CN104812775A - 抗kit抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明在一个方面提供的是免疫特异性结合于包含第四和/或第五细胞外Ig样域(即，D4和/或D5域)的人KIT抗原的抗体、包含编码这样的抗体的核苷酸序列的多核苷酸和用于产生这样的抗体的表达载体和宿主细胞。所述抗体能抑制KIT活性，例如配体诱导的受体磷酸化。本发明还提供的是包含特异性结合于KIT抗原的抗体的试剂盒和药物组合物，以及使用本发明描述的抗体治疗或处理KIT相关紊乱或疾病的方法及诊断KIT相关紊乱或疾病的方法。

Description

抗KIT抗体及其用途
本申请要求于2012年7月25日申请的美国临时申请第61/675,751号和于2012年7月25日申请的美国临时申请第61/675,762号的在35U.S.C§119(e)下的权益，所述各临时申请以全文引用的方式并入本文中。
本申请含有序列表，该序列表作为文件名为“Sequence_Listing_12638-059-228.txt”、于2013年7月18日创建并且大小为152,576个字节的ASCII文本文档同时提交。该序列表以全文引用的方式并入本文中。
1.领域
本文提供的是特异性结合于KIT多肽的抗体、其抗原结合片段、这样的抗体的缀合物(conjugate)、编码这样的抗体的多核苷酸、用于产生这样的抗体的载体和宿主细胞、包含免疫特异性结合于KIT抗原的抗体的试剂盒和药物组合物，及用于治疗或处理KIT相关紊乱的用途和方法，以及诊断方法。
2.背景
KIT(或c-Kit)是由c-kit基因编码的III型受体酪氨酸激酶。KIT包含五个细胞外免疫球蛋白(Ig)样域、单个跨膜区、抑制性细胞质近膜域和由激酶插入区段隔开的断裂细胞质激酶域(参见例如，Yarden等人,Nature,1986,323:226-232；Ullrich和Schlessinger,Cell,1990,61:203-212；Clifford等人,J.Biol.Chem.,2003,278:31461-31464)。编码KIT受体的人c-kit基因已经克隆，如Yarden等人,EMBO J.,1987,6:3341-3351所描述。KIT也称为CD117或干细胞因子受体(“SCFR”)，因为它是干细胞因子(“SCF”)配体(也称为Steel因子或Kit配体)的受体。结合于KIT的前三个细胞外Ig样域的SCF配体诱导受体二聚化，并因此通过近膜域和激酶域中的特定酪氨酸残基的磷酸化来活化固有酪氨酸激酶活性(参见例如，Weiss和Schlessinger,Cell,1998,94:277-280；Clifford等人,J.Biol.Chem.,2003,278:31461-31464)。已证明Stat、Src、ERK和AKT信号传导途径的成员是KIT信号传导的下游信号转导子(transducers)。
相信KIT的第四(D4)和第五(D5)细胞外Ig样域介导受体二聚化(参见例如，国际专利申请公布号WO 2008/153926；Yuzawa等人,Cell,2007,130:323-334)。
已在诸如肥大细胞、干细胞、脑细胞、黑色素母细胞、卵巢细胞和癌细胞(例如白血病细胞)等多种细胞类型中检测到KIT的表达。功能损失性(loss-of-function)KIT突变的研究表明KIT对造血祖细胞、肥大细胞、黑色素细胞、原始生殖细胞和Cajal间质细胞的正常生长非常重要(参见例如，Besmer,P.,Curr.Opin.Cell Biol.,1991,3:939-946；Lyman等人,Blood,1998,91:1101-1134；Ashman,L.K.,Int.J.Biochem.Cell Biol.,1999,31:1037-1051；Kitamura等人,Mutat.Res.,2001,477:165-171；Mol等人,J.Biol.Chem.,2003,278:31461-31464)。此外，KIT在血细胞生成、黑色素生成和配子生成中起重要作用(参见Ueda等人,Blood,2002,99:3342-3349)。
已暗示异常KIT活性与多种癌症有关。例如，导致KIT的不依赖SCF的组成性活化的功能获得性(gain-of-function)KIT突变在某些癌细胞中被发现并且与例如白血病(例如慢性髓细胞白血病)和胃肠道间质瘤等某些癌症相关(参见例如，Mol等人,J.Biol.Chem.,2003,278:31461-31464)。
3.概述
本文在一个方面提供的是免疫特异性结合于KIT(例如人KIT)的细胞外域的域4(D4)(或D4区)并且抑制KIT活性的抗体、其抗原结合片段及其缀合物，以及相关组合物、试剂和方法。
在一个方面，本文提供的是免疫特异性结合于人KIT的D4的抗体或其抗原结合片段，包含：
(i)轻链可变区(“VL”)，包含分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；和
(ii)重链可变区(“VH”)，包含分别具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。
在一个实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段的VL和VH在人类中是非免疫原性的。在一个特定的实施方式中，所述抗体能在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中以至少0.45μg/mL的效价表达。在一个特定的实施方式中，所述抗体能在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中以至少0.3μg/mL、至少0.6μg/mL、至少0.75μg/mL或至少1μg/mL的效价表达。
在某一个方面，本文提供的是免疫特异性结合于人KIT的D4的抗体或其抗原结合片段或其缀合物，包含：
轻链可变区(“VL”)，包含氨基酸序列：DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:11)，其中XK1为具有芳族或脂族羟基侧链的氨基酸，XK2为具有芳族或脂族羟基侧链的氨基酸，XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸，XK4为具有脂族羟基侧链的氨基酸或为P，XK5为具有带电荷或酸性侧链的氨基酸，和XK6为具有芳族侧链的氨基酸；和
重链可变区(“VH”)，包含分别具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在一个特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于人KIT的D4的抗体(或其片段或其缀合物)，包含：
(i)VL，包含分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和
(ii)VH，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH 3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:12)，其中XH1为具有脂族侧链的氨基酸，XH2为具有脂族侧链的氨基酸，XH3为具有极性或碱性侧链的氨基酸，XH4为具有脂族侧链的氨基酸，XH5为具有脂族侧链的氨基酸，XH6为具有酸性侧链的氨基酸，XH7为具有酸性或酰胺衍生物侧链的氨基酸，和XH8为具有脂族羟基侧链的氨基酸。
在一个特定的实施方式中，XK1为氨基酸F或S，XK2为氨基酸A或S，XK3为氨基酸T或S，XK4为氨基酸S或P，XK5为氨基酸D或T，和XK6为氨基酸F或Y。
在某一个实施方式中，XK1为氨基酸S，XK2为氨基酸A，XK3为氨基酸T，XK4为氨基酸P，XK5为氨基酸D，和XK6为氨基酸F。
在一个特定的实施方式中，XK1为氨基酸F，XK2为氨基酸A，XK3为氨基酸T，XK4为氨基酸S，XK5为氨基酸D，和XK6为氨基酸F。
在一个特定的实施方式中，XK1为氨基酸F或S，XK2为氨基酸A，XK3为氨基酸T，XK4为氨基酸S或P，XK5为氨基酸D，和XK6为氨基酸F。
在一个特定的实施方式中，XK1为氨基酸S，XK2为氨基酸A，XK3为氨基酸T，XK4为氨基酸P，XK5为氨基酸D，和XK6为氨基酸F。
在一个特定的实施方式中，XK1为氨基酸S，XK2为氨基酸S，XK3为氨基酸S，XK4为氨基酸P，XK5为氨基酸T，和XK6为氨基酸Y。
在一个实施方式中，XH1为氨基酸L或V，XH2为氨基酸L或V，XH3为氨基酸K或R，XH4为氨基酸V或A，XH5为氨基酸L或I，XH6为氨基酸E或D，XH7为氨基酸Q或E，和XH8为氨基酸S或T。
在一个具体的实施方式中，XH1为氨基酸V，XH2为氨基酸L或V，XH3为氨基酸R或Q，XH4为氨基酸A，XH5为氨基酸L或I，XH6为氨基酸D，XH7为氨基酸Q或E，和XH8为氨基酸T。
在一个具体的实施方式中，XH1为氨基酸V，XH2为氨基酸L，XH3为氨基酸R，XH4为氨基酸A，XH5为氨基酸L，XH6为氨基酸D，XH7为氨基酸Q，和XH8为氨基酸T。
在某一个实施方式中，XH1为氨基酸V，XH2为氨基酸V，XH3为氨基酸R，XH4为氨基酸A，XH5为氨基酸I，XH6为氨基酸D，XH7为氨基酸E，和XH8为氨基酸T。
在某一个实施方式中，XH1为氨基酸L，XH2为氨基酸L，XH3为氨基酸K，XH4为氨基酸A，XH5为氨基酸L，XH6为氨基酸E，XH7为氨基酸Q，和XH8为氨基酸S。
在某一个实施方式中，XH1为氨基酸V，XH2为氨基酸L，XH3为氨基酸K，XH4为氨基酸A，XH5为氨基酸L，XH6为氨基酸E，XH7为氨基酸Q，和XH8为氨基酸T。
在某一个实施方式中，XH1为氨基酸V，XH2为氨基酸V，XH3为氨基酸R，XH4为氨基酸V，XH5为氨基酸I，XH6为氨基酸D，XH7为氨基酸E，和XH8为氨基酸T。
在一个特定的实施方式中，XK1至XK6为表6A中所阐述的氨基酸，和/或XH1至XH8为表6B中所阐述的氨基酸。
在一个特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于人KIT的D4的抗体或其抗原结合片段或其缀合物，包含：
i)VL，包含与SEQ ID NO:7有至少90％同一性、与SEQ ID NO:8有至少88％同一性、与SEQ ID NO:9有至少87％同一性或与SEQID NO:10有至少84％同一性的氨基酸序列；和
ii)VH，包含与SEQ ID NO:2有至少93％同一性、与SEQ ID NO:3有至少92％同一性、与SEQ ID NO:4有至少90％同一性、与SEQID NO:5有至少87％同一性或与SEQ ID NO:6有至少86％同一性的氨基酸序列。
在某一个方面，本文提供的是免疫特异性结合于人KIT的D4区的抗体或其抗原结合片段或其缀合物，包含：
iii)轻链可变区(“VL”)，包含氨基酸序列：DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK，其中XK1为具有芳族或脂族羟基侧链的氨基酸，XK2为具有芳族或脂族羟基侧链的氨基酸，XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸，XK4为具有脂族羟基侧链的氨基酸或为P，XK5为具有带电荷或酸性侧链的氨基酸，和XK6为具有芳族侧链的氨基酸；和
iv)VH，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS，其中XH1为具有脂族侧链的氨基酸，XH2为具有脂族侧链的氨基酸，XH3为具有极性或碱性侧链的氨基酸，XH4为具有脂族侧链的氨基酸，XH5为具有脂族侧链的氨基酸，XH6为具有酸性侧链的氨基酸，XH7为具有酸性或酰胺衍生物侧链的氨基酸，和XH8为具有脂族羟基侧链的氨基酸。
在一个特定的实施方式中，XK1至XK6为表6A中所阐述的氨基酸，和/或XH1至XH8为表6B中所阐述的氨基酸。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体特异性结合于重组表达野生型KIT的CHO细胞，如通过流式细胞术所测定其EC50为约150pM或约150pM以下。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体特异性结合于人KIT的重组D4/D5区，如通过流式细胞术所测定其EC50为约600pM或约600pM以下，或为约250pM至约600pM。在某一个实施方式中，本文描述的抗体抑制KIT的酪氨酸磷酸化，如通过ELISA所测定其IC50为约600pM或约600pM以下。
在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体能在CHO细胞中以至少1.0μg/mL、或至少1.1μg/mL、或至少1.2μg/mL的效价表达。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体还包含人轻链恒定区和人重链恒定区。在一个实施方式中，本文描述的抗体的人轻链恒定区是人κ(kappa)轻链恒定区。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体的人重链恒定区是人γ(gamma)重链恒定区。
在某一个实施方式中，本文描述的抗体是人IgG1或IgG4抗体。在某一个实施方式中，本文描述的抗体是抗原结合片段或Fab片段。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体是抗原结合片段或Fab片段。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体是双特异性抗体。在某一个实施方式中，本文描述的抗体被细胞内化。
在一个特定的方面，本文提供的是包含与药剂连接的本文描述的抗体或其KIT-结合片段的缀合物。在一个具体的实施方式中，所述药剂是毒素。在某一个实施方式中，所述毒素是相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素。在一个实施方式中，所述缀合物被细胞内化。
在某一个方面，本文提供的是药物组合物，其包含本文描述的缀合物和药学上可接受的载剂。
在另一个方面，本文提供的是包含药物组合物，其本文描述的抗体和药学上可接受的载剂。
在一个特定的方面，本文提供的是多核苷酸，其包含编码本文描述的抗体的VH链区、VL链区或VL链区和VH链区两者的核苷酸序列。
在一个具体的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含编码VH的SEQ ID NO:22、23、24、25或26。在某一个实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含编码VL的SEQ IDNO:27、28、29或30。在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ ID NO:22、23、24、25或26和编码VL的SEQ ID NO:27、28、29或30。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:22和编码VL的SEQ ID NO:27。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:22和编码VL的SEQ ID NO:28。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:22和编码VL的SEQ ID NO:29。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:22和编码VL的SEQ ID NO:30。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:23和编码VL的SEQ ID NO:27。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:23和编码VL的SEQ ID NO:28。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:23和编码VL的SEQ ID NO:29。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:23和编码VL的SEQ ID NO:30。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:24和编码VL的SEQ ID NO:27。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:24和编码VL的SEQ ID NO:28。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:24和编码VL的SEQ ID NO:29。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:24和编码VL的SEQ ID NO:30。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:25和编码VL的SEQ ID NO:27。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:25和编码VL的SEQ ID NO:28。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:25和编码VL的SEQ ID NO:29。
在一个特定的实施方式中，多本文提供的核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:25和编码VL的SEQ ID NO:30。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:26和编码VL的SEQ ID NO:27。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:26和编码VL的SEQ ID NO:28。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:26和编码VL的SEQ ID NO:29。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)或多核苷酸群体(例如，分离的多核苷酸群体)包含编码VH的SEQ IDNO:26和编码VL的SEQ ID NO:30。
在一个方面，本文提供的是包含本文描述的多核苷酸的载体，其用于表达抗KIT抗体或其片段。在某一个实施方式中，本文提供的载体是哺乳动物表达载体。
在某一个方面，本文提供的是包含本文提供的载体或一种或多种本文提供的多核苷酸的宿主细胞，其用于表达抗KIT抗体或其片段。
在一个特定的方面，本文提供的是产生本文描述的抗体的细胞。在一个实施方式中，本文提供的细胞包含一种或多种本文描述的多核苷酸，其中所述细胞能表达与人KIT的D4特异性结合的抗体。在某一个实施方式中，所述细胞包含本文描述的载体。
在一个具体的方面，本文提供的是包含本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)的试剂盒。在一个特定的实施方式中，试剂盒包含本文描述的缀合物。
在某一个方面，本文提供的是用于治疗或处理KIT相关紊乱(例如，癌症)的方法，包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段或其缀合物。
在一个方面，本文提供的是用于治疗或处理KIT相关紊乱的方法，包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的缀合物。
在一个特定的实施方式中，所述KIT相关紊乱是癌症、炎症性病症或纤维化。在一个具体的实施方式中，所述癌症是白血病、慢性髓细胞白血病、肺癌、小细胞肺癌或胃肠道间质瘤。在一个实施方式中，所述癌症是对用酪氨酸激酶抑制剂治疗具有顽固性的。在一个进一步的实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂是甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)或SU11248。
在某一个实施方式中，本文提供的方法还包括给予第二种药剂。在一个具体的实施方式中，第二种药剂是化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、抗体或细胞因子。在一个特定的实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂是甲磺酸伊马替尼或SU11248。
在一个具体的方面，本文提供的是用于诊断患有KIT相关紊乱的对象的方法，包括使获自所述对象的细胞或样品与本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)接触，及检测所述细胞或所述样品中的KIT的表达水平。例如，检测本文描述的抗体与该细胞或样品中存在的KIT抗原的结合可以与该细胞或样品中的KIT的表达水平有关。在一个特定的实施方式中，所述抗体与可检测分子缀合。在某一个实施方式中，所述可检测分子是酶、荧光分子、发光分子或放射性分子。
在一个特定的方面，本文提供的是用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的方法，包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)接触。
在一个特定的方面，本文提供的是用于诱导或增强表达KIT的细胞中的细胞凋亡的方法，包括使所述细胞与有效量本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)接触。
在一个特定的方面，本文提供的是用于诱导细胞分化的方法，包括使表达KIT的细胞与有效量的本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)接触。在一个特定的实施方式中，所述细胞是干细胞。
在某一个方面，本文提供的是制备免疫特异性结合于人KIT的D4区的抗体的方法，包括培养本文描述的细胞或宿主细胞。在某一个方面，本文提供的是制备免疫特异性结合于人KIT的D4区的抗体的方法，包括使用本文描述的细胞或宿主细胞表达所述抗体。在一个特定的实施方式中，所述细胞是分离的细胞。在一个特定的实施方式中，所述方法还包括纯化获自该细胞或宿主细胞的抗体的步骤。
在一个方面，本文提供的是免疫特异性结合于人KIT的D4区的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)轻链可变区(“VL”)，包含选自表10-12中所阐述之组的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和
(ii)重链可变区(“VH”)，包含选自表13-15中所阐述之组的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在某一个方面，本文描述的是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)VL，包含选自表20-23中所阐述之组的VL FR1、VL FR2、VLFR3,和VL FR4；和
(ii)VH，包含选自表16-19中所阐述之组的Vh FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。
在一个特定的方面，本文描述的抗体或抗原结合片段包含具有氨基酸修饰的Fc区。在某一个方面，本文描述的抗体或抗原结合片段包含作为IgG1同种型(isotype)或IgG4同种型的Fc区。在一个方面，本文描述的抗体或抗原结合片段是人源化抗体。在一个特定的方面，本文描述的抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
在某一个方面，本文描述的是与另一种药剂缀合的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本文提供的是包含本文描述的抗体或其抗原结合片段的组合物。
在一个特定的方面，本文提供的是多核苷酸，其包含编码本文描述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表10-15中所阐述的序列的抗体或其抗原结合片段)的VH链区、VL链区或VL链区和VH链区两者的核苷酸序列。还提供的是包含本文描述的多核苷酸的载体。在一个方面，所述载体是哺乳动物表达载体。
在某一个方面，本文提供的是包含一种或多种本文描述的多核苷酸的载体的宿主细胞。在一个方面，本文提供的是产生本文描述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表10-15中所阐述的序列的抗体或其抗原结合片段)的细胞。
在一个特定的方面，本文提供的是包含本文描述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表10-15中所阐述的序列的抗体或其抗原结合片段)的试剂盒。
在某一个方面，本文提供的是用于治疗或处理KIT相关紊乱的方法，包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表10-15中所阐述的序列的抗体或其抗原结合片段)。在一个实施方式中，所述KIT相关紊乱是癌症、炎症性病症或纤维化。在一个特定的实施方式中，所述癌症是白血病、慢性髓细胞白血病、肺癌、小细胞肺癌或胃肠道间质瘤。
在一个特定的方面，本文描述的用于治疗或处理的KIT相关紊乱的方法还包括给予第二种药剂。在一个特定的实施方式中，第二种药剂是化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、抗体、细胞因子、HSP90抑制剂、PGP抑制剂或蛋白体(proteosome)抑制剂。
在一个方面，本文提供的是用于诊断患有KIT相关紊乱的对象的方法，包括使获自所述对象的细胞或样品与本文描述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表10-15中所阐述的序列的抗体或其抗原结合片段)接触，及检测所述细胞或所述样品中的KIT的表达水平。在某一个实施方式中，所述抗体与可检测分子缀合。
在某一个方面，本文提供的是用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的方法，包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表10-15中所阐述的序列的抗体或其抗原结合片段)接触。
用于诱导或增强表达KIT的细胞中的细胞凋亡的方法，包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表10-15中所阐述的序列的抗体或其抗原结合片段)接触。
制备免疫特异性结合于人KIT的D4区的抗体的方法，包括培养本文描述的细胞，和/或使用本文描述的细胞表达所述抗体。
4.附图简述
图1描绘全长人KIT的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)(GenBankTM登记号AAC50969)。第一个到第五个细胞外Ig样域(即，D1、D2、D3、D4和D5)被标出；“{”描绘各域的氨基末端残基，而“}”描绘各域的羧基末端残基。D1域描绘于P34到R112处，D2域描绘于D113到P206处，D3域描绘于A207到D309处，D4域描绘于K310到N410(SEQ ID NO:15)处，D4和D5之间的铰链区位于V409到N410处，和D5域描绘于T411-K509处。另外，D1/D2铰链区位于D113到L117处；D2/D3铰链区位于P206到A210；和D3/D4铰链区位于D309到G311处。D4/D5区包含K310到K509。跨膜域包含残基F525到Q545，和激酶域包含残基K589到S933。
图2描绘重组KIT D4/D5的氨基酸序列。人KIT氨基酸V308到H515(SEQ ID NO:73)以粗体描绘。所描绘的多肽(SEQ ID NO:14)含有(i)人KIT的氨基末端的前33个氨基酸(即，M1至E33)(包括信号肽，加下划线，非粗体)，(ii)人KIT的D4/D5区(粗体)，和(iii)在羧基末端的5xHis标签(tag)(斜体)。
图3A描绘H1VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:22)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图3B描绘H2VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:23)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图3C描绘H3VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:24)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图3D描绘H4VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:25)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图3E描绘H5VH域的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:26)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图3F描绘L1VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:27)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图3G描绘K2VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:28)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图3H描绘L3VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:29)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图3I描绘L4VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)和编码该氨基酸序列的DNA(SEQ ID NO:30)。构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和CDR(CDR1、CDR2和CDR3)被标出。氨基酸残基的Kabat编号和数字编号两者均标出。
图4A描绘VH域的共有序列。XH1-H8表示可为任何氨基酸的氨基酸。
图4B描绘VL域的共有序列。XK1-K6表示可为任何氨基酸的氨基酸。
图5描绘抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10，以及抗体37M的嵌合体(chimera)(“嵌合体”)与人KIT的D4/D5区的重组多肽的结合活性，如通过固相ELISA所测定。各抗体的EC50值被标出。
图6描绘通过流式细胞术(flow cytomery)进行的结合测定结果的曲线图，其中用重组表达野生型人KIT的CHO细胞表征抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10与抗体37M的嵌合体(“嵌合体”)相比的KIT结合活性。各抗体的EC50值被标出。
图7描绘通过ELISA进行的KIT磷酸化抑制测定结果的曲线图，其中用重组表达野生型KIT的CHO细胞表征抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10与抗体37M嵌合体(“嵌合体”)相比的磷酸化阻断活性。各抗体的IC50值被标出。
5.详述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术及科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所用的，术语“约”或“近似”是指在给定值或范围的加10％或减10％以内。
本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，含有人KIT D4域的KIT多肽)的抗体及其抗原结合片段，及其缀合物。也提供的是编码这样的抗体及其抗原结合片段的分离的核酸(多核苷酸)。进一步提供的是包含编码这样的抗体或其抗原结合片段的核酸的载体(例如，表达载体)和细胞(例如，宿主细胞)。也提供的是制备这样的抗体、细胞(例如，宿主细胞)的方法。本文还提供的是用于治疗或处理KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症或纤维化)或这样的KIT相关紊乱或疾病的一种或多种效应的方法和用途，包括给予一种或多种本文描述的抗体或其抗原结合片段或其缀合物。本文还提供的是用于诊断KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症或纤维化)的方法，包括使样品与一种或多种本文描述的抗体(或其抗原结合片段)接触，及测定该样品中相对于参考样品(例如，对照样品)的KIT的表达水平。本文进一步提供的是用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的方法和用途，包括使所述细胞与有效量的抗体或其抗原结合片段接触。本文还进一步提供的是用于诱导或增强表达KIT的细胞中的细胞分化或细胞凋亡的方法，包括使所述细胞与有效量的一种或多种本文描述的抗体接触。
如本文所用的，术语“D4/D5区”或“D4/D5域”是指在KIT多肽内按以下顺序自氨基末端到羧基末端跨越KIT的第四Ig样细胞外(“D4”)域、第五Ig样细胞外(“D5”)域和在D4域和D5域之间的铰链区(“D4-D5铰链区”)的区域：D4、D4-D5铰链区和D5。如本文所用的，本文中图1的氨基酸V308至H515和图2所描绘的多肽都被认为是D4/D5区或D4/D5域的实例。
如本文所用的，术语“KIT”或“KIT受体”或“KIT多肽”是指全长KIT的任何形式，包括但不限于原生KIT、KIT的同等型(isoform)、种间KIT同源物(homolog)或KIT变异体(variant)，例如天然存在的(例如，等位基因或剪接变异体或突变体，例如体细胞突变体)或人工构建的变异体(例如，重组或化学修饰的变异体)。KIT是由c-kit基因编码的III型受体酪氨酸激酶(参见例如，Yarden等人,Nature,1986,323:226-232；Ullrich和Schlessinger,Cell,1990,61:203-212；Clifford等人,J.Biol.Chem.,2003,278:31461-31464；Yarden等人,EMBO J.,1987,6:3341-3351；Mol等人,J.Biol.Chem.,2003,278:31461-31464)。GenBankTM登记号NM_000222提供一个示例性的人KIT核酸序列。GenBankTM登记号NP_001087241、P10721和AAC50969提供示例性的人KIT氨基酸序列。GenBankTM登记号AAH75716提供一个示例性的鼠KIT氨基酸序列。原生KIT包含五个细胞外免疫球蛋白(Ig)样域(D1、D2、D3、D4、D5)、单个跨膜区、抑制性细胞质近膜域和由激酶插入区段(insert segment)隔开的断裂细胞质激酶域(参见例如，Yarden等人,Nature,1986,323:226-232；Ullrich和Schlessinger,Cell,1990,61:203-212；Clifford等人,J.Biol.Chem.,2003,278:31461-31464)。人KIT的D4/D5区的一个示例性氨基酸序列在图1中在氨基酸残基V308至H515处提供。在一个具体的实施方式中，KIT是人KIT。在一个特定的实施方式中，KIT能以单体、二聚体、多聚体、天然形式或变性形式存在。
在肽或多肽的情形下，如本文所用的术语“片段(fragment)”是指包含小于全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可例如由在氨基末端的截短、在羧基末端的截短和/或从氨基酸序列的残基的内部缺失而产生。片段可以例如由交替RNA剪接或由活体内(in vivo)蛋白酶活性而产生。在某些实施方式中，KIT片段或抗体片段(例如，免疫特异性结合于KIT多肽的抗体片段)包括分别包含KIT多肽或抗体(例如，免疫特异性结合于KIT多肽的抗体)的氨基酸序列的至少5个邻接氨基酸残基、至少10个邻接氨基酸残基、至少15个邻接氨基酸残基、至少20个邻接氨基酸残基、至少25个邻接氨基酸残基、至少40个邻接氨基酸残基、至少50个邻接氨基酸残基、至少60个邻接氨基残基、至少70个邻接氨基酸残基、至少80个邻接氨基酸残基、至少90个邻接氨基酸残基、至少100个邻接氨基酸残基、至少125个邻接氨基酸残基、至少150个邻接氨基酸残基、至少175个邻接氨基酸残基、至少200个邻接氨基酸残基或至少250个邻接氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。在一个具体的实施方式中，KIT多肽或抗体(例如，免疫特异性结合于KIT多肽的抗体)的片段保留该多肽或抗体的至少1种、至少2种或至少3种功能。
如本文所用的，术语“宿主细胞”是指包含外源核酸分子的特定细胞，例如已被核酸分子转染或转化的细胞，及该亲本细胞的子代或潜在子代。该细胞的子代可能由于后代中能出现的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中而与亲本细胞不完全相同。
5.1抗体
如本文所用的，术语“抗体”和“免疫球蛋白”和“Ig”是技术术语并且在本文中可互换使用，并且是指具有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。
如本文所用的，“抗原”是含有表位且因而也被抗体特异性结合的部分或分子。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体所结合的抗原是KIT(例如人KIT)或其片段，例如KIT(例如人KIT)的细胞外域或KIT(例如人KIT)的D4区。
如本文所用的，“表位”是技术术语并且是指抗体能特异性结合的抗原的局部化区域。对表位作出贡献的区域或多肽可以是多肽的邻接氨基酸或者表位可同时来自多肽的两个或两个以上非邻接区域。
如本文所用的，术语“抗原结合域(antigen binding domain)”、“抗原结合区(antigen binding region)”、“抗原结合片段(antigen binding fragment)”及类似术语是指抗体分子中包含与抗原相互作用的氨基酸残基并且赋予该抗体分子以其对该抗原的特异性的部分(例如，互补决定区(CDR))。抗原结合区可来源于任何动物物种，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人类。抗体分子的CDR可通过本领域技术人员所熟知的任何方法来确定。具体地说，CDR可根据Kabat编号系统来确定(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest.(美国卫生与公众服务部(U.S.Departmentof Health and Human Services),Washington,D.C.),第5版)。在某些方面，抗体的CDR可根据以下编号方案或编号系统来确定：(i)Chothia编号方案，其在本文中将称为“Chothia CDR”(参见例如，Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196:901-917；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948；和美国专利第7,709,226号)；或(ii)IMGT编号系统，例如，如Lefranc,M.-P.,1999,The Immunologist,7:132-136和Lefranc,M.-P.等人,1999,Nucleic AcidsRes.,27:209-212中所描述。
如本文所用的，“构象表位”或“非线性表位”或“不连续表位”是指包含至少两个氨基酸的表位，所述至少两个氨基酸不是单一蛋白质链中的连续氨基酸。举例来说，构象表位可包含由一段间插氨基酸隔开但足够接近以致被本文描述的抗体(例如，抗KIT抗体)识别为单一表位的两个或两个以上氨基酸。作为一个进一步的实例，在单一蛋白质链上由间插氨基酸隔开的氨基酸或者在独立蛋白质链上存在的氨基酸可由于蛋白质结构或复合物的构象形状而开始接近以变成可以被本文描述的抗KIT抗体结合的构象表位。本领域技术人员将会认识到，一般而言，被本文描述的抗KIT抗体结合的线性表位可能依赖于或可能不依赖于KIT受体的二级、三级或四级结构。例如，在有些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体可结合一组氨基酸，无论它们是否折叠成天然的三维蛋白质结构。在其它的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不识别构成表位的个别氨基酸残基，且需要特殊构象(弯曲、扭曲、扭转或折叠)以便识别并结合表位。
如本文所用的，术语“恒定区(constant region)”或“恒定域(constantdomain)”是指抗体部分，例如轻链和/或重链中不直接参与抗体与抗原的结合但表现出各种效应子功能(例如与Fc受体相互作用)的羧基末端部分。该术语是指免疫球蛋白分子中相对于免疫球蛋白可变域具有一般更保守氨基酸序列的部分。
如本文所用的，术语“重链”当参照抗体使用时是指基于恒定域的氨基酸序列的任何独特类型(distinct types)，例如α、δ、ε、γ和μ，其分别产生抗体的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个具体的实施方式中，所述重链是人重链。
如本文所用的，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体的情形下是类似术语并且是指与抗原(例如，表位或免疫复合物)结合的分子，因为这样的结合为本领域技术人员所了解。例如，与抗原特异性结合的分子可与其它肽或多肽结合，一般具有较低亲和力，如通过例如免疫测定、BiacoreTM、KinExA 3000仪器(SapidyneInstruments,Boise,ID)或本领域已知的其它分析法所测定。在一个具体的实施方式中，与抗原免疫特异性结合的分子以至少2log、2.5log、3log、4log或大于该分子与另一抗原结合的Ka的Ka与该抗原结合。在另一个具体的实施方式中，与抗原免疫特异性结合的分子不与其它蛋白质交叉反应。在另一个具体的实施方式中，与抗原免疫特异性结合的分子不与其它非KIT蛋白质交叉反应。
如本文所用的，“分离的”或“纯化的”抗体实质上不含来自得到抗体的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白质，或者当化学合成时实质上不含化学前体或其它化学物质。
术语“Kabat编号”及类似术语是本领域公认的并且是指对抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391,和Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公布号91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR典型地存在于氨基酸位置31至35(“CDR1”)、氨基酸位置50至65(“CDR2”)和氨基酸位置95至102(“CDR3”)处。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR典型地存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)处。
如本文所用的，术语“轻链”当参照抗体使用时是指基于恒定域的氨基酸序列的任何独特类型(distinct types)，例如κ或λ。轻链氨基酸序列为本领域所熟知的。在具体的实施方式中，所述轻链是人轻链。
如本文所用的，术语“单克隆抗体”是指从同源或实质上同源抗体的群体获得的抗体，并且各单克隆抗体将典型地识别该抗原上的单一表位。术语“单克隆的”并不限于任何特定的抗体制备方法。一般而言，单克隆抗体的群体可由细胞、细胞群体或细胞系产生。在具体的实施方式中，如本文所用的“单克隆抗体”是由单一杂交瘤或其它细胞(例如，产生重组抗体的宿主细胞)产生的抗体，其中该抗体与KIT表位(例如，人KIT的D4的表位)免疫特异性结合，如例如通过ELISA或本领域已知的或本文提供的实施例中的其它抗原-结合测定法或竞争性结合测定法所确定。本文描述的单克隆抗体可以例如由Kohler等人；Nature,256:495(1975)中描述的杂交瘤方法来制备，或者可以例如使用如本文描述的技术由噬菌体文库中分离。用于制备克隆细胞系及由其表达的单克隆抗体的其它方法为本领域所熟知的(参见例如，Short Protocols in Molecular Biology,(2002),第5版,第11章,Ausubel等人编著,John Wiley and Sons,New York)。
如本文所用的，术语“多克隆抗体”是指包括针对一种或多种抗原内的相同和不同表位的多种不同抗体的抗体群体。用于产生多克隆抗体的方法为本领域已知的(参见例如，参见例如，Short Protocols in Molecular Biology,(2002),第5版,第11章,Ausubel等人编著,John Wiley and Sons,NewYork)。
如本文所用的，术语“重组人抗体”包括通过重组手段分离、制备、表达或产生的人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、自重组的组合人抗体文库中分离的抗体、自针对人免疫球蛋白基因转基因的和/或转染色体的动物(例如，小鼠、兔、山羊或牛)分离的抗体(参见例如，Taylor,L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或通过涉及创建的任何其它手段，例如经由合成、对编码人免疫球蛋白序列的DNA序列的基因工程改造或将编码人免疫球蛋白的序列(例如，人免疫球蛋白基因序列)剪接至其它此种序列而制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体可具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些实施方式中，这样的重组人抗体的氨基酸序列已经修饰致使该重组抗体的VH区和/或VL区的氨基酸序列为尽管来源于人种系VH和VL序列并且与其有关但并不天然存在于活体内(in vivo)的人抗体种系谱系(repertoire)内的序列。作为一个非限制性实例，重组人抗体可通过将若干人序列片段组装成重组人抗体的复合人序列来获得。
如本文所用的，术语“可变区(variable region)”或“可变域(variabledomain)”是指抗体的一部分，一般为轻链或重链的一部分，典型地在成熟重链中约氨基末端的110至120个氨基酸和在成熟轻链中约90至100个氨基酸，其在抗体中在序列上广泛不同并且用于特定抗体对于其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中在那些称为互补决定区(CDR)的区域中，而可变域中的更高度保守的区域称作构架区(FR)。虽然不希望受到任何特定机制或理论的束缚，但是相信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的氨基酸位置的编号是根据EU索引，如在Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health andHuman Services),NIH公布号91-3242(“Kabat等人”)中。在某些方面，抗体的CDR可根据以下编号方案或编号系统来确定：(i)Chothia编号方案，其在本文中将称为“Chothia CDR”(参见例如，Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196:901-917；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948；和美国专利号7,709,226)；或(ii)IMGT编号系统，例如，如Lefranc,M.-P.,1999,The Immunologist,7:132-136和Lefranc,M.-P.等人,1999,Nucleic Acids Res.,27:209-212中所描述。在某些实施方式中，所述可变区是人可变区。在某些实施方式中，所述可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人构架区(FR)。在特定的实施方式中，所述可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在某些实施方式中，所述可变区包含啮齿动物或鼠CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)构架区(FR)。作为一个的非限制性实例，本文描述的可变区由将人序列的两个或两个以上片段组装成复合人序列而获得。
在具体的方面，本文提供的是免疫特异性结合于人KIT的D4和KIT(例如，人KIT)的D4/D5区的抗体(包括其抗原结合片段)，例如人源化抗体。图1和图2的氨基酸残基V308至H515(SEQ ID NO:73)代表人KIT的一个示例性D4/D5区，且如图1和图2所描绘的氨基酸K310至N410(SEQ ID NO:15)代表人KIT的一个示例性D4。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)以低于KIT(例如，人KIT)的D4域的亲和力免疫特异性结合于KIT(例如，人KIT)的D5域。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)以高于KIT(例如，人KIT)的D5域的亲和力免疫特异性结合于KIT(例如，人KIT)的D4域；例如，该较高亲和力为至少10倍、20倍、50倍、100倍、500倍或1000倍，如通过本领域已知的方法(例如，ELISA或Biacore测定法)所测定。
在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)免疫特异性结合于KIT(例如，人KIT)的D4或D4/D5区并且其针对基本上仅由D4域组成的KIT抗原具有比基本上仅由D5域组成的KIT抗原高的亲和力。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)免疫特异性结合于KIT(例如，人KIT)的D4或D4/D5区并且其针对基本上仅由D4域组成的KIT抗原具有比基本上仅由D5域组成的KIT抗原高出至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍的亲和力。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)免疫特异性结合于KIT(例如，人KIT)的D4或D4/D5区并且其针对基本上仅由D4域或仅由D4/D5区组成的KIT抗原具有比基本上仅由D5域组成的KIT抗原高的结合亲和力(例如，高出近似2倍到3倍的亲和力)。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)免疫特异性结合于包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或基本上由其组成的KIT抗原。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)免疫特异性结合于KIT(例如，人KIT)的D4域。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体免疫特异性结合于包含人KIT的D4或基本上由其组成的KIT抗原。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)免疫特异性结合于包含SEQ ID NO:14或73的氨基酸序列或基本上由其组成的KIT抗原。
在特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如，人KIT)的D4区，例如SEQ ID NO:15[人D4序列])的抗体或其抗原结合片段，并且包含如本文描述的氨基酸序列。
在具体的方面，本文描述的是抗体(例如，人抗体或人源化抗体)，包括其抗原结合片段，包含：
(i)VH域的VH CDR，包含SEQ ID NO:31(QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGVYYFDYWGQGTTLTVSS)或SEQ ID NO:69(QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGVYYFDYWGQGTTLTVSA)的氨基酸序列，和
(ii)VL域的VL CDR，包含SEQ ID NO:32(DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVRTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYNSYPRTFGGGTKLEIKR)的氨基酸序列。
在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)包含表1中所描述的VH CDR(SEQ ID NO:16-18)和VL CDR(SEQ ID NO:19-21)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)包含表2中所描述的VH CDR和VL CDR(例如，第1组或第2组)。在某一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)包含表3中所描述的VH CDR和VL CDR(AbM CDR或接触CDR(Contact CDR))。
表1：CDR氨基酸序列
氨基酸序列 SEQ ID NO:
VL CDR1 KASQNVRTNVA 19
VL CDR2 SASYRYS 20
VL CDR3 QQYNSYPRT 21
VH CDR1 DYYIN 16
VH CDR2 RIYPGSGNTYYNEKFKG 17
VH CDR3 GVYYFDY 18
表2：CDR氨基酸序列
表3：CDR氨基酸序列
表4：抗体Hum1-20的VL域和VH域
在某些方面，本文提供的是VH域(例如，分别包含SEQ ID NO:2-6的H1、H2、H3、H4和H5)和VL域(例如，分别包含SEQ ID NO:7-10的L1、L2、L3和L4)。在某些实施方式中，本文提供的是包含例如表4中所阐述的这类VH域和VL域的抗体(即，抗体Hum1-Hum20)。在特定的实施方式中，这些抗体包含分别包含SEQ ID NO:16-18和19-21的VH CDR1-3和VL CDR 1-3。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含可变轻(VL)链区，该可变轻(VL)链区包含本文描述的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:7-10(例如，参见图3F-3I)中的任何一个或SEQ ID NO:12。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)链区，该可变重(VH)链区包含本文描述的氨基酸序列，例如SEQ IDNO:2-6(例如，参见图3A-3E)中的任何一个或SEQ ID NO:11。
例如，本文描述的是抗体，其免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)并且包含(i)VH域H1(SEQ ID NO:2)、H2(SEQ ID NO:3)、H3(SEQ ID NO:4)、H4(SEQ ID NO:5)或H5(SEQ ID NO:6)和/或(ii)VL域L1(SEQ ID NO:7)、L2(SEQ ID NO:8)、L3(SEQ ID NO:9)或L4(SEQID NO:10)。在一个特定的实施例中，本文描述的抗体或其抗原结合片段能免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)并且包含抗体Hum1-Hum20中的任何一个的VH域和/或VL域(参见表4)。在一个特定的实施例中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含抗体Hum4、Hum8、Hum10或Hum17中的任何一个的VH域和/或VL域。
