EP1673443A1

EP1673443A1 - Zellkultivierungs- und aufzuchtverfahren

Info

Publication number: EP1673443A1
Application number: EP04763711A
Authority: EP
Inventors: Jörg RATHENOW; Jürgen Kunstmann; Andreas Ban; Sohéil ASGARI
Original assignee: Blue Membranes GmbH
Current assignee: Cinvention AG
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2004-08-02
Publication date: 2006-06-28

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, umfassend die Schritte Bereitstellen eines Trägerkörpers auf Kohlenstoffbasis mit schichtartigem Aufbau, umfassend mindestens zwei im Wesentlichen übereinander angeordnete und miteinander verbundene poröse Materiallagen, zwischen denen ein durchströmbarer Zwischenraum besteht; oder mindestens eine poröse Materiallage die formhaltend so in sich aufgerollt oder angeordnet ist, dass zwischen mindestens zwei übereinander liegenden Abschnitten der Materiallage ein durchströmbarer Zwischenraum besteht; Beladen des Trägerkörpers mit lebendem und/oder vermehrungsfähigem biologischen Material; und Kontaktieren des beladenen Trägerkörpers mit einem fluiden Medium.

Description

Zellkultivierungs- und Aufzuchtverfahren

In der Bioreaktorprozesstechnik hat sich mittlerweile etabliert, Trägermaterialien zur Vergrößerung der Oberfläche einzusetzen. Bisherige Systeme nutzen hauptsächlich ungeordnete Strukturen in Form von Granulaten, Flocken, Scheiben, Kapillaren, Netzen, Kugeln, etc., wobei die eingesetzten Materialien hauptsächlich aus Keramik oder Polymeren bestehen. Diese Systeme weisen meist einen hohen Druckverlust und eine begrenzte Oberflächen zu Volumenausbeute auf. Auch ist hierbei häufig eine Limitierung in der Größe der Formkörper gegeben (Druckverlust, Gewicht, Kosten, Packungswechsel, etc.), die ein prozesstechnisches Scale-up erschweren. Außerdem neigen Polymere zu chemischer oder physikalischer Verändemng während der Nutzung oder Sterilisation. Außerdem kann bei ungeordneten Packungen eine gleichmäßige, homogene Nährstoffversorgung sowie eine Reproduzierbare Füllung nicht immer sichergestellt werden. Auch Toträume und bevorzugte Strömung an den Behälterwänden führt zu unterschiedlichen Stoffwechselbedingungen, die die Produkteigenschaften von z.B. empfindlicher Proteine in ihrer Faltung beeinflussen können.

Reaktionen im industriellen Maßstab erfordern hohe Durchsätze und unterliegen ökonomischen Gesichtspunkten. Um die Stoffwechselprodukte besser vom Zellgemisch abtrennen zu können oder anschließend wieder verwenden zu können, immobilisiert man die Zellen oder Zellkulturen auf Feststoffsubstraten. Hierdurch erreicht man eine Trennung von beispielsweise scherkraftempfindlichen Zellen und umgebendem Medium. Setzt man beispielsweise eine Membran als Wand des Forrnkörpers ein und verwendet z.B. eine Kreuzgeometrie, so hat man die

Möglichkeit kontinuierlich gasförmige Stoffwechselprodukte blasenfrei zu den Zellen zu bringen bzw. gewünschte Stoffwechselprodukte auf einer Membranseite anzureichern. Dies erleichtert die Nährstoffversorgung, den

Stoffwechselproduktaustausch sowie die Messung der Prozessparameter und führt so zu einer signifikanten Prozessintensivierung. Die Immobilisierung der Zellkulturen ermöglicht auch eine kontinuierliche Prozessführung mit kontinuierlicher Versorgung sowie Ernte vom Produkt.

Darüber hinaus erlauben Verfahren mit immobilisierten Zellkulturen hohe Zelldichten, so dass vergleichsweise hohe Reaktionsgeschwindigkeiten und damit kleiner dimensionierte Anlagen möglich sind sowie die Ausbeute drastisch gesteigert werden kann. Mit immobilisierten Zellkulturen aus gentechnisch modifizierten Säugetierzelllinien, für beispielsweise Fermentationsprozesse, werden höhere Reaktionsgeschwindigkeiten als mit suspensionsständigen Zellkulturen erreicht.

Besonders im Zusammenhang mit "lebenden katalytischen Einheiten" ist darauf zu achten, dass das Substrat biokompatibel ist, sich leicht sterilisieren lässt, einen guten Haftgrund für die Zelle bietet und der Immobilisierungsvorgang schonend verläuft. Ferner ist es notwendig den Träger an die Bedürfnisse der unterschiedlichen Zellkulturen oder Zellen anzupassen. Hierbei spielt die Porengröße und die

Trägerzusammensetzung eine Rolle. Es existieren bereits einige Verfahren zur Immobilisierung von Zellkulturen oder Zellen.

Die DE 693 11 134 beschreibt beispielsweise einen Bioreaktor mit immobilisierten Milchsäurebakterien, wobei die Bakterien auf einen porösen Träger aufgebracht sind. Der Träger besteht aus einer Matrix aus einer Vielzahl von lose miteinander verbunden Mikropartikeln oder Mikrofasern. Bevorzugt wird Zellulose oder Rayon und deren Derivate eingesetzt. Die Agglomeration erfolgt vorzugsweise mit Polystyrol.

Die WO 01/19972 beschreibt einen Immobilisierungsprozess, in dem die Zellkulturen mit einer Polymervorstufe vermischt werden und durch die nachfolgende Vernetzung des Polymers immobilisiert werden.

Auch können Zellkulturen auf offenporigen „mineralischen" Schüttstoffen immobilisiert werden, wie in der WO 94/10095 beschrieben wird. Beispiele sind Blähton, Blähschiefer, Lava, Bims, Perlite und Ziegelsplitt.

Ferner wird in der WO 00/06711 die Immobilisierung von Zellkulturen oder Enzymen auf Kieselgur als Trägermaterial beschrieben.

In EP 1270533 wird der Einsatz von kristalliner Oxidkeramik gemischt mit amorpher polyanionischer intergranularer Phase in Form von Granulat und Scheiben beschrieben.

Die vorgenannten Verfahren weisen gewisse Nachteile auf. Die Trägermatrices lassen sich beispielsweise nicht beliebig modifizieren, oder das Trägermaterial weist eine mindere Biokompatibilität auf oder die Immobilisierung ist verlustreich.

Das Immobilisieren von Zellkulturen in einer Polymermatrix durch Quervernetzen einer Polymervorstufe/Zellkulturen-Mischung führt beispielsweise aufgrund von giftigen Reaktionsprodukten oder -edukten, wie etwa Vernetzungsmittel, häufig dazu, dass viele Zellkulturen während der Polymerreaktion absterben. Ferner sind die vernetzten Polymere häufig quellbar und damit nicht formstabil und verursachen eine Veränderung von Strömungsverhältnissen bzw. dadurch mechanischen Stress in den Zellen.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, hoch biokompatible, flexibel einsetzbare und an den jeweiligen Verwendungszweck gezielt anpassbare Trägerkörper zur Immobilisierung von lebendem und/oder vermehrungsfähigem biologischen Material zur Verfügung zu stellen. Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Zeilkultivierungsverfahren zur Verfügung zu stellen, welches die genannten Trägerkörper verwendet. Bevorzugt ist dieses Verfahren für Anwendungen im Labor- und/oder industriellen Maßstab geeignet.

Zusammenfassung der Erfindun

Die obige Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausfuhrungsformen ergeben sich durch Kombination mit den in den Unteransprüchen angegebenen Merkmalen.

Im allgemeinsten Aspekt gibt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines porösen Körper auf Kohlenstoff basis zur Immobilisierung von biologischem Material für chemische und/oder biologische Reaktionen an. Hierzu wird ein Verfahren zur Zellkultivierung beschrieben, welches poröse Trägerkörper, beladen mit biologischem Material verwendet. Geeignete mit biologischem Material beladene Trägerkörper auf Kohlenstoffbasis werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.

Die erfindungsgemäße Lösung beinhaltet ein Verfahren zur Kultivierung von Zellkulturen auf geordneten, gezielt durchströmbaren Kohlenstoffpackungen mit Fluiden, vorteilhafterweise bei geringem spezifischem Druckverlust. Durch die geordnete Packung der erfindungsgemäßen Trägerkörper werden einerseits gleichmäßige Strömungsverhältnisse mit höchstem Oberfläche zu Volumenverhältnis zwecks Nutrition der Zellkulturen, andererseits auch eine vorteilhafte Trennung der Kompartimente in Zellkultur und Medium erreicht. Vorzugsweise weisen die Trägerkörper kanalartige Strukturen zwischen übereinander angeordneten Materiallagen oder einzelnen Abschnitten davon auf. Durch Variation der Strömungskanaldurchmesser sowie der Kanalwandstärken und/oder der Materiallagendicke lassen sich für jeden Anwendungsfall erfindungsgemäß flexibel optimale Verhältnisse im Trägerkörper einstellen. Die Strömungsverhältnisse können beispielsweise durch Veränderung der Kanalgeometrie in Flussrichtung (z.B. wellenförmige Kanäle), durch Variation des Durchmessers und durch Variation der Oberflächeneigenschaften der Kohlenstoffoberfläche wie z.B. Membraneigenschaften, Rauhigkeit, Porosität, Hydrophilie, Hydrophobie, Oleophilie, Oleophobie, pH- Wert, Imprägnierung mit Wirkstoffen und/oder Katalysatoren, etc., auf die benötigten Kulturbedingungen eingestellt werden.

Innerhalb jedes Zwischenbereichs zwischen je zwei Materiallagen oder Abschnitten davon bzw. innerhalb der Strömungskanäle des erfindungsgemäßen Trägerkörpers werden somit definiert gleichmäßige Versorgungsbedingungen wie auch Substratbedingungen des Trägermaterials sichergestellt, so dass die Zellkulturen immer optimale Wachstumsbedingung bei sehr hohen Zelldichten eingestellt werden können. Die erfindungsgemäßen Trägerkörper lassen sich einfach in Gehäuse oder Behälter einbauen und in dieser Form als Kartuschen einzeln oder zu mehreren in industriellen oder Labormaßstabsreaktoren für Verfahren zur Zellkultivierung und - Züchtung verwenden. Erfindungsgemäß ist damit eine absolute Reproduzierbarkeit der Strömungs- und Substratverhältnisse für jede gleich hergestellte Kartusche sichergestellt, was beispielsweise für Zulassungsverfahren im pharmazeutischen Sektor eine sehr große Vereinfachung darstellt.

