EA022611B1

EA022611B1 - Способ лечения плексиформной нейрофибромы

Info

Publication number: EA022611B1
Application number: EA201071340A
Authority: EA
Inventors: Д. Уэйд Клэпп; Дэвид Ингрэм; Фэн-Чунь Ян
Original assignee: Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2016-02-29
Also published as: KR20110044945A; IL209973A; AU2009262214A1; TWI508728B; EA201500525A1; JP2015187104A; MA32419B1; EA201071340A1; JP2011526292A; WO2009158447A2; US9345704B2; SG192444A1; US20150072992A1; NZ590076A; US20140121214A1; US20110195975A1; CL2009001486A1; IL209973A0; AU2009262214B2; EP2291186A4

Abstract

Заявленное изобретение относится к способу лечения плексиформной нейрофибромы, включающему введение пациенту от примерно 200 до примерно 500 мг соединения, соответствующего формуле 2 или формуле 3или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения формулы 2, где указанная доза этого соединения вводится пациенту по меньшей мере один раз в день.

Description

Различные аспекты и варианты осуществления изобретения, раскрытые в данной заявке, относятся к способу лечения плексиформной нейрофибромы.

Уровень техники

Мутации в гене-супрессоре опухолевого роста ΝΡ1 являются причиной нейрофиброматоза типа 1 (ΝΡ1), общеизвестного, широко распространенного генетического заболевания человека. Только оно одно поражает около 250000 пациентов в США, Европе и Японии. Ген ΝΡ1 кодирует нейрофибромин, белок с массой 320 килодальтон, который, по меньшей мере, отчасти функционирует как белок-активатор ГТФазы (САР) для р21та§. Нейрофибромин обладает высокой консервативностью у множества видов позвоночных и имеет высокую степень гомологии со своими аналогами у дрожжей и дрозофилы.

У людей ΝΡ1 имеет широкий спектр злокачественных и доброкачественных проявлений, включая плексиформные нейрофибромы, которые в совокупности поражают 25-40% пациентов с ΝΡ1, эти нейрофибромы являются основным источником пожизненной заболеваемости и смертности. Принимая во внимание то негативное воздействие, которое данное патологическое состояние оказывает на людей, имеющих эту мутацию, и недостаток эффективного лечения этого и сопутствующих ему состояний, существует острая потребность в дополнительных способах лечения этого состояния. Различные аспекты и варианты осуществления изобретения, раскрытые в данной заявке, направлены на удовлетворение этой потребности.

Сущность изобретения

Некоторые варианты осуществления изобретения включают способы лечения пациента, имеющего форму нейрофиброматоза, например плексиформную нейрофиброму, введения пациенту от примерно 200 до примерно 500 мг соединения, соответствующего формуле 2

или ее фармацевтически приемлемой соли в котором указанная доза этого соединения вводится пациенту по меньшей мере один раз в день.

В некоторых вариантах осуществления изобретения химическое соединение является фармацевтически приемлемой солью соединения формулы 2, в некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтически приемлемая соль соединения формулы 2 является мезилатной солью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения величина терапевтически эффективной дозы химического соединения, соответствующего формуле 2, составляет от примерно 200 до примерно 500 мг, и данная доза этого соединения вводится пациенту по меньшей мере один раз в день. В других вариантах осуществления изобретения величина терапевтически эффективной дозы химического соединения, соответствующего формуле 2, составляет от примерно 350 до примерно 450 мг, и данная доза этого соединения вводится пациенту по меньшей мере один раз в день. В одном варианте осуществления изобретения терапевтически эффективная доза химического соединения, соответствующего формуле 2, составляющая примерно 400 мг, вводится пациенту два раза в день.

Другие варианты осуществления изобретения включают способ лечения пациента, имеющего форму нейрофиброматоза, например плексиформную нейрофиброму, включающего стадии введения пациенту по меньшей мере одной терапевтически эффективной дозы химического соединения, соответствующего формуле 3

- 1 022611

Краткое описание чертежей

Вышеупомянутые аспекты настоящего раскрытия и способы их осуществления станут более очевидными, и их аспекты будут более понятными из следующего описания вариантов осуществления данного раскрытия в сочетании с сопровождающими его чертежами, фигурами, схемами, формулами и тому подобным, где фиг. 1А - принципиальная схема стратегии изучения роли гемопоэтического микроокружения; фиг. 1В - следовые количества, обнаруживаемые в результате использования флуоресцентной цитометрии. Νί1^+/ костный мозг необходим для образования плексиформной нейрофибромы у мышей Кгох20; Νί!^{£1οχ/£1οχ} и Кгох20; ΝΗ^;

фиг. 2А - график формулы Каплана-Мейера для оценки выживания, отражающий зависимость процента выживания (ось Υ) от времени (ось X). Мышей Кгох20; Νί1^{ί1οχ/£1οχ} и Кгох20; Νί1^£1οχ/', которым был пересажен Νί1^+/' костный мозг или костный мозг дикого типа (ДТ), наблюдали до достижения ими возраста 1 год;

фиг. 2В - фотографии мышей Κτοχ20; Νί1^{£1οχ/£1οχ}, которым был пересажен костный мозг (КМ) дикого типа (1) или ΝίΊ^+/· КМ (2-3);

фиг. 2С - фотографии гистологических препаратов дорсальных корешковых ганглиев и периферических нервов мышей Кго\20; ΝΠ^{ηοχ/£1οχ} которым был пересажен ДТ или Νη^+/ костный мозг. Стрелками показаны опухоли в дорсальных корешковых ганглиях и периферических нервах;

фиг. 3А - окрашенные гематоксилин-эозином гистологические срезы дорсальных корешковых ганглиев и проксимальных периферических нервов;

фиг. 3В - фотографии при 200-кратном увеличении гистологических срезов, окрашенных трихромом по Массону. Указаны генотипы донорского костного мозга и мышей-реципиентов;

фиг. 3С - увеличенные в 200 раз гистологические срезы, окрашенные альциановым синим. Маленькими стрелками на препаратах 2 и 3 обозначены мастоциты. Большими стрелками на препарате 3 обозначены кровеносные сосуды;

фиг. 3Б - гистограмма, показывающая различие в количестве мастоцитов между различными генотипами. Клеточные линии были выделены при помощи флуоресцентной сортировки клеток из опухолей мышей Кго\20; ΝΓ1^{£1οχ/£1οχ}, которым был пересажен №1^+АКМ;

фиг. 3Е - графическое представление данных фенотипической оценки различных клеточных линий, полученных из костного мозга, с использованием флуоресцентной цитометрии. Клетки костного мозга (1) и опухолевые клетки (2) были выделены, и ЕОЕР+ СБ45.2 положительные популяции были отобраны. Опухолевые СБ45.2 клетки были затем разделены для выявления популяций мастоцитов (3), макрофагов (4), В-лимфоцитов (4) и Т-лимфоцитов. Указана доля каждой популяции гемопоэтических клеток в опухоли;

фиг. 3Е - фотография геля, показывающая генотип клеточных линий, выделенных при помощи флуоресцентной сортировки клеток из опухолей мышей Кго^); ΝΓ1^{£1οχ/£1οχ}, которым был пересажен ΝΓ1^+/' КМ. Стрелками обозначены амплифицированные ДНК продукты указанных аллелей из соответствующих фенотипических линий;

фиг. 4А - график формулы Каплана-Мейера для оценки выживания, отражающий зависимость процента выживания (ось Υ) от времени (ось X);

фиг. 4В - фотографии спинного мозга и его задних корешков мышей Кго^); Νη^{ί1οχ/£1οχ} которым был пересажен ДТ КМ (препарат 1) или ΝΓ1^+/ КМ (препарат 2). Стрелками показаны опухоли в периферических нервах;

фиг. 4С - график, иллюстрирующий размер дорсальных корешковых ганглиев (ДКГ), определенный в случае различных генотипов донорских клеток;

фиг. 4Б - фотографии характерных гистологических срезов дорсальных корешковых ганглиев и проксимальных спинномозговых нервов мышей Кго^); ΝΓ1^{£1οχ/£1οχ}, которым был пересажен ΝΠ^+/' или №1^+/'; мутантный костный мозг;