在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H1(SEQ ID NO:2)和L1(SEQ ID NO:7)。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H1(SEQ ID NO:2)和L2(SEQ ID NO:8)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H1(SEQ IDNO:2)和L3(SEQ ID NO:9)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H1(SEQ ID NO:2)和L4(SEQ ID NO:10)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H2(SEQ ID NO:3)和L1(SEQ ID NO:7)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H2(SEQ ID NO:3)和L2(SEQ ID NO:8)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H2(SEQ ID NO:3)和L3(SEQ ID NO:9)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H2(SEQ IDNO:3)和L4(SEQ ID NO:10)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H3(SEQ ID NO:4)和L1(SEQ ID NO:7)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H3(SEQ ID NO:4)和L2(SEQ ID NO:8)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H3(SEQ ID NO:4)和L3(SEQ ID NO:9)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H3(SEQ ID NO:4)和L4(SEQ ID NO:10)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H4(SEQ IDNO:5)和L1(SEQ ID NO:7)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H4(SEQ ID NO:5)和L2(SEQ ID NO:8)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H4(SEQ ID NO:5)和L3(SEQ ID NO:9)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H4(SEQ ID NO:5)和L4(SEQ ID NO:10)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H5(SEQ ID NO:6)和L1(SEQ ID NO:7)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H5(SEQ IDNO:6)和L2(SEQ ID NO:8)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H5(SEQ ID NO:6)和L3(SEQ ID NO:9)。在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含H5(SEQ ID NO:6)和L4(SEQ ID NO:10)。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段在人类中是非免疫原性的。在一个特定的实施方式中，非免疫原性的氨基酸序列缺乏经鉴定是针对人MHCII类的结合子(binder)的表位，例如作为针对人MHC II类的非人种系结合子的表位。在一个特定的实施方式中，氨基酸序列实质上缺乏经鉴定是针对人MHC II类的结合子的表位，例如作为针对人MHC II类的非人种系结合子的表位。例如，已经开发出用于标识B-和T-细胞表位的位置并且评估免疫原性潜力的电脑计算工具(in silico tools)，且这样的工具提供了活体外(invitro)或活体内(in vivo)免疫原性测定的替代方案，举例来说，已经开发出计算表位预测方法和含有实验获得的表位数据的人工注释数据库(manuallycurated databases)(参见Bryson等人,Biodrugs,2010,24(1):1-8)。表位数据库的非限制性实例包括免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)和有专利权的T细胞表位数据库TM(T Cell Epitope DatabaseTM,TCEDTM)。这样的表位数据库可以单独使用或者与本领域所描述的体外测定法(in vitro assays)(例如，MHC II类结合测定法和T细胞活化或增殖测定法)结合使用。或者，这样的体外测定法可不依赖于这类表位数据库来使用。用于测定药剂(agent)(例如抗体)的免疫原性或用于去除或降低药剂(agent)(例如抗体)的免疫原性的方法在本领域已有描述，参见例如，Altschul等人,Nucleic Acids Res.,1997,25:3389-3402；Baker等人,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.,2007,10:219；Hill等人,Arthritis Res.Ther.,2003,1:R40-R48；Jones等人,J.Thromb.Haemost.,2005,3:991-1000；Holgate等人,IDrugs,2009,12:233-237；Jones等人,Methods Mol.Biol.,2009,525:405-423；和Baker等人,Curr.DrugSaf.,2010,5:308-313。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于人KIT的D4区的本文描述的抗体包含如通过T细胞表位数据库TM(TCEDTM)所测定不具有免疫原性的VH域和VL域。在某一个实施方式中，本文描述的抗体免疫特异性结合于人KIT的D4区，并且包含如通过本领域所描述的体外测定不具有免疫原性的VH域和VL域，参见例如Wang等人,2008,PLoSCoomputational Biology,2008,4(4):e1000048；和Arnold等人,2002,J.Immunol.,169:739-749。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含与H1(SEQ ID NO:2)具有至少93％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含与H1(SEQ ID NO:2)具有至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，所述VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ IDNO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含与H2(SEQ ID NO:3)具有至少92％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含与H2(SEQID NO:3)具有至少93％、至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，所述VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ IDNO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含与H3(SEQ ID NO:4)具有至少90％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含与H3(SEQ ID NO:4)具有至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，所述VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含与H4(SEQ ID NO:5)具有至少87％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含与H4(SEQ ID NO:5)具有至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，所述VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含与H5(SEQ ID NO:6)具有至少86％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含与H5(SEQ ID NO:6)具有至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VH域。在一个特定的实施方式中，所述VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含与L1(SEQ ID NO:7)具有至少90％序列同一性的VL域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含与L1(SEQ ID NO:7)具有至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VL域。在一个特定的实施方式中，所述VL域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含与L2(SEQ ID NO:8)具有至少88％序列同一性的VL域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体包含与L2(SEQ ID NO:8)具有至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VL域。在一个特定的实施方式中，所述VL域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ IDNO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含与L3(SEQ ID NO:9)具有至少87％序列同一性的VL域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含与L3(SEQ ID NO:9)具有至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VL域。在一个特定的实施方式中，所述VL域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含与L4(SEQ ID NO:10)具有至少84％序列同一性的VL域。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含与L4(SEQ ID NO:10)具有至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的VL域。在一个特定的实施方式中，所述VL域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H1(SEQ ID NO:2)具有至少93％或至少95％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L1(SEQ ID NO:7)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H2(SEQ ID NO:3)具有至少92％或至少94％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L1(SEQ ID NO:7)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H3(SEQ ID NO:4)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L1(SEQ ID NO:7)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H4(SEQ ID NO:5)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L1(SEQ ID NO:7)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H5(SEQ ID NO:6)具有至少86％或至少88％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L1(SEQ ID NO:7)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H1(SEQ ID NO:2)具有至少93％或至少95％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L2(SEQ ID NO:8)具有至少88％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H2(SEQ ID NO:3)具有至少92％或至少94％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L2(SEQ ID NO:8)具有至少88％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H3(SEQ ID NO:4)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L2(SEQ ID NO:8)具有至少88％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H4(SEQ ID NO:5)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L2(SEQ ID NO:8)具有至少88％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H5(SEQ ID NO:6)具有至少86％或至少88％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L2(SEQ ID NO:8)具有至少88％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H1(SEQ ID NO:2)具有至少93％或至少95％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L3(SEQ ID NO:9)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H2(SEQ ID NO:3)具有至少92％或至少94％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L3(SEQ ID NO:9)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H3(SEQ ID NO:4)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L3(SEQ ID NO:9)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H4(SEQ ID NO:5)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L3(SEQ ID NO:9)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H5(SEQ ID NO:6)具有至少86％或至少88％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L3(SEQ ID NO:9)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H1(SEQ ID NO:2)具有至少93％或至少95％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L4(SEQ ID NO:10)具有至少84％或至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H2(SEQ ID NO:3)具有至少92％或至少94％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L4(SEQ ID NO:10)具有至少84％或至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H3(SEQ ID NO:4)具有至少90％或至少92％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L4(SEQ ID NO:10)具有至少84％或至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H4(SEQ ID NO:5)具有至少87％或至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含与L4(SEQ ID NO:10)具有至少84％或至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
在具体的实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含(i)VH域，包含与H5(SEQ ID NO:6)具有至少86％或至少88％序列同一性的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含具与L4(SEQ ID NO:10)有至少84％或至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL域和VH域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。在某一个实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR 1-3和分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR 1-3。
为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分同一性，将这两个序列进行比对用于最佳比较目的(例如，可在第一个氨基酸序列或核酸序列的序列中引入空位(gaps)以便与第二个氨基酸序列或核酸序列进行最佳比对)。然后，将相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一个序列中的某一位置被与第二个序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位置上完全相同。两个序列之间的百分同一性是该序列所共享的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同的重叠位置数/位置总数X 100％)。在一个实施方式中，两个序列具有相同的长度。在某一个实施方式中，百分同一性在氨基酸序列或核苷酸序列的整个长度上进行测定。
两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的百分同一性的测定法也可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列所采用的数学算法的一个优选的非限制性实例是以下算法：Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:22642268，如在Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:58735877中所修改。这样的算法能掺入到Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可使用NBLAST核苷酸程序参数集来进行，例如对于分值＝100，字长＝12，可获得与本文描述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可使用XBLAST程序参数集来进行，例如对于分值＝50，字长＝3，可获得与本文描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得带有空位的比对用于比较目的，可以使用Gapped BLAST，如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:33893402中所描述。或者，可以使用PSI BLAST进行检测分子间远缘关系的迭代检索(参考文献同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSIBlast程序时，可以使用相应各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认(default)参数(参见例如，国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI),在万维网上(on the worldwide web),ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列所采用的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller,1988,CABIOS 4:1117的算法。这样的算法掺入ALIGN程序(2.0版本)中，而ALIGN程序(2.0版本)是GCG序列比对软件包的组成部分。当采用ALIGN程序进行比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12和空位罚分4。
两个序列之间的百分同一性可以使用与如上所述技术类似的技术(加或不加允许空位(allowing gaps))来测定。在计算百分同一性时，典型地仅统计精确匹配。
在一个特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)VH域，包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的一、二、三或四个构架区(参见表5A)；和/或(ii)VL域，包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的一、二、三或四个构架区(参见表5B)。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR1。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR2。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR3。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR1和FR2。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR1、FR2和FR3。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR1、FR2、FR3和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR1和FR3。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR1、FR3和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR1和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR1、FR2和FR4。
在一个实施方式中，其免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的人抗体或人源化抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR2和FR3。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR2、FR3和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VH域，该VH域包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和H1、H2、H3、H4或H5的构架区FR3和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR1。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ IDNO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR2。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR3。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR1和FR2。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR1、FR2和FR3。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR1、FR2、FR3和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR1和FR3。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR1、FR3和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR1和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR1、FR2和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR2和FR3。在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR2、FR3和FR4。
在一个实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体包含VL域，该VL域包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和L1、L2、L3或L4的构架区FR3和FR4。
在一个特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含：(i)VH域，包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和VH域HH257-HH281中的任何一个的构架区FR1-FR4(参见表5C)；和(ii)VL域，包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和VL域LL65-LL76中的任何一个的FR1-FR4(参见表5D)。
在一个特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，包含：(i)VH域，包含包含表2或表3中所阐述的氨基酸序列的组合的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和VH域H1-H5(表5A)和HH257-HH281(参见表5C)中的任何一个的构架区FR1-FR4；和(ii)VL域，包含分别包含表2(第1组或第2组)或表3(AbM或接触CDR)中所阐述的氨基酸序列的组合的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和VL域L1-L4(表5B)和LL65-LL76(参见表5D)中的任何一个的FR1-FR4。
在一个特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)VH域，包含包含表2或表3中所阐述的氨基酸序列的组合的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，和包含侧接VH CDR的序列的相应构架区FR1-FR4，例如，如在图3A-3I中的任何一个所描绘；和(ii)VL域，包含分别包含表2(第1组或第2组)或表3(AbM或接触CDR)中所阐述的氨基酸序列的组合的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，和包含侧接VL CDR的序列的相应构架区FR1-FR4，例如，如在图3A-3I中的任何一个所描绘。
表5A:VH域构架区(FR)
表5B:VL域构架区(FR)
表5C:VH域HH257至HH281的构架区序列
VH域 VH FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4
HH257 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
HH258 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36
HH259 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36
HH260 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:36
HH261 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:36
HH262 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:36
HH263 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:36
HH264 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:36
HH265 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:36
HH266 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
HH267 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
HH268 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36
HH269 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:36
HH270 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:36
HH271 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:36
HH272 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:36
HH273 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:36
VH域 VH FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4
HH274 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
HH275 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
HH276 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36
HH277 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:36
HH278 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:36
HH279 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:36
HH280 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:36
HH281 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:36
表5D:VL域LL65至LL76的构架区序列
VL域 VL FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4
LL65 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
LL66 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:47
LL67 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:47
LL68 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:47
LL69 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:47
LL70 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:47
LL71 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:47
LL72 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
LL73 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
LL74 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:47
LL75 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:47
LL76 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:47
在一个特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片段，其包含：(i)VH域，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:11)，其中在Kabat位置11的XH1、在Kabat位置20的XH2、在Kabat位置38的XH3、在Kabat位置67的XH4、在Kabat位置69的XH5、在Kabat位置72的XH6、在Kabat位置81的XH7和在Kabat位置87的XH8独立地选自任何氨基酸；和/或(ii)VL域，包含氨基酸序列DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK 2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)，其中在Kabat位置10的XK1、在Kabat位置46的XK2、在Kabat位置63的XK3、在Kabat位置80的XK4、在Kabat位置85的XK5和在Kabat位置87的XK6独立地选自任何氨基酸。在一个特定的实施方式中，所述VH和/或VL域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。
在一个特定的方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的抗体，其包含：(i)VH域，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:11)，其中在Kabat位置11的XH1、在Kabat位置20的XH2、在Kabat位置38的XH3、在Kabat位置67的XH4、在Kabat位置69的XH5、在Kabat位置72的XH6、在Kabat位置81的XH7和在Kabat位置87的XH8选自表6B中所阐述的氨基酸的组合；和/或(ii)VL域，包含氨基酸序列：DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK 2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)，其中在Kabat位置10的XK1、在Kabat位置46的XK2、在Kabat位置63的XK3、在Kabat位置80的XK4、在Kabat位置85的XK5和在Kabat位置87的XK6选自表6A中所阐述的氨基酸的组合。在一个特定的实施方式中，所述VH和/或VL域是非免疫原性的，例如，如通过不存在与MHC II类结合的表位(例如，针对MHC II类的非人种系结合子)所确定。
在一个实施方式中，在Kabat位置11的XH1为具有脂族侧链的氨基酸(例如，疏水性侧链或非极性侧链支链氨基酸(BCAA))，例如L或V。在一个实施方式中，在Kabat位置20的XH2为具有脂族侧链的氨基酸(例如，疏水性侧链或非极性侧链支链氨基酸(BCAA))，例如L或V。在一个实施方式中，在Kabat位置38的XH3为具有极性侧链的氨基酸(例如，亲水性侧链、碱性侧链或带电荷的侧链，例如带正电荷的侧链或带负电荷的侧链)，例如K或R。在一个实施方式中，在Kabat位置67的XH4为具有脂族侧链的氨基酸(例如，疏水性侧链或非极性侧链支链氨基酸(BCAA))，例如V或A。在一个实施方式中，在Kabat位置69的XH5为具有脂族侧链的氨基酸(例如，疏水性侧链或非极性侧链支链氨基酸(BCAA))，例如L或I。在一个实施方式中，在Kabat位置72的XH6为具有酸性侧链的氨基酸，例如E或D。在一个实施方式中，在Kabat位置81的XH7为具有酸性侧链或其酰胺衍生物的氨基酸，例如Q(E的不带电荷的/酰胺衍生物)或E。在一个实施方式中，在Kabat位置87的XH8为具有脂族羟基基团或亲水性侧链的氨基酸，例如S或T。
在一个实施方式中，在Kabat位置11的XH1为脂族氨基酸，例如支链氨基酸(BCAA)，例如V；在Kabat位置20的XH2为脂族氨基酸，例如支链氨基酸(BCAA)，例如L；在Kabat位置38的XH3为具有极性侧链的氨基酸，例如R；在Kabat位置67的XH4为具有脂族侧链的氨基酸，例如A；在Kabat位置69的XH5为具有脂族侧链的氨基酸，例如L；在Kabat位置72的XH6为具有极性侧链的氨基酸，例如D；在Kabat位置81的XH7为具有酸性氨基酸的酰胺衍生物的氨基酸，例如Q；和在Kabat位置87的XH8为具有脂族羟基侧链的氨基酸，例如T。
在一个实施方式中，在Kabat位置11的XH1为脂族氨基酸，例如支链氨基酸(BCAA)，例如V；在Kabat位置20的XH2为脂族氨基酸，例如支链氨基酸(BCAA)，例如V；在Kabat位置38的XH3为具有极性侧链的氨基酸，例如R；在Kabat位置67的XH4为具有脂族侧链的氨基酸，例如A；在Kabat位置69的XH5为具有脂族侧链的氨基酸，例如I；在Kabat位置72的XH6为具有极性侧链的氨基酸，例如D；在Kabat位置81的XH7为酸性氨基酸，例如E；和在Kabat位置87的XH8为具有脂族羟基侧链的氨基酸，例如T。
在一个具体的实施方式中，在Kabat位置10的XK1为芳族氨基酸(例如F)或具有脂族羟基侧链的氨基酸(例如S)。在某一个实施方式中，在Kabat位置46的XK2为具有脂族侧链的氨基酸(例如，疏水性氨基酸)(例如A)或具有脂族羟基侧链的氨基酸(例如S)。在一个实施方式中，在Kabat位置63的XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸(例如T或S)。在一个具体的实施方式中，在Kabat位置80的XK4为具有脂族羟基侧链的氨基酸(例如S)或芳族氨基酸(例如P)。在某一个实施方式中，在Kabat位置85的XK5为酸性氨基酸(例如D)或具有脂族羟基侧链的氨基酸(例如T)。在一个实施方式中，在Kabat位置87的XK6为芳族氨基酸(例如F或Y)。
在一个具体的实施方式中，在Kabat位置10的XK1为具有脂族羟基侧链的氨基酸，例如S；在Kabat位置46的XK2为具有脂族侧链的氨基酸(例如，疏水性氨基酸)，例如A；在Kabat位置63的XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸，例如T；在Kabat位置80的XK4为芳族氨基酸，例如P；在Kabat位置85的XK5为酸性氨基酸，例如D；和在Kabat位置87的XK6为芳族氨基酸，例如F。
在一个具体的实施方式中，在Kabat位置10的XK1为芳族氨基酸，例如F；在Kabat位置46的XK2为具有脂族侧链的氨基酸(例如，疏水性氨基酸)，例如A；在Kabat位置63的XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸，例如T；在Kabat位置80的XK4为脂族羟基侧链，例如S；在Kabat位置85的XK5为酸性氨基酸，例如D；和在Kabat位置87的XK6为芳族氨基酸，例如F。
在一个特别特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH域，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:11)，其中在Kabat位置11的XH1为具有脂族侧链的氨基酸例如V，在Kabat位置20的XH2为具有脂族侧链的氨基酸例如L，在Kabat位置38的XH3为具有极性侧链的氨基酸例如K，在Kabat位置67的XH4为具有脂族侧链的氨基酸例如A，在Kabat位置69的XH5为具有脂族侧链的氨基酸例如L，在Kabat位置72的XH6为酸性氨基酸例如D，在Kabat位置81的XH7为酸性氨基酸或其酰胺衍生物例如Q，和在Kabat位置87的XH8为具有脂族羟基侧链的氨基酸例如T；和(ii)VL域，包含氨基酸序列DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK 2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)，其中在Kabat位置10的XK1为具有脂族羟基侧链的氨基酸例如S，在Kabat位置46的XK2为具有脂族侧链的氨基酸例如A，在Kabat位置63的XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸例如T，在Kabat位置80的XK4为芳族氨基酸例如P，在Kabat位置85的XK5为酸性氨基酸例如D，和在Kabat位置87的XK6为芳族氨基酸例如F。
在一个特别特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH域，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:11)，其中在Kabat位置11的XH1为具有脂族侧链的氨基酸例如V，在Kabat位置20的XH2为具有脂族侧链的氨基酸例如V，在Kabat位置38的XH3为具有极性侧链的氨基酸例如R，在Kabat位置67的XH4为具有脂族侧链的氨基酸例如A，在Kabat位置69的XH5为具有脂族侧链的氨基酸例如I，在Kabat位置72的XH6为酸性氨基酸例如D，在Kabat位置81的XH7为酸性氨基酸例如E，和在Kabat位置87的XH8为具有脂族羟基侧链的氨基酸例如T；和(ii)VL域，包含氨基酸序列DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK 2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)，其中在Kabat位置10的XK1为芳族氨基酸例如F，在Kabat位置46的XK2为具有脂族侧链的氨基酸例如A，在Kabat位置63的XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸例如T，在Kabat位置80的XK4为具有脂族羟基侧链的氨基酸例如S，在Kabat位置85的XK5为酸性氨基酸例如D，和在Kabat位置87的XK6为芳族氨基酸例如F。
在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH域，包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL域，包含SEQ ID NO:7、8、9或10。
在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH域，包含分别包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL域，包含氨基酸序列DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK 2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)，其中在Kabat位置10的XK1、在Kabat位置46的XK2、在Kabat位置63的XK3、在Kabat位置80的XK4、在Kabat位置85的XK5和在Kabat位置87的XK6选自表6A中所阐述的氨基酸的组合。
在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH域，包含SEQ IDNO:2、3、4或5的氨基酸序列；和(ii)VL域，包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区)的本文描述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH域，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:11)，其中在Kabat位置11的XH1、在Kabat位置20的XH2、在Kabat位置38的XH3、在Kabat位置67的XH4、在Kabat位置69的XH5、在Kabat位置72的XH6、在Kabat位置81的XH7和在Kabat位置87的XH8选自表6B中所阐述的氨基酸的组合；和(ii)VL域，包含分别包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
表6A:VK域氨基酸取代
表6B:VH域氨基酸取代
在一个具体的实施方式中，本文描述的VL链区相对于恒定区的位置(即，边界)可以改变一、二、三或四个氨基酸位置，只要对KIT(例如，人KIT的D4区)的免疫特异性结合被维持(例如，实质上维持，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。在一个具体的实施方式中，本文描述的VH链区相对于恒定区的位置(即，边界)可以改变一、二、三或四个氨基酸位置，只要对KIT(例如，人KIT的D4区)的免疫特异性结合被维持(例如，实质上维持，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。
在具体的方面，本文提供的是包含本文描述的VH CDR和/或VL CDR的部分，例如，如表1-3和表10-15中所阐述，其中VH CDR和VL CDR以赋予与人KIT的D4区特异性结合的空间取向排列。
在具体的方面，本文提供的是包含以下的部分：包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列的VH CDR和包含SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列的VLCDR、包含SEQ ID NO:56、62和63的氨基酸序列的VH CDR和包含SEQID NO:59-61的氨基酸序列的VL CDR、包含SEQ ID NO:70-72的氨基酸序列的VH CDR和包含SEQ ID NO:66-68的氨基酸序列的VL CDR，其中VH CDR和VL CDR以赋予与人KIT的D4区特异性结合的空间取向排列。在某些实施方式中，所述部分是抗体或其抗原结合片段。在一个特定的实施方式中，所述部分是蛋白质，例如包含Fc区的融合蛋白。
在具体的方面，本文提供的是包含选自表13-15的VH CDR和/或选自表10-12的VL CDR的部分，其中VH CDR和VL CDR以赋予与人KIT的D4区特异性结合的空间取向排列。在某些实施方式中，所述部分是抗体或其抗原结合片段。在一个特定的实施方式中，所述部分是蛋白质，例如包含Fc区的融合蛋白。
在具体的方面，本文提供的是包含选自表10-15中给出的VH CDR 1-3和VL CDR 1-3的部分，例如抗体或其抗原结合片段，其中VH CDR和VLCDR以赋予与人KIT的D4区特异性结合的空间取向排列。在特定的方面，本文描述的部分包含以赋予与人KIT的D4区特异性结合的空间取向连接VH CDR 1-3和/或VL CDR 1-3的接头(linkers)，例如肽接头。
在特定的方面，本文描述的部分包含以赋予与人KIT的D4区特异性结合的空间取向连接VH CDR和/或VL CDR的接头，例如肽接头。
在某些方面，本文提供的是包含选自表10-15中给出的VL CDR 1-3和VH CDR 1-3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合KIT(例如人KIT)的D4区。
在一个具体的实施方式中，表10-15中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸是维持对人KIT的D4区的特异性结合亲和力的任何天然存在的氨基酸。在一个具体的实施方式中，表10-15中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸是维持对人KIT的D4区的特异性结合亲和力的非天然氨基酸。在一个具体的实施方式中，表10-15中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸是具有SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列的CDR的相应氨基酸的保守取代，其中维持对人KIT的D4区的特异性结合亲和力。
在一个具体的实施方式中，表10-15中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸独立地为氨基酸A、G、T、K或L。在一个特定的实施方式中，表10-15中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸为氨基酸A、G、T、Y、C或S。在这些实施方式的某些方面，维持对人KIT的D4区的特异性结合亲和力。
在某一个实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含VH CDR和/或VL CDR，选自表10-15中给出的那些。
在一个特定的实施方式中，CDR，例如在表10-15中所描绘的VL CDR1-3和VH CDR 1-3中的任何一个，包含一个或多个(例如，二、三、四或五个)“X”氨基酸，其中各“X”氨基酸可以为可维持该抗体或其片段对人KIT的D4区的特异性结合的任何氨基酸。
表10:VL CDR1
VL CDR1 SEQ ID NO:
K A S Q N V R T N V A 19
X A S Q N V R T N V A 74
K X S Q N V R T N V A 75
K A X Q N V R T N V A 76
K A S X N V R T N V A 77
K A S Q X V R T N V A 78
K A S Q(A/G/T/Y/C/S)V R T N V A 79
K A S Q N X R T N V A 80
K A S Q N V X T N V A 81
K A S Q N V R X N V A 82
K A S Q N V R T X V A 83
K A S Q N V R T(A/G/T/Y/C/S)V A 84
K A S Q N V R T N X A 85
K A S Q N V R T N V X 86
C K A S Q N V R T N V 87
I C K A S Q N V R T N 88
A S Q N V R T N V A W 89
S Q N V R T N V A W Y 90
Q N V R T N V A W Y Q 91
表11:VL CDR2
VL CDR2 SEQ ID NO:
S A S Y R Y S 20
X A S Y R Y S 92
S X S Y R Y S 93
S A X Y R Y S 94
S A S X R Y S 95
S A S Y X Y S 96
S A S Y R X S 97
S A S Y R Y X 98
Y S A S Y R Y 99
I Y S A S Y R 100
L I Y S A S Y 101
A S Y R Y S G 102
S Y R Y S G V 103
Y R Y S G V P 104
表12:VL CDR3
VL CDR3 SEQ ID NO:
Q Q Y N S Y P R T 21
Q X Y N S Y P R T 105
Q Q X N S Y P R T 106
Q Q Y X S Y P R T 107
Q Q Y N X Y P R T 108
Q Q Y N S X P R T 109
Q Q Y N S Y X R T 110
Q Q Y N S Y P X T 111
Q Q Y N S Y P R X 112
Q Q Y N S Y P R 113
C Q Q Y N S Y P 114
F C Q Q Y N S Y 115
Y F C Q Q Y N S 116
Q Y N S Y P R F 117
Y N S Y P R F G 118
S Y P R F G G 119
表13:VH CDR1
VH CDR1 SEQ ID NO:
D Y Y I N 16
X Y Y I N 120
D X Y I N 121
D Y X I N 122
D Y Y X N 123
DYYIX 124
TDYYI 125
FTDYY 126
TFTDY 127
Y Y I N W 128
Y Y I N W V 129
I N W V R 130
表14:VH CDR2
VH CDR2 SEQ ID NO:
R I Y P G S G N T Y Y N E K F K G 17
VH CDR2 SEQ ID NO:
X I Y P G S G N T Y Y N E K F K G 131
R X Y P G S G N T Y Y N E K F K G 132
R I X P G S G N T Y Y N E K F K G 133
R I Y X G S G N T Y Y N E K F K G 134
R I Y P X S G N T Y Y N E K F K G 135
R I Y P G X G N T Y Y N E K F K G 136
R I Y P G S X N T Y Y N E K F K G 137
R I Y P G S G X T Y Y N E K F K G 138
R I Y P G S G N X Y Y N E K F K G 139
R I Y P G S G N T X Y N E K F K G 140
R I Y P G S G N T Y X N E K F K G 141
R I Y P G S G N T Y Y X E K F K G 142
R I Y P G S G N T Y Y N X K F K G 143
R I Y P G S G N T Y Y N E X F K G 144
R I Y P G S G N T Y Y N E K X K G 145
R I Y P G S G N T Y Y N E K F X G 146
R I Y P G S G N T Y Y N E K F K X 147
A R I Y P G S G N T Y Y N E K F 148
I A R I Y P G S G N T Y Y N E K 149
