TWI508728B - 抑制及／或治療神經纖維瘤及相關腫瘤的材料和方法 - Google Patents

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Description

抑制及/或治療神經纖維瘤及相關腫瘤的材料和方法
政府權利之聲明
本發明的部分發展得到來自NIH，在補助編號NS 052606之下，以及來自美國國防部(the Department of Defense)，在補助編號W81XWH-05-1-0185之下的政府支持。美國政府在本發明中擁有某些權利。
優先權主張
本申請案主張2008年6月27日申請之美國臨時專利申請案第61/076,185號和2008年10月8日申請之美國臨時專利申請案第61/103,650號的權益，將這兩個臨時專利申請案全部以引用方式納入本文中，就如同已個別地將各個申請案全部以引用方式納入本文中一般。
在本文中揭示的各種觀點和具體事實，通常係關於疾病(其特徵為形成腫瘤，例如神經纖維瘤)的模式化、治療、預防和診斷。
在NF1腫瘤抑制子基因中的突變，引起神經纖維瘤病第1型(NF1)，一種常見廣泛分布的人類遺傳病症，其僅在美國、歐洲和日本便影響大約25萬個患者。NF1基因編碼神經纖維瘤蛋白(neurofibromin)，320千道爾吞的蛋白質，其至少一部分的功能為p21ras的GTP酶活化蛋白質(GAP)。神經纖維瘤蛋白在脊椎動物物種中是經高度保留的，並與其對應物、酵母菌和果蠅(Drosophila)具有高度同種性。
患有NF1之個體顯示出各種惡性和非惡性徵候，包括叢狀神經纖維瘤，其集體地影響25-40%的NF1患者，這些神經纖維瘤是終身發病率和死亡率的主要來源。該病症對具有此突變之人類給與負面的衝擊，但對於此一及相關病症卻缺少有效的治療，故對該病症之額外治療有迫切的需求。在本文中揭示的各種觀點和具體事實解決了該需求。
某些具體事實包括治療患有一型神經纖維瘤病(例如叢狀神經纖維瘤)之患者的方法，包括下列步驟：提供至少一種治療有效劑量的根據式1之化合物：
其中R1 為4-吡基；1-甲基-1H-吡咯基；經胺基-或胺基-低碳烷基-取代之苯基，其中在每個情況下的胺基基團是游離的、經烷基化或經醯化的；在5-員環碳原子處結合的1H-吲哚基或1H-咪唑基；或在環碳原子處結合且在氮原子處未經取代或被氧取代之未經取代或經低碳烷基取代的吡啶基；R2 和R3 係彼此獨立地為氫或低碳烷基；基團R4 、R5 、R6 、R7 和R8 之一或二，分別為硝基、經氟基-取代的低碳烷氧基，或式Ⅱ之基團-N(R9 )-C(=X)-(Y)n -R10 (Ⅱ)，其中R9 為氫或低碳烷基，X為側氧基、硫基、亞胺基、N-低碳烷基-亞胺基、羥亞胺基或O-低碳烷基-羥亞胺基，Y為氧或基團NH，n為0或1，且R10 為具有至少5個碳原子的脂肪族基團，或芳香族、芳香族-脂肪族、環脂肪族、環脂肪族-脂肪族、雜環或雜環-脂肪族基團，而剩下的基團R4 、R5 、R6 、R7 和R8 係彼此獨立地為氫、未經取代的或被游離或經烷基化之胺基、六氫吡基、六氫吡啶基、吡咯啶基或被嗎啉基，或低碳鏈烷醯基、三氟甲基、游離、經醚化或經酯化之羥基、游離、經烷基化或經醯化之胺基，或游離或經酯化之羧基取代之低碳烷基，或為這類具有至少一個鹽-形成性基團之化合物的鹽。
在某些具體事實中，該化合物為式1之藥學上可接受之鹽，在某些具體事實中，式1之藥學上可接受之鹽為甲磺酸鹽。
某些其他的具體事實更包括診斷患有叢狀神經纖維瘤或類似病症之患者的步驟。而其他的具體事實則包括鑑認有發展出叢狀神經纖維瘤或類似病症之風險的患者的步驟。
在某些具體事實中，治療有效劑量的根據式1之化合物，是在大約200毫克到大約500毫克之間的等級，並每天至少一次將該劑量之化合物投予患者。在另一具體事實中，治療有效劑量的根據式1之化合物，是在大約350毫克到大約450毫克之間的等級，並每天至少一次將該劑量之化合物投予患者。在某些具體事實中，每天兩次以大約400毫克的治療有效劑量之根據式1化合物治療患者。
某些具體事實包括治療患有一型神經纖維瘤病(例如叢狀神經纖維瘤)之患者，包括下列步驟：提供至少一種治療有效劑量的根據式2之化合物：
另一具體事實包括治療患有一型神經纖維瘤病(例如叢狀神經纖維瘤)之患者的方法，其包括下列步驟：提供至少一種治療有效劑量的根據式3之化合物：
另一具體事實則包括至少一種根據式(1)、(2)或(3)之化合物或其之藥學上可接受之鹽的用途，其係用以製備用來治療患有一型神經纖維瘤病(例如叢狀神經纖維瘤)之患者的醫藥品。
在下文中提交及/或描述之具體事實，並不是無遺漏的，或企圖限制在以下詳細說明中揭示的精確形式。反而選擇並描述具體事實，使熟諳此藝者得以察知並瞭解在本文中討論之各種觀點和具體事實的原理和實行。
已經證明各種疾病的動物模式是發展對模型疾病的瞭解，或許更重要的是發展並測試用以診斷、治療及/或預防模型疾病之新材料及/或方法非常有效的工具。聲稱能夠分析對腫瘤發展之細胞自主和非-細胞自主貢獻的小鼠模式，已經變得相當出名。當以外插法從小鼠腫瘤模式推定人類時，必須運用嚴格的稽查，且可能僅在與人類疾病狀態有清楚且可證明之生理學關聯的情況下，才能察知這類實驗策略的顯著性。
因此，在塑造人類癌症之小鼠模式時的基本原則，需要在與人類腫瘤相同之組織中發展出相關分子路徑的突變。而且，用以塑造人類疾病模型的小鼠腫瘤應該在一連串可靠的細胞和分子成果中簡述人類表現型的重點。倘若在設計實驗和解釋結果時充分地注意，便可順利地使用小鼠模式來研究人類的腫瘤發展。例如，當人類腫瘤是在遺傳上可繼承之特性的結果(可將其減少至單一基因突變，如在范瑞克林浩森氏神經纖維瘤病的情況下)時，遺傳模式化是特別有利的。因此，本發明的某些方面教示適合在人類中將某些形式之神經纖維瘤形成減至最少的小鼠模式。或許，欲證實特定疾病之動物模式具有在發展對在人類中相同或類似疾病之治療的效力的最佳證據，不像基於特定動物模式所設計之人類疾病治療的許多動物模式，顯示在治療人類患者上具有效力。
神經纖維瘤病之小鼠模式的發展
范瑞克林浩森氏神經纖維瘤病是單一基因病症。在大多數的案例中，其顯示生殖種系突變和完全的體細胞異型接合性，接著是在產生該疾病之定型徵候的細胞類型中罕見地喪失異型接合性。在該病症中，幾乎常常在受影響患者之周圍神經系統中發展出腫瘤。人類組織研究暗示神經鞘細胞的關鍵性角色，但這些研究受害於依靠後來的資訊推論先前的事情。允許Nf1之組織專一刪除的有條件Nf1基因剔除小鼠模式，已經對該過程有了解決線索。在與生理學有關的全面異型接合性方面，這些研究顯示叢狀神經纖維瘤形成的遺傳瓶頸可能在於在胚胎神經鞘細胞譜系中Nf1異型接合性的喪失。這些腫瘤的組織病理學分析，幾乎與天然的人類腫瘤無法區別。