Die Wechselwirkung des erfindungsgemäßen Trägerkörpers und der z.B. leicht darauf immobilisierten Zellkulturen mit dem Medium kann hierbei im erfindungsgemäßen Verfahren auf mehrere Arten erfolgen, beispielsweise durch: Strömung des Mediums durch die Trägerkörper/Kartuschen durch Bewegung des Mediums (z.B. mittels Kolben, Druck, Pumpen, etc.) - Bewegung des Trägerkörpers / der Kartusche im Medium - Bewegung des Trägerkörpers / der Kartusche mit Medium über korrespondierende Leitungen (z.B. mittels hydrostatischem Druck)

Aufgrund der hohen chemischen und physikalischen Beständigkeit von Kohlenstoff ist eine Sterilisation der erfindungsgemäßen Trägerkörper mit den gängigen Sterilisationsverfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, unproblematisch. Dies ermöglicht beispielsweise ein optimales Wachstum von Zellkulturen, da die Zellen rasch und adhärent bzw. adhesiv auf der Kohlenstoffoberfläche der Trägerkörper siedeln und somit vom umgebenden Medium im Sinne einer Kompartimentbildung im Wesentlichen abgekoppelt werden können. Hierdurch werden sehr große Zelldichten erreicht, bei gleichmäßiger und kontrollierbarer Nährstoffversorgung, Stoffwechselproduktentsorgung sowie die Ernte von Zellkulturprodukten erheblich verbessert.

Gemäß dem Verfahrensaspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen eines Trägerkörpers auf Kohlenstoffbasis mit schichtartigem Aufbau, umfassend: ii) mindestens zwei im Wesentlichen übereinander angeordnete poröse Materiallagen, zwischen denen ein durchströmbarer Zwischenraum besteht; oder ii) mindestens eine poröse Materiallage die formhaltend so in sich aufgerollt oder angeordnet ist, dass zwischen mindestens zwei übereinander liegenden Abschnitten der Materiallage ein durchströmbarer Zwischenraum besteht; b) Beladen des Trägerkörpers mit lebendem und/oder vermehrungsfähigem biologischen Material; c) Kontaktieren des beladenen Trägerkörpers mit einem fluiden Medium.

Im Produktaspekt umfasst die erfindungsgemäße Lösung obiger Aufgaben einen porösen Trägerkörper auf Kohlenstoff basis mit schichtartigem Aufbau, umfassend ii) mindestens zwei im Wesentlichen übereinander angeordnete poröse Materiallagen, zwischen denen ein durchströmbarer Zwischenraum besteht; oder ii) mindestens eine poröse Materiallage die formhaltend so in sich aufgerollt oder angeordnet ist, dass zwischen mindestens zwei übereinander liegenden Abschnitten der Materiallage ein durchströmbarer Zwischenraum besteht; umfassend immobilisiertes lebendes und/oder vermehrungsfähiges biologisches Material.

Figurenbeschreibung Figur 1 zeigt schematisch eine Ausführungsform erfindungsgemäßer Trägerkörper mit schichtartiger Form. Figur 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform erfindungsgemäßer zylindrischer Trägerkörper mit kreisförmiger Anströmfläche. Figur 3 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Zellkultivierungsverfahrens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform.

Figur 4 zeigt schematisch eine weitere Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Zellkultivierungsverfahrens gemäß einer alternativen bevorzugten Ausführungsform.

Die Figur 1 zeigt schichtartig aufgebaute Ausführungsformen erfindungsgemäßer Trägerkörper. Der in Figur 1 A in perspektivischer Ansicht gezeigte Trägerkörper 1 umfasst mehrere alternierend übereinander angeordnete Materiallagen 2,3, wobei jeweils eine erste Materiallage 2 mit einer darüber angeordneten ggf. strukturierten, z.B. gewellten oder gefalteten Materiallage 3 verbunden ist, so dass zwischen den Materiallagen 2 und 3 ein Zwischenraum besteht, umfassend eine Vielzahl von parallelen durchströmbaren Kanälen 4 bestehen. Im einfachsten Fall kann man sich den Trägerkörper der Figur 1 A als einen Wellpappkartonstapel vorstellen. Wenn die strukturierten Materiallagen alternierend gegeneinander in einem Winkel, z.B. 90°, versetzt angeordnet werden, ergibt sich ein Trägerkörper wie in Figur 1B dargestellt, der kreuzweise in den Kanälen 4, 4' durchströmt werden kann. Dieser Trägerkörper ist an seinen stirnseitigen Oberflächen im Wesentlichen offen und weist durch die kreuzweise gegeneinander versetzten Wellenstrukturschichten zwei zueinander versetzte mögliche Durchströmungsrichtungen des Trägerkörpers auf. Alternativ zu strukturierten Materiallagen könne erfindungsgemäß wie in Figur IC gezeigt auch zwei oder mehrere im Wesentlichen flache Materiallagen 2,3 übereinander angeordnet werden, von denen jeweils zwei durch Abstandselemente 5 verbunden sind, so dass im Zwischenraum der Materiallagen 2,3 eine Vielzahl von durchströmbaren Kanälen 4 vorliegen.

Figur 2 zeigt eine weitere Ausführungsform des Trägerkörpers der vorliegenden Erfindung. Die Draufsicht auf den zylindrischen Trägerkörper 6 in Figur 2A zeigt eine spiralförmig aufgerollte gewellte Materiallage 7. Durch die Wicklung ergeben sich eine Vielzahl von Bereichen, wodurch jeweils auf einem Abschnitt 8 der Materiallage in der nächsten Windung ein weiterer Abschnitt 8' der Materiallage 7 aufliegt, so dass zwischen den Abschnitten 8 und 8' Zwischenraumkanäle 9 vorliegen. Wie in Figur 2B zu sehen ist der Trägerkörper 6 zylindrisch aufgebaut durch Aufwickeln bzw. Aufrollen eines Flächengebildes mit wellenförmiger Strukturierung. Entsprechende Trägerkörper lassen sich beispielsweise durch Aufrollen von Wellpappe zu einem zylindrischen Formkörper aufrollen. Durch Karbonisierung des entsprechenden Wellpappmaterials lassen sich so zylindrische Formkörper 6 erhalten, die in Richtung der Zylinderhöhe von einer Vielzahl von Kanälen 9 durchzogen sind. Somit ergibt sich ein im Wesentlichen unidirektional durchströmbarer zylindrischer Trägerkörper 7 mit einer kreisförmigen Stirnseite (Figur 2A).

Die Figur 3 zeigt eine Schemazeichnung einer bevorzugten Ausführungsform einer Vorrichtung bzw. eines Reaktors 10 zur Durchführung des Zellkultivierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung. Ein Trägerkörper 11, beispielsweise in Form eines Zylinders wie in Figur 2 oder eines Blocks wie in Figur 1 gezeigt liegt auf einer geeigneten Halterung 12, beispielsweise einem Siebboden in einem Reaktorgefäß 13. Dieses Reaktorgefäß 13 ist über eine Ausgleichsleitung 14 mit einem Ausgleichsund Vorratsbehälter 15 verbunden, in welchem das fluide Medium 16, beispielsweise ein Nährmedium enthalten ist. Das Reaktorgefäß 13 ist über eine geeignete Vorrichtung 17 auf- und abwärts bewegbar gegenüber dem Ausgleichsbehälter 15. Beim Abwärtsbewegen des Reaktorgefäßes 13 fließt Medium 16 aus dem Vorratsbehälter 15 über die Leitung 14 in das Reaktorgefäß 13, so dass der

Trägerkörper 11 teilweise oder vollständig in das Nährmedium eingetaucht wird, je nach vertikaler Ausrichtung der Reaktorgefäßes 13 gegenüber dem Flüssigkeitsstand im Vorratsbehälter 15. Durch regelmäßiges Auf- und Abbewegen des Reaktorgefäßes 13 wird der Trägerkörper 11 beispielsweise zyklisch in das Nährmedium 16 eingetaucht und wieder herausgehoben, so dass der Trägerkörper 11 von Medium 16 durchspült wird. Das Reaktorgefäß 13 kann gegebenenfalls luftdicht verschlossen werden und der über dem Medium vorhandene Gasraum im Reaktorgefäß 13 kann gegebenenfalls mit Inertgas befüllt werden, wobei gegebenenfalls eine Druckausgleichsvorrichtung vorzusehen ist. Durch Auf- und Abbewegen des Reaktorgefäßes wird auch das Medium 16 so in den Strömungskanälen des Trägerkörpers 11 bewegt, so dass eine gleichmäßige Versorgung von Mikroorganismen oder Zellen bzw. Zellgeweben mit beispielsweise Feuchtigkeit, Nährstoffen oder dergleichen ermöglicht wird. Gleichzeitig können über das Medium 16 von auf dem Trägerkörper 11 immobilisierten Mikroorganismen Zellen oder sonstigem biologischen Material erzeugte Stoffwechselprodukte aus dem Trägerkörper 11 abgeführt werden. Diese Stoffwechselprodukte reichern sich im Medium 16 an und können daraus über die Ausgleichsleitung 14 oder den Vorratsbehälter 15 diskontinuierlich oder kontinuierlich entnommen werden, beispielsweise durch Extraktion oder ähnliche Trennverfahren.

Figur 4 zeigt eine weitere Ausführungsform einer Vorrichtung 18 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Zellkultivierungsverfahrens, welche nach dem Druckwechselprinzip arbeitet. In einem Reaktorgefäß 19 mit zwei übereinander angeordneten Kammern 20, 21 befindet sich in der oberen Kammer 20 ein erfindungsgemäßer Trägerkörper 22, beispielsweise in Form eines Zylinderabschnitts des Trägerkörpers wie in Figur 2 gezeigt, oder in Blockform wie in Figur 1 gezeigt. Dieser Trägerkörper 22 weist eine radiale Bohrung auf, durch welche über einen Differenzdruckeingang 23 Druckluft in einen in der unteren Reaktorkammer 20 liegenden Verdrängungsraum 24 eingeführt werden kann. Die beiden Kammern 20,21 des Reaktorgefäßes 19 sind durch eine durchlässige Reaktortrennwand 25 voneinander abgetrennt, die beispielsweise ein Siebboden sein kann, auf welchem der Trägerkörper 22 aufliegt. Zum Betrieb des Reaktors wird die untere Reaktorkammer 20 mit fiuidem Medium 26, beispielsweise einer Nährlösung für Mikroorganismen oder Zellen befüllt, so dass der Flüssigkeitspegel unterhalb der Reaktortrennwand 25 verbleibt. Wird nun über den Differenzdruckeingang 23 Druckluft in den Verdrängungsraum 24 eingeführt, so wird nach dem Tauchglockenprinzip ein Teil der Nährlösung 26 in der unteren Reaktorkammer 20 verdrängt und durch die Reaktortrennwand 25 nach oben gedrückt, wodurch der Trägerkörper 22 in Kontakt mit der Nährlösung 26 kommt. Über eine Druckausgleichsöff ung 27 in der oberen Reaktorkammer 21 wird der bestehende Überdruck in der oberen Reaktorkammer abgegeben. Durch regelmäßiges oder unregelmäßiges Unterdrucksetzen und Entlasten der unteren Reaktorkammer 20 über den Differenzdruckeingang 23 in den Verdrängungsraum 24 wird der Trägerkörper 22 mit Nährlösung 26 durchspült. Dabei kann der Trägerkörper 22 vollständig oder teilweise in das Medium 26 eingetaucht werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Trägerkörper Erfindungsgemäße Trägerkörper auf Kohlenstoff basis weisen als Trägermaterialien für Zellkulturen oder Zellen eine hervorragende Biokompatibilität auf, sind frei von toxischen Emissionen, formstabil und äußerst variabel bezüglich ihres Aufbaus, wie etwa Porengrößen, innere Struktur und äußere Form, herstellbar. Ferner lassen sich die erfindungsgemäßen porösen Körper leicht sterilisieren und bieten einen guten Haftuntergrund für Mikroorganismen, Zellkulturen und Zellen, sowie allgemein lebendes bzw. vermehrungsfähiges biologisches Material. Aufgrund dieser Eigenschaften lassen sich diese porösen Körper auf Kohlenstoffbasis für eine Vielzahl von Anwendungen maßgeschneidert anpassen. Bevorzugt bestehen die porösen Trägerkörper überwiegend aus amorphen und/oder pyrolytischem und/oder glasartigem Kohlenstoff, vorzugsweise ausgewählt aus Aktivkohle, gesinterter Aktivkohle, amorphem, kristallinem oder teilkristallinem Kohlenstoff, Graphit, pyrolytisch erzeugtem kohlenstoffhaltigen Material, Kohlefaser, oder Carbiden, Carbonitriden, Oxycarbiden bzw. Oxycarbonitriden von Metallen oder

Nichtmetallen, sowie aus Mischungen dieser, oder ähnlichen kohlenstoffbasierten Materialien. Besonders bevorzugt sind die porösen Trägerkörper der vorliegenden Erfindung aus im Wesentlichen aus Kohlenstoff bestehendem, pyrolytisch erzeugtem Material.

Gegebenenfalls besonders bevorzugt werden die Trägerkörper durch Pyrolyse/Karbonisierung von Ausgangsmaterialien hergestellt, die unter hoher Temperatur in Sauerstoffreier Atmosphäre zu den genannten kohlenstoffhaltigen Materialien umgewandelt werden. Geeignete Ausgangsmaterialien zur Karbonisierung in erfindungsgemäße Trägerkörper sind beispielsweise Polymere, Polymerfilme, Papier, imprägniertes bzw beschichtetes Papier, Wovens, Nonwovens, beschichtete Keramikscheiben, Watte, Wattestäbe, Wattepellets,

Zellulosematerialien, oder z.B. Hülsenfrüchte wie Erbsen, Linsen, Bohnen und dergleichen auch Nüsse, Trockenfrüchte und dergleichen sowie auf Basis dieser Materialien hergestellter Grünkörper.

Mit "kohlenstoffbasiert" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Materialien bezeichnet, die einen Kohlenstoffanteil vor einer eventuellen Modifizierung mit Metallen von mehr als 1 Gew.-%, insbesondere mehr als 50 Gew.- %, vorzugsweise mehr als 60 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 70 Gew.-%, etwa mehr als 80 Gew.-% und insbesondere mehr als 90 Gew.-% aufweisen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen die erfindungsgemäßen kohlenstoffhaltigen Trägerkörper zwischen 95 und 100 Gew.-% Kohlenstoff auf, insbesondere 95 bis 99 Gew.-%.

Bevorzugt ist, dass der Trägerkörper eine Vielzahl von übereinander angeordneten Materiallagen umfasst, zwischen denen jeweils ein durchströmbarer Zwischenraum angeordnet ist. Bevorzugt umfasst jeder Zwischenraum kanalartige Strukturen, beispielsweise eine Vielzahl von im Wesentlichen parallel zueinander, gekreuzt oder netzwerkartig verlaufenden Kanälen. Die kanalartigen Strukturen können beispielsweise durch eine Vielzahl von Abstandselementen, die auf den Trägermateriallagen angeordnet sind und diese voneinander beabstandet gewährleistet sein. Die Kanäle bzw. kanalartigen Strukturen weisen vorzugsweise mittlere Kanaldurchmesser im Bereich von etwa 1 nm bis etwa 1 m, insbesondere von etwa 1 nm bis etwa 10 cm auf, vorzugsweise 10 nm bis 10 mm, und besonders bevorzugt 50 nm bis 1 mm. Der Abstand zwischen jeweils zwei benachbarten Materiallagen wird im Wesentlichen identische Dimensionen aufweisen.

Der erfindungsgemäße Trägerkörper ist besonders bevorzugt so aufgebaut, dass die Kanäle zwischen jeweils einer ersten und einer zweiten Materiallage und die Kanäle in einer angrenzenden Schicht zwischen der zweiten und einer dritten Materiallage ein im Wesentlichen in gleichlaufender Richtung angeordnet sind, so dass der Trägerköφer insgesamt in einer Vorzugsrichtung durchströmbare Kanalschichten aufweist. Alternativ kann der Trägerköφer auch so gestaltet sein, dass die Kanäle zwischen jeweils einer ersten und einer zweiten Materiallage gegenüber den Kanälen in einer angrenzenden Schicht zwischen der zweiten Materiallage und einer dritten Materiallage in einem Winkel von größer als 0° bis zu 90°, vorzugsweise 30 bis 90° und besonders bevorzugt 45 bis 90°, versetzt angeordnet sind, so dass der Trägerköφer alternierend gegeneinander in einem Winkel versetzte Kanalschichten aufweist.

Die Kanäle bzw. kanalartigen Strukturen im erfindungsgemäßen Trägerköφer sind endseitig an beiden Enden der Kanäle im Wesentlichen offen, so dass der erfindungsgemäße Köφer insgesamt eine Art "Sandwichstruktur" aufweist, schichtartig aufgebaut alternierend aus porösen Materiallagen und dazwischenliegenden durchströmbaren Zwischenräumen, vorzugsweise Kanalschichten. Die Kanäle bzw. kanalartigen Strukturen können erfindungsgemäß in ihrer Längsrichtung linear verlaufen, oder z.B. wellenförmig, mäandrierend oder zickzackfbrmig sein, und dabei innerhalb eines Zwischenraums zwischen zwei Materiallagen parallel oder gekreuzt zueinander verlaufen.

Die äußere Form und Dimensionierung des erfindungsgemäßen Trägerköφers kann dem jeweiligen Anwendungszweck entsprechend gewählt und angepasst werden. Der Trägerköφer kann eine äußere Form aufweisen, die beispielsweise ausgewählt ist aus länglichen Formen wie zylindrisch, mehreckssäulenfbrmig wie etwa dreieckssäulenförmig oder barrenförmig; oder plattenförmig, oder mehreckförmig, wie quadratisch, quaderförmig, tetraedrisch, pyramidal, oktaedrisch, dodekaedrisch, ikosaedrisch, rhomboid, prismenförmig, oder sphärisch, wie etwa kugelförmig, hohlkugeli rrnig, sphärisch oder zylindrisch linsenförmig, oder Scheiben- oder ringförmig.

Erfindungsgemäße Trägerköφer können in geeigneter Weise auf die vorgesehene Anwendung bezogen dimensioniert werden, beispielsweise mit Trägerköφervolumen im Bereich von ab 1 mm³, bevorzugt etwa 10 cm³ bis 1 m . In Fällen wo dies erwünscht ist, sind die Trägerköφer auch deutlich größer oder auch im noch kleineren Mikromaßstab dimensionierbar, die vorliegende Erfindung ist nicht auf bestimmte Dimensionen des Trägerköφers beschränkt. Der Trägerköφer kann eine längste äußere Dimension im Bereich von etwa 1 nm bis 1000m, vorzugsweise etwa 0,5 cm bis 50 m, besonders bevorzugt etwa 1 cm bis 5 m aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Trägerköφer scheibenförmig bzw. zylindrisch, mit einem Durchmesser im Bereich 1 nm bis 1000m, vorzugsweise etwa 0,5 cm bis 50 m, besonders bevorzugt etwa 1 cm bis 5 m.

Hierzu kann eine beispielsweise gewellte Materiallage spiralförmig zu einem zylindrischen Köφer aufgerollt sein; derartige Trägerköφer sind so gestaltet, dass eine Materiallage, ggf. gewellt, geprägt oder sonst wie strukturiert formhaltend spiralförmig so angeordnet ist, dass zwischen mindestens zwei übereinander liegenden Abschnitten der Materiallage ein durchströmbarer Zwischenbereich besteht, vorzugsweise mit einer Vielzahl kanalartiger Strukturen bzw. Kanälen.

Auch mehrere aufeinanderliegende Materiallagen können durch Aufrollen zu derartigen zylindrischen Trägerköφern geformt werden.

Die porösen Materiallagen und/oder die Kanalwände bzw. Abstandselemente zwischen den Materiallagen erfindungsgemäßer Trägerköφer können mittlere Porengrößen im Bereich von etwa 1 nm bis 10cm, vorzugsweise 10 nm bis 10 mm, und besonders bevorzugt 50 nm bis 1 mm aufweisen. Die porösen Materiallagen sind ggf. semipermeabel und haben im Allgemeinen eine Dicke von zwischen 3 Angström und 10 cm, bevorzugt von 1 nm bis 100 μm und am meisten bevorzugt von 10 nm bis lOμm. Der mittlere Porendurchmesser der porösen, ggf. semipermeablen, Materiallagen liegt zwischen 0,1 Angström und 1 mm, bevorzugt von 1 Angström bis 100 μm und am meisten bevorzugt von 3 Angström bis lOμm.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Trägerköφers der vorliegenden Erfindung werden die Materiallagen des Trägerköφers ein oder beidseitig, vorzugsweise beidseitig strukturiert. Eine bevorzugte Strukturierung der

Materiallagen besteht in Form eines aufgeprägten oder sonst wie eingebrachten Rillenmusters mit über die gesamte Fläche der Materiallagen im Wesentlichen äquidistant zueinander angeordneten Rillen bzw. kanalartigen Vertiefungen. Die Rillenmuster können bezüglich der äußeren Kanten der Materiallagen parallel verlaufen, in einem beliebigen Winkel hierzu angeordnet sein, Zickzack- Muster aufweisen oder wellenförmig sein. Femer können die Materiallagen, sofern beidseitig strukturiert, auf beiden Seiten identische Rillenmuster aufweisen, oder unterschiedliche Rillenmuster. Bevorzugt ist, dass die porösen Materiallagen beidseitig gleichförmig komplementär strukturiert sind, das heißt, dass die Rillenvertiefungen auf einer Seite der Materiallage einer entsprechenden Erhöhung im Profil der anderen Seite der Materiallage entsprechen. Vorzugsweise werden die Materiallagen im Trägerköφer so angeordnet, dass die Rillenmuster zweier benachbarter Materiallagen im Wesentlichen parallel zueinander verlaufen.

Femer können die Materiallagen so angeordnet werden, dass sich die Rillenmuster zweier benachbarter Materiallagen in einem Winkel kreuzen, so dass sich bei Aufeinanderlegen der Materiallagen eine Vielzahl von Berührungspunkten zwischen den benachbarten Materiallagen an den Stellen sich kreuzender erhabender Ränder der Rillenstrukturen benachbarter Materiallagen ergibt. Auf diese Weise werden Trägerköφer erhalten, die aufgrund der Verbindung an vielen Punkten entsprechend den Berührungspunkten der sich kreuzenden Rillenmuster eine deutlich erhöhte mechanische Stabilität aufweisen. Die Rillenstrukturen werden insbesondere so gewählt, dass sich beim Aufeinanderlegen zweier Materiallagen in den Zwischenbereichen zwischen jeweils zwei benachbarten Materiallagen eine kanal- oder netzwerkartige Struktur ergibt, die einer Vielzahl von Kanälen oder Röhren entspricht, und die einen geeigneten, möglichst geringen Strömungswiderstand im Trägerköφer gewährleistet. Der Fachmann wird die Rillenmuster in geeigneter Weise dimensionieren und auswählen. Übliche Rillenstrukturen in geprägten Materiallagen führen im erfindungsgemäßen Trägerköφer zu kanal- bzw. röhrenartigen Strukturen in Zwischenräumen, deren Querschnittsfläche dem jeweiligen Verwendungszweck angepasst werden kann.

Alternativ zur Rillen- oder Kanalprägung können die Materiallagen auch gewellt vorgeformt, oder im Zickzack Ziehharmonika-artig gefaltet sein. Beim Anordnen mehrerer derartiger Materiallagen flach aufeinander ergeben sich so in der stimseitigen Draufsicht auf den Trägerköφer wabenartige Strukturen, die in Richtung der Materiallagenebene als Kanalstrukturen fortlaufen. Beim Aufrollen derartig vorgeformter Materiallagen ergeben sich zylindrische Trägerköφer, deren Querschnitt eine Vielzahl von spiralförmig angeordneten Kanälen zeigt, die sich entlang der Längendimension des Zylinders erstrecken. Derartige Zylinder/Scheiben sind an beiden endseitigen Querschnittsflächen im wesentlichen offen.

Darüber hinaus können zwischen die Materiallagen alternativ oder zusätzlich Abstandselemente eingebracht sein bzw. vorgesehen sein. Entsprechende Abstandselemente dienen der Gewährleistung ausreichend großer Zwischenräume zwischen den Materiallagen, in welchen die Kanäle verlaufen, und die einen geeigneten geringen Strömungswiderstand des Moduls gewährleisten.

Entsprechende Abstandselemente können poröse, offenporige Flächengebilde in Form von Zwischenlagen, Netzstrukturen sein, oder auch an den Materiallagen kantenseitig oder zentral angeordnete Spacer, die einen bestimmten Mindestabstand zwischen den Materiallagen gewährleisten.

Die erfindungsgemäßen Trägerköφer weisen Zwischenschichten bzw. Kanäle bzw. Kanalschichten auf, die endseitig an beiden Enden der Kanäle bzw. Schichten im Wesentlichen offen sind. Erfindungsgemäße Trägerköφer sind stim- und kantenseitig der Materiallagen bzw. an den Ein- oder Ausgängen der Kanäle nicht verschlossen oder gegenüber Fluiden abgedichtet.

Besonders bevorzugt wird der Abstand der Materiallagen zueinander dadurch gewährleistet, dass durch entsprechend dimensionierte Rillenprägungen, Faltungen oder Wellungen und ein Kreuzen der Rillen- Falt- oder Wellmuster zweier benachbarter Materiallagen in einem bestimmten Winkel sich wie oben erwähnt eine Vielzahl von Berührungspunkten zwischen den benachbarten Materiallagen an den Stellen sich kreuzender erhabener Ränder der Strukturen ergibt, welche gewährleisten, dass entlang der Vertiefungen in den Materiallagen Zwischenräume in Form einer Vielzahl von kanalartigen Strukturen entsteht. Analog kann dies auch durch alternierend verschieden breite Falze oder Wellungen der Materiallage bewerkstelligt werden.

Fe er können die Materiallagen auch dadurch beabstandet sein, dass auf den Materiallagen alternierend unterschiedlich tiefe Rillenprägungen oder Faltungen bzw. Wellungen vorgesehen werden, was zu unterschiedlich hohen Erhebungen einzelner Rillenränder führt, so dass die Zahl der Berührungspunkte zwischen den benachbarten Materiallagen an den Stellen sich kreuzender Ränder der Rillen-,

Wellen- oder Faltstrukturen insgesamt gegenüber der Gesamtzahl der vorhandenen Rillenränder in geeigneter Weise verringert wird. Durch Verbindung der Materiallagen an diesen Stellen wird eine ausreichende Festigkeit des Trägerköφers gewährleistet und ein günstiger Strömungswiderstand gewährleistet.

Besonders bevorzugt ist, dass als poröser Trägerköφer eine Modulstruktur verwendet wird, die durch Karbonisierung eines ggf. strukturierten, geprägten, vorbehandelten und gefalteten Flächengebildes auf Faser-, Papier- Textil oder Polymermaterialbasis erzeugt wird. Entsprechende erfindungsgemäße Trägerköφer bestehen aus einem kohlenstoffbasierten Material, ggf. auch Kohlenstoff- Kompositmaterial, das durch Pyrolyse von kohlenstoffhaltigen Ausgangsstoffen hergestellt wird, und im wesentlichen einer Art Kohlenstoffkeramik bzw. kohlenstoffbasierten Keramik entspricht. Die Herstellung entsprechender Materialien kann beispielsweise ausgehend von papierartigen Ausgangsstoffen durch Pyrolyse bzw. Karbonisierung bei hohen Temperaturen erfolgen. Entsprechende Herstellungsverfahren, insbesondere auch für Kohlenstoff-Kompositmaterialien, sind in der internationalen Patentanmeldung WO 01/80981 , insbesondere dort auf Seite 14, Zeile 10 bis Seite 18, Zeile 14 beschrieben und vorliegend anwendbar. Die erfindungsgemäßen kohlenstoffbasierten Trägerköφer können femer auch nach den in der internationalen Patentanmeldung WO 02/32558, insbesondere dort auf Seite 6, Zeile 5 bis Seite 24, Zeile 9 hergestellt werden. Die Offenbarung dieser internationalen Anmeldungen wird hiermit vollständig per Zitierung einbezogen.

Auch durch Pyrolyse von geeignet vorgefertigten Polymerfilmen bzw. dreidimensional angeordneten oder gefalteten Polymerfilmpaketen, wie in der DE 103 22 182 beschrieben deren Offenbarung hiermit vollständig per Referenz einbezogen wird, lassen sich erfindungsgemäße Trägerköφer erhalten.

Nach den in den oben genannten Patentanmeldungen beschriebenen Pyrolyseverfahren lassen sich besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Trägerköφers insbesondere auch durch Karbonisierung von Wellpappe herstellen, wobei die Wellpappschichten vor der Karbonisierung geeignet aufeinander fixiert werden, so dass sich ein offener, durchströmbarer Köφer ergibt.

Darüber hinaus ergeben sich bevorzugte Trägerköφer in zylindrischer Form auch durch Aufrollen oder Wickeln von parallel- oder kreuzstromartig angeordneten Papier- oder Polymerfilmlagen oder -stapeln zu zylindrischen Köφem, Rohren oder Stangen, sowie deren anschließende Pyrolyse nach oben genannten Verfahren des Standes der Technik. Diese „Wickelköφer" umfassen im einfachsten Fall eine gerillte, geprägte, gefaltete oder gewellte poröse Materiallage, die durch Aufrollen dieser blattförmigen Vorstufe zum Zylinder gewickelt wird und die dann in aufgerollter Form karbonisiert wird. Der hieraus entstehende zylindrische

Trägerköφer umfasst eine im Querschnitt spiral- oder schneckenartig aufgerollte poröse Materiallage, zwischen deren Windungen die Zwischenräume bzw. Kanäle sich im Wesentlichen in Richtung der Zylinderhöhe erstrecken, mit dem Querschnitt als Anströmfläche mit dem geringsten Strömungswiderstand. Analog können zwei oder mehrere übereinander liegende Materiallagenvorstufen aufgerollt und anschließend zum Trägerköφer karbonisiert werden. Besonders bevorzugt sind mindestens zwei alternierend übereinander angeordnete Materiallagen, von denen eine gewellt (Wellenlage) und die andere im Wesentlichen flach (Decklage) ist, was beim Aufwickeln zum Zylinder ein ggf. auftretendes Ineinanderrutschen der Wellen bzw. Rillen verhindert und so die Kanalstrukturartigen Zwischenräume offenhält. Das nachfolgende Beispiel 1 beschreibt derartige zylindrische Formköφer.

Die erfindungsgemäßen Trägerköφer können optional modifiziert werden, um die physikalischen und/oder chemisch-biologischen Eigenschaften dem vorgesehenen Anwendungszweck entsprechend anzupassen. Kohlenstoff-basierte Materialien sind an sich bereits hoch biokompatible Stoffe, die ein ideales Substrat für Zellen, Mikroorganismen oder Gewebe abgeben. Erfindungsgemäße Trägerköφer können an ihren inneren und/oder äußeren Oberfläche zumindest teilweise hydrophil, hydrophob, oleophil oder oleophob modifiziert werden, beispielsweise durch Fluoridierung, Parylenierung, durch Beschichten oder Imprägnieren des Trägerköφers mit besiedelungsfördernden Stoffen, Nährmedien, Polymeren etc.

Besonders bevorzugt kann der Trägerköφer mit weiteren Substanzen, ausgewählt aus organischen und anorganischen Stoffen oder Verbindungen, in seinen Eigenschaften modifiziert werden. Bevorzugt werden Stoffe wie oder Verbindungen von Eisen, Kobalt, Kupfer, Zink, Mangan, Kalium, Magnesium, Kalzium, Schwefel oder Phosphor. Der Einbau dieser weiteren Verbindungen kann beispielsweise dazu genutzt werden, das Wachstum bestimmter Mikroorganismen oder Zellen auf dem Trägerköφer zu fördern. Zur Wachstumsförderung femer geeignet ist eine Imprägnierung oder Beschichtung des Trägerköφers mit Kohlehydraten, Lipiden, Purinen, Pyromidinen, Pyrimidinen, Vitaminen, Proteinen, Wachstumsfaktoren, Aminosäuren und/oder Schwefel- oder Stickstoffquellen. Femer können zur

Stimulation des Zellwachstums folgende Stoffe verwendet werden: Bisphosphonate (z.B. Risedronate, Pamidronate, lbandronate, Zoledronsäure, Clodronsäure, Etidronsäure, Alendronsäure, Tiludronsäure), Fluoride (Dinatriumfluorophosphat, Natriumfluorid); Calcitonin, Dihydrotachystyrol, sowie alle Wachstumsfaktoren (Growth Factors) und Zytokine (Epidermal Growth Factor (EGF), Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Fibroblast Growth Factors (FGFs), Transforming Growth Factors-b TGFs-b), Transforming Growth Factor-a (TGF-a), Erythropoietin (Epo), Insulin-Like Growth Factor-I (IGF-I), Insulin-Like Growth Factor-II (IGF-II), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), Tumor Necrosis Factor-a (TNF-a), Tumor Necrosis Factor-b (TNF-b), Interferon-g (INF-g), Monocyte chemotactic protein, fibroblast stimulating factor 1 , Histamin, Fibrin oder Fibrinogen, Endothelin-1, Angiotensin II, Kollagene, Bromocriptin, Methylsergid, Methotrexat, Kohlenstofftetrachlorid, Thioacetamid, Ethanol.

Die Strömungsverhältnisse im Trägerköφer können beispielsweise durch Veränderung der Zwischenraum- oder Kanalgeometrie in Flussrichtung (z.B. wellenförmige Kanäle), durch Variation des Durchmessers und durch ggf. auch durch Variation der Oberflächeneigenschaften der Kohlenstoffoberfläche wie etwa Membraneigenschaften, Rauhigkeit, Porosität, Hydrophilie, Hydrophobie, Oleophilie, Oleophobie, pH- Wert, Imprägnierung mit Wirkstoffen und/oder Katalysatoren, etc. auf die benötigten Kulturbedingungen eingestellt werden.

Beladung und Zellkultivierung Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Trägerköφer mit lebendem und/oder vermehrungsfähigem biologischen Material beladen. Bevorzugt umfasst das biologische Material ein- oder mehrzellige Mikroorganismen, Pilze, Sporen, Viren, pflanzlichen Zellen, Zellkulturen oder Gewebe oder tierischen bzw. menschlichen Zellen, Zellkulturen oder Gewebe oder Mischungen davon. Vorzugsweise fuhrt die Beladung zu einer weitgehenden Immobilisierung des biologischen Materials.

Bevorzugt erfolgt die Beladung mit gewebebildenden oder nicht gewebebildenden Säugerzellen, Algen, Bakterien, insbesondere gentechnisch modifizierte, wirkstoffproduzierende Bakterien; primären Zellkulturen wie eukaryote Gewebe, z.B. Knochen, Knoφel, Leber, Nieren, sowie xenogene, allogene, syngene oder autologe Zellen und Zelltypen, sowie gegebenenfalls auch genetisch modifizierte Zelllinien, und insbesondere auch Nervengewebe.

Das biologische Material kann nach üblichen Verfahren auf den Trägerköφer aufgebracht werden. Beispiele hierfür sind das Eintauchen des Trägers in eine Lösung/Suspension des Zellmaterials, das Besprühen des Trägers mit Zellmateriallösung oder -Suspension, das Beimpfen eines fluiden Mediums im Kontakt mit dem Träger und dergleichen. Gegebenenfalls ist nach der Beladung eine Inkubationszeit notwendige, um das immobilisierte biologische Material den Träger vollständig besuchen zu lassen.

Die kohlenstoffhaltigen Trägerköφer eignen sich besonders zur Immobilisierung und Vermehrung von Mikroorganismen aller Art und von Gewebekulturen, insbesondere Zellgeweben. Hierbei siedeln sich die Mikroorganismen bzw. Gewebekulturen auf den Trägerköφer an und können über die durchströmbaren Zwischenschichten bzw. Strömungskanäle in den Zwischenschichten mit flüssigen oder gasförmigen Nährstoffen versorgt werden, während ggf. Stoffwechselprodukte einfach mit einem durch den Trägerköφer geleiteten Fluidstrom abgeführt werden können. Femer sind die auf dem Träger weitgehend immobilisierten Mikroorganismen und Zellen vor dem Austrag und vor eventuellen schädlichen Umwelteinflüssen, wie etwa mechanische Belastungen, geschützt.

Außerdem ist es gemäß der Erfindung z.B. möglich, mehrere Trägerköφer mit verschiedenen Mikroorganismen, Zeil- oder Gewebekulturen in eine

Reaktionsmischung, enthaltend z. B. ein Reaktionsmedium und ggf. die Edukte, zu tauchen oder damit zu durchströmen, ohne dass es zur Vermischung der Mikroorganismen, Zeil- oder Gewebekulturen kommt, die auf dem Trägerköφer weitestgehend immobilisiert sind.

Die entsprechenden, ggf. in geeignete Gehäuse zu Kartuschensystemen eingebauten Trägerköφer, die mit ggf. unterschiedlichen Mikroorganismen oder Zellkulturen beladen sind, können beispielsweise zur Vermehrung oder Wirkstoffproduktion in ein einziges Nährmedium getaucht werden und nach gewisser Zeit zur Ernte als einzelne Kartuschen aus dem Nährmedium genommen und geöffnet werden, oder die Produkte werden kontinuierlich entfernt. Die Trägerköφer oder diese enthaltende Gehäuse bzw. Kartuschen können auch wahlweise so gestaltet sein, dass sie zur Wirkstoffentfernung zerstört werden müssen, oder dass sie reversibel geöffnet oder verschlossen werden können. Bevorzugt können die Kartuschen reversibel geöffnet und wieder verschlossen werden.

Erfindungsgemäß können die Trägerköφer ggf. in einem geeigneten Gehäuse angeordnet werden, oder in oder auf einem geeigneten Behälter, ausgewählt aus Reaktoren für chemische oder biologische Reaktoren, wie etwa Kolben, Flaschen, insbesondere Zellkulturflaschen, Rollerflaschen, Spinnerflaschen, Kulturröhrchen, Zellkulturkammern, Zellkulturschalen, Kultuφlatten, Pipettenhütchen, Schnappdeckelgläser, Kryoröhrchen, Rührreaktoren, Festbettreaktoren, Rohrreaktoren und dergleichen.

Vor, während oder nach der Beladung mit dem biologischen Material wird der Trägerköφer mit einem fluiden Medium in Kontakt gebracht. Hierbei kann das fluide Medium vor der Beladung ggf. ein anderes sein als danach. Der Ausdruck

„fluides Medium" umfasst jedes Fluid, gasförmig, fest oder flüssig, wie etwa Wasser, organische Lösungsmittel, anorganische Lösungsmittel, überkritische Gase, übliche Trägergase, Lösungen oder Suspensionen fester oder gasförmiger Stoffe, Emulsionen und dergleichen. Vorzugsweise ist das Medium ausgewählt aus Flüssigkeiten oder Gasen, Lösungsmitteln, Wasser, gasförmigen oder flüssigen oder festen

Reaktionsedukten und/oder -produkten, Nährlösungen für Enzyme Zellen und Gewebe, Mischungen davon und dergleichen.

Beispiele für Nährlösungen sind etwa RPMI 1640 von Cell Concepts, PFHM II; Hybridoma-SFM bzw. CD Hybridoma von GIBCO, etc. Diese können mit oder ohne Serum verwendet werden, z.B. MediumFetal Bovine Serum, mit oder ohne Aminosäuren wie z.B. L-Glutamin. Das fluide Medium kann auch mit biologischem Material versetzt sein, beispielsweise zur Beimpfung des Trägerköφers.

Die Kontaktierung kann durch vollständiges oder teilweises Eintauchen des Trägerköφers oder des diesen enthaltenden Gehäuses/Behälters in das fluide Medium erfolgen. Auch können die Trägerköφer in geeigneten Reaktoren fixiert vom fluiden Medium durchströmt werden. Ein wichtiges Kriterium ist hierbei die Benetzbarkeit und die Entfembarkeit von eventuell eingeschlossenen Luftblasen aus dem Trägermaterial. Hierfür sind ggf. Evakuierungs-, Entgasungs- und/oder Spülvorgänge erforderlich, die nach Bedarf angewendet werden können.

Vorzugsweise wird anschließend, nach einer ersten Kontaktierung des Trägerköφers mit einem fluiden Medium das biologische Material eingeimpft, d. h. üblicherweise in flüssiger Form, etwa als Lösung, Suspension, Emulsion oder dergleichen, besonders bevorzugt in dem fluiden Medium selbst, üblicherweise unter sterilen Bedingungen zugegeben. Bei den erfindungsgemäßen Trägerköφern tritt hierbei üblicherweise eine Aufklarung der durch die Zellen getrübten Mediumumgebung auf, meist bereits nach einigen Stunden, oft schon nach ca. 2 Stunden.

Bevorzugt wird der Köφer in eine das biologische Material enthaltende Lösung, Emulsion oder Suspension für einen Zeitraum von 1 Sekunde bis zu 1000 Tagen getaucht oder damit beimpft, ggf. unter sterilen Bedingungen, um dem Material die Möglichkeit zu geben, in den porösen Köφer hinein zu diffundieren und sich anzusiedeln. Die Beimpfung kann auch durch Sprühmethoden oder dergleichen vorgenommen werden.

Das fluide Medium, z. B. ein Nährmedium kann bewegt werden, um eine möglichst homogene Lebensumgebung und Nährstoffversorgung der Mikroorganismen sicherzustellen. Dies kann durch die verschiedenen, oben genannten Weisen erfolgen, etwa durch Bewegen des Trägerköφers im Medium oder Bewegen des Mediums durch den Trägerköφer. Dies geschieht üblicherweise für einen ausreichenden Zeitraum, um ein Wachstum, eine Vermehrung oder eine ausreichende Stoffwechselaktivität des biologischen Materials zu ermöglichen.

Anschließend erfolgt die „Ernte" der Stoffwechselprodukte bzw. der polyferierten Zellen. Hierbei ist die feste Besiedlung auf der Trägerköφeroberfläche eine gewünschte Vereinfachung, da Zellen und umgebendes Medium hierdurch einfach voneinander getrennt werden können. Die Zellen auf dem Trägerköφer haften fest und können nach Abspülen des Mediums ggf. durch Ausspülen mit geeigneten Mitteln entfernt werden.

Nach der Emte von Stoffwechselprodukten beispielsweise durch Extraktion aus dem Medium können die Trägerköφer sofern erwünscht oder erforderlich gereinigt, sterilisiert und für eine Neubeladung mit gleichem oder anderem biologischen Material wiederverwendet werden. Für eine spätere Wiederverwendung der beladenen Trägerköφer können diese auch zusammen mit dem biologischen Material kryokonserviert werden.

Bioreaktoren Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einem (oder mehreren) Trägerköφer(n) durchgeführt, der/die vor oder nach der Beladung mit biologischem Material in ein geeignetes Gehäuse, Behältnis oder Reaktor bzw. Reaktorsystem eingebracht wird/werden. Vorzugsweise wird der Trägerköφer dabei in dem Gehäuse, Behälter oder Reaktor bzw. Reaktorsystem durch mindestens teilweises Befüllen des Gehäuses, Behälters oder Reaktors bzw. Reaktorsystems mit dem fluiden Medium in Kontakt gebracht.

Der Mediumkontakt erfolgt in einer Ausführungsform so, dass der Trägerköφer in dem Gehäuse, Behälter oder Reaktor bzw. Reaktorsystem im Medium kontinuierlich oder diskontinuierlich bewegt wird. Hierzu wird der Behälter üblicherweise mit einem mit dem Medium gefüllten Vorratsgefäß über Zuführungseinrichtungen verbunden sein, und gegebenenfalls werden zusätzlich Abführungseinrichtungen vorgesehen sein, um das Medium kontinuierlich oder diskontinuierlich in und durch den Behälter zu führen. Alternativ kann der Trägerköφer auch in einem mit dem fluiden Medium ganz oder teilweise gefüllten Gehäuse, Behälter oder Reaktor bzw. Reaktorsystem mittels geeigneter Vorrichtungen bewegt werden.

