CN1090461C - 香味料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种香味料的制备方法，其中一种酵母溶胞产物与酱醪或一部分酱醪混合，让该混合物在30-70℃反应以便溶胞产物的AMP转化成IMP。

Description

香味料的制备方法
本发明的主题是一种香味料的制备方法。
举例来说，酵母抽提物广泛用作汤、肉基产品和调味汁的香味料，其中尤以鸟苷5′-单磷酸(GMP)和肌苷5-单磷酸(IMP)为这些抽提物的主香成分，后者是用来增强肉基产品风味的主要的不挥发化合物。IMP由腺苷5′-单磷酸(AMP)进行氧化脱氨基而制得，该反应用一种称之为腺苷单磷酸脱氨基酶的酶催化，该酶存在于许多真核或原核微生物中，尤其是某些曲霉属的霉菌中。
JP53018773描述了借助取自种曲的黑曲霉(Aspergillus niger)分离出的一种腺苷单磷酸脱氨基酶将一种酵母溶解物的AMP转化成IMP。
JP55120788还描述了在某些耐高盐微生物、特别是球拟酵母属或念珠菌属中存在一种腺苷单磷酸脱氨基酶，但不幸的是该脱氨基酶40℃时便呈现热不稳定性且酶活性较低，故特别难以工业化应用。
另外，已知的传统酱油制备方法为分别涉及曲霉和耐高盐微生物的两步发酵。EP417481公开了一种发酵酱油的制备方法，其中曲是由种曲对煮熟大豆和烘烤小麦混合物发酵而制得，该曲在水悬浮液中借种曲发酵过程产生的酶进行水解，温度45-60℃，3-8小时，向该水解过的曲悬浮液中加入氯化钠制成酱醪，酱醪用耐高盐微生物发酵、压榨，以压榨过的酱醪或饼中回收液体，将该液体巴氏灭菌、再澄清除沉淀。
本发明的目的是直接使用传统酱醪或其的一部分将一种酵母溶解物的AMP转化成IMP。
为此目的，在本发明香味料的制备方法中，一种酵母溶解物与酱醪或一部分酱醪混合，使该混合物在30-70℃反应从而将溶解物的AMP转化成IMP。
实际上出人意料地观察到：尽管酱醪没有经如上所述的可产生腺苷单磷酸脱氨基酶的耐高盐微生物进行发酵，但酱醪却具有工业价值的脱氨基酶活性。
此外，亦令人惊奇的是酱醪的腺苷单磷酸脱氨基酶活性来自种曲，因为种曲要在高盐浓度下用耐高盐微生物发酵几个星期、甚至几个月。更令人惊奇的是，种曲的脱氨基酶居然可有效地忍受这种发酵条件，因为该盐含量足能使其变性，而且发酵实际上应使其水解。
此外，由于酱醪在众多国家能非常大量地按传统方法生产，故本发明方法的优点在于所使用的腺苷单磷酸脱氨基酶极为经济。
另一个优点在于这个事实，即不需要分离所述脱氨基酶，高盐含量的酱醪或其一部分组份可直接加入到酵母抽提物中，尽管如此，还能获得大于50％的转化率，或甚至会大于80％。本发明方法甚至还可能获得在含50％以上酵母抽提物粉的混合物中的至少50％的转化量，换句话说，混合物越是特别粘稠、或成糊状，则越是出人意料。
优点之三是居于这个事实，即来自酱醪的饼通常被丢弃，所以加大了废物的代价，特别由于废物盐含量高而导致污染的问题。
此外，酱醪提取液中的沉淀传统做法是在酱醪开始发酵时再引起，而本发明是将其用作给酵母抽提物增香工序中的原料。令人惊奇的是腺苷单磷酸脱氨基酶活性在该沉淀中被很好地保留。
本说明书中，″曲″(″koji″)一词是指用种曲将蛋白质原料和碳水化合物原料发酵的产物，尤其是将豆科植物或煮过的油料植物和煮或焙烤过的谷物原料的混合物，例如大豆或煮过的豆类和煮或焙烤过的小麦或米的混合物发酵的产物。另外，该种曲可取自在日本和中国特别易于商购的曲孢子的种曲，它具体包括米曲霉(Aspergillus oryzae)或酱油曲霉(Aspergillus Soyae)孢子。
同样，″酱醪″(″moromi″)一词是指在酱油的传统制备模式中的至少一类曲和一种盐水的混合物，它借助耐高盐微生物菌种发酵几星期或甚至几个月，该微生物是风味物质的产生者，例如为某些易变假丝酵母(Candida Versatilis)，埃切球拟酵母(Torulopsisetchelsii)，鲁氏酵母，(Saccharomyces rouxii)，或嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)之类。例如EP429760所述，酱醪也可以是曲、盐水和富含蛋白原料和/或富含碳水化合物原料的发酵混合物。