小鼠遺傳學的力量顯示微環境的關鍵性角色，其在不同的遺傳構型下可能是許可腫瘤或抗腫瘤的。數據指出在神經鞘細胞譜系之外的Nf1異型接合性，為腫瘤形成所必需的。例如，肥大細胞浸潤至周圍神經內，在這些小鼠中在出現腫瘤之前幾個月出現，但在非腫瘤形成之Nf1野外型( flox/flox )基因型中則否。已經在人類神經纖維瘤中觀察到肥大細胞，雖然在小鼠模式中沒有，可能沒有直接研究在腫瘤發育或維持中之功能角色的檢查。有趣的是注意到已經以額外的Cre轉殖基因複製Nf1單倍不足的需求，該Cre轉殖基因靶定神經脊神經鞘細胞譜系，包括骨膜蛋白(periostin)-Cre、P0-Cre和他莫昔芬(tamoxifen)可誘導之PLP-Cre。這些觀察進一步確認對於在神經鞘細胞譜系之外Nf1異型接合性的需求。使用組織專一之Cre轉殖基因收集的數據，並未排除腫瘤可在野外型環境中，在實驗不自然條件下發展的可能性。確實，當我們利用神經脊專一之Cre驅動子(driver)，其具有早期、廣布和穩健的表現時，我們觀察到周圍神經的增生，即使是在 flox/flox 小鼠中，雖然比在 flox/ - 小鼠中低。
在本文中揭示之結果說明後者模式違反了在帶有NF1之人類中的生理學狀況，其中LOH是如此罕見的隨機事件，在分離時升高的零合胚胎神經鞘細胞前驅物，在微環境中處於相對較不利的地位，發育成腫瘤。這些小鼠模式指出細胞的經分離零合囊，藉著與經招募之異型接合肥大細胞的明顯協同作用，得到顯著的選擇性優點。這些結果的一個解釋，與數據相符，是在穩健Cre介導之重組模式上的增生，反映出Nf1非生理學的廣泛喪失，不僅在神經鞘細胞中，還有在額外譜系中的額外Nf1喪失，其可能克服經分離LOH的障礙。
神經纖維瘤形成與周圍神經有關，並包括神經鞘細胞、內皮細胞、纖維母細胞、脫顆粒性發炎性肥大細胞，以及外被細胞(pericytes)/血管平滑肌細胞(VSMCs)和某些大型膠原蛋白沉積物。Nf1有條件之基因剔除小鼠模式證實來自人類腫瘤的回顧研究，證實在神經鞘細胞譜系中Nf1的異型接合性喪失(loss of heterozygosity,LOH)，似乎對誘發神經纖維瘤是必要但非充分的。如同所報告的，腫瘤進行需要在腫瘤微環境中，在神經鞘細胞與Nf1單倍不足細胞譜系之間的複雜交互作用。因此，在Nf1 WT背景中，在神經鞘細胞中的Nf1零合性對於引起腫瘤形成可能是必要的，但不一定是足夠的。形成腫瘤之異型接合小鼠的一項經報告特徵，是在周圍神經中出現肥大細胞，完全在腫瘤發育之前。此外，混合經神經鞘細胞條件化之培養基與肥大細胞的試管內實驗，證實Nf1異型接合之肥大細胞對得自零合神經鞘細胞之條件化培養基的敏感性。不希望與任何特定的理論結合，我們假設形成那些類型腫瘤的模式，包括前贅瘤周圍神經的Nf1異型接合之肥大細胞浸潤，並與Nf1零合之神經鞘細胞結合，促成了腫瘤發育。
發現異型接合NF1 +/- 衍生之骨髓的繼承性轉移，足以與內在的零合神經鞘細胞譜系專一性摘除合作，以誘導腫瘤形成，在不同的WT環境中，暗示需要屬於骨髓衍生細胞的單倍不足，但不是在這些腫瘤中發現的其他細胞類型。此外，對於在捐贈者骨髓中c-Kit發送信號的遺傳需求，以及捐贈者異型接合之肥大細胞浸潤至初期的周圍神經腫瘤內，強烈地支持此一構成因果交互作用的假設。
該c-Kit受體在肥大細胞發育和功能上具有重要的角色。神經鞘細胞和纖維母細胞，神經纖維瘤的兩種主要組份，反映許多不同刺激而分泌kit-配體。例如，已經在神經纖維瘤組織中報告了升高的kit-配體mRNA轉錄本，並業已報告了NF1患者在其血清中有升高水平的kit配體。在前臨床試驗中，認為甲磺酸伊馬替尼-FDA批准的藥理學製劑，藉著抑制某些酪胺酸激酶，包括c-Kit而產生作用。
當在疾病的小鼠模式中測試對抗神經纖維瘤之效力時，甲磺酸伊馬替尼展現出驚人的效力。投予治療有效劑量的該化合物，對逆轉神經纖維瘤病理學有戲劇化的影響。以伊馬替尼治療，結果使肥大細胞從在以該化合物治療之動物的周圍神經中消失。除了擴大試管內研究(其證實c-Kit介導在NF1神經鞘細胞和異型接合之肥大細胞之間的交互作用)之外，活體內研究亦鑑認出對甲磺酸伊馬替尼有反應之腫瘤維持的持續需求。
發炎反應和肥大細胞在腫瘤發育中的角色，是研究的主動領域。肥大細胞釋放發炎反應的介體，包括組織胺、5-羥色胺、蛋白多糖和白三烯(leukotriene)，隨後活化高親和力IgE受體(FcεRI)和c-kit受體。而且，據說肥大細胞釋放VEGF，一種血管生成因子，其亦是對神經鞘細胞有效的增殖、存活和趨化性因子。VEGF亦在腫瘤形成中與血管生成的改變有關。最後，肥大細胞亦釋放PDGF-β，一種促進外被細胞和纖維母細胞增殖之生長因子；以及TGF-β，一種促進纖維母細胞增殖和膠原蛋白合成的生長因子。
甲磺酸伊馬替尼和腫瘤微環境
在神經纖維瘤的情況下，一個重要的問題是肥大細胞如何與神經鞘細胞合作，誘發腫瘤形成？在本文中提交之數據指出在腫瘤中的其他細胞類型不一定是異型接合的。然而，太早以致於不能斷言浸潤性Nf1異型接合之肥大細胞是否主要地互相作用在零合的神經鞘細胞上，以促進腫瘤形成，或者與局部基質和亦出現在這些腫瘤中之其他細胞類型的間接交互作用是否為腫瘤誘導的必要中間者。對於在神經纖維瘤中額外旁分泌(paracrine)交互作用的較佳瞭解，以及其等如何影響腫瘤形成及維持，則等候額外的研究。
此外，在本文中以及在先前之試管內研究中報告的遺傳結果，證實了甲磺酸伊馬替尼抑制多重NF1 +/- 外被細胞和纖維母細胞的腫瘤促進性功能。再者，在這些額外的腫瘤細胞中，缺少對異型接合性的需求，並未排除甲磺酸伊馬替尼引起腫瘤退化之能力，可能不是僅由其對肥大細胞之抑制活性引起的可能性。藉以解釋而非限制，提出下列的假設：以化合物(如甲磺酸伊馬替尼)治療減少腫瘤的事實，為本發明之觀點，且絕不依賴任何特定理論或提出以企圖解釋該結果之說明的真實度。甲磺酸伊馬替尼，以及與該化合物相同或類似家族的化合物，可偶然地在其他腫瘤細胞類型中抑制額外及/或其他可能的關鍵性腫瘤促進性活性。例如，除了抑制在肥大細胞中的c-Kit之外，甲磺酸伊馬替尼亦可經由PDGFR降低血管生成，並經由c-Ab1減少纖維變性/膠原蛋白產生。可能需要額外的調查，以解決這些關鍵性和吸引人的情況，在此期間，觀察該化合物在神經纖維瘤之小鼠模式中，以及在與病症(如叢狀神經纖維瘤)有關之人類患者中引起腫瘤退化的有效劑量。
c-kit減少腫瘤尺寸和代謝活性的藥理學抑制可用以實行本發明之化合物包括式1化合物：
其中R1 為4-吡基；1-甲基-1H-吡咯基；經胺基-或胺基-低碳烷基-取代之苯基，其中在每個情況下的胺基基團是游離的、經烷基化或經醯化的；在5-員環碳原子處結合的1H-吲哚基或1H-咪唑基；或在環碳原子處結合且在氮原子處未經取代或被氧取代之未經取代或經低碳烷基取代的吡啶基；R2 和R3 係彼此獨立地為氫或低碳烷基；基團R4 、R5 、R6 、R7 和R8 之一或二，分別為硝基、經氟基-取代的低碳烷氧基，或式Ⅱ之基團-N(R9 )-C(=X)-(Y)n -R10 (Ⅱ)，其中R9 為氫或低碳烷基，X為側氧基、硫基、亞胺基、N-低碳烷基-亞胺基、羥亞胺基或O-低碳烷基-羥亞胺基，Y為氧或基團NH，n為0或1，且R10 為具有至少5個碳原子的脂肪族基團，或芳香族、芳香族-脂肪族、環脂肪族、環脂肪族-脂肪族、雜環或雜環-脂肪族基團，而剩下的基團R4 、R5 、R6 、R7 和R8 係彼此獨立地為氫、未經取代的或被游離或經烷基化之胺基、六氫吡基、六氫吡啶基、吡咯啶基或被嗎啉基，或低碳鏈烷醯基、三氟甲基、游離、經醚化或經酯化之羥基、游離、經烷基化或經醯化之胺基，或游離或經酯化之羧基取代之低碳烷基，或為這類具有至少一個鹽-形成性基團之化合物的鹽。