фиг. 5А - ПЭТ-изображения, иллюстрирующие результаты лечения мышей Кго^); ΝΗ^' иматиниба мезилатом;

фиг. 5В - представленные в графическом виде обобщенные данные об изменении средней интенсивности ФДГ-ПЭТ после 12 недель лечения иматиниба мезилатом или ФСБ;

фиг. 5С - графическое представление данных, полученных при препарировании определенных пе- 2 022611 риферических нервов;

фиг. 5Ό - фотографии, показывающие гистологический анализ мышей Кгох20; Ν£1^ηοχ/-, получавших иматиниба мезилат или плацебо;

фиг. 5Е - гистограмма, показывающая количество мастоцитов в поле зрения (ПЗ) в зависимости от лечения с использованием или без использования иматиниба мезилата;

фиг. 5Р - гистограмма, показывающая количество ΤϋΝΕΡ-положительных клеток в ПЗ в зависимости от лечения с использованием или без использования иматиниба мезилата;

фиг. 6 - МРТ-снимки пациента с плексиформными нейрофибромами до и после лечения иматиниба мезилатом;

фиг. 7 - ультраструктурный анализ дорсальных корешковых ганглиев при помощи трансмиссионной электронной микроскопии. Препараты 1-4 - увеличение в 750 раз, препараты 5-8 - увеличение в 1500 раз. Препараты 1-2 - проксимальные спинномозговые нервы мыши Кгох20; Ν£1^{ί1οχ/ί1οχ}, которой был пересажен ДТ КМ; препараты 3-8 - проксимальные спинномозговые нервы реципиентов, которым был пересажен N£1+ КМ. (И) обозначает немиелинизированные аксоны; (§) обозначает увеличение пространства эндоневрия. Стрелками показаны коллагеновые пучки; (М) обозначает мастоциты, инфильтрирующие опухоль;

фиг. 8 - микрофотографии образцов ткани мышей. Эти изображения иллюстрируют выявление плексиформных нейрофибром с использованием ФДГ-ПЭТ. ФДГ-ПЭТ-изображения и гистологические препараты спинномозговых нервов мыши Кгох20; Ν£1^ί1οχ/^ί1οχ и мыши Кгох20; Ν£1^ί1οχ/- были сделаны в возрасте девяти месяцев;

фиг. 9 - микрофотографии окрашенных толуидиновым синим образцов ткани, сделанные при увеличении в 100 и 600 раз, стрелками показаны мастоциты;

фиг. 10 - фотография геля, показывающая определение генотипа ДНК отдельных миелоидных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга облученных реципиентов Кго.\20; Ν£1^{ηοχ/ί1οχ}, которым был пересажен Ν£1+^/-; Жу/Жу костный мозг;

фиг. 11А - выявление плексиформных нейрофибром с использованием ФДГ-ПЭТ. ФДГ-ПЭТизображения и гистологические препараты спинномозговых нервов мыши Ι<ιόχ20; Ν£1^{ηοχ/ί1οχ} и мыши Κγοχ20; Ν£1^ί1οχ/- были сделаны в возрасте девяти месяцев;

фиг. 11В - график, показывающий среднюю интенсивность ФДГ-ПЭТ в изучаемой области седалищного нерва у мышей Κγοχ20; Ν£1^ί1οχ/- и Κγοχ20; Ν£1^{ί1οχ/ί1οχ};

фиг. 11С - фотографии характерных гистологических препаратов дорсальных корешковых ганглиев мыши Κγοχ20; Ν£1^{ί1οχ/ί1οχ} (препарат 1) и мышей Κγοχ20; Ν£1^ί1οχ/- с ПЭТ положительными опухолями (препараты 2-4);

фиг. 12 - определение апоптоза в плексиформных нейрофибромах с использованием ΤυΝΕΡ-метода после лечения иматиниба мезилатом или плацебо. Характерные гистологические срезы плексиформных нейрофибром, которые лечили плацебо-контролем (левый препарат) или иматиниба мезилатом (правый препарат). Стрелками показаны ΤυΝΕΡ-положительные клетки;

фиг. 13А - МРТ-снимки головы и шеи;

фиг. 13В - снимки С, Ό: последовательные аксиальные Т2-взвешенные МРТ-изображения до и после шестимесячного лечения иматиниба мезилатом соответственно.

Соответствующие позиционные обозначения используются для обозначения соответствующих частей на всех снимках.

Подробное описание изобретения

Не предполагается, что представленные и/или описанные ниже варианты осуществления изобретения являются исчерпывающими или задают рамки точных форм, раскрытых в нижеследующем подробном описании. Скорее, эти варианты осуществления изобретения выбраны и описаны таким образом, чтобы другие специалисты в данной области техники могли оценить и понять принципы и практические методы различных аспектов и вариантов осуществления изобретения, обсуждаемых в настоящей заявке.

Было доказано, что животные модели различных заболеваний являются весьма эффективным инструментом для развития понимания моделируемого заболевания и возможно, что также важно, для создания и испытания новых материалов и/или способов для диагностики, лечения и/или предупреждения моделируемого заболевания. Мышиные модели, предназначенные для того, чтобы сделать возможным вычленение автономного клеточного вклада и неавтономно-клеточного вклада в развитие опухоли, получили значительную известность. Экстраполяция мышиной модели опухоли на человека должна осуществляться под строгим контролем, и значимость таких экспериментальных стратегий может оцениваться только в контексте явного и доказуемого физиологического соответствия заболеванию человека.

Таким образом, основной принцип моделирования у мышей злокачественных опухолей человека требует того, чтобы мутации соответствующих молекулярных путей проявляли себя в тех же тканях, что и в опухолях человека. Кроме того, мышиные опухоли, используемые для моделирования заболеваний человека должны повторять человеческий фенотип по ряду надежных клеточных и молекулярных критериев. В тех случаях, когда планированию эксперимента и интерпретации результатов уделялось надлежащее внимание, мышиные модели были с успехом использованы для изучения развития опухолей у

- 3 022611 людей. Например, генетическое моделирование является особенно плодотворным тогда, когда опухоли у человека возникают вследствие генетически наследуемого признака, который может быть сведен к одиночной генной мутации, такой как в случае нейрофиброматоза Фон Реклингхаузена. Таким образом, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к мышиной модели, пригодной для минимизации образования некоторых форм нейрофибромы у людей. Возможно лучшим доказательством того, что животная модель данного заболевания эффективна при разработке подходов к лечению такого же или сходных заболеваний у человека является демонстрация того, что, в отличие от многих животных моделей заболеваний человека, способы лечения разработанные на основе данной животной модели показали свою эффективность при лечении пациентов-людей.

Создание мышиной модели нейрофиброматоза

Нейрофиброматоз Фон Реклингхаузена является моногенным заболеванием. В подавляющем большинстве случаев оно проявляется в результате генеративной мутации и полной соматической гетерозиготности с последующей редкой потерей гетерозиготности в тех типах клеток, которые порождают стереотипные проявления этого заболевания. Почти всегда при этом заболевании опухоли развиваются в периферической нервной системе пораженного пациента. Исследования ткани человека позволяют предположить ключевую роль Шванновских клеток, но недостатком этих исследований является то, что, делая заключение о предшествующем событии, они основываются на апостериорной информации. Мышиная модель с программируемым нокаутом гена ΝΠ, позволяющая осуществлять тканеспецифичную делецию гена ΝΠ, дала представление об этом процессе. В физиологически значимом окружении общей гетерозиготности эти исследования показывают, что критическим генетическим параметром для образования плексиформной нейрофибромы вероятно является потеря ΝΠ гетерозиготности в эмбриональной линии Шванновских клеток. Гистопатологическое исследование этих опухолей показало, что они практически не отличаются от опухолей, присущих человеку.

