이다. 이것은 본 발명을 특정 형태 또는 구성으로 제한하지 않는 것으로 의도된다.
본 발명은 지금부터 하기의 실시예를 기준으로 추가로 설명될 것이지만 발명이 여기에 제한되는 것으로서 해석되지 말아야 한다.
실시예 1:
본 발명의 세포 배양 공정에서 지지체/기질 물질로서의 의도된 응용을 위해, 천연 섬유를 함유하고 단위 면적당 중량이 평방 미터당 100그램이고, 건조 층 두께가 110마이크로미터인 중합체 혼성물을 상향으로 감아서 길이가 150mm이고 직경이 70mm인 체형을 형성한다. 평균 채널 직경이 3mm인 방사상으로 폐쇄된 유체 채널이, 길이가 약 8m인 편평한 물질로부터 주름지게 성형함에 의해 제조되고 이러한 단일층의 주름진 구조는 이어서 횡단 방향으로 감겨 올라가서 이러한 형태로 확고하게 된다. 이들 성형체는, 말단쪽으로 공기를 주입하고 다공성을 변형시켜 800℃에서 48시간 동안 질소 대기에서 탄소화시켰다. 61중량%의 중량 손실이 발생하였다. 수득한 물질은 물에서 pH 7.4이고 완충 범위는 약산 범위이다. 당해 탄소화된 물질로부터 절단된, 각각 직경이 60mm이고 두께가 20mm인 디스크는 하기의 성질을 가졌다:
표면 대 용적 비 1700m2/m3, 자유 유동 횡단면 0.6m2/m3; 대기 조건하에 물질을 통한 물의 유동에서 개방된 구조 및 길이가 20mm인 유체 채널로 인해 어떠한 측정 가능한 압력 강하가 검출될 수 없었다.
이들 디스크는 500ml 배지 및 150ml의 세포 현탁액이 멸균 조건하에 각각의 디스크를 통해 유동할 수 있도록 도 4에 따른 교차하는 압력 장치에 설치하였다. 세포 현탁액은 현탁액에서 비접착 또는 비접착 성장하는 것으로 공지된, 쉬가 (Shiga) 독소에 대한 하이브리도마 FLT2 MAB를 생산하는 세포주를 함유하였다.
비교 목적을 위해, 동일한 조건 및 동일한 주입 속도 및/또는 로딩하에서 기질 및 탄소 물질이 없는 상응하는 단위체를 사용하였다. 액체 매질은 30초 주기로 카트리지에 통과시키고, 즉 순환시키고, 즉 몸체를 30초 마다 액체 매질에 침지시켰다.
기질을 갖는 샘플은 자발적으로 고정화된 세포를 보여주었고(이전에 혼탁한 상등액은 약 4시간 후 청명하게 되었다) 이어서 현탁액에서 더 이상의 탁도가 검출될 수 없었다. 7일간의 배양 시간내에, 세포 밀도는 ml당 1.8 x 107 세포로 7배 증가하였다. MAB 생산은 우선 50㎍/ml에서 평균 배양 시간동안 350㎍/ml로 증가하였고, 단백질 가수분해에 대한 징후를 나타내지 않았다. 25일 후, 12개의 샘플중 12개는 여전히 생존하고 있고 이후, 공정을 종료하였다. 이것은 본 발명의 지지체/기질이 세포 밀도가 보다 높지만 접촉 억제를 중단시킨다는 것을 보여준다. 심지어 냉동보존 및 해동후에도 MAB 생산은 신선한 배지를 첨가한 후에 자발적으로 개시되었다.
비교 실험에서, 6개의 배양물 중 1개가 11일까지 생존하였다.
실시예 2: 십자 기하학적 구조
세포 배양 시스템을 위한 지지체/기질 물질로서의 의도된 응용을 위해, 천연 섬유를 함유하고 중량이 100g/m2이고 건조 층 두께가 110마이크로미터인 중합체 혼 성물을 길이가 300mm이고 폭이 150mm이고 높이가 50mm인 치수를 갖는 몸체로 성형시키고 당해 형태로 접착시켰다. 이것은 편평한 물질이 주름지고 각각 90°로 오프셋되고 방사상으로 폐쇄되는 유체 채널을 갖는 이들 단일층의 주름진 구조의 적층으로 인해 평균 유체 채널 직경이 3mm인 유체 채널을 생성시켰다. 이들 성형체는 질소 대기하에 공기를 말단쪽으로 첨가하여 다공성을 변형시키면서 48시간 동안 800℃에서 탄소화시켰다. 61중량%의 중량 손실이 발생하였다. 수득한 물질은 물중에서 pH 7.4이고 완충 범위는 약산 범위이다.