最后，在本说明书的其余部分中″脱氨基酶″一词可按腺苷单磷酸脱氨基酶之含义使用。另外，除另有说明，百分比按重量计算。
因此本发明方法要寻求将酵母溶解物的AMP转化成IMP。为此选择水解酵母的悬浮液或粉状酵母抽提物作为酵母溶解物，它们是由酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、Kluvveromyces、圆酵母属(Torula)或单胞发酵菌属(Zymomonas)按常规制得的。
以水解酵母悬浮液形式的溶解物例如其干物质含量为5-50％，可通过将商购粉状酵母抽提物与水混合的常规方法制备，或者将鲜酵母的悬浮液水解而制备，即活酵母进行质壁分离、和/或细胞自溶，或通过加入蛋白酶进行加强(例如参见EP 39415)。
以粉状酵母抽提物形式的溶胞产物可直接与酱醪或其一部分组分混合使溶胞产物的AMP转化成IMP。这种酵母粉可从酵母抽提物厂商获得，或者将水解的酵母悬浮液进行真空干燥而制得。
实施本发明方法的特别有益的溶胞产物优选包含至少0.5％AMP(以干物质重量计)。这种溶胞产物可直接从厂商购得，或者例如在其制备过程或其它情形以下用核酸酶，特别是5′-核糖核酸酶之类的磷酸二脂酶将溶胞产物进行消化。为此，已知含有这些酶的麦芽小根抽提物可加入到酵母悬浮液中，或者将取自橘青霉(Penicilliumcitrinum)的微生物的磷酸二脂酶加入其中，然后例如让整个混合物在30-70℃反应足够长时间，直到RNA部分或全部降解成单体。
同样，实施本方法特别重要的溶胞产物例如可包括少于20％的盐(以干物质重量计)，优选少于10％，或甚至5％，从而在本方法中不会部分抑制脱氨基酶的活性。这种溶胞产物可直接从厂商购得，或者清洗粉状酵母抽提物从中除去盐，然后经常规方法干燥而获得。
为实施本方法，采用酱醪或酱醪组分将酵母溶胞产物的AMP转化成IMP。
用任何已知的制备酱油的传统方法可以获得酱醪，所述酱醪可包括相对酱醪干物质而言2％重量以上的曲。值得注意的是仅含2％的曲即足以从酱醪或其组分中获得脱氨基酶活性，这是本发明方法的实质所在。
此外，酱醪组分可以是例如用压榨、过滤和/或澄清等常规技术手段分离出的固体和/或液体酱醪。因此本方法所用的酱醪组分可以是来自酱醪的饼粕，和/或来自酱醪的液体，和/或该澄清液体、和/或该液体的沉淀，和/或饼的水抽提物。值得注意的是本发明并不试图获得含纯脱氨基酶的酱醪组分，而是例如使用上述酱油传统制造中常规方法分离出的组分。
从酱醪所得的饼粕实际上是酱醪的不溶部分，含有盐及碳水化合物和蛋白质的发酵残余物。为得到通常含至少50％干物质的饼粕，可利用压榨机或压滤机压榨酱醪，或离心分离而直接获得饼粕。该饼粕最后直接加入到酵母溶胞产物中从而将其中的AMP转化成IMP；不过优选的是将饼粕粉碎成小片后方加入到酵母溶胞产物中。
饼粕所含的腺苷单磷酸脱氨基酶亦可从饼粕中抽提，然后可将所述抽提物直接加入酵母溶胞产物中。为此，饼粕的水抽提物可通过混合1份饼粕和0.5-10份水，并将该混合物过滤而制备。然后滤液或抽提物可直接加入到酵母溶胞产物中，或预先进行蒸发或超滤浓缩后再加入其中，或进行冷冻干燥并再悬浮于水中后加入其中。所述抽提物在用于实施本方法前可以浓缩或干物形式保存。
优选在水/饼粕混合物中预先加入一种酶以降低其粘度，从而促进脱氨基酶的抽提。因此可在该混合物中加入一种酶制剂，特别是以Viscozyme商标出售的糖酶混合物(Novo Mordisk，Denmark)，让全部混合物于搅拌下反应1-5小时，然后过滤。
同样，取自酱醪的液体也可直接加入到酵母溶胞产物中，该液体一般含至少30％的干物质，其中40-60％是以盐的形式存在。2-5％经几天后能沉淀，因此最好让该液体放置1-7天，使得在压榨或离心分离中未除去的不溶物能够沉淀，通过滤纸过滤澄清，然后直接加入到酵母溶胞产物中。
最后，取自酱醪液体中的沉淀具有特别高的脱氨基酶活性，因此通常在发酵前再次加入到酱醪中的这些沉淀能直接加入到酵母溶胞产物中。
例如，为实施本方法，取自酱醪的1-30％饼粕或沉淀，10-50％酱醪，或5-50％液体可以同含5-50％水解酵母干物质的酵母悬浮液混和。
同样，例如50-90％饼粕水抽提物可直接与粉状酵母抽提物混和。
最后，可让溶胞产物/酱醪或溶胞产物/酱醪组分在30-70℃反应10分钟-6小时，并于80-100℃加热10-30分钟使其失活，如果其中含有沉淀或饼粕的固体残余物，则适宜的时候可进行过滤，因此获得了酵母香料悬浮物，例如它特别适合给肉基产品调味，尤其是调味汁和汤汁。
例如可按传统方法，如真空干燥或冷冻干澡法将失活悬浮液干燥而获得酵母粉，它亦可用作肉基产品的香味料。
本方法获得的酵母溶胞产物AMP转化成IMP的转化率至少为50％，通常至少为80％。
本发明方法在实施例中进一步详细地通过举例的说明方式叙述，除另外说明，百分比是按重量给出。这些实施例是由某些酱醪组分的腺苷单磷酸脱氨基酶活性的特征表示。脱氨基酶活性的特征
按EP 429760实施例1所述，用易变假丝酵母(Candidaversatilis)发酵15天制备出传统酱醪，不同之处是该酱醪含有相对酱醪干物质而言15重量％的曲，然后借助水力压榨机将酱醪压榨，回收饼粕和液体。
一系列酶抽提物由上述饼粕制得。为此，该饼粕再悬浮于(10％重量/体积)PH值为4-9的几种缓冲介质中，其混合2小时，之后于20,000g和4℃下离心分离30分钟，回收上清液。
同样，上述液体的酶抽提物第一系列是用PH为5的上述缓冲溶液之一将其稀释2-20倍而制备的。
根据E.A.Bruns等所述的方法(The analytical chemistry ofnitrogen and its compounds，51，Wiley-InterScience，NewYork，1970)，每一种这些提取物的腺苷单磷酰脱氨基酶活性借助测量其与奈斯勒试剂的氢氧化铵释放来进行试验。常规方法中，含100mM AMP的溶液和该饼粕的一种酶抽提物(400μl/100μl)或该液体的一种酶抽提物(480μl/20μl)的混合物于37℃恒温培养10分钟，然后加入500μl 0.5N H2SO4溶液终止该反应，向该混合物中加入5ml蒸馏水和1ml奈斯勒试剂，在430nm处测量其光密度，借助在相同条件下用已知浓度硝酸铵建立的校准曲线计算出生成的氢氧化铵的量。
脱氨基酶的最佳活性约在PH是5和6，温度约为60℃。这两个值与来自种曲的脱氨基酶表现出的值相同，但酵母脱氨基酶的那些值则明显不同，即为PH7和40℃(Yoshino等，Biochemica etBiophysica Acta，570，1979，157-166；JP55120788)。因此可推出酱醪的脱氨基酶活性来源于曲。
最后，饼粕或液体的脱氨基酶显示出最大的酶促比Vmax(以每分(钟和每克酶制剂产生的氢氧化铵微摩尔数表示)和Km(以毫摩尔表示)，它非常类似于来自传统种曲的脱氨基酶所观察到的情形。下表1表示该脱氨基酶的生化性能，它们由上述方法测定并与用来制备上述酱醪的种曲的脱氨基酶性能比较，同时还与酵母脱氨基酶的性能比较。
                          表1
腺苷单磷酸脱氨基酶源     最佳pH  最佳温度(℃)    Km(mM)     Vmax(μmol/min/g)
曲     5-6     60   1.47     7.94
酱醪压榨液     5-6     60   1.58     0.69
酱醪饼粕     5-6     60   1.72     1.02
酵母(Yoshino1979)     6.5-7.5     40   0.02     350-500
令人惊奇的是，所有这些结果清楚地表明酱醪及其组分的脱氨基酶活性源于曲，因为酱醪发酵确实没有破坏该活性。