Возможности мышиной генетики позволили выявить ключевую роль микроокружения, которое в определенных генетических конфигурациях может быть или чувствительным или устойчивым к развитию опухоли. Эти данные указывают на то, что для образования опухоли необходимо наличие Νίΐ гетерозиготности за пределами линии Шванновских клеток. Например, инфильтрация периферических нервов мастоцитами у этих мышей происходит за месяц до появления опухолей в отличие от мышей с нетуморогенным ΝΠ^{(ί1οχ/ί1οχ)} генотипом дикого типа. Мастоциты были обнаружены в нейрофибромах человека, хотя, в отсутствие мышиной модели, изучение их функциональной роли в развитии и поддержании опухоли не могло быть осуществлено напрямую. Интересно отметить, что необходимость ΝΠ гаплонедостаточности была воспроизведена с дополнительными Сге трансгенами, мишенью которых служила линия Шванновских клеток нервного гребня, включая периостин-Сге, РО-Сге и тамоксифен, индуцируемый РЬР-Сге. Эти наблюдения дополнительно доказывают необходимость ΝΠ гетерозиготности за пределами линии Шванновских клеток. Данные, полученные с использованием тканеспецифичных Сге трансгенов, не исключают возможности того, что в искусственных экспериментальных условиях опухоли могут развиваться в окружении дикого типа. Действительно, когда авторы используют специфичные к нервному гребню Сге-драйверы, имеющие раннюю, повсеместную и сильную экспрессию, наблюдается гиперплазия периферических нервов даже у ^{Пох/Йох} мышей, хотя в меньшей степени, чем у ^йох/- мышей.

Результаты, описанные в данном описании, показывают, что вышеуказанные модели отличаются от физиологической ситуации у людей с ΝΡ1, у которых потеря гетерозиготности является таким редким случайным событием, что нуль-зиготный предшественник эмбриональной Шванновской клетки, появляющийся обособленно, находится в относительно неблагоприятном микроокружении для того, чтобы развиться в опухоль. Эти мышиные модели показывают, что изолированный нуль-зиготный участок клеток получает значительное селективное преимущество от явной синергии с мобилизованными гетерозиготными мастоцитами. Одна интерпретация этих результатов, согласующаяся с полученными данными, состоит в том, что гиперплазия в моделях с сильной Сге опосредованной рекомбинацией является следствием нефизиологической повсеместной потери ΝΠ не только Шванновскими клетками, но также дополнительно и другими линиями, которая может преодолевать барьеры локальной потери гетереозиготности.

Нейрофибромы образуются в соединении с периферическими нервами и состоят из Шванновских клеток, эндотелиальных клеток, фибробластов, дегранулирующих воспалительных мастоцитов, и перицитов/гладкомышечных клеток сосудов (У8МСк) и содержат большие отложения коллагена. Мышиная модель с программируемым нокаутом гена ΝΠ подтверждает результаты ретроспективных исследований опухолей человека, демонстрируя, что потеря ΝΠ гетерозиготности линией Шванновских клеток, вероятно, необходима, но недостаточна для того, чтобы вызвать образование нейрофибром. Как сообщалось, для развития опухоли необходимы сложные взаимодействия между Шванновскими клетками и ΝΠ гаплонедостаточными клеточными линиями в опухолевом микроокружении. Таким образом, при общем ΝΠ статусе дикого типа ΝΠ нуль-зиготность Шванновских клеток может быть необходимой, но не обязательно достаточной для того, чтобы вызвать образование опухоли. Одной подтвержденной характерной особенностью образования опухоли у гетерозиготных мышей является появление мастоцитов в периферических нервах задолго до развития опухоли. Кроме того, эксперименты ίη νίΐΓο по смешиванию конди- 4 022611 ционированной Шванновскими клетками среды и мастоцитов показали повышенную чувствительность N11 гетерозиготных мастоцитов к кондиционированной среде нуль-зиготных Шванновских клеток. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы предложили гипотетическую модель образования опухолей таких типов, включающую в себя инфильтрацию N11 гетерозиготными мастоцитами предопухолевых периферических нервов и их взаимодействие с N11 нуль-зиготными Шванновскими клетками, способствующее развитию опухоли.

Установление того факта, что адоптивный перенос происходящих из костного мозга Ν11^- гетерозиготных клеток, вместе с избирательным удалением резидентной линии нуль-зиготных Шванновских клеток, является достаточным для того, чтобы вызвать образование опухоли в отличном от дикого типа окружении, позволяет предположить, что гаплонедостаточность является необходимым условием только для клеток, происходящих из костного мозга, но не для других типов клеток, обнаруживаемых в этих опухолях. Кроме того, генетическая необходимость в наличии с-Κίί сигнального пути в донорском костном мозге и инфильтрация донорскими гетерозиготными мастоцитами появляющихся опухолей периферических нервов убедительно поддерживает гипотезу о том, что они находятся в причинно-следственной взаимосвязи.

С-Кй рецептору принадлежит центральная роль в развитии и функционировании мастоцитов. Шванновские клетки и фибробласты, два основных компонента нейрофибром, секретируют кй-лиганд в ответ на множество различных стимулов. Например, сообщалось, что ткань нейрофибромы содержит повышенное количество мРНК транскриптов кй-лиганда, и сообщалось, что пациенты с ΝΡ1 имеют повышенный уровень кй-лиганда в сыворотке крови. При проведении доклинических испытаний иматиниба мезилата - фармакологического агента, одобренного Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств, считалось, что он действует путем ингибирования некоторых тирозинкиназ, включая с-Кй.

При испытании его эффективности против нейрофибромы в мышиной модели этого заболевания, иматиниба мезилат показал неожиданную эффективность. Введение терапевтически эффективных доз этого химического соединения способно очень эффективно обращать течение патологического процесса образования нейрофибром. Лечение иматинибом приводило к исчезновению мастоцитов из периферических нервов у животных, получавших это химическое соединение. В дополнение к продолжающимся исследованиям ίη νίίτο, которые показывают с-Кй опосредованное взаимодействие между ΝΡ1 Шванновскими клетками и гетерозиготными мастоцитами, исследования ίη νίνο выявили сохраняющуюся потребность в чувствительном к иматиниба мезилату поддержании опухоли.

Роль воспаления и мастоцитов в развитии опухоли является областью активных исследований. После активации высокоаффинного рецептора иммуноглобулина Е (РскМ) и с-Кй рецептора мастоциты высвобождают медиаторы воспаления, включая гистамин, серотонин, протеогликаны и лейкотриены. Кроме того, по имеющимся данным мастоциты высвобождают УБОР, ангиогенный фактор, который также является сильным пролиферативным, хемотаксическим и обеспечивающим выживание фактором для Шванновских клеток. УЕОР также связан с ангиогенным переключением при образовании опухоли. Наконец, мастоциты также высвобождают ΡΌΟΡ-β - фактор роста, который стимулирует пролиферацию перицитов и фибробластов; и ТОР-β- фактор роста, который стимулирует пролиферацию фибробластов и синтез коллагена.

Иматиниба мезилат и опухолевое микроокружение

В связи с нейрофибромами важным является вопрос, как мастоциты взаимодействуют со Шванновскими клетками, чтобы вызвать образование опухоли. Представленные в данном описании данные указывают на то, что другие типы клеток опухоли не обязательно должны быть гетерозиготными. Однако еще слишком рано утверждать, взаимодействуют ли инфильтрирующие N11 гетерозиготные мастоциты преимущественно с нуль-зиготными Шванновскими клетками, чтобы стимулировать образование опухоли, или же непрямое взаимодействие с локальной стромой и дополнительными типами клеток, также присутствующими в этих опухолях, является необходимым промежуточным звеном для индукции опухоли. Для лучшего понимания дополнительных паракринных взаимодействий в нейрофибромах и того влияния, которое они могут оказывать на образование и поддержание опухоли, необходимы дополнительные исследования.