Femer kann der Trägerköφer kontinuierlich oder diskontinuierlich, ggf. ganz oder teilweise getaucht in einem Gehäuse, Behälter oder Reaktor bzw. Reaktorsystem, mit einem fluiden Medium durchströmt werden. Hierbei kann die Durchströmung des Trägerköφers mit dem fluiden Medium durch Bewegen des Trägerköφers im Medium bewirkt wird. Alternativ kann die Durchströmung des Trägerköφers mit dem fluiden Medium durch Bewegen des Mediums im Trägerköφer bewirkt werden, beispielsweise mittels geeigneter Rührvorrichtungen, Pumpsysteme, pneumatischer Mediumhebevorrichtungen und dergleichen. Bevorzugt werden mit dem Medium nach der Beladung der Trägerköφers mit dem biologischen Material kontinuierlich oder diskontinuierlich Nährstoffe zu und/oder Stoffwechselprodukte abgeführt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Trägerköφer mit einer dem Anwendungszweck entsprechenden, geeigneten Menge an biologischem Material beladen bzw. beimpft. Vorzugsweise wird so beladen bzw. beimpft, dass der Trägerköφer basierend auf dem gesamten Gewicht des beladenen Trägerköφers zwischen 10^"5 Gew.-% und 99 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 10^"2 und 80 Gew.-%, am meisten bevorzugt zwischen 1 und 50 Gew.-% an Zellen enthält. Besonders bevorzugt umfasst der Trägerköφer Zellkulturen bis zum 10⁶-fachen seines Eigengewichtes, sowie eine Zelldichte von 1 bis 10²³ Zellen pro ml Trägerköφervolumen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere auch zur Kultivierung und ggf. Vermehrung von Nervengewebe. Besonders vorteilhaft ist hierbei, dass die erfindungsgemäßen kohlenstoffbasierten Trägerköφer insbesondere durch die einfache Einstellung der Leitfähigkeit der Köφer und die Applikation von Impulsströmen zur Kultivierung von Nervengewebe besonders anpassbar und geeignet sind. Eriϊndungsgemäß können die Trägerköφer zur Kultivierung in üblichen Bioreaktorsystemen verwendet werden, z. B. passive Systeme ohne kontinuierliche Regeltechnik wie z.B. Gewebeplatten, Gewebeflaschen, Roller-Flaschen; aber auch aktive Systeme mit Gaszufuhr und automatischer Einstellung von Parametern (Azidität, Temperatur), also im weitesten Sinne Reaktorsysteme mit Mess- und Regeltechnik.

Außerdem können die erfindungsgemäßen Trägerköφer durch Vorsehung geeigneter Vorrichtungen wie z.B. Anschlüsse für die Perfusion mit Nährlösungen und den Gasaustausch als Reaktorsystem betrieben werden insbesondere auch modular in entsprechenden Reihenreaktorsystemen und Gewebekulturen.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Durchführung des Zellkultivierungsverfahrens mit einem Reaktor bzw. Reaktorsystem umfassend mindestens einen Trägerköφer wie oben beschrieben, wobei der Reaktor bzw. das Reaktorsystem ausgewählt ist aus Kolben, Flaschen, insbesondere Zellkulturflaschen, Rollerflaschen, Spinnerflaschen, Kulturröhrchen, Zellkulturkamrnern, Zellkulturschalen, Kultuφlatten, Kryoröhrchen, Rührreaktoren, Festbettreaktoren, Rohrreaktoren. Besonders bevorzugt sind Rollerflaschen umfassend einen erfindungsgemäßen Trägerköφer, oder Kartusche umfassend einen erfindungsgemäßen Trägerköφer in einem Gehäuse.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Trägerköφer zur Förderung der Organgenese geeignet modifiziert werden, beispielsweise mit Proteoglykanen, Kollagenen, gewebetypischen Salzen, z.B. Hydroxylapatit etc., besonders auch mit den obengenannten biologisch abbaubaren bzw. resorbierbaren Polymeren.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Trägerköφer femer durch Imprägnierung und/oder Adsoφtion von Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Interferone und/oder Adhäsionsfaktoren modifiziert. Beispiele geeigneter Wachstumsfaktoren sind PDGF, EGF, TGF-α, FGF, NGF, Erythropoietin, TGF-ß, IGF-I und IGF-II. Geeignete Cytokine umfassen beispielsweise IL-l-α und -ß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13. Geeignete Interferone umfassen z.B . INF-α und -ß, LNF-γ. Beispiele geeigneter Adhäsionsfaktoren sind Fibronectin, Laminin, Vitronectin, Fetuin, Poly-D-Lysin und dergleichen.

Die Zelldichte bei erfindungsgemäßen Trägerköφern kann im Bereich von 1 bis 10 Zellen pro ml Volumen, insbesondere Reaktorvolumen, vorzugsweise bis zu 10 , bevorzugt 10⁵, insbesondere bis zu 10⁹ Zellen pro ml liegen.

Die Reaktoren bzw. Reaktorsysteme können kontinuierlich oder Batchweise betriebenen werden. Die erfindungsgemäßen Trägerköφer darin können eine semipermeable Trennschicht enthalten. Trägerköφer ohne semipermeable Trennschicht können in einem Behälter in den Reaktor eingebaut werden, der bevorzugt eine semipermeable Trennschicht enthält. Der Behälter ist in einem solchen Fall bevorzugt so gestaltet, dass der Stoffaustausch zwischen dem fluiden Medium im Reaktor und dem Innenraum des Behälters durch die semipermeable Trennschicht gesteuert wird. Die semipermeable Trennschicht kann die gleichen

Trenneigenschaften aufweisen wie die der semipermeablen Trennschicht in Kontakt mit der äußern Oberfläche des porösen Trägerköφers.

Für den Einsatz von Trägerköφern mit einer semipermeablen Trennschicht oder von Trägerköφern, die sich in einem Behälter befinden mit einer semipermeablen Trennschicht, die nur einen Stoffaustausch bezüglich der Edukte und des Reaktionsmediums zulässt, werden Batchweise betriebene Rührkesselreaktoren bevorzugt, ebenso für erfindungsgemäße Trägerköφer ohne jede Trennschicht. Diese Rührkesselreaktoren sind üblicherweise mit einem Rührwerk ausgestattet und gegebenenfalls mit einer kontinuierlichen Edukt-Zugabevorrichtung. Der/die

Trägerköφer wird/werden gegebenenfalls in einem Behälter, der gegebenenfalls eine semipermeable Trennschicht aufweist, in das fluide Medium getaucht. Wenn vergleichsweise kleine Trägerköφer eingesetzt werden, werden diese bevorzugt in einem Behälter oder Gehäuse in das Medium getaucht. Der Behälter lässt den Kontakt mit dem Medium zu, gegebenenfalls über eine semipermeable Trennschicht, verhindert aber eine unkontrollierte Verteilung der Trägerköφer im Reaktor. Bevorzugt ist die Strömung im Reaktionsraum turbulent und der laminare Grenzfilm möglichst dünn. Für die Aufrechterhaltung eines Gradienten ist eine gute Konvektion notwendig. Edukte müssen immer in ausreichender Menge zugeführt werden. Der Fachmann erkennt, dass Maßnahmen die zur guten Durchmischung und zur guten Konvektion führen, geeignet sind für die vorliegende Erfindung.

Der Fachmann weiß, dass mit ansteigender Turbulenz (ansteigender Re-Zahl) der Stofftransport durch die Verringerung der Diffusionsweg schneller wird. Je kleiner die Diffusionswege und je größer der Konzentrationsgradient desto rascher der Stofftransport zwischen Innen- und Außenraum. Der Fachmann weiß, dass die Geschwindigkeit der meisten Reaktionen durch den Stofftransport und nicht die Reaktionsgeschwindigkeitrate bestimmt wird und somit die Umsetzungsgeschwindigkeit direkt vom Stofftransport abhängt. Nur in Ausnahmefällen wird die Reaktionsgeschwindigkeit selbst langsamerer sein als der Stofftransport, so dass die Reaktionsgeschwindigkeit durch die tatsächliche Reaktion und nicht durch den Stofftransport limitiert wird.

Alternativ kann eine kontinuierliche Prozessfüh ng verwendet werden. Eine kontinuierliche Prozessführung bringt den Vorteil, dass Edukte mit dem fluiden Medium kontinuierlich zugeführt und Produkte kontinuierlich oder diskontinuierlich abgeführt werden können. Für diese Ausführungsform werden bevorzugt Trägerköφer ohne semipermeable Trennschicht verwendet. Alternativ zu Trägerköφern mit semipermeabler Trennschicht, können Trägerköφer verwendet werden, die keine semipermeable Trennschicht aufweisen, aber in einem Behälter oder Gehäuse in den Reaktor eingebracht werden, der eine semipermeable Trennschicht aufweist. Bevorzugte Reaktoren sind kontinuierlich betriebene Rührkesselreaktoren, Rohrreaktoren sowie ggf. auch Wirbelschichtreaktoren.

Die Reaktorverweilzeit wird je nach Reaktion unterschiedlich sein und hängt von der Geschwindigkeit der biologischen Reaktion ab. Der Fachmann stellt die Verweilzeit entsprechend der jeweiligen Reaktion ein. Vorzugsweise kann der Eduktstrom im Kreislauf geführt werden, wobei geeignete Meß- und Regelvorrichtungen vorgesehen werden um z.B. Temperatur, pH- Wert, Nährstoff- oder Eduktkonzentration im Medium zu steuern. Produkte können aus dem Kreislaufstrom kontinuierlich oder diskontinuierlich entnommen werden.

Die erfindungsgemäßen Trägerköφer können entweder fest im Rührkessel oder Rohrreaktor verankert werden, lose im Medium schwimmen oder sich in einem Behälter oder Gehäuse befinden, der in das Reaktionsmedium getaucht wird. Wenn die Köφer frei im Medium schwimmen, muss am Reaktorauslass dafür gesorgt werden, dass diese den Reaktor nicht verlassen können. Beispielsweise können am Auslass Siebe angebracht werden. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen

Trägerköφer in einem porösen Behälter oder Gehäuse, der gegebenenfalls mit einer semipermeablen Trennschicht versehen ist, in die Reaktionsmischung getaucht. Diese Ausführungsform bringt femer den Vorteil, dass die Trägerköφer leicht entfernt werden können, wenn der Rührkessel für andere Reaktionen benötigt wird oder sofern eine Erneuerung notwendig ist.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Reaktor als Rohrreaktor ausgestaltet. Bevorzugt werden in dieser Ausführungsform länglich ausgebildete Trägerköφer, insbesondere zylindrische Wickelköφer wie im Beispiel 1 angegeben verwendet. Diese Trägerköφer werden frei oder in einem Behälter gebündelt in dem Rohrreaktor angeordnet. Am einen Ende des Rohrreaktors wird die Edukt- Reaktionsmedium-Mischung eingeführt, am anderen Ende des Rohrreaktors wird im wesentlichen Produkt-Reaktionsmedium-Mischung abgeführt. Während das Medium den Rohrreaktor durchströmt, findet eine Durchströmung des Trägerköφers mit dem Medium statt. Die Länge des Rohrreaktors sowie die Fließgeschwindigkeit des fluiden Mediums und die damit verbundene Verweilzeit wird vom Fachmann entsprechend der durchgeführten Reaktion eingestellt. Der Fachmann erkennt, dass der Rohrreaktor zusätzlich mit Strömungsstörem ausgestattet werden kann um eine turbulente Strömung zu bewirken. Wie oben für den kontinuierlich betriebenen Rührreaktor ausgeführt, ist eine Strömung mit möglichst hohen Re-Zahlen wünschenswert um die laminare Grenzschicht möglichst klein zu halten und die Diffusionswege zu verringern. Die Strömungsstörer können ggf. in Form der speziellen Form des porösen Trägerköφers vorliegen. Alternativ können zusätzliche Formköφer eingebracht werden, die als Strömungsstörer dienen.

Der Fachmann erkennt, dass neben den oben beschriebenen Grundformen für Reaktoren auch abgewandelte Formen für das erfindungsgemäße Zellkultivierungsverfahren verwendet werden können ohne von den Erfindungsgedanken der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Die Erfindung wird nun im folgenden anhand von graphischen Darstellungen in einzelnen bevorzugten Aspekten weiter veranschaulicht. Diese sind nicht dazu gedacht eine Beschränkung auf bestimmte Formen oder Anordnungen anzugeben.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden, nicht beschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht.

Beispiele Beispiel 1: Für die vorgesehene Anwendung als Trägermaterial im erfindungsgemäßen Zellkultivierungsverfahren wurde ein naturfaserhaltiges Polymerkomposit mit einem Flächengewicht von 100 g/m² und 110 μm Trockenschichtstärke in einen Formköφer mit den Abmessungen 150 mm Länge und 70 mm Durchmesser aufgerollt. Hierbei wurden radial geschlossene Strömungskanäle mit einem mittleren Kanaldurchmesser von 3 mm durch Wellengebung aus dem ca. 8 m langen Flachmaterial erzeugt und diese einlagige Wellenstruktur anschließend in Querrichtung aufgerollt und fixiert. Diese Formköφer wurden unter Stickstoffatmosphäre bei 800 °C über 48 Stunden karbonisiert, wobei gegen Ende Luft zugesetzt wurde, um die Porosität zu modifizieren. Es trat ein Gewichtsverlust von 61 Gew.-% auf. Das resultierende Material weist in Wasser einen pH- Wert von 7,4 und einen Pufferbereich im schwach Sauren auf.

Scheiben von je etwa 60 mm Durchmesser und 20 mm Dicke dieses Kohlenstoffmaterials hatten die folgenden Eigenschaften: Oberfläche zu Volumenverhältnis 1700 m²/m³, freie Strömungsquerschnitte 0,6 m²/m³, aufgrund der offenen Struktur und Strömungskanallänge von 20 mm ist kein messbarer Druckverlust bei der Durchströmung mit Wasser unter experimentellen Bedingungen feststellbar. Diese Scheiben wurden in einer Druckwechselapparatur gemäß Figur 4 eingebaut, so dass sie unter sterilen Bedingungen mit 500 ml Nährlösung und je 150 ml Zellsuspension durchströmt werden konnte. Die Zellsuspension enthielt Hybridoma FLT2 MAB gegen Shigatoxin produzierende Zel linien, bekannt für nicht adhärentes, nicht adhäsives suspensionsständiges Wachstum. Als Vergleich wurden entsprechende Apparaturen trägerfrei ohne

Kohlenstoffrnaterial bei sonst gleichen Bedingungen und Beschickung verwendet. Das flüssige Medium wurde im Zyklus von 30 Sekunden durch die Kartusche geleitet bzw. umgewälzt, d.h. es erfolgte ein Eintauchen des Köφers in das flüssige Medium alle 30 Sekunden. Die Proben mit Träger zeigten eine spontane, quantitative Immobilisierung der Zellen (klar werden des zuvor trüben Überstandes nach ca. 4 Stunden), es konnte danach keine Trübung der Suspension mehr nachgewiesen werden. Innerhalb von 7 Tagen Inkubationszeit kam es zu einer Versiebenfachung der Zelldichte auf 1,8 x 10⁷ Zellen pro ml. Die MAB Produktion stieg von anfänglich 50 μg/ml auf 350 μl/ml der durchschnittlichen Kulturlebensdauer, ohne Zeichen eines proteolytischen Abbaus. 12 von 12 Proben waren nach 25 Tagen noch lebend, wonach abgebrochen wurde. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Träger zu einer Unterbrechung der Kontaktinhibition trotz der höheren Zelldichte führen. Selbst nach Kryokonservierung und Auftauen erfolgt nach Zugabe frischen Nährmediums ein spontanes Wiedereinsetzen der MAB-Produktion.

Im Vergleichsexperiment hat nur eine von 6 Kulturen bis zum 11. Tag überlebt.

Beispiel 2 Kreuzgeometrie: Für die vorgesehene Anwendung als Trägermaterial für Zellkulturaufzuchtsysteme wurde ein naturfaserhaltiges Polymerkomposit mit einem Flächengewicht von 100 g/m² und 110 μm Trockenschichtstärke in einen Formköφer mit den Abmessungen 300 mm Länge, 150 mm Breite und 50 mm Höhe verklebt. Hierbei wurden radial geschlossene Strömungskanäle mit mittleren Kanaldurchmessern von 3 mm Durchmesser durch Wellengebung aus dem Flachmaterial und Laminierung dieser einlagige Wellenstrukturen anschließend jeweils um 90° versetzt erzeugt. Diese Formköφer wurden unter Stickstoffatmosphäre bei 800 °C über 48 Stunden karbonisiert, wobei gegen Ende Luft zugesetzt wurde, um die Porosität zu modifizieren. Es trat ein Gewichtsverlust von 61 Gew.-% auf. Das resultierende Material wies in Wasser einen pH- Wert von 7,4 und einen Pufferbereich im schwach Sauren auf. Durch Wasserstrahlschneiden wurden zylindrische Trägerköφer dieses

Kohlenstoffmaterials mit Abmessungen 35 mm Durchmesser und 40 mm Dicke erzeugt, die die folgenden Eigenschaften aufwiesen:

Oberfläche zu Volumenverhältnis 1700 m²/m³, freie Strömungsquerschnitte 0,6 m²/m³, aufgrund der offenen Struktur und Strömungskanallänge von 20 mm ist kein messbarer Dmckverlust bei der Durchströmung mit Wasser unter experimentellen Bedingungen feststellbar.

Diese Scheiben wurden in eine strahlenvernetzte Schutzhülle gegeben und zu Strängen von 160 mm Länge zusammengefügt. Jeweils einer dieser Stränge wurde in eine handelsübliche 2 Liter Rollerflasche eingeführt und unter sterilen Bedingungen mit 500 ml Nährlösung und je 150 ml Zellsuspension beschickt. Die Zellsuspension enthielt Hybridoma FLT2 MAB gegen Shigatoxin produzierende Zelllinien, bekannt für nicht adhärentes, nicht adhäsives Suspensionsständiges Wachstum. Als Vergleich wurden entsprechende Rollerflaschen ohne Kohlenstoffmaterial bei sonst gleichen Bedingungen und Beschickung verwendet. Die Rollerflaschen wurde auf einer Rollerflaschenapparatur gedreht.

Die Proben mit Träger zeigten eine spontane, quantitative Immobilisierung der Zellen (klar werden des zuvor trüben Überstandes nach ca. 4 Stunden), es konnte keine Trübung der Suspension mehr nachgewiesen werden. Innerhalb von 7 Tagen Inkubationszeit kam es zu einer Versiebenfachung der Zelldichte auf 1,8 x 10⁷ Zellen pro ml. Die MAB Produktion stieg von anfänglich 50 μg/ml auf 350 μl/ml der durchschnittlichen Kulturlebensdauer, ohne Zeichen eines proteolytischen Abbaus. 12 von 12 Proben waren nach 25 Tagen noch lebend, wonach abgebrochen wurde. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Träger zu einer Unterbrechung der Kontaktinhibition trotz der höheren Zelldichte führen. Selbst nach Kryokonservierung und Auftauen erfolgen nach Zugabe frischen Nährmediums ein spontanes Wiedereinsetzen der MAB-Produktion.

Im Vergleichsexperiment hat nur eine von 6 Kulturen bis zum 11. Tag überlebt.

Beispiel 3: Für die vorgesehene Anwendung als Trägermaterial für Zellkulturaufzuchtsysteme wurde ein naturfaserhaltiges Polymerkomposit mit einem Flächengewicht von 100 g/m² und 110 μm Trockenschichtstärke in einen Formköφer mit den Abmessungen 150 mm Länge und 70 mm Durchmesser aufgerollt. Hierzu wurden zuvor radial geschlossene Strömungskanäle in S- oder Wellenform mit einem mittleren Kanaldurchmesser von 3 mm durch Prägung und anschließender Wellengebung aus dem Flachmaterial erzeugt und diese einlagige Wellenstruktur anschließend aufgerollt (siehe Beispiel 1). Diese Formköφer wurden unter Stickstoffatmosphäre bei 800 °C über 48 Stunden karbonisiert, wobei gegen Ende Luft zugesetzt wurde, um die Porosität zu modifizieren. Es trat ein Gewichtsverlust von 61 Gew.-% auf. Das resultierende Material weist in Wasser einen pH- Wert von 7,4 und einen Pufferbereich im schwach Sauren auf.

Scheiben von je etwa 60 mm Durchmesser und 20 mm Dicke dieses Kohlenstoffmaterials hatten die folgenden Eigenschaften: Oberfläche zu Volumenverhältnis 2500 m²/m³, freie Strömungsquerschnitte 0,3 m²/m³, aufgrund der offenen Stmktur und Strömungskanallänge von 20 mm ist kein messbarer Dmckverlust bei der Durchströmung mit Wasser unter den experimentellen Bedingungen feststellbar.

Diese Scheiben wurden in einer Apparatur nach Figur 3 eingebaut, so dass sie unter sterilen Bedingungen mit 500 ml Nährlösung und je 150 ml Zellsuspension durchströmt wurden. Die Zellsuspension enthielt Hybridoma FLT2 MAB gegen Shigatoxin produzierende Zelllinien, bekannt für nicht adhärentes, nicht adhäsives Suspensionsständiges Wachstum. Als Vergleich wurden entsprechende Apparaturen ohne Kohlenstoffmaterial bei sonst gleichen Bedingungen und Beschickung verwendet. Das flüssige Medium wurde im Zyklus von 30 Sekunden durch die Kartusche geleitet bzw. umgewälzt, d.h., der Träger tauchte alle 30 Sekunden vollständig in das Medium ein.

Die Proben mit Träger zeigten eine spontane, quantitative Immobilisierung der Zellen (klar werden des zuvor trüben Überstandes nach ca. 4 Stunden), es konnte danach keine Trübung der Suspension mehr nachgewiesen werden. Innerhalb von 7 Tagen Inkubationszeit kam es zu einer Versiebenfachung der Zelldichte auf 1,8 x 10 Zellen pro ml. Die MAB Produktion stieg von anfänglich 50 μg/ml auf 350 μl/ml der durchschnittlichen Kulturlebensdauer, ohne Zeichen eines proteolytischen Abbaus. 12 von 12 Proben waren nach 25 Tagen noch lebend, wonach abgebrochen wurde. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Träger zu einer Unterbrechung der Kontaktinhibition trotz der höheren Zelldichte führen. Selbst nach Kryokonserviemng und Auftauen erfolgen nach Zugabe frischen Nährmediums ein spontanes Wiedereinsetzen der MAB-Produktion.

Beispiel 4: Die Scheiben aus dem Beispiel 1 wurden nach der Karbonisierung mit einer wässrigen, 10 % Polyvinylpyrrolidon Lösung getränkt und wieder getrocknet. Anschließend wurden die Kartuschen entsprechend Beispiel 1 in eine Apparatur verbaut und mit Nährmedium und Zellen inkubiert. Es konnte beobachtet werden, dass das Benetzungsverhalten der Kartuschen verbessert wurde und die Zellen bereits nach 2 Stunden immobilisiert wurden (klar werden des zuvor trüben Überstandes).

Beispiel 5: Die Scheiben aus dem Beispiel 1 wurden in eine Apparatur nach Figur 3 verbaut, umfassend zwei Behälter die durch korrespondierende Leitungen jeweils mittig am Boden miteinander verbunden waren.

Dieses Behältersystem wurde mit Nährmedium und Zellen gemäß Beispiel 1 inkubiert. Die Behälteranordnung wurde nun so gewählt, dass die Kohlenstoffscheibe in der Ruheposition gerade mit Flüssigkeit bedeckt war. Nach abwarten der kompletten Immobilisierung der Zellen, wurde das Gefäß mit der Kohlenstoffscheibe nun mechanisch so weit angehoben, dass durch die korrespondierenden Leitungen die Flüssigkeit in das zweite Flüssigkeitsgefäß entweichen konnte und die Kohlenstoffscheibe nicht mehr in die Flüssigkeit eintauchte. Anschließend wurde das Gefäß wieder in die Ruheposition abgesenkt. Die Zykluszeit für den Gesamtvorgang betrug 30 Sekunden. Der Vorteil dieser Umwälzung lag darin, dass die zur Medienbewegung benötigte Kraft durch mechanische Arbeit durch heben bzw. senken geleistet wurde und somit ohne Medienberührung auskam. Innerhalb von 7 Tagen Inkubationszeit kam es zu einer Versiebenfachung der

Zelldichte auf 1,8 x 10⁷ Zellen pro ml. Die MAB Produktion stieg von anfänglich 50 μg/ml auf 350 μl/ml der durchschnittlichen Kulturlebensdauer, ohne Zeichen eines proteolytischen Abbaus. 12 von 12 Proben waren nach 25 Tagen noch lebend, wonach abgebrochen wurde. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Träger zu einer Unterbrechung der Kontaktinhibition trotz der höheren Zelldichte führen. Selbst nach Kryokonserviemng und Auftauen erfolgen nach Zugabe frischen Nährmediums ein spontanes Wiedereinsetzen der MAB-Produktion.

Beispiel 6: Die Scheiben aus dem Beispiel 1 wurden in eine Apparatur nach Figur 3 verbaut, umfassend zwei Behälter, die durch korrespondierende Leitungen jeweils mittig am Boden miteinander verbunden waren.

Dieses Behältersystem wurde mit Nährmedium und Zellen gemäß Beispiel 1 inkubiert. Die B ehälter anordnung wurde nun so gewählt, dass die Kohlenstoffscheibe in der Ruheposition gerade mit Flüssigkeit bedeckt war. Nach Abwarten der kompletten Immobilisierung der Zellen, wurde das Gefäß mit der Kohlenstoffscheibe nun mechanisch so weit abgesenkt, dass durch die korrespondierenden Leitungen die Flüssigkeit aus dem zweite Flüssigkeitsgefäß zuströmen konnte und durch die Kohlenstoffscheibe strömte. Anschließend wurde das Gefäß wieder in die Ruheposition angehoben. Die Zykluszeit für den Gesamtvorgang betrug 30

Sekunden. Der Vorteil dieser Umwälzung lag darin, dass die zur Medienbewegung benötigte Kraft durch mechanische Arbeit durch heben bzw. senken geleistet wurde und somit ohne Medienberührung auskam.

Innerhalb von 7 Tagen Inkubationszeit kam es zu einer Versiebenfachung der Zelldichte auf 1,8 x 10⁷ Zellen pro ml. Die MAB Produktion stieg von anfänglich 50 μg/ml auf 350 μl/ml der durchschnittlichen Kulturlebensdauer, ohne Zeichen eines proteolytischen Abbaus. 12 von 12 Proben waren nach 25 Tagen noch lebend, wonach abgebrochen wurde. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Träger zu einer Unterbrechung der Kontaktinhibition trotz der höheren Zelldichte führen. Selbst nach Kryokonservierung und Auftauen erfolgen nach Zugabe frischen Nährmediums ein spontanes Wiedereinsetzen der MAB-Produktion.

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Kultivierung von Zellen, umfassend die folgenden Schritte: d) Bereitstellen eines Trägerköφers auf Kohlenstoffbasis mit schichtartigem Aufbau, umfassend: ii) mindestens zwei im Wesentlichen übereinander angeordnete poröse Materiallagen, zwischen denen ein durchströmbarer Zwischenraum besteht; oder ii) mindestens eine poröse Materiallage die formhaltend so in sich aufgerollt oder angeordnet ist, dass zwischen mindestens zwei übereinander liegenden Abschnitten der Materiallage ein durchströmbarer Zwischenraum besteht; e) Beladen des Trägerköφers mit lebendem und/oder vermehrungsfähigem biologischen Material; f) Kontaktieren des beladenen Trägerköφers mit einem fluiden Medium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerköφer eine Vielzahl von Materiallagen umfasst, und jeweils zwischen zwei übereinander angeordneten Materiallagen mindestens ein Zwischenraum besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Zwischenraum zwischen jeweils zwei Materiallagen oder zwei Abschnitten der einen aufgerollten Materiallage eine

Vielzahl von im Wesentlichen parallel zueinander verlaufenden Kanälen aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die im Wesentlichen parallel zueinander angeordneten Kanäle jeweils einen mittleren Kanaldurchmesser im Bereich von etwa 1 nm bis etwa 1 m, insbesondere etwa 1 nm bis etwa 10 cm aufweisen, vorzugsweise 10 nm bis 10 mm, und besonders bevorzugt 50 nm bis 1 mm.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanäle zwischen jeweils einer ersten und einer zweiten Materiallage gegenüber den Kanälen in einer angrenzenden Schicht zwischen der zweiten Materiallage und einer dritten Materiallage in einem Winkel von größer als 0° bis zu 90°, vorzugsweise 30 bis 90° und besonders bevorzugt 45 bis 90°, versetzt angeordnet sind, so dass der Trägerköφer alternierend gegeneinander in einem Winkel versetzte Kanalschichten aufweist. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die im Wesentlichen parallel verlaufenden Kanäle innerhalb einer Schicht linear, wellenförmig, mäandrierend oder zickzackförmig sind. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die poröse Materiallage und/oder die Kanalwände mittlere Porengrößen im Bereich von etwa 1 nm bis 10cm, vorzugsweise 10 nm bis 10 mm, und besonders bevorzugt 50 nm bis 1 mm aufweisen. 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als poröser Trägerköφer eine Modulstruktur verwendet wird, die durch Karbonisierung eines ggf. strukturierten, gerollten, geprägten, vorbehandelten und/oder gefalteten Flächengebildes auf Faser-, Papier- Textil oder Polymermaterialbasis erzeugt wird.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Material aus ein- oder mehrzelligen Mikroorganismen, Pilzen, Sporen, pflanzlichen Zellen, Zellkulturen oder Geweben oder tierischen bzw. menschlichen Zellen, Zellkulturen oder Geweben oder Mischungen davon ausgewählt ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beladung des Trägerköφers zu einer weitgehenden Immobilisierung des biologischen Materials in und/oder auf dem Trägerköφer führt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ausgewählt ist aus Flüssigkeiten oder Gasen, Lösungsmitteln, Wasser, gasförmigen oder flüssigen oder festen Reaktionsedukten und/oder -produkten, Nährlösungen für Enzyme Zellen und Gewebe, Mischungen davon und dergleichen.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerköφer in einem Gehäuse angeordnet ist, oder in oder auf einem geeigneten Behälter, ausgewählt aus Reaktoren für chemische oder biologische Reaktoren wie Kolben, Flaschen, insbesondere Zellkulturflaschen, Rollerflaschen, Spinnerflaschen, Kulturröhrchen, Zellkulturkammern, Zellkulturschalen, Kultuφlatten, Pipettenhütchen, Schnappdeckelgläser, Kryoröhrchen, Rührreaktoren, Festbettreaktoren, Rohrreaktoren und dergleichen angeordnet ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12 , dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerköφer in dem Behälter durch mindestens teilweises Befüllen des Behälters mit dem fluiden Medium in Kontakt gebracht wird. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerköφer in dem Behälter im Medium bewegt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13 , dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter mit einem mit dem Medium gefüllten Vorratsgefäß über Zufühmngseinrichtungen verbunden ist, und gegebenenfalls zusätzlich Abführungseinrichtungen vorgesehen sind, um das Medium kontinuierlich oder diskontinuierlich in und durch den Behälter zu führen.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerköφer kontinuierlich oder diskontinuierlich, ggf. getaucht in einem Behälter, mit einem fluiden Medium durchströmt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchströmung des Trägerköφers mit dem fluiden Medium durch Bewegen des Trägerköφers im Medium bewirkt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchströmung des Trägerköφers mit dem fluiden Medium durch Bewegen des Mediums im Trägerköφer bewirkt wird.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Medium kontinuierlich oder diskontinuierlich Nährstoffe zu und/oder Stoffwechselprodukte abgeführt werden. 20. Poröser Trägerköφer auf Kohlenstoffbasis wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beschrieben, umfassend lebendes und/oder vermehrungsfähiges immobilisiertes biologisches Material.

21. Trägerköφer nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Material aus ein- oder mehrzelligen Mikroorganismen, Pilzen, Sporen, pflanzlichen Zellen, Zellkulturen oder Geweben oder tierischen bzw. menschlichen Zellen, Zellkulturen oder Geweben oder Mischungen davon ausgewählt ist.

22. Trägerköφer gemäß Anspruch 20 oder 21 , bestehend aus Aktivkohle, gesinterter Aktivkohle, amoφhem, kristallinem oder teilkristallinem Kohlenstoff, Graphit, pyrolytisch erzeugtem kohlenstoffhaltigen Material, Kohlefaser, oder Carbiden, Carbonitriden, Oxycarbiden bzw. Oxycarbonitriden von Metallen oder Nichtmetallen, sowie aus Mischungen dieser. 23. Trägerköφer gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass er basierend auf dem gesamten Gewicht des beladenen Trägerköφers zwischen 10^'5 Gew.-% und 99 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 10^"2 und 80 Gew.-%, am meisten bevorzugt zwischen 1 und 50 Gew.-% Zellen enthält.

24. Reaktor für die Kultivierung von Zellen, umfassend einen oder mehrere Trägerköφer gemäß den Ansprüchen 20 bis 23.

25. Reaktor nach Ansprach 24, ausgewählt aus Reaktoren für chemische oder biologische Reaktoren wie Kolben, Flaschen, insbesondere Zellkulturflaschen, Rollerflaschen, Spinnerflaschen, Kulturröhrchen, Zellkulturkammern, Zellkulturschalen, Kultuφlatten, Pipettenhütchen, Schnappdeckelgläser, Kryoröhrchen, Rührreaktoren, Festbettreaktoren, Rohrreaktoren.

26. Rollerflasche umfassend einen Trägerköφer nach einem der Ansprüche 20 bis 23.

27. Kartusche umfassend einen Trägerköφer nach einem der Ansprüche 20 bis 26, in einem Gehäuse.