KR101894769B1

KR101894769B1 - siRNA를 포함하는 신경섬유육종 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101894769B1
Application number: KR1020180031589A
Authority: KR
Inventors: 정선용; 박은국; 안수용
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2018-09-04
Also published as: WO2019112242A1

Abstract

본 발명은 TNS3 유전자 발현억제 siRNA(짧은 간섭 RNA)를 유효성분으로 포함하는 신경섬유종증 악성종양 예방, 개선 내지 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 상기 siRNA가 제1형 신경섬유종증 환자의 종양에서 과발현(overexpression)되어 있는 TNS3 유전자의 발현을 억제함으로써 악성종양의 증식 억제와 치료에 좋은 효과가 있음을 확인한 바, 세포실험과 동물실험에서 TNS3 유전자 발현억제 siRNA가 좋은 효과를 나타내었으며, 또한 TNS3 siRNA 조성물은 ICE(이포스파미드, 카보플라틴, 에토포시드) 항암제와의 병용 사용 시에, 특히 제1형 신경섬유종증 악성종양의 성장 억제와 치료에 뛰어난 효과가 있다.

Description

siRNA를 포함하는 신경섬유육종 예방 또는 치료용 조성물{Composition Comprising Short Interfering RNAs for Preventing or Treating Neurofibrosarcoma}

본 발명은 TNS3 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 및 이를 유효성분으로 포함하는 신경섬유종증 악성종양 치료용 조성물에 관한 것이다.

제1형 신경섬유종증(Neurofibromatosis Type 1, NF1)은 1882년 Fredrich von Recklin-ghausen이 처음 기술하였으며, 말초신경을 따라 종양을 형성하는 상염색체 우성유전 질환으로 약 3,500명 중 1명꼴로 발생한다. 종양은 신경이 있는 신체 어느 부위에나 발생할 수 있고, 그 수가 한 개 이상으로 생기는 다발성이기 때문에 '신경섬유종증'이라고 한다. 주된 증상은 신경이 있는 곳이면 어디서나 발생하는 신경섬유종(neurofibroma)과 밀크 커피색 반점(cafe-au-lait spots), 홍채결절(Lisch nodules), 시신경교종(optic pathway glioma), 척추측만(scoliosis), 경골형성이상(tibial dysplasia), 총상신경섬유종(plexiform neurofibroma), 교뇌신경교종(pontine glioma) 등이 있다(본원발명의 도 1 참조).

제1형 신경섬유종증 환자에서 가장 많이 발생하는 것은 피부에 발생하는 양성종양인 신경섬유종이다. 제1형 신경섬유종증 환자의 약 30-40%에서는 피부 아래 또는 몸의 심부에서 생기는 양성종양인 총상신경섬유종이 있다. 특히 총상신경섬유종의 경우는 다양한 신체부위에 옆으로 확산되어 자라서 자루처럼 늘어진 거대한 덩어리(혹) 모양을 나타내며(본원발명의 도 2 참조), 심부에 많은 수의 다발성 총상신경섬유종이 발생하기도 한다(본원발명의 도 3 참조). 이러한 총상신경섬유종(plexiform neurofibroma; PN)은 비록 양성 종양이지만 끊임없이 자라기 때문에 환자들에게 매우 심각한 증상이 발생하며, 제1형 신경섬유종증 환자의 약 10%에서 총상신경섬유종이 악성종양인 신경섬유육종(neurofibrosarcoma; malignant peripheral nerve sheath tumor, MPNST)으로 발전한다(본원발명의 도 4 참조). 이러한 제1형 신경섬유종증 환자에서 양성종양의 악성전개(malignant progression)는 급속도로 전개되기 때문에 매우 높은 치사율을 나타낸다.

총상신경섬유종(PN)은 뼈와 주위 조직의 성장을 자극하여 거대한 크기로 자라나 추형의 외모를 나타내기도 하며, 이러한 환자들의 약 8~13%는 신경섬유육종(MPNSTs)으로 악성화 된다(본원발명의 도 5 참조). MPNST는 고도로 악성화된 전이암으로 높은 사망률과 화학요법과 방사능에 낮은 반응을 보이는 것으로 알려져 있다.

제1형 신경섬유종증은 NF1 유전자의 돌연변이에 의해 발병하며, 환자의 약 50%는 유전이 아닌 자연발생적인 돌연변이에 의해 발생한다. NF1 유전자는 염색체 17q11.2에 위치하며, 350 kb의 지노믹 DNA(genomic DNA), 57개의 엑손으로 구성되어 있고, mRNA는 11 내지 13 Kb정도이다. 종양억제유전자(tumor suppress gene) NF1은 ~320 kDa의 세포질에 존재하는 뉴로파이브로민(neurofibromin) 단백질을 암호화하고 있는데, 아미노산 1125-1537부위에 Ras 신호를 음성적으로(negatively) 조절하는 GAP-관련 도메인(GAP-related domain ; GRD) 영역을 가지고있다. GTPase-활성화 단백질(GTPase-activating protein ; GAP)은 Ras의 내재성(intrinsic) GTPase를 자극하여 활성화 형태인 Ras-GTP에서 Ras-GDP 불활성화 형태로 전환시킴으로써 Ras의 활성을 조절한다. 종양 유전자(oncogene) Ras에 의해 코딩되는 Ras 단백질은 신경능선세포와 내피세포 모두에서 발현되고 그 신호는 여러 가지 다운스트림 경로(downstream pathway)로 전달된다. 증가된 GTP-Ras는 대표적 다운스트림 경로인 Raf 키나아제를 통해 신호전달을 유발하고, Raf는 MEK 키나아제와 마이토젠-활성화 단백질(mitogen-activated protein ; MAP) 키나아제의 Erk1과 Erk2 아이소폼을 포함한 키나아제 캐스캐이드를 활성화시킴으로써 세포의 증식, 분화, 사멸 등에 관여한다(본원발명의 도 6 참조).

Ras 유전자는 크게 K-Ras, H-Ras, N-Ras의 3종류가 있으며 사람에게 발생하는 약 50% 암에서 Ras 유전자의 돌연변이가 발견된다. Ras 유전자의 돌연변이와 Ras 단백질의 과잉 활성은 세포의 암화에 관여하기 때문에 Ras 단백질의 세포내 발현억제를 통한 암 치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. NF1 유전자의 돌연변이에 의해 K-Ras, H-Ras, N-Ras의 3종류 Ras 단백질 모두가 과잉 활성화된다고 알려져 왔으나, 최근의 연구에서 제1형 신경섬유종증 환자의 별아교세포(astrocytes)의 경우 H-Ras와 N-Ras의 활성화는 보이지 않고 K-Ras만이 특이적으로 활성화되고, 조혈세포의 경우는 H-Ras만이 활성화된다는 사실이 보고되었다.

뉴로파이브로민(neurofibromin)의 손실(loss) 혹은 기능 장애로 인해 과잉 활성 및 축적된 RAS에 의해 발병하는 NF1 환자의 20%에서는 생명을 위협하는 심한 합병증이 야기되고, 환자의 약 8~13%에서 나타나는 악성화는 예측이 불가능하며 임상적 증상이 심각하지만 유전성이기 때문에 근본 치료는 불가능하다. 신경섬유육종으로 악성화가 된 경우, 종양의 절제 등의 대중요법만이 유일한 치료법이나, 종양의 위치에 따라 수술이 불가능한 경우가 많아 암의 진행시기에 관계없이 환자의 생명과 직결된다. 제1형 신경섬유종증의 임상적 표현형의 다양성과 악성화 과정에 대한 정확한 기전은 여전히 밝혀지지 않았다. 전통적인 치료방법으로 방사선 요법, 외과적 수술 절제, 세포 독성약이 있지만 장기간의 효과는 크게 없는 것으로 밝혀졌다.

한국공개특허 제10-2011-0044945호(2011.05.03 공개).

본 발명의 목적은 TNS3 유전자 발현을 억제할 수 있는 짧은 간섭 RNA를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 제1형 신경섬유종증의 악성종양인 신경섬유육종의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나로 이루어지는 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA)를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나로 이루어지는 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA)를 유효성분으로 함유하는 신경섬유육종(neurofibrosarcoma; malignant peripheral nerve sheath tumor, MPNST) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 TNS3 유전자 발현을 효과적으로 억제하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 siRNA 처리 시에 악성종양의 암세포의 생존율이 현저히 감소하였으며, 이소파마이드(Isofamide), 에토포시드(Etoposide) 및 카보플라틴(Carboplatin) 등의 항암제와의 병용 처리 시에도 상승효과를 나타낸 바, 상기 siRNA를 포함하는 조성물은 제1형 신경섬유종증의 악성종양을 효과적으로 예방, 개선 내지 치료할 수 있으므로, 신경섬유육종 예방 또는 치료용 약학 조성물, 신경섬유육종 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 제1형 신경섬유종증의 대표적인 증상을 나타낸 것이다((A) 밀크 커피색 반점(cafe-au-lait spots), (B) 피부신경섬유종(neurofibroma), (C) 홍채결절(Lisch nodules), (D) 시신경교종(optic pathway glioma), (E) 척추측만(scoliosis), (F) 경골형성이상(tibial dysplasia), (G) 총상신경섬유종(plexiform neurofibroma), (H) 교뇌신경교종(pontine glioma)).
도 2는 다양한 신체부위에 발생하는 총상신경섬유종을 나타낸 것이다.
도 3은 심부에 발생한 총상신경섬유종의 예를 나타낸 것이다.
도 4는 양성 총상신경섬유종에서 악성으로 전개된 신경섬유육종의 예를 나타낸 것이다.
도 5는 제1형 신경섬유종증의 종양형성 및 악성화의 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 뉴로파이브로민(neurofibromin)의 역할과 Ras 활성화 기전을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 7은 정상 슈반 세포(HSC)와 NF1 악성종양 슈반 세포주에서의 Tensin 3 단백질과 TNS3 mRNA 발현량을 비교한 결과를 나타낸 것이다(도 7a: 악성 종양 세포(S462)에서 TNS3 유전자의 발현이 증가되어 있음, 도 7b: 악성 종양(MPNST) sNF02.2, sNF96.2, S462 세포주에서 TNS3 유전자의 발현이 증가 되어 있음).
도 8은 제1형 신경섬유종증 악성종양 슈반 세포주(S462)에 siRNA #1, #2를 이용한 TNS3 발현 저해 시의 ERK1/2 활성화(phospho-ERK1/2)와 Bcl-2 과발현(도 8A) 및 RAS 활성화(도 8B)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 9는 TNS3 유전자에 대한 siRNA(#2) 단독 처리 또는 항암제와의 병용 처리 시의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 10은 TNS3 유전자 발현억제에 의한 in vivo 효능을 확인한 것으로, 제1형 신경섬유종증 악성종양 세포인 S462를 마우스에 이식하여 제작한 악성종양 모델 동물인 이종이식 마우스의 악성종양 조직의 크기, 부피, 무게의 변화를 관찰한 결과이다(항암제인 ICE와 TNS3 유전자 siRNA(#2) 단독 및 병용 처리 시의 현저한 항암 효과 확인).
도 11은 TNS3 유전자 발현억제에 의한 in vivo 실험에서 종양의 외형과 적출한 종양의 크기를 비교한 결과를 나타낸 것이다.

제1형 신경섬유종증(Neurofibromatosis Type1, NF1)은 1882년 Fredrich von Recklin-ghausen이 처음 기술하였으며, 말초신경을 따라 종양을 형성하는 상염색체 우성유전 질환으로 약 3,500명 중 1명꼴로 발생한다. 환자의 약 8 내지 13%에서 나타나는 악성종양은 예측이 불가능하고 임상적 증상이 심각하며 치사율이 높지만, 종양의 위치에 따라 수술이 불가능한 경우가 많아 치료가 매우 힘든 질환이다. 항암제 효과가 낮고 재발율이 높아 아직까지 적절한 약물치료제가 없는 실정이다.

이에, 본 발명의 발명자들은 제1형 신경섬유종증 환자의 악성종양에서 과발현(overexpression)되어 있는 TNS3 유전자(tensin 3 단백질)의 발현을 억제함으로써 악성종양의 증식 억제와 치료에 좋은 효과가 있음을 밝히고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나로 이루어지는 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA)를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 siRNA는 TNS3 유전자 발현을 억제할 수 있는 바, 따라서 TNS3을 억제하여 신경섬유종증을 예방, 개선 내지 치료하는 데에 사용될 수 있다.

이에, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나로 이루어지는 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA)를 유효성분으로 함유하는 신경섬유육종(neurofibrosarcoma; malignant peripheral nerve sheath tumor, MPNST) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 신경섬유육종은 총상신경섬유종의 악성화로 유발된 것일 수 있는 바, 즉, 본 발명은 악성 종양에 해당하는 신경섬유육종을 치료할 수 있다. 상기 신경섬유육종은 총상신경섬유종 환자의 약 8-13%에서 악성화가 전개되어 유발되는 것으로 알려져 있다.

이때, 상기 siRNA는 TNS3 유전자의 발현을 억제함으로써 신경섬유육종을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 siRNA는 ERK1/2 및 RAS의 활성화 또는 Bcl-2의 발현을 억제함으로써 신경섬유육종을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 조성물은 이소파마이드(Isofamide), 카보플라틴(Carboplatin) 및 에토포시드(Etoposide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 항암제와 병용 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 즉, 상기 조성물은 이소파마이드, 카보플라틴 및 에토포시드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 항암제를 더 포함할 수 있는 바, 이러한 경우, 가장 우수한 시너지 효과를 나타내어 악성종양 세포의 사멸 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포 배양

정상 세포인 인간 세포(HSC)(ScienCell Research Laboratories)와 신경섬유육종(neurofibrosarcoma; malignant peripheral nerve sheath tumor, MPNST) 세포인 sNF96.2, sNF02.2, S462(American Type culture Collection, USA)는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Hyclone Laboratories, Logan, USA), 페니실린(100 U/ml)과 스트렙토마이신(100 μg/ml)을 첨가한 둘베코의 수정 이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium ; Hyclone Laboratories, Logan, USA)를 이용하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실시예 2: 웨스턴 블롯 분석

배양한 세포를 50 μg/ml 페닐메탄설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), 단백분해효소 억제제 칵테일(Protease inhibitor cocktail)이 첨가된 용해 버퍼(lysis buffer; 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 첨가하여 단백질을 추출한 후, 여기서 얻어진 시료를 Lowry protein assay reagent kit(Bio-rad laboratories, U.S.A.)를 이용하여 단백질을 정량하였다.

각 조건마다 동일한 양의 단백질을 취하여 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼(5X)와 섞은 후, 100℃에서 10분간 가열하고, 이를 로딩하여 8-15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였다. 전기영동으로 분리한 단백질은 트랜스퍼 버퍼(transfer buffer; 20% 메탄올, 25 mM Tris-HCl, 192 mM 글라이신)를 이용하여 350 mA에서 120분간 이모빌론-피-트랜스퍼 멤브레인(immobilon-P transfer membrane(0.45 ㎛); PVDF transfer membrane, Millipore Corporation, USA)으로 흡착 이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인은 3% 탈지유(non-fat dry milk; skim milk solution)로 블로킹(blocking)시킨 후, 4℃에서 1차 항체로 24시간 동안 반응시키고, TBST(tris-buffered saline and tween 20)로 3회 세척하였다. 이후, 다음과 같이 각각의 특이 항체로 웨스턴 블롯을 시행하여 분석하였다.

사용한 1차 항체는 TNS3(Tensin 3) 1:3000 (Sigma Aldrich, U.S.A.), ERK, phospo-ERK, 분열된 카스파아제 3(cleaved-Caspase 3), Bcl-2, 총 Ras 1:3000(Cell signaling, Thecnology, Inc. Beverly, MA., U.S.A.), 뉴로피브로민(Neurofibromin), β-액틴 1:3000(Santa Cruz Biotechnology, INC, U.S.A.), 2차 항체로는 퍼록시다아제가 컨쥬게이트된 염소 항-토끼 항체(goat anti-rabbit antibody), 염소 항-마우스 항체(goat anti-mouse antibody) 1:5000 (Santa cruz Biotechnology, INC, USA)를 이용하여 반응시킨 뒤, WEST-ZOL Plus (iNtRON Biotechnology, KOREA)를 처리하여 필름에 현상하였다.

실시예 3: Ras 활성 분석

Ras 활성을 측정하기 위해, Ras activation assay kit(Upstate Biotech. Lake Placid, NY)를 사용하여 친화 침전(affinity precipitation) 방식으로 GTP-Ras의 양을 분석하였다. 배양한 S462 세포를 용해 버퍼(25 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 및 2% 글리세롤)에 용해한 후, 용해물(500 μg의 단백질 함유)을 Raf-1 RBD 융합 단백질과 결합하고 있는 아가로즈 비드(agarose bead)와 함께 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 아가로즈 비드를 1 ml의 용해 버퍼로 3회 세척한 후, 샘플 로딩 버퍼(loading buffer, 5X)와 혼합한 뒤, 100℃에서 10분 동안 가열하고, 이를 12-15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하여 전기영동하였다. 아가로오스 비드는 원심분리하여 모은 후 용해 버퍼로 세척하였다. 최종적으로 샘플 버퍼를 첨가하여 95℃에서 5분간 가열한 후, Ras 특이 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하여 GTP-Ras의 양을 분석하였다.

실시예 4: TNS3 유전자 발현 억제용 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA ) 디자인 및 제작

TNS3 유전자의 발현억제를 위해, TNS3 유전자 mRNA에 상보적으로 결합 가능한 siRNA를 디자인 및 합성하였다(Cosmogenetech, Korea). 센스(Sense)와 안티센스(Antisense)의 상보적인 2 가닥의 RNA-DNA 하이브리드 올리고머(hybrid oligomer ; 앞 19개 배열은 RNA이고 마지막 2개 TT는 DNA)를 각각 합성하여, 2가닥을 상보적으로 결합시킨 2중 가닥 RNA(double strand RNA)를 siRNA로 사용하였다. 이때 제조한 서열번호 1 및 2(#1)및 서열번호 3 및 4(#2)로 표시되는 siRNA의 센스와 안티센스의 염기서열은 하기 <표 1>에 나타난 바와 같았다.

siRNA	종류	염기서열	서열번호
siTNS3 #1	Sense	5‘-CCC AGC AAA GCG TTC AAA CTT-3	1
siTNS3 #1	Antisense	5‘-GUU UGA ACG CUU UGC UGG GTT-3’	2
siTNS3 #2	Sense	5‘-GGU CCG AAC ACU UGU ACA ATT-3’’	3
siTNS3 #2	Antisense	5‘-UUG UAC AAG UGU UCG GAC CTT-3’	4

실시예 5: 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 정량 PCR

TNS3의 발현량을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 배양한 세포에서 Trizol™ 시약(Invitrogen Co., U.S.A.)을 이용하여 RNA를 추출하고, 그 중 RNA 3 μg을 이용하여 DNase I(Invitrogen Co., U.S.A.) 3U을 처리하여 남아있는 gDNA를 제거한 후 cDNA를 합성하였고, 합성한 cDNA를 이용하여 PCR로 증폭하여 확인하였다. 사용한 프라이머(표 2)는, RNA가 PCR의 주형이 될 수 없으며 인트론 영역은 gDNA에만 존재하는 특성을 이용하여 제작하였다. PCR 결과 gDNA가 완전히 제거된 것으로 확인이 된 RNA를 TransScriptII Reverse Transcriptase PCR Kit(Qiagen, U.S.A.)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이종이식 마우스에서 적출한 종양의 경우, 균질화기(Homogenizer)를 사용하여 종양을 분쇄한 후 Trizol^™ 시약(Invitrogen Co., U.S.A.)을 이용하여 RNA를 추출하여 위와 같은 방법으로 cDNA를 합성하였다.

이와 같이 배양한 세포에서 총 RNA를 추출하여, 합성한 cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이 프라이머를 사용하여 실시간 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real-time PCR)으로 증폭하였다. 이때, 이중 가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 STBR Green(TaKaRa, Shiga, Japan)을 cDNA(150 ng)에 첨가하여 형광강도를 ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems; Foster City, CA, U,S,A)로 측정하였다. 사용한 프라이머 서열은 하기 <표 2>에 나타난 바와 같았다.

유전자	종류	염기서열	서열번호
Human	정방향	5'-CGT TCT TTG GGC TCA GTC TC-3'	5
Human	역방향	5'-CTG AAG CCT TGG AAA AGT CG-3'	6
Mouse	정방향	5'-GAG GGG TGG TAA AGG ACG C-3'	7
Mouse	역방향	5'-GGA GGG CTC CAT TAA TGC TGA A-3'	8

실시예 6: 세포 생존율(Cell viability) 측정

세포 생존율은 D-Plus™ CCK cell viability assay kit(DonglinLS, Korea)를 사용하여 분석하였다. 96 웰 플레이트에 세포를 웰 당 7×10³세포 농도로 접종하고 siRNA(상기 표 1 참조) 또는/및 항암제 처리 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 CCK 시약(10 μl)이 첨가된 배지(100 μl)로 교체하고 2시간 추가 배양하였다. ELISA 플레이트 리더기(Bio-Rad Model 680)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 분석하였다.

실시예 7 : 제1형 신경섬유종증 악성화 이종이식 마우스 모델 제작 및 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA) 투여

7-1. 제1형 신경섬유종증 악성화 이종이식 마우스 모델 제작

신경섬유육종 S462 세포를 1,000 rpm으로 5분 원심분리하여 상층액을 제거한 후 인산완충식염수(PBS)에 1×10⁷ 세포/ml로 준비한 후, 8주령 마우스 우측 등 부위의 피하에 0.1 ml씩 투여하여 이식하였다. 종양의 부피를 측정하여 약 80~120 mm³에 도달한 개체를 선별하고, 종양의 부피 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 군을 분리하였다.

7-2. 항암제 및/또는 siRNA 투여

상기 실시예 4에서 제조한 siTNS3(#2)를 5% 포도당 용액에 siTNS3(10 μg)와 in vivo-JETPEI(Polyplus, France)를 섞고 15분간 배양한 후 종양조직에 국부주입(local injection)하였다. siTNS3를 직접 종양에 투여하였으며, siTNS3 10 μg/100 μl를 주 3회(월, 수, 금) 3주간 투여하였다.

또한, 항암제 이포스파마이드(Ifosfamide), 카보플라틴(Carboplatin), 에토포시드(Etoposide)는 투여 농도에 따라 생리식염수와 섞어 조제하여 복강 내 주사(intraperitoneal injection)하였으며, 이때, 이포스파마이드(40 mg/kg)와 에토포시드(3.3 mg/kg)는 첫 주 5일간(월~금) 복강 투여하였고, 카보플라틴(13.3 mg/kg)은 첫 주 2일 간 (월, 화) 복강투여 하였다.

7-3. 종양 부피 측정과 종양 적출 및 중량 분석

관찰기간 동안 주 2회, 캘리퍼스(caliper)를 사용하여 종양의 장축(maximum length, L)과 단축(perpendicular width, W)을 측정하고, 하기 계산식 1에 대입하여 종양의 부피(tumor volume, TV)를 계산하였다.

[계산식 1]

TV(mm³)=L(mm)×W²(mm²)×1/2

또한, 마우스를 CO₂가스로 안락사 시킨 후, 종양을 적출하여 중량을 측정하였다. 적출된 종양은 하기 계산식 2에 대입하여 종양 성장 억제율(tumor growth inhibition rate, IR)을 계산하였다.

[계산식 2]

IR(%) = (1-T/C)×100

T: 실험군 및 대조군의 평균 종양 무게

C: 음성 대조군의 종양 무게

실시예 8: 통계 분석

In vitro 그래프의 유의성 검증을 위해 Student's t-test를 사용하였다. In vivo 실험에서 얻어진 체중, 종양의 부피 및 종양의 중량은 SAS(Version 9.3, SAS Institute Inc., USA)를 사용하여 검정하였다. 체중, 종양의 부피 및 종양의 중량은 Bartlett test를 실시하여 등분산성을 검정하였다(유의수준: < 0.05). 등분산성인 경우 one-way analysis of variance(ANOVA)를 실시(유의수준: < 0.05)하여 유의성이 관찰되면 음성 대조군에 대한 각 시험군의 유의성을 확인하기 위해 Dunnett's t-test의 다중검정을 실시하였다(유의수준: 단측 < 0.05 및 < 0.01). 등분산성이 기각되면 Kruskal-Wallis test를 실시(유의수준: < 0.05)하여 유의성이 관찰되면 음성 대조군에 대한 각 시험군의 유의성을 확인하기 위해 Steel's test의 다중검정을 실시하였다.

실험예 1 : TNS3의 과발현 여부 확인

TNS3의 발현량을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 및 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real-time PCR)을 수행한 결과, 제1형 신경섬유종증 환자 유래의 악성종양 세포주에서 TNS3(tensin-like SH2 domain containing 1, Tensin 3)의 과발현되어 있음을 발견하였다. 즉, 정상 슈반 세포(HSC)와 NF1 악성종양 슈반 세포주(S462)에서의 Tensin 3 단백질과 TNS3 mRNA 발현량을 비교한 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 악성 종양에서 TNS3 유전자의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다. Tensin 3는 Rho GTPase 신호와 세포 접착 조절에 관여한다고 밝혀져 있으며, Src에 의해 인산화(활성화)되어 종양의 악성화에 관여하는 것으로 알려져 있다.

또한, 도 7b에 나타난 바와 같이, 다른 종류의 악성 종양(MPNST) sNF02.2, sNF96.2 세포주에서도 TNS3 유전자의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다. 따라서, TNS3(Tensin 3)의 발현 억제가 제1형 신경섬유종증 악성종양 치료에 좋은 효과가 있을 것이라고 가설을 세웠다.

실험예 2 : NF1 악성 종양 슈반 세포주에서 siRNA의 ERK1/2와 RAS 활성화 억제 및 Bcl-2 발현 억제 효과

상기 실험예 1에서 얻은 결과를 토대로, 상기 실시예 4에서 제조한 siTNS3 #1, #2를 10 pmole/ml 농도로 RNAi MAX(Invitrogen) 시약을 사용하여 제1형 신경섬유종증 악성종양 슈반 세포주(S462)에 처리하여 TNS3 발현을 저해시킨 후, 웨스턴 블롯을 통해 ERK1/2 활성화(phospho-ERK1/2, p-ERK1/2) 여부와 Bcl-2 발현량을 확인하였다. 또한, RAS 활성화(GTP-RAS) 정도를 조사하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 신경섬유육종 세포주(S462)에 siTNS3 #1, #2 처리 시에 상기 ERK1/2 활성화(p-ERK1/2)와 Bcl-2 발현량이 모두 현저하게 감소됨을 확인하였다. 또한, siTNS3 #2 처리 시에는 RAS 활성화(GTP-RAS)가 현저하게 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 TNS3의 발현량이 제1형 신경섬유종증 악성화와 밀접한 관련이 있으며, 본 발명의 siTNS3 #1, #2에 의한 TNS3의 발현 저해가 신경섬유종증 악성종양 치료에 좋은 효과가 있을 것임을 시사한다.

실험예 3 : NF1 악성종양 슈반 세포에서 siRNA에 의한 종양세포 사멸 효과

먼저, 상기 실험예 2에 개시된 바와 같이, 제조한 siTNS3 #2를 처리하여 TNS3의 발현을 저해시킨 후, NF1 악성 종양 슈반 세포주(S462)의 변화를 관찰하였다. 이때 siTNS3 #2를 단독으로 처리하거나, 기존에 사용되는 대표적 항암제인 ICE(Ifosfamide 1.8 mM, Carboplatin 90 μM, Etoposide 30 μM)와 각각 10 pmole/ml 만큼 병용처리 하였고, 세포 생존율을 분석하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, S462 악성세포에 TNS3 유전자 siRNA(siTNS3 #2) 처리 시에 유의하게 세포 생존율이 감소되는 것을 확인하였으며, 대표적인 항암제인 ICE(Ifosfamide, Carboplatin, Etoposide)와 병용 처리 시에 시너지 효과가 있음을 확인하였다. 정상세포인 HSC 세포에 TNS3 유전자 siRNA(siTNS3 #2) 처리 시에는 세포 생존율이 감소와 ICE(Ifosfamide, Carboplatin, Etoposide)와 병용 치의 시너지 효과가 나타나지 않았다.

실험예 4: 제1형 신경섬유종증 악성화 이종이식 마우스 모델에서 siRNA의 악성종양 억제 효과

in vivo에서의 TNS 유전자 발현 억제 효능을 확인하기 위해, 실시예 7-1에 나타난 바와 같이, NF1 악성종양 슈반 세포주(S462)를 누드마우스에 접종하여 발암을 유도한 제1형 신경섬유종증 악성화 이종이식 마우스를 제작하였고, 실시예 7-2에 나타난 바와 같이, TNS3 유전자에 상보적으로 결합하는 siTNS3 #2 단독, 항암제 ICE 단독, siTNS3 #2와 항암제 ICE 병용(siRNA는 주 3회 local injection, 항암제는 첫 1회 복강투여)으로 21일까지 투여하여 43일간 종양의 크기를 관찰하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, TNS3 유전자 siTNS3 #2 단독으로도 매우 뛰어난 항암작용(종양 조직의 증식 억제)이 관찰되었으며 항암제인 ICE와 병용 처리 시에 더 좋은 시너지 효과가 나타났다. 또한, 43일째 각 군의 평균 종양 부피와 무게를 비교하였을 시에 TNS3 유전자 siTNS3 #2 ICE 병용 처리군에서 현저한 종양 억제 효과가 나타났다. 더욱이, 도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이, 종양의 외형과 적출한 종양의 크기를 비교하였을 경우에도 siTNS3 #2 및 ICE 병용 처리군에서 뛰어난 악성종양 억제 효과가 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition Comprising Short Interfering RNAs for Preventing or Treating Neurofibrosarcoma <130> ADP-2018-0078 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTNS3 #1 (sense) <220> <223> Sense strand of RNA-DNA hybrid oligomer <400> 1 cccagcaaag cgttcaaact t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTNS3 #1 (antisense) <220> <223> Antisense strand of RNA-DNA hybrid oligomer <400> 2 guuugaacgc uuugcugggt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTNS3 #2 (sense) <220> <223> Sense strand of RNA-DNA hybrid oligomer <400> 3 gguccgaaca cuuguacaat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTNS3 #2 (antisense) <220> <223> Antiense strand of RNA-DNA hybrid oligomer <400> 4 uuguacaagu guucggacct t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TNS3 RT-PCR primer (FW) <400> 5 cgttctttgg gctcagtctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TNS3 RT-PCR primer (RV) <400> 6 ctgaagcctt ggaaaagtcg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tns3 RT-PCR primer (FW) <400> 7 gaggggtggt aaaggacgc 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tns3 RT-PCR primer (RV) <400> 8 ggagggctcc attaatgctg aa 22

Claims

삭제
서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 염기 서열 중 어느 하나로 이루어지는 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA)를 유효성분으로 함유하는 신경섬유육종(neurofibrosarcoma; malignant peripheral nerve sheath tumor, MPNST) 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 신경섬유육종은 총상신경섬유종의 악성화로 유발되는 것을 특징으로 하는 신경섬유육종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 siRNA는 TNS3 유전자의 발현을 억제함으로써 신경섬유육종을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 신경섬유육종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 siRNA는 ERK1/2 및 RAS의 활성화 또는 Bcl-2의 발현을 억제함으로써 신경섬유육종을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 신경섬유육종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 이소파마이드(Isofamide), 카보플라틴(Carboplatin) 및 에토포시드(Etoposide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 항암제와 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 신경섬유육종 예방 또는 치료용 약학 조성물.