Кроме того, генетические данные, приводимые в данном описании и в предыдущих исследованиях ίη νίίτο, показали, что иматиниба мезилат ингибирует разнообразные стимулирующие образование опухоли функции Ж1^- перицитов и фибробластов. И в этом случае отсутствие необходимости гетерозиготности в этих дополнительных опухолевых клетках не исключает возможности того, что способность иматиниба мезилата вызывать регрессию опухолей может не быть обусловлена исключительно его ингибирующей активностью в отношении мастоцитов. Следующая гипотеза представлена в качестве иллюстрации, и для нее не является ограничением тот факт, что уменьшение опухолей при лечении такими химическими соединениями как иматиниба мезилат является аспектом настоящего изобретения, и она никак не зависит от достоверности той или иной теории или интерпретации, предложенной с целью объяснения данного результата. Иматиниба мезилат и соединения из того же или подобного ему семейств хи- 5 022611 мических соединений могут случайно ингибировать дополнительную и/или другую потенциально критическую активность, стимулирующую рост опухоли, в других типах опухолевых клеток. Например, кроме ингибирования с-Κίί в мастоцитах, иматиниба мезилат может уменьшать ангиогенез, действуя через ΡΌΟΡΚ, и понижать фиброзирование/синтез коллагена, действуя через с-ЛЫ. Для изучения этих важных и интересных вариантов могут потребоваться дополнительные исследования, а пока существуют данные, что эффективная доза этого соединения вызывает регрессию опухоли в мышиной модели нейрофибром и у людей, имеющих такие патологические состояния, как плексиформные нейрофибромы. Фармакологическое ингибирование с-Κίΐ уменьшает размер опухоли и метаболическую активность.

Химические соединения, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения на практике, включают соединения формулы 1

где К₁ является 4-пиразинилом; 1-метил-1Н-пирролилом; амино- или аминонизшим алкилзамещенным фенилом, у которого аминогруппа в каждом случае является свободной, алкилированной или ацилированной; 1Н-индолилом или 1Н-имидазолилом, связанным с атомом углерода пятичленного углеродного кольца; или незамещенным или низшим алкил-замещенным пиридилом, связанным с атомом углерода углеродного кольца, и у которого атом азота является незамещенным или замещенным кислородом; К₂ и К₃ являются независимо друг от друга водородом или низшим алкилом; один или два из радикалов К₄, К₅, К₆, К₇ и К₈ являются каждый нитро, фторзамещенным низшим алкокси или радикалом формулы II -Ν (К9)-С(=Х)-(У)_п-К₁₀ (II), где К₉ является водородом или низшим алкилом, X является оксо, тио, имино, Ν-низший алкилимино, гидроксиимино или О-низший алкилгидроксиимино, Υ является кислородом или ΝΗ группой, п равно 0 или 1 и К₁₀ является алифатическим радикалом, имеющим по меньшей мере пять атомов углерода, или ароматическим, ароматически-алифатическим, циклоалифатическим, циклоалифатически-алифатическим, гетероциклическим или гетероциклически-алифатическим радикалом, и остальные радикалы К₄, К₅, К₆, К₇ и К₈ являются независимо друг от друга водородом, низшим алкилом, который является незамещенным или замещенным свободными или алкилированными аминогруппой, пиперазинилом, пиперидинилом, пирролидинилом, или замещенным морфолинилом или низшим алканоилом, трифторметилом, свободной, этерифицированной или эстерифицированной гидроксигруппой, свободной, алкилированной или ацилированной аминогруппой, или свободной или эстерифицированной карбоксигруппой, или солью такого соединения, имеющего по меньшей мере одну солеобразующую группу.

Соединения формулы 1 в целом и конкретно раскрыты в заявке на патент США 5521184, в частности в формуле изобретения и в конечных продуктах демонстрационных примеров, объект этой заявки включен в данную заявку путем ссылки полностью. В приведенном выше определении соединения формулы 1 радикалы и символы имеют те же значения, что и в патенте США 5521184, который включен в данную заявку путем ссылки полностью.

Для целей настоящего изобретения иматиниб может применяться в виде своей мономезилатной соли. Иматиниба мономезилат может быть получен в соответствии со способами, раскрытыми в патенте США 6894051, который включен в данную заявку путем ссылки полностью. Раскрытые в этом патенте соответствующие полимофы, например кристаллические модификации, также включены в данную заявку.

Взрослым пациентам суточная доза мономезилатной соли иматиниба, составляющая от примерно 200 до примерно 800 мг, например 400 мг, вводится перорально. Иматиниба мономезилат может вводится в лекарственных формах, описанных в патентах США 5521184, 6894051, заявке на патент США 2005/0267125 или заявке РСТ νθ 2006/121941, которые все включены в данную заявку путем ссылки полностью, как если бы каждая из них была отдельно включена в данную заявку. Дополнительная информация об этих соединениях может быть получена, например, из заявки на патент США № 11/815046, в настоящее время публикации № 2008/00114001 А1, опубликованной 15 мая 2008 г., которая включена в данную заявку путем ссылки полностью.

Одним химическим соединением особенно эффективным при лечении заболеваний, которые, как полагают, связаны с активностью тирозинкиназ, является соединение иматиниба мезилат (4-(4метилпиперазин-1-илметил)^-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]бензамид). Иматиниб может, например, быть получен в соответствии со способами, раскрытыми в заявке РСТ νθ 03/066613. Одной фармацевтически приемлемой солью этого соединения является иматиниба мезилат,

- 6 022611 соответствующий представленной ниже формуле 3.

Иматиниба мезилат является сильнодействующим ингибитором тирозинкиназ с-Κίΐ, ΡΌ0Ρ-ΒΒ и саЫ. Это химическое соединение на рынке защищено товарным знаком Гливек. В США оно было одобрено для лечения пациентов с Κίΐ-экспрессией (СЭ117 + ). По мнению Национального центра нормативной документации Схлхлу.щибПпе.доу) начальный уровень дозы, рекомендованный для введения взрослому пациенту, составляет 400 мг, два раза в день. Фактическая терапевтически эффективная доза является индивидуальной и определяется лечащим врачом на основании различных факторов, включая вес, возраст, пол, общее состояние здоровья пациента и его реакцию на препарат.

Одним ограничением мышиной модели является короткая продолжительность жизни животных, учитывая это, на основании исследований на мышах никто не может предсказать, какую ответную реакцию можно ожидать от долгоживущих опухолей. Однако результаты, полученные на мышиной модели, убедительно указывают на то, что лечение этими соединениями может и будет оказывать благотворное действие на людей, страдающих некоторыми опухолями. Дополнительной поддержкой этой гипотезы служит неожиданно хороший результат, полученный при лечении пациента иматиниба мезилатом, когда у него успешно удалось уменьшить размер опухоли.

Следующее обсуждение предлагается в качестве объяснения, а не с целью ограничения. За последние годы теории, касающиеся клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе развития спонтанных злокачественных опухолей, претерпели значительную эволюцию. Первоначальные представления о том, что автономные клеточные события стимулируют одиночную клетку ослабить свою нормальную регуляцию, приводя к развитию злокачественного заболевания, и, кроме того, к формированию идентичности клеток-предшественниц опухолевого типа, в настоящее время подвергаются согласованному пересмотру. Становится все более очевидным, что, хотя ряд генетических и эпигенетических событий в одиночной клетке дает начало движению к злокачественному фенотипу, большинство форм рака включают в себе путем кооптаци пермиссивное микроокружение, допускающее и даже стимулирующее их туморогенное состояние, в соответствии с этой гипотезой, устойчивое окружение будет в значительной степени предотвращать возможность образования опухоли. В числе выявленных неавтономноклеточных факторов кооптированного пермиссивного процесса образования опухоли находятся неоангиогенез, участие локальной стромы и воспаление среди других типов клеток. Понимание точного масштаба паракринных взаимодействий, относительной важности и молекулярных основ взаимодействия с нетуморогенным окружением находится в стадии становления. Однако терапевтическое применение раскрытых в настоящей заявке химических соединений никак не ограничивается любым гипотетическим способом действия или предполагаемой молекулярной этиологией различных заболеваний или состояния, которые можно попробовать лечить или контролировать с использованием описываемых здесь материалов и/или способов.

Эти данные согласуются с ролью происходящих из костного мозга клеток в образовании плексиформной нейрофибромы. Эти данные также указывают на то, что фармакологическое и генетическое ингибирование с-Κίΐ рецептора способно предотвратить или, по меньшей мере, задержать образование плексиформной нейрофибромы у ΝΠ мышей. Эти результаты показывают, что в опухолевом микроокружении для того, чтобы обеспечить развитие нейрофибромы, необходима Νί1 гаплонедостаточность происходящих из костного мозга клеток, в частности тех, которые зависят от активации с-Κίί рецептора. Эти данные позволяют сделать вывод об активном участии мастоцитов в образовании опухоли и выявить новые терапевтические агенты для первой и второй фазы клинических испытаний на человеке.