W I A R I Y P G S G N T Y Y N E 150
I Y P G S G N T Y Y N E K F K G R 151
Y P G S G N T Y Y N E K F K G R A 152
P G S G N T Y Y N E K F K G R A T 153
表15:VH CDR3
VH CDR3 SEQ ID NO:
G V Y Y F D Y 18
X V Y Y F D Y 154
G X Y Y F D Y 155
G V X Y F D Y 156
G V Y X F D Y 157
G V Y Y X D Y 158
G V Y Y F X Y 159
G V Y Y F D X 160
R G V Y Y F D 161
A R G V Y Y F 162
C A R G V Y Y 163
G V Y Y F D Y W 164
V Y Y F D Y W G 165
Y Y F D Y W G Q 166
在某些方面，本文提供的是抗体或其抗原结合片段，包含选自表20-23中给出的VL FR 1-4和/或选自表16-19中给出的VH FR 1-4，其中所述抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合KIT(例如人KIT)的D4区。
在一个具体的实施方式中，表16-23中的任何一个中的FR的“X”氨基酸是维持对人KIT的D4区的特异性结合亲和力的任何天然存在的氨基酸。在一个具体的实施方式中，表16-23中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸是维持对人KIT的D4区的特异性结合亲和力的非天然氨基酸。在一个具体的实施方式中，表16-23中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸是具有SEQ IDNO:16-21的氨基酸序列的CDR的相应氨基酸的保守取代，其中维持对人KIT的D4区的特异性结合亲和力。
在一个具体的实施方式中，表16-23中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸为氨基酸A、G、T、K或L。在一个特定的实施方式中，表16-23中的任何一个中的CDR的“X”氨基酸为氨基酸A、G、T、Y、C或S。在这些实施方式的某些方面，维持对人KIT的D4区的特异性结合亲和力。在某一个实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含VH CDR和/或VL CDR，选自表16-23中给出的那些。
在一个特定的实施方式中，FR，例如表16-23中所描绘的VL FR 1-4和VH FR 1-4中的任何一个，包含一个或多个(例如，二、三、四或五个)“X”氨基酸，其中各“X”氨基酸可以为可维持该抗体或其片段对人KIT的D4区的特异性结合的任何氨基酸。
表16:VH FR1
VH FR1 SEQ ID NO:
H1 QVQLVQSGAELKKPGASVKLSCKASGYTFT 33
H2/H3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFT 37
H4/H5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 41
XVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 167
QXQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 168
QVXLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 169
QVQXVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 170
QVQLXQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 171
QVQLVXSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 172
QVQLVQXGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 173
QVQLVQSXAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 174
QVQLVQSGXE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 175
QVQLVQSGAX(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 176
QVQLVQSGAEXKKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 177
QVQLVQSGAE(L/V)XKPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 178
QVQLVQSGAE(L/V)KXPGASVK(L/V)SCKASGYTFT 179
QVQLVQSGAE(L/V)KKXGASVK(L/V)SCKASGYTFT 180
QVQLVQSGAE(L/V)KKPXASVK(L/V)SCKASGYTFT 181
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGXSVK(L/V)SCKASGYTFT 182
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGAXVK(L/V)SCKASGYTFT 183
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASXK(L/V)SCKASGYTFT 184
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVX(L/V)SCKASGYTFT 185
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVKXSCKASGYTFT 186
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)XCKASGYTFT 187
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SXKASGYTFT 188
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCXASGYTFT 189
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKXSGYTFT 190
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKAXGYTFT 191
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASXYTFT 192
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGXTFT 193
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYXFT 194
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTXT 195
QVQLVQSGAE(L/V)KKPGASVK(L/V)SCKASGYTFX 196
表17:VH FR2
VH FR2 SEQ ID NO:
H1/H2 WVKQAPGKGLEWIA 34
H3/H4/H5 WVRQAPGKGLEWIA 39
XV(R/K)QAPGKGLEWIA 197
WX(R/K)QAPGKGLEWIA 198
WVXQAPGKGLEWIA 199
WV(R/K)XAPGKGLEWIA 200
WV(R/K)QXPGKGLEWIA 201
WV(R/K)QAXGKGLEWIA 202
WV(R/K)QAPXKGLEWIA 203
WV(R/K)QAPGXGLEWIA 204
WV(R/K)QAPGKXLEWIA 205
WV(R/K)QAPGKGXEWIA 206
WV(R/K)QAPGKGLXWIA 207
WV(R/K)QAPGKGLEXIA 208
WV(R/K)QAPGKGLEWXA 209
WV(R/K)QAPGKGLEWIX 210
表18:VH FR3
表19:VH FR4
VH FR4 SEQ ID NO:
H1-H5 WGQGTTVTVSS 36
XGQGTTVTVSS 243
WXQGTTVTVSS 244
VH FR4 SEQ ID NO:
WGXGTTVTVSS 245
WGQXTTVTVSS 246
WGQGXTVTVSS 247
WGQGTXVTVSS 248
WGQGTTXTVSS 249
WGQGTTVXVSS 250
WGQGTTVTXSS 251
WGQGTTVTVXS 252
WGQGTTVTVSX 253
表20:VL FR1
VL FR1 SEQ ID NO:
L1 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC 44
L2/L3/L4 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITC 48
XIVMTQSPS(F/S)LSASVGDRVTITC 254
DXVMTQSPS(F/S)LSASVGDRVTITC 255
DIXMTQSPS(F/S)LSASVGDRVTITC 256
DIVXTQSPS(F/S)LSASVGDRVTITC 257
DIVMXQSPS(F/S)LSASVGDRVTITC 258
DIVMTXSPS(F/S)LSASVGDRVTITC 259
DIVMTQXPS(F/S)LSASVGDRVTITC 260
DIVMTQSXS(F/S)LSASVGDRVTITC 261
DIVMTQSPX(F/S)LSASVGDRVTITC 262
DIVMTQSPSXLSASVGDRVTITC 263
DIVMTQSPS(F/S)XSASVGDRVTITC 264
DIVMTQSPS(F/S)LXASVGDRVTITC 265
DIVMTQSPS(F/S)LSXSVGDRVTITC 266
DIVMTQSPS(F/S)LSAXVGDRVTITC 267
DIVMTQSPS(F/S)LSASXGDRVTITC 268
DIVMTQSPS(F/S)LSASVXDRVTITC 269
DIVMTQSPS(F/S)LSASVGXRVTITC 270
DIVMTQSPS(F/S)LSASVGDXVTITC 271
DIVMTQSPS(F/S)LSASVGDRXTITC 272
DIVMTQSPS(F/S)LSASVGDRVXITC 273
DIVMTQSPS(F/S)LSASVGDRVTXTC 274
DIVMTQSPS(F/S)LSASVGDRVTIXC 275
DIVMTQSPS(F/S)LSASVGDRVTITX 276
表21:VL FR2
VL FR2 SEQ ID NO:
L1/L2/L3 WYQQKPGKAPKALIY 45
L4 WYQQKPGKAPKSLIY 51
XYQQKPGKAPK(S/A)LIY 277
WXQQKPGKAPK(S/A)LIY 278
WYXQKPGKAPK(S/A)LIY 279
WYQXKPGKAPK(S/A)LIY 280
WYQQXPGKAPK(S/A)LIY 281
WYQQKXGKAPK(S/A)LIY 282
WYQQKPXKAPK(S/A)LIY 283
WYQQKPGXAPK(S/A)LIY 284
WYQQKPGKXPK(S/A)LIY 285
WYQQKPGKAXK(S/A)LIY 286
WYQQKPGKAPX(S/A)LIY 287
WYQQKPGKAPKXLIY 288
WYQQKPGKAPK(S/A)XIY 289
WYQQKPGKAPK(S/A)LXY 290
WYQQKPGKAPK(S/A)LIX 291
表22:VL FR3
表23:VL FR4
VL FR4 SEQ ID NO:
L1-L4 FGGGTKVEIK 47
XGGGTKVEIK 324
FXGGTKVEIK 325
FGXGTKVEIK 326
FGGXTKVEIK 327
FGGGXKVEIK 328
FGGGTXVEIK 329
FGGGTKXEIK 330
FGGGTKVXIK 331
FGGGTKVEXK 332
FGGGTKVEIX 333
在一个方面，本文描述的抗体包含Fc区，该Fc区包含一个或多个氨基酸缺失、添加和/或修饰。
如本文所用的“Fc区”包括包含排除了第一恒定区免疫球蛋白域的抗体的恒定区的多肽，并因此是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白域、IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白域和这些域的N-末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc区可包括J链。对于IgG，Fc区可包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3及Cγ1和Cγ2之间的铰链。虽然Fc区的边界可改变，但是人IgG重链Fc区一般包含残基C226或P230至其羧基末端，其中该编号是根据如在Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,国家技术信息服务中心(National Technical Information Service),Springfield,VA)中的EU索引。“如在Kabat中所阐述的EU索引”是指如Kabat等人(同上)所描述的人IgG1EU抗体的残基编号。在某一个实施方式中，Fc区包含非天然存在的Fc区。在某些方面，一个或多个Fc位置，包括但不限于Kabat 270、272、312、315、356和358上存在一种或多种多态现象。
在一个方面，本文提供的是如本文描述的与KIT的D4区特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含相对于相应抗体(例如，具有相同氨基酸序列但具有野生型Fc区的抗体)对Fc配体(例如，Fc受体，例如C1q)具有改变的结合特性的Fc区。
Fc区对其配体的亲和力及结合特性可通过本领域已知的用于测定Fc-FcγR相互作用即Fc区与FcγR的特异性结合的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定法)来测定，包括但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如，分析)和其它方法例如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和层析法(例如，凝胶过滤)。这些和其它方法可利用一种或多种待检组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。
在一个实施方式中，本文描述的抗体的Fc区对一种或多种Fc配体具有比相应分子增强的结合性。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的Fc区对Fc受体具有增强的结合性。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的Fc区对Fc受体FcγRIIIA具有增强的结合性。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的Fc区对Fc受体FcRn具有增强的结合性。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的Fc区对C1q具有比相应分子增强的结合性。
在某一个方面，包含Fc区的蛋白质的血清半衰期可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力而增加。在一个实施方式中，本文描述的抗体的Fc区比相应分子具有增强的血清半衰期。
“抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中结合于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcRs)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性细胞与携带抗原的靶细胞特异性结合并随后用细胞毒素杀死这些靶细胞。针对靶细胞表面的特异性高亲和力IgG抗体“武装”细胞毒性细胞用于这样的杀伤。靶细胞的溶胞涉及直接细胞与细胞接触，但不涉及补体。预期除了抗体以外，具有特异性结合于携带抗原的靶细胞的能力的包含Fc区的其它蛋白质(准确地讲是Fc融合蛋白)也将能够发挥细胞介导的细胞毒性。为简便起见，因Fc融合蛋白的活性所致的细胞介导的细胞毒性在本文中也被称为ADCC活性。
可测定包含Fc区的任何特定蛋白质(例如，抗体)通过ADCC介导靶细胞溶解的能力。为了评估Fc区的ADCC活性，将包含Fc区的靶细胞-结合抗体加到靶细胞与免疫效应子细胞的组合中，免疫效应子细胞可被抗原-抗体复合物活化而导致靶细胞的细胞溶解。一般通过标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然细胞内蛋白质)自溶解的细胞中释放来检测细胞溶解。用于这样的测定法的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。体外ADCC测定的具体实例描述于Wisecarver等人,198579:277-282；Bruggemann等人,1987,J Exp.Med.166:1351-1361；Wilkinson等人,2001,J Immunol Methods 258:183-191；Patel等人,1995J ImmunolMethods 184:29-38。或者，或另外地，包含Fc区的蛋白质的ADCC活性可进行体内评估，例如在动物模型中，例如在Clynes等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656中公开的动物模型中。
在一个实施方式中，包含Fc区的蛋白质(例如，本文描述的抗体)相对于相应蛋白质(例如，抗体)具有增强的ADCC活性。在另一个具体的实施方式中，本文描述的包含Fc区的抗体相对于相应抗体具有增强的对Fc受体FcγRIIIA结合性并且具有增强的ADCC活性。在有些实施方式中，本文描述的包含Fc区的抗体相对于相应抗体既具有增强的ADCC活性又具有增强的血清半衰期。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在补体存在下靶细胞的溶解。通过补体系统的第一组分(C1q)与分子(例如与关联(cognate)抗原复合的抗体)的结合而启动补体活化途径。为了评估补体活化，可以进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人,1996,J Immunol Methods,202:163中所描述。在一个实施方式中，本文描述的包含Fc区的抗体相对于相应抗体具有增强的CDC活性。在其它的实施方式中，本文描述的包含Fc区的抗体相对于相应抗体既具有增强的CDC活性又具有增强的血清半衰期。
在一个实施方式中，本文描述的抗体包含Fc区，该Fc区在一个或多个位置(例如，在一、二、三或四个位置)上包含氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加或非天然存在的氨基酸残基)，所述的一个或多个位置选自由234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、252、254、256、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333和334组成的组，如Kabat中所阐述的EU索引加以编号。任选地，该Fc区在本领域技术人员已知的另外的和/或替代的位置上可包含氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加)或非天然存在的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公布WO 01/58957；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217，所述各文献以全文并入本文中，但尤其是关于此类修饰的公开内容)。在一个进一步的实施方式中，Fc区的一种或多种功能被维持(例如，实质上维持，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)，因为该Fc区在一个或多个位置上包含氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加)或非天然存在的氨基酸残基。例如，这样的Fc功能可包括效应子功能(例如CDC或ADCC)或对Fc受体的结合亲和力。在某一个实施方式中，在一个或多个位置上包含氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加)或非天然存在的氨基酸残基的Fc区表现出至少一种或多种增强的Fc活性(例如，增强的半衰期)或增强的效应子功能(例如ADCC或CDC)。在一个特定的实施方式中，在一个或多个位置上包含氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加)或非天然存在的氨基酸残基的Fc区表现出降低的Fc活性(例如，降低的稳定性/半衰期)或降低的效应子功能(例如ADCC或CDC)。
在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体包含Fc区，其中该Fc区包含至少一个(例如，一、二、三或四个)氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加)或至少一个非天然存在的氨基酸残基(例如，一、二、三或四个)，所述氨基酸残基选自由234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R.243W、243L 243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、252Y、254T、256E、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H,332Y和332A组成的组，如Kabat中所阐述的EU索引加以编号。任选地，该Fc区可包含本领域技术人员已知的另外的和/或替代的非天然存在的氨基酸残基(参见例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公布WO01/58957；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217)。
在某一个方面，本文提供的是包含Fc区的抗体，其中该Fc区在一个或多个位置上包含至少一个非天然存在的氨基酸，所述一个或多个位置选自由239、330和332组成的组，如Kabat中所阐述的EU索引加以编号。在一个具体的实施方式中，本文提供的是包含Fc区的抗体，其中该Fc区包含至少一个非天然存在的氨基酸，所述氨基酸选自由239D、330L和332E组成的组，如Kabat中所阐述的EU索引加以编号。任选地，该Fc区在一个或多个位置上可进一步包含另外的非天然存在的氨基酸，所述氨基酸选自由252、254和256组成的组，如Kabat中所阐述的EU索引加以编号。在一个具体的实施方式中，本文提供的是包含Fc区的抗体，其中该Fc区在一个或多个位置上包含至少一个非天然存在的氨基酸(选自由239D、330L和332E组成的组，如Kabat中所阐述的EU索引加以编号)和至少一个非天然存在的氨基酸(选自由252Y、254T和256E组成的组，如Kabat中所阐述的EU索引加以编号)。在一个实施方式中，包含此种序列的Fc区表现出一种或多种Fc活性(例如，对Fc受体的结合亲和力)或效应子功能(例如ADCC或CDC)。在一个具体的实施方式中，包含此种序列的Fc区表现出降低的Fc活性(例如，降低的对Fc受体的结合亲和力)或降低的效应子功能(例如ADCC或CDC)。在一个特定的实施方式中，包含此种序列的Fc区表现出增强的Fc活性(例如，增强的半衰期、增强的对Fc受体的结合亲和力)或增强的效应子功能(例如ADCC或CDC)。
Fc区修饰的非限制性实例在以下文献中提供：Ghetie等人,1997,NatBiotech.15:637-40；Duncan等人,1988,Nature 332:563-564；Lund等人,1991,J.Immunol 147:2657-2662；Lund等人,1992,Mol Immunol 29:53-59；Alegre等人,1994,Transplantation 57:1537-1543；Hutchins等人,1995,ProcNatl.Acad Sci U S A 92:11980-11984；Jefferis等人,1995,Immunol Lett.44:111-117；Lund等人,1995,Faseb J 9:115-119；Jefferis等人,1996,Immunol Lett 54:101-104；Lund等人,1996,J Immunol 157:4963-4969；Armour等人,1999,Eur J Immunol 29:2613-2624；Idusogie等人,2000,JImmunol 164:4178-4184；Reddy等人,2000,J Immunol 164:1925-1933；Xu等人,2000,Cell Immunol 200:16-26；Idusogie等人,2001,J Immunol166:2571-2575；Shields等人,2001,J Biol Chem 276:6591-6604；Jefferis等人,2002,Immunol Lett 82:57-65；Presta等人,2002,Biochem Soc Trans30:487-490)；美国专利号5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745、6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,528,624、6,194,551、6,737,056、6,821,505、6,277,375、8,163,882、7,355,008、7,960,512、8,039,592、8,039,359、8,101,720、7,214,775、7,682,610、7,741,442；美国专利公布号2004/0002587和PCT公布WO 94/29351、WO99/58572、WO 00/42072、WO 04/029207、WO 04/099249、WO04/063351。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体包含对IgG1Fc区(例如人IgG1Fc区)的一个或多个(例如，一、二、三或四个)修饰。在某一个实施方式中，本文描述的抗体包含对IgG2Fc区(例如人IgG2Fc区)的一个或多个(例如，一、二、三或四个)修饰。在一个实施方式中，本文描述的抗体包含对IgG4Fc区(例如人IgG4Fc区)的一个或多个(例如，一、二、三或四个)修饰。
在一些方面，本文描述的抗体包含Fc区，其中该Fc区包含一个或多个(例如，一、二、三或四个)糖形修饰(例如，一个或多个糖形的去除或取代)，例如工程改造的糖形，即与包含Fc区的分子共价连接的碳水化合物组合物。工程改造的糖形对于多种目的(包括但不限于增强或降低效应子功能)可能是很有用的。工程改造的糖形可通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过使用工程改造的或变异的表达菌株、通过与一种或多种酶(例如DIN-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTI11))一起共表达、通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子或者通过在已表达包含Fc区的分子后修饰碳水化合物来产生。用于产生工程改造的糖形的方法为本领域已知的，并且包括但不限于以下文献中描述的那些：Umana等人,1999,Nat.Biotechnol 17:176-180；Davies等人,20017Biotechnol Bioeng74:288-294；Shields等人,2002,J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,J Biol Chem 278:3466-3473)美国专利号6,602,684；美国申请号10/277,370；美国申请号10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；WO00061739；US 20030115614；和Okazaki等人,2004,JMB,336:1239-49。用于产生本文描述的抗体的修饰的糖形的方法在本领域有描述，并且包括但不限于以下文献中描述的那些：美国专利号7,517,670、美国专利号8,021,856、美国专利号8,080,415、美国专利号8,084,222、美国专利号7,700,321和美国专利号8,071,336。
在一个特定的实施方式中，Fc区的糖基化可经修饰以增加或减少效应子功能。因此，在一个实施方式中，本文描述的抗体的Fc区包含氨基酸残基的修饰的糖基化。在另一个实施方式中，所述氨基酸残基的修饰的糖基化导致降低的效应子功能(例如ADCC或CDC)。在另一个实施方式中，所述氨基酸残基的修饰的糖基化导致增加的效应子功能。在有些实施方式中，本文提供的抗体的糖基化模式经修饰以增强ADCC和CDC效应子功能(参见例如，Shields等人,(2002)JBC.277:26733；Shinkawa等人,(2003)JBC.278:3466和Okazaki等人,(2004)J.Mol.Biol.,336:1239)。在一个具体的实施方式中，这样的修饰的糖基化不同于体内天然存在的Fc区的糖基化，或者这样的修饰的糖基化是Fc区的非天然存在的糖基化。例如，Fc区的修饰的糖基化可通过以下方法来实现：通过修饰氨基酸或通过在已经过工程改造以含有不同于其未经过修饰的亲本细胞的糖基化机器的细胞中表达该蛋白质/抗体。关于这一点，这样的细胞可经过工程改造以不表达某一糖基化酶或表达亲本细胞中不存在的某一糖基化酶。
用于产生非天然存在的Fc区的方法为本领域已知的。例如，氨基酸取代和/或缺失可通过以下方法产生：诱变方法，包括但不限于位点定向诱变(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985))、PCR诱变(Higuchi,载于"PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications",Academic Press,San Diego,第177-183页(1990))和盒式诱变(Wells等人,Gene 34:315-323(1985))。位点定向诱变可以通过重叠-延伸PCR方法来进行(Higuchi,载于"PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification”,Stockton Press,New York,第61-70页(1989))。或者，重叠-延伸PCR(Higuchi,同上)的技术可用于将任选期望的突变引入到靶序列(起始DNA)中。可用于产生Fc区修饰的其它方法为本领域已知的(参见例如，美国专利号5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745、6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,528,624、6,194,551、6,737,056、6,821,505、6,277,375；美国专利公布号2004/0002587和PCT公布WO 94/29351、WO99/58572、WO 00/42072、WO 02/060919、WO 04/029207、WO 04/099249、WO 04/063351)。
在一个具体的实施方式中，所述Fc区具有降低的岩藻糖基化。在另一个实施方式中，所述Fc区经去岩藻糖基化(参见例如，美国专利申请公布号2005/0226867)。
在某一个方面，本文描述的抗体是非岩藻糖基化抗体，例如所述抗体的Fc区不含有具有岩藻糖(例如，与N-乙酰基葡糖胺结合的岩藻糖)的糖链(参见例如，美国专利号7,214,775、7,682,610和7,741,442)。用于制备非岩藻糖基化抗体的方法为本领域已知的，参见例如美国专利第7,708,992号。例如，非岩藻糖基化抗体可使用工程改造的宿主细胞产生，参见例如美国专利号6,946,292、7,425,446、8,067,232、7,846,725和7,393,683。用于产生非岩藻糖基化抗体的敲除(knock-out)动物也已经有描述，参见例如美国专利第7,737,325号。在一个特定的实施方式中，本文描述的与人KIT的D4区特异性结合的非岩藻糖基化抗体表现出增加的ADCC。
在一个特定的方面，相对于参考抗体的岩藻糖含量，本文描述的抗体包含小于100％，例如小于65％的岩藻糖含量(参见例如，美国专利号7,931,895和7,846,434)。在某一个实施方式中，本文描述的抗体的特征在于岩藻糖含量，其中至少约60％的N联寡糖(例如CH2源性域中的N联寡糖)不含有岩藻糖。在具体的实施方式中，不含有岩藻糖的N联寡糖(例如CH2源性域中的N联寡糖)的百分比为至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约95％以上，并且表现出改变的效应子功能，例如增强的ADCC或降低的ADCC。在一个特定的实施方式中，本文描述的与人KIT的D4区特异性结合的抗体包含小于65％的岩藻糖含量并且表现出增加的ADCC。
在特定的方面，本文描述的抗体包含具有改变的FcγR结合活性而呈现与FcγR结合降低的Fc区，并且包含位于该Fc区的氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439中的一个或多个(例如，一、二、三或四个)上的氨基酸修饰，其中该Fc区中的残基编号是如Kabat中的EU索引的编号(参见例如，美国专利第7,183,387号)。例如，本文描述的包含Fc区的抗体呈现与FcγRI结合降低并且包含位于该Fc区的氨基酸位置238、265、269、270、327或329中的一个或多个(一、二、三或四个)上的氨基酸修饰，其中该Fc区中的残基编号是如Kabat中的EU索引的编号。
在一个特定的实施方式中，本文描述的包含Fc区的抗体呈现与FcγRII结合降低并且包含位于该Fc区的氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439中的任何一个或多个(例如，一、二、三或四个)上的氨基酸修饰，其中该Fc区中的残基编号是如Kabat中的EU索引的编号。
在一个具体的实施方式中，本文描述的包含Fc区的抗体呈现与FcγRIII结合降低并且包含位于该Fc区的氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437中的一个或多个(例如，一、二、三或四个)上的氨基酸修饰，其中该Fc区中的残基编号是如Kabat中的EU索引的编号。
在某些方面，包含Fc区的蛋白质(例如本文描述的抗体)的血清半衰期通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力而增加。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段与KIT多肽(例如，人KIT的D4区)特异性结合，其中EC50(半数最大有效浓度)值为约50nM或约50nM以下，如通过ELISA所测定。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段与KIT多肽(例如，人KIT的D4区)特异性结合，其中EC50值为约150pM或约150pM以下，如通过FACs利用CHO-WT-KIT细胞(经工程改造以重组表达野生型人KIT的CHO细胞)所测定。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段(其特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区))能够阻断KIT磷酸化，其中IC50(50％抑制浓度)值为约600pM或约600pM以下。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段(其特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区))在CHO细胞中以至少0.5μg/mL的平均效价重组表达。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段(其特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区))在CHO细胞中以至少1.0μg/mL的平均效价重组表达。
在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段(其特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT的D4区))包含作为非免疫原性的VH域和VL域，例如所述VH域和VL域不含有T细胞表位。
在特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)不结合KIT的细胞外配体结合位点，例如KIT的SCF结合位点。在特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段)不抑制配体与KIT结合，例如不抑制KIT配体(例如，SCF)与KIT结合。
在具体的方面，本文描述的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)是抑制性抗体，即，抑制(例如，部分抑制)KIT活性(即，一种或多种KIT活性)的抗体。在一个具体的实施方式中，KIT活性的部分抑制导致例如约25％至约65％或75％抑制。在一个具体的实施方式中，KIT活性的部分抑制导致例如约35％至约85％或95％抑制。KIT活性的非限制性实例包括KIT二聚化、KIT磷酸化(例如，酪氨酸磷酸化)、KIT下游的信号传导(例如，Stat、AKT、MAPK或Ras信号传导)、基因转录(例如，c-Myc)的诱导或增强、细胞增殖的诱导或增强或细胞存活。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体抑制KIT磷酸化(例如，配体诱导的磷酸化)。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体抑制KIT细胞质域中的KIT酪氨酸磷酸化。在另一个特定的实施方式中，本文描述的抗体抑制细胞增殖。在又一个特定的实施方式中，本文描述的抗体抑制细胞存活。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体诱导细胞凋亡。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体诱导细胞分化，例如表达KIT(例如人KIT)的细胞中的细胞分化。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体抑制KIT活性但不抑制KIT二聚化。在另一个特定的实施方式中，本文描述的抗体抑制KIT活性但不抑制配体与KIT结合，例如不抑制KIT配体(例如，SCF)与KIT结合，但确实抑制KIT二聚化。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体抑制KIT活性，例如配体诱导的KIT细胞质域的酪氨酸磷酸化，抑制程度为约25％至约65％或75％，如通过本领域所熟知的基于细胞的磷酸化测定法(例如，本文描述的基于细胞的磷酸化测定法)所测定。在某一个实施方式中，本文描述的抗体抑制KIT活性，例如配体诱导的KIT细胞质域的酪氨酸磷酸化，抑制程度为约35％至约85％或95％，如通过本领域所熟知的基于细胞的磷酸化测定法(例如，本文描述的基于细胞的磷酸化测定法)所测定。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段或其缀合物抑制KIT活性，例如配体诱导的KIT细胞质域的酪氨酸磷酸化，其中50％抑制浓度(IC50)为小于约600pM、或小于约500pM、或小于约250pM，如通过本领域所熟知的基于细胞的磷酸化测定法(例如，本文描述的基于细胞的磷酸化测定法)所测定。在一个具体的实施方式中，IC50为小于约550pM或200pM。在一个具体的实施方式中，IC50是在约50pM至约225pM的范围内或在100pM至约600pM的范围内。在一个具体的实施方式中，IC50是在约50pM至约550pM、或约50pM至约600pM、或约150pM至约550pM的范围内。
在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段或其缀合物，(i)免疫特异性结合于包含人KIT的D4区的KIT多肽，(ii)抑制KIT磷酸化(例如，酪氨酸磷酸化)，和(iii)不影响KIT配体(例如，SCF)结合于KIT。在又一个具体的实施方式中，这样的抗体不抑制KIT二聚化。在又一个具体的实施方式中，这样的抗体可由CHO细胞以至少0.5μg/mL，例如至少1.0μg/mL的平均效价重组表达。在一个进一步具体的实施方式中，这样的抗体包含作为非免疫原性的VH域和VL域，例如所述VH域和VL域不含有T细胞表位。
在其它具体的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段或其缀合物免疫特异性结合于单体形式的KIT(例如人KIT)。在特定的实施方式中，本文描述的抗体不免疫特异性结合于单体形式的KIT(例如人KIT)。在具体的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段或其缀合物免疫特异性结合于二聚体形式的KIT(例如人KIT)。在具体的实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段或其缀合物不结合于单体形式的KIT但特异性结合于二聚体形式的KIT或多聚体形式的KIT。在某些实施方式中，抗体对KIT单体亲和力高于对KIT二聚体的亲和力。在某些实施方式中，抗体对KIT单体的亲和力高于对KIT多聚体的亲和力。
在具体的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)特异性结合于KIT的天然同等型或天然变异体(即，在动物(例如，猴、小鼠、山羊、驴、狗、猫、兔、猪、大鼠、人、青蛙或鸟)中的可以从动物、优选人中分离的KIT的天然存在的同等型或变异体)。在特定的实施方式中，本文描述的抗体免疫特异性结合于人KIT或其片段。在具体的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)特异性结合于人KIT或其片段但不特异性结合于非人KIT(例如，猴、小鼠、山羊、驴、狗、猫、兔、猪、大鼠或鸟)或其片段。在具体的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)特异性结合于人KIT或其片段但不特异性结合于鼠KIT。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体特异性结合于人KIT或其片段(例如，人KIT的D4区)和犬(狗)和非人灵长类动物(例如，猴)KIT。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体特异性结合于人KIT或其片段(例如，人KIT的D4区)和犬(狗)KIT。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体特异性结合于人KIT或其片段(例如，人KIT的D4区)和非人灵长类动物(例如，猴)KIT。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体特异性结合于人KIT或其片段(例如，人KIT的D4区)和犬(狗)和非人灵长类动物(例如，猴)KIT，但不特异性结合于鼠KIT或其片段(例如，鼠KIT的D4区)。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段结合于包含突变的人KIT的细胞外域，所述突变例如与癌症(例如，GIST)相关的体细胞突变，例如人KIT的外显子9中的突变，其中位置502和503上的Ala和Tyr残基重复出现。在某些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段结合于野生型人KIT的细胞外域和包含突变的人KIT的细胞外域，所述突变例如与癌症(例如，GIST)相关的体细胞突变，例如人KIT的外显子9中的突变，其中位置502和503上的Ala和Tyr残基重复出现(参见例如，Marcia等人,(2000)Am.J.Pathol.156(3):791-795；和Debiec-Rychter等人,(2004)European Journal of Cancer.40:689-695，这些文献均以全文引用的方式并入本文中，描述KIT突变)。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段结合于经糖基化的人KIT的细胞外域。在某些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段结合于人KIT的细胞外域的两种不同糖基化形式。例如，通过免疫印迹法已观察到具有不同分子量，从而指示不同的糖基化模式的两种人KIT形式。在某些实施方式中，本文描述的抗体可特异性结合于两种具有不同糖基化模式的这些人KIT形式，例如一种形式的糖基化程度大于另一种形式。在某些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段结合于未经糖基化的人KIT的细胞外域。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体不免疫特异性结合于由国际专利申请号WO 2008/153926中所描述的KIT表位，例如基本上由氨基酸序列SELHLTRLKGTEGGTYT(SEQ ID NO:38)或LTRLKGTEGG(SEQ IDNO:39)组成的表位。
在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不是选自以下的抗体：SR-1抗体(参见美国专利申请公布号US 2007/0253951A1；国际专利申请公布号WO 2007/127317)；获自杂交瘤细胞系DSM ACC 2007、DSM ACC 2008或DSM ACC 2009的抗KIT抗体，其已在德国微生物菌种保藏中心(theDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),DSM,Mascheroder Weg 1b,D-38124Braumschweig,Germany(参见美国专利号5,545,533；国际专利申请公布号WO 92/021766)进行了保藏；由杂交瘤细胞系DSM ACC 2247产生的抗体(或A3C6E2；保藏号DSM ACC 2247，保藏在德国微生物菌种保藏中心(the Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH),DSM,Mascheroder Weg 1b,D-38124Braumschweig,Germany)(参见美国专利号5,808,002)；和命名为K27、K44、K45、K49、K57、K69和K94的抗KIT抗体(参见例如，Blechman等人,Stem Cells,1993,11:12-21；Blechman等人,Cell,1995,80:103-113；Lev等人,Mol.Cell.Biol.,1993,13:2224-2234；和欧洲专利申请公布号EP0548867A2)。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不包含选自这些组的抗体的CDR。在特定的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不包含选自这些组的抗体的一个或多个(例如，二、三、四、五或六个)CDR(例如，3个VL CDR和/或3个VH CDR)。在另一个实施方式中，本文描述的抗体不被那些抗体之一竞争性阻断(例如，以剂量依赖性方式竞争性阻断)，例如，如通过竞争结合测定(例如，ELISAs)所测定。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不是如2010年12月22日申请的美国临时申请号61/426,387中所描述的抗体Ab1或Ab21。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不是选自以下的抗体：如2010年12月22日申请的美国临时申请号61/426,387中所描述的Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20和Ab21，以及如2011年3月25日申请的PCT国际专利申请号PCT/US2011/29980中所描述的Ab24-Ab192。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不包含选自以下的抗体的CDR或一个或多个CDR(例如，3个VL CDR和/或3个VH CDR)：如2010年12月22日申请的美国临时申请号61/426,387中所描述的Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20和Ab21，以及如2011年3月25日申请的PCT国际专利申请号PCT/US2011/29980中所描述的Ab24-Ab192。在特定的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不包含选自如2010年12月22日申请的美国临时申请号61/426,387或2011年3月25日申请的PCT国际专利申请号PCT/US2011/29980中所描述的抗体(例如，抗体Ab1-Ab21和Ab24-Ab192)的抗体的CDR或一个或多个CDR(例如，3个VL CDR和/或3个VH CDR)、VL链区或VH链区。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不是如2010年12月22日申请的美国临时申请号61/426,387中所描述的抗体Ab1或Ab21或包含该抗体Ab1或Ab21的CDR(例如，一、二、三、四、五或六个CDR)的抗体。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体不是如2012年1月25日申请的PCT国际专利申请号PCT/US2012/022471中所描述的抗体37M或37C。在某一个实施方式中，本文描述的抗体不包含包含SEQ ID NO:32的VL域或包含SEQ ID NO:31的VH域。
在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如，人KIT)的D4区)的本文描述的抗体或其抗原结合片段不包含如美国专利申请公布号US 2008/0287309中所描述的抗体的一个或多个(例如，二、三、四、五或六个)CDR(例如，VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)，例如抗体36C1、84H7、63C10或65A12。
在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不是例如在美国专利号5,919,911或美国专利号5,489,516中所描述的由具有美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号HB10716的杂交瘤(BA7.3C.9)产生的抗体的人或人源化形式。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不包含例如在美国专利号5,919,911或美国专利号5,489,516中所描述的由具有美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号HB10716的杂交瘤(BA7.3C.9)产生的抗体的CDR(例如，VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3)。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不包含例如在美国专利号5,919,911或美国专利号5,489,516或美国专利申请公布号US 2007/0253951A1(参见例如，[0032]或[0023])中所描述的SR-1抗体的CDR。在一个进一步的实施方式中，本文描述的抗体不是例如在美国专利号5,919,911或美国专利号5,489,516中所描述的由具有美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号HB10716的杂交瘤(BA7.3C.9)产生的抗体的抗体。
在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不是如在美国专利申请公布号US 2007/0253951A1中所描述的SR-1抗体的人源化抗体。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不包含选自以下的一个或多个氨基酸序列：在美国专利申请公布号US 2007/0253951A1中所提及的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体不包含在美国专利申请公布号US2007/0253951A1中所提及的SEQ ID NO:2和4或SEQ ID NO:2和6的氨基酸序列。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不包含与选自以下的氨基酸序列有至少90％同一性的一个或多个氨基酸序列：在美国专利申请公布号US 2007/0253951A1中所提及的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体不包含在美国专利申请公布号US 2007/0253951A1中所描述的一个或多个CDR，例如SEQ ID NO:8的氨基酸44至58(抗体SR-1的VL CDR1；RASESVDIYGNSFMH)、SEQ ID NO:8的氨基酸74至80(抗体SR-1的VL CDR2；LASNLES)、SEQ ID NO:8的氨基酸111至121(抗体SR-1的VL CDR3；QQNNEDPYT)、SEQ ID NO:10的氨基酸50至54(抗体SR-1的VH CDR1；SYNMH)、SEQ ID NO:10的氨基酸69至85(抗体SR-1的VH CDR2；VIYSGNGDTSYNQKFKG)和/或SEQ ID NO:10的氨基酸118至125(抗体SR-1的VH CDR3；RDTRFGN)，其中SEQ ID NO:8和10是美国专利申请公布号US 2007/0253951A1(参见例如，[0032]或[0023])中所提及的那些。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体不包含美国专利申请公布号US 2007/0253951A1中所描述的一个或多个CDR，例如SEQ ID NO:2的氨基酸43至58(VL CDR1)、SEQ ID NO:2的氨基酸74至80(VL CDR2)、SEQ ID NO:2的氨基酸113至121(VL CDR3)、SEQID NO:4的氨基酸50至54(VH CDR1)、SEQ ID NO:4的氨基酸69至85(VHCDR2)和/或SEQ ID NO:4的氨基酸118至125(VH CDR3)，其中SEQ ID NO:2和4是美国专利申请公布号US 2007/0253951A1中所提及的那些。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体不是如美国专利申请公布号US2007/0253951A1中所描述的抗体SR-1的抗体。