在專利申請案美國專利第5,521,184號中普通且專一地揭示了式1化合物，特別是申請專利範圍之化合物，以及工作實施例的終產物，將其內容全部以引用方式納入本文中。在以上之式1化合物的定義中，基團和符號具有在美國專利第5,521,184號中提供之意義，全部以引用方式納入本文中。
為了本發明之目的，可以其單-甲磺酸鹽之形式施用伊馬替尼。可根據在美國專利第6,894,051號中揭示的製程，製備伊馬替尼單-甲磺酸鹽，全部以引用方式納入本文中。同樣地包括相對應之多形體，例如其中揭示的結晶修改。
在成年患者中，口服投予在大約200到大約800毫克之間，例如400毫克之伊馬替尼單-甲磺酸鹽的每日劑量。可以在美國專利第5,521,184號、美國專利第6,894,051號、US2005/0267125或WO2006/121941中描述之劑型，投予伊馬替尼單-甲磺酸鹽，全部以引用方式納入本文中，就如同分別將其納入一般。關於這些化合物的額外討論，請參見例如美國專利申請案第11/815,046號，現在是2008年5月15日發表之美國公開案第2008/00114001 A1號，全部以引用方式納入本文中。
一種對於治療認為其涉及酪胺酸激酶活性之疾病特別有用的化合物，為化合物甲磺酸伊馬替尼(4-(4-甲基六氫吡-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基胺基)苯基]-苯甲醯胺)伊馬替尼，例如可根據在WO03/066613中揭示之製程來製備。在式3中出示了該化合物之藥學上可接受之鹽，為甲磺酸伊馬替尼，如下：
甲磺酸伊馬替尼是有效的c-Kit、PDGF-BB和c-abl酪胺酸激酶之抑制劑。該化合物以經商標保護之名稱基立克(Gleevec)上市販售。在美國已經批准用來治療患有Kit-表現性(CD117+)的患者。根據美國國家指引交換中心(National Guideline Clearinghouse)(www.guidline.gov)，成人患者最初的建議劑量水平為400毫克，每天投藥兩次。精確的治療有效劑量為患者特有的，並由處方醫師基於各種因素來決定，包括患者的體重、年齡、性別、年齡、整體健康和對藥物的反應。
小鼠模式的限制之一為動物的短壽命，不能基於小鼠研究來預測長命的腫瘤如何反應。然而，這些利用小鼠模式的結果，強烈地暗示以這些化合物治療可以並會對受相同腫瘤侵襲之人類有有利的影響。對該假設的額外支持來自當以甲磺酸伊馬替尼治療人類患者時獲得意外的良好結果，其在人類患者中成功地減少了腫瘤的尺寸。
藉以解釋而非限制，提供以下的討論。近年來，在特發性癌症的發展之下，與細胞和分子機制有關的理論，已經經歷了重大的演變。細胞自主事件的原始想法傳至單一細胞，以克服其正常的調節，導致惡性疾病的發展，且目前正在協同再調查腫瘤起源之細胞類型的同一性。然而在單一細胞中一系列遺傳和後生的事件開始了朝向惡性表現型的軌道，變得越來越清楚，大多數形式的癌症包括寬容之微環境的共同-選擇，其允許且甚至促進了腫瘤形成狀態，而根據該假設，有抵抗力的環境基本上會排除腫瘤形成的可能性。在對腫瘤形成之共同-選擇許可過程鑑認之非-細胞自主的促成者中，有新血管生成、局部基質的參與，以及發炎反應中的其他細胞類型。瞭解旁分泌交互作用的精確順序、相對重要性和非腫瘤形成環境交互作用之分子基礎，仍停留在初步階段。然而，絕不是藉著任何經假設的作用模式或所提出之各種疾病或病症(其可使用在本文中描述之材料及/或方法大膽地治療或控制)的分子病因學，來限制在本文中揭示之化合物的治療用途。
這些數據與在叢狀神經纖維瘤形成中之骨髓衍生細胞的角色一致。這些數據亦指出c-kit受體的藥理學和遺傳抑制可預防或至少延遲在Nf1小鼠中形成叢狀神經纖維瘤。這些結果表示在腫瘤微環境中需要骨髓衍生細胞的Nf1單倍不足，且特別是依賴c-kit受體活化的那些，以允許神經纖維瘤進行。該數據牽涉到在腫瘤形成中成為主動參與者的肥大細胞，並鑑認出人類第1-2期臨床試驗的新穎治療目標。
本揭示內容提供人類癌症在生理學上相關之小鼠模式的實例，該小鼠模式對於在起源之腫瘤細胞和微環境之間的複雜交互作用，提供了具體的洞察力。同時，使用小鼠作為人類疾病之模式的研究，暗示藉著靶定腫瘤形成的微環境，而不是腫瘤形成細胞，來治療迄今不能治療之腫瘤的可能治療途徑。因為在人類和小鼠之間有相當大細胞和生理學差異，故使用化合物(如甲磺酸伊馬替尼)治療人類之神經纖維瘤的效力，只能藉著以該化合物成功地治療人類來”證明”。至少一部分是因為人類通常比小鼠活得更久，甲磺酸伊馬替尼治療患有病症(如神經纖維瘤)之人類的能力，不像使用該化合物治療慢性骨髓性白血病的狀況，可能導致藥物抗藥性的發展。在CML中，認為甲磺酸伊馬替尼直接作用在白血病細胞上，且對準經突變之組成上有活性的酪胺酸激酶致癌蛋白(oncoprotein)(Bcr-abl)。Bcr-abl致癌基因可經由獲得第二位置突變，而發展出藥物抵抗力。相反的，主要可能是若抗-c-kit製劑(如甲磺酸伊馬替尼)對神經纖維瘤的非獨佔活性，是對非-腫瘤細胞作用，例如對WT蛋白質，則對其可能沒有選擇藥物抵抗力的便捷路徑。
我們已經鑑認出在試管內對Nf1異型接合之肥大細胞具有比甲磺酸伊馬替尼高10倍之多的抑制活性的化合物(未經發表的結果)。已經報告了極少數的案例，其中患者患有范瑞克林浩森氏神經纖維瘤病和白斑病(piebaldism)。這些研究推論白斑病起因於c-kit受體的次形態(hypomorphic)突變。報告說這些患者缺少神經纖維瘤。禁戒的其他似合理性解釋是這些個體缺乏肥大細胞。因此，這些報告可提供c-Kit和肥大細胞在人類神經纖維瘤形成上之重要性的證明。
在本文中討論之神經纖維瘤小鼠模式的遺傳和細胞可塑性，顯示在腫瘤形成時有關微環境參與的重要細節，其與范瑞克林浩森氏神經纖維瘤病之情況以外的人類癌症有普遍的關聯。
實驗
材料和方法
動物和試劑
先前已經描述了在這些研究中使用的Krox20；Nf1 flox/f1ox 小鼠(Zhu等人,2002)，”在NF1中的神經纖維瘤：神經鞘細胞起源和腫瘤環境的角色(Neurofibroma in NF1：Schwann cell origin and role of tumor environment)”Science 296,920-922。欲產製Krox20；Nfl fl ox / - 小鼠，我們使Krox20；Nfl flox/flox 小鼠與Nf1 +/- 小鼠雜交。由在印地安那大學醫學院(Indiana University School of Medicine)的實驗動物管理委員會(the Institutional Animal Care and Use Committee)批准所有涉及使用動物的程序。除非另行陳述，化學藥品均購自Sigma(St.Louis,MO)。
造血細胞的繼承性轉移
為了評估叢狀神經纖維瘤進行之微環境調節的角色，進行骨髓移植。簡言之，以每個接受者兩百萬個，將得自WT GFP或Nf1 + / - GFP小鼠之同基因WT或Nf1 + / - 骨髓細胞，繼承性轉移至以1100雷得的游離輻射(以兩個分割劑量投予)處理之後的年輕成年Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠和Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠內。
PET影像分析