Настоящее раскрытие содержит пример физиологически релевантной мышиной модели рака человека, дающей частное представление о сложных взаимодействиях между опухолевой клеткойпредшественницей и ее микроокружением. В то же время исследования с использованием мыши в качестве модели заболевания человека позволяют предложить возможный терапевтический подход к лечению ранее неизлечимых опухолей путем направленного воздействия на микроокружение образующейся опухоли, а не на туморогенные клетки. Ввиду значительных клеточных и физиологических различий между человеком и мышью, эффективность применения такого химического соединения как иматиниба мезилат для лечения нейрофибромы у людей может быть доказана только путем успешного лечения людей этим соединением. По меньшей мере, отчасти из-за того, что люди, как правило, живут дольше мышей, способность иматиниба мезилата лечить людей с такими заболеваниями как нейрофиброма, в отличие от ситуации с использованием этого соединения для лечения хронической миелоидной лейке- 7 022611 мии, может привести к развитию лекарственной устойчивости. Считается, что при лечении ХМЛ иматиниба мезилат действует непосредственно на лейкозную клетку и его мишенью является мутированный конститутивно активный тирозинкиназный онкобелок (Всг-аЫ). Лекарственная устойчивость онкогена Вст-аЫ может развиваться в результате приобретения им супрессорных мутаций. В противоположность этому вполне вероятно, что главной, если не единственной формой активности анти-с-кй агентов, таких как иматиниба мезилат, на нейрофибромы является их действие на неопухолевые клетки, например, на белки дикого типа, у которых может не быть готового механизма для отбора на лекарственную устойчивость.

Авторами были выявлены химические соединения, обладающие ίη νίίτο вплоть до десяти раз большей ингибирующей активностью в отношении ΝΓ1 гетерозиготных мастоцитов, чем иматиниба мезилат (неопубликованные данные). Было зарегистрировано очень небольшое число случаев, когда пациенты страдали одновременно и нейрофиброматозом Фон Реклингхаузена и пиебалдизмом. При изучении этих случаев был сделан вывод о том, что пиебалдизм возникал в результате гипоморфных мутаций в с-Κίί рецепторе. Сообщалось об отсутствии у этих пациентов нейрофибром. Другим возможным объяснением этого отсутствия является то, что эти пациенты имели дефицит мастоцитов. Таким образом, эти данные могут служить подтверждением важности с-Κίί и мастоцитов в образовании нейрофибром у людей.

Генетическая и клеточная пластичность обсуждаемых в данном описании мышиных моделей нейрофибромы раскрывает важные подробности, касающиеся участия микроокружения в образовании опухоли, которые имеют общее значение для раковых опухолей человека не связанных с нейрофиброматозом Фон Реклингхаузена.

Примеры

Материалы и методы

Животные и реактивы

Мыши Кгох20; ΝΓ1^{Γ1οχ/Γ1οχ}, использованные в данных исследованиях, были ранее описаны (2йи с1 а1., 2002), №итойЪгота ίη ΝΡ1: Зсйтапп се11 οτί§ίη апй го1е оГ (итог е^йоптепС, Зшепсе 296, 920-922. Для того, чтобы получить мышей Кгох20; ΝΓ1^{Γ1οχ -}, авторы скрещивали мышей Кгох20; Νί1^{ί1οχ/ί1οχ} с мышами ΝΓ1^-. Все процедуры, связанные с использованием животных, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию медицинского факультета Университета Индианы. Химические реактивы приобретались у компании §1§та (δί. Ьош8, МО), если не указано иное.

Адоптивный перенос гемопоэтических клеток

Для того чтобы оценить роль микроокружения в регуляции развития плексиформной нейрофибромы, были получены трансплантаты костного мозга. Вкратце схема была следующей: два миллиона изогенных ДТ или ΝΓ1^- клеток костного мозга на реципиента от ДТ ЗФБ или ΝΓ1^- ЗФБ мышей адоптивно переносили молодым взрослым мышам Кгох20; ΝΓ1^{Γ1οχ/Γ1οχ} и Кгох20; ΝΓ1^Γ1οχ/-, после облучения их двумя дробными дозами ионизирующего излучения, так что общая поглощенная доза составляла 1100 рад.

ПЭТ анализ

Для того чтобы подтвердить и анатомически локализовать плексиформные нейрофибромы, была использована позитронная эмиссионная томография с [¹⁸Р]-фтордеоксиглюкозой ([¹⁸Р]ФДГ-ПЭТ), объединенная с рентгеновской компьютерной томографией (КТ). При получении КТ-изображений трафарет располагали по областям тела латерально, чтобы получить стандартизированный исследуемый объем, тем самым, давая возможность исследователю количественно определить накопление ФДГ. Зафиксированные и наложенные данные КТ-изображений были использованы для идентификации отдельных позвонков (обозначаемых, например, маркировочными знаками от Ь1 до δ1). Затем оператор выбрал точки вдоль спинного мозга, чтобы определить ход спинного мозга между Ы и δ1. Далее, у интерполированных вдоль спинного мозга точек выделяют три круговых изучаемых области, таким образом, чтобы в них попали области спинного мозга и ганглия заднего корешка. В довершение всего, круговые изучаемые области объединяют, чтобы создать исследуемые объемы спинного мозга, левого ганглия заднего корешка и правого ганглия заднего корешка. ФДГ -изображения получают через 45 мин после инъекции в хвостовую вену примерно 0,5-1,0 мКи ФДГ. Все животные получают инъекции ФДГ в состоянии бодрствования и изофлурановую анестезию примерно через 40 мин после инъекции, для того, чтобы обездвижить животных для получения изображений.

Предварительные исследования изображений проводят для нетуморогенных мышей Кгох20; Νί1^{ί1οχ/ί1οχ} и мышей Кгох20; ΝΓ1^Γ1οχ/-, у которых нейрофибромы проявляются с полной пенетрантностью. В результате предварительных исследований, как экспериментальных ПЭТ-изображений, так и анатомических препаратов дорсальных корешковых ганглиев и проксимальных периферических нервов, ни у одной из мышей до шестимесячного возраста независимо от их генотипа не удалось обнаружить опухоли (данные не приводятся). Сходным образом, незначительное накопление ФДГ в пояснично-крестцовой области наблюдалось у мышей Кгох20; ΝΓ1^{Γ1οχ/Γ1οχ} в возрасте девяти месяцев (фиг. 8А). В отличие от этого ФДГ-ПЭТ-изображения девятимесячных мышей Кгох20; ΝΓ1^ί1οχ'^-. у которых опухоли локализуются в основном в седалищном нерве, показывают характерное увеличение интенсивности ФДГ-ПЭТ в поясничном отделе позвоночника (фиг. 8А; стрелки). Последующее вскрытие животных, для которых были получены изображения, соответствующим образом подтвердило существование выявленных при помощи

- 8 022611

ФДГ-ПЭТ опухолей (фиг. 8В). Обобщенные данные ФДГ-ПЭТ-изображений, полученные от группы мышей Кгох20; №Т^йох/-, по сравнению с группой мышей Кгох20; ΝΠ^Πο'''^Πο'' сопоставимого возраста показаны на фиг. 8С. Эти исследования подтверждают пригодность неинвазивной ФДГ-ПЭТ интраскопии для выявления плексиформных нейрофибром у мышей Кгох20; ΝΓ1^ί1οχ'^-.

Препарирование дорсальных корешковых ганглиев

Сразу после умерщвления мышей фиксируют методом перфузии в 4% параформальдегиде. Затем дорсальные корешковые ганглии и периферические нервы иссекают под препаровальной лупой. Мышей, чьи ткани планируют изучать под электронным микроскопом, фиксируют методом перфузии в 2% параформальдегиде, 2,5% глутаральдегиде и 0,1 М какодилате (рН 7,4).

Измерение размера опухоли

Для того чтобы оценить размер опухоли, анатомическое измерение размера дорсальных корешковых ганглиев выполняют после измерения с помощью циркуля максимально возможной ширины и длины дорсальных корешковых ганглиев. Объем опухоли определяется путем вычисления приблизительного объема для шарообразного тела (например, 0,52 х (ширина)2 х длина).