在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不是选自以下的抗体：如在美国专利号6,989,248或美国专利号7,449,309中所描述的抗体抗S100、ACK2和ACK4。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体不是选自该组的抗体的人或人源化形式。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不是包含选自以下的抗体的一个或多个CDR(例如，3个VL CDR和/或3个VH CDR)的抗体：如在美国专利号6,989,248或美国专利号7,449,309中所描述的抗体抗S100、ACK2和ACK4。
在某些方面，竞争结合测定可以用于辅助鉴定抗体的靶表位或者确定当两种抗体在竞争性结合测定法(例如竞争性ELISA测定法)中识别完全相同的或空间上重叠的表位时，抗体是否被作为参考抗体的另一抗体(例如基本上结合同一表位或重叠表位的抗体)例如以剂量依赖性方式竞争性阻断，该测定可以使用经标记的抗原或经标记的抗体加以配置而呈许多不同的格式。已知许多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心(sandwich)竞争测定(参见Stahli等人,(1983)Methods in Enzymology 9:242)；固相直接生物素—抗生物素(biotin-avidin)EIA(参见Kirkland等人,(1986)J.Immunol.137:3614)；固相直接标记的测定、固相直接标记的夹心测定(参见Harlow和Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人,(1988)Mol.Immunol.25(1):7)；固相直接生物素—抗生物素EIA(Cheung等人,(1990)Virology 176:546)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等人,(1990)Scand J.Immunol.32:77)。典型地，这样的测定涉及使用与携带这些未标记的试验免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中任一个的固体表面或细胞结合的经纯化的抗原(例如，KIT，例如KIT的细胞外域或KIT的D4区)。可通过测定在试验免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。试验免疫球蛋白通常过量存在。在某些方面，当竞争性抗体过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合，抑制程度为至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％以上。在该测定的一个普通形式中，将抗原固定在96孔板上。然后使用放射性标记或酶标记来测量未标记的抗体阻断标记的抗体与抗原结合的能力。有关更多细节，参见例如Wagener等人,J.Immunol.,1983,130:2308-2315；Wagener等人,J Immunol Methods,1984,68:269-274；Kuroki等人,Cancer Res.,1990,50:4872-4879；Kuroki等人,Immunol.Invest.,1992,21:523-538；Kuroki等人,Hybridoma,1992,11:391-407,和UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Harlow和David Lane编辑编(Cold SpringsHarbor Laboratory Press,Cold Springs Harbor,N.Y.,1999),第386-389页。
在某些方面，免疫特异性结合于KIT多肽(例如人KIT多肽)的D4区的本文描述的抗体可以通过其VL链区(例如，SEQ ID NO:7-10中的任何一个)或VH链区(例如，SEQ ID NO:2-6中的任何一个)或者通过其3个VL CDR或其3个VH CDR来描述。参见例如，Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:8910-8915，所述文献以全文引用的方式并入本文中，该文献描述了通过分别自人轻链或重链文库中鉴定互补轻链或重链来人源化小鼠抗αvβ3抗体，从而导致产生具有与原始抗体的亲和力同样高或比原始抗体的亲和力更高的亲和力的人源化抗体变异体。也参见Clackson等人,1991,Nature,352:624-628，所述文献以全文引用的方式并入本文中，描述了通过使用特异性VL(或VH)域并且筛选文库中的互补可变域来产生结合特异性抗原的抗体的方法。该筛选针对特异性VH域产生了14种新的配偶体(partners)且针对特异性VL域产生了13种新的配偶体，通过ELISA测定，它们都是强结合子。
因此，在某些方面，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如人KIT多肽)的D4区的抗体，该抗体包含VL域，该VL域包含SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列。在有些实施方式中，本文提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如人KIT多肽)的D4区的抗体，该抗体包含VH域，该VH域包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列。
在某些方面，本文描述的抗体的CDR根据Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196:901-917中所描述的方法来确定，在本文中将其称为“ChothiaCDR”(也参见例如，美国专利第7,709,226号)。采用对VH链区和VL链区中的氨基酸残基编号的Kabat编号系统，抗体重链分子内的Chothia CDR典型地存在于氨基酸位置26至32(“CDR1”)、氨基酸位置53至55(“CDR2”)和氨基酸位置96至101(“CDR3”)处。采用对VH链区和VL链区中的氨基酸残基编号的Kabat编号系统，抗体轻链分子内的Chothia CDR典型地存在于氨基酸位置26至33(CDR1)、氨基酸位置50至52(CDR2)和氨基酸位置91至96(CDR3)处。
在一个具体的实施方式中，沿着本文描述的抗体的VH和/或VL区的CDR的位置可以改变一、二、三或四个氨基酸位置，只要对KIT(例如，人KIT的D4区)的免疫特异性结合被维持(例如，实质上维持，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。例如，在一个实施方式中，限定本文描述的抗体的CDR的位置可以通过将CDR的N-末端和/或C-末端边界相对于图3A-3I中所描绘的CDR位置位移一、二、三或四个氨基酸而改变，只要对KIT(例如，D4区)的免疫特异性结合被维持(例如，实质上维持，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)即可。
在具体的方面，本文提供的是包含抗体轻链和重链(例如独立的轻链和重链)的抗体。关于轻链，在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的轻链是κ轻链。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的轻链是λ轻链。在又一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的轻链是人κ轻链或人λ轻链。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，包含KIT(例如人KIT)的D4区(例如，SEQ ID NO:15)的KIT多肽)的本文描述的抗体包含这样的轻链：其中该VL链区的氨基酸序列包含本文描述的任何氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:7、8、9或10)，和其中该轻链的恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。人轻链恒定区序列的非限制性实例在本领域已有描述，例如参见美国专利第5,693,780号和Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公布号91-3242。
关于重链，在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体的重链可以为α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)、γ(gamma)或μ(mu)重链。在另一个具体的实施方式中，所描述的抗体的重链可包含人α、δ、ε、γ或μ重链。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT多肽，包含包含KIT(例如人KIT)的D4区(例如，SEQ ID NO:15)的KIT多肽)的本文描述的抗体包含这样的重链：其中该VH链区的氨基酸序列可包含本文描述的任何氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:2-6中的任何一个)，和其中该重链的恒定区包含人γ重链恒定区的氨基酸序列。人重链恒定区序列的非限制性实例在本领域已有描述，例如参见美国专利第5,693,780号和Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公布号91-3242。
在一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)的本文描述的抗体包含VL链区和VH链区，该VL链区和VH链区包含本文描述的任何氨基酸序列，和其中该恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子或人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)的本文描述的抗体包含VL链区和VH链区，该VL链区和VH链区包含本文描述的任何氨基酸序列，和其中该恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述恒定区包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。
在又一个具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)的本文描述的抗体包含VL链区和VH链区，该VL链区和VH链区包含本文描述的任何氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:2-6中的任何一个和/或SEQ ID NO:7-10中的任何一个)，和其中该恒定区包含人IgG1或人IgG4的恒定区的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)的本文描述的抗体包含VL链区和VH链区，该VL链区和VH链区包含本文描述的任何氨基酸序列，和其中该恒定区包含人IgG1的恒定区的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT多肽，例如KIT(例如人KIT)的D4区，例如SEQ ID NO:15)的本文描述的抗体包含构架区(例如，VL域和/或VH域的构架区)，该构架区是人构架区或来源于人构架区。人构架区的非限制性实例在本领域有描述，例如参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公布号91-3242)。在某一个实施方式中，本文描述的抗体包含构架区(例如，VL域和/或VH域的构架区)，该构架区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)构架区或来源于灵长类动物(例如，非人灵长类动物)构架区。
在某些实例中，本文描述的抗体包含构架区(例如，VL域和/或VH域的构架区)，该构架区不是灵长类动物(例如，非人灵长类动物，例如猿，例如旧世界猿(Old World ape))构架区或不来源于灵长类动物(例如，非人灵长类动物)构架区。
在某些实例中，关于本文描述的这些抗体中的任何一个，该VL链区不包含非人灵长类动物(例如猿，例如旧世界猿)构架区或不来源于非人灵长类动物(例如猿，例如旧世界猿)构架区。在某些其它的实施方式中，所述VH链区不包含非人灵长类动物(例如猿，例如旧世界猿)构架区或不来源于非人灵长类动物(例如猿，例如旧世界猿)构架区。
非人灵长类动物构架区的非限制性实例包括来自旧世界猿(Old Worldapes)，例如黑猩猩(Pan troglodytes)、倭黑猩猩(Pan paniscus)或金刚猩猩(Gorilla gorilla)；非洲大猩猩(chimpanzee Pan troglodytes)；旧世界猴(OldWorld monkey)，例如来自猕猴属(Macaca)的旧世界猴；和食蟹猴(cynomolgus monkey)食蟹猕猴(Macaca cynomolgus)的那些。非人灵长类动物构架序列的非限制性实例在美国专利申请公布号US 2005/0208625中有描述。
在某些方面，本文还提供的是免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)的抗体，其包含一个或多个氨基酸残基取代，例如在VL链区或VH链区(例如，CDR或FR)中。在具体的实施方式中，没有氨基酸残基取代位于CDR内。在具体的实施方式中，所有氨基酸取代都在FR中(参见例如，表5A-6B)。在某一个实施方式中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。
如本文所用的，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基置换的取代。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族在本领域已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在特定的实施方式中，本文描述的抗体的糖基化是修饰的。例如，可以制备无糖基化抗体(即，该抗体缺乏糖基化)，或者可以制备在一个或多个糖基化位点包含突变或取代以消除在一个或多个糖基化位点处的糖基化的抗体。糖基化可以被改变以例如增加抗体对靶抗原(例如人KIT，例如人KIT的D4区)的亲和力。这样的碳水化合物修饰可通过如下方法完成：例如，改变该抗体序列内糖基化的一个或多个位点。例如，可以制备一个或多个氨基酸取代，从而导致一个或多个可变区(例如，VL和/或VH CDR或VL和/或VH FR)糖基化位点被消除，致使消除在该位点处的糖基化。这样的糖基化可增加抗体对抗原(例如人KIT，例如人KIT的D4区)的亲和力。这样的方法在美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中有更进一步的详细描述。
糖基化可经由N联(或天冬酰胺联)糖基化或O联糖基化发生。N联糖基化涉及多肽中天冬酰胺氨基酸的侧链NH2基团上的碳水化合物修饰。O联糖基化涉及丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸氨基酸的侧链上的羟基基团的碳水化合物修饰。
在具体的实施方式中，在本文描述的抗体的VH区(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5或6)或VL区(例如，SEQ ID NO:7、8、9或10)内的天冬酰胺(N)残基被丝氨酸(S)或另一氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)取代。在其它具体的实施方式中，在包含本文描述的抗体的VH CDR(例如VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18的序列)和/或VL CDR(例如，VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3，分别包含SEQ ID NO:19-21的序列)内的天冬酰胺(N)残基被丝氨酸(S)或另一氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)取代。在其它具体的实施方式中，在本文描述的抗体的VHFR(例如，如表5A、5C和6B中所阐述的VH FR1、VH FR2、VH FR3和/或VH FR4)和/或VL FR(例如，如表5B、5D和6A中所阐述的VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4)内的天冬酰胺(N)残基被丝氨酸(S)或另一氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)取代。
在某些实施方式中，无糖基化抗体可以在缺乏必需糖基化机器的细菌细胞中产生。具有改变的糖基化机器的细胞在本领域已有描述并且可以用作表达本文描述的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如，Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-1,以及欧洲专利号:EP 1,176,195；PCT公布WO 03/035835；WO 99/54342。
在某些实施方式中，可以对此处描述的抗体的Fc区进行一种或多种修饰，一般能改变该抗体的一种或多种功能性特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗体-依赖性细胞的细胞毒性。这些修饰例如在国际专利申请公布号WO 2008/153926A2中有描述。
在具体的实施方式中，在本文描述的抗体的重链区的恒定区和/或轻链区的恒定区内的天冬酰胺(N)残基被丝氨酸(S)或另一氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)取代。
在具体的实施方式中，在本文描述的抗体的重链区和/或轻链区内的天冬酰胺(N)残基被丝氨酸(S)或另一氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)取代。
本文提供的是免疫特异性结合于KIT抗原并且可调节KIT活性的抗体。在某些实施方式中，本文提供的抗体免疫特异性结合于KIT多肽(例如，人KIT多肽)并且抑制KIT活性。KIT活性可以与本领域已知的或描述的KIT的任何活性有关，例如KIT受体二聚化、KIT受体磷酸化(酪氨酸磷酸化)、KIT受体下游的信号传导(例如，AKT、MAPK/ERK、Ras、Stat1、Stat3或Stat5信号传导)、KIT配体(例如，SCF)诱导的转录调节(例如，SCF诱导的c-Myc的转录活化)、细胞增殖的诱导或增强或细胞存活。KIT活性或KIT功能在文中可互换使用。在某些方面，KIT活性由KIT配体(例如，SCF)与KIT受体结合来诱导。在特定的方面，KIT活性可由功能获得性突变来诱导或增强，这可导致例如二聚化和组成性活性KIT信号传导(参见例如，Mol等人,J.Biol.Chem.,2003,278:31461-31464；Hirota等人,J.Pathology,2001,193:505-510)。这样的功能获得性可允许在不存在KIT配体(例如，SCF)与KIT受体结合时发生KIT受体二聚化和KIT信号传导。在某些实施方式中，KIT活性或信号传导的增加可在不存在KIT配体(例如，SCF)结合KIT受体的情况下发生，这是由于KIT受体的高表达(或过度表达)。KIT在细胞中的高表达或过度表达是指比已知具有正常KIT表达或KIT活性的参考细胞的表达水平或比KIT在已知具有正常KIT表达或KIT活性的细胞或样品群体中的平均KIT表达水平高出至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的表达水平。KIT的表达水平可通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，蛋白质印迹法(Western blotting)或免疫组织化学法)来评估。在特定的实施方式中，比正常KIT活性高的KIT活性可导致细胞转化、赘生物生成(neoplasia)和肿瘤生成。在特定的实施方式中，比正常KIT活性高的KIT活性可导致其它KIT相关紊乱或疾病。
在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不阻断或不抑制KIT配体(例如，SCF)与KIT受体的结合。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体仅仅可忽略不计地(例如，小于约2％或3％)抑制或降低KIT配体(例如，SCF)与KIT受体的结合。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不诱导或不增强KIT配体(例如，SCF)从KIT受体上的解离。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体仅仅可忽略不计地(例如，小于约2％或3％)诱导或增强KIT配体(例如，SCF)从KIT受体上的解离。
在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不阻断或不抑制KIT受体二聚化。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体仅仅可忽略不计地(例如，小于约2％或3％或在误差或偏差的标准以内)抑制或降低KIT受体二聚化。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体不诱导或不增强KIT受体二聚体解离。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体仅仅可忽略不计地(例如，小于约2％或3％或在误差或偏差的标准以内)诱导或增强KIT受体二聚体解离。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能与KIT受体二聚体特异性结合并且不阻断或不抑制KIT受体二聚化。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能与KIT受体单体特异性结合并且不阻断或不抑制KIT受体二聚化。
在某些方面，作为KIT活性的抑制剂，本文描述的抗体能阻断或抑制(例如，部分抑制)KIT的二聚化。一般而言，当KIT配体与KIT结合时，诱导KIT受体二聚化。因此，在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且阻断或抑制(例如，部分抑制)KIT受体的二聚化，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的KIT受体二聚化，阻断或抑制程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，免疫沉淀测定法)所评估。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且部分抑制KIT受体的二聚化，抑制程度为约25％至75％。KIT受体的二聚化被本文描述的抗体的阻断或抑制(例如，部分抑制)可以在存在KIT配体刺激时进行评估。例如，使表达KIT的细胞与KIT配体在存在或不存在本文描述的抗KIT抗体时接触，并且测定KIT受体二聚化的水平。在某些实施方式中，将KIT配体在不存在抗KIT抗体时诱导的KIT受体二聚化与在存在抗KIT抗体时诱导的KIT受体二聚化相比，前者比后者高出至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，免疫沉淀测定法)所评估。KIT的细胞质域中的一个或多个残基的酪氨酸磷酸化可以是KIT受体二聚化的指标。
在某些实施方式中，本文描述的抗体能抑制(例如，部分抑制)KIT活性，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的KIT活性，抑制程度为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的和/或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施方式中，本文描述的抗体能抑制(例如，部分抑制)KIT活性，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的KIT活性，抑制程度为至少约25％至约65％，如通过本文描述的和/或本领域技术人员已知的方法所评估。KIT活性的非限制性实例可包括KIT受体磷酸化、KIT受体信号传导、KIT配体(例如，SCF)介导的细胞增殖、KIT配体(例如，SCF)介导的细胞存活和KIT靶基因(例如，c-Myc)的转录活化。
作为KIT活性的抑制剂，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)能阻断(例如，部分阻断)或抑制(例如，部分抑制)KIT的磷酸化、具体地说是KIT的细胞质域中的一个或多个残基的酪氨酸磷酸化。一般而言，当KIT配体与KIT结合时，诱导KIT受体二聚化和磷酸化。然而，在某些方面，KIT受体二聚化和/或磷酸化与KIT配体结合于KIT受体可以独立地发生。例如KIT受体二聚化和/或磷酸化可以由于KIT的功能获得性突变或过度表达而发生。
可被磷酸化(例如，在配体刺激时)的鼠KIT的细胞质域中的酪氨酸残基的非限制性实例包括544、546、552、567、569、577、608、645、671、674、702、719、728、745、772、821、844、853、868、878、898和934(参见Ueda等人,Blood,2002,99:3342-3349)。可以容易地确定人KIT的细胞质域中的相应酪氨酸残基。可被磷酸化(例如，在配体刺激时)的人KIT(例如，GenBank Accession No.P10721)的细胞质域中的酪氨酸残基的非限制性实例包括残基568、570、703、721、730、747、823、900和936。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能抑制鼠KIT的酪氨酸残基719处的受体磷酸化。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能抑制人KIT的酪氨酸残基703或721处的受体磷酸化。
因此，在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且阻断或抑制KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，阻断或抑制程度为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。在特定的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且阻断或抑制KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，阻断或抑制程度为至少约25％、任选至约65％或75％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。在某些实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且阻断或抑制KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，阻断或抑制程度为至少约25％至约80％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且阻断或抑制KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，其IC50为小于约600pM、或小于约550pM、或小于约500pM、或小于约400pM、或小于约300pM，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如下文第6节中描述的用表达野生型KIT的CHO细胞的磷酸化抑制测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且阻断或抑制KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，其IC50为小于约600pM。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且阻断或抑制KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，其IC50为小于约550pM。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且阻断或抑制KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，其IC50在约100pM至约500pM、约25pM至约550pM、或约40pM至约600pM、或约50pM至约350pM的范围内。例如，可通过在例如下文第6节中所描述的检测酪氨酸磷酸化的ELISA中分析来自重组表达KIT的细胞(例如，CHO细胞)的溶胞物，来测定抑制酪氨酸磷酸化的IC50。在某些实施方式中，重组表达KIT的细胞(例如，CHO细胞)在用于磷酸化抑制测定之前进行分选，例如分选以选出高度表达KIT的细胞。在有些实施方式中，该细胞在用于磷酸化抑制测定之前不进行分选。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且降低KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，降低程度为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且降低KIT的细胞质域中的酪氨酸磷酸化，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，降低程度为至少约25％或35％、任选至约75％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且阻断或抑制KIT的细胞质域中的一个或多个酪氨酸残基的磷酸化，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，阻断或抑制程度为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如免疫印迹测定法)所评估。在具体的实施方式中，KIT的细胞质域的一个或多个酪氨酸残基的磷酸化被本文描述的抗体阻断或抑制(例如，部分抑制)可在KIT配体刺激时进行评估。例如，使表达KIT的细胞与KIT配体在存在或不存在本文描述的抗KIT抗体时接触，并且可以测定KIT的细胞质域中的一个或多个酪氨酸残基的磷酸化水平。在某些实施方式中，KIT配体在不存在抗KIT抗体时诱导的KIT的细胞质域的一个或多个酪氨酸残基的磷酸化与KIT配体在存在抗KIT抗体时诱导的KIT的细胞质域的一个或多个酪氨酸残基的磷酸化相比，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，前者比后者高出至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，免疫印迹测定法)所评估。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体内化，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的内化，诱导或增强程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体内化，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的内化，诱导或增强程度为至少约25％或35％、任选至约75％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体内化，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的内化，诱导或增强程度至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。用于定量或显现细胞表面受体的技术为本领域所熟知的并且包括多种荧光技术和放射性技术。例如，一种方法涉及将该细胞与放射性标记的抗受体抗体一起孵育。或者，可将该受体的天然配体与荧光分子或放射性标记缀合并且与该细胞一起孵育。另外的受体内化测定法为本领域所熟知的并且描述于例如Jimenez等人,Biochemical Pharmacology,1999,57:1125-1131；Bernhagen等人,Nature Medicine,2007,13:587-596；和Conway等人,J.Cell Physiol.,2001,189:341-55。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体更新(turnover)，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的更新，诱导或增强程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，脉冲追踪测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体更新，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的更新，诱导或增强程度为至少约25％或35％、任选至约75％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，脉冲追踪测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体更新，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的更新，诱导或增强至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，脉冲追踪测定法)所评估。用于测定受体更新的方法为本领域所熟知的。例如，可使用35S-EXPRESS蛋白质标记混合物(35S-EXPRESS Protein Labelingmix)(NEG772,NEN Life Science Products)对表达KIT的细胞进行脉冲标记，用未标记培养基洗涤且追踪一段时间，随后使用抗KIT抗体使来自经标记的细胞的蛋白质裂解产物免疫沉淀，且通过SDS-PAGE解析且显现(例如，暴露于PhosphoImager显示屏(Molecular Dynamics)，使用Typhoon8600扫描仪(Amersham)进行扫描，且使用ImageQuant软件(Molecular Dynamics)进行分析)(参见例如，Chan等人,Development,2004,131:5551-5560)。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体降解，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的降解，诱导或增强程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，脉冲追踪测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体降解，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的降解，诱导或增强程度为至少约25％或35％、任选至约75％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，脉冲追踪测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且诱导或增强KIT受体降解，相对于在存在无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)时的降解，诱导或增强程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，脉冲追踪测定法)所评估。用于定量或监测细胞表面受体的泛素化和/或降解(例如，降解的动力学或速率)的技术为本领域所熟知的并且包括各式各样的荧光技术和放射性技术(参见例如，国际专利申请公布号WO 2008/153926A2)。例如，可以进行脉冲追踪实验或使用放射性标记的配体(例如125I-SCF)的实验以定量地测量KIT的降解。
此外，KIT受体磷酸化下游的信号传导事件能充当KIT活性的指标。例如，与其受体KIT结合的KIT配体(例如，SCF)刺激若干截然不同的信号传导途径，包括例如Src家族激酶的成员、磷脂酰肌醇(PI)3-激酶和Ras促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)(参见Munugalavadla等人,Mol.Cell.Biol.,2005,25:6747-6759)。KIT的细胞质域中的磷酸化酪氨酸可以为含有SH2域的蛋白质提供结合位点，其包括但不限于p21Ras–促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的蛋白质、PI 3-激酶的p85亚基、磷脂酶C-γ1、Grb2衔接子蛋白(adaptor protein)、Src家族激酶(SFKs)、Cbl、CRKL、p62Dok-1、SHP1和SHP2(参见Ueda等人,Blood,2002,99:3342-3349)。
因此，在某些方面，用作KIT活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能抑制Src家族激酶的成员、PI 3-激酶或Ras-MAPK的信号传导。在特定的实施方式中，用作KIT活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能抑制一种或多种含有SH2域的蛋白质(例如p21Ras–MAPK途径的蛋白质、PI 3-激酶的p85亚基、磷脂酶C-γ1、Grb2衔接子蛋白、SFK的成员、Cbl、CRKL、p62Dok-1、SHP1和SHP2)与KIT的细胞质域的结合(或抑制其相互作用)。在某些实施方式中，用作KIT活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能抑制一种或多种含有SH2域的蛋白质(例如p21Ras–MAPK途径的蛋白质、PI3-激酶的p85亚基、磷脂酶C-γ1、Grb2衔接子蛋白、SFK的成员、Cbl、CRKL、p62Dok-1、SHP1和SHP2)被KIT活化。
在特定的实施方式中，用作KIT活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能抑制下游信号传导例如MAPK的磷酸化、AKT的磷酸化或Stat1、Stat3或Stat5的磷酸化。因此，在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能抑制或降低MAPK的磷酸化(例如，KIT配体(例如，SCF)诱导的MAPK的磷酸化)，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，抑制或降低程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的蛋白质印迹法或ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能抑制或降低AKT的磷酸化(例如，KIT配体(例如，SCF)诱导的AKT的磷酸化)，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，抑制或降低程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的蛋白质印迹法或ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。在特定的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能抑制或降低Stat3的磷酸化(例如，KIT配体(例如，SCF)诱导的Stat3的磷酸化)，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，抑制或降低程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的蛋白质印迹法或ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。在特定的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能抑制或降低Stat1或Stat5的磷酸化(例如，KIT配体(例如，SCF)诱导的磷酸化)，相对于在无任何抗体或有无关抗体(例如，不免疫特异性结合于KIT的抗体)的情况下在存在KIT配体刺激时的磷酸化，抑制或降低程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的蛋白质印迹法或ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。
在某些方面，能用作KIT活性或活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能抑制表达KIT并且对KIT信号传导应答的细胞(例如，在对KIT配体刺激和KIT信号传导应答时增殖的细胞)(例如，癌细胞，例如TF-1细胞)的细胞增殖。细胞增殖测定在本领域有描述并且可由本领域技术人员容易地进行。例如，可通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)掺入(参见例如，Hoshino等人,1986,Int.J.Cancer 38,369；Campana等人,1988,J.Immunol.Meth.107:79)或(3H)胸苷掺入(参见例如，Blechman等人,Cell,1995,80:103-113；Chen,J.,1996,Oncogene 13:1395-403；Jeoung,J.,1995,J.Biol.Chem.270:1836773)，通过在各种时间间隔(例如，12小时或24小时的间隔)进行直接细胞计数，或通过检测已知基因例如原癌基因(例如，fos、myc)或细胞周期标志物(Rb、cdc2、细胞周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)的转录、翻译或活性变化来分析细胞增殖。这样的蛋白质和mRNA的水平及活性可通过本领域所熟知的任何方法来测定。例如，可通过已知的免疫诊断方法例如ELISA、蛋白质印迹法(Western blotting)或免疫沉淀法使用抗体(包括市售的抗体)来定量蛋白质。可使用本领域所熟知的和常规的方法，例如使用RNA分析(northern analysis)、RNase保护或连同反转录一起的聚合酶链式反应来定量mRNA。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且抑制细胞增殖，抑制程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，BrdU掺入测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且抑制细胞增殖，抑制程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，BrdU掺入测定法)所评估。
在某些方面，能用作KIT活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能降低或抑制表达KIT并且对KIT信号传导应答的细胞(例如，在对KIT配体刺激和KIT信号传导应答时增殖的细胞)的存活。细胞存活分析在本领域有描述并且可由本领域技术人员容易地进行。例如，可通过使用锥虫蓝(trypan-blue)染色或本领域已知的其它细胞死亡或活力标志物来评估细胞活力。在一个具体的实施方式中，测量细胞的ATP水平以确定细胞活力。在具体的实施方式中，采用本领域的测定标准以三天和七天为周期测量细胞活力，例如测量细胞内的ATP水平的CellTiter-Glo测定试剂盒(Promega)。细胞的ATP降低说明有细胞毒性效应。在另一个具体的实施方式中，在中性红摄取测定(neutral red uptake assay)中测量细胞活力。在其它的实施方式中，对形态学变化的肉眼观察可包括增大、颗粒度、具有粗糙边缘的细胞、膜状外观、变圆、自孔表面脱离或其它变化。给予这些变化以下名称：T(100％毒性)、PVH(部分毒性–极严重–80％)、PH(部分毒性–严重–60％)、P(部分毒性–40％)、Ps(部分毒性–轻微–20％)或0(无毒性–0％)，与所见到的细胞毒性程度相符。50％细胞抑制性(细胞毒性)浓度(IC50)通过这些数据的回归分析来确定。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且抑制(例如，部分抑制)细胞(例如，癌细胞)存活，抑制程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，锥虫蓝排除测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且抑制细胞(例如，癌细胞)存活，抑制程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，锥虫蓝测定法)所评估。
在某些方面，能用作KIT活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能够诱导表达KIT及对KIT信号传导应答的细胞(例如，在对KIT配体刺激和KIT信号传导应答时增殖的细胞)(例如癌细胞，例如MO7E细胞)的细胞凋亡(即，程序性细胞死亡)。细胞凋亡在本领域有描述并且可由本领域技术人员容易地进行。例如，可使用流式细胞术来检测经历细胞凋亡的细胞中的活化胱天蛋白酶3(caspase 3)(一种介导细胞凋亡的酶)，或者可使用蛋白质印迹法检测聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的裂解(参见例如，Smolich等人,Blood,2001,97:1413-1421)。PARP的裂解是细胞凋亡的指标。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且诱导或增强细胞凋亡，诱导或增强程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，检测活化胱天蛋白酶3的流式细胞术)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且诱导或增强细胞凋亡，诱导或增强程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，检测活化胱天蛋白酶3的流式细胞术)所评估。
在某些方面，能用作KIT活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能够抑制或减少不依赖锚定的细胞生长(例如，集落形成(colony formation))，由表达KIT并对KIT信号传导应答(例如，在对KIT配体刺激和KIT信号传导应答时增殖的细胞)的细胞(例如，表达外源KIT的H526细胞或CHO细胞)，如通过本领域公知的方法(例如软琼脂测定法)所测定。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且抑制或减少不依赖锚定的细胞生长，抑制或减少程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，软琼脂测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且抑制或减少不依赖锚定的细胞生长，抑制或减少程度为至少约25％或35％、任选至约75％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，软琼脂测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且抑制或减少不依赖锚定的细胞生长，抑制或减少程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，软琼脂测定法)所评估。
适合用于与KIT活性有关的本文描述的测定法的细胞和细胞系是容易获得的(例如，ATCC)或者可使用本领域已知的方法容易地鉴定。例如，内源性地表达KIT或具有KIT信号传导或活性的细胞和/或细胞系为本领域技术人员已知的。在某些实施方式中，适合用于本文描述的测定法的细胞或细胞系能内源性地或重组地表达KIT。在特定的实施方式中，用于细胞增殖测定的细胞或细胞系能内源性地或重组地表达KIT并且在对KIT配体(例如，SCF)刺激应答时增殖或增加增殖。用于细胞活力测定的细胞或细胞系能内源性地或重组地表达KIT并且在对KIT配体(例如，SCF)刺激应答时细胞活力发生变化。用于细胞凋亡测定的细胞或细胞系能内源性地或重组地表达KIT并且在对KIT配体(例如，SCF)刺激应答时细胞凋亡发生变化。
可用于本文描述的方法和测定法的细胞的非限制性实例包括原代细胞、癌细胞、转化的细胞、干细胞、肥大细胞、原始生殖细胞、卵母细胞、精母细胞、胚胎干细胞、造血细胞、红白血病细胞(例如，F36P和TF-1细胞系)、人髓样白血病细胞系，例如MO7E细胞；胃肠道间质瘤细胞系，例如ST-882、GIST-T1、GIST48、GIST48B、GIST430和GIST882；神经母细胞瘤细胞系，例如SK-N-SH、SK-SY5Y、H-EP1、SK-N-BE(2)、SK-N-BE(ZkM17)、SK-N-BE(2)C、LA-N-l或LA-N-1-5s；尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)细胞系，例如TC71、TC32、RD-ES、5838、A4573、EWS-925、NCI-EWS-94和NCI-EWS-95；和小细胞肺癌细胞系，例如H526、ECC12、TMK1、MKN7、GCIY和HGC27。
或者，表达KIT(例如，人KIT)的细胞和细胞系可常规地通过重组产生。可经工程改造重组地表达KIT的细胞的非限制性实例包括COS细胞、HEK293细胞、CHO细胞、成纤维细胞(例如人成纤维细胞)例如NIH3T3细胞和MEFS。在一个具体的实施方式中，用于本文描述的方法中的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞。在一个特定的实施方式中，这些工程改造的细胞外源性地表达全长人KIT(例如，SEQ ID NO:1)。
在某些方面，能用作KIT活性的抑制剂的本文描述的抗KIT抗体能够在小鼠模型研究中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退。例如，可将肿瘤细胞系引入裸小鼠中，且可给予所述小鼠本文描述的抗KIT抗体一次或多次，且可以在以周和/或月为单位的周期内监测注射的肿瘤细胞的肿瘤进展。在有些情况下，将抗KIT抗体给予裸小鼠可在引入肿瘤细胞系之前发生。任何适当的肿瘤细胞系(例如，表达KIT的肿瘤细胞系)可用于本文描述的小鼠异种移植物模型中。用于这些异种移植物小鼠模型中的肿瘤细胞系的非限制性实例包括巨核母细胞(megakaryoblastic)白血病细胞系，例如MO7e；胃肠道间质瘤细胞系，例如ST-882、GIST-T1、GIST430、GIST48、GIST48B和GIST882；人红白血病细胞系，例如HEL和TF-1；人早幼粒细胞性白血病细胞系，HL60；神经母细胞瘤细胞系，例如SK-N-SH、SK-SY5Y、H-EP1、SK-N-BE(2)、SK-N-BE(ZkM17)、SK-N-BE(2)C、LA-N-l或LA-N-1-5s；尤因肉瘤细胞系，例如TC71、TC32、RD-ES、5838、A4573、EWS-925、NCI-EWS-94和NCI-EWS-95；和小细胞肺癌细胞系，例如H526、DMS153、DMS79、ECC12、TMK1、MKN7、GCIY和HGC27。在一个具体的实施方式中，用于异种移植物小鼠模型的肿瘤细胞系是GIST882、GIST430、GIST48、GIST48B、HEL、HL60、H526、DMS153或DMS79细胞系。在某些实施方式中，用于异种移植物肿瘤模型的合适细胞系可以通过在细胞中重组表达KIT来产生。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退，抑制或诱导程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退，抑制或诱导程度为至少约25％或35％、任选至约75％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且在小鼠模型中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退，抑制或诱导程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。确定肿瘤生长抑制或肿瘤消退可通过监测一段时间内的肿瘤尺寸，例如通过物理测量可触知的肿瘤或其它肉眼检测方法来评估。例如，可产生肿瘤细胞系以重组地表达目测剂，例如绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶，然后可通过显微镜术进行GFP的活体内显现，以及通过将萤光素酶底物给予异种移植物小鼠并检测由于萤光素酶加工萤光素酶底物产生的发光，可以实现萤光素酶的活体内显现。在异种移植物小鼠中，GFP或萤光素酶的检测程度或水平与肿瘤的尺寸有关。
在某些方面，本文描述的抗KIT抗体与KIT抗原特异性结合并且在肿瘤异种移植物模型中增加动物的存活率。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且在肿瘤异种移植物模型中增加小鼠的存活率，增加程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)与KIT特异性结合并且在肿瘤异种移植物模型中增加小鼠的存活率，增加程度为至少约25％或35％、任选至约75％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体的实施方式中，本文描述的抗体与KIT特异性结合并且在肿瘤异种移植物模型中增加小鼠的存活率，增加程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法所评估。可通过在肿瘤细胞系注射后，将存活的小鼠数目对时间(例如，天数或周数)绘制的存活率曲线图，求出存活率。
本文提供的是以特定亲和力免疫特异性结合KIT多肽(例如，人KIT多肽，例如KIT(例如，人KIT)的D4区)的抗体。
本文描述的抗体对表位(例如，KIT表位)的“亲和力”为本领域所熟知的术语并且是指抗体与表位结合的程度或强度。亲和力可以采用本领域已知的多种方式来测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD或Kd)、表观平衡解离常数(KD′或Kd′)和IC50(在竞争测定中实现50％抑制所需的量)。应该理解，对于本文描述的目的，亲和力是与表位结合的给定抗体群体的平均亲和力。本文描述的KD′的值(单位为毫克(mg)Ig/mL或mg/mL)表示mgIg/mL血清，尽管可以使用血浆。当抗体亲和力用作本文描述的治疗方法的给药或本文描述的治疗方法的选择基础时，可以在治疗之前和/或期间测量抗体亲和力，且临床医师在评估人患者是否为用于治疗的适当候选者时可使用所获得的值。
在具体的方面，本文提供的是对于KIT抗原、优选人KIT抗原、特别是人KIT的D4/D5区具有高结合亲和力的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)(例如，具有KD为小于250nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、200pM、100pM或50pM的抗体)。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4/D5区)并且具有解离常数(KD)为小于500,000pM(500nM)、小于100,000pM(100nM)、小于50,000pM(50nM)、小于10,000pM(10nM)、小于3,000pM(3nM)、小于2,500pM(2.5nM)、小于2,000pM、小于1,500pM、小于1,000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的测定法(例如，BiacoreTM测定法)(BiacoreTMInternational AB,Uppsala,Sweden)所评估。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4/D5区)并且具有KD在25至100,000pM、25至75,000pM、25至50,000pM、25至40,000pM、25至30,000pM、25至20,000pM、25至10,000pM、25至1,000pM、25至500pM、25至250pM、25至100pM或25至50pM的范围内，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，BiacoreTM测定法，使用KinExA 3000仪器的测定法)所评估。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)，并且具有KD为约100pM至约250nM或在两者之间的任何值，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，BiacoreTM测定法，使用KinExA 3000仪器的测定法)所评估。
在具体的实施方式中，抗KIT抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)，并且具有在50％与抗原结合时浓度为小于3000pM(3nM)、小于2500pM(2.5nM)、小于2000pM、小于1500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的测定(例如，如第6节中描述的固相ELISA)所评估。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)，并且具有浓度在50％与抗原结合时在25至500,000pM(500nM)、25至250,000pM(250nM)、25至100,000pM(100nM)、25至75,000pM(75nM)、25至50,000pM(50nM)、25至40,000pM(40nM)、25至30,000pM(30nM)、25至20,000pM(20nM)、25至10,000pM(10nM)、25至1,000pM(1nM)、25至500pM、25至250pM、25至100pM或25至50pM的范围内，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的固相ELISA)所评估。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)，并且具有浓度在50％与抗原结合时为约1nM至约25nM或在两者之间的任何值，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的固相ELISA)所评估。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)，并且具有浓度在50％与抗原结合时为约50pM至约500pM或在两者之间的任何值，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的固相ELISA)所评估。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体(或其抗原结合片段或其缀合物)免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)，并且具有浓度在50％结合时为约0.5nM、0.25nM、0.1nM、1nM、1.5nM、2nM、2.5nM、3nM、3.5nM、4nM、4.5nM、5nM、5.5nM、6nM、6.5nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、18nM、19nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM或500nM或500nM以下，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的固相ELISA)所评估。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)，并且具有浓度在50％结合时为约100pM至约10nM，如使用本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，ELISA、使用KinExA 3000仪器的测定法或BiacoreTM测定法)所评估。
用于测定抗体与其靶抗原的亲和力的方法是容易地获得的并且在本领域有描述。例如，抗体对其靶抗原的亲和力及结合特性可通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定法)来测定，例如平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如，BiacoreTM分析)和其它方法例如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、免疫沉淀、凝胶电泳和层析法(例如，凝胶过滤)。这些和其它方法可以利用一种或多种待检查组分上的标记和/或采用各种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。在某些实施方式中，标记的使用不是必需的，例如BiacoreTM系统利用表面等离子体共振(SPR)的自然现象实时递送数据，无需使用标记。结合亲和力和结合动力学的详细描述可以在Paul,W.E.编著,Fundamental Immunology,第4版(Lippincott-Raven,Philadelphia 1999)中找到，其着重于抗体-免疫原相互作用。
在某些方面，本文描述的抗体对KIT抗原(例如，人KIT，例如KIT(例如人KIT)的D4区)的亲和力可以使用基于细胞的测定间接地表征。例如，可以使在细胞膜表面表达KIT的细胞与抗KIT抗体接触，且可使用本领域已知的测定法测定KIT下游的细胞活性。例如，在该细胞与抗KIT抗体接触之后，通过免疫印迹法(或蛋白质印迹法)测定KIT的细胞质域的磷酸化；获取并加工细胞的提取物进行免疫印迹法(例如，将细胞的提取物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并且将该凝胶上分离的蛋白质转移到含有特异性结合于KIT的细胞质域中的磷酸化酪氨酸但不结合未磷酸化酪氨酸的抗体的膜(例如，硝基纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF))上。
在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体特异性结合于KIT抗原，例如人KIT，例如KIT(例如人KIT)的D4区，并且在存在或不存在KIT配体SCF时诱导或增强KIT的二聚化和磷酸化。在有些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能抑制或减少KIT配体(例如SCF)与KIT结合(即，抗KIT抗体可以与KIT配体(例如，SCF)竞争与KIT的结合)。在这样的情况下，可以使细胞与抗KIT抗体和KIT配体接触，并且可测定KIT磷酸化的抑制程度作为抗KIT抗体与KIT配体竞争与KIT结合的指示。
抗体包括但不限于单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、包含两条重链和两条轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体(intrabody)、杂缀合(heteroconjugate)抗体、单域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fvs(scFv)(例如，包括单特异性的、双特异性的，等等)、骆驼化(camelized)抗体、亲和抗体(affybody)、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如抗抗Id抗体)和任何上述抗体的表位-结合片段。在某些实施方式中，本文描述的抗体是指多克隆抗体群体。抗体可以属于免疫球蛋白分子的任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)。在某些实施方式中，本文描述的抗体是IgG抗体或其类(例如人IgG1或IgG4)或亚类。在具体的实施方式中，单克隆抗体是由单一杂交瘤或其它细胞产生的抗体，其中该抗体免疫特异性结合于人KIT表位的D4区，如例如通过ELISA或在本领域或在本文提供的实施例中已知的其它抗原-结合测定法或竞争性结合测定法所测定。术语“单克隆的”并不限于用于制备该抗体的任何特定方法。
在一个特定的实施方式中，本文提供的抗体是免疫特异性结合于KIT多肽(例如KIT的D4区)的Fab片段。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体是单克隆抗体或分离的单克隆抗体。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体是人源化单克隆抗体。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体是重组抗体，例如重组人抗体、重组人源化抗体或重组单克隆抗体。在某些实施方式中，本文描述的抗体含有非人氨基酸序列，例如非人CDR或非人(例如，非人灵长类动物)构架残基。
在本文提供的特定实施方式中，重组抗体可以通过重组手段进行分离、制备、表达或产生，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合抗体文库中分离的抗体或通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体，该其它方式涉及创建，例如经由合成、基因工程改造编码人免疫球蛋白序列的DNA序列或剪接编码人免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白基因序列)的序列成为其它这样的序列。在某些实施方式中，这样的重组抗体的氨基酸序列已经过修饰使得这样的抗体(例如，VH和/或VL区)的氨基酸序列是在生物体的体内抗体种系谱系(repertoire)(例如鼠或人种系谱系)内不是天然存在的序列。在一个特定的实施方式中，重组抗体可通过将生物体(例如，灵长类动物，例如人)中天然存在的若干序列片段组装成为重组抗体的复合序列来获得，其中所述复合序列不天然地存在于生物体(例如，灵长类动物例如人)中。
本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子的任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。在一个具体的实施方式中，本文提供的抗体是IgG抗体(例如人IgG抗体)或其类(例如人IgG1或IgG4)或亚类。在另一个具体的实施方式中，本文描述的抗体是IgG1(例如人IgG1(同种型a、z或f))或IgG4抗体。在某些实施方式中，本文描述的抗体是整个或完整抗体，例如整个或完整人源化、人或复合人抗体。
本文提供的抗体可包括保留与抗原(例如，KIT表位(例如，在含有人KIT的D4区的KIT多肽内的KIT表位))特异性结合的能力的抗体片段。在一个具体的实施方式中，片段包括Fab片段(含有抗原-结合域并且包含轻链和部分重链(即，重链的VH和CH1域)(通过二硫键桥连)的抗体片段)；Fab'(含有单抗原-结合域(包含Fab)和额外的部分重链(通过铰链区连接)的抗体片段)；F(ab′)2(通过重链的铰链区中的链间二硫键连接的两个Fab′分子；该Fab'分子可以针对相同或不同表位)；双特异性Fab(具有两个抗原结合域的Fab分子，它们各自可以针对不同表位)；包含可变区的单链Fab链，也称为sFv(通过10-25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单条轻链和重链的可变、抗原-结合决定区)；二硫键连接的Fv或dsFv(通过二硫键连接在一起的抗体的单条轻链和重链的可变、抗原-结合决定区)；骆驼化VH(抗体的单条重链的可变、抗原-结合决定区，其中在VH界面的一些氨基酸是在天然存在的骆驼抗体的重链中发现的那些)；双特异性sFv(具有两个抗原-结合域的sFv或dsFv分子，它们各自可以针对不同表位)；双抗体(diabody)(当第一sFv的VH域与第二sFv的VL域组装在一起及第一sFv的VL域与第二sFv的VH域组装在一起时所形成的二聚化sFv；双抗体的两个抗原-结合区可以针对相同或不同表位)；和三抗体(triabody)(三聚化sFv，以类似于双抗体的方式形成，但是其中产生三个抗原-结合域呈单一复合物；这三个抗原结合域可以针对相同或不同表位)。本文提供的抗体也可以包括抗体的一个或多个CDR序列。当存在两个或两个以上CDR序列时，CDR序列可以在骨架(scaffold)上连接在一起。在某些实施方式中，抗体包含单链Fv(“scFv”)。scFvs是包含抗体的VH域和VL域的抗体片段，其中这些域以单一多肽链存在。一般而言，scFv多肽还包含在VH域和VL域之间的多肽接头，使得scFv形成期望的结构用于抗原结合。关于scFvs的综述，参见Pluckthun,载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。虽然不受任何特定理论的束缚，但是Fv分子因为它们的小尺寸而能够穿透组织。完整抗体可被胃蛋白酶进行酶法切割产生F(ab′)2片段，或者被木瓜蛋白酶进行酶法切割产生两个Fab片段。
在某些实施方式中，本文描述的抗体是人单克隆抗体、复合人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体是工程改造的抗体，例如通过重组方法产生的抗体。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体是包含一个或多个非人(例如，啮齿动物或鼠)CDR和一个或多个人构架区(FR)和任选的人重链恒定区和/或轻链恒定区的人源化抗体。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体包含一个或多个灵长类动物(或非人灵长类动物)构架区。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体不包含非人灵长类动物构架区。
本文提供的抗体可包括包含化学修饰的抗体，例如经过化学修饰的抗体，例如将分子的任何型共价连接成所述抗体。例如但并不作为限制，抗KIT抗体可经糖基化、乙酰基化、聚乙二醇化(pegylated)、磷酸化或酰胺化，可经由保护/封闭基团衍生化，或者可以还包含细胞配体或其它蛋白质或肽等。例如，本文提供的抗体可以例如通过糖基化、乙酰基化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白酶水解性裂解、连接到细胞配体或其它蛋白质等而经化学修饰。此外，本文描述的抗KIT抗体可含有一个或多个非经典氨基酸。
在一个特定的实施方式中，本文提供的是已经以适合大规模制造的方式(例如，Lonza的制造平台(Basel,Switzerland))修饰的抗KIT抗体。例如，技术平台(Boehringer Ingleheim,Germany)可用于使本文描述的抗KIT抗体适应在重组哺乳动物细胞表达系统中的合适大规模制造。这样的适应性改变可包括将编码抗KIT抗体的必需域(例如一个或多个CDR或FR)的多核苷酸序列克隆到也含有编码合适的恒定区的多核苷酸序列的合适表达载体中，使得产生完整抗体。由表达载体提供的多核苷酸序列是可以优化以使细胞培养生产条件和纯化过程的抗体收率和稳定性最大化的核苷酸序列。
5.1.1.缀合物
在有些实施方式中，本文提供的是与诊断剂、可检测剂或治疗剂或任何其它分子缀合或重组融合的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其抗原结合片。该缀合或重组融合的抗体可用于例如监测或预后KIT相关紊乱或疾病的发作、发展、进展和/或严重程度，例如作为临床试验程序的一部分，例如确定特殊疗法的功效。该缀合或重组融合的抗体可用于例如治疗或处理KIT相关紊乱(例如，癌症)或治疗或处理KIT相关紊乱(例如，癌症)的效应。本文描述的抗体也可以与可影响该抗体的一种或多种生物学和/或分子特性(例如，稳定性(例如，在血清中)、半衰期、溶解度和抗原性)的分子(例如，聚乙二醇)缀合。
在一个特定的方面，本文提供的是包含与本文描述的抗体(或其抗原结合片段)连接的药剂(例如，治疗剂)的缀合物，所述抗体与人KIT的D4区(例如，SEQ ID NO:15)免疫特异性结合。在一个具体的实施方式中，缀合的抗体特异性结合KIT(例如人KIT)的D4区，并且包含包含表1或表2或表3中所阐述的CDR的抗体。在一个具体的实施方式中，缀合的抗体特异性结合KIT(例如人KIT)的D4区并且包含VL链区(该VL链区包含分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)和/或VH链区(该VH链区包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)。在一个具体的实施方式中，缀合的抗体特异性结合KIT(例如人KIT)的D4区，并且包含抗体Hum1-Hum20中的任何一个。在一个具体的实施方式中，本文提供的缀合的抗体特异性结合KIT(例如人KIT)的D4区，并且包含抗体，该抗体包含包含选自表1或表2或表3的CDR的VL和/或VH，和包含选自表5A-5D的sFR。在一个具体的实施方式中，本文提供的缀合的抗体特异性结合KIT(例如人KIT)的D4区，并且包含抗体，该抗体包含包含SEQ ID NO:12的VL和/或包含SEQ ID NO:11的VH。在一个实施方式中，缀合的抗体是以例如EC50为约200pM或约200pM以下的亲和力结合人KIT的D4区的抗体。在另一个实施方式中，缀合的抗体是抑制KIT的生物活性的抗体。在具体的实施方式中，缀合物包含本文描述的抗体和分子(例如，治疗部分或药物部分)，其中抗体与分子直接连接或者经由一个或多个接头连接。在某些实施方式中，抗体与分子共价缀合。在一个特定的实施方式中，抗体与分子非共价缀合。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(例如，与药剂缀合的抗体)与野生型人KIT结合。在某些实施方式中，本文描述的抗体(例如，与药剂缀合的抗体)与包含突变(例如与癌症(例如，GIST)相关的体细胞突变，例如人KIT的外显子9中的突变，其中位置502和503上的Ala和Tyr残基重复出现)的人KIT的细胞外域结合。
这样的诊断和检测可以如下完成：例如，通过所述抗体与可检测分子或物质偶联，所述分子或物质包括但不限于各种酶，例如但不限于辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰基胆碱酯酶；辅基基团，例如但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性材料，例如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Sn；和使用各种正电子发射体层摄影术的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
提供的是与治疗部分(或一个或多个治疗部分)缀合或重组融合的本文描述的抗体或其抗原结合片段及该抗体的用途。该抗体可以与治疗部分缀合或重组融合，所述治疗部分例如细胞毒素，例如抑细胞剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，例如α-发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。治疗部分包括但不限于阿瑞他汀(auristatin)或其衍生物，例如一甲基阿瑞他汀E(MMAE)、一甲基阿瑞他汀F(MMAF)、阿瑞他汀PYE和阿瑞他汀E(AE)(参见例如，美国专利号7,662,387和美国专利申请公布号2008/0300192和2008/0025989，所述各文献以引用的方式并入本文中)；微管破坏剂，例如美登素(maytansine)或其衍生物，例如类美登素(maytansinoid)DM1(参见例如，美国专利号7,851,432、7,575,748,和5,416,064，所述各文献以引用的方式并入本文中)；前药，例如CC-1065(雷查霉素(rachelmycin))类似物的前药；抗代谢药(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、达卡巴嗪(decarbazine))；烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺二氯二胺络铂(cisdichlorodiamine platinum)(II)(DDP)和顺铂(cisplatin))；结合小沟的烷化剂；蒽环类(anthracyclines)(例如，柔红霉毒(daunorubicin)(旧称道诺霉素(daunomycin))和多柔比星(doxorubicin))；抗生素(例如，放线菌素D(dactinomycin)(旧称放射菌素(actinomycin))、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin)(AMC))；阿瑞他汀分子(例如，阿瑞他汀PHE、苔藓虫素1(bryostatin 1)和索拉他汀10(solastatin 10)；参见Woyke等人,Antimicrob.Agents Chemother.46:3802-8(2002),Woyke等人,Antimicrob.Agents Chemother.45:3580-4(2001),Mohammad等人,Anticancer Drugs 12:735-40(2001),Wall等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.266:76-80(1999),Mohammad等人,Int.J.Oncol.15:367-72(1999)，所有文献以引用的方式并入本文中)；激素类(例如，糖皮质激素类、孕激素类、雄激素类和雌激素类)、DNA-修复酶抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide)或托泊替康(topotecan))；激酶抑制剂(例如，化合物ST1571、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(Kantarjian等人,Clin Cancer Res.8(7):2167-76(2002))；细胞毒性剂(例如，紫杉醇(paclitaxel)、细胞松驰素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放射菌素D(actinomycin D)、1-脱氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素类、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同源物和以下文献公开的那些化合物：美国专利号6,245,759、6,399,633、6,383,790、6,335,156、6,271,242、6,242,196、6,218,410、6,218,372、6,057,300、6,034,053、5,985,877、5,958,769、5,925,376、5,922,844、5,911,995、5,872,223、5,863,904、5,840,745、5,728,868、5,648,239、5,587,459，所述各文献中关于这样的化合物的公开内容以引用的方式并入本文中)；法尼基转移酶抑制剂(例如，R115777、BMS-214662和由例如以下美国专利号所公开的那些：6,458,935、6,451,812、6,440,974、6,436,960、6,432,959、6,420,387、6,414,145、6,410,541、6,410,539、6,403,581、6,399,615、6,387,905、6,372,747、6,369,034、6,362,188、6,342,765、6,342,487、6,300,501、6,268,363、6,265,422、6,248,756、6,239,140、6,232,338、6,228,865、6,228,856、6,225,322、6,218,406、6,211,193、6,187,786、6,169,096、6,159,984、6,143,766、6,133,303、6,127,366、6,124,465、6,124,295、6,103,723、6,093,737、6,090,948、6,080,870、6,077,853、6,071,935、6,066,738、6,063,930、6,054,466、6,051,582、6,051,574和6,040,305，所述各专利中关于这样的抑制剂的公开内容以引用的方式并入本文中)；拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱(camptothecin)；依立替康(irinotecan)；SN-38；托泊替康(topotecan)；9-氨基喜树碱；GG-211(GI 147211)；DX-8951f；IST-622；卢比替康(rubitecan)；吡唑并吖啶(pyrazoloacridine)；XR-5000；saintopin；UCE6；UCE1022；TAN-1518A；TAN 1518B；KT6006；KT6528；ED-110；NB-506；ED-110；NB-506；和若贝霉素(rebeccamycin))；bulgarein；DNA小沟结合剂，例如Hoescht染料33342和Hoechst染料33258；两面针碱(nitidine)；花椒路宁(fagaronine)；表小檗碱(epiberberine)；康尼碱(coralyne)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；BC-4-1；双膦酸盐(bisphosphonates)(例如，阿仑膦酸盐(alendronate)、西马膦酸盐(cimadronte)、氯膦酸盐(clodronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)、依替膦酸盐(etidronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、奈立膦酸盐(neridronate)、奥帕膦酸盐(olpandronate)、利塞膦酸盐(risedronate)、吡膦酸盐(piridronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、唑来膦酸盐(zolendronate))HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、他汀(statin)、西立伐他汀(cerivastatin)、来适可(lescol)、立普妥(lupitor)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)和阿托伐他汀(atorvastatin))；反义寡核苷酸(例如，在美国专利号6,277,832、5,998,596、5,885,834、5,734,033,和5,618,709中公开的那些，所述各专利中关于这样的寡核苷酸的内容以引用的方式并入本文中)；腺苷脱氨酶抑制剂(例如，磷酸氟达拉滨(Fludarabine phosphate)和2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine))；替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)托西莫单抗(tositumomab))及其药学上可接受的盐、溶剂化物、笼形包合物(clathrates)和前药。在一个实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是以小于约200pM的亲和力结合人KIT的D4区的抗体。在另一个实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是抑制KIT的生物活性的抗体。在一个具体的实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是包含表1(例如，分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，和/或包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH链区)或表2或表3中所阐述的CDR的抗体。在一个具体的实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是包含以下各物的抗体：包含SEQ ID NO:7、8、9、10或12或表5B和表5D中所阐述的序列的VL，和/或包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6或11或表5A和表5C中所阐述的序列的VH。
在特定的实施方式中，治疗部分或药物部分是抗微管蛋白药物，例如阿瑞他汀或其衍生物。阿瑞他汀的非限制性实例包括一甲基阿瑞他汀E(MMAE)、一甲基阿瑞他汀F(MMAF)、阿瑞他汀PYE和阿瑞他汀E(AE)(参见例如，美国专利号7,662,387和美国专利申请公布号2008/0300192和2008/0025989，所述各文献以引用的方式并入本文中)。在某些实施方式中，治疗部分或药物部分是微管破坏剂，例如美登素或其衍生物，例如类美登素(maytansinoid)DM1或DM4(参见例如，美国专利号7,851,432、7,575,748,和5,416,064，所述各文献以引用的方式并入本文中)。在某些实施方式中，治疗部分或药物部分是前药，例如CC-1065(雷查霉素(rachelmycin))类似物的前药(参见例如，美国专利申请公布号2008/0279868和PCT国际专利申请公布号WO 2009/017394、WO 2010/062171和WO 2007/089149，所述各文献以引用的方式并入本文中)。在一个实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是以小于约200pM的亲和力结合人KIT的D4区的抗体。在另一个实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是抑制KIT的生物活性的抗体。在一个具体的实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)是包含表1(例如，分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和/或包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH链区)或表2或表3中所阐述的CDR的抗体。在一个具体的实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)是包含以下各物的抗体：包含SEQ ID NO:7、8、9、10或12或表5B和表5D中所阐述的序列的VL和/或包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6或11或表5A和表5C中所阐述的序列的VH。
在一个具体的实施方式中，所述抗体和治疗/药物剂经由一个或多个接头(linker)缀合。在另一个具体的实施方式中，所述抗体和治疗/药物剂直接缀合。
在具体的实施方式中，用于与本文描述的抗体缀合的治疗部分或药物部分的非限制性实例包括卡奇霉素(calicheamicins)(例如，LL-E33288络合物，例如γ-卡奇霉素，参见例如美国专利号4,970,198)及其衍生物(例如γ卡奇霉素酰肼衍生物)、奥佐米星(ozogamicins)、度卡霉素(duocarmycins)及其衍生物(例如，CC-1065(NSC 298223)或度卡霉素的非手性类似物(例如AS-1-145或森坦霉素(centanamycin)))、紫杉烷类(taxanes)及其衍生物和烯二炔类(enediynes)及其衍生物(参见例如，PCT国际专利申请公布号WO2009/017394、WO 2010/062171、WO 2007/089149、WO 2011/021146、WO 2008/150261、WO 2006/031653、WO 2005/089809、WO 2005/089807和WO 2005/089808，所述各文献以全文引用的方式并入本文中)。在一个具体的实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是包含表1中所阐述的CDR(例如，分别具有SEQ ID NO:20、21和22的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3，和/或包含分别具有SEQ ID NO:23、24和25的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH链区)的抗体。在一个具体的实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是包含以下各物的抗体：包含SEQ ID NO:7、8、9、10或12或表5B和表5D中所阐述的序列的VL，和/或包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6或11或表5A和表5C中所阐述的序列的VH。在一个具体的实施方式中，所述抗体和治疗剂经由一个或多个接头缀合。在另一个具体的实施方式中，所述抗体和治疗剂直接缀合。
适合与本文描述的抗体缀合的卡奇霉素的非限制性实例公开于例如美国专利号4,671,958；5,053,394；5,037,651；5,079,233；和5,108,912；和PCT国际专利申请公布号WO 2011/021146、WO 2008/150261、WO 2006/031653、WO 2005/089809、WO 2005/089807和WO 2005/089808；各文献中关于这样的卡奇霉素的公开内容以引用的方式并入本文中。在特定的实施方式中，这些化合物可含有甲基三硫化物，该甲基三硫化物与适当的硫醇反应生成二硫化物，并且同时引入官能团例如酰肼或其它可用于使卡奇霉素与本文描述的抗体缀合的官能团。在某些实施方式中，通过添加二甲基取代基来稳定卡奇霉素缀合物中存在的二硫键可产生经改良的抗体/药物缀合物。在具体的实施方式中，所述卡奇霉素衍生物是N-乙酰基γ卡奇霉素二甲基酰肼或NAc-γDMH(CL-184,538)，作为一种优化的衍生物用于缀合。可与本文描述的抗体缀合的卡奇霉素的二硫化物类似物例如在美国专利第5,606,040和5,770,710号中有描述，所述各文献中关于这样的化合物的公开内容以引用的方式并入本文中。在某一个实施方式中，部分(例如，卡奇霉素或其衍生物)通过接头与抗体缀合。在一个特定的实施方式中，部分(例如，卡奇霉素或其衍生物)从抗体-药物缀合物中在接头处水解而来。在一个实施方式中，部分(例如，卡奇霉素或其衍生物)在接头处大约在pH 3.0和pH 4.0之间在20-50℃、优选37℃的温度下从抗体缀合物中水解1-24小时而来。
在具体的实施方式中，用于与本文描述的抗体缀合的治疗部分或药物部分的非限制性实例包括吡咯并苯并二吖庚因(PBDs)及其衍生物，例如PBD二聚体(例如，SJG-136或SG2000)、C2-不饱和PBD二聚体、携带C2芳基取代的吡咯并苯并二吖庚因二聚体(例如，SG2285)、由水解活化的PBD二聚体前药(例如，SG2285)和聚吡咯-PBD(例如，SG2274)(参见例如，PCT国际专利申请公布号WO 2000/012507、WO 2007/039752、WO 2005/110423、WO 2005/085251和WO 2005/040170和美国专利号7,612,062，所述各文献中关于这样的化合物的公开内容以引用的方式并入本文中)。在一个具体的实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是包含表1(例如，分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，和/或包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH链区)或表2或表3中所阐述的CDR的抗体。在一个具体的实施方式中，与这样的治疗/药物部分缀合的抗体是包含以下各物的抗体：包含SEQ ID NO:7、8、9、10或12或表5B和表5D中所阐述的序列的VL，和/或包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6或11或表5A和表5C中所阐述的序列的VH。在一个具体的实施方式中，所述抗体和治疗剂经由一个或多个接头缀合。
此外，本文描述的抗体可以与改变给定生物应答的治疗部分或药物部分缀合或重组融合。治疗部分或药物部分不得解释为局限于经典化学治疗剂。例如，该药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这样的蛋白质可包括例如毒素，例如相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂(apoptotic agent)，例如TNF-γ、TNF-γ、AIM I(参见国际公布号WO 97/33899)、AIM II(参见国际公布号WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等人,1994,J.Immunol.,6:1567-1574)和VEGF(参见国际公布号WO99/23105)、抗血管生成剂，例如血管生长抑素(angiostatin)、内皮生长抑素(endostatin)或凝固途径的组分(例如，组织因子)；或生物应答调节剂(modifier)，例如淋巴因子(例如，干扰素γ、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-5(“IL-5”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-7(“IL-7”)、白介素9(“IL-9”)、白介素-10(“IL-10”)、白介素-12(“IL-12”)、白介素-15(“IL-15”)、白介素-23(“IL-23”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))或生长因子(例如，生长激素(“GH”))或凝固剂(coagulation agent)(例如，钙、维生素K、组织因子，例如但不限于哈格曼因子(Hageman factor)(因子XII)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶(prekallikrein)(PK)、凝固蛋白因子II(凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、XI、XIa、IX、IXa、X、磷脂和血纤蛋白单体)。
本文提供的是与异源蛋白或多肽(或其片段，优选与约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个氨基酸的多肽)重组融合或化学缀合(共价或非共价缀合)以产生融合蛋白的抗体。具体地说，本文提供的是包含本文描述的抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)和异源蛋白、多肽或肽的融合蛋白。在一个实施方式中，所述与抗体融合的异源蛋白、多肽或肽可用于使所述抗体靶向特定细胞类型，例如表达KIT的细胞。例如，免疫特异性结合于由特定细胞类型(例如，免疫细胞)表达的细胞表面受体的抗体可以与本文描述的修饰的抗体融合或缀合。在具体的实施方式中，所述异源蛋白或多肽(或其片段)与第二靶标结合(例如，KIT除外的靶标)(参见例如，PCT国际专利申请公布号WO 2009/088805和美国专利申请公布号US 2009/0148905)。
本文提供的是包含任何本文描述的抗体或其抗原结合片段和异源多肽(例如，除KIT以外的多肽)的缀合蛋白或融合蛋白。在一个实施方式中，本文描述的缀合蛋白或融合蛋白包含本文描述的抗KIT抗体和异源多肽。在另一个实施方式中，本文提供的缀合蛋白或融合蛋白包含本文描述的抗KIT抗体的抗原结合片段和异源多肽。在另一个实施方式中，本文描述的缀合蛋白或融合蛋白包含具有本文描述的抗KIT抗体的VH域中的任何一个的氨基酸序列的VH域，和/或具有本文描述的抗KIT抗体的VL域中的任何一个的氨基酸序列的VL域，和异源多肽。在另一个实施方式中，本文描述的缀合蛋白或融合蛋白包含一个或多个具有SEQ ID NO:16、17和18中的任何一个的氨基酸序列(参见例如，表1)或表2或表3中所阐述的CDR中的任何一个的氨基酸序列的VH CDR，和异源多肽。在另一个实施方式中，本文描述的缀合蛋白或融合蛋白包含一个或多个具有本文描述的抗KIT抗体的VL CDR中的任何一个的氨基酸序列的VL CDR(例如，表1中的VLCDR，SEQ ID NO:19、20和21或表2或表3的VL CDR)和异源多肽。在另一个实施方式中，本文描述的缀合蛋白或融合蛋白包含本文描述的抗KIT抗体的至少一个VH域和至少一个VL域，和异源多肽。在另一个实施方式中，本文描述的缀合蛋白或融合蛋白包含至少一个VH域和至少一个VL域，其包含SEQ ID NO:7、8、9、10或12或表5B和表5D中所阐述的序列；和/或VH域，其包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6或11或表5A和表5C中所阐述的序列，和异源多肽。在又一个实施方式中、本文描述的缀合蛋白或融合蛋白包含本文描述的抗KIT抗体的至少一个VH CDR和至少一个VLCDR(例如，表1或表2或表3中的VL CDR和VH CDR)，和异源多肽。
另外，本文描述的抗体可以与治疗部分缀合，所述治疗部分例如放射性金属离子，例如α-发射体，例如213Bi；或大环螯合剂，该大环螯合剂可用于放射性金属离子(包括但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)与多肽缀合。在某些实施方式中，所述大环螯合剂是可以通过接头分子与该抗体连接的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)。这样的接头分子是本领域公知的并且在以下文献中有描述：Denardo等人,1998,ClinCancer Res.4(10):2483-90；Peterson等人,1999,Bioconjug.Chem。10(4):553-7；和Zimmerman等人,1999,Nucl.Med.Biol.26(8):943-50，所述各文献以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或其抗原结合片段经由一个或多个接头分子直接地或间接地与一种或多种分子(例如，治疗部分或药物部分)缀合。在特定的实施方式中，接头是酶可裂解接头或二硫键接头。在一个具体的实施方式中，所述可裂解接头是通过诸如氨基肽酶、氨基酯酶、二肽基羧基肽酶或凝血级联的蛋白酶等酶而裂解的。在特定的实施方式中，接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20个氨基酸残基。在某些实施方式中，接头由1-10个氨基酸残基、1-15个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、10-25个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基或10-50个氨基酸残基组成。
在某些实施方式中，部分经由一个或多个接头与抗体缀合。在一个特定的实施方式中，部分由所述抗体-药物缀合物在接头处水解而来。在一个实施方式中，部分由所述抗体缀合物在接头处大约在pH 3.0和pH 4.0之间和在约20-50℃、优选37℃的温度下水解1-24小时而来。在一个具体的实施方式中，接头在血流中是稳定的，但是在其处于中靶细胞内部后就立即释放缀合的部分。在某些实施方式中，部分经由一个或多个含有三唑的接头与本文描述的抗体缀合(参见例如，国际专利申请公布号WO2007/018431，所述文献以引用的方式并入本文中)。用于掺入到本文描述的抗体-药物缀合物的接头和间隔基的非限制性实例在PCT国际专利申请公布号WO 2007/018431、WO 2004/043493和WO 2002/083180中被公开。
此外，本文描述的抗体可以与标记(marker)序列(例如肽)融合以促进纯化。在优选的实施方式中，所述标记氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在pQE载体(QIAGEN,Inc.)中提供的标签(tag)，其中许多是市售的。正如在Gentz等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所描述，举例来说，六组氨酸提供融合蛋白的方便纯化。可用于纯化的其它肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,1984,Cell 37:767)；和“FLAG”标签。
用于使治疗部分(包括多肽)与抗体融合或缀合的方法为熟知的，参见例如Arnon等人,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”,载于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编著),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery”,in Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等人(编著),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,载于Monoclonal Antibodies 84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编著),第475-506页(1985)；“Analysis,Results,And Future ProspectiveOf The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,载于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编著),第303-16页(Academic Press 1985),Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119-58；美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,723,125、5,783,181、5,908,626、5,844,095,和5,112,946；EP307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公布WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535-10539,1991；Traunecker等人,Nature,331:84-86,1988；Zheng等人,J.Immunol.,154:5590-5600,1995；Vil等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:11337-11341,1992，所述各文献以全文引用的方式并入本文中。
融合蛋白可例如通过基因改组(gene-shuffling)、基序改组(motif-shuffling)、外显子改组(exon-shuffling)和/或密码子改组(codon-shuffling)(统称为“DNA改组”)的技术来产生。可以利用DNA改组改变本文描述的抗体(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体)的活性。一般参见美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人,1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；和Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-313(这些专利和出版物各自以全文引用的方式并入本文中)。抗体或所编码的抗体可以在重组之前通过易错PCR(error-prone PCR)、随机核苷酸插入或其它方法经受随机诱变而改变。编码本文描述的抗体的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序(motifs)、区段(sections)、部分(parts)、域(domains)、片段(fragments)等进行重组。
本文描述的抗体也可以与第二抗体缀合以形成抗体杂缀合物，如美国专利号4,676,980所描述，所述专利以引用的方式并入本文中。
与免疫特异性结合于KIT抗原的本文描述的抗体缀合或重组融合的治疗部分或药物可进行选择以达到所需的预防或治疗效果，例如减小肿瘤尺寸或负担、降低癌细胞生长或增殖或诱导癌细胞的死亡。在某些实施方式中，所述抗体是修饰的抗体。临床医师或其它医学人员在决定哪一种治疗部分或药物与本文描述的抗体缀合或重组融合时应考虑以下因素：疾病的性质、疾病的严重程度和对象的病症。
本文描述的抗体也可以与对靶抗原的免疫测定或纯化特别有用的固体支持物相连。这样的固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙(nylon)、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
在某一个方面，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含与药物、任选通过接头连接的抗体的细胞外药物缀合物(extracellular drug conjugate,ECD)(参见例如，PCT国际专利申请公布号WO 2011/031870)。药物可以在细胞的外部起作用，并因此不需要缀合物的内化。在ECD结合靶细胞之后，药物向该细胞中发送一个信号。
在一个实施方式中，ECD的接头是不可裂解的接头。不可裂解的接头的实例包括含有聚乙二醇链或聚乙烯链且对酸或碱不敏感的接头(例如含腙接头)、对还原剂或氧化剂不敏感的接头(例如含有二硫键的那些)或对可在细胞或循环系统中发现的酶不敏感的接头。不可裂解的接头的具体实例包括SMCC接头(美国专利申请20090202536)。出于说明性目的，可裂解接头的实例包括含有未受阻的谷胱甘肽敏感性二硫化物、酯、对诸如组织蛋白酶或纤溶酶等肽酶敏感的肽序列、pH敏感性腙的接头(参见BioconjugateChem.,2010,21(1),第5-13页)和未受阻的二硫化物接头SPP(美国专利申请20090202536)的接头。
在某些方面，ECD包含药物或药剂，该药物或药剂是强心苷(cardiacglycoside)，例如海葱次苷(proscillaridin)或糖增强型海葱次苷。在一个实施方式中，所述药剂由强心苷组成且无糖。在各种实施方式中，所述强心苷是PCT公布号WO 2010/017480(PCT/US2009/053159)中鉴定的化合物。
5.2多核苷酸
在某些方面，本文提供的是包含编码免疫特异性结合于KIT抗原的本文描述的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)或其片段(例如，可变轻链区和/或可变重链区)的核苷酸序列的多核苷酸，和载体，例如包含用于在宿主细胞(例如，大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达的这类多核苷酸的载体。本文提供的是包含编码本文提供的抗体任意一种的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸序列的载体，例如用于在宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)中有效表达的表达载体。本文还提供的是编码用于产生本文描述的抗KIT抗体的KIT抗原(例如，SEQ ID NO:14或15)的多核苷酸。
如本文所用的，“分离的”多核苷酸或核酸分子是从核酸分子的天然来源(例如，在人类中)中存在的其它核酸分子中分离的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)当采用重组技术产生时可实质上不含其它细胞材料或培养基，或当采用化学合成时可实质上不含化学前体或其它化学物质。例如，措辞“实质上不含”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是小于约10％)的其它材料(例如，细胞材料、培养基、其它核酸分子、化学前体和/或其它化学物质)的多核苷酸或核酸分子的制备物。在一个具体的实施方式中，编码本文描述的抗体的核酸分子是分离的或纯化的。
在特定的方面，本文提供的是包含编码以下抗体的核苷酸序列的多核苷酸：免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如，人KIT)的D4区)并且包含如本文描述的氨基酸序列的抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，以及与这样的抗体竞争与KIT多肽结合(例如，以剂量依赖性方式)或与这样的抗体的表位相同的表位结合的抗体。
在某些方面，本文提供的是包含编码本文描述的抗体的轻链或重链的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸可包含编码包含本文描述的抗体的VL FR和CDR(参见例如，表1和表5B)的轻链的核苷酸序列。所述多核苷酸可包含编码包含本文描述的抗体的VH FR和CDR(参见例如，表1和表5A)的重链的核苷酸序列。在具体的实施方式中，本文描述的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:7、8、9或10的氨基酸序列的VL链区。在具体的实施方式中，本文描述的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2-6中的任何一个的氨基酸序列的VH链区。
在特定的实施方式中，本文描述的多核苷酸编码VL链区，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:27、28、29或30的核酸序列。在特定的实施方式中，本文描述的多核苷酸编码VH链区，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:22、23、24、25或26的核酸序列。在特定的实施方式中，多核苷酸编码本文描述的抗体，其中所述多核苷酸包含编码L2VL链区的SEQ ID NO:28的核酸序列和编码H3VH链区的SEQ ID NO:24的核酸序列。在特定的实施方式中，一种或多种多核苷酸包含编码VL链区的SEQ ID NO:28的核酸序列和编码VH链区的SEQ ID NO:24的核酸序列。在特定的实施方式中，多核苷酸编码本文描述的抗体，其中所述多核苷酸包含编码L1VL链区的SEQ ID NO:27的核酸序列和编码H4VH链区的SEQ ID NO:25的核酸序列。在特定的实施方式中，一种或多种多核苷酸包含编码VL链区的SEQ IDNO:27的核酸序列和编码VH链区的SEQ ID NO:25的核酸序列。在特定的实施方式中，本文描述的多核苷酸编码VL链区，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:27、28、29或30的核酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核酸序列。在特定的实施方式中，本文描述的多核苷酸编码VH链区，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:22、23、24、25或26的核酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核酸序列。
在特定的实施方式中，本文提供的是包含编码抗KIT抗体的核苷酸序列的多核苷酸，该抗KIT抗体包含VL链区，例如含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4、包含本文描述的氨基酸序列(例如，参见表1、表5A-5B和表6A-6B)。在具体的实施方式中，本文提供的是包含编码抗KIT抗体的核苷酸序列的多核苷酸，该抗KIT抗体包含VH链区，例如含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4、包含本文描述的氨基酸序列(例如，参见表1、表5A-5B和表6A-6B)。
在某些实施方式中，本文描述的多核苷酸包含编码本文提供的抗体的核苷酸序列，该抗体包含可变轻(VL)链区，该可变轻(VL)链区包含本文描述的氨基酸(例如，参见图3A-3I)，其中该抗体免疫特异性结合于KIT多肽，例如人KIT多肽，例如KIT(例如人KIT)的D4区，例如SEQ ID NO:15。
在某些实施方式中，本文描述的多核苷酸包含编码本文提供的抗体的核苷酸序列，该抗体包含可变重(VH)链区，该可变重(VH)链区包含本文描述的氨基酸序列(例如，参见图3A-3I)，其中该抗体免疫特异性结合于KIT多肽，例如人KIT多肽，例如KIT(例如人KIT)的D4区，例如SEQ ID NO:15。
在某些方面，多核苷酸包含编码本文描述的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)的核苷酸序列，该抗体包含VL链区，该VL链区包含一个或多个VL FR，该一个或多个VL FR具有本文描述的氨基酸序列(例如，参见表5B和表5D)，其中该抗体免疫特异性结合于KIT多肽，例如人KIT多肽，例如KIT(例如人KIT)的D4区，例如SEQ ID NO:15。在某些方面，多核苷酸包含编码本文描述的抗体的核苷酸序列，该抗体包含VH链区，该VH链区包含一个或多个VH FR，该一个或多个VH FR具有本文描述的氨基酸序列(例如，参见表5A和表5C)，其中该抗体免疫特异性结合于KIT多肽，例如人KIT多肽，例如KIT(例如人KIT)的D4区，例如SEQ ID NO:15。
在具体的实施方式中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)的核苷酸序列，该抗体包含：作为人构架区的构架区(例如，VL域和VH域的构架区)，其中该抗体免疫特异性结合于KIT多肽，例如人KIT多肽，例如KIT(例如人KIT)的D4区，例如SEQ ID NO:15。
在具体的方面，本文提供的是包含编码包含轻链和重链(例如，独立的轻链和重链)的抗体的核苷酸序列的多核苷酸。关于轻链，在一个具体的实施方式中，本文提供的多核苷酸包含编码κ轻链的核苷酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供的多核苷酸包含编码λ轻链的核苷酸序列。在又一个具体的实施方式中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的抗体的核苷酸序列，该抗体包含人κ轻链或人λ轻链。在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的抗体的核苷酸序列，该抗体免疫特异性结合于KIT多肽(例如，包含KIT(例如人KIT)的D4区(例如，SEQ IDNO:15)的KIT多肽)，其中该抗体包含轻链，和其中该VL链区的氨基酸序列可包含本文描述的任何氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:7、8、9或10或12)，和其中该轻链的恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述轻链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在另一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的抗体的核苷酸序列，该抗体免疫特异性结合于KIT多肽(例如，包含KIT多肽包含KIT(例如人KIT)的D4区(例如，SEQ ID NO:15)的KIT多肽)，并且包含轻链，其中该VL链区的氨基酸序列可包含本文描述的任何氨基酸序列(例如，SEQID NO:7、8、9或10或12)，和其中该轻链的恒定区包含人λ轻链恒定区的氨基酸序列。例如，人恒定区序列可以是美国专利号5,693,780中描述的那些。
在一个特定的实施方式中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的抗体的核苷酸序列，该抗体免疫特异性结合于KIT多肽(例如，包含包含KIT(例如人KIT)的D4区(例如，SEQ ID NO:15)的KIT多肽的KIT多肽)，其中该抗体包含重链，其中该VH链区的氨基酸序列可包含本文描述的任何氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5或6或11)，和其中所述重链的恒定区包含人γ(gamma)重链恒定区的氨基酸序列。
在又一个具体的实施方式中，本文提供的多核苷酸包含编码本文描述的抗体(或其抗原结合片段)的核苷酸序列，该抗体免疫特异性结合于KIT多肽(例如，KIT(例如人KIT)的D4区)，其中该抗体包含包含本文描述的任何氨基酸序列的VL链区和VH链区，和其中该恒定区包含人IgG1(例如，同种型a、z或f)或人IgG4的恒定区的氨基酸序列。
在一个具体的实施方式中，本文提供的是包含编码抗KIT抗体或其抗原结合片段或本文命名的域(参见例如，表1-6B和图3A-3I)(例如抗体Hum1-Hum20)的核苷酸序列的多核苷酸。
本文还提供的是编码抗KIT抗体或其片段的多核苷酸，其为优化的，例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列置换和消除mRNA不稳定性元件。因此，通过在mRNA中引入密码子变化和/或消除抑制性区域以产生用于重组表达的编码抗KIT抗体或其片段(例如，轻链、重链、VH域或VL域)的优化核酸的方法可通过相应地改变在例如美国专利号5,965,726、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6,794,498中描述的优化方法来实现。例如，RNA内的潜在剪接位点和不稳定性元件(例如，富含A/T或A/U的元件)可以发生突变而不改变由核酸序列编码的氨基酸以增加RNA的稳定性用于重组表达。所述改变利用遗传密码子的简并性，例如使用完全相同氨基酸的替代密码子。在有些实施方式中，可能希望改变一个或多个密码子以编码保守突变，例如与原始氨基酸具有类似化学结构和特性和/或功能的类似氨基酸。这样的方法可以使抗KIT抗体或其片段的表达相对于由未经优化的多核苷酸编码的抗KIT抗体的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或100倍以上。
在某些实施方式中，编码本文描述的抗KIT抗体或其片段(例如，VL域和/或VH域)的优化多核苷酸序列可以与编码本文描述的抗KIT抗体或其片段(例如，VL域和/或VH域)的未优化多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸杂交。在具体的实施方式中，编码本文描述的抗KIT抗体或片段的优化核苷酸序列与编码本文描述的抗KIT抗体或其片段的未优化多核苷酸序列的反义多核苷酸在高严格性条件下杂交。在一个具体的实施方式中，编码本文描述的抗KIT抗体或其片段的优化核苷酸序列与编码本文描述的抗KIT抗体或其片段的未优化核苷酸序列的反义多核苷酸在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下杂交。关于杂交条件的信息已有描述，参见例如美国专利申请公布号US 2005/0048549(例如，段落72-73)，所述文献以引用的方式并入本文中。
在某些实施方式中，编码本文描述的抗体的VL区的优化多核苷酸序列与SEQ ID NO:27、28、29或30的核苷酸序列有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性。在某些实施方式中，编码本文描述的抗体的VH区的优化多核苷酸序列与SEQ ID NO:22、23、24、25或26的核苷酸序列有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性。
可通过本领域已知的任何方法获得所述多核苷酸，并且测定所述多核苷酸的核苷酸序列。编码本文描述的抗体的核苷酸序列，例如在表1-6B和图3A-3I中描述的抗体，及这些抗体的修饰形式可以使用本领域所熟知的方法来测定，即，已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子可以以这种产生编码所述抗体的核酸的方式进行组装。编码所述抗体的此类多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如描述于Kutmeier等人,1994,BioTechniques17:242)，简而言之，其涉及合成含有编码所述抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火和连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增所连接的寡核苷酸。
或者，可使用本领域所熟知的方法(例如，PCR和其它分子克隆方法)，由来自合适来源(例如，杂交瘤)的核酸产生编码本文描述的抗体的多核苷酸。例如，使用可与已知序列的3’端和5’端杂交的合成引物的PCR扩增可以使用得自产生目标抗体的杂交瘤细胞的基因组DNA来进行。这样的PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体的轻链和/或重链的序列的核酸。这样的PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体的可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。可将所扩增的核酸克隆到用于在宿主细胞中表达并用于进一步克隆的载体中，例如以产生嵌合抗体和人源化抗体。
如果含有编码特定抗体的核酸的克隆无法获得，但抗体分子的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成或采用以下方法获得：从合适的来源(例如，抗体cDNA文库或从表达所述抗体的任何组织或细胞(例如选择表达本文描述的抗体的杂交瘤细胞)分离的核酸、优选poly A+RNA产生的cDNA文库)通过使用可与该序列的3’端和5’端杂交的合成引物的PCR扩增，或通过使用对特定基因序列有特异性的寡核苷酸探针以鉴定例如来自编码所述抗体的cDNA文库的cDNA克隆来克隆。然后可使用本领域所熟知的任何方法，将通过PCR产生的经扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
编码本文描述的抗KIT抗体的DNA可以使用常规的程序(例如，通过使用能够与编码抗KIT抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离并测序。杂交瘤细胞可充当此DNA的来源。一旦被分离，就可将该DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染到宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴(simian)COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞)或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中合成抗KIT抗体。
为了产生完全抗体，可使用包括VH或VL核苷酸序列、限制位点和用于保护限制位点的侧翼序列的PCR引物来扩增scFv克隆中的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可将PCR扩增的VH域克隆到表达重链恒定区(例如，人γ4恒定区)的载体中，并且可将PCR扩增的VL域克隆到表达轻链恒定区(例如人κ或λ恒定区)的载体中。在某些实施方式中，用于表达VH或VL域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号、针对可变域、恒定域的克隆位点和选择标记(例如新霉素)。也可将VH域和VL域克隆到表达必需恒定区的一种载体中。然后使用本领域技术人员已知的技术，将重链转换载体和轻链转换载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
该DNA也可被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定域的编码序列替代鼠序列，或者通过使非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列上。
也提供的是与编码本文描述的抗体的多核苷酸在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下杂交的多核苷酸。在具体的实施方式中，本文描述的多核苷酸与编码本文提供的VH链区(例如，SEQ ID NO:2、3、4、5或6)和/或VL链区(例如，SEQ ID NO:7、8、9或10)的多核苷酸在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下杂交。在具体的实施方式中，本文描述的多核苷酸与与编码本文提供的VH链区(例如，SEQ ID NO:3或5)和/或VL链区(例如，SEQ ID NO:2)的多核苷酸互补的多核苷酸在高严格性或中等严格性杂交条件下杂交。
在具体的实施方式中，本文描述的多核苷酸与与包含编码VL域的SEQID NO:27、28、29或30的多核苷酸互补的多核苷酸在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下杂交。在具体的实施方式中，本文描述的多核苷酸与与包含编码VH域的SEQ ID NO:22、23、24、25或26的多核苷酸互补的多核苷酸在高严格性或中等严格性杂交条件下杂交。
杂交条件在本领域已有描述并且为本领域技术人员已知的。例如，在严格性条件下杂交可涉及在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下与滤膜结合的DNA杂交，然后在0.2xSSC/0.1％SDS中在约50-65℃下进行一次或多次洗涤；在高严格性条件下杂交可涉及在6xSSC中在约45℃下与滤膜结合的核酸杂交，然后在0.1xSSC/0.2％SDS中在约68℃下进行一次或多次洗涤。在其它严格性杂交条件下杂交为本领域技术人员已知的并且已有描述，参见例如Ausubel,F.M.等人(编著),1989,Current Protocols inMolecular Biology,第I卷,Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York,第6.3.1-6.3.6页和第2.10.3页。
5.3宿主细胞和抗体的重组表达
在某些方面，本文提供的是重组表达本文描述的抗体(或其抗原结合片段)的宿主细胞及相关表达载体。本文提供的是包含多核苷酸的载体(例如，表达载体)，该多核苷酸包含编码抗KIT抗体或片段的核苷酸序列，用于在宿主细胞中、优选在哺乳动物细胞中重组表达。本文还提供的是包含用于重组表达本文描述的抗KIT抗体(例如，人抗体或人源化抗体)的这类载体的宿主细胞。在一个特定的方面，本文提供的是用于产生本文描述的抗体的方法，包括由宿主细胞表达这样的抗体。
免疫特异性结合于KIT抗原的本文描述的抗体(例如，全长抗体、抗体的重链和/或轻链或本文描述的单链抗体)的重组表达涉及构建含有编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。一旦已获得编码本文描述的抗体分子、抗体的重链和/或轻链或其片段(优选，但不一定含有重链和/或轻链可变域)的多核苷酸，就可以使用本领域所熟知的技术，通过重组DNA技术产生用于产生所述抗体分子的载体。因此，用于通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法在本文中有描述。可使用本领域技术人员所熟知的方法来构建含有抗体编码序列及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外(in vitro)重组DNA技术、合成技术和体内(invivo)遗传重组。也提供的是可复制载体，其包含与启动子操作性连接的编码本文描述的抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变域或其片段或重链或轻链CDR的核苷酸序列。这样的载体可例如包括编码所述抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际公布号WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且可将所述抗体的可变域克隆到这样的载体中用于表达完整重链、完整轻链或完整重链和轻链两者。
可通过常规的技术将表达载体转移到细胞(例如，宿主细胞)中，然后可通过常规的技术培养所得的细胞以产生本文描述的抗体或其片段。因此，本文提供的是宿主细胞，其含有与启动子操作性连接的编码本文描述的抗体或其片段或其重链或轻链或其片段或本文描述的单链抗体的多核苷酸，用于在该宿主细胞中表达这样的序列。在某些实施方式中，为了表达双链抗体，可将分别编码重链和轻链两者的载体在宿主细胞中共表达，用于表达完整的免疫球蛋白分子，如下文所详述。在某些实施方式中，宿主细胞含有包含编码本文描述的抗体或其片段的重链和轻链两者的多核苷酸的载体。在具体的实施方式中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一种载体包含编码本文描述的抗体或其片段的重链的多核苷酸，和第二种载体包含编码本文描述的抗体或其片段的轻链的多核苷酸。在其它的实施方式中，第一种宿主细胞包含第一种载体，第一种载体包含编码文描述的抗体或其片段的重链的多核苷酸；和第二种宿主细胞包含第二种载体，第二种载体包含编码本文描述的抗体的轻链的多核苷酸。
可利用多种宿主-表达载体系统来表达本文描述的抗体分子(参见例如，美国专利号5,807,715)。这样的宿主-表达系统表示可产生目标编码序列并且随后加以纯化的媒介物(vehicles)，但也表示当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位(in situ)表达本文描述的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒(cosmid)DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如，绿色藻类，例如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或携带含有来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3细胞)。在一个具体的实施方式中，用于表达本文描述的抗体(例如，Hum1-Hum20)或其抗原结合片段的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞。在一个具体的实施方式中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。优选使用细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞，更优选使用真核细胞(尤其是对于表达完整重组抗体分子)来表达重组抗体分子。例如，将哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)与载体(例如来自人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件)相结合是抗体的有效表达系统(Foecking等人,1986,Gene 45:101；和Cockett等人,1990,Bio/Technology 8:2)。在某些实施方式中，本文描述的抗体由CHO细胞或NS0细胞产生。在一个具体的实施方式中，编码免疫特异性结合于KIT抗原的本文描述的抗体的核苷酸序列的表达受组成性启动子、诱导性启动子或组织特异性启动子调节。
在细菌系统中，宜视所表达的抗体分子的预定用途而选择许多表达载体。例如，当欲产生大量的这种抗体以产生抗体分子的药物组合物时，可能需要指导表达容易纯化的融合蛋白产物的高水平的载体。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,1983,EMBO 12:1791)，其中所述抗体编码序列可个别地连接到具有与lac Z编码区同读框的载体中，使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,1985,Nucleic Acids Res.13:3101-3109；Van Heeke&Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503-5509)等。pGEX载体也可用于表达外源多肽作为具有谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，这样的融合蛋白是可溶的并且可通过吸附和结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠，然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从裂解的细胞中容易地纯化。pGEX载体经设计以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，使得可以从GST部分中释放出克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus,AcNPV)用作表达外源基因的载体。所述病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将所述抗体编码序列个别地克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可将目标抗体编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物(例如，晚期启动子和三联(tripartite)前导序列)。然后，可通过体外或体内重组将这个嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(例如，区域El或E3)将导致产生有活力的并且能够在被感染的宿主中表达所述抗体分子的重组病毒(例如参见Logan&Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359)。对于经插入的抗体编码序列的有效翻译也可需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的读框同相，以确保翻译全部插入序列。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有各种各样的来源，天然及合成皆可。表达效率可以通过包括适当转录增强子元件、转录终止子等来增强(参见例如，Bittner等人,1987,Methods in Enzymol.153:51-544)。
另外，可选择调节插入的序列的表达或以所需的特定方式修饰且加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能非常重要。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此目的，可使用具有用于对初级转录物进行正确加工、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性地产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在某些实施方式中，本文描述的人源化单克隆抗KIT抗体在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中产生。
为了长期、高产率产生重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可对稳定表达所述抗体分子的细胞系进行工程改造。若不使用含有病毒复制起点的表达载体，则宿主细胞可以用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标记转化。在引入外源DNA之后，可允许工程改造的细胞在加富(enriched)培养基中生长1-2天，然后换成选择性培养基。重组质粒中的选择标记赋予选择抗性并且允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体上并且生长以形成转化灶(foci)，该转化灶进而可克隆并扩充成细胞系。这种方法可有利地用于工程改造表达所述抗体分子的细胞系。这样的工程改造的细胞系可尤其适用于筛选及评估与所述抗体分子直接或间接相互作用的组合物。
可以使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人,1980,Cell 22:8-17)基因，可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。另外，可以用抗代谢物抗性作为以下基因的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性(Wigler等人,1980,Natl.Acad.Sci.USA77:357；O’Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对麦考酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science 260:926-932；和Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIB TECH 11(5):l55-215)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,1984,Gene 30:147)。通常可应用重组DNA技术领域公知的方法来选择所需的重组克隆，并且这样的方法描述于例如Ausubel等人(编著),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；和载于第12章和第13章,Dracopoli等人(编著),Current Protocols in Human Genetics,JohnWiley&Sons,NY(1994)；Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1，这些文献以全文引用的方式并入本文中。
可通过载体扩增来增加抗体分子的表达水平(有关综述，参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning(基于克隆基因表达的基因扩增的载体在哺乳动物细胞中在DNA克隆中的应用),第3卷(Academic Press,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因缔合，因此抗体的产生也将增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell.Biol.3:257)。
宿主细胞可以用两种或两种以上本文描述的表达载体共转染，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体均可以含有完全相同的选择标记，使得重链和轻链多肽可均等表达。宿主细胞可以用不同量的两种或两种以上表达载体共转染。例如，宿主细胞可以用第一种表达载体和第二种表达载体的以下比率中的任何一个转染：1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:12，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45或1:50。
或者，可以使用编码并且能够表达重链和轻链多肽两者的单一载体。在这样的情况下，轻链应当置于重链之前以避免过量的无毒性重链(Proudfoot,1986,Nature 322:52；和Kohler,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子的或多顺反子的。多顺反子核酸构建体可编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上或者在2-5、5-10或10-20个范围内的基因/核苷酸序列。例如，双顺反子的核酸构建体可按以下顺序包含启动子、第一基因(例如，本文描述的抗体的重链)和第二基因和(例如，本文描述的抗体的轻链)。在这样的表达载体中，两种基因的转录可由启动子驱动，而由来自第一基因的mRNA的翻译可以是通过帽依赖性扫描机制(cap-dependent scanning mechanism)且由来自第二基因的mRNA的翻译可以是通过帽非依赖性机制(例如，通过IRES)。
一旦已通过重组表达产生本文描述的抗体分子，就可通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法将其纯化，所述方法例如通过层析法(例如，离子交换层析法、亲和层析法(特别是在蛋白A之后对特异性抗原的亲和层析法)和大小柱层析法)、离心、差异溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术。此外，本文描述的抗体可以与本文描述的或本领域另外已知的异源多肽序列融合以促进纯化。
在具体的实施方式中，本文描述的抗体是分离的或纯化的。一般而言，分离的抗体是实质上不含与该分离的抗体不同的抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体的制备物实质上不含细胞材料和/或化学前体。措辞“实质上不含细胞材料”包括将抗体与自其中分离或重组产生该抗体的细胞的细胞组分分离的抗体制备物。因此，实质上不含细胞材料的抗体包括具有小于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白(在本文中也称为“污染蛋白质”)和/或抗体变异体(例如，抗体的不同翻译后修饰形式或抗体的其它不同形式(例如，抗体片段))的抗体制备物。当所述抗体经重组产生时，它一般实质上不含培养基，即培养基占蛋白质制备物体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当所述抗体由化学合成产生时，它一般实质上不含化学前体或其它化学物质，即将其与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质分离开。因此，所述抗体制备物具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或除目标抗体以外的化合物。在一个具体的实施方式中，本文描述的抗体是分离的或纯化的。
5.4产生抗体的方法
免疫特异性结合于KIT抗原的本文描述的抗体(例如，人抗体或人源化抗体)(或其抗原结合片段)可通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法产生，例如通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有说明，否则本文描述的方法利用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和在技术技能内的相关领域中的常规技术。这些技术在本文中引用的参考文献中有描述并且在文献中有详尽解释。参见例如，Maniatis等人(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press；Sambrook等人,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987年和每年的更新版本)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987和每年的更新版本)Gait(编著)(1984)Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press；Eckstein(编著)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press；Birren等人(编著)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
例如，人源化抗体可使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(CDR-grafting)(欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、面饰法(veneering)或表面重整法(resurfacing)(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,ProteinEngineering 7(6):805-814；和Roguska等人,1994,PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利号5,565,332)和在以下文献中公开的技术：例如美国专利号6,407,213,美国专利号5,766,886,WO 9317105,Tan等人,J.Immunol.169:111925(2002),Caldas等人,Protein Eng.13(5):353-60(2000),Morea等人,Methods 20(3):26779(2000),Baca等人,J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997),Roguska等人,Protein Eng.9(10):895904(1996),Couto等人,CancerRes.55(增刊23):5973s-5977s(1995),Couto等人,Cancer Res.55(8):1717-22(1995),Sandhu JS,Gene 150(2):409-10(1994)和Pedersen等人,J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)。也参见美国专利公布号US 2005/0042664A1(2005年2月24日)，所述文献以引用的方式并入本文中。
在具体的方面，人源化抗体能够与预先确定的抗原结合并且包含实质上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的构架区和实质上具有非人免疫球蛋白(例如，鼠免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。在特定的实施方式中，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分、典型地人免疫球蛋白的至少一部分。所述抗体也可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可选自免疫球蛋白的任何类(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何同种型(isotype)(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。
单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤技术产生，包括本领域已知的和在以下文献中教导的那些：例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier,N.Y.,1981)。如本文所用的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。例如，单克隆抗体可通过重组技术产生，例如由宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)表达的重组单克隆抗体。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的且为本领域所熟知。例如，在杂交瘤方法中，将小鼠或其它适当宿主动物(例如绵羊、山羊、兔、大鼠、仓鼠或恒河猴)免疫以诱发淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合于免疫接种所用的蛋白质(例如，人KIT的D4区)的抗体。或者，淋巴细胞可进行体外免疫。然后使用合适的融合试剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。另外，可使用多位点重复性免疫(repetitive immunization multiple sites,RIMMS)技术来免疫动物(Kilptrack等人,1997Hybridoma 16:381-9,所述文献以引用的方式并入本文中)。
骨髓瘤细胞系的非限制性实例包括鼠骨髓瘤系，例如来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自萨克研究院细胞配送中心(the Salk Institute CellDistribution Center),San Diego,CA,USA)和SP-2或X63-Ag8.653细胞(可得自美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection),Rockville,MD,USA)的那些。人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系也描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体产生技术与应用),第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
本文描述的抗体包括识别特异性KIT抗原的抗体片段并且可通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，本文描述的Fab和F(ab’)2片段通过使用酶例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)对免疫球蛋白分子进行蛋白水解性裂解而产生。Fab片段对应于抗体分子的两条相同臂之一并且含有与重链的VH和CH1域配对的完全轻链。F(ab’)2片段含有抗体分子的在铰链区中通过二硫键连接的两条抗原结合臂。
在一个方面，为了产生整个抗体，可使用包括VH或VL核苷酸序列、限制位点和用于保护限制位点的侧翼序列的PCR引物自模板(例如，scFv克隆)扩增VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可将经PCR扩增的VH域克隆到表达VH恒定区的载体中，并且可将经PCR扩增的VL域克隆到表达VL恒定区(例如人κ或λ恒定区)的载体中。也可将VH域和VL域克隆到表达必需恒定区的一种载体中。然后使用本领域技术人员已知的技术，将重链转换载体和轻链转换载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
单域抗体(例如，缺乏轻链的抗体)可通过本领域所熟知的方法产生。参见Riechmann等人,1999,J.Immunol.231:25-38；Nuttall等人,2000,Curr.Pharm.Biotechnol.1(3):253-263；Muylderman,2001,J.Biotechnol.74(4):277302；美国专利号6,005,079；和国际公布号WO 94/04678、WO94/25591和WO 01/44301。
在某些方面，本文描述的抗体(例如杂缀合抗体、单链抗体和双特异性抗体)可通过本领域已知的重组技术产生。例如，将包含表达本文描述的抗体的载体的哺乳动物宿主细胞在适合抗体产生的条件下进行培养。
此外，免疫特异性结合于KIT抗原的抗体可使用本领域技术人员所熟知的技术进而用于产生“模拟”抗原的抗独特型抗体。(参见例如，Greenspan&Bona,1989,FASEB J.7(5):437-444；和Nissinoff,1991,J.Immunol.147(8):2429-2438)。
5.5药物组合物和试剂盒
本文提供的是包含一种或多种本文描述的抗体(例如人源化抗体)或其抗原结合片段或其缀合物的组合物、药物组合物和试剂盒。在特定的方面，本文描述的组合物可供体外、体内或离体使用。在具体的实施方式中，本文提供的是包含本文描述的抗体(例如，人源化抗体)(或其抗原结合片段)和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
如本文所用的，术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府的管理机构批准并且列于美国药典、欧洲药典或其它公认的药典中的用于动物且更特别用于人类。
可制备含有一种或多种本文提供的抗体(例如人源化抗体)的治疗制剂用于以冻干制剂或水溶液的形式贮藏，即将具有所需纯度程度的抗体与任选生理上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA；Remington:The Science和 Practice of Pharmacy,第21版(2006)Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
制剂(例如本文描述的那些)也可以含有超过一种活性化合物(例如，分子，例如一种或多种本文描述的抗体)，必要时，用于待治疗的特定适应症。在某些实施方式中，制剂包含本文提供的抗体和一种或多种具有互补活性且不负面地影响彼此的活性化合物。这样的分子适合以组合形式以有效达到预定目的的量存在。例如，本文描述的抗体可以与一种或多种其它治疗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼或舒尼替尼(sunitinib))或组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如伏立诺他(vorinostat)))组合。这样的联合疗法可以连续地或同时地或顺序地给予患者。
欲用于体内给药的制剂必须是无菌的。这由通过例如无菌过滤膜的过滤来容易地实现。
在具体的方面，本文提供的药物组合物含有在药学上可接受的载剂中的治疗有效量的一种或多种本文提供的抗体(例如人源化抗体)和任选的一种或多种另外的预防剂或治疗剂。这样的药物组合物可用于预防、治疗、处理或改善KIT相关紊乱或疾病，例如癌症(例如，GIST)或炎症性肠疾病或其一种或多种症状。
适合于给予本文提供的抗体的药用载剂包括本领域技术人员已知的适合于特定给药方式的任何这样的载剂。
另外，本文描述的抗体可以配制为组合物中的唯一药用活性成分或者可以与其它活性成分(例如一种或多种其它预防剂或治疗剂)组合。
所述组合物可含有一种或多种本文提供的抗体。在一个实施方式中，所述抗体配制成合适的药物制剂，例如溶液剂、混悬剂、片剂、可分散片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂或酏剂(对于口服给药)或无菌溶液剂或混悬剂(对于胃肠外给药)，以及经皮贴片制剂和干粉吸入剂。
在组合物中，将一种或多种本文提供的抗体(或其缀合物)与合适的药用载剂混合。组合物中的一种或多种抗体浓度可以例如当给药时有效递送治疗、预防或改善KIT相关紊乱或疾病或其症状的量。在特定的实施方式中，组合物中的一种或多种抗体-药物缀合物浓度可以例如当给药时有效递送治疗、预防或改善KIT相关紊乱或疾病或其症状的量。
在一个实施方式中，所述组合物配制用于单剂量给药。为了配制组合物，将一定重量分数的化合物以有效浓度(使得所治疗的病症减轻、预防，或者一种或多种症状得到改善)溶解、悬浮、分散或以其它方式混合于所选定的载剂中。
在某些方面，本文提供的抗体(例如，人源化抗体)(或其抗体-药物缀合物)以有效量包括在药学上可接受的载剂中，该有效量对待治疗的患者足以发挥有用的效果而不存在不需要的副作用或具有最小或可忽略不计的不需要的副作用。治疗有效浓度可以凭经验确定，即通过使用常规方法在体外和体内系统中测试该化合物并且之后由其外推用于人类的剂量。
药物组合物中的抗体浓度将取决于例如抗体的理化性质、剂量时间表和给予的量以及本领域技术人员已知的其他因素。在某些方面，药物组合物中的抗体-药物缀合物浓度将取决于例如抗体和/或药物的理化性质、剂量时间表和给予的量以及本领域技术人员已知的其他因素。
在一个实施方式中，治疗有效剂量产生约0.1ng/ml至约50-100μg/ml的抗体的血清浓度。在另一个实施方式中，所述药物组合物提供每千克体重约0.001mg至约2000mg抗体的剂量用于在一段时间(例如，每天、每周、每2周或每3周)给药。可制备药物剂量单位形式以提供每剂量单位形式约0.01mg至约2000mg，和在一个实施方式中约10mg至约500mg的所述抗体和/或其它任选的必需成分的组合。
在一个特定的实施方式中，本文描述的抗体-药物缀合物以每千克体重约1-100mg抗体-药物缀合物的有效剂量给予以供在一段时间(例如，每天、每周、每2周或每3周)给药。
所述抗体可以一次给予，或者可分成多个较小的剂量以一定的时间间隔给予。应当理解，精确剂量和治疗的持续时间是待治疗疾病的函数并且可以使用已知的测试方案或者通过从体内或体外试验数据外推而凭经验确定。还应当注意，浓度和剂量值也可以随着待减轻的病症的严重程度而改变。还应当理解，对于任何特定对象，具体的剂量方案可以根据个体的需求和给予或监管组合物给药的人员的专业判断随时间做出调整，且本文给出的浓度范围仅仅是示例性的并且不意欲限制请求保护的组合物的范围或实务。
在混合或添加所述抗体后，所得混合物可以是溶液剂、混悬剂、乳液剂等。所得混合物的形式取决于诸多因素，包括计划的给药方式和化合物在选定载剂或溶媒中的溶解度。有效浓度足以改善所治疗的疾病、紊乱或病症的症状并且可以凭经验确定。
所述药物组合物按单位剂型给人类和动物提供给药，例如含有合适量的所述化合物或其药学上可接受的衍生物的无菌胃肠外(例如，静脉内)溶液剂或混悬剂。药物组合物也按单位剂型给人类和动物提供给药，例如含有合适量的所述化合物或其药学上可接受的衍生物的片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂和口服溶液剂或混悬剂及水包油乳液剂。在一个实施方式中，所述抗体配制成单位剂型(unit-dosage forms)或复合剂型(multiple-dosageforms)并且按单位剂型或复合剂型给予。如本文所用的单位剂型是指适合于人和动物对象并且独立包装的物理上分散的一种单位，正如本领域已知的。每个单位剂量含有预定量的足以产生所需治疗效果的所述抗体，以及所需的药用载剂、溶媒或稀释剂。单位剂型的实例包括安瓿剂和注射剂及独立包装的片剂或胶囊剂。单位剂型可以按分数或其倍数给予。复合剂型是以分离的单位剂型给予的包装在单一容器中的多份相同的单位剂型。复合剂型的实例包括片剂或胶囊剂的一小瓶、一大瓶或以品脱或加仑为单位的一大瓶。因此，复合剂型是包装时不是分离的单位剂量的倍数。
在某些实施方式中，一种或多种本文描述的抗KIT抗体是在液体药物制剂中。药学上可给予的液体组合物可例如通过以下方法制备：将如上定义的活性化合物和任选的药用辅助剂在载剂(例如，水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、二醇类、乙醇等)中溶解、分散或以其它方式混合，从而形成溶液剂或混悬剂。如果需要，待给予的药物组合物也可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂、乳化剂、增溶剂和pH缓冲剂等。
制备这样的剂型的实际方法为本领域技术人员已知的或将显而易见；例如，参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co.,Easton,PA；Remington:The Science和Practice of Pharmacy,第21版(2006)Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD。
可制备含有在0.005％至100％的范围内的抗体并且由无毒载剂补足的剂型或组合物。用于制备这些组合物的方法为本领域技术人员已知的。
在一个实施方式中，胃肠外给药通过注射表征，本文也考虑了经皮下、肌内或静脉内注射。注射剂可以按常规形式制备成液体溶液剂或混悬剂、适合于在注射前制成呈液体的溶液剂或混悬剂的固体形式，或制备成乳液剂。注射剂、溶液剂和乳液剂也含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，如果需要，待给予的药物组合物也可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解增强剂和其它此类试剂。其它的给药途径可包括经肠给药、脑内给药、经鼻给药、动脉内给药、心脏内给药、骨内输注、鞘内给药和腹膜内给药。
用于胃肠外给药的制剂包括注射用无菌溶液剂(即用)(无菌的干的可溶性产品(例如冻干粉末)，准备在临用前与溶剂混合)(包括皮下片剂)、注射用无菌混悬剂(即用)(无菌的干的不溶性产品，准备在临用前与溶媒混合)和无菌乳液剂。所述溶液剂可以是水性的或非水性的。
如果静脉内给予，合适的载剂包括生理盐水或磷酸缓冲盐水(PBS)或含有增稠剂和增溶剂(例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物)的溶液。
胃肠外制剂中使用的药学上可接受的载剂包括水性溶媒、非水性溶媒、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、乳化剂、掩蔽剂(sequestering agent)或螯合剂(schelating agent)和其它药学上可接受的物质。
药用载剂也包括用于水混溶性溶媒的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
作为说明，含有活性化合物的无菌水性溶液剂的静脉内或动脉内输注是有效的给药方式。另一个实施方式是含有活性材料的无菌水性或油性溶液剂或混悬剂，按需要注射以产生所需的药理作用。
所述抗体可以微粉化或其它合适的形式悬浮。所得混合物的形式取决于诸多因素，包括计划的给药方式和所述化合物在选定载剂或溶媒中的溶解度。有效浓度足以改善所述病症的症状并且可以凭经验确定。
在其它的实施方式中，所述药物制剂是冻干粉针剂，其可复原作为溶液剂、乳液剂和其它混合物进行给药。它们也可复原并配制成固体制剂或凝胶剂。
冻干粉针剂通过将本文提供的抗体溶解在合适的溶剂中来制备。在有些实施方式中，所述冻干粉针剂是无菌的。所述溶剂可含有改进粉末或由粉末制备的复原溶液的稳定性或其它药理学组分的赋形剂。可使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨醇(sorbital)、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的试剂。所述溶剂也可含有缓冲剂，例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施方式中，约中性pH。随后将溶液无菌过滤后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干提供所需的制剂。在一个实施方式中，将所得溶液按比例分配到小瓶中进行冻干。每个小瓶将含有所述化合物的单剂量或多剂量。将冻干粉针剂贮藏在适当条件下，例如在约4℃至室温下。
这种冻干粉针剂用注射用水复原提供用于胃肠外给药的制剂。对于复原，将无菌水或其它合适的载剂加到冻干粉针剂中。精确量取决于所选定的化合物。这样的量可以凭经验确定。
本文提供的抗体可配制成供局部(local或topical)应用，例如以凝胶剂、乳油剂或洗剂局部应用于皮肤和粘膜(例如眼中)，和应用于眼或供脑池内或脊柱内应用。对于经皮递送并且也对于眼或粘膜的给药或对于吸入疗法考虑了局部给药。也可以给予活性化合物单用或与其它药学上可接受的赋形剂组合的鼻用溶液剂。
本文提供的抗体和其它组合物也可以配制成靶向待治疗对象的特定组织、感受器或其身体的其它部位。许多这样的靶向方法为本领域技术人员所熟知。所有这样的靶向方法在本文中都考虑用于本组合物中。关于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。在有些实施方式中，将本文描述的抗KIT抗体靶向(或用别的方式给予)至骨髓，例如在患有白血病或处于患白血病的风险之中的患者中。在有些实施方式中，将本文描述的抗KIT抗体靶向(或用别的方式给予)至胃肠道，例如在患有胃肠道间质瘤或处于患胃肠道间质瘤的风险之中的患者中。在有些实施方式中，将本文描述的抗KIT抗体靶向(或用别的方式给予)至肺，例如在患有肺癌(例如，小细胞肺癌)或处于患肺癌(例如，小细胞肺癌)的风险之中的患者中。在有些实施方式中，将本文描述的抗KIT抗体靶向(或用别的方式给予)至脑，例如在患有神经母细胞瘤或处于患神经母细胞瘤的风险之中的患者中。在具体的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体能够穿过血脑屏障。
本文提供的是药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，容器中装有本文描述的药物组合物的一种或多种成分，例如一种或多种本文提供的抗体。与这样的容器任选相关的可以是由管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的通知书，该通知书中反映出由生产、使用或销售的机构批准用于人类给药。
本文还提供的是可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文描述的抗体、优选纯化的抗体。在一个具体的实施方式中，本文描述的试剂盒含有实质上分离的KIT抗原作为对照。在另一个具体的实施方式中，本文描述的试剂盒还包含不与KIT抗原反应的对照抗体。在另一个具体的实施方式中，本文描述的试剂盒含有一种或多种要素以用于检测修饰的抗体与KIT抗原结合(例如，所述抗体可与可检测底物例如荧光化合物、酶促底物、放射性化合物或发光化合物缀合，或者识别第一抗体的第二抗体可与可检测底物缀合)。在具体的实施方式中，所述试剂盒可包括重组产生的或化学合成的KIT抗原。在试剂盒中提供的KIT抗原也可与固体支持物相连接。在一个更具体的实施方式中，上述试剂盒的检测手段包括与KIT抗原相连接的固体支持物。这样的试剂盒也可包括非连接的报道子-标记的抗人抗体。在这个实施方式中，所述抗体与KIT抗原的结合可以通过所述报道子-标记的抗体的结合来检测。
5.6方法
本文提供的是用于阻碍、预防、治疗和/或处理KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症)的方法。这样的方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗KIT抗体(例如，人源化抗体及其抗原结合片段或其缀合物)。在某些方面，本文还提供的是用于预防、阻碍、治疗或处理KIT相关紊乱或疾病的一种或多种症状的方法。
如本文所用的，“给予”或“给药”是指将物质(例如，本文提供的人源化抗KIT抗体或其抗原结合片段或其缀合物)注射或用别的方式物理上递送到对象或患者(例如人)的作用，例如通过粘膜、局部、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文描述的或本领域已知的任何其它物理递送方法。
如本文所用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以降低和/或改善给定疾病和/或与其相关的症状的严重程度和/或持续时间的疗法(例如，本文提供的人源化抗体或药物组合物)的量。这些术语也包括用于降低或改善给定疾病的恶化或进展、降低给定疾病的复发、发展或发作和/或改进或增强其它疗法(例如，除本文提供的抗KIT抗体以外的疗法)的预防或治疗效果所必需的量。在有些实施方式中，如本文所用的“有效量”也指本文描述的抗体达到特定结果(例如，细胞的KIT生物活性的抑制(例如，部分抑制)，例如细胞增殖或细胞存活的抑制或细胞凋亡或细胞分化的增强或诱导)的量。
如本文所用的，术语“联合疗法”在给予其它疗法的情形下是指使用超过一种疗法。术语“联合疗法”的使用并不限制给予疗法的顺序。所述疗法可以例如连续地、序贯地、同时地或伴随地给予。
如本文所用的，术语“处理”是指对象自疗法(例如，预防剂或治疗剂)获得的有益效果，其不导致KIT相关疾病或紊乱的治愈。在某些实施方式中，给予对象一种或多种疗法(例如，预防剂或治疗剂，例如本文描述的抗体)以“处理”KIT相关疾病(例如，癌症、炎症性病症或纤维化)、其一种或多种症状，以便预防疾病的进展或恶化。
如本文所用的，术语“阻碍”在KIT相关紊乱或疾病的情形下是指由于给予本文提供的疗法或疗法组合(例如，预防剂或治疗剂的组合，例如本文描述的抗体)而全部或部分抑制(例如，小于100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％)或阻断KIT相关疾病和/或与其相关的症状的发展、复发、发作或扩散。
如本文所用的，术语“预防剂”是指可全部或部分抑制对象的KIT相关疾病和/或与其相关的症状的发展、复发、发作或扩散的任何药剂。在某些实施方式中，术语“预防剂”是指本文描述的抗体。在某些其它的实施方式中，术语“预防剂”是指除本文描述的抗体以外的药剂。一般而言，预防剂是已知可用于或已经用于或目前正在用于预防KIT相关疾病和/或与其相关的症状或阻碍KIT相关疾病和/或与其相关的症状的发作、发展、进展和/或严重化的药剂。在具体的实施方式中，所述预防剂是人抗KIT抗体，例如人源化或全人抗KIT单克隆抗体。
如本文所用的，术语“副作用”包括疗法(例如，预防剂或治疗剂)的不合需要的及不利的作用。不合需要的作用未必不利。来自疗法(例如，预防剂或治疗剂)的不利作用可以是有害的或不适的或危险的。副作用的实例包括腹泻、咳嗽、胃肠炎、喘鸣、恶心、呕吐、厌食症、腹部绞痛(abdominalcramping)、发热、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、消化不良(dyspenea)、失眠症、眩晕、粘膜炎、神经及肌肉效应、疲乏、口干和食欲不振、给药部位的皮疹或肿胀、流感样症状(例如发热、发冷和疲乏)、消化道问题和变态反应。患者所经历的另外的不合需要的作用是众多的且为本领域已知的。许多在the Physician’s Desk Reference(第63版,2009)中有描述。
如本文所用的，术语“对象”和“患者”可互换使用。如本文所用的，对象优选是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、山羊、兔、大鼠、小鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)，最优选是人。在一个实施方式中，所述对象是患有KIT相关紊乱或疾病的哺乳动物、优选人。在另一个实施方式中，所述对象是处于发生KIT相关紊乱或疾病的风险之中的哺乳动物、优选人。在另一个实施方式中，所述对象是非人灵长类动物。在一个具体的实施方式中，所述对象是年龄至少18周岁的成年人对象。
如本文所用的，术语“疗法”可指可用于预防、治疗、处理或改善病症或紊乱或其症状(例如，癌症或与其相关的一种或多种症状或病症；炎症性病症或与其相关的一种或多种症状或病症；纤维化或与其相关的一种或多种症状或病症)的任何方案、方法、组合物、制剂和/或药剂。在某些实施方式中，术语“疗法”是指可用于治疗、处理、预防或改善病症或紊乱或其一种或多种症状(例如，癌症或与其相关的一种或多种症状或病症；炎症性病症或与其相关的一种或多种症状或病症；纤维化或与其相关的一种或多种症状或病症)的药物疗法、辅助疗法、辐射、外科手术、生物疗法、支持疗法和/或其它疗法。在某些实施方式中，术语“疗法”是指除本文描述的抗KIT抗体或其药物组合物以外的疗法。在具体的实施方式中，“另外的疗法”是指除使用本文描述的抗KIT抗体或药物组合物治疗以外的疗法。在一个具体的实施方式中，疗法包括使用本文描述的抗KIT抗体作为辅助疗法。例如，使用本文描述的抗KIT抗体与药物疗法、生物疗法、外科手术和/或支持疗法相结合。
如本文所用的，术语“治疗剂”是指可用于治疗、处理或改善KIT相关疾病和/或与其相关的症状的任何药剂。在某些实施方式中，术语“治疗剂”是指本文描述的抗KIT抗体(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个)、其抗原结合片段或其缀合物。在某些其它的实施方式中，术语“治疗剂”是指除本文描述的抗体以外的药剂。优选地，治疗剂是已知可用于或已经用于或目前正在用于治疗、处理或改善KIT相关疾病或与其相关的一种或多种症状的药剂。在具体的实施方式中，所述治疗剂是人抗KIT抗体，例如全人抗KIT单克隆抗体。
如本文所用的，术语“KIT相关紊乱”或“KIT相关疾病”可互换使用并且是指完全地或部分地由KIT表达和/或活性或缺乏它引起的、与其相关或是其结果的任何疾病。在一个方面，KIT相关紊乱或疾病可以为本领域技术人员已知的或者由本领域技术人员确定。在某一个实施方式中，KIT相关疾病或紊乱与KIT表达和/或活性相关。例如，KIT表达和/或活性可与一种或多种其它因素(例如，另一基因的突变或表达和/或活性)一起造成KIT相关疾病或紊乱的发展和/或进展。在某一个实施方式中，KIT相关疾病或紊乱与KIT的一个或多个突变相关。
在某些实施方式中，KIT相关疾病是纤维化或炎症性紊乱，例如炎症性肠疾病(IBD)，例如克罗恩病(Crohn’s disease,CD)或溃疡性结肠炎(UC)。在其它的实施方式中，KIT相关疾病是癌症，例如肺癌(例如，小细胞肺癌)、白血病、神经母细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤(例如，尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma))或胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)。
如本文所用的，术语“治疗”是指由于给予一种或多种疗法(包括但不限于给予一种或多种预防剂或治疗剂，例如本文提供的抗体)而降低或改善KIT相关疾病(例如，癌症、炎症性紊乱或纤维化)的进展、严重程度和/或持续时间。
在具体的实施方式中，用于本文描述的治疗KIT相关紊乱或疾病的方法提供由于给予一种或多种疗法(包括但不限于给予一种或多种预防剂或治疗剂，例如本文描述的抗KIT抗体)而降低或改善KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症或纤维化)的进展、严重程度和/或持续时间。在进一步具体的实施方式中，本文描述的用于治疗KIT相关紊乱或疾病的方法与减少KIT相关紊乱或疾病的一种或多种症状有关。在具体的实施方式中，本文描述的抗体(例如Hum1-Hum20中的任何一个抗体，例如抗体Hum8或Hum4或Hum17或Hum10)或其抗原结合片段或其缀合物是用于治疗或处理KIT相关紊乱(例如，癌症)。在一个特定的实施方式中，待用本文描述的抗KIT抗体或其抗原结合片段或其缀合物治疗或处理的KIT相关疾病或紊乱与KIT表达和/或活性相关，例如包括表达KIT和/或表现出KIT活性的细胞，但不是由KIT表达或活性引起或是KIT表达或活性的结果。
在一个特定的实施方式中，本文提供的是用于治疗或处理KIT相关紊乱(例如，癌症)的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)，例如抗体Hum1-Hum20或Hum17、Hum10、Hum8或Hum4中的任何一个，或其抗原结合片段或其缀合物，其中所述抗体包含(i)具有SEQ ID NO:7、8、9或10的氨基酸序列的VL链区，和/或(ii)具有SEQ ID NO:2、3、4、5或6的氨基酸序列的VH链区。在另一个特定的实施方式中，本文提供的是用于治疗或处理KIT相关紊乱(例如，癌症)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VH域(例如，H1-H5，SEQ ID NO:2-6)和VL域(L1-L4，SEQ ID NO:7-10)的组合，选自表4中给出的组。在一个特定的实施方式中，本文提供的是用于治疗或处理KIT相关紊乱(例如，癌症)的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物，其中所述抗体包含(i)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(参见例如，图4A)的VL链区，和/或(ii)包含SEQ ID NO:11的共有氨基酸序列(参见例如，图4B)的VH链区。在一个特定的实施方式中，本文提供的是用于治疗或处理KIT相关紊乱(例如，癌症)的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物，其中所述抗体包含(i)包含表6A中所阐述的氨基酸序列(例如，L1-L4和LL1-LL62)的VL链区，和/或(ii)包含表6B中所阐述的氨基酸序列(例如，H1-H5和HH1-HH256)的VH链区。
在一个具体的实施方式中，用于本文描述的方法中的抗体被与其结合的细胞内化。在一个特定的实施方式中，缀合物用于本文描述的方法中，其中所述缀合物包含本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体，例如Hum4或Hum8)或其KIT-结合片段。在一个具体的实施方式中，所述缀合物包含与治疗剂(例如毒素)共价或非共价连接的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其KIT-结合片段。在某一个实施方式中，用于本文描述的方法中的缀合物经内化进入与其结合的细胞内。
在某些实施方式中，KIT由细胞异常(例如，高)表达，例如KIT是过度表达的。在特定的实施方式中，KIT表达(例如，在细胞表面上)比在对照细胞(例如，表达正常水平的KIT的细胞，例如以下正常细胞(例如人)：肥大细胞、干细胞、脑细胞、黑色素母细胞或卵巢细胞)表面上的KIT表达高出至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在特定的实施方式中，KIT表达比在对照细胞群体(例如，表达正常水平的KIT的细胞群体，例如以下正常细胞群体(例如人)：肥大细胞群体、干细胞群体、脑细胞群体、黑色素母细胞群体或卵巢细胞群体)表面上的平均KIT表达产生高出至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞表面KIT表达。在具体的实施方式中，这样的对照细胞可得自或来源于健康个体(例如，健康人)。在有些实施方式中，KIT可在特定细胞类型中被异常上调，不论KIT在细胞表面上是否异常表达。在特定的实施方式中，KIT信号传导或活性可在特定细胞类型中被异常上调，不论KIT在细胞表面上是否异常表达。在特定的实施方式中，KIT信号传导比对照细胞(例如，含有正常KIT信号传导的细胞，例如肥大细胞、干细胞、脑细胞、黑色素母细胞或卵巢细胞)的KIT信号传导高出至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在特定的实施方式中，KIT信号传导比对照细胞群体(例如，表现出正常KIT信号传导的细胞群体，例如以下正常细胞群体(例如人)：肥大细胞群体、干细胞群体、脑细胞群体、黑色素母细胞群体或卵巢细胞群体)的平均KIT信号传导高出至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施方式中，正常、异常或过度细胞信号传导由KIT与KIT配体的结合引起。在其它的实施方式中，异常或过量细胞信号传导发生不依赖KIT与KIT配体的结合。
在某些方面，KIT相关紊乱或疾病可由功能获得性KIT活性、KIT活性增加或KIT过度表达来表征。在一个实施方式中，KIT相关紊乱或疾病完全或部分地由功能获得性KIT活性或表达(例如，KIT的过度表达)引起或为其结果。在某些实施方式中，所述功能获得性KIT活性可以发生不依赖于KIT配体(例如，SCF)结合KIT受体。在特定的方面，KIT在细胞中的高表达或过度表达是指这样的表达水平：比已知具有正常KIT表达或KIT活性的参考细胞的表达水平高出至少约35％、45％、55％或65％或者超过已知具有正常KIT表达或KIT活性的细胞群体或样品中的KIT的平均表达水平。KIT的表达水平可通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，蛋白质印迹法或免疫组织化学法)来评估。在特定的实施方式中，KIT相关紊乱或疾病通过高于正常KIT活性的KIT活性并且引起细胞转化、赘生物生成和肿瘤生成来表征。在特定的方面，在细胞中KIT活性高或增加是指比已知具有正常KIT活性的参考细胞的表达水平高出至少约35％、45％、55％或65％的KIT活性水平或超过已知具有正常KIT活性的细胞群体或样品中的KIT活性的平均水平的KIT活性水平。KIT活性的非限制性实例包括KIT的细胞质域的酪氨酸磷酸化和KIT下游的信号传导，例如Stat或Akt信号传导。
紊乱或KIT相关紊乱或疾病的非限制性实例包括癌症，例如乳癌、白血病(例如，慢性髓细胞白血病、急性髓样白血病、肥大细胞白血病)、肺癌(例如，小细胞肺癌)、神经母细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、黑色素瘤、结肠直肠癌、肉瘤(例如，尤因肉瘤)和生殖细胞肿瘤(例如，精原细胞瘤)。在一个特定的实施方式中，通过本文提供的方法治疗或处理的癌症通过功能获得性KIT突变或KIT的过度表达来表征。
在一个具体的实施方式中，本文描述的方法是用于治疗癌症(例如，GIST、肺癌或肉瘤(例如，尤因肉瘤))，其中所述方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在某些方面，本文还提供的是用于预防、治疗或处理癌症的一种或多种症状的方法，其中所述方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)，例如抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4，或其抗原结合片段或其缀合物。在一个具体的实施方式中，用于本文描述的治疗癌症的方法中的抗体包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的(L2)VL域和/或包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(H3)的VH域。在一个具体的实施方式中，用于本文描述的治疗癌症的方法中的抗体包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(L1)的VL域和/或包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(H4)的VH域。
在一个具体的实施方式中，本文描述的方法是用于治疗GIST，其中所述方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在某些方面，本文还提供的是用于预防、治疗或处理GIST的一种或多种症状的方法，其中所述方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在一个具体的实施方式中，用于本文描述的治疗GIST的方法中的抗体包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(L2)的VL域和/或包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(H3)的VH域。在一个具体的实施方式中，用于本文描述的治疗GIST的方法中的抗体包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(L1)的VL域和/或包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(H4)的VH域。
在一个具体的实施方式中，本文描述的方法是用于治疗肺癌(例如，小细胞肺癌)，其中所述方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在某些方面，本文还提供的是用于预防、治疗或处理肺癌(例如，小细胞肺癌)的一种或多种症状的方法，其中所述方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在一个具体的实施方式中，用于治疗肺癌(例如，小细胞肺癌)的方法中的抗体包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(L2)的VL域和/或包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(H3)的VH域。在一个具体的实施方式中，用于治疗肺癌(例如，小细胞肺癌)的方法中的抗体包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(L1)的VL域和/或包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(H4)的VH域。
在一个具体的实施方式中，本文描述的方法是用于治疗黑色素瘤，其中所述方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在某些方面，本文还提供的是用于预防、治疗或处理黑色素瘤的一种或多种症状的方法，其中所述方法包括向有其需要的对象给予治疗有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在一个具体的实施方式中，用于本文描述的治疗黑色素瘤的方法中的抗体包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(L2)的VL域和/或包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(H3)的VH域。在一个具体的实施方式中，用于本文描述的治疗黑色素瘤的方法中的抗体包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(L1)的VL域和/或包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(H4)的VH域。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法进行治疗的癌症可以是任何类型的癌症，其包含表达细胞表面KIT或其突变形式的癌症或肿瘤细胞，其可通过本领域技术人员已知的任何组织学或细胞学方法来证实。
在某些实施方式中，癌症是转移性的。在某些实施方式中，癌症是已经通过局部侵袭或转移扩散到原始部位或器官外部的晚期癌症。
在特定的实施方式中，癌症是在对初始疗法作出反应之后(例如，在经外科手术切除肿瘤和外科手术后的辅助疗法之后)已在初始部位或在远端部位重新生长的复发性癌症。在有些实施方式中，癌症是即使抗肿瘤剂(例如化学治疗剂)正在给予或已经给予癌症患者但仍然进展的难治性癌症。难治性癌症的非限制性实例是对例如(甲磺酸伊马替尼)、(SU11248或舒尼替尼)、IRESSATM(吉非替尼(gefitinib))、(埃罗替尼(erlotinib))、(索拉非尼(sorafenib))或VOTRIENTTM(帕唑帕尼(pazopanib))等酪氨酸激酶抑制剂具有顽固性的难治性癌症。在有些实施方式中，癌症是在将放射疗法或化学疗法给予或已经给予癌症患者但仍然进展的难治性癌症。
在具体的实施方式中，本文提供的是用于治疗有其需要的患者的难治性癌症的方法，包括向所述患者给予治疗有效量的本文描述的抗体，其中所述难治性癌症对抗癌剂例如酪氨酸激酶抑制剂(例如，(甲磺酸伊马替尼)或(SU11248或舒尼替尼))具有顽固性或抗性。酪氨酸激酶(kinse)抑制剂的其它非限制性实例包括706和AMNI07(尼洛替尼(nilotinib))、RAD00I、PKC412、吉非替尼(gefitinib)(IRESSATM)、埃罗替尼(erlotinib)索拉非尼(sorafenib)帕唑帕尼(pazopanib)(VOTRIENTTM)、阿昔替尼(axitinib)、波舒替尼(bosutinib)、西地替尼(cediranib)(达沙替尼(dasatinib))、拉帕替尼(lapatinib)来他替尼(lestaurtinib)、尼拉替尼(neratinib)、尼洛替尼(nilotinib)司马沙尼(semaxanib)、托西尼布(toceranib)(PALLADIATM)、凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMATM)和伐他拉尼(vatalanib)。在某些实施方式中，所述难治性癌症最初对例如酪氨酸激酶抑制剂(例如，或SU11248(即，舒尼替尼))等抗癌剂有反应，但是已发展对该抗癌剂产生抗性。在某些实施方式中，对象具有KIT中的一个或多个赋予对例如酪氨酸激酶抑制剂等抗癌剂抗性的突变。
在特定的实施方式中，将本文描述的抗体给予先前已接受或目前正在接受一种或多种抗癌疗法的患者，所述一种或多种抗癌疗法例如化学治疗剂或酪氨酸激酶抑制剂(例如，(甲磺酸伊马替尼)、(SU11248或舒尼替尼)、IRESSATM(吉非替尼)、(埃罗替尼)、(索拉非尼)或VOTRIENTTM(帕唑帕尼))或组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如，伏立诺他或辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA))。在其它特定的实施方式中，将本文描述的抗体给予对例如酪氨酸激酶抑制剂等抗癌疗法具有或怀疑具有抗性或顽固性的患者，所述酪氨酸激酶抑制剂例如(甲磺酸伊马替尼)、(SU11248或舒尼替尼)、IRESSATM(吉非替尼)、(埃罗替尼)、(索拉非尼)或VOTRIENTTM(帕唑帕尼)。
在特定的实施方式中，将本文描述的抗体(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其缀合物)给予先前已接受或目前正在接受一种或多种抗癌疗法的患者，所述一种或多种抗癌疗法例如抗生长因子受体抗体(例如，抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗VEGFR抗体或抗KIT抗体)或抗生长因子抗体(例如，抗EGF抗体、抗VEGF抗体)。在其它特定的实施方式中，将本文描述的抗体给予对例如抗生长因子受体抗体(例如，抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗VEGFR抗体或抗KIT抗体)或抗生长因子抗体(例如，抗EGF抗体、抗VEGF抗体)等抗癌疗法具有或怀疑具有抗性或顽固性的患者。
在一个特定的实施方式中，本文描述的用于治疗或处理有其需要的对象的癌症的方法由于给予治疗有效量的本文描述的抗KIT抗体可达到以下效果中的至少一、二、三、四种或四种以上：(i)降低或改善癌症(例如，白血病、肺癌或胃肠基质癌)和/或与其相关的一种或多种症状的严重程度；(ii)减少与癌症(例如，白血病、肺癌或胃肠基质癌)相关的一种或多种症状的持续时间；(iii)防止肿瘤(例如，肺肿瘤或胃肠道间质瘤)的复发；(iv)使癌症(例如，白血病、肺癌或胃肠道间质瘤)和/或与其相关的一种或多种症状消退；(v)对象住院减少；(vi)住院长度缩短；(vii)对象生存期增加；(viii)抑制癌症(例如，白血病、肺癌或胃肠道间质瘤)和/或与其相关的一种或多种症状的进展；(ix)增强或改善其它疗法(例如，外科手术、辐射、化学疗法或其它酪氨酸激酶抑制剂)的治疗效果；(x)减少或消除癌细胞群体(例如，白血病细胞群体、肺癌细胞群体、胃肠道间质瘤细胞群体)；(xi)减少肿瘤或赘生物生长；(xii)肿瘤尺寸(例如，体积或直径)缩小；(xiii)新形成的肿瘤的形成减少；(xiv)根除、去除或控制原发性、局限性和/或转移性癌症；(xv)通过在手术之前减少肿瘤和/或水肿相关的血管形成而易于肿瘤切除；(xvi)降低转移瘤的数量或大小；(xvii)死亡率降低；(xviii)患者的无肿瘤存活率增加；(xvix)无复发生存期增加；(xx)缓解的患者数增加；(xxi)住院率降低；(xxii)肿瘤尺寸得以维持且不增加或增加小于给予标准疗法之后的肿瘤增加，如通过本领域技术人员可利用的常规方法所测量，例如计算机体层摄影术(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、动态对比度增强型MRI(DCE-MRI)或正电子发射体层摄影术(PET)扫描；(xxiii)防止与癌症相关的一种或多种症状的发展或发作；(xxiv)患者缓解时间长度增加；(xxv)与癌症相关的症状数量减少；(xxvi)癌症患者的无症状生存增加；(xxvii)降低患有癌症(例如，白血病、肺癌或胃肠基质癌)的对象的生物样本(例如，血浆、血清、脑脊液、尿液或任何其它生物体液)中的一种或多种炎性介质(例如，细胞因子或白介素)浓度；(xxviii)减少患有癌症(例如，白血病、肺癌或胃肠基质癌)的对象的血液中的循环肿瘤细胞(CTCs)；(xxix)肿瘤代谢或灌注抑制(例如，部分抑制)或降低；和(xxx)生活质量改善，如通过本领域所熟知的方法(例如，问卷调查)所评估。
在某些方面，本文提供的是用于杀死个体的癌细胞的方法，其中所述方法包括向有其需要的个体给予有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在某些方面，本文提供的是用于抑制个体的癌细胞生长或增殖的方法，其中所述方法包括向有其需要的个体给予有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。在某些实施方式中，达到癌细胞生长或增殖的部分抑制，例如癌细胞的生长或增殖被抑制至少约20％至约55％。
在某些方面，本文提供的是用于降低有其需要的个体的肿瘤尺寸或负荷的方法，其中所述方法包括向所述个体给予有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum17、Hum10、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段或其缀合物。
KIT相关紊乱或疾病的其它非限制性实例包括系统性肥大细胞紊乱(例如，肥大细胞增多症)、造血障碍、纤维化(例如，特发型肺纤维化(TPF)、硬皮病或骨髓纤维化)和炎症性病症(例如哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠疾病和变应性炎症)。
在一个特定的实施方式中，本文描述的用于治疗或处理有其需要的对象的KIT相关紊乱例如纤维化或炎症性病症(例如，哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠疾病和变应性炎症)的方法由于给予治疗有效量的本文描述的抗KIT抗体可达到以下效果中的至少一、二、三、四种或四种以上：(i)降低或改善纤维化或炎症性病症(例如，哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠疾病和变应性炎症)和/或与其相关的一种或多种症状的严重程度；(ii)减少与纤维化或炎症性病症(例如，哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠疾病和变应性炎症)相关的一种或多种症状的持续时间；(iii)防止纤维化或炎症性病症(例如，哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠疾病和变应性炎症)的复发；(iv)对象住院减少；(v)住院长度缩短；(vi)抑制(例如，部分抑制)纤维化或炎症性病症(例如，哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠疾病和变应性炎症)和/或与其相关的一种或多种症状的进展；(vii)增强或改善其它疗法(例如，抗炎疗法例如类固醇)的治疗效果；(viii)缓解的患者数增加(即，由无或最小与炎症性病症相关的症状表征的时间周期)；(ix)患者缓解时间长度增加；(x)住院率降低；(xi)减少与纤维化或炎症性病症(例如，哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠疾病和变应性炎症)相关的症状数量；(xii)降低患有纤维化或炎症性病症(例如，哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠疾病和变应性炎症)的对象的生物样本(例如，血浆、血清、脑脊液、尿液或任何其它生物体液)中的一种或多种炎性介质(例如，细胞因子或白介素)的浓度；和(xiii)生活质量改善，如通过本领域所熟知的方法(例如，问卷调查)所评估。
在某些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体可通过任何合适的方法给予有其需要的对象。给药方法的非限制性实例包括粘膜、真皮内、静脉内、肿瘤内、皮下、肌内递送和/或本文描述的或本领域已知的任何其它物理递送方法。在一个实施方式中，将抗KIT抗体或其药物组合物系统地(例如，胃肠外地)给予有其需要的对象。在另一个实施方式中，将抗KIT抗体或其药物组合物局部地(例如，肿瘤内地)给予有其需要的对象。每个剂量可以或者不可以通过相同的给药途径给予。在有些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体可以通过多种给药途径与相同或不同的本文描述的抗KIT抗体的其它剂量同时或相继给予。
当对疾病或其症状进行治疗时，该物质的给药典型地在疾病或其症状发作之后发生。当对疾病或其症状进行预防时，该物质的给药典型地在疾病或其症状发作之前发生。在某些实施方式中，将本文描述的抗KIT抗体预防性或治疗性给予对象。可将本文描述的抗KIT抗体预防性或治疗性给予对象以便预防、降低或改善KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)或其症状。
按照本文提供的用于治疗KIT相关紊乱或疾病的方法向有其需要的对象给予本文描述的抗KIT抗体或其药物组合物的给药剂量和频率应在有效的同时将副作用减至最小。欲给予具体对象的本文描述的抗KIT抗体或其药物组合物的准确剂量可由从业人员(practitioner)根据与需要治疗的对象相关的因素来确定。可考虑的因素包括疾病状态的严重程度、对象的一般健康状况、对象的年龄和体重、饮食、给药的时间和频率、与其它治疗剂或药物的组合、反应敏感性和对疗法的耐受性/反应。本文描述的抗KIT抗体或其药物组合物的给药剂量和频率可随时间做出调整以提供足够水平的抗KIT抗体或维持所需效果。
欲在制剂中使用的精确剂量也将取决于给药途径和KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)的严重性并且应当根据从业人员的判断和各患者的情形来决定。
在一个实施方式中，对于本文描述的抗KIT抗体而言，为了处理KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)而给予患者的剂量典型地为0.1mg/kg至100mg/kg患者体重。一般而言，人抗体比来自其它物种的抗体在人体内具有更长的半衰期，这是由于对外源多肽的免疫应答。因此，人抗体的较低剂量和较少给药频率经常是可能的。此外，可通过修饰(例如，脂质化)来增强抗体的摄取和组织渗透从而降低本文描述的抗体的给药剂量和频率。
在一个实施方式中，给予近似0.001mg/kg(mg抗体/kg对象体重)至近似500mg/kg本文描述的抗KIT抗体以处理KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)。
在有些实施方式中，本文提供的抗体的有效量为约0.01mg至约1,000mg。在具体的实施方式中，本文描述的抗KIT抗体的“有效量”是指足以达到以下效果的至少一、二、三、四种或四种以上的本文描述的抗KIT抗体的量：(i)降低或改善KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)和/或与其相关的一种或多种症状的严重程度；(ii)减少与KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)相关的一种或多种症状的持续时间；(iii)防止肿瘤(例如，胃肠道间质瘤)的复发；(iv)使KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)和/或与其相关的一种或多种症状消退；(v)对象住院减少；(vi)住院长度缩短；(vii)对象生存期增加；(viii)抑制(例如，部分抑制)KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)和/或与其相关的一种或多种症状的进展；(ix)增强或改善其它疗法的治疗效果；(x)减少或消除癌细胞群体(例如，白血病细胞群体、肺癌细胞群体、胃肠基质癌细胞群体)；(xi)减少肿瘤或赘生物的生长；(xii)肿瘤尺寸(例如，体积或直径)缩小；(xiii)新形成的肿瘤的形成减少；(xiv)根除、去除或控制原发性、局限性和/或转移性癌症；(xv)通过在手术之前减少肿瘤和/或水肿相关的血管形成而易于肿瘤切除；(xvi)降低转移瘤的数量或大小；(xvii)死亡率降低；(xviii)患者的无肿瘤存活率增加；(xvix)无复发生存期增加；(xx)缓解的患者数增加；(xxi)住院率降低；(xxii)肿瘤尺寸得以维持且不增加或增加小于给予标准疗法之后的肿瘤增加，如通过本领域技术人员可利用的常规方法所测量，例如计算机体层摄影术(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、动态对比度增强型MRI(DCE-MRI)或正电子发射体层摄影术(PET)扫描；(xxiii)防止与癌症相关的一种或多种症状的发展或发作；(xxiv)患者缓解时间长度增加；(xxv)与癌症相关的症状数量减少；(xxvi)癌症患者的无症状生存增加；(xxvii)降低患有KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)的对象的生物样本(例如，血浆、血清、脑脊液、尿液或任何其它生物体液)中的一种或多种炎性介质(例如，细胞因子或白介素)的浓度；(xxviii)减少患有癌症的对象的血液中的循环肿瘤细胞(CTCs)；(xxix)肿瘤代谢或灌注抑制(例如，部分抑制)或降低；和(xxx)生活质量改善，如通过本领域所熟知的方法(例如，问卷调查)所评估。在有些实施方式中，如本文所用的“有效量”也指本文描述的抗体达到规定结果(例如，抑制细胞的一种或多种KIT生物活性，例如抑制细胞增殖)的量。
在有些实施方式中，在必要时给予本文描述的抗KIT抗体，例如每周、每两周(即，每两周一次)、每月、每两个月、每三个月等等，如由内科医师决定。
在有些实施方式中，将本文描述的抗KIT抗体的单剂量给予患者一次或多次以阻碍、预防、处理、治疗和/或改善KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)。
在特定的实施方式中，将抗KIT抗体或其药物组合物按照本文给出的用于治疗KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)的方法以循环方式给予对象，其中在一段时间内给予所述抗KIT抗体或药物组合物，然后是一段休息时间(即，在一段时间内不给予抗KIT抗体或药物组合物)。
另外，本文给出的是用于治疗KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)的联合疗法，其包括将本文描述的抗KIT抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物与一种或多种另外的疗法(例如，化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂、PGP抑制剂、HSP-90抑制剂、蛋白体抑制剂或组蛋白脱乙酰酶抑制剂)组合给予有其需要的对象。在一个具体的实施方式中，本文给出的是用于治疗KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)的联合疗法，其包括将一定量(例如，治疗有效量或次最佳量)的本文描述的抗KIT抗体与一定量(例如，治疗有效量或次最佳量)的其它疗法(例如，化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂或组蛋白脱乙酰酶抑制剂)组合给予有其需要的对象。
在联合疗法中，一种或多种本文提供的抗KIT抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物可以在给予一种或多种用于治疗、处理和/或缓解KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)的另外的疗法(例如，药剂、外科手术或放疗)之前、同时或之后给予。术语“联合疗法”的使用并不限制给予对象一种或多种抗KIT抗体和一种或多种另外的疗法的顺序。在具体的实施方式中，所述疗法可以连续地或序贯地给予。
在具体的实施方式中，一种或多种本文提供的抗KIT抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物可以在给予一种或多种用于治疗、处理和/或缓解KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症，例如GIST、黑色素瘤或肺癌)的另外的疗法例如抗癌剂，例如酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼或舒尼替尼(SUTENT)或组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如，伏立诺他或辛二酰苯胺异羟肟酸)之前、同时或之后给予。
在另一个具体的实施方式中，本文给出的是用于治疗KIT相关紊乱或疾病(例如，癌症、炎症性病症、纤维化)的联合疗法，其包括将一定量的本文描述的抗KIT抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物与一定量的其它疗法(例如，化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂或组蛋白脱乙酰酶抑制剂)组合给予有其需要的对象。在一个具体的实施方式中，所述联合疗法导致产生协同效应。在某些实施方式中，所述联合疗法导致产生相加效应。
在一个具体的实施方式中，本文给出的是用于治疗癌症的联合疗法，其包括将一定量的本文描述的抗KIT抗体与一定量的其它疗法(例如，外科手术、辐射、干细胞移植法或化学疗法)组合给予有其需要的对象。在一个具体的实施方式中，所述联合疗法导致产生协同效应。在另一个具体的实施方式中，所述联合疗法导致产生相加效应。
在一个具体的实施方式中，本文给出的是用于治疗炎症性病症的联合疗法，其包括将一定量的本文描述的抗KIT抗体与其它疗法(例如，抗炎疗法，例如类固醇疗法)组合给予有其需要的对象。在一个具体的实施方式中，所述联合疗法导致产生协同效应。在另一个具体的实施方式中，所述联合疗法导致产生相加效应。
与本文描述的抗体联合使用的其它疗法的非限制性实例包括免疫特异性结合于KIT的不同表位的另一种抗KIT抗体、一种或多种其它抗体(例如，抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗VEGF抗体)、抗炎疗法、化学疗法(例如，微管解组装阻断剂、抗代谢药、拓扑异构酶(topisomerase)抑制剂和DNA交联剂或损伤剂)、辐射、外科手术、PGP抑制剂(例如，环孢菌素A(cyclosporine A)、维拉帕米(Verapamil))、HSP-90抑制剂(例如，17-AAG、STA-9090)、蛋白体抑制剂(例如，硼替佐米(Bortezomib))和酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼舒尼替尼或SU11248)、吉非替尼(IRESSATM)、埃罗替尼索拉非尼帕唑帕尼(VOTRIENTTM)、阿昔替尼、波舒替尼、西地替尼(达沙替尼)、拉帕替尼来他替尼、尼拉替尼、尼洛替尼司马沙尼、托西尼布(PALLADIATM)、凡德他尼(ZACTIMATM)和伐他拉尼)。在一个具体的实施方式中，与本文描述的抗体联合使用的另一种疗法是甲磺酸伊马替尼。
与本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物联合使用的另一种疗法的其它非限制性实例包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如伏立诺他或辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)或具有如下所示的化学式(I)、(II)或(III)的化合物。在一个具体的实施方式中，本文提供的是用于治疗癌症(例如，GIST或肺癌)的方法，包括(i)给予本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物；和(ii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如伏立诺他或辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)或具有如下所示的化学式(I)、(II)或(III)的化合物。
在一个实施方式中，本文提供的用于本文描述的方法中的与抗KIT抗体组合的是式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R1为羟基氨基；
R2和R3中的每一个独立地为彼此相同或不同、取代的或未取代的、支链的或非支链的，并且为氢、羟基、烷基、烯基、环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基或吡啶；或者，R2和R3结合在一起形成哌啶；和
n为5到7的整数。
在一个实施方式中，R2为氢原子，R3为取代或未取代的苯基。在某一个实施方式中，R3为被以下基团取代的苯基：甲基、氰基、硝基、三氟甲基、氨基、氨基羰基、甲基氰基、氯、氟、溴、碘、2,3-二氟、2,4-二氟、2,5-二氟、3,4-二氟、3,5-二氟、2,6-二氟、1,2,3-三氟、2,3,6-三氟、2,4,6-三氟、3,4,5-三氟、2,3,5,6-四氟、2,3,4,5,6-五氟、叠氮基、己基、叔丁基、苯基、羧基、羟基、甲氧基、苯氧基、苄氧基、苯基氨基氧基、苯基氨基羰基、甲氧基羰基、甲基氨基羰基、二甲基氨基、二甲基氨基羰基或羟基氨基羰基。在另一个实施方式中，R3为未取代的苯基。在一个进一步的实施方式中，n为6。
在一个实施方式中，本文提供的用于本文描述的方法中的与抗KIT抗体组合的是式(II)的化合物
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中n为5到8的整数。在一个实施方式中，n为6。
在一个实施方式中，本文提供的用于本文描述的方法中的与抗KIT抗体组合的是式(III)的化合物(SAHA)
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
式I-III的化合物可根据美国再授予的专利号RE38,506和美国专利号6,087,367中所描述的方法合成，所述各专利以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方式中，本文提供的用于本文描述的方法中的与抗KIT抗体组合的是SAHA的I型多晶型物，其特征在于与美国专利号7,456,219的图13A中所阐述者实质上类似的X-射线衍射图案，该专利以全文引用的方式并入本文中。在一个实施方式中，SAHA的I型多晶型物的特征在于包括在约9.0、9.4、17.5、19.4、20.0、24.0、24.4、24.8、25.0、28.0和43.3度2θ处的特征性峰的X-射线衍射图案，如用Siemens D500自动化粉末衍射计(范围：4-40度2θ；来源：Cu；λ＝1.54埃，50kV，40mA)所测量。
在某一个实施方式中，SAHA的I型多晶型物的特征在于在约164.4±2.0℃下具有单一最大值的差示扫描量热法(DSC)温谱图，如通过Perkins Elmer DSC 6仪器以10℃/min的加热速率自50℃至超过所观察的熔融温度至少30℃所测量。
SAHA的I型多晶型物可根据美国专利号7,456,219中所描述的方法合成。
在一个实施方式中，本文提供的是包含赖氨酸和SAHA的结晶组合物，其特征在于与国际专利申请公布号WO2008/042146的图1中所阐述的X-射线衍射图案实质上类似的X-射线衍射图案，该专利申请以全文引用的方式并入本文中。在另一个实施方式中，所述结晶组合物的特征在于包括在约6.8、20.1和23.2度2θ处的特征性峰的X-射线衍射图案，如用PANanalytical X’Pert Pro X-射线粉末衍射计(范围：2-40度2θ；来源：Cu Kα1和Kα2)所测量。在另一个实施方式中，所述结晶组合物的特征在于包括在约6.8、12.6、18.7、20.123.2和24.0度2θ处的特征性峰的X-射线衍射图案，如用PANanalytical X’Pert Pro X-射线粉末衍射计(范围：2-40度2θ；来源：Cu Kα1和Kα2)所测量。在另一个实施方式中，所述结晶组合物的特征在于包括在约6.8、12.0、12.6、16.4、18.7、20.123.2、24.0、29.3度2θ处的特征性峰的X-射线衍射图案，如用PANanalytical X’Pert Pro X-射线粉末衍射计(范围：2-40度2θ；来源：Cu Kα1和Kα2)所测量。
在某一个实施方式中，所述包含赖氨酸和SAHA的结晶组合物的特征在于差示扫描量热法(DSC)温谱图，其中所述结晶(crytalline)组合物的吸热曲线表现出近似182℃的外推起始温度，如通过TA仪器Q1000差示扫描量热计以10℃/min的加热速率自室温至300℃所测量。
所述包含赖氨酸和SAHA的结晶组合物可以根据国际专利申请公布号WO2008/042146中所描述的方法合成。
在某些实施方式中，本文描述的联合疗法导致产生协同作用或协同效应。在一个具体的实施方式中，联合疗法的协同效应使得可以给对象使用较低剂量(例如，次最佳剂量)的本文描述的抗KIT抗体和/或另外的疗法和/或以较少频率给予本文描述的抗KIT抗体或另外疗法。在某些实施方式中，使用较低剂量的抗KIT抗体和/或另外疗法和/或以较少频率给予抗KIT抗体或所述另外疗法的能力降低了与分别给予对象抗KIT抗体或所述另外疗法相关的毒性，但不降低与分别给予抗KIT抗体或所述另外疗法在治疗KIT相关紊乱或疾病的中的功效。在有些实施方式中，协同效应导致改善本文描述的抗KIT抗体和/或所述另外疗法在治疗KIT相关紊乱或疾病中的功效。在有些实施方式中，本文描述的抗KIT抗体和一种或多种另外疗法的组合的协同效应避免或降低与使用任何单一疗法相关的不利或不合需要的副作用
本文提供的是用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的方法，包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物接触。本文还提供的是用于诱导或增强表达KIT的细胞中的细胞凋亡的方法，包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触。本文还提供的是用于诱导或增强表达KIT的细胞中的细胞分化的方法，包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触。
KIT活性和例如抗体对KIT活性的影响可以使用例如基于细胞的测定(例如本文描述的那些)以常规方式进行评估。
可通过本文提供的方法抑制的KIT活性的非限制性实例可包括本领域已知的或描述的任何KIT活性，例如KIT受体二聚化、KIT受体磷酸化(酪氨酸磷酸化)、KIT受体下游的信号传导(例如，Stat、AKT、MAPK或Ras信号传导)、KIT配体(例如，SCF)诱导的转录调节(例如，SCF诱导的c-Myc转录活化)、细胞增殖的诱导或增强或细胞存活。
在某些实施方式中，用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物接触，从而足以抑制或拮抗KIT活性，抑制或拮抗程度为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的和/或本领域技术人员已知的方法(例如，ELISA)所评估。在某些实施方式中，用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物接触，从而足以抑制或拮抗KIT活性，抑制或拮抗程度为至少约25％、35％、45％、50％、55％或65％，如通过本文描述的和/或本领域技术人员已知的方法(例如，ELISA)所评估。KIT活性的非限制性实例可包括KIT受体磷酸化、KIT受体信号传导、KIT配体(例如，SCF)介导的细胞增殖、KIT配体(例如，SCF)介导的细胞存活和KIT靶基因(例如，c-Myc)的转录活化。
在一个特定的实施方式中，用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体(例如，人源化抗KIT抗体)(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，例如Hum10、Hum17、Hum8或Hum4)或其抗原结合片段(例如，其KIT-结合片段)或其抗体缀合物接触，从而足以抑制(例如，部分抑制)或拮抗下游KIT信号传导，例如Src家族激酶的成员、PI3-激酶或Ras-MAPK的信号传导。
在另一个特定的实施方式中，用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的一种或多种KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以抑制或拮抗下游KIT信号传导，例如MAPK的磷酸化、AKT的磷酸化或Stat1、Stat3或Stat5的磷酸化。
在某些实施方式中，用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以抑制或降低AKT的磷酸化(例如，KIT配体(例如，SCF)诱导的AKT的磷酸化)，抑制或降低程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的蛋白质印迹法(Western blot)或ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。在某些实施方式中，用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以抑制或降低AKT的磷酸化(例如，KIT配体(例如，SCF)诱导的AKT的磷酸化)，抑制或降低程度为至少约25％、35％、45％、55％或65％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，如第6节中描述的蛋白质印迹法或ELISA测定法或免疫印迹测定法)所评估。
在某些方面，用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞(例如，癌细胞)中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以抑制所述细胞的增殖。细胞增殖测定在本领域有描述并且可由本领域技术人员容易地进行。例如，细胞增殖可以如下测定：通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)掺入(参见例如，Hoshino等人,1986,Int.J.Cancer 38,369；Campana等人,1988,J.Immunol.Meth.107:79)或(3H)胸苷掺入(参见例如，Blechman等人,Cell,1995,80:103-113；Chen,J.,1996,Oncogene13:1395-403；Jeoung,J.,1995,J.Biol.Chem.270:1836773)，通过在各种时间间隔(例如，12小时或24小时的间隔)进行直接细胞计数，或者通过检测已知基因例如原癌基因(例如，fos、myc)或细胞周期标志物(Rb、cdc2、细胞周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)的转录、翻译或活性变化。这样的蛋白质和mRNA的活性水平可通过本领域所熟知的任何方法来测定。例如，可通过已知的免疫诊断方法(例如ELISA、蛋白质印迹法或免疫沉淀法)使用抗体(包括市售的抗体)来定量蛋白质。可通过本领域所熟知的和常规的方法，例如使用RNA分析法、RNase保护或连同反转录一起的聚合酶链式反应来定量mRNA。
在具体的实施方式中，用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞(例如，癌细胞)中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以抑制细胞增殖，抑制程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，BrdU掺入测定法)所评估。在具体的实施方式中，用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以抑制细胞增殖，抑制程度为至少约25％、35％、45％、55％或65％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，BrdU掺入测定法)所评估。在具体的实施方式中，用于抑制或拮抗表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以抑制细胞增殖，抑制程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，BrdU掺入测定法)所评估。
在某些方面，本文提供的用于抑制表达KIT的细胞(例如，癌细胞)中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以降低或抑制细胞存活。细胞存活测定在本领域有描述并且可由本领域技术人员容易地进行。例如，细胞活力可通过使用锥虫蓝染色或本领域已知的其它细胞死亡或活力标志物来评估。在一个具体的实施方式中，测量细胞ATP的水平以确定细胞活力。在具体的实施方式中，细胞活力如下测量：在三天或七天周期内，使用本领域的测定标准品，例如测量细胞内ATP水平的CellTiter-Glo Assay Kit(Promega)。细胞ATP降低指示细胞毒性效应。在另一个具体的实施方式中，细胞活力可在中性红摄取测定(neutral reduptake assay)中进行测量。在其它的实施方式中，形态学变化的肉眼观察可包括增大、颗粒度、具有粗糙边缘的细胞、膜状外观、变圆、自孔表面脱离或其它变化。给予这些变化以下名称：T(100％毒性)、PVH(部分毒性–极严重–80％)、PH(部分毒性–严重–60％)、P(部分毒性–40％)、Ps(部分毒性–轻微–20％)或0(无毒性–0％)，与所见到的细胞毒性程度相符。50％细胞抑制性(细胞毒性)浓度(IC50)通过这些数据的回归分析求出。
在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以降低或抑制细胞存活，降低或抑制程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，锥虫蓝排除测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以降低或抑制细胞存活，降低或抑制程度为至少约25％、35％、45％、55％或65％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，锥虫蓝排除测定法)所评估。在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以降低或抑制细胞存活，降低或抑制程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，锥虫蓝测定法)所评估。
在一个具体的实施方式中，本文提供的用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以诱导细胞凋亡(即，程序性细胞死亡)。用于检测细胞凋亡的方法在本领域有描述并且可由本领域技术人员容易地进行。例如，可使用流式细胞术来检测经历细胞凋亡的细胞中的活化胱天蛋白酶3(一种介导细胞凋亡的酶)，或者可使用蛋白质印迹法来检测聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的裂解(参见例如，Smolich等人,Blood,2001,97:1413-1421)。PARP的裂解为细胞凋亡的指标。在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制或拮抗表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以诱导或增强细胞凋亡，诱导或增强程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，检测活化胱天蛋白酶3的流式细胞术)所评估。在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制或拮抗表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以诱导或增强细胞凋亡，诱导或增强程度为至少约25％、35％、45％、55％或65％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，检测活化的胱天蛋白酶3的流式细胞术)所评估。在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的抗体方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以诱导或增强细胞凋亡，诱导或增强程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，检测活化的胱天蛋白酶3的流式细胞术)所评估。
在一个具体的实施方式中，本文提供的用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以诱导分化。用于检测分化的方法在本领域有描述并且可由本领域技术人员容易地进行。例如，可使用流式细胞术来检测与本文描述的抗体接触的细胞中的一种或多种分化标志物(markers)的表达或缺乏一种或多种未分化标志物的表达。同样，也可使用蛋白质印迹法来检测分化标志物。合适的分化标志物和未分化标志物已有描述并且为本领域技术人员已知的。
在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以诱导分化，诱导程度为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术)所评估。在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制(例如，部分抑制)表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以诱导分化，诱导程度为至少约25％、35％、45％、55％或65％，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术)所评估。在具体的实施方式中，本文提供的用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的抗体接触，从而足以诱导分化，诱导程度为至少约1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的方法(例如，流式细胞术)所评估。
可通过本文描述的方法分化的细胞的非限制性实例包括干细胞(例如，胚胎干细胞、造血干细胞)和祖细胞。示例性的造血干细胞标志物包括CD38、CD34、CD59、CD133、Sca-1和ABCG2。神经干细胞标志物的非限制性实例包括巢蛋白(Nestin)、PSA-NCAM、p75神经营养蛋白R(Neurotrophin R)和波形蛋白(Vimentin)。干细胞标志物的其它非限制性实例包括Oct4、Sox2、Klf4、LIN28、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、Notch和Wnt。
5.7诊断方法
免疫特异性结合于KIT抗原(例如，KIT(例如，人KIT)的D4区)的标记的或别的可检测的抗体可用于诊断目的以检测、诊断或监测KIT相关疾病。
本文提供的是用于检测获自患有KIT相关紊乱或疾病的患者的样品中的KIT表达的方法。在一个特定的实施方式中，用于检测获自患者的样品中的KIT表达的方法包括使该样品与本文描述的抗KIT抗体接触并检测该样品中的KIT的表达水平，例如通过将抗KIT抗体与KIT的结合与KIT表达水平相关联。用于检测的方法为本领域技术人员已知的。
在某些方面，本文提供的是用于诊断患有KIT相关紊乱或疾病的患者的方法。在某一个方面，用于诊断患有KIT相关紊乱或疾病的对象的方法包括使获自所述对象的样品与本文描述的抗KIT抗体(或其抗原结合片段)接触并检测该样品中的KIT的表达水平。在某些实施方式中，用于诊断患有KIT相关紊乱或疾病的患者的方法是体外方法。在特定的实施方式中，用于诊断患有KIT相关紊乱或疾病的患者的方法是离体方法。
在某些方面，本文提供的是用于检测KIT相关疾病的方法，包括：(a)使用一种或多种本文描述的抗体测定对象的细胞或组织样品中的KIT抗原的表达；和(b)将KIT抗原的水平与对照水平(例如，正常组织样品(例如，来自未患KIT相关疾病的患者或者在疾病发作之前来自同一患者)中的水平)进行比较，与KIT抗原的对照水平相比，KIT抗原的测量水平增加指示KIT相关疾病。
用于检测的方法为本领域技术人员已知的。例如，可将抗KIT抗体与可检测分子(例如，如第5.1.1节所描述)缀合，并且可使用标准技术(例如，显微镜术)显现可检测分子。可使用本文描述的抗体，并使用如本文描述的或本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法(例如，参见Jalkanen等人,1985,J.Cell.Biol.101:976-985；和Jalkanen等人,1987,J.Cell.Biol.105:3087-3096)来测定生物样品中的KIT抗原水平。可用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定法，例如ELISA和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记为本领域已知的并且包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(125I,121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记，例如鲁米诺(luminol)；和荧光标记，例如荧光素和罗丹明(rhodamine)，和生物素。在具体的实施方式中，本文描述的诊断方法包括使用不与可检测标志物缀合的裸抗体或未标记抗体并且例如通过使用可被标记的第二抗体间接检测裸抗体或未标记抗体。
在某些实施方式中，相对于正常对照样品(例如，得自未罹患KIT相关紊乱或疾病的健康患者的样品)，样品中的KIT的高表达指示该患者罹患KIT相关紊乱或疾病。
用于在获自患者的样品中诊断患有KIT相关紊乱或疾病(例如癌症)的患者的方法包括使该样品与本文描述的抗KIT抗体接触并检测该样品中的KIT的表达水平。在某些实施方式中，相对于正常对照样品(例如，得自未罹患KIT相关紊乱或疾病的健康患者的样品)，样品中的KIT的高表达指示该患者罹患KIT相关紊乱或疾病。
在某些实施方式中，样品可以是来源于患者肿瘤或包含来自患者肿瘤的肿瘤细胞的肿瘤样品。本文中的肿瘤样品的实例包括但不限于肿瘤生物活检样品、循环肿瘤细胞、循环血浆蛋白、腹水液、来源于肿瘤或表现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及防腐保存的肿瘤样品(例如福尔马林固定的肿瘤样品、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品)。在某些实施方式中，样品是已使用固定剂经过组织学防腐处理的固定的肿瘤样品。在有些实施方式中，样品是已使用甲醛作为固定剂进行防腐处理的福尔马林固定的肿瘤样品。在某些实施方式中，样品是由一层坚固和一般很硬的介质(例如石蜡、蜡、火棉胶(celloidin)或树脂)围绕的包埋的肿瘤样品。包埋使得切割薄切片成为可能，以用于显微镜检查或用于产生组织微阵列(TMAs)。在特定的实施方式中，样品是由来源于石油的固态烃的纯化混合物围绕的石蜡包埋的肿瘤样品。在某些实施方式中，样品是经冷冻或已冷冻的冷冻的肿瘤样品。在一个具体的实施方式中，将样品(例如，石蜡包埋的样品或冷冻的样品)切片。
在某些方面，显示KIT表达、扩增或活化的癌症或生物样品是在诊断试验中表达(包括过度表达)KIT受体、具有扩增的KIT基因和/或用别的方式证明KIT受体的活化或磷酸化的样品。
本文还提供的是人类的KIT相关疾病的检测和诊断。在一个实施方式中，诊断包括：a)给予(例如，胃肠外、皮下或腹膜内)对象有效量的本文描述的经标记的抗体；b)在给予后等待一段时间间隔以允许标记的抗体优先在对象体内表达KIT抗原的部位浓缩(和对于未结合的经标记的分子清除至背景水平)；c)测定背景水平；和d)检测对象中的经标记的抗体，使得检测到标记的抗体超出背景水平指示对象患有KIT介导的疾病。背景水平可通过各种方法来测定，所述方法包括将所检测的经标记分子的量与先前针对特定系统测定的标准值进行比较。
在本领域中应当理解，对象体型和所用的造影系统将决定产生诊断影像所需的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人对象而言，所注射的放射活性量将通常在约5-20毫居里99Tc的范围内。所述经标记的抗体随后将优先积聚在细胞中含有特定蛋白质的位置。活体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等人,“Immunopharmacokinetics of RadiolabeledAntibodies and Their Fragments(放射性标记的抗体及其片段的)免疫药代动力学.”(第13章,Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer(肿瘤成像：癌症的放射化学检测),S.W.Burchiel和B.A.Rhodes(编著),MassonPublishing Inc.(1982))。
根据若干变量(包括所用的标记类型和给药方式)，给药后用于允许经标记的抗体优先在对象的部位浓缩且使未结合的经标记的抗体清除至背景水平的时间间隔为6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一个实施方式中，给药后的时间间隔为5至20天或5至10天。
在一个实施方式中，监测KIT介导的疾病通过重复用于诊断KIT介导的疾病的方法来进行，例如初次诊断后一个月、初次诊断后六个月、初次诊断后一年，等等。
可使用本领域已知的活体内扫描的方法来检测对象中的经标记的分子的存在。这些方法取决于所使用的标记类型。技术人员将能够确定用于检测特定标记的适当方法。可用于本发明的诊断方法中的方法和装置包括但不限于计算机体层摄影术(CT)、全身扫描(例如正电子发射体层摄影术(PET))、磁共振成像(MRI)和回波描记术。
在一个具体的实施方式中，所述分子用放射性同位素标记并且使用辐射反应性手术仪器在患者中进行检测(Thurston等人,美国专利号5,441,050)。在另一个实施方式中，所述分子用荧光化合物标记并且使用荧光反应扫描仪器在患者中进行检测。在另一个实施方式中，所述分子用正电子发射金属标记并且使用正电子发射-体层摄影术在患者中进行检测。在又一个实施方式中，所述分子用顺磁性标记标记并且使用磁共振成像(MRI)在患者中进行检测。
6.实施例
在本节(即，第6节)中提供实施例作为说明而非作为限制。
6.1实施例1：产生抗KIT抗体
使用复合人抗体TM(Composite Human AntibodyTM)技术(Antitope Ltd.,Cambridge,United Kingdom)及免疫特异性结合于人KIT D4区的小鼠抗体37M的氨基酸序列(2012年1月25日申请的美国专利申请号13/358,210)产生具有人氨基酸序列的抗KIT抗体来设计抗KIT抗体，其中所述抗体结合人KIT D4区。选择五个重链可变区序列(H1、H2、H3、H4和H5)和四个轻链可变区序列(L1、L2、L3和L4)用于基因合成、在哺乳动物细胞中表达并测试与重组KIT域的直接结合以及在阻断干细胞因子(SCF)诱导的磷酸化中的活性。H1-H5、L1-L4的氨基酸序列及编码它们的核酸序列示于图3A-3I。
将编码H(重链)和L(轻链)可变区氨基酸序列的核酸分子直接克隆到人IgG1VH链和人Vκ链的表达载体中。所有构建体都通过测序证实。将编码IgG1VH(H1-H5)和Vκ(L1-L4)链的载体以不同的组合转染到CHO细胞(例如，CHOdhfr-细胞)中，产生20种抗体(参见表4,抗体Hum1-Hum20)。将编码嵌合抗体37C(一种具有人恒定域和小鼠37M可变域的嵌合抗体)的载体(2012年1月25日申请的美国专利申请号13/358,210)也转染到CHO细胞中。将用非线性化DNA瞬时转染的细胞在收获上清液之前孵育四天，上清液直接用于测定或用于纯化。使用线性化DNA进行稳定转染以建立表达所述抗体的细胞系并随后进行药物选择。使用IgG1ELISA测试各构建体的来自药物抗性菌落的上清液的IgG效价，并且基于该上清液中超过背景(通常>0.1μg/ml)IgG效价来选择最佳表达系，并且经由24孔和6孔板、T75和T175组织培养瓶在药物选择存在下扩充，其中在每个阶段筛选IgG表达。0.1-1μg/ml的效价对于非优化CHOdhfr-细胞系是典型的。抗体表达通过考马斯蓝(Coomassie Blue)染色的SDS–PAGE证实。
在这些特定细胞中，大部分抗体以在0.1-1.0μg/ml的范围内的效价表达，且具体地说，抗体Hum4以1.2μg/ml的效价表达。
6.2实施例2：与人KIT Ig样域D4/D5的结合亲和力
抗KIT抗体与靶抗原KIT Ig样域D4/D5的结合亲和力通过直接结合ELISA来评估。将嵌合抗体37C和Hum1-Hum20抗体的近似1x10-8M至4.7x10-13M的稀释系列(三倍)在室温下在平底微量滴定板上孵育1小时，该平底微量滴定板用在硼酸盐缓冲液中稀释的并用1％BSA预先阻断1小时的50ng/孔重组c-Kit Ig样域D4/D5(参见图2)预包被。结合的抗体用抗人Ig-HRP检测，然后使用TMB底物进行检测。结果在下表7中给出。
表7：抗KIT抗体的结合表征。
计算抗KIT抗体Hum1-20的EC50值(pM)，且将抗体的值针对相应实验中嵌合抗体37C的值归一化。值愈高指示结合活性愈强。各实验中嵌合抗体的实际EC50值连同平均化以得到该值的重复实验次数一起显示在表的底部。(上清液)＝含有抗体的上清液；(经纯化)＝自上清液中纯化的抗体。
某些抗体以及嵌合抗体37C的结合活性通过固相ELISA使用含有人KIT的D4/D5区(参见图2)的抗原进一步表征。下面描述了用于固相ELISA实验的通用方案。
材料：
·重组抗原：KIT的细胞外区的第四和第五重组IG域
·TBS-T：50mM Tris pH 7.4,150mM NaCl,0.1％吐温20
·TBS：50mM Tris pH 7.4,150mM NaCl
·阻断溶液：1％牛血清白蛋白(BSA)的TBS
·稀释缓冲液：1％BSA的TBS-T
·检测抗体溶液：与辣根过氧化酶特异性缀合的山羊抗小鼠IgG HRP抗体和Pierce山羊抗人F(ab’)2(Thermo scientific 31414)
·检测底物：TMB(3,3’,5,5’–四甲基联苯胺)底物试剂盒(Thermoscientific#34021)
使对应于KIT细胞外域的D4/D5区(参见图2)的重组抗原吸附在96孔微量滴定板上。具体地说，将重组抗原(5μg)稀释在10mL的硼酸盐缓冲液中，且向96孔板的各孔中加入100μL的抗原溶液并且于4℃孵育过夜。
抗体样品的系列稀释液用稀释缓冲液制备供用于ELISA。
ELISA：在用TBS-T漂洗一次后，将阻断缓冲液(200μL)加到该板的含所吸附抗原的各孔中并且在室温下孵育一小时。然后，移除阻断缓冲液，且将试验抗体和对照的连续稀释溶液以50μL的体积加到该板中并在室温下孵育一小时。移除抗体溶液，且在培养板洗涤器上用100μL的洗涤缓冲液将该板洗涤三次。最后一次洗涤后，将该板吸干。第二抗体溶液进行1:8000稀释后以100μL的体积加到各孔中并且允许在室温下孵育一小时。移除经稀释的第二抗体溶液，且在培养板洗涤器上用100μL的洗涤缓冲液将该板洗涤三次。然后，将新鲜混合的TMB底物溶液以100μL的体积加到各孔中并且允许在室温下孵育30分钟。随后，向各孔中加入100μL 2NH2SO4并且立即在培养板读数器上读数。无关抗体充当阴性对照，且针对KIT的细胞外区的D4和/或D5域的抗KIT抗体充当阳性对照。在450nm的波长下获得各样品的OD值。
使用Graph Pad Prism和Excel分析结果，以获得50％结合于抗原时的抗体浓度。
图5描绘抗KIT抗体的OD450vs对数(log)浓度(M)绘制的图。对于抗体37M的嵌合体和抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10与人KIT的D4/D5区的结合亲和力，50％结合时的有效浓度(EC50)经计算分别近似为12pM、6.6pM、11pM、7.5pM和23pM。
图5中给出的结果显示，抗体37M的嵌合体和抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10的结合亲和力相当。
另外的结合测定证明，Hum17、Hum8、Hum4和Hum10表现出除人KIT以外还与犬KIT和猴KIT特异性结合，但它们不表现出与鼠KIT特异性结合。
6.3实施例3：抗KIT抗体对CHO细胞上表达的人KIT的结合亲和力
为了证实抗KIT抗体可以与细胞表面上表达的KIT结合，使用外源性表达(CHO/KIT-WT)和不外源性表达(亲本CHO细胞)全长、野生型人KIT受体的CHO细胞进行流式细胞术测定。简而言之，将亲本CHO细胞和CHO/KIT-WT细胞洗涤后与0.01nM、0.1nM、1nM或10nM的嵌合(人-小鼠)37M抗体、抗体Hum17、Hum8、Hum4或Hum10、阴性对照同种型IgG抗体或作为阳性对照的商业抗KIT抗体一起孵育。加工处理样品以进行流式细胞术分析。更具体地说，使用EDTA自培养瓶中移出细胞，且用PBS洗涤。然后，将该细胞重悬浮于培养基中并且计数。将含有近似200,000-250,000个细胞的各样品离心，移除培养基，且将细胞重悬浮于FC缓冲液(1％BSA、0.01％叠氮化钠的1XPBS)用于阻断步骤。将细胞在FC缓冲液中于冰上孵育1小时。然后，将第一抗体(例如，嵌合(人-小鼠)37M抗体、Hum17、Hum8、Hum4、Hum10、阳性对照抗KIT抗体或阴性对照抗体)加到如上所述的含细胞的FC缓冲液中。将样品混合且于冰上孵育1小时，然后用0.5-1mL FC缓冲液洗涤细胞。通过将细胞在4℃下以1200rpm离心3分钟，倾析出液体来移除FC缓冲液。将细胞沉淀重悬浮于200μL FC缓冲液中，且将第二抗体(DyLight 488AffiniPure山羊抗小鼠IgG JacksonLaboratories)以1:1000至1:2000稀释加到细胞中。将样品混合且于冰上孵育1小时，然后如上所述加以洗涤。将样品在荧光激活细胞分选仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)机器(Accuri FlowCytometer C6)上运行。通过追踪通道FLA-1分析样品中的DyLight缀合的样品。
图6概述来自流式细胞术分析的结果。对于抗体37M的嵌合体(人-小鼠)和抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10与人KIT的D4/D5区的结合亲和力，50％结合时的有效浓度(EC50)经计算分别近似为47pM、139pM、83pM、106pM和132pM。
图6中给出的结果显示，嵌合37M抗体和抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10对细胞表面表达的人KIT的结合亲和力相当。
6.4实施例4：在基于细胞的磷酸-KIT测定中对由SCF诱导的KIT磷酸化的抑制
抗KIT嵌合37M抗体和某些本文描述的抗KIT抗体对干细胞因子(SCF)介导的细胞表面KIT磷酸化的抑制在基于细胞的测定中评估如下：将针对高细胞表面抗原表达分选的CHO-KIT细胞在24孔板或96孔板中在不存在血清的情况下培养过夜，接着添加试验抗体(嵌合抗体或自上清液中纯化而来的本文描述的抗KIT抗体)或对照阻断抗体(BioLegend,克隆A3C6E2)的1x10-8M-1.4x10-11M的三倍稀释系列。
在37℃下孵育2小时后，在37℃下用30ng/mL SCF(R&D Systems,目录号255-SC/CF)刺激细胞10分钟，在蛋白酶和磷酸酶抑制剂存在下进行细胞裂解，且自全溶胞物中将KIT蛋白捕获在用KIT捕获抗体(ThermoScientific,目录号LVMS289-PABX)预包被的白色壁96孔Maxisorp板上。对于96孔格式，针对各条件设置一式两份的孔且进行裂解和独立地转移到捕获板，而对于24孔格式，自同一孔获取一式两份的溶胞物样品。将培养板在4℃下过夜孵育并且充分洗涤后，使用HRP缀合的抗磷酸酪氨酸克隆4G10(Millipore,目录号16-105)和West PICO化学发光底物(Fisher,目录号PN34087)检测酪氨酸磷酸化的KIT。结果在下表8中给出。
表8：阻断测定
计算这些抗体的IC50值(pM)，且将这些值针对相应实验中嵌合37M抗体的值归一化。值愈高指示阻断活性愈强。“(96孔)”是指在96孔板格式中进行的测定，与24孔格式(24孔)相对。
表8中的结果显示，抗体Hum4、Hum8、Hum9、Hum10、Hum13、Hum14、Hum15、Hum17、Hum18和Hum19的阻断活性与抗体37M嵌合体的阻断活性相当。
为了进一步表征这些抗体对KIT活性(具体地说是SCF诱导的KIT的细胞质域的酪氨酸磷酸化)的影响，如下进行基于细胞的磷酸-KIT测定。
材料：
·用编码全长人KIT(参见图1)的质粒稳定转染的CHO细胞，其克隆自人卵巢cDNA文库(OriGene,Rockville,Maryland)
·完全细胞培养基(参见表9)
·饥饿培养基：表9中描述的细胞培养基不加FBS
·胰蛋白酶-EDTA
·PBS
·SCF溶液：rhSCF(RD Systems 255-SC/CF)；最终浓度30ng/mL
·裂解缓冲液：50mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合片(cocktail tables)(无EDTA)(RocheDiagnostics 04693132001)，1mM NaVO4
·TBS-T：50mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，0.1％吐温20
·阻断溶液：5％牛血清白蛋白(BSA)的TBS-T
·稀释缓冲液：1％BSA的TBS-T，含有1mM NaVO4
·检测抗体溶液：与辣根过氧化酶缀合的抗磷酸-酪氨酸抗体(Millipore,4G10)；稀释因子1:500
·捕获抗体：抗KIT抗体Ab3，得自Thermo Scientific(MS-289-PABX)
表9：细胞培养基
CHO/KIT-WT细胞的传代：用无菌PBS将汇合细胞洗涤一次，在室温下与0.25％胰蛋白酶-EDTA一起孵育直到细胞自塑料组织培养板脱离。将含有FBS的完全培养基加到培养板中以结束胰蛋白酶消化。
计数细胞：将10微升细胞悬浮液与10μL 0.4％锥虫蓝混合。将该混合物的一半(10μL)转移到细胞计数腔室(Invitrogen)中，且对细胞进行计数。将细胞(200,000个/孔)转移到24孔细胞培养板中，且在正常细胞培养条件(即，加湿的95％空气和5％CO2气氛，于37℃)下在完全培养基(表9)中培养24小时。
细胞处理：在将细胞接种到24孔板中并且培养过夜后，移除培养基，且用饥饿培养基将细胞单层洗涤一次。然后在正常细胞培养条件下将细胞在饥饿培养基中培养24小时。然后，在正常细胞培养条件下用嵌合(人-小鼠)37M抗体、Hum4、Hum8、Hum10、Hum17或对照抗体溶液将细胞处理2小时。抗体溶液的最终浓度为100nM(5μg/mL)或100nM(5μg/mL)以下。随后，将SCF溶液加到在正常细胞培养条件下用抗KIT抗体或对照抗体预处理10分钟的细胞中，最终浓度为30ng/mL。
对照：
·阴性对照：未经处理且未经刺激的饥饿细胞
·阳性对照：未经处理且经SCF刺激的饥饿细胞
·药物对照：经1μM Gleevec处理且经SCF刺激的饥饿细胞
·抗体对照：经100nM阻断抗体(与SCF结合位点结合的经纯化的小鼠抗人KIT抗体(BioLegend A3C6E2))处理的饥饿细胞
细胞溶胞物的制备：在刺激后，将24孔板中的细胞立即置于冰上，用冷PBS将细胞洗涤一次，然后用100μL冷的裂解缓冲液进行裂解。
含有捕获抗体的96孔ELISA板的制备：将捕获抗体(5μL)稀释于10mL50mM硼酸盐缓冲液中，且将捕获抗体溶液(100μL或50ng/孔)加到96孔ELISA板的各孔中。将96孔板在室温下孵育5-6小时或在4℃下孵育过夜。在阻断步骤之前移除捕获抗体溶液。通过将100μL阻断溶液加到各孔中进行阻断并允许在室温下孵育1小时。移除阻断溶液，用稀释缓冲液将各孔洗涤一次，且向各孔中加入50μL稀释缓冲液。
磷酸-KIT测定：将来自24孔板的孔的各样品的50μL细胞溶胞物转移到所制备的含有50μL稀释缓冲液的96孔板的1个孔中，将该96孔板在4℃下孵育过夜。在过夜孵育后，移除上清液，用TBS-T将该板洗涤3次(每次孵育5分钟)。将检测抗体稀释液(100μL)加到各孔中并在室温下避光孵育1小时，该板用TBS-T洗涤3次，用TBS洗涤一次，且移除TBS。将“SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate”试剂(Thermo Scientific)混合(1:1)，并且将100μL混合物加到各孔中。
使用GEN5TM方案“Luminescence Glow”在ELISA培养板读数器中检测发光并且使用Microsoft Excel分析数据。
图7描绘由来自这些实验的数据所绘制的图。该图是任意发光单位vs抗体37M的嵌合体(人-小鼠)或抗体Hum17、Hum8、Hum4或Hum10的log浓度(M)的曲线图。嵌合体37M、抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10的50％抑制浓度(IC50)经计算分别近似为344pM、510pM、542pM、470pM和510pM。结果表明，如同37M嵌合体抗体一样，抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10是配体(SCF)诱导的KIT的细胞质域的酪氨酸磷酸化的有效抑制剂。
这些抗KIT抗体能在多种不同的细胞类型中表达而不会实质上影响抗体的特性，例如结合活性和阻断活性。例如，抗KIT抗体Hum17、Hum8、Hum4和Hum10在基于HEK293-Freestyle(293F)细胞的不同重组表达系统中表达，且表现出阻断活性，如通过KIT磷酸化抑制测定所确定。这些结果表明，可使用多种细胞系统来表达本文描述的抗KIT抗体，例如抗体Hum1-Hum20，而不损害抗体活性。
6.5实施例5：表达野生型KIT的CHO细胞的抗体内化
进行免疫荧光染色测定以评估表达野生型KIT的CHO细胞(“CHO/KIT-WT”)对抗体Hum4、Hum10、Hum17和Hum8的内化。
基本上如下所述进行免疫荧光染色测定。用于免疫荧光测定的材料和试剂包括以下：
·第一抗体：抗体Hum4、Hum8、Hum10、Hum17、37M和β-微管蛋白(9F3)兔单克隆抗体(mAb)(Cell Signaling#2128)。
·第二抗体：与Oregon488缀合的山羊抗小鼠抗体(Invitrogen#011038)、与得克萨斯红(Texas Red)缀合的山羊抗兔抗体(Invitrogen#T2767)和与Alexa Fluor 488缀合的山羊抗人抗体(Invitrogen#A11013)。
·固定剂：4％低聚甲醛(PFA)(以40％PFA显微镜术级在冰箱中保存且在即将使用之前用PBS以1:10稀释)。
·透化溶液：经无菌过滤的含有0.1％Triton X-100和0.5％BSA的PBS
·阻断/稀释溶液：经无菌过滤的含2％BSA的PBS
·固定介质：含有DAPI(P36931Invitrogen)(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的Gold抗褪色试剂
·经工程改造以表达外源人、野生型KIT(全长)的CHO细胞(“CHO/KIT-WT”)
将CHO细胞(例如，75,000个细胞/孔)接种到每孔含有一个圆形玻璃盖片的24孔组织培养板中。将该细胞培养至少6小时，随后在不含有胎牛血清的培养基中饥饿过夜。在饥饿后，自该细胞移除培养基，且在时间0分钟、30分钟、45分钟或55分钟将在含有1％牛血清白蛋白的饥饿培养基中稀释至33.3nM的抗体37M、Hum4、Hum10、Hum17或Hum8转移到细胞层上以产生时程。将细胞在标准培养条件(37℃和5％CO2)下孵育指定时间。在添加抗体之后5至60分钟，用PBS(室温)将细胞层洗涤一次。在室温下用4％PFA将细胞层固定20分钟后用PBS洗涤3次。通过加入透化溶液来透化细胞膜3分钟，然后用PBS洗涤3次。将阻断溶液加到各孔中，细胞在室温下阻断20分钟。将β-微管蛋白(9F3)兔mAb在稀释溶液中进行1:100稀释并且在室温下与细胞层一起孵育1小时，然后用PBS洗涤2次且用阻断溶液洗涤1次。将两种第二抗体一起以1:200稀释于稀释溶液中，随后加到细胞中。将细胞在室温下在第二抗体中避光孵育1小时，然后进行3次PBS洗涤。使用1滴含DAPI的Gold抗褪色试剂与玻璃载片相抵来封固盖片上的细胞，且在室温下保持过夜。在暴露于抗体37M、Hum4、Hum10、Hum17或Hum8的不同时间点，例如5分钟和60分钟，通过荧光显微镜术分析抗体的内化。
免疫荧光染色测定证明，在CHO/KIT-WT细胞中，与抗体37M类似，抗体Hum4、Hum10、Hum17和Hum8结合于这些细胞的表面并且被这些细胞内化。具体地说，暴露于这些抗体中的细胞的影像显示膜缔合结构在较早时间点(例如在暴露于抗KIT抗体后5分钟时)的染色，且显示内部结构(例如，囊泡)在稍晚时间点(例如在暴露于抗体后60分钟时)的染色。相比之下，暴露于抗β-微管蛋白抗体(作为对照)的细胞的影像显示细胞的整个细胞质中的细长结构染色。这些结果表明，抗体Hum4、Hum10、Hum17和Hum8被表达KIT的细胞内化。抗体的有效内化可用于例如向表达KIT的细胞(例如癌细胞)递送毒素。
6.6实施例6：稳定性数据
治疗性抗体的成功开发部分地依赖于抗体活体内稳定性的表征。为此，对本文描述的抗KIT抗体的亚组的相对热稳定性和在模拟的生理条件(即，血清，37℃)下相对稳定性两者进行了表征。
差示扫描量热法：
差示扫描量热法(DSC)是用于测定目标样品经历相转变(例如熔融或结晶)的点的一项热分析技术。因此，DSC是用于比较多种抗体的相对热稳定性的有用工具。为此，使用DSC分析本文描述的抗KIT抗体(例如，抗体Hum1-Hum20)的亚组，且测定这些抗体的熔融温度。各抗KIT抗体的熔融分布型(profiles)揭示出一个主要熔融峰及一个或两个次要峰。占主导的熔点在85.7℃至86.6℃的范围内，而次要峰经计算为71.6℃-71.9℃。显示熔融温度显著高于37℃的这些结果表明，这些抗KIT抗体在治疗环境下(例如，在37℃下)可以是稳定的。
血清稳定性:
为了更好地理解本文描述的抗KIT抗体在生理条件下的稳定性，在胎牛血清中在37℃下长期孵育后评估抗体活性。简而言之，将抗KIT抗体在无血清培养基或含有50％胎牛血清的培养基中稀释至0.2mg/mL。将样品于37℃孵育1周、2周和3周，在此时间点，将等分试样与在4℃保存相同持续时间的抗体在如先前实施例中所描述的结合ELISA和基于细胞的磷酸化测定中相比较。使用4℃抗体作为参考，结合ELISA测定揭示出在一周后，EC50值的最大变化为4倍，但低至1.1倍，而使用4℃抗体作为对照，在两周后，最大变化为4倍。始终如一地，在有或无血清的情况下在37℃保存的这些相同抗KIT抗体在基于细胞的磷酸化测定中的IC50值与在4℃保存的抗体的IC50值相比改变小于两倍。
总而言之，这些数据提示本文描述的抗KIT抗体的长期稳定性，因为在血清中及在升高的温度下孵育后各抗体的结合活性和阻断活性得以维持。这些结果表明，本文描述的抗KIT抗体(例如，Hum1-Hum20)可表现出得以维持的活性，并且可例如用于较少频率的给药疗程中。
6.7实施例7：阻断配体诱导的AKT磷酸化
测定本文描述的抗KIT抗体(例如，Hum1-Hum20)抑制或阻断AKT磷酸化的能力，AKT磷酸化是KIT信号传导的下游信号传导事件。该测定如上所述进行，但进行以下修改。首先，将小鼠抗AKT抗体固定在ELISA板上作为捕获抗体。其次，使用两步法进行AKT磷酸化(磷酸-AKT)的检测。将细胞溶胞物与包被的ELISA板一起孵育之后，将识别磷酸-AKT(Ser473)的生物素化小鼠单克隆抗体以1:500的稀释度加到各孔中后在室温下保持1小时。在这次孵育和随后的洗涤之后，用蛋白Western C链霉抗生物素蛋白-HRP抗体(BioRad)以1:2500的稀释度检测磷酸-AKT抗体。如本文(例如，第6.2节和第6.4节)所描述利用TMB底物溶液进行最终检测步骤。
6.8实施例8：抗KIT抗体在治疗癌症中的动物模型研究
本文描述的抗KIT抗体的抗肿瘤作用使用人肿瘤的小鼠模型(例如异种移植物小鼠模型)来证实。用于研究癌症的各种小鼠模型已有描述(参见例如，Fernandez等人,J.Clin.Invest.,2007,117(12):4044-4054)。下文描述了来源于多种源自患者的人细胞系的小鼠模型，例如异种移植物小鼠模型。下文还描述了用于评估毒性的小鼠模型。
胃肠道间质瘤(GIST)
GIST的小鼠模型已有描述，例如参见Fernández等人,J.Clin.Invest.,2007,117(12):4044–4054。例如，通过短暂暴露于0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)而自亚汇合培养物中收获GIST细胞。用含有10％FBS的培养基终止胰蛋白酶消化。然后该细胞在无血清培养基中洗涤两次并重悬浮于无血清HBSS(Invitrogen)中。将如通过锥虫蓝排除法所测定具有大于95％活力的单细胞悬浮液用于注射液。为了产生肿瘤，将1x105至1x107个GIST细胞(例如6×106个GIST细胞)/100μl注射(皮下)到各SCID小鼠(例如，雌性C.B-17/IcrHsd-PrkdcSCID小鼠，购自Harlan Sprague Dawley Inc.；圈养在由美国实验室动物保护评估与认证协会(the American Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)、美国农业部(theUnited States Department of Agriculture)、美国健康与公共事业部(the UnitedStates Department of Health and Human Services)和NIH批准并符合要求的设施中；并且根据研究机构指南加以使用)的单侧胁腹。在溶媒组和抗KIT抗体组中，每组使用五到十只小鼠。一旦肿瘤可触知(例如，距注射近似8-11周)，就对小鼠开始注射(例如每天、每周或每两周腹膜内注射)正常生理盐水(溶媒)或抗KIT抗体(例如，抗体Hum1-Hum20或其抗体-药物缀合物)的疗法。持续治疗一段时间，例如近似6周，其中每周对肿瘤尺寸进行二维测量。也可使用检测肿瘤尺寸的成像方法，例如MRI。当对照组中的肿瘤尺寸接近约1.5cm时，将所有小鼠处死。收集肿瘤，在福尔马林中固定，并通过H&E染色进行分析。使用光学显微镜在×40和×100放大倍数下获取各肿瘤的代表性影像。
产生各小鼠的肿瘤尺寸或体积针对肿瘤注射后的时间(例如，天数或周数)绘制的图，以确定相对于溶媒阴性对照，抗KIT抗体对小鼠中的肿瘤生长的影响。
可用于这些小鼠模型的GIST细胞的非限制性实例包括GIST 430细胞(表达突变KIT的人GIST细胞，该突变KIT具有外显子11(V560-L576)缺失和外显子13中的V654A突变)和GIST882细胞(KIT中具有纯合外显子13错义突变(即，K642E)的无限增殖GIST细胞(参见例如，Tuveson等人,Oncogene,2001,20:5054–5058))。
白血病
为了研究抗KIT抗体对白血病的影响，基本上如上文所描述，但改用白血病细胞(例如，K562、HEL或HL60细胞)替代GIST细胞注射到小鼠中来建立人白血病细胞(例如，K562、HEL或HL60细胞)的异种移植物小鼠模型。具体地说。自亚汇合悬浮液中收集肿瘤细胞。为了产生肿瘤，将1×105至1×107个肿瘤细胞/100μl注射到各SCID小鼠中。然后将小鼠随机分到以下各组(每组n＝5-10只)中：(a)每天正常生理盐水；和(b)抗KIT抗体(例如，抗体Hum1-Hum20或其抗体-药物缀合物)。对小鼠开始注射(例如，每天、每周或每两周腹膜内注射)正常生理盐水(溶媒)或抗KIT抗体的疗法(例如，在第0、7或14天或当肿瘤可检测时)。持续治疗一段时间，例如近似6周，其中每周对肿瘤尺寸进行二维测量。也可使用检测肿瘤尺寸的成像方法，例如MRI。在治疗期间每周一次和在验尸时测量肿瘤。
产生各小鼠的肿瘤尺寸或体积针对肿瘤注射后的时间(例如，天数或周数)绘制的图，以确定相对于溶媒阴性对照，抗KIT抗体对小鼠中的肿瘤生长的影响。
人白血病的小鼠模型也可如下产生：通过其它途径(例如静脉内途径)将人白血病细胞注射到裸鼠或经照射小鼠中，并且在存在或者不存在用抗KIT抗体治疗的情况下监测动物死亡作为白血病进展的指示。产生各小鼠的存活曲线以确定抗KIT抗体对存活的影响。
肺癌(例如，小细胞肺癌)
基本上如上文所描述但进行一些改进来建立使用人肺癌细胞(例如，人小细胞肺癌细胞(例如，H526细胞、WBA细胞或NCI-H209细胞))的异种移植物小鼠模型。例如，用肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)替代GIST细胞注射到小鼠中。收集肺癌细胞，例如H526肿瘤细胞，将1×105至1×107个肺癌细胞/100μl注射到各小鼠(例如，SCID小鼠)中。然后将小鼠随机分到以下各组(例如每组n＝5-10只)中：(a)每天正常生理盐水；和(b)抗KIT抗体(例如，抗体Hum1-Hum20或其抗体-药物缀合物)。对小鼠开始注射(例如，每天、每周或每两周腹膜内注射)正常生理盐水(溶媒)或抗KIT抗体的疗法(例如，在第0、7或14天或当肿瘤可检测时)。持续治疗一段时间(例如近似6周或6周以上)，其中每周对肿瘤尺寸进行二维测量。也可使用检测肿瘤尺寸的成像方法，例如MRI。在治疗期间每周一次和在验尸时测量肿瘤。
产生各小鼠的肿瘤尺寸或体积针对肿瘤注射后的时间(例如，天数或周数)绘制的图，以确定相对于溶媒阴性对照，抗KIT抗体对小鼠中的肿瘤生长的影响。产生存活曲线以确定抗KIT抗体(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个，或其抗原结合片段或其缀合物)对动物存活的影响。
肺癌(例如，小细胞肺癌)的小鼠模型已有描述(参见例如，Garton等人,2006,Cancer Res.66(2):1015-24；和Wolff等人,2004,Clin Cancer Res.10:3528-3534)，并可据此加以改进以研究本文描述的抗KIT抗体的效应。
肉瘤
使用来源于尤因家族的肿瘤的细胞系(例如RD-ES、SK-ES-1或SK-N-MC或横纹肌肉瘤，例如A-673)建立异种移植物模型。细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas,VA)。一般而言，利用与上文所描述的那些类似的方法。例如，将2.5-5x 106个细胞用胰蛋白酶/EDTA悬浮或再悬浮于100-200μL生长培养基中并且经皮下植入6-8周龄免疫缺陷小鼠(NuNu,SCID)(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)的胁腹。在溶媒组和抗KIT抗体组中，每组使用五到十只小鼠。一旦肿瘤可触知或已达到100-200mm3，就对小鼠开始注射(例如，每天、每周或每两周腹膜内注射)正常生理盐水(溶媒)或抗KIT抗体(例如，抗体Hum1-Hum20或其抗体-药物缀合物)的疗法。持续治疗一段时间，例如近似6周或6周以上，并且评估肿瘤尺寸(例如，通过二维测量每周两次)。可使用检测肿瘤尺寸的成像方法，例如MRI。当对照组中的肿瘤尺寸接近某一尺寸(例如，近似1.5cm)时，将小鼠处死。收集肿瘤，在福尔马林中固定，并通过H&E染色进行分析。使用光学显微镜在例如×40和×100放大倍数下获取各肿瘤的代表性影像。
产生各小鼠的肿瘤尺寸或体积针对肿瘤注射后的时间(例如，天数或周数)绘制的图，以确定相对于溶媒阴性对照，抗KIT抗体对小鼠中的肿瘤生长的影响。
肉瘤(例如，尤因肉瘤)的小鼠模型已有描述，例如参见以下出版物清单，且可据此加以修改以评估抗KIT抗体(例如，抗体Hum1-Hum20中的任何一个)的效应：
González等人,2004,Clin Cancer Res.10(2):751-61；
Landuzzi等人,2000,Am J Pathol.157(6):2123-31(6647细胞)；
Merchant等人,2002,JNCI 94(22):1673-1679(TC71细胞)；
Sturla等人,2000,Cancer Res.60(21):6160-70(TC32和RD-ES细胞)；
Powis等人,2006,Mol Cancer Ther.5(3):630-636(A-673细胞)；
Watanabe等人,2008,Hum Gene Ther.19(3):300-10(A-673细胞)；
Rouleau等人,2008,Clin Cancer Res.14(22):7223-7236(A-673细胞)；
Karmakar等人,2011,World J Oncol.2(2):53-63(RD-ES和SK-N-MC细胞)；
Wang等人,2009,In vivo 23(6):903-9(TC71细胞)；和
Ikeda等人,2010,Mol Cancer Ther.(3):653-60(TC71细胞和A4573细胞)。
人源化小鼠模型
利用抗KIT抗体(包括抗KIT抗体药物缀合物)，例如Hum1-Hum20抗体(包括其抗体-药物缀合物)进行的研究可利用通过将免疫缺陷小鼠移植人免疫系统的组分产生的小鼠模型，例如人源化NSG小鼠(The JacksonLaboratory,Bar Harbor,Maine)来进行。人源化NSG小鼠是植入人造血干细胞(hCD34+细胞)以重建人免疫系统的NOD scid IL-2受体γ链敲除(knockout)小鼠(NSG)。
这些小鼠可充当研究抗KIT抗体毒性的平台。例如，在一段时间(例如，4-16周)内向各组小鼠(例如，1-5只小鼠)中注射各种浓度的抗KIT抗体。评估小鼠的毒性指标，例如体重、存活时间长短。
6.9实施例9：在软琼脂测定中通过表达KIT的CHO细胞抑制集落形成
在软琼脂测定中测试本文描述的抗KIT抗体(例如Hum1-Hum20)抑制CHO/KIT-WT细胞的不依赖锚定(anchorage independent)的细胞生长的能力。用于集落形成的软琼脂测定是不依赖锚定的生长测定法，其是用于检测细胞恶性转化的一项有用测定法。活体外转化与某些表型变化(例如接触抑制丧失(细胞可彼此叠加生长)和锚定独立性丧失(细胞在软琼脂中形成集落)相关。一般而言，非转化的细胞当悬浮于粘性流体或凝胶(例如，琼脂或琼脂糖)中时不能生长，然而当这些细胞发生转化时，它们能够在粘性流体或凝胶中生长并变成不依赖锚定的。这些表型变化发生的过程据推测与活体内癌发生的过程紧密相关。
软琼脂测定如下进行。将基础琼脂层(含有琼脂和细胞培养培养基)加到96孔板的各孔中。将细胞琼脂层(含有琼脂、细胞培养基和细胞悬浮液)加到基础琼脂层的顶部。将抗KIT抗体在细胞培养基中稀释并且用移液管加到该层的顶部。对照样品不含有任何抗体。在37℃和5％CO2下在存在或不存在30ng/mL SCF时将板孵育5-8天。将配体SCF和抗KIT抗体(100nM)同时加到琼脂中。
当完成处理时，琼脂得以溶解且细胞得以溶解。将绿色荧光GR染料与溶胞物混合。这种染料当与细胞核酸结合时发荧光。在480nm激发和520nm发射时测量荧光。
本文描述的实施方式意欲仅仅是示例性的，并且本领域技术人员将使用不超过常规实验即能认识到或能够确定本文描述的具体程序的众多等同方案。所有这样的等同方案都被认为在本发明的范围内并且由所附权利要求书所涵盖。此外，如在本说明书和权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”(“a”或“an”)和“该”(“the”)包括复数形式，除非其内容中另外明确指出。因此，举例来说，提及“抗体”包括两种或两种以上这样的抗体的混合物，以及其类似情形。另外，普通技术人员将会认识到，出于解释和请求保护的目的必须按某一特定顺序阐述操作顺序，但是本发明涵盖超出这种特定顺序以外的各种变化。
本文中所引用的所有参考文献(包括专利申请、专利和出版物)以全文引用的方式并入本文中并且用于所有目的，其引用程度达到如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地和单独地以全文引用的方式并入本文中用于所有目的一样。

Claims (57)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其免疫特异性结合于人KIT的D4区，包含：
(i)轻链可变区(“VL”)，包含分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和
(ii)重链可变区(“VH”)，包含分别具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；
其中所述VL和VH在人类中是非免疫原性的。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体能在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中以至少0.45μg/mL的效价表达。
3.权利要求1的抗体，其中所述VL包含SEQ ID NO:8、10、7或9的氨基酸序列，且所述VH包含SEQ ID NO:4、3、6、5或2的氨基酸序列。
4.权利要求1的抗体，其中
(i)所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列；
(ii)所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；
(iii)所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；
(iv)所述VL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；
(v)所述VL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列；
(vi)所述VL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；
(vii)所述VL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列；
(viii)所述VL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；
(ix)所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列；
(x)所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；
(xi)所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；
(xii)所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列；
(xiii)所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；
(xiv)所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列；
(xv)所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；
(xvi)所述VL包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且所述VH包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；
(xvii)所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且所述VH包含SEQID NO:2的氨基酸序列；
(xviii)所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且所述VH包含SEQID NO:4的氨基酸序列；
(xix)所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且所述VH包含SEQID NO:5的氨基酸序列；或
(xx)所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且所述VH包含SEQID NO:6的氨基酸序列。
5.权利要求1的抗体，其包含：
(i)轻链可变区(“VL”)，包含氨基酸序列：
DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK 2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK，其中XK1为具有芳族或脂族羟基侧链的氨基酸，XK2为具有芳族或脂族羟基侧链的氨基酸，XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸，XK4为具有脂族羟基侧链的氨基酸或为P，XK5为具有带电荷或酸性侧链的氨基酸，和XK6为具有芳族侧链的氨基酸；和
(ii)重链可变区(“VH”)，包含分别具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
6.权利要求1的抗体，其包含：
(i)VL，包含分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和
(ii)VH，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS，其中XH1为具有脂族侧链的氨基酸，XH2为具有脂族侧链的氨基酸，XH3为具有极性或碱性侧链的氨基酸，XH4为具有脂族侧链的氨基酸，XH5为具有脂族侧链的氨基酸，XH6为具有酸性(acidid)侧链的氨基酸，XH7为具有酸性或酰胺衍生物侧链的氨基酸，和XH8为具有脂族羟基侧链的氨基酸。
7.权利要求1的抗体，其包含：
(iii)VL，包含与SEQ ID NO:7有至少90％同一性、与SEQ ID NO:8有至少88％同一性、与SEQ ID NO:9有至少87％同一性或与SEQ ID NO:10有至少84％同一性的氨基酸序列；和
(iv)VH，包含与SEQ ID NO:2有至少93％同一性、与SEQ ID NO:3有至少92％同一性、与SEQ ID NO:4有至少90％同一性、与SEQ ID NO:5有至少87％同一性或与SEQ ID NO:6有至少86％同一性的氨基酸序列。
8.分离的抗体或其抗原结合片段，其免疫特异性结合于人KIT的D4区，包含：
(i)轻链可变区(“VL”)，包含氨基酸序列：DIVMTQSPSXK1LSASVGDRVTITCKASQNVRTNVAWYQQKPGKAPKXK 2LIYSASYRYSGVPDRFXK3GSGSGTDFTLTISSLQXK4EDFAXK5YXK6CQQYNSYPRTFGGGTKVEIK，其中XK1为具有芳族或脂族羟基侧链的氨基酸，XK2为具有芳族或脂族羟基侧链的氨基酸，XK3为具有脂族羟基侧链的氨基酸，XK4为具有脂族羟基侧链的氨基酸或为P，XK5为具有带电荷或酸性侧链的氨基酸，和XK6为具有芳族侧链的氨基酸；和
(ii)VH，包含氨基酸序列：QVQLVQSGAEXH1KKPGASVKXH2SCKASGYTFTDYYINWVXH3QAPGKGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGRXH4TXH5TAXH6KSTSTAYMXH7LSSLRSEDXH8AVYFCARGVYYFDYWGQGTTVTVSS，其中XH1为具有脂族侧链的氨基酸，XH2为具有脂族侧链的氨基酸，XH3为具有极性或碱性侧链的氨基酸，XH4为具有脂族侧链的氨基酸，XH5为具有脂族侧链的氨基酸，XH6为具有酸性侧链的氨基酸，XH7为具有酸性或酰胺衍生物侧链的氨基酸，和XH8为具有脂族羟基侧链的氨基酸。
9.权利要求8的抗体，其中XK1为氨基酸F或S，XK2为氨基酸A或S，XK3为氨基酸T或S，XK4为氨基酸S或P，XK5为氨基酸D或T，和XK6为氨基酸F或Y。
10.权利要求8的抗体，其中XH1为氨基酸L或V，XH2为氨基酸L或V，XH3为氨基酸K或R，XH4为氨基酸V或A，XH5为氨基酸L或I，XH6为氨基酸E或D，XH7为氨基酸Q或E，和XH8为氨基酸S或T。
11.权利要求1-10中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合于重组表达野生型KIT的CHO细胞，其中如通过流式细胞术所测定的EC50为约150pM或约150pM以下。
12.权利要求1-10中任一项的抗体，其中所述抗体抑制KIT的酪氨酸磷酸化，其中如通过ELISA所测定的IC50为约600pM或约600pM以下。
13.权利要求1-10中任一项的抗体，其能在CHO细胞中以至少1.0μg/mL、或至少1.1μg/mL、或至少1.2μg/mL的效价表达。
14.权利要求1-10中任一项的抗体，其中所述抗体还包含人κ轻链恒定区和人γ重链恒定区。
15.权利要求1-10中任一项的抗体，其中所述抗体是人IgG1或IgG4抗体。
16.权利要求1-10中任一项的抗体，其是单克隆抗体。
17.权利要求1-10中任一项的抗体，其是抗原结合片段或Fab片段。
18.权利要求1-10中任一项的抗体，其是双特异性抗体。
19.权利要求1-10中任一项的抗体，其与异源多肽融合。
20.缀合物，包含与药剂连接的权利要求1-10中任一项的抗体或其抗原结合片段。
21.权利要求20的缀合物，其中所述药剂是毒素。
22.权利要求21的缀合物，其中所述毒素是相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素。
23.权利要求20的缀合物，其中所述缀合物被细胞内化。
24.药物组合物，包含权利要求20的缀合物和药学上可接受的载剂。
25.药物组合物，包含权利要求1-10中任一项的抗体和药学上可接受的载剂。
26.多核苷酸，包含编码权利要求1-10中任一项的抗体的VH链区、VL链区或VL链区和VH链区两者的核苷酸序列。
27.权利要求26的多核苷酸，其包含编码VH的SEQ ID NO:22、23、24、25或26。
28.权利要求26的多核苷酸，其包含编码VL的SEQ ID NO:27、28、29或30。
29.权利要求26的多核苷酸，其包含编码VH的SEQ ID NO:22、23、24、25或26和编码VL的SEQ ID NO:27、28、29或30。
30.载体，包含权利要求26的多核苷酸。
31.权利要求30的载体，其是哺乳动物表达载体。
32.宿主细胞，包含权利要求30的载体或一种或多种权利要求26的多核苷酸。
33.分离的细胞，产生根据权利要求1-10中任一项所述的抗体。
34.分离的细胞，包含一种或多种权利要求26的多核苷酸，其中所述细胞能表达与人KIT的D4特异性结合的抗体。
35.细胞，包含权利要求30的载体。
36.试剂盒，包含权利要求1-10中任一项的抗体。
37.试剂盒，包含权利要求20的缀合物。
38.用于治疗或处理KIT相关紊乱的方法，包括向有其需要的对象给予治疗有效量的权利要求1-10中任一项的抗体。
39.用于治疗或处理KIT相关紊乱的方法，包括向有其需要的对象给予治疗有效量的权利要求20的缀合物。
40.权利要求38的方法，其中所述KIT相关紊乱是癌症、炎症性病症或纤维化。
41.权利要求40的方法，其中所述癌症是白血病、慢性髓细胞白血病、肺癌、小细胞肺癌或胃肠道间质瘤。
42.权利要求41的方法，其中所述癌症对于酪氨酸激酶抑制剂的治疗具有顽固性。
43.权利要求42的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是甲磺酸伊马替尼或SU11248。
44.权利要求38的方法，其中所述方法还包括给予第二种治疗剂。
45.权利要求44的方法，其中所述第二种治疗剂是化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、抗体或细胞因子。
46.权利要求45的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是甲磺酸伊马替尼或SU11248。
47.用于诊断患有KIT相关紊乱的对象的方法，包括使获自所述对象的细胞或样品与权利要求1-10中任一项的抗体接触，及检测所述细胞或所述样品中的KIT的表达水平。
48.权利要求47的方法，其中所述抗体与可检测分子缀合。
49.权利要求48的方法，其中所述可检测分子是酶、荧光分子、发光分子或放射性分子。
50.用于抑制表达KIT的细胞中的KIT活性的方法，包括使所述细胞与有效量的权利要求1-10中任一项的抗体接触。
51.用于诱导或增强表达KIT的细胞中的细胞凋亡的方法，包括使所述细胞与有效量的权利要求1-10中任一项的抗体接触。
52.用于诱导细胞分化的方法，包括使表达KIT的细胞与有效量的权利要求1-10中任一项的抗体接触。
53.权利要求52的方法，其中所述细胞是干细胞。
54.制备免疫特异性结合于人的D4区的抗体的方法，包括培养权利要求32的细胞，和/或使用权利要求32的细胞表达所述抗体。
55.权利要求54的方法，还包括纯化获自所述细胞的抗体。
56.分离的抗体或其抗原结合片段，其免疫特异性结合于人KIT的D4区，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)轻链可变区(“VL”)，包含选自表10-12中所阐述之组的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和
(ii)重链可变区(“VH”)，包含选自表13-15中所阐述之组的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
57.分离的抗体或其抗原结合片段，其免疫特异性结合于人KIT的D4区，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)轻链可变区(“VL”)，包含选自表2和表3中所阐述之组的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和
(ii)重链可变区(“VH”)，包含选自表2和表3中所阐述之组的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3。
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