為了證實並對叢狀神經纖維瘤進行解剖定位，進行經組合[18 F]氟脫氧葡萄糖([18 F]FDG)PET和x-射線CT顯影。在收集CT影像時，將模板放在區域側面上方，以獲得經標準化的感興趣體積(volume of interest,VOI)，藉此使研究人員能夠定量FDG攝取。使用登記過並經覆蓋的CT影像數據，以鑑認特定的脊椎(例如從L1到S1的界標)。然後操作者沿著脊髓選擇數點，以判定脊髓通過L1到S1之間的路徑。接下來，沿著脊髓將三個環狀的感興趣區域(regions-of-interest,ROI)放在插入點，以捕捉脊髓和背根神經節區域。最後，組合環狀的ROI’s，創造出脊髓、左背根神經節和右背根神經節的VOI’s。在經由尾靜脈注射，注射大約0.5-1.0毫居里FDG之後45分鐘，獲得FDG影像。所有動物均得到FDG注射，在注射後大約40分鐘，雖然醒著但以異氟烷(isoflurane)麻醉，以便使動物在顯影時保持不動。
在非腫瘤形成的Krox20；Nfl flox/flox 小鼠和Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠(其發展出具有完全表現率(penetrance)之神經纖維瘤)中進行預備顯影研究。在預備研究中，背根神經節和近端周圍神經的實驗性PET顯影和解剖剖面兩者，都無法在6個月齡之前的任何小鼠中偵測到腫瘤，不考慮基因型(數據未顯示)。類似地，在9個月大Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的腰薦區有少許FDG攝取(圖8A)。相反的，9個月大Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠的FDG PET掃描，其中腫瘤盛行於坐骨神經，證實在脊椎腰部有特別增加的FDG-PET強度(圖8A；箭號)。經顯影動物之後的驗屍，提供了與FDGP ET顯影鑑認之腫瘤相符合的證明(圖8B)。在圖8C中出示得自Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠之隊伍對具有相當年齡之Krox20；Nf1 flox/flox 隊伍的摘要FDG-PET影像數據。這些研究確認非侵入性FDG-PET顯影，適合在Krox20；Nfl flox/ - 小鼠中鑑認叢狀神經纖維瘤。
背根神經節的剖面
在犧牲其等之後，馬上以4%仲甲醛灌注並固定小鼠屍體。然後在解剖顯微鏡下切開背根神經節和周圍神經。以2%仲甲醛、2.5%戊二醛和0.1M二甲胂酸鹽(cacodylate)(pH7.4)灌注固定會藉著電子顯微鏡分析來分析的小鼠組織。
腫瘤尺寸的測量
為了評估腫瘤尺寸，在使用測徑器測量近端背根神經節的最大可能寬度和長度之後，進行背根神經節尺寸的解剖測量。藉著建立球體之近似體積(例如0.52x(寬度)2 x長度)，判定腫瘤的體積。
在背根神經節中捐贈者細胞的表現型評估
欲檢查來自捐贈者的細胞類型(其重建成腫瘤)，進行流動式細胞測量(flow cytometric)分析。簡言之，切開背根神經節、剁碎，並藉著膠原蛋白酶V消化。然後將單一細胞懸浮液與抗CD117、CD31或Col1A和FcεRI及抗體混合。然後使用螢光活化細胞分類儀(fluorescence-activated cell sorter)(Becton Dickson)分離族群。
組織學分析
欲詳細檢查腫瘤的形態學，以蘇木素和曙紅(H&E)染色石蠟切片。膠原蛋白佔人類叢狀神經纖維瘤之乾重的大約60%。亦以梅森氏三重染色組織切片。欲判定肥大細胞出現在腫瘤中，進行艾爾遜藍染色。
穿透式電子顯微鏡檢查
在灌注固定之後，以連續梯度的乙醇和丙酮將組織脫水，並包埋在Epon-Araldite(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)中。以醋酸鈾醯(uranyl acetate)和檸檬酸鉛染色超薄切片(銀到金)，並以FEI Tecnai G2電子顯微鏡(Philips,Eindhoven,Netherlands)檢查。
實驗1
Nf1異型接合之骨髓(BM)的繼承性轉移，減少了與接受者存活有關的腫瘤
現在參考圖1，圖解說明接受者小鼠的基因型，在接受者的游離輻射之後，經繼承性轉移之細胞的基因型，並在移植後獲得測量值。為了測試以下的假設：在腫瘤微環境內，在造血細胞中之Nf1的異型接合性為神經纖維瘤形成所需之遺傳單倍不足的原因，我們將Nf1異型接合之骨髓轉移至在大約10%神經鞘細胞中藏有兩個消除Nf1對偶基因之Krox20-Cre轉殖基因的小鼠(Krox20；Nf1 flox/flox )內。Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠在所有細胞譜系中在功能上為野外型，且沒有觀察到神經纖維瘤。作為互補實驗，將WT骨髓細胞移植到含有Nf1之生殖種系零合的對偶基因，以及如上在神經鞘細胞譜系中，對重組有感受性的經flox化之對偶基因的小鼠(Krox20；Nfl flox/ - )中。Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠如同先前的描述(Zhu等人,2002)，獨特地發展出叢狀神經纖維瘤。將一部分Nf1 + / - 或WT骨髓繼承性轉移至接受游離輻射後的接受者內，並監視叢狀神經纖維瘤的發展和與這些腫瘤有關的死亡率，直到一歲大為止。
現在參考圖2A，在每個線圖旁邊指出基因型。一旦小鼠顯示出主要病態的明顯症狀便將其犧牲。Y-軸顯示存活小鼠的百分比。比較Krox20；Nf1 flox/flox + Nf1 + / - BM(虛線)對Krox20；Nf1 flox/flox + WT BM(空心正方形)(p<0.002)；Krox20；Nf1 flox/flox + Nf1 + / - BM(虛線)對Krox20；Nf1 flox/ - (空心圓形)-無顯著差異。Krox20；Nf1 flox/ - (空心圓形)對Krox20；Nf1 1lox/ - +WT骨髓(實心正方形)(p<0.002)。在移植之後6個月，以異型接合之Nf1 + / - 骨髓接枝的有功能之生殖種系WT(Krox20；Nf1 flox/flox )接受者，開始展現出運動麻痺、體重喪失，且在整個實驗期間僅有15%小鼠存活，參見例如圖2A&B。該死亡率充分反映出先前在生殖種系異型接合之Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠中觀察到的(圖2A)。相反的，大約90%以WT骨髓重建的Krox20；Nf1 fl ox /flox 小鼠仍活著，並顯示沒有叢狀神經纖維瘤形成的臨床特徵(圖2A)。藉著相反的實驗證實這些數據，其中將WT骨髓細胞移植到生殖種系異型接合之Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠內，恢復存活至可與非腫瘤形成之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠(其含有完整的骨髓)相比擬的水平(圖2A)。
現在參考圖2C，以WT或Nf1 + / - 骨髓移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的背根神經節和周圍神經的剖面照片。箭頭鑑認在背根神經節和近端周圍神經中的腫瘤。發病小鼠之腦部和脊髓的驗屍，顯示22隻Nf1 + / - 骨髓移植接受者中的21隻，與以WT骨髓移植之無病徵小鼠的脊髓相比較，有整個脊髓的厚度增加。該異常形態學與腫瘤形成的Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠類似。
現在參考圖2C，帶有不同遺傳組合之小鼠的背根神經節，箭頭鑑認供應出現運動麻痺之肢體的神經節。圖2C的方格2和3顯示從以Nf1 + / - 骨髓移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的背根神經節中產生的個別腫瘤，而這些腫瘤特別盛行於坐骨神經。腫瘤的體積分析顯示與未發展出腫瘤之小鼠中不受影響的背根神經節相比較，體積增加了3-6倍。浸潤坐骨神經和腰薦神經叢之腫瘤的大尺寸和解剖位置，可能足以說明所觀察到的行為異常、後肢麻痹、腎盂積水(hydronephrosis)和增大、弛緩性膀胱(圖2B)。總而言之，這些數據指出在神經鞘細胞喪失異型接合性的情況下，出現NF1異型接合之骨髓，足以重現最初在Krox20；Nf1 flox/ - 腫瘤形成小鼠中觀察到的發病率和周圍神經增生。
實驗2
Nf1+ / - 骨髓(BM)接受者發展出叢狀神經纖維瘤
現在參考圖3A，病理學分析證實了在Nf1異型接合之骨髓接受者中出現叢狀神經纖維瘤。方格1和6是得自以WT BM移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的切片。方格2、3、7、8是得自以Nf1 + / - BM移植之Krox20；Nf1 1lox/flox 小鼠。方格4、5、9、10是得自以WT BM移植之Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠。在100X下以光學顯微鏡取得在上排方格中的照片，同時在200X下取得在下排方格中的照片。得自以Nf1 + / - 骨髓移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的背根神經節，顯示出人類叢狀神經纖維瘤的典型組織學特徵，包括正常構造的破裂；波狀的神經鞘細胞和具有濃染細胞核(hyperchromatic nuclei)的浸潤性細胞(圖3A，方格7-8)；過量的膠原蛋白沉積(圖3A，方格2-3)；血管生成(圖3C，在方格3中的大箭頭鑑認血管)；以及典型的超結構異常(圖7)。在圖7中，方格1-4，750X，方格5-8，1500X。方格1-2：得自以WT BM移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的近端脊髓神經；方格3-8：得自以Nf1 +/- BM移植之接受者的近端神經。在這些照片中，(U)代表無髓鞘軸突；(S)表示神經內衣腔的擴展；箭頭鑑認膠原蛋白束；而(M)表示浸潤腫瘤的肥大細胞。相反的，得自以WT骨髓移植之Krox20；Nf1 flox/flox 或Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠的神經，顯示出外觀正常、在整個背根神經節和近端周圍神經之切片中均勻分布的核(參見，例如圖3A，方格1、4-6和9-10)，且沒有膠原蛋白沉積的證據。從以Nf1 +/- 骨髓移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠中分離之腫瘤，具有叢狀神經纖維瘤的組織學特徵。
現在參考圖3B，方格4-5，新生血管化(neovascularization)，且仍保持正常的超-結構形態學(圖7)。神經纖維瘤是包括多個細胞類型的複雜腫瘤，其中LOH僅出現在神經鞘細胞譜系中(Zhu等人,2002)。肥大細胞浸潤是人類和鼠類叢狀神經纖維瘤的特徵(Zhu等人,2002)。在本文使用之該病症的鼠類模式中，我們觀察到在腫瘤出現之前，周圍神經就先被肥大細胞浸潤。因此，重建Krox20；Nf1 flox/f1ox 小鼠的異型接合骨髓亦展現廣泛的肥大細胞浸潤(圖3C，方格2-3)。使用螢光細胞計數法，以純化在以Nf1 +/- 骨髓移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的神經纖維瘤中的內皮細胞(CD31)、纖維母細胞(Col1A)和造血細胞(c-Kit，CD117)。
現在參考圖3D，箭頭鑑認來自個別表現型譜系之經指定對偶基因的經擴大DNA產物。驚人的是，隨後的基因定型顯示只有c-Kit族群，其亦表現FcεRI(未顯示)，藏有Nf1無效對偶基因(null allele)(圖3D)。這些數據與在經重建之Krox20；Nf1 flox/flox 中真正的叢狀神經纖維瘤的外觀一致，包括使經移植之異型接合的肥大細胞回到Nf1零合之神經鞘細胞的位置。
現在參考圖3E，分離骨髓(BM)(譜帶1)和腫瘤細胞(方格2)，並藉著EGFP+；CD45.2陽性族群分類。為了肥大細胞(方格3)、巨噬細胞(方格4)、B-淋巴細胞(方格4)和T-淋巴細胞(方格5)，進一步分離與腫瘤有關的CD45.2細胞。該圖指出在腫瘤內每種造血細胞族群的比例。
現在參考圖3F，藉著FCAS從以Nf1 +/- 骨髓(BM)移植之Krox20；NF1 flox/flox 小鼠的腫瘤中分離譜系的基因型。在圖3F中的箭號，指出在凝膠上由分離自所指示之表現型譜系的相同對偶基因之經擴大DNA產物形成的譜帶。
Nf1 +/- 骨髓介導之腫瘤形成需要c-Kit
在經重建的叢狀神經纖維瘤中僅偵測到Nf1異型接合細胞是衍生自骨髓。該發現與我們先前在試管內和在活體內涉及在腫瘤形成時需要肥大細胞單倍不足的觀察一致。認為c-kit受體酪胺酸激酶(RTK)控制肥大細胞發育和功能的許多方面。我們已經報告c-Kit活性似乎支配Nf1 +/- 骨髓衍生之肥大細胞的移行、增殖和存活。我們假設在病症之間的相關性，並測試在移植到Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠內之Nf1 +/- 骨髓細胞中之c-kit活性的遺傳瓦解，對腫瘤進行的努力。
在經繼承性轉移Nf1 +/- 骨髓中之c-kit的遺傳瓦解，在接受者Krox20；Nf1 flox/f1ox 小鼠中預防了叢狀神經纖維瘤的發生。簡言之，使Nf1 +/- 小鼠獨立地與兩個次形態品系的小鼠雜交，該次形態品系之小鼠藉著在c-kit受體中的點突變而具有經抑制的肥大細胞移動，其分別降低激酶活性85%(W41/W41)到95%(Wv/Wv)。
現在參考圖4A。將得自Nf1 +/- ；Wv/Wv 或Nf1 +/- ；W41-W41雙重突變小鼠的骨髓，分別移植到五和十隻Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠中。當與以Nf1 +/- 骨髓移植之Nf1 flox/flox 小鼠相比較時，明顯地減少了以Nf1 +/- ；W突變骨髓接枝之小鼠的發病率。追蹤以Nf1 +/- 或Nf1 +/- ；W突變骨髓移殖的Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠1年。指出在兩組之間的基因型和統計顯著性。因此，與Nf1 +/- 骨髓的接受者相反，得自以Nf1 +/- ；W突變骨髓移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的背根神經節和近端周圍神經，具有正常的形態學，且沒有顯示肥大或腫瘤的證據(圖4B)。這些結果支持以下假設：在骨髓中產生Nf1單倍不足，並進一步改良活性組份對c-kit依賴性細胞類型的同一性。現在參考圖4C，顯示為基因型之函數，得自Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠之坐骨神經的個別背根神經節(DRG)的體積作圖。每個個別的點代表個別DRG的體積，而線代表得自各個實驗組的平均體積。以Nf1 +/- 骨髓細胞重建的接受者，具有明顯比以Nf1 +/- 骨髓(其亦在c-kit受體中含有突變，而使c-kit路徑失活)(Nf1 +/- ；W/W)重建之小鼠高的平均坐骨神經DRG體積。
現在參考圖4D，在方格1-3中出示的切片是經H&E染色的。在方格4-6中的切片是經艾爾遜藍染色的。箭頭強調肥大細胞。在方格各欄之下，指出經繼承性轉移之骨髓的基因型。
實驗4
欲評估甲磺酸伊馬替尼和其他可能之藥理學製劑對腫瘤負荷的活性，我們批准非侵入性的經氟化脫氧葡萄糖正電子發射斷層攝影(fluoridinated deoxyglucose positron emission tomography FDG-PET)顯影協定，允許在Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠中鑑認並縱向觀察叢狀神經纖維瘤(亦參見方法章節和圖8)。
現在參考圖5A，在以甲磺酸伊馬替尼治療12週之後，在平均FDG-PET陽性腫瘤上的影像改變。感興趣的區域，在3隻個別小鼠中的顳部連續掃瞄，並鑑認實驗治療組。我們接著鑑認8至9個月大的Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠隊伍，證實在以250毫克/公斤/天之甲磺酸伊馬替尼或安慰劑對照組(PBS)口服治療的坐骨神經區中有PET陽性攝取。FDG-PET顯影研究之後，接著評估腫瘤的演變。顯示在得自以甲磺酸伊馬替尼或PBS治療三週之前和之後顯影的三隻小鼠之受影響神經的代表性FDG-PET軸切片。如同預期，在以甲磺酸伊馬替尼或PBS治療之前，在Krox20；Nf1 flox/ - 動物之脊髓側面看到增加的FDG攝取(圖5A，方格1、3、5)。令人印象深刻的是，與PBS對照組相比較(圖5A，方格6)，在以甲磺酸伊馬替尼治療之Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠(圖5A，方格2-4)中，FDG攝取有性質上的減少。欲小心地定量在所有經治療動物中的FDG-PET強度，在每隻動物中使用經標準化的感興趣區域(ROI)，以選取定量FDG攝取值(毫居里/毫升組織)。使用圓柱形狀的三次元ROIs，以ROI圓柱包覆脊柱側面的區域，並在所有的情況下使用從L1到S1的特定脊椎界標，以確保一致性。在方格7-8(圖5A)中出示得自在治療前後之實驗動物的代表性結果。這些影像說明了以甲磺酸伊馬替尼治療，在該動物中減少了腫瘤尺寸。現在參考圖5B，是對一隊12隻實驗小鼠的坐骨神經區ROIs作圖，以圖表形式提交的PET顯影結果摘要。大體而言，以甲磺酸伊馬替尼治療之小鼠，在治療後有平均50%的FDG-PET攝取減少(p<0.035)。相反的，在以PBS治療之隊伍中的腫瘤代謝活性，有適度但不顯著之FDG攝取比例上的增加，與在Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠中出現之叢狀神經纖維瘤中隨著時間之函數觀察到的FDG漸進性攝取相當。
欲判定在代謝活性(FDG攝取)上的改變是否與在腫瘤中的組織學改變有直接關係，犧牲經顯影的隊伍，檢查脊髓，並製備組織學評估的切片。
現在參考圖5C，得自所有以媒劑安慰劑對甲磺酸伊馬替尼治療之Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠的坐骨神經之背根神經節的平均體積(在媒劑對照組中n=28，且在基立克治療組中n=28)。實線代表每組的平均體積。每個符號代表個別神經的體積。在驗屍之後，我們亦比較得自年齡相當之Krox20； Nf1 flox/flox 小鼠隊伍的所有背根神經節的體積。與FDG-PET顯影研究一致，在以甲磺酸伊馬替尼治療組中，與PBS治療組相比較，在背根神經節體積上有明顯的降低。
亦在以甲磺酸伊馬替尼或PBS治療之小鼠中，進行背根神經節和近端周圍神經的組織學評估。現在參考圖5D，顯示以H&E染色、艾爾遜藍染色和梅森氏三重染色的代表性切片。在圖片的左邊指出實驗性療法，製備樣本所使用的染色。在圖片底部顯示在每組方格中的影像放大率。如同由欄位標題所示，在方格1-6中出示之試樣係獲自以甲磺酸伊馬替尼治療之小鼠；在方格7-12中出示之試樣係獲自僅以安慰劑治療之小鼠。在方格10中的箭頭鑑認在個別切片中找到的肥大細胞。在性質上，與經甲磺酸伊馬替尼治療之小鼠相比較，在獲自經安慰劑治療之小鼠的神經中有正常神經構造的明顯瓦解，以及細胞結構的增加。這在顯示末端背根和近端神經段的組織切片中得到說明(圖5D，比較方格1-6與方格7-12)。而且，與經PBS治療之對照組相比較，在從以甲磺酸伊馬替尼治療之小鼠中切下的神經中，在肥大細胞數目方面有顯著的減少(圖5D，方格3、4對方格9、10)。PET、巨觀解剖和組織學數據集體地鑑認甲磺酸伊馬替尼對減少在Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠中之腫瘤體積的可能性。
現在參考圖5E，說明在以伊馬替尼治療之小鼠與未利用該化合物治療的小鼠之間，在肥大細胞數目上之驚人差異的柱狀圖。現在參考圖5F，說明在取自以甲磺酸伊馬替尼治療之小鼠的試樣中，對未利用該化合物治療之小鼠，有較少Tunnel陽性細胞/HPF的柱狀圖。
對我們之小鼠模式的限制之一為動物的短壽命。因此，我們不能基於我們之小鼠研究來預測長命的腫瘤如何反應。可想像腫瘤細胞可隨著時間自然產生額外的特性，使其等變成不依賴某些早期的旁分泌事件，如肥大細胞神經鞘細胞交互作用。
實驗5
以甲磺酸伊馬替尼治療出現叢狀神經纖維瘤之孩童的特別用途
主要出現在帶有NF1之嬰幼兒中的叢狀神經纖維瘤，經常有快速生長並侵入鄰近器官的特徵，結果經常導致正常器官功能的損害。此外，這些腫瘤有進行至惡性的高可能性，對其卻沒有治療方法。即使是良性時，這些腫瘤也可能是威脅生命的，且目前主要的臨床挑戰-如手術治療，卻有受限的效力，而沒有可廣泛接受可供選擇的療法。出現NF1之典型臨床斑(stigmata)，包括大型三叉叢狀神經纖維瘤的三歲孩童，出現在小兒科腫瘤學醫院，伴隨有威脅生命的氣道壓迫。基於我們最近在小鼠模式上關於此一及相關病症的研究，主治醫師將小孩安置在350毫克/平方公尺/劑量的甲磺酸伊馬替尼，進行受限的試驗。
現在參考圖6，評估甲磺酸伊馬替尼在患有叢狀神經纖維瘤之指標患者中的效力。在兩個方格中，藉著深黑色線描繪腫瘤的周圍。在治療前(方格1)和在以甲磺酸伊馬替尼治療之後3個月(方格2)，患有叢狀神經纖維瘤之NF1患者的頭和口咽之矢狀MRI掃描。治療之前和3個月之後的MRI掃描，顯示在腫瘤體積方面，明顯減少了大約70%(圖6)。在治療6個月之後，沒有觀察到任何副作用。患者停止治療六個月，並沒有症狀的復發。
現在參考圖13A，在A、B排中的方格是冠狀MRI T1加重的STIR連續影像；分別為前-甲磺酸伊馬替尼(A排)和以甲磺酸伊馬替尼治療之後6個月(B排)。這些影像證實在治療之前和之後，顯示出明顯降低腫瘤尺寸的證據。
現在參考圖13B，在兩組連續的影像中，在前-甲磺酸伊馬替尼影像(C排)對後-伊馬替尼治療(在D排中的影像)中，注意到明顯變窄的上氣道(箭號)，被腫瘤推移到右邊。在以甲磺酸伊馬替尼治療之後獲得的影像，顯示對氣道擴大返回中線有明顯的改善。指出在個別影像中的腫瘤區域。
在人類中利用化合物甲磺酸伊馬替尼的藥學介入，結果導致叢狀神經纖維瘤尺寸的明顯減少，是清楚的證據。雖然考慮到這是單一患者的過程，但此一令人印象深刻的結果與在小鼠模式中的前臨床研究一致。
雖然將典型的具體事實納入已經在上文揭示之各種觀點和具體事實中，但本發明無意限制所揭示之具體事實。本申請案反而打算涵蓋任何使用在本文中揭示之一般原則揭示之資訊的變化、用途或改編。而且，本申請案亦打算涵蓋違反本揭示內容，但來自在與本發明有關之技術領域中已知或習慣作法的，且其在附錄之申請專利範圍及其相等物的限制之內。
藉著參考本揭示內容之具體事實的下列說明，連同附圖、圖式、計畫、公式以及類似者，上文-提及之本揭示內容的觀點，以及獲得其等之方式會變得更清楚，並會更佳地瞭解其觀點，其中：
圖1A.檢查造血微環境之角色之策略的圖解。
圖1B.使用螢光細胞計數法(fluorescence cytometry)產生的圖跡。在Krox20；Nf1 flox/flox 和Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠中，Nf1 + / - 骨髓對於叢狀神經纖維瘤形成是必要的。
圖2A.顯示為時間(x-軸)之函數的存活百分比(y-軸)的卡本-麥爾(Kaplan-Meier)作圖。追蹤以Nf1 + / - 或WT骨髓移植的Krox20；Nf1 flox/flox 和Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠，直到1歲大。
圖2B.以WT BM(1)或Nf1 + / - BM(2-3)移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的照片。
圖2C.以WT或Nf1 + / - 骨髓移植之Nf1 flox/flox 小鼠的背根神經節和周圍神經的解剖照片。箭頭鑑認在背根神經節和在周圍神經中的腫瘤。
圖3A.背根神經節和近端周圍神經的蘇木素和曙紅(H&E)切片。
圖3B.以梅森氏(Masson’s)三重染色之切片的200X放大照片。指出捐贈者骨髓和接受者小鼠的基因型。
圖3C.以艾爾遜(Alcian)藍染色之切片的200X放大。在方格2和3中的小箭頭鑑認肥大細胞。在方格3中的大箭頭鑑認血管。
圖3D.顯示在不同基因型之間，在肥大細胞數目上之差異的柱狀圖。藉著FACS從以Nf1 + / - BM移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的腫瘤中分離譜系。
圖3E.使用螢光細胞計數法，各種骨髓-衍生譜系之表現型評估數據的圖解表示。分離骨髓(方格1)和腫瘤細胞(方格2)，並針對EGFP+ CD45.2陽性族群分類。進一步分離與腫瘤有關的CD45.2細胞，以鑑認肥大細胞(方格3)、巨噬細胞(方格4)、B-淋巴細胞(方格4)和T-淋巴細胞族群。指出在腫瘤內每種造血細胞族群的比例。
圖3F.顯示藉著FACS從以Nf1 + / - BM移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的腫瘤中分離之譜系的基因定型的凝膠。箭頭鑑認從個別表現型譜系中所指示之對偶基因的經擴大DNA產物。
圖4A.顯示為時間(x-軸)之函數的存活百分比(y-軸)的卡本-麥爾作圖。
圖4B.以WT BM(方格1)或Nf1 + / - BM(方格2)移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的脊髓和背根之照片。箭頭鑑認在近端神經中的腫瘤。
圖4C.說明以不同基因型之捐贈者細胞測量背根神經節(DRG)尺寸的圖表。
圖4D.以Nf1 + / - 或Nf1 + / - ；W/W突變種骨髓移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的背根神經節和近端脊髓神經之代表性組織學切片的照片。
圖5A.說明以甲磺酸伊馬替尼治療Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠之效果的PET影像。
圖5B.在以甲磺酸伊馬替尼或PBS治療12週之後，在平均FDG-PET強度上之改變的圖解摘要。
圖5C.藉著切開某些周圍神經收集之數據的圖解表現。
圖5D.顯示以甲磺酸伊馬替尼或安慰劑治療之Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠的組織學分析的照片。
圖5E.顯示以甲磺酸伊馬替尼治療和沒有為函數作圖之肥大細胞數目/HPF的柱狀圖。
圖5F.顯示以甲磺酸伊馬替尼治療和沒有為函數作圖之Tunnel陽性細胞之數目/HPF的柱狀圖。
圖6.在以甲磺酸伊馬替尼治療之前和之後，患有叢狀神經纖維瘤之患者的MRI掃描。
圖7.藉著穿透式電子顯微鏡，背根神經節的超結構分析。方格1-4，750X，方格5-8，1500X。方格1-2：得自以WT BM移植之Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠的近端脊髓神經；方格3-8：得自以Nf1 + / - BM移植之接受者的近端神經。(U)無髓鞘軸突；(S)表示神經內衣腔(endoneurial space)的擴展。箭頭鑑認膠原蛋白束；(M)表示浸潤腫瘤的肥大細胞。
圖8.取自小鼠之組織試樣的顯微照片。這些影像說明使用FDG-PET來鑑認叢狀神經纖維瘤。在9個月齡時取得FDG-PET影像，並使Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠及Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠之脊髓神經的剖面顯影。
圖9.以甲苯胺藍(Toludine Blue)染色之組織試樣的顯微照片，並以100X和600X放大倍率顯示，箭號指出肥大細胞。
圖10.顯示分離自以Nf1 +/- ；Wv/Wv 骨髓移植之經照射Krox20；Nf1 flox/flox 接受者之骨髓的個別骨髓樣祖先之DNA之基因型鑑認的凝膠。
圖11A.使用FDG-PET鑑認叢狀神經纖維瘤。在9個月齡時取得FDG-PET影像，並使Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠及Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠之脊髓神經的剖面顯影。
圖11B.顯示得自在Krox20；Nf1 flox/ - 和Krox20；Nf1 flox/flo x 小鼠中坐骨神經之感興趣區域的FDG-PET之平均強度的圖表。
圖11C.得自來自Krox20；Nf1 flox/flox 小鼠(方格1)和帶有PET陽性腫瘤之Krox20；Nf1 flox/ - 小鼠(方格2-4)的背根神經節之代表性剖面的照片。
圖12.使用TUNEL接著以甲磺酸伊馬替尼或安慰劑治療，評估在叢狀神經纖維瘤中的細胞凋亡。得自以安慰劑對照組(左方格)或以甲磺酸伊馬替尼(右方格)治療之叢狀神經纖維瘤的代表性切片。箭頭表示TUNEL陽性細胞。
圖13A. MRI影像，頭和頸部。
圖13B.方格C、D：軸索MRI T2加重的連續影像；在分別以甲磺酸伊馬替尼治療6個月之前和之後。
使用相對應的參考數字以表示在數個視野中的相對應的部分。

Claims (18)

  1. 一種根據式1 的化合物或這類具有至少一個鹽-形成性基團之化合物的鹽之用途，其係用於製造用於治療叢狀神經纖維瘤之醫藥品， 其中R1 為4-吡基；1-甲基-1H-吡咯基；經胺基-或胺基-低碳烷基-取代之苯基，其中在每個情況下的胺基基團是游離的、經烷基化或經醯化的；在5-員環碳原子處結合的1H-吲哚基或1H-咪唑基；或在環碳原子處結合且在氮原子處未經取代或被氧取代之未經取代或經低碳烷基取代的吡啶基；R2 和R3 係彼此獨立地為氫或低碳烷基；基團R4 、R5 、R6 、R7 和R8 之一或二，分別為硝基、經氟基-取代的低碳烷氧基，或式Ⅱ之基團-N(R9 )-C(=X)-(Y)n -R10 (Ⅱ)；其中R9 為氫或低碳烷基，X為側氧基、硫基、亞胺基、N-低碳烷基-亞胺基、羥亞胺基或O-低碳烷基-羥亞胺基，Y為氧或基團NH， n為0或1，且R10 為具有至少5個碳原子的脂肪族基團，或芳香族、芳香族-脂肪族、環脂肪族、環脂肪族-脂肪族、雜環或雜環-脂肪族基團，而剩下的基團R4 、R5 、R6 、R7 和R8 係彼此獨立地為氫、未經取代的或被游離或經烷基化之胺基、六氫吡基、六氫吡啶基、吡咯啶基或被嗎啉基，或低碳鏈烷醯基、三氟甲基、游離、經醚化或經酯化之羥基、游離、經烷基化或經醯化之胺基，或游離或經酯化之羧基取代之低碳烷基，且其中該醫藥品中的根據式1 之化合物的治療有效劑量是在約200毫克至約500毫克之間的等級，並且每天至少一次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該化合物為式1 之藥學上可接受的鹽。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該式1 之藥學上可接受的鹽為甲磺酸鹽。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係用於包括診斷患有叢狀神經纖維瘤或類似病症之患者的步驟之方法。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係用於包括鑑認有發展出叢狀神經纖維瘤或類似病症之風險的患者的步驟之方法。
  6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品中治療有效劑量的根據式1 之化合物，是在大約350毫克到大約 450毫克之間的等級，並每天至少一次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
  7. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品中治療有效劑量的根據式1 之化合物，是大約400毫克，並每天兩次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
  8. 一種根據式2 之化合物的用途 其係用於製造用於治療叢狀神經纖維瘤之醫藥品，其中該醫藥品中的根據式2 之化合物的治療有效劑量，是在約200毫克至約500毫克之間的等級，並且每天至少一次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
  9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該化合物為式2 之藥學上可接受的鹽。
  10. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該醫藥品係用於包括診斷患有叢狀神經纖維瘤或類似病症之患者的步驟之方法。
  11. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該醫藥品係用於包括鑑認有發展出叢狀神經纖維瘤或類似病症之風險的患者的步驟之方法。
  12. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該醫藥品中治療有效劑量的根據式2 之化合物，是在大約350毫克到大約450毫克之間的等級，並每天至少一次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
  13. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該醫藥品中治療有效劑量的根據式2 之化合物，是大約400毫克，並每天兩次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
  14. 一種根據式3 之化合物的用途 其係用於製造用於治療叢狀神經纖維瘤之醫藥品，其中該醫藥品中的根據式3 之化合物的治療有效劑量，是在約200毫克至約500毫克之間的等級，並且每天至少一次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該醫藥品係用於包括診斷患有叢狀神經纖維瘤或類似病症之患者的步驟之方法。
  16. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該醫藥品係用於包括鑑認有發展出叢狀神經纖維瘤或類似病症之風險的患者的步驟之方法。
  17. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該醫藥品中治療有效劑量的根據式3 之化合物，是在大約350毫克到大約450毫克之間的等級，並每天至少一次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
  18. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該醫藥品中治療有效劑量的根據式3 之化合物，是大約400毫克，並每天兩次將具有該劑量之化合物的醫藥品投予患者。
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