Фенотипическая оценка донорских клеток в дорсальных корешковых ганглиях

Чтобы изучить тип(ы) донорских клеток, которые образовали опухоли, был применен проточный цитометрический анализ. Вкратце процедура была следующей: дорсальные корешковые ганглии иссекали, измельчали и переваривали коллагеназа V. Суспензию одиночных клеток затем смешивали с антителами к ΟΌ117, СЭ31 или Со11А и РсеКТ Затем популяции разделяли с использованием клеточного сортера с активацией флуоресценции (ВесЮп Эгекхоп).

Гистологический анализ

Для подробного изучения морфологии опухолей, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Принимая во внимание, что приблизительно 60% сухого веса плексиформных нейрофибром человека составляет коллаген, срезы тканей также окрашивали трихромом по Массону. Для того чтобы определить наличие в опухолях мастоцитов, применяли окрашивание альциановым синим.

Трансмиссионная электронная микроскопия

После фиксации методом перфузии ткани обезвоживали в серии разведений этанола и ацетона с повышающейся концентрацией и фиксировали на смоле Ероп-АтаЫйе (Е1ес1топ М1сго8сору-8с1епсе8, На1ПсИ. РА). Ультратонкие срезы (с серебряно-золотым напылением) окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали при помощи электронного микроскопа РЕ1 Теспа1 С2 (РЫНрк, ЕтШюуеп, Ν«1ιет1апЙ8).

Пример 1. Адоптивный перенос ΝΓ1 гетерозиготного костного мозга (КМ) уменьшает опухолеассоциированное выживание реципиентов

На фиг. 1 изображена схема, показывающая генотипы мышей-реципиентов, генотипы клеток, адоптивно перенесенных реципиентам после облучения реципиентов ионизирующей радиацией, и исследования, проведенные после трансплантации. Для проверки гипотезы о том, что ΝΓ1 гетерозиготность гемопоэтических клеток в опухолевом микроокружении отвечает за генетическую гаплонедостаточность, необходимую для образования нейрофибромы, авторы пересадили ΝΓ1 гетерозиготный костный мозг мышам, у которых два аллеля ΝΓ1 у приблизительно 10% Шванновских клеток были удалены при помощи Кгох20-Сге трансгеноза (Кгох20; νΠ^'^'^^). Мыши Кгох20; ^1^{йох/йох} во всех клеточных линиях функционально соответствовали дикому типу, и нейрофибром у них не наблюдалось. В качестве дополнительного эксперимента клетки ДТ костного мозга пересаживали мышам, имеющим в зародышевой линии нуль-зиготный ΝΓ1 аллель и подверженный рекомбинации флоксированный аллель, в линии Швановских клеток, как указано выше (Кгох20; ΝΓ^⁰^^-). У всех мышей Кгох20; №Т^йох/-развивались плексиформные нейрофибромы, как это было описано ранее (Ζΐη.ι е( а1., 2002). Порция ΝΓ1^- или ДТ костного мозга была адоптивно перенесена реципиентам, предварительно облученным ионизирующей радиацией, и развитие плексиформных нейрофибром и связанную с этими опухолями смертность наблюдали до достижения мышами возраста 1 год.

На фиг. 2А генотипы указаны возле каждой кривой. Мышей умерщвляли сразу после того, как у них обнаруживались явные признаки массовой заболеваемости. По оси Υ показан процент выживших мышей. Сравнение мышей Кгох20; ΝΠ^Πο''^Γ1°'' + ΝΓ1^- км (пунктирная линия) с мышами Кгох20; ΝΠ^ί1ο''^Γ1°'' + дт. км (пустые квадраты) (Р<0,002); мышей Кгох20; эдТ^{йох/йох} + ΝΓ1+^/- КМ (пунктирная линия) с мышами Кгох20; МТ^йох/(пустые кружки) не показало достоверных различий. Мышей Кгох20; №Т^йох/- (пустые кружки) с мышами Кгох20; ΝΓ11^11ох/- + ДТ костный мозг (закрашенные квадраты) (Р<0,0002). Через шесть месяцев после пересадки у реципиентов с функциональной зародышевой линией ДТ, которым был пересажен ΝΓ1^+/- гетерозиготный костный мозг, начали появляться двигательный паралич и потеря веса, и только 15% мышей дожило до конца экспериментального периода (см., например, фиг. 2А и В). Такой уровень смертности в значительной степени является зеркальным отражением ситуации, ранее наблюдаемой у гетерозиготных по зародышевой линии мышей Кгох20; №Т^йох/-(фиг. 2А). В отличие от этого приблизительно 90% мышей Кгох20; эдТ^{йох/йох}, которым пересадили ДТ костный мозг, остались живы и не обнаружили никаких клинических признаков образования плексиформных нейрофибром (фиг. 2А). Эти данные были подтвер- 9 022611 ждены обратным экспериментом, в котором пересадка клеток ДТ костного мозга мышам Кгох20; ΝΗ^ηοχ/с гетерозиготной зародышевой линией восстанавливала их выживаемость до уровня, сопоставимого с уровнем выживания нетуморогенных мышей Кгох20; ΝΠ^{ηοχ/ί1οχ}, имеющих неповрежденный костный мозг (фиг. 2А).

На фиг. 2С приводятся фотографии гистологических препаратов дорсальных корешковых ганглиев и периферических нервов мышей Кгох20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен ДТ или ΝΗ^+/ костный мозг. Стрелками показаны опухоли в дорсальных корешковых ганглиях и проксимальных периферических нервах. Аутопсия головного и спинного мозга больных мышей показала, что 21 из 22 реципиентов с пересаженным ΝΗ^+/ костным мозгом имели увеличенную толщину всего костного мозга по сравнению со спинным мозгом мышей без симптомов заболевания, с пересаженным ДТ костным мозгом. Эта ненормальная морфология схожа с той, которая наблюдается у туморогенных мышей Кгох20; ΝΗ^ηοχ/-.

На фиг. 2С приводятся микрофотографии дорсальных корешковых ганглиев мышей с различными генотипами, стрелками показаны ганглии, иннервирующие конечности, которые проявляют двигательный паралич. На препаратах 2 и 3 на фиг. 2С показано наличие отдельных опухолей, возникающих из дорсальных корешковых ганглиев мышей Кгох20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен ΝΗ^+/- костный мозг, и эти опухоли особенно распространены в седалищных нервах. Волюметрический анализ этих опухолей выявил у них 3-6 кратное увеличение объема по сравнению с непораженными дорсальными корешковыми ганглиями мышей, у которых не образовывались опухоли. Большой размер и анатомическая локализация этих опухолей, инфильтрирующих седалищный нерв и пояснично-крестцовое сплетение, вероятно, объясняют наблюдаемые поведенческие аномалии, паралич задних конечностей, гидронефроз и увеличенный атоничный мочевой пузырь (фиг. 2В). В целом, эти данные показывают, что наличие ΝΗ гетерозиготного костного мозга при условии потери гетерозиготности Швановскими клетками достаточно для воспроизведения болезненного состояния и гиперплазии периферических нервов первоначально наблюдаемых у туморогенных мышей Кгох20; ΝΓ1^ί1οχ'^-.