물 분사 절단을 사용하여 이러한 탄소성 물질로부터 직경이 35mm이고 두께가 40mm인 크기를 갖는 실린더형 기질을 제조하였고 하기의 성질을 갖는다:
표면 대 용적 비 1700m2/m3, 자유 유동 횡단면 0.6m2/m3; 대기 조건하에서 지지체/기질을 통한 물의 유동에서 개방된 구조 및 20mm 길이의 유체 채널로 인해 어떠한 측정 가능한 압력 강하가 검출될 수 없었다.
당해 디스크를 방사선 가교결합된 보호 쉘에 놓고 연결하여 길이가 160mm인 쇄를 형성시켰다. 이들 쇄의 각각은 통상적인 2ℓ 롤러 병으로 주입하고 멸균 조건하에서 500ml의 액체 배지 및 150ml의 세포 현탁액을 충전시켰다. 세포 현탁액은 현탁액에서 비흡착성, 비접착성으로 성장하는 것으로 공지된 쉬가 독소에 대한 하이브리도마 FLT2 MAB를 생산하는 세포주를 함유하였다.
비교 목적을 위해, 탄소 물질이 없는 상응하는 롤러 병을 동일한 조건 및 로딩하에서 사용하였다.
롤러 병은 롤러 병 장치상에서 회전시켰다.
지지체/기질을 갖는 샘플은 자발적으로 고정화된 세포를 보여주었고(이전에 혼탁한 상등액은 약 4시간 후 청명하게 되었다) 이어서 현탁액에서 더 이상의 탁도가 검출될 수 없었다. 7일간의 배양 시간내에, 세포 밀도는 ml당 1.8 x 107 세포로 7배 증가하였다. MAB 생산은 우선 50㎍/ml에서 평균 배양 시간동안 350㎍/ml로 증가하였고 단백질 가수분해에 대한 징후를 나타내지 않았다. 25일 후, 12개의 샘플중 12개는 여전히 생존하고 있고 이후, 실험을 종료하였다. 이것은 본 발명의 기질이 세포 밀도가 보다 높지만 접촉 억제를 중단시킨다는 것을 보여준다. 심지어 냉동보존 및 해동후에도 MAB 생산은 신선한 배지를 첨가한 후에 자발적으로 개시되었다.
비교 실험에서 6개의 배양물 중 하나만이 11일까지 생존하였다.
실시예 3:
세포 배양 시스템을 위한 지지체/기질 물질로서의 의도된 응용을 위해, 천연 섬유를 함유하고 중량이 평방 미터당 100그램이고 건조 층 두께가 110마이크로미터인 중합체 혼성물을 상향으로 감아서 길이가 150mm이고 직경이 70mm인 크기를 갖는 체형을 형성하였다. 이를 위해, S자 형 또는 주름진 형태를 갖고 평균 채널 직경이 3mm인 이전에 방사상으로 폐쇄된 유체 채널을, 편평한 물질을 엠보싱하고 주름지게 하고 이어서 당해 단일 층의 주름진 구조를 상향으로 감아서 제조하였다(실시 예 1 참조). 이들 성형체는, 말단쪽으로 공기를 주입하여 다공성을 변형시키면서 800℃에서 48시간동안 질소 대기에서 탄소화시켰다. 61중량%의 중량 손실이 발생하였다. 수득한 물질은 물에서 pH 7.4이고 완충 범위는 약산 범위이다.
각각 직경이 60mm이고 두께가 20mm인 당해 탄소성 물질의 디스크는 하기의 성질을 가졌다:
표면 대 용적 비 2500m2/m3, 자유 유동 횡단면 0.3m2/m3; 실험 조건하에 지지체/기질을 통한 물의 유동에서 개방된 구조 및 길이가 20mm인 유체 채널로 인해 어떠한 측정 가능한 압력 강하가 검출될 수 없었다.
이들 디스크는 500ml 배지 및 150ml의 세포 현탁액이 멸균 조건하에 각각의 디스크를 통해 유동할 수 있도록 도 3에 따른 장치에 설치하였다. 세포 현탁액은 현탁액에서 비유착 또는 비접착으로 성장하는 것으로 공지된, 쉬가(Shiga) 독소에 대한 하이브리도마 FLT2 MAB를 생산하는 세포주를 함유하였다.
비교 목적을 위해, 동일한 조건 및 동일한 주입 속도 및/또는 로딩하에서 기질 및 탄소 물질이 없는 상응하는 단위체를 사용하였다.
액체 매질은 30초 주기로 카트리지에 통과시키고, 즉 순환시키고 즉 몸체를 30초 마다 액체 매질에 침지시켰다.
지지체/기질을 갖는 샘플은 자발적으로 고정화된 세포를 가졌고(이전에 혼탁한 상등액은 약 4시간 후 청명하게 되었다) 이어서 현탁액에서 더 이상의 탁도가 검출될 수 없었다. 7일간의 배양 시간내에, 세포 밀도는 ml당 1.8 x 107 세포로 7 배 증가하였다. MAB 생산은 우선 50㎍/ml에서 평균 배양 시간동안 350㎍/ml로 증가하였고 단백질 가수분해에 대한 징후를 나타내지 않았다. 25일 후, 12개의 샘플중 12개는 여전히 생존하고 있고 이후, 공정을 종료하였다. 이것은 본 발명의 지지체/기질이 세포 밀도가 보다 높지만 접촉 억제를 중단시킨다는 것을 보여준다. 심지어 냉동보존 및 해동후에도 MAB 생산은 신선한 배지를 첨가한 후에 자발적으로 개시되었다.
실시예 4:
실시예 1의 디스크를 탄소화 후 10% 폴리비닐 피롤리돈을 함유하는 수용액에 함침시키고 이어서 다시 건조시켰다. 다음, 카트리지를 실시예 1에 따른 장치에 설치하고 배지에서 세포를 배양하였다. 카트리지의 습윤 작용이 개선되었고 세포가 불과 2시간 후에 고정화되는 것으로 관찰되었다(이전에 혼탁한 상등액을 청명하게 하면서).
실시예 5:
실시예 1의 디스크를 바닥의 중앙에서 상응하는 라인에 의해 상호 연결된 2개의 용기를 포함하는, 도 3에 따른 장치에 설치하였다.
당해 용기 시스템의 실시예 1에 따른 배지에서 세포를 배양하였다. 용기 배열은 정지 위치에서, 탄소 디스크가 연전히 유체로 덮여 있도록 선택하였다. 세포 가 완전히 고정화할때까지 대기한 후, 탄소 디스크와 함께 용기를 기계적으로 액체 가 상응하는 라인을 통해 제2 액체 용기로 배출되고 탄소 디스크가 더 이상 액체에 침지되어 있지 않는 정도까지 올렸다. 이어서 용기를 다시 정지 위치로 낮추었다. 전체 공정에 대한 순환 시간은 30초이다. 당해 순환의 잇점은 배지를 이동시키는데 필요한 힘이 카트리지를 승강 및 하강시킴에 의해 생성됨에 따라 배지와의 접촉이 요구되지 않는다는 것이다.
배양 시간 7일 이내에, 세포 밀도는 ml당 1.8 x 107으로 7배 증가하였다. MAB 생산은 처음 50㎍/ml에서 평균 배양 시간동안 350㎕/ml로 증가하였고 단백질 가수분해에 대한 징후를 나타내지 않았다. 25일 후에, 12개의 샘플중 12개는 여전히 생존하였고 이후 실험을 종료하였다. 이것은 본 발명의 지지체/기질이 세포 밀도가 보다 높지만 접촉 억제를 중단시킴을 보여준다. 냉동보존 및 해동후에도, MAB 생산은 신선한 배지를 첨가한 후에 자발적으로 개시되었다.
실시예 6:
실시예 1의 디스크를 바닥의 중앙에서 상응하는 라인에 의해 상호 연결된 2개의 용기를 포함하는, 도 3에 따른 장치에 설치하였다.
당해 용기 시스템의 실시예 1에 따른 배지에서 세포를 배양하였다. 용기 배열은 정지 위치에서, 탄소 디스크가 연전히 유체로 덮여 있도록 선택하였다. 세포가 완전히 고정화할때까지 대기한 후, 탄소 디스크와 함께 용기를, 액체가 상응하는 라인을 통해 제2 액체 용기로 부터 배출되고 탄소 디스크를 통과할 수 있도록 기계적으로 낮추었다. 이어서 용기를 다시 정지 위치로 올렸다. 전체 공정에 대한 순환 시간은 30초이다. 당해 순환의 잇점은 배지를 이동시키는데 필요한 힘이 카트리지를 승강 및 하강시킴에 의해 생성됨에 따라 배지와의 접촉이 요구되지 않는다는 것이다.
배양 시간 7일 이내에, 세포 밀도는 ml당 1.8 x 107으로 7배 증가하였다. MAB 생산은 처음 50㎍/ml에서 평균 배양 시간동안 350㎕/ml로 증가하였고 단백질 가수분해에 대한 징후를 나타내지 않았다. 25일 후에, 12개의 샘플중 12개는 여전히 생존하였고 이후 실험을 종료하였다. 이것은 본 발명의 지지체/기질이 세포 밀도가 보다 높지만 접촉 억제를 중단시킴을 보여준다. 냉동보존 및 해동후에도, MAB 생산은 신선한 배지를 첨가한 후에 자발적으로 개시되었다.

Claims (27)

  1. a) i) 필수적으로 서로의 정상부에 배열되고, 이들 사이에서 유체 통과가능한 상호공간이 존재하는 2개 이상의 다공성 물질층, 또는
    ii) 이의 형태를 유지하면서 그 자체가 상향으로 감기거나 유체 통과가능한 상호공간이 서로 정상부에 있는 2개 이상의 물질층 부분 사이에 존재하는 방식으로 배열된 하나 이상의 다공성 물질층을 포함하는, 적층 구조를 갖는 탄소계 지지체를 제공하는 단계;
    b) 지지체에 생존하고/또는 증식가능한 생물학적 물질층을 로딩하는 단계; 및
    c) 로딩된 지지체와 유체 매질을 접촉시키는 단계
    를 포함하는 세포를 배양하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    지지체가 다수의 물질층을 포함하고, 서로의 정상부에 배열된 각각 2개의 물질층 사이에 하나 이상의 상호공간이 존재함을 특징으로 하는
    방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    각각 2개의 물질층 사이 또는 상향으로 감긴 하나의 물질층 사이에 상호공간이, 필수적으로 서로 평행하게 위치하는 다수의 채널을 갖고 있음을 특징으로 하는
    방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    필수적으로 각각 서로 평행하게 배열된 채널의 평균 직경이 약 1nm 내지 약 1m, 특히, 1nm 내지 약 10cm, 바람직하게 10nm 내지 10mm, 및 특히 바람직하게는 50nm 내지 1mm임을 특징으로 하는
    방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    각각 제 1 및 제 2 물질층 사이의 채널이 제 2 물질층과 제 3 물질층 사이의 인접한 층에서의 채널에 대해 특정 각도의 오프셋과 함께 배열되고, 지지체가 하나에 대해 교차하는 각의 오프셋인 채널층을 나타내도록 각도가 0°초과 내지 90°, 바람직하게는 30 내지 90°, 및 특히 바람직하게는 45 내지 90°임을 특징으로 하는
    방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    필수적으로 평행하게 위치하는 채널들이 층내에서 선형, 파도형, 굴곡형 또는 지그재그형임을 특징으로 하는
    방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다공성 물질층 및/또는 채널 벽의 평균 공극 크기가 약 1nm 내지 10cm, 바람직하게는 10nm 내지 10mm, 및 특히 바람직하게는 50nm 내지 1mm임을 특징으로 하는
    방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다공성 지지체로서, 섬유, 종이, 직물 또는 중합체 물질을 기초로 하는 임의로 구조화되고, 감기고, 엠보싱되고, 전처리되고/또는 폴딩된 쉬트 물질의 탄소화에 의해 생성되는 모듈 구조가 사용됨을 특징으로 하는
    방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 물질이 단세포 또는 다세포 미생물, 진균류, 효모, 포자, 식물 세포, 세포 배양물, 또는 조직 또는 동물 및/또는 사람 세포, 세포 배양물 또는 조직, 또는 이의 혼합물로부터 선택됨을 특징으로 하는
    방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    지지체의 로딩이 지지체내에서 및/또는 이의 위에서 실질적으로 생물학적 물질의 광범위한 고정화를 유도함을 특징으로 하는
    방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    매질이 액체 또는 기체, 용매, 물, 기체 또는 액체 또는 고체 반응 추출물 및/또는 생성물, 효소, 세포 및 조직에 대한 액체 배지, 및 이의 혼합물로부터 선택됨을 특징으로 하는
    방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    지지체가, 하우징내, 또는 플라스크, 병, 특히, 세포 배양 병, 롤러 병, 회전 병, 배양 튜브, 세포 배양 챔버, 세포 배양 접시, 배양 플레이트, 피펫 캡, 스냅 커버 유리, 냉동튜브, 진탕 반응기, 고정화된 베드 반응기, 관형 반응기 등과 같은 화학적 또는 생물학적 반응을 위한 반응기로부터 선택되는 적합한 용기내 또는 이의 위에 배열됨을 특징으로 하는
    방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    지지체가, 적어도 부분적으로 용기를 충전시킴에 의해 유체 매질과 접촉하게됨을 특징으로 하는
    방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    지지체가 용기내 매질에서 이동함을 특징으로 하는
    방법.
  15. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    용기가 공급 장치에 의해 매질로 충전된 공급 용기에 연결되어 있고, 임의로 매질을 연속적으로 또는 불연속적으로 용기내로 및 이를 통해 통과시키는 제거 장치가 장착되어 있음을 특징으로 하는
    방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유체 매질이 임의로 용기내에 침지된 지지체를 통해 연속적으로 또는 불연속적으로 유동함을 특징으로 하는
    방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    지지체를 통한 유체 매질의 유동이 매질내 지지체를 이동시킴에 의해 성취됨을 특징으로 하는
    방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    지지체를 통한 유체 매질의 유동이 지지체내 매질을 이동시킴에 의해 성취됨을 특징으로 하는
    방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    영양물이 매질과 함께 연속적으로 또는 불연속적으로 제공되고/되거나 대사물이 매질과 함께 연속적으로 또는 불연속적으로 제거됨을 특징으로 하는
    방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은, 생존하고/또는 증식할 수 있는 고정화된 생물학적 물질을 포함하는 탄소계 다공성 지지체.
  21. 제 20 항에 있어서,
    생물학적 물질이 단세포 또는 다세포 미생물, 효모, 진균류, 포자, 식물 세포, 세포 배양물 또는 조직 또는 동물 및/또는 사람 세포, 세포 배양물 또는 조직 또는 이의 혼합물로부터 선택됨을 특징으로 하는
    지지체.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    활성탄, 소결 활성탄, 무정형, 결정 또는 부분적인 결정성 탄소, 흑연, 열분해 탄소성 물질, 탄소 섬유 또는 카바이드, 탄질화물, 금속 또는 비금속의 옥시탄화물 또는 옥사탄질화물 뿐만 아니라 이의 혼합물로 이루어진
    지지체.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    로딩된 지지체의 총중량을 기준으로 10-5 중량% 내지 99중량%, 바람직하게는 10-2중량% 내지 80중량%, 가장 바람직하게 1 내지 50중량%의 세포를 함유함을 특징으로 하는
    지지체.
  24. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 지지체를 포함하 는 세포 배양용 반응기.
  25. 제 24 항에 있어서,
    플라스크, 병, 특히, 세포 배양 병, 롤러 병, 회전 병, 배양 튜브, 세포 배양 챔버, 세포 배양 접시, 배양 플레이트, 피펫 캡, 스냅 커버 유리, 냉동튜브, 진탕 반응기, 고정화된 베드 반응기, 관형 반응기 등과 같은 화학적 또는 생물학적 반응을 위한 반응기로부터 선택되는
    반응기.
  26. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 지지체를 포함하는 롤러 병.
  27. 하우징내에 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 지지체를 포함하는 카트리지.
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