CN104974976B - 一种细胞的固定化培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种细胞的固定化培养方法，涉及细胞培养技术领域，用于增加细胞层中的表层细胞在单位时间内获得的培养基，进而提高细胞的固定化培养的产量。所述细胞的固定化培养方法包括：将所述细胞接种在所述支撑层上，形成附着在所述支撑层上的细胞层；向所述支撑层提供培养基，所述培养基浸润所述支撑层及所述细胞层；其中，所述细胞层中形成有多条第一沟道，各所述第一沟道中储存有所述培养基。本发明提供的细胞的固定化培养方法用于藻类、真菌及细菌的培养等。

Description

一种细胞的固定化培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞的固定化培养方法。

背景技术

细胞的固定化培养是一种较为常见的细胞培养方法，该细胞培养方法具有成本低、能耗低、单位培养面积产量高的优点，适用于藻类、细菌及真菌的培养等。

通常，在细胞的固定化培养中，首先将细胞接种于支撑层，形成附着在支撑层上的细胞层(细胞层包括距离支撑层较远的表层细胞和距离支撑层较近的底层细胞)，而后向支撑层提供培养基，使培养基浸润支撑层和其上的细胞层，同时向细胞层提供光照和二氧化碳等气体，使得细胞层中的细胞能够进行生长，从而实现细胞的固定化培养。在细胞层中，由于表层细胞直接接触外界的光照以及二氧化碳等气体，因此表层细胞的生长最为旺盛，从而能够在细胞的固定化培养中提供大部分的产量。

然而，上述培养过程中，若从细胞层的表面流加培养基，则会冲刷细胞层表面，对于互相之间附着力不够强的细胞而言，培养基将冲落细胞层表面的细胞，进而影响产量。因此，在支撑层上，通常向与细胞附着的表面相对的表面提供培养基，以避免培养基冲刷表层细胞的问题，但此时培养基需经由支撑层及细胞层中的底层细胞，才能够渗透至细胞层中的表层细胞，导致培养基无法畅通无阻地渗透支撑层及底层细胞并最终提供给表层细胞，从而导致表层细胞的生长受到限制，表层细胞在单位时间内获得的培养基减少，最终致使细胞的固定化培养的产量降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞的固定化培养方法，用于增加细胞层中的表层细胞在单位时间内获得的培养基，进而提高细胞的固定化培养的产量。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供的细胞的固定化培养方法，用于在支撑层上对细胞进行培养，所述细胞的固定化培养方法包括：

将所述细胞接种在所述支撑层上，形成附着在所述支撑层上的细胞层；

向所述支撑层提供培养基，所述培养基浸润所述支撑层及所述细胞层；

其中，所述细胞层中形成有多条第一沟道，各所述第一沟道中储存有所述培养基。

本发明提供的细胞的固定化培养方法，在附着于支撑层上的细胞层中，形成多条第一沟道，从而在向支撑层提供的培养基浸润支撑层及其上的细胞层后，部分培养基将储存在该第一沟道中。通过该第一沟道的设置，使得细胞层中的表层细胞不仅能够获得经由支撑层和底层细胞渗透至表层细胞的培养基，还能够从第一沟道中直接获得培养基。因此，与现有技术中表层细胞仅能够获得经由支撑层和底层细胞渗透至表层细胞的培养基相比，在本发明中，表层细胞在单位时间内获得的培养基明显增加，从而避免或减轻了培养基不足对表层细胞的生长的限制，最终使得细胞的固定化培养的产量提高。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例提供的细胞的固定化培养方法的流程图；

图2为图1示出的第一沟道的形成方法的流程图；

图3为图1示出的第一沟道的另一种形成方法的流程图；

图4为图1示出的细胞的固定化培养方法的改进方案的流程图；

图5为图4示出的细胞的固定化培养方法的进一步改进方案的流程图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明实施例提供的细胞的固定化培养方法，下面结合说明书附图进行详细描述。

请参阅图1，本发明实施例提供的细胞的固定化培养方法包括：

步骤10、将细胞接种在支撑层上，形成附着在支撑层上的细胞层。具体地，可通过抽滤、喷洒及刮涂等接种方法，将细胞接种在固定化养殖平台中的支撑层上，形成附着在支撑层上的细胞层。该细胞层由待培养的细胞构成，包括表层细胞和底层细胞，一般而言，表层细胞和底层细胞各占细胞层的一半。底层细胞附着在支撑层上；表层细胞覆盖底层细胞，且表层细胞直接接触外界的光照和二氧化碳等气体。

步骤20、向支撑层提供培养基，培养基浸润支撑层及细胞层；其中，细胞层中形成有多条第一沟道，各第一沟道中储存有培养基。具体地，培养基可包括水、营养物质和生长因子，其中，营养物质可包括碳源、氮源、微量元素和金属盐等；向支撑层提供培养基的具体方式包括但不限于喷淋、滴灌、浸润和雾化等；培养基在浸润支撑层后又浸润其上的细胞层。其中，部分培养基优先被细胞层中的底层细胞吸收，而后渗透至表层细胞，其余部分培养基储存在上述各第一沟道中，直接为各第一沟道周围的表层细胞提供培养基；同时，这些培养基在重力作用下，由上而下自然地流动，未被细胞吸收和未被第一沟道所储存的培养基最终将从细胞层中流出。

在本发明实施例提供的细胞的固定化培养方法中，通过在附着于支撑层上的细胞层中形成多条第一沟道，使得在进行细胞的固定化培养时，向支撑层提供的培养基在浸润支撑层及细胞层后，部分培养基储存在第一沟道中；这样，在细胞层中，表层细胞不仅能够获得经由支撑层和底层细胞而渗透至表层细胞的培养基，还能够从第一沟道中直接获得培养基。因此，与现有技术中表层细胞仅能够获得经由支撑层和底层细胞渗透至表层细胞的培养基相比，本发明实施例能够明显增加细胞层中表层细胞在单位时间内获得的培养基，进而避免或减轻了培养基不足对表层细胞的生长的限制，最终使得细胞的固定化培养的产量得以提高。

进一步地，在具体实施时，还可先行搭建固定化养殖平台，固定化养殖平台包括：用于接种细胞的支撑层，用于储存培养基的培养基储存容器，以及用于使培养基在支撑层和培养基储存容器之间循环的培养基输送装置。支撑层可由柔性材料(如丝绸等)、亲水材料(如木材等)或柔性亲水材料(如棉布等)制成，其中：柔性材料制成的支撑层能够根据不同的培养条件改变自身形状，便于细胞的接种和采收；亲水材料制成的支撑层具有良好的保持培养基的性能，能够增加在单位时间内透过支撑层并到达细胞层的培养基，进而提高细胞的固定化培养的产量；柔性亲水材料制成的支撑层则兼具上述两者的优点；本领域技术人员可根据实际情况选择合适材料制成的支撑层。培养基储存容器可选用无菌水箱等大型密封储液容器，以确保培养液的无菌保存；培养基输送装置可由多条管线及循环泵组成，其具体设置可根据固定化养殖平台的工作环境及培养基循环运行的实际情况决定，本发明并不对此进行特别限定。

可以理解的是，在细胞的固定化培养的初期，细胞层中的部分的细胞可能因附着不牢固而从细胞层脱落。为了防止第一沟道被这些脱落的细胞填满、失去储存培养基的作用，本发明实施例优选至少有一条第一沟道的延伸方向与细胞层中培养基的流动方向一致。该设置所产生的效果为：即使上述从细胞层脱落的细胞进入该延伸方向与培养基流动方向一致的第一沟道，这些脱落的细胞也将会随着培养基从第一沟道流出，从而确保第一沟道不会被上述脱落的细胞填满，进而确保细胞层中的表层细胞在单位时间内能够从第一沟道获得较多的培养基，最终提高细胞的固定化培养的产量。

作为上述技术方案的改进方案，至少有一条第一沟道的两端与细胞层的相对的两侧边连通，即不论该第一沟道是否弯曲，其两端均位于细胞层相对的两侧边，从而使得第一沟道的长度较长。由于第一沟道的长度越长，与之接近的表层细胞就越多，因此，通过上述设置，使得细胞层中更多的表层细胞能够直接从第一沟道中获得培养基，从而进一步提高细胞的固定化培养的产量。

为了进一步使细胞层中较多的表层细胞能够从第一沟道中获得培养基，作为上述技术方案及其改进方案的一种优化方案，第一沟道的深度为d，细胞层的厚度为t，则d和t满足如下关系：t≥d≥0.5t，上述内容已经提及，一般而言，细胞层中表层细胞和底层细胞各占细胞层的一半，因此，上述设置使得在第一沟道附近，位于表层细胞中任意层面的细胞均能够从第一沟道直接获得培养基，从而使得更多的表层细胞能够直接从第一沟道中获得培养基，进而提高细胞的固定化培养的产量。此外，在不会影响表层细胞从第一沟道中获得培养基的前提下，也可使第一沟道的深度和细胞层的厚度相等，从而使得在第一沟道附近，除表层细胞之外，底层细胞也能够从第一沟道中获得培养基，进而进一步提高细胞的固定化培养的产量。

不论上述何种第一沟道，均可通过如下两种方法形成。

如图2所示，在第一种形成第一沟道的方法中，在步骤10(即“将所述细胞接种在所述支撑层上，形成附着在所述支撑层上的细胞层”的步骤)之后，进行如下步骤：

步骤11、在细胞层中划出多条第一沟道。具体地，根据所要形成的沟道的厚度以及深度，选取适当的工具(例如宽度合适的铁片或塑料片)，以适当的力度在细胞层表面划出第一沟道。进一步地，对于划出沟道的工具的材料，优选对于当前培养的细胞不具有粘附性的材料，例如某些塑料或金属等。此外，在形成第一沟道后，可将因形成第一沟道而从细胞层脱落的细胞再次接种在支撑层上，以减少形成第一沟道所造成的细胞固定化培养的产量损失。需要说明的是，该步骤11可在步骤20(即“向支撑层提供培养基，培养基浸润支撑层及细胞层”的步骤)之后进行，也可在步骤20之前进行，本领域技术人员可根据实际情况选择进行该步骤11的时机。

如图3所示，在第二种形成第一沟道的方法中，在步骤10(即“将所述细胞接种在所述支撑层上，形成附着在所述支撑层上的细胞层”的步骤)前，进行如下步骤：

步骤12、在支撑层上设置多个可取下的条状物；

并且，在步骤10后，进行如下步骤：

步骤13、取下条状物以及接种在条状物上的细胞，在细胞层中形成多条第一沟道。

通过上述方法流程，在细胞层中形成与支撑层上放置的条状物形状相同的第一沟道。具体地，例如，根据所要形成的第一沟道的形状以及位置，在支撑层上放置多条棉线，然后将待培养的细胞接种至该放置有多条棉线的支撑层上；在接种完毕后，将这些棉线连同其上附着的细胞一同取下，即可在原棉线的位置形成第一沟道。可以理解的是，通过这种方式形成的第一沟道，其深度通常与细胞层的厚度相等。此外，在将上述条状物取下后，可将附着在条状物上的细胞冲洗下来并收集，并将这部分细胞再次接种在支撑层上，以减少因形成第一沟道而造成的细胞的固定化培养的产量损失。可以理解的是，步骤13可在步骤20(即“向支撑层提供培养基，培养基浸润支撑层及细胞层”的步骤)之后进行，也可在步骤20之前进行，本领域技术人员可根据实际情况选择进行该步骤13的时机。

如图4所示，进一步地，随着细胞的固定化培养的进行，细胞层的厚度逐渐变大，细胞层中表层细胞逐渐增加，并且第一沟道逐渐被细胞层中脱落的细胞填满并消失。因此，在细胞的固定化培养初期所形成的第一沟道已经无法为表层细胞提供足够的培养基，从而在本发明实施例中，对于上述技术方案及其改进方案而言，在步骤20(即“向支撑层提供培养基，培养基浸润支撑层及细胞层”的步骤)后，还包括：