Пример 2. Развитие плексиформных нейрофибром у реципиентов с ΝΓ1^- костным мозгом (КМ)

На фиг. ЗА показаны результаты патологического исследования, подтвердившего наличие плексиформных нейрофибром у реципиентов с ΝΓ1 гетерозиготным костным мозгом. На фотографиях препаратов 1 и 6 изображены гистологические срезы мыши Кгох20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которой был пересажен ДТ КМ. На фотографиях препаратов 2, 3, 7, 8 изображены гистологические срезы мышей Кгох20; ΝΓ1^{ί1οχΓ1οχ}. которым был пересажен ΝΓ1^- КМ. На фотографиях препаратов 4, 5, 9, 10 изображены гистологические срезы мышей Кгох20; Ν£1^ί1οχ/-, которым был пересажен ДТ КМ. Фотографии препаратов в верхнем ряду были сделаны через световой микроскоп при 100 кратном увеличении, а фотографии препаратов в нижнем ряду были сделаны при 200 кратном увеличении. Дорсальные корешковые ганглии мышей Кгох20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен ΝΓ1^- костный мозг, обладают классическими гистологическими особенностями плексиформных нейрофибром человека, включая нарушение нормальной архитектуры, неровные Швановские клетки и инфильтрирующие клетки с гиперхроматическими ядрами (фиг. ЗА, препараты 7-8), избыточные отложения коллагена (фиг. ЗВ, препараты 2-3), ангиогенез (фиг. ЗС, большими стрелками на препарате 3 обозначены кровеносные сосуды) и классические ультраструктурные аномалии (фиг. 7). На фиг. 7, препараты 1-4 - увеличение в 750 раз, препараты 5-8 - увеличение в 1500 раз. Препараты 1-2 проксимальные спинномозговые нервы мыши Кгох20; ΝΗ^ί1ο^^ί1οχ, которой был пересажен ДТ КМ; препараты 3-8 - проксимальные спинномозговые нервы реципиентов, которым был пересажен ΝΓ1КМ. На этих фотографиях (И) обозначает немиелинизированные аксоны; (§) обозначает увеличение пространства эндоневрия; стрелками показаны коллагеновые пучки; и (М) обозначает мастоциты, инфильтрирующие опухоль. В отличие от этого, как у мышей Кгох20; ΝΗ^ί1ο^^ί1οχ, так и у мышей Кгох20; Ν£1^ί1οχ/-, которым был пересажен ДТ костный мозг, нервы имели нормальный вид, равномерно распределенные во всех срезах дорсальных корешковых ганглиев и проксимальных периферических нервов ядра (см., например, фиг. 3А, препараты 1, 4-6 и 9-10) и отсутствие отложений коллагена. Выделенные из мышей Кгох20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен ΝΓ1^- костный мозг, опухоли обладают гистологическими признаками нейрофибром.

На фиг. 3В на фотографиях препаратов 4-5 показана неоваскуляризация, и сохраненная нормальная ультраструктурная морфология (фиг. 7). Нейрофибромы являются сложными опухолями, включающими в себя несколько типов клеток, из которых потеря гетерозиготности имеет место исключительно в линии Шванновских клеток (Ζΐη.ι с1 а1., 2002). Инфильтрация мастоцитами характерна для плексиформных нейрофибром человека и мыши (Ζΐη.ι с1 а1., 2002). В использованной в настоящем исследовании мышиной модели этого заболевания авторы наблюдали инфильтрацию мастоцитами периферических нервов, предшествующую появлению опухоли. Соответственно, гетерозиготный костный мозг вновь созданных мышей Кгох20; ΝΗ^ί1ο^^ί1οχ, также обнаруживал обширную инфильтрацию мастоцитами (фиг. 3С, препараты 2-3).

Флуоресцентная цитометрия используется для того, чтобы выделить в нейрофибромах мышей Кгох20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен ΝΓ1^- костный мозг, эндотелиальные клетки (СИ31), фибробласты (Οο11Ά) и гемопоэтические клетки (е-Кй, СИ 117).

На фиг. 3Ό стрелками обозначены амплифицированные ДНК продукты указанных аллелей из соот- 10 022611 ветствующих фенотипических линий. Неожиданно, последующее генотипирование показало, что только с-Κίί популяция, которая также экспрессировала РсеРТ (данные не приводятся), содержала нулевой аллель ΝΗ (фиг. 3Ό). Эти данные согласуются с появление истинных плексиформных нейрофибром у вновь созданных мышей Кгох20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, включая хоуминг пересаженных гетерозиготных мастоцитов в области ΝΗ нуль-зиготных Шванновских клеток.

На фиг. 3Е показано, что костный мозг (КМ) (диаграмма 1) и опухолевые клетки (диаграмма 2) были выделены, и из них были отобраны ЕСЕР+ СЭ45.2 положительные популяции. Затем опухолевые СН45.2 клетки были разделены для выявления мастоцитов (диаграмма 3), макрофагов (диаграмма 4), Влимфоцитов (диаграмма 4) и Т-лимфоцитов (диаграмма 5). Графики показывают долю каждой популяции гемопоэтических клеток в опухоли.

На фиг. 3Р показаны генотипы клеточных линий, выделенных при помощи флуоресцентной сортировки клеток из опухолей мышей Кгох20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен Ν£1+^/- костный мозг КМ. Стрелками на фиг. 3Р обозначены зоны на геле, образованные амплифицированными ДНК продуктами, соответствующими аллелям, выделенным из указанных фенотипических линий.

Необходимость е-Кй для опосредованного Νί1^+/ костным мозгом образования опухоли

Только ΝΗ гетерозиготные клетки, обнаруженные в воссозданных плексиформных нейрофибромах, происходили из костного мозга. Эти данные согласуются с нашими предыдущими наблюдениями ίη νίίτο и ίη νίνο, предполагающими необходимость гаплонедостаточности мастоцитов для образования опухоли. Считается, что с-Κίί рецепторная тирозинкиназа (РТК) контролирует многие аспекты в развитии мастоцитов и осуществлении им своих функций. Авторы сообщали о том, что с-Κίί активность, повидимому, управляет миграцией, пролиферацией и продолжительностью жизни происходящих из костного мозга Ж1^-мастоцитов. Авторы предположили наличие связи между этими параметрами и экспериментально проверили влияние генетического нарушения в с-Κίί активности Νί1+^/- клеток костного мозга, пересаженных мышам Κτοχ20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, на развитие опухоли.

Генетическое нарушение с-Κίί сигнального пути в адоптивно перенесенном Νί1+^/- костном мозге предотвращает образование плексиформных нейрофибром у мышей-реципиентов Κτοχ20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}. Вкратце схема эксперимента была следующей: Ж1^-мышей независимо скрещивали с двумя линиями мышей, у которых активность мастоцитов была ингибирована посредством точечной мутации в с-Κίί рецепторе, что приводило к уменьшению киназной активности от 85% (^41/Ψ41) до 95% (^ν/^ν) соответственно.

Комментарии к фиг. 4А.

Костный мозг двойных мутантов ΝΓ1+^/-; ХУуЛУу и ΝΓ1+^/-; \У41/\М41 был пересажен пяти и десяти мышам Κτοχ20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, соответственно. Смертность среди мышей, которым был пересажен ΝΓ1+^/-; мутантный костный мозг, была значительно ниже, чем у мышей ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен ΝΓ1+^/костный мозг. Мышей Κτοχ20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен ΝΓ1+^/- или ΝΓ1+^/-; мутантный костный мозг, наблюдали в течение одного года. Генотипы и статистическая значимость между двумя группами указаны. Таким образом, в отличие от реципиентов с ΝΓ1+^/- костным мозгом, дорсальные корешковые ганглии и проксимальные периферические нервы мышей Κτοχ20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ}, которым был пересажен ΝΓ1+^/-; мутантный костный мозг, имеют нормальную морфологию, у них не наблюдается гипертрофия и отсутствуют признаки опухоли (фиг. 4В). Эти результаты поддерживают гипотезу о том, что ΝΗ гаплонедостаточность возникает в костном мозге и затем доводит идентичность активного компонента до сΚίί зависимого типа клеток. На фиг. 4С показан график, выражающий объем отдельных дорсальных корешковых ганглиев (ДКГ) седалищных нервов мышей Κτοχ20; ΝΗ^{ί1οχ/ί1οχ} в зависимости от генотипа. Каждая отдельная точка представляет объем отдельного ДКГ, и каждая линия представляет средний объем в соответствующей экспериментальной группе. У реципиентов с пересаженными клетками ΝΓ1+^/- костного мозга наблюдаются значительно большие объемы ДКГ седалищного нерва по сравнению с мышами, которым пересадили ΝΓ1+^/- костный мозг, который также имеет мутацию с-Κίί рецептора, инактивирующую с-Κίί сигнальный путь (ΝΓ1+^/-; ^/^).

На фиг. 40 показаны гистологические срезы, окрашенные гематоксилин-эозином (препараты 1-3) и альциановым синим (препараты 4-6). Стрелками показаны мастоциты. Генотипы адоптивно перенесенного костного мозга указаны под соответствующими препаратами.

Пример 4.