                 实施例1-8
按EP 429760实施例1所述用易变假丝酵母(Candida Versatilis)将传统酱醪发酵15天，不同之处是酱醪相对酱醪干物质而言含15重量％的曲，和35％的干物质，其中42％以盐的形式存在。
该酱醪部分再经传统水力压滤机压榨，由此得到含65％干物质的饼粕，其中12％以盐的形式存在，以及得到含30％干物质的液体，其中50％以盐的形式存在和3％的可沉淀物。
该液体部分放置3天，然后经过滤器澄清。所得澄清液含29％干物质，过滤器上的沉淀含50％干物质。
下一步是制备几种混合物，包括一定量含2％AMP(以干物质重量计)和约20％盐(以干物质重量计)的商购粉状酵母(BiospringerEXL 2003，France)，一定量的水，以及一定量的酱醪、或饼粕、或压榨液、或澄清液或沉淀，这些取决于试验情况。为此，粉状酵母抽提物首先与水混合，再补加酱醪或其一部分组分，然后让全部混合物在搅拌下于某一温度中反应一段时间使得能充分观察到该抽提物的AMP转化成IMP。接着，进行脱氨基化之后，于95℃将每一混合物加热20分钟使脱氨基酶失活，如果其中含有饼粕或沉淀的残余物，则适宜的话可进行过滤。
最后，每一失活混合物按传统方法真空干燥，或适宜的话可进行过滤，其AMP和IMP含量用下述色谱方法测量。
核苷酸的分析是借助Waters HPLC型高性能色谱系统(millipore，Switzerland)来进行的，其上装配有一自动注射器WISP 710B，两个Waters 510泵和一个Waters 680自动梯度控制器。核苷酸的分离于室温下在Vydac RP C18型柱(P.Bucher，Switzerland)上进行。流动相由两种洗脱液组成：20mM三乙胺溶液(溶剂A)和含20mM三乙胺和50％(V/V)乙腈的溶液(溶剂B)。
要分析的样品以及洗脱液在孔率为0.22μm的Nylaflo膜(Gelman，U.S.)上预过滤，色谱分析这样进行：用100％溶剂A，第一洗脱相以1ml/min的速度停留时间10分钟；第二洗脱相40分钟，同时溶剂B的比例增至15％；最后第三洗脱相10分钟，100％溶剂B。在254nm处用吸收分光光度测定法来测量核苷酸的含量。吸收峰的定量涉及含已知量核苷酸的参照溶液。用待测量的样品与参照核苷酸共洗脱(称作加同位素指示剂技术)，并控制对应于所得不同峰的吸收光谱，借助HP8452A型分光光度计(Hewlett-Packard)证明了峰的同一性。
每一样品的结果和脱氨化条件在下表2中说明，粉状酵母抽提物最初含97％干物质，2％AMP和0％IMP。
                                 表2
 实施例   酵母抽提物(％) 酱醪或酱醪组分(％)     水(％)     脱氨基化条件  成品粉状酵母抽提物中的核苷酸(％)
 1     20 酱醪：35     45     52℃；3h  AMP  0.16；IMP  1.60
 2     20 饼粕：1     79     54℃；4h  AMP  0.30IMP  1.71
 3     20 饼粕：10     70     54℃；4h  AMP  0.01IMP  1.80
 4     20 压榨液：20     60     50℃；4h  AMP  0.19IMP  1.23
 5     20 压榨液：30     50     50℃；4h  AMP  0.2IMP  1.30
 6     20 澄清液：30     55     50℃；4h  AMP  0.3IMP  1.20
 7     20 沉淀：1     79     54℃；4h  AMP  0.15IMP  1.7
 8     20 沉淀：10     70     54℃； 4h  AMP  0.1IMP  1.83
                    实施例9-11
在这些实施例中，使用实施例1-8中所述的相同的酱醪和相同的酱醪部分。另一方面，使用含少于3％盐的商购粉状酵母抽物(Biospringer，EXL 2000，无盐，France)。
根据本发明方法将溶胞产物AMP转化成IMP。为此，按照实施例，水/粉状酵母抽提物混合物中补加一定量的压榨液或澄清液或沉淀。然后将每一混合物按实施例1-8所述进行处理。
下表3列出每一实施例的结果和脱氨基化条件，粉状酵母抽提物最初含有1％AMP和0％IMP。
                             表3
实施例   酵母抽提物(％) 酱醪或酱醪部分(％)     水(％)     脱氨基化条件 粉状酵母抽提物中成品中的核苷酸(％)
9     40 压榨液：40     20     50℃；4h  AMP  0.14；IMP  0.58
10     20 澄清液：40     40     50℃；4h  AMP  0.01IMP  0.52
11     40 沉淀：5     55     50℃；4h  AMP  0.33IMP  0.37
由上表可见：本发明方法中无盐酵母抽提物能增加酵母粉和酱醪部分的各自比例，而不会影响AMP向IMP的转化率。
                 实施例12-14
在实施例12和13中，实施例2和3所述饼粕中含有的脱氨基酶被抽提出，为此，于50℃下，1份饼粕与5份水混合。在实施例13的情况下，0.1％ Viscosyme加入到水/饼粕混合物中，于50℃下搅拌2小时，然后过滤除去不溶残渣。将实施例12和13的滤液加入到如实施例1-8所述的相同酵母溶胞产物中，再按这些实施例描述的方法处理每一混和物。
在实施例14中，实施例13的滤液经真空蒸发进行浓缩，直至80％的水被除去。为了根据本发明实施从AMP到IMP的转化，浓缩的抽提物以26.6份对23.4份水的量稀释，在下表所述的条件下与实施例9-11叙及的酵母抽提物混合，该混合物于95℃加热20分钟，然后真空干燥得到酵母粉，其中对核苷酸含量作了测定。
下表4列出了每一实施例的结果和脱氨基化条件。
                   表4
实施例   酵母抽提物(％)   饼粕的水抽提物(％)   脱氨基化条件  粉状酵母抽提物成品中的核苷酸(％)
12     20 无Viscosyme80   54℃；4h  AMP  0.07；IMP  1.80
13     20 有Viscosyme80   54℃；4h  AMP  0.1IMP  1.86
14     50 浓缩抽提物50   54℃；4h  AMP  0.53IMP  0.9

Claims (10)

1.一种香味料的制备方法，包括：
i)将足量的酵母溶胞产物与酱醪或一部分酱醪混合，从而形成混合物，
ii)让该混合物在30-70℃下反应足够的时间，以便至少部分溶胞物中的AMP转化成IMP，由此产生香味料。
2.如权利要求1的方法，其中溶胞产物是水解酵母悬浮液或粉状酵母抽提物。
3.如权利要求1的方法，其中酵母溶胞产物含有以干物质重量计至少0.5％的AMP。
4.如权利要求1的方法，其中酵母溶胞产物含有以干物质重量计少于10％盐。
5.如权利要求1的方法，其中以单独或混合形式的酱醪部分包括以下组成：取自酱醪的饼粕，取自酱醪的液体，澄清的该液体，来自该液体的沉淀和该饼粕的水抽提物。
6.如权利要求5的方法，其中为了制备水抽提物，0.5-10份水与1份饼粕混合，适宜的话，用糖酶降低水/饼粕混合物的粘度，将其过滤并回收滤液。
7.如权利要求5的方法，其中以干物质重量计1-30％的饼粕或沉，10-50％酱醪，或5-50％取自酱醪的液体与含5-50％水解酵母的悬浮液进行混合。
8.如权利要求5的方法，其中50-90％的一种饼粕水抽提物或沉淀与一种粉状酵母抽提物进行混合。
9.如权利要求1的方法，其中该混合物反应10分钟至6小时，然后加热失活。
10.如权利要求9的方法，其中失活混合物被干燥。
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