步骤30、当细胞层的厚度达到1mm-5mm时、或各第一沟道被从细胞层脱落的细胞填满时，在细胞层中形成多条第二沟道，各第二沟道中储存有培养基。

在步骤30中，可根据细胞层的厚度来判断形成第二沟道的时间。具体地，由于在不同的细胞所形成细胞层中，细胞的密集程度不同，一般来说，对于同样厚度的细胞层而言，细胞层中的细胞越密集，其消耗培养基的速度就越快。因此，对于细胞比较密集的细胞层，应当在细胞层厚度较小时在其上划出第二沟道，使表层细胞能够获得充足的培养基；而对于细胞比较稀疏的细胞层，则应当在细胞层厚度较大时在其上划出第二沟道，以避免形成第二沟道时造成细胞层中的细胞减少。由实验可知，对于大多数细胞而言，当细胞层厚度在1mm-5mm范围内时，可在细胞层中形成第二沟道。形成第二沟道的具体时机可由本领域技术人员根据其培养的细胞的密集程度推断得出。

此外，在步骤30中，还可根据第一沟道是否被从细胞层脱落的细胞填满，来判断形成第二沟道的时机。这是由于，对于某些细胞之间附着力较弱的细胞层，其中的细胞会在固定化培养过程中不断脱落，进而在细胞层厚度较小时将第一沟道填满，此时第一沟道已无法发挥储存培养基并向表层细胞提供培养基的作用，因此需要在细胞层中形成第二沟道，以持续地为细胞层中的表层细胞提供培养基，确保细胞的固定化培养的产量。可以理解的是，也可在各第一沟道完全被从细胞层脱落的细胞填满前，形成第二沟道，防止第一沟道在未被完全被部分填满时已无法在单位时间内向表层细胞提供较多的培养基，确保细胞的固定化培养的产量。

进一步地，优选第二沟道与第一沟道交叉设置，从而通过相互交叉的第二沟道和第一沟道，将细胞层分划为若干个细胞区域，每个细胞区域被第一沟道和/或第二沟道包围，这使得每个细胞区域内的细胞层中的表层细胞均能够从四周任意方向获得培养液，从而使得表层细胞在单位时间内获得的培养基进一步增加，最终提高细胞的固定化培养的产量。

此外，由于随着细胞的固定化培养的进行，细胞层中可能产生细胞聚集区域，细胞聚集区域内的细胞密集程度大于其他区域内的细胞密集程度，因此可根据这些细胞聚集区域来设置第二沟道的形状，以使细胞聚集区域内的第二沟道的条数较多或被更多的第二沟道环绕，从而确保细胞聚集区域内的表层细胞在单位时间内获得较多的培养基。具体地，第二沟道的形状，除长条形外，也可为由多个长条形的第二沟道构成的多边形，还可为由长条形的第二沟道首尾相接所构成的圆环形，其中，可将上述细胞聚集区域作为中心，设置多边形的第二沟道和圆环形的第二沟道，从而使得细胞聚集区域内的表层细胞获得的培养基进一步增加。

如图5所示，进一步地，由于在细胞的固定化培养时间较长的情况下，第一沟道和第二沟道可能均被从细胞层脱落的细胞所填满。因此，为了确保表层细胞能够在单位时间获得较多的培养基，在本发明实施例中，在步骤30(当细胞层的厚度达到1mm-5mm时、或各第一沟道被从细胞层脱落的细胞填满时，在细胞层中形成第二沟道)后，还包括：

步骤40、当各第一沟道和各第二沟道被从细胞层脱落的细胞填满时，在细胞层中形成多条第三沟道，各第三沟道中储存有培养基。通过该步骤，使得在第一沟道和第二沟道被从细胞层脱落的细胞填满时，细胞层中的表层细胞能够继续从第三沟道中获得培养基，从而得以继续旺盛地生长。此外，由于在细胞培养时间过长时，第三沟道也可能被细胞层脱落的细胞填满，因此，以此类推，可继续在细胞层中形成第四沟道和第五沟道等，从而在细胞的固定化培养的整个过程中，使表层细胞得以旺盛地生长，进而进一步提高细胞的固定化培养的产量。与第二沟道相同，第三沟道、第四沟道和第五沟道的形状可为长条形、圆形和多边形等，本领域技术人员可根据细胞层中细胞聚集区域的分布情况设置第三沟道、第四沟道和第五沟道的位置和形状。

进一步地，在本发明实施例中，第二沟道的宽度大于第一沟道的宽度，第三沟道的宽度大于第二沟道的宽度，这是由于随着细胞层中的细胞的生长，表层细胞越来越多，其生长所需要的培养基也随之增加，因此，较晚形成的第二沟道需要比较早形成的第一沟道更宽，以储存更多的培养基，从而使得细胞层中的表层细胞能够从第二沟道中获得足够的培养基。出于同样的目的，第三沟道的宽度也要大于第二沟道的宽度。

具体地，由于上述内容已经提到，第一沟道在细胞的固定化培养的初期(即细胞层厚度小于1mm时)形成，此时接种在支撑层上的细胞数量较少，若第一沟道过宽，则形成第一沟道的过程将导致接种在支撑层上的细胞大量脱落，进而影响细胞的固定化培养的产量，因此，在本发明实施例中，使第一沟道具有较小的宽度，以避免对细胞的固定化培养的产量造成影响，例如，第一沟道的宽度为1mm-2mm即可。另一方面，随着固定化培养的进行，细胞层中的表层细胞增多，其在单位时间内所需的培养基也随之增加，从而需要宽度较大的第二沟道和第三沟道，以确保表层细胞在单位时间内获得足够的培养基。例如，第二沟道和第三沟道的宽度可为2mm-5mm。可以理解的是，第一沟道、第二沟道及第三沟道各自的宽度，并不限于上述范围，本领域技术人员可综合考虑第一沟道、第二沟道及第三沟道所占据的养殖面积，以及细胞层中表层细胞的生长所需的培养基的量，对第一沟道、第二沟道及第三沟道的宽度进行设置。

进一步地，在上述内容已经提及，根据固定化培养的细胞的不同，细胞层中的细胞的密集程度也不同，因此，对于不同的细胞，单位培养面积内的表层细胞所需的培养基的量也存在不同，从而为了在任意细胞的固定化培养过程中，均能够确保细胞层中的表层细胞在单位时间内获得较多的培养基，在本发明实施例中，平行且相邻的第一沟道之间的距离、平行且相邻的第二沟道之间的距离、平行且相邻的第三沟道之间的距离、平行且相邻的第一沟道和第二沟道之间的距离、平行且相邻的第一沟道和第三沟道之间的距离、以及平行且相邻的第二沟道和第三沟道之间的距离为2cm-50cm。

具体地，对于细胞的密集程度较高的细胞层，可使上述各距离较小，从而使得单位培养面积内流过的培养基较多，例如，若细胞层的上表面为边长为1m的正方形，第一沟道、第二沟道和第三沟道均为长条状，则可在细胞层上形成共计51条相互平行且相邻的第一沟道、第二沟道和第三沟道，其中，相邻的第一沟道、第二沟道或第三沟道之间的距离为2cm。此外，由于上述已经提及，随着固定化培养的进行，细胞层中表层细胞逐渐增多，则单位面积内所需的培养基的量也逐渐增加，因此，一般而言，平行且相邻的第一沟道之间的距离大于平行且相邻的第二沟道之间的距离，平行且相邻的第二沟道之间的距离大于平行且相邻的第三沟道之间的距离。通过上述设置，能够确保在细胞的固定化培养的任意时期，表层细胞在单位时间内获得足够的培养基。

为了证明本发明实施例确实具有提高细胞的固定化养殖的产量的效果，本申请的发明人还进行了如下对比实验：

对比实验1

实验组和对照组均对栅藻细胞进行固定化培养，实验组中附着于支撑层的栅藻细胞层中形成有第一沟道和第二沟道，对照组中附着于支撑层的细胞层中未形成沟道。

(1)搭建固定化养殖平台：

在长×宽为1m×1m、厚为5cm的有机玻璃板上平铺与有机玻璃板大小相同的无纺布，以该无纺布作为支撑层，然后将该有机玻璃板连同其上的无纺布竖直放置(同时采取措施防止无纺布脱落)，在无纺布与有机玻璃板之间、从两者上部不断滴加培养基，培养基自另一端留下，落入位于有机玻璃板下方的水槽内，该水槽为培养基储存容器，设置潜水泵以及循环管线，构成培养基输送装置，使得培养基能够循环浸润无纺布(实验组和对照组各设置一套上述固定化养殖平台)。

(2)接种栅藻细胞及形成第一沟道：

将相同浓度的栅藻藻液(包括培养基和栅藻细胞)分别喷洒在实验组和对照组的无纺布上，分别形成栅藻细胞层；在培养基储存容器中的培养基内通入二氧化碳与空气的混合气体，其中二氧化碳气体的体积分数为2％，并通过曝气石对该混合气体进行分散，促进该混合气体的溶解；采用荧光灯对附着于无纺布表面的细胞层进行持续光照；

实验组：在接种后，在附着于支撑层的栅藻细胞层中，使用塑料片划出多条长条状的第一沟道，其中部分第一沟道的延伸方向与培养基在栅藻细胞层中的流动方向一致，其余部分的第一沟道的延伸方向与培养基在栅藻细胞层中的流动方向垂直，从而在栅藻细胞层中形成网格状的第一沟道；开始对栅藻细胞层中的栅藻细胞进行培养。

对照组：不进行处理，按照上述条件开始培养。

(3)培养2天后，在实验组和对照组的细胞层厚度均增加至1mm时，形成第二沟道：

实验组：在栅藻细胞层中，使用塑料片划出多条圆形的第二沟道，第二沟道环绕栅藻细胞层中栅藻细胞较为密集的区域，同时与多条第一沟道交叉，；继续对栅藻细胞进行培养；

对照组：不进行处理，继续按照上述条件对栅藻细胞进行培养。

继续培养3天，该实验共计培养5天，采收栅藻细胞层中的所有栅藻细胞，将采收得到的栅藻细胞烘干，测定烘干后的栅藻细胞的质量。

实验结果

在对比实验1中，实验组中附着于无纺布上的栅藻细胞层中形成有第一沟道和第二沟道，对照组中附着于无纺布上的栅藻细胞层中未形成有沟道。参照表1，实验组的产量比对照组的产量高31％。上述结果说明，通过在栅藻细胞层中形成第一沟道和第二沟道，使得在栅藻细胞的固定化培养过程中，即使栅藻细胞层的厚度逐渐变大导致表层细胞距离支撑层较远，也能够使得表层细胞在单位时间内获得较多的培养基，从而使得栅藻细胞培养的平均产量得到提高。

表1

	培养时间	培养面积	是否在细胞层中形成沟道	平均产量
					实验组	5天	1m<sup>2</sup>	是	17g/m<sup>2</sup>/天
对照组	5天	1m<sup>2</sup>	否	13g/m<sup>2</sup>/天

对比实验2

(1)搭建固定化养殖平台：

在长×宽为1m×1m、厚为5cm的有机玻璃板上平铺无纺布，无纺布的面积为有机玻璃板面积的1/3，以该无纺布作为支撑层；然后将该有机玻璃板连同其上的无纺布竖直放置(同时采取措施防止无纺布脱落)，在无纺布与有机玻璃板之间、从两者上部不断滴加培养基，培养基自另一端留下，落入位于有机玻璃板下方的水槽内，该水槽为培养基储存容器，设置潜水泵以及循环管线，构成培养基输送装置，使得培养基能够循环浸润无纺布(实验组和对照组各设置一套上述固定化养殖平台)。

(2)接种小球藻细胞与形成第一沟道：

实验组：无纺布上铺放10条与培养基流向一致(在重力方向上由上到下)的棉线，然而后将一定浓度的小球藻藻液(包括小球藻细胞和培养基)喷洒在无纺布上，使得小球藻细胞接种在无纺布上，待无纺布上形成小球藻细胞层后，将10条棉线连同附着在其上的小球藻细胞取下，在小球藻细胞层中形成10条第一沟道。

对照组：将一定浓度的小球藻藻液(包括小球藻细胞和培养基)喷洒在无纺布上，使得小球藻细胞接种在无纺布上，在无纺布上形成小球藻细胞层。

(3)培养小球藻细胞与形成第二沟道：

将实验组和对照组中附着有小球藻细胞层的无纺布置于同一培养体系内，在水槽中的培养基内通入二氧化碳与空气的混合气体，其中二氧化碳的体积分数为2％，并通过曝气石对该混合气体进行分散，促进混合气体的溶解，采用荧光灯进行对附着于无纺布表面的小球藻细胞层进行持续光照；

实验组：在培养至小球藻细胞层厚度为1mm以上时，采用塑料片在小球藻细胞层中划出多个同心圆状的第二沟道，第二沟道与原第一沟道交叉，且第二沟道环绕小球藻细胞层中细胞较为密集的区域；将第二沟道形成过程中脱落的小球藻细胞接种于无纺布上，继续进行小球藻细胞的固定化培养。

对照组：不进行特别处理，继续进行固定化培养。

实验组以及对照组各自分别进行4天的固定化培养后，分别采收各自产出的小球藻细胞，将其烘干，并测定烘干后的小球藻细胞的质量。

实验结果

实验组中附着于无纺布上的小球藻细胞层中形成有第一沟道和第二沟道，对照组中附着于无纺布上的小球藻细胞层中未形成有沟道。参照表2，实验组的产量比对照组产量高25％。该结果说明，通过在小球藻细胞层中形成第一沟道和第二沟道，使得在小球藻细胞的固定化培养过程中，即使小球藻细胞层的厚度逐渐变大导致表层细胞距离支撑层较远，也能够通过第一沟道和第二沟道中储存的培养基，使得表层细胞在单位时间内获得较多的培养基，从而使得小球藻细胞培养的平均产量得到提高。

表2

	培养时间	培养面积	是否在细胞层中形成沟道	平均产量
					实验组	4天	1/3m<sup>2</sup>	是	12.5g/m<sup>2</sup>/天
对照组	4天	1/3m<sup>2</sup>	否	10g/m<sup>2</sup>/天

在上述实施方式的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同或相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种藻类细胞的固定化培养方法，用于在支撑层上对细胞进行培养，其特征在于，所述细胞的固定化培养方法包括：

将所述细胞接种在所述支撑层上，形成附着在所述支撑层上的细胞层；

向所述支撑层提供培养基，所述培养基浸润所述支撑层及所述细胞层；

其中，所述细胞层中形成有多条第一沟道，各所述第一沟道中储存有所述培养基，

当所述细胞层的厚度达到1mm-5mm时、或各所述第一沟道被从所述细胞层脱落的所述细胞填满时，在所述细胞层中形成多条第二沟道，各所述第二沟道中储存有所述培养基。

2.根据权利要求1所述的细胞的固定化培养方法，其特征在于，至少有一条所述第一沟道的延伸方向与所述细胞层中培养基的流动方向一致。

3.根据权利要求1所述的细胞的固定化培养方法，其特征在于，至少有一条所述第一沟道的两端与所述细胞层的相对的两侧边连通。

4.根据权利要求1所述的细胞的固定化培养方法，其特征在于，所述第一沟道的深度为d，所述细胞层的厚度为t，则d和t满足如下关系：t≥d≥0.5t。

5.根据权利要求1所述的细胞的固定化培养方法，其特征在于，在所述细胞层中形成多条所述第一沟道的方法包括：

在所述将所述细胞接种在所述支撑层上，形成附着在所述支撑层上的细胞层后，在所述细胞层中划出多条所述第一沟道；或

在所述将所述细胞接种在所述支撑层上，形成附着在所述支撑层上的细胞层前，在所述支撑层上设置多个可取下的条状物，在所述将所述细胞接种在所述支撑层上后，取下所述条状物以及接种在所述条状物上的所述细胞，在所述细胞层中形成多条所述第一沟道。

6.根据权利要求1所述的细胞的固定化培养方法，其特征在于，所述第二沟道与所述第一沟道交叉设置。

7.根据权利要求1所述的细胞的固定化培养方法，其特征在于，所述在所述细胞层中形成多条第二沟道后，所述细胞的固定化培养方法还包括：

当各所述第一沟道和各所述第二沟道被从所述细胞层脱落的所述细胞填满时，在所述细胞层中形成多条第三沟道，各所述第三沟道中储存有所述培养基。

8.根据权利要求7所述的细胞的固定化培养方法，其特征在于，所述第二沟道的宽度大于所述第一沟道的宽度，所述第三沟道的宽度大于所述第二沟道的宽度。

9.根据权利要求7所述的细胞的固定化培养方法，其特征在于，平行且相邻的所述第一沟道之间的距离、平行且相邻的所述第二沟道之间的距离、平行且相邻的所述第三沟道之间的距离、平行且相邻的所述第一沟道和所述第二沟道之间的距离、平行且相邻的所述第一沟道和所述第三沟道之间的距离、以及平行且相邻的所述第二沟道和所述第三沟道之间的距离为2cm-50cm。