Для оценки влияния иматиниба мезилата и других потенциальных фармакологических агентов на опухолевую массу авторы обоснованно использовали неинвазивную позитронную эмиссионную томографию с фтордеоксиглюкозой (ФДГ-ПЭТ), позволяющую идентифицировать и в течение продолжительного времени наблюдать плексиформные нейрофибромы у мышей Κτοχ20; ΝΓ1^Ποχ'^- (см. также раздел методы и фиг. 8).

На фиг. 5А показано изменение средней интенсивности ФДГ-ПЭТ положительных опухолей после 12 недель лечения иматиниба мезилатом. Показаны изучаемые области, сделанные в разное время последовательные изображения трех отдельных мышей и экспериментальные группы. Далее авторы сформировали группы мышей Κτοχ20; ΝΓ1^ηοχ/- в возрасте 8-9 месяцев с подтвержденным ПЭТ-положительным накоплением в области седалищного нерва для перорального введения им или иматиниба мезилата в дозе

- 11 022611

250 мг/кг в день или плацебо-контроля (ФСБ). Далее проводили ФДГ-ПЭТ исследование с целью оценить процесс изменения в опухолях. Показаны репрезентативные аксиальные ФДГ-ПЭТ изображения пораженных нервов трех мышей, сделанные до и после лечения иматиниба мезилатом или ФСБ в течение трех недель. Как и ожидалось, повышенное накопление ФДГ наблюдалось у животных Кгох20; Νί1^ηοχ/- по бокам от позвоночника до лечения иматиниба мезилатом или ФСБ (фиг. 5А, изображения 1, 3, 5). Отчетливо видно, что накопление ФДГ качественно уменьшилось у мышей Кгох20; Ж1^Пох'^-. получавших иматиниба мезилат (фиг. 5А, изображения 2, 4), по сравнению с ФСБ-контролем (фиг. 5А, изображение 6). Чтобы провести точное количественное определение ФДГ-ПЭТ интенсивности у всех подвергнутых лечению животных, авторы использовали стандартизированную для всех животных изучаемую область для получения количественных значений накопления ФДГ (мКи/мл ткани). Трехмерные изучаемые области в форме цилиндров были использованы для того, чтобы заключить в них области, расположенные сбоку от позвоночного столба, во всех случаях вместе с цилиндрическими изучаемыми областями авторы использовали маркировочные знаки для позвонков от Ь1 до 81, чтобы обеспечить единообразие измерений. Репрезентативные результаты от одного экспериментального животного до и после лечения показаны на фиг. 5А (изображения 7-8). Эти изображения показывают, что лечение иматиниба мезилатом уменьшает размер опухоли у этого животного. На фиг. 5В в графическом виде представлены обобщенные данные ПЭТ анализа изучаемых областей в районе седалищного нерва у одной группы из 12 экспериментальных животных. В целом, у подвергнутых лечению иматиниба мезилатом мышей накопление ФДГ-ПЭТ после лечения уменьшилось в среднем на 50% (р<0,035). В отличие от этого метаболическая активность опухолей в группе мышей, получавших ФСБ, имела небольшое, но незначимое увеличение коэффициента накопления ФДГ, сопоставимое с нарастающим со временем накоплением ФДГ, наблюдаемым у мышей Кгох20; Ж1^Похх- с развивающимися плексиформными нейрофибромами.

Для того чтобы определить, связано ли изменение метаболической активности непосредственно с гистологическими изменениями в опухолях, животных из групп, от которых получали изображения, умерщвляли, изучали спинной мозг и готовили срезы для гистологической оценки.

На фиг. 5С показан средний объем дорсальных корешковых ганглиев из всех седалищных нервов мышей Кгох20; Νί1^ηοχ/-, получавших плацебо-наполнитель, по сравнению с иматиниба мезилатом (п=28 в группе, поучавшей плацебо-контроль, и п=28 в группе, получавшей гливек). Сплошными линиями показан средний объем в каждой соответствующей группе. Каждый символ обозначает объем отдельного нерва. При вскрытии авторы также сравнили объемы всех дорсальных корешковых ганглиев мышей Кгох20; ^1^{Яох/Яох} из группы того же возраста. Было обнаружено явное уменьшение объема дорсальных корешковых ганглиев в группе, получавшей иматиниба мезилат, по сравнению с группой, получавшей ФСБ, что согласуется с ФДГ-ПЭТ исследованиями.

Также была проведена гистологическая оценка дорсальных корешковых ганглиев и окружающих проксимальных нервов мышей, получавших или иматиниба мезилат или ФСБ. На фиг. 5Ό показаны репрезентативные гистологические срезы после их окраски гематоксилином и эозином, альциановым синим и трихромом по Массону. Экспериментальная терапия, красители, используемые для приготовления образцов, указаны с левой стороны фигуры. Увеличение изображения в каждой группе препаратов показано в нижней части фигуры. Как указано в заголовках столбцов, препараты 1-6 были получены от мышей, подвергавшихся лечению иматиниба мезилатом; препараты 7-12 были получены от мышей, получавших только плацебо. Стрелками на препарате 10 показаны мастоциты, обнаруженные в соответствующих гистологических срезах. Качественно, существует отчетливое нарушение нормальной нервной архитектуры и увеличение насыщенности клетками нервов, полученных от мышей, которым давали плацебо, по сравнению с мышами, подвергнутыми лечению иматиниба мезилатом. Это показано на гистологических срезах дистального заднего корешка и проксимальных нервных сегментов (фиг. 5Ό, препараты 1-6 в сравнении с препаратами 7-12). Кроме того, наблюдается заметное уменьшение числа мастоцитов в нервах, иссеченных из мышей, подвергнутых лечению иматиниба мезилатом, по сравнению с получавшими ФСБ контрольными мышами (фиг. 5Ό, препараты 3-4 в сравнении с препаратами 9-10). В совокупности, ПЭТ, обобщенные анатомические и гистологические данные свидетельствуют о способности иматиниба мезилата уменьшать объем опухоли у мышей Кгох20; Ж1^Пох-.

На фиг. 5Е приведена гистограмма, показывающая существенное различие в количестве мастоцитов между мышами, которых лечили иматиниба мезилатом, и мышами, которых не лечили этим соединением. На фиг. 5Р приведена гистограмма, показывающая, что в образцах, полученных от мышей, которых лечили иматиниба мезилатом, содержится меньшее количество ТЦКЕЬ-положительных клеток в ПЗ, по сравнению с мышами, которых не лечили этим соединением.

Одним ограничением мышиной модели является короткая продолжительность жизни животных. Поэтому на основании своих исследований на мышах авторы не могут предсказать какую ответную реакцию можно ожидать от долгоживущих опухолей. Можно предположить, что с течением времени опухолевые клетки могут накапливать дополнительные свойства, которые делают их независимыми от некоторых ранних паракринных событий, таких как взаимодействие между мастоцитами и Шванновскими клетками.

- 12 022611

Пример 5. Применение иматиниба мезилата для лечения безнадежно больного ребенка с плексиформной нейрофибромой

Плексиформные нейрофибромы, в основном встречающиеся у младенцев и детей раннего возраста, страдающих ΝΡ1, часто характеризуются быстрым ростом и прорастанием в соседние органы, часто приводящим к расстройству функции этих органов. Кроме того, эти опухоли имеют высокую вероятность перехода в злокачественное состояние, для которого отсутствует лечение. Даже являясь доброкачественными, эти опухоли могут быть опасными для жизни и представлять большую клиническую проблему, так как их хирургическое лечение имеет ограниченную эффективность, а общепризнанные альтернативные способы лечения отсутствуют. Трехлетний ребенок с классическими признаками ΝΡ1, включая крупную плексиформную нейрофиброму тройничного нерва, был доставлен в детскую онкологическую клинику с угрожающим жизни сдавлением дыхательных путей. Основываясь на наших текущих исследованиях, проводимых на мышиной модели этого и сопутствующих ему заболеваний, лечащий врач, в качестве ограниченного испытания, назначил ребенку иматиниба мезилат в дозе 350 мг/м².

На фиг. 6 показана оценка эффективности иматиниба мезилата при лечении указанного пациента с плексиформной нейрофибромой. Границы опухоли показаны на обоих изображениях жирной темной линией. Сагиттальные МРТ-изображения головы и ротоглотки ΝΡ1 пациента с плексиформной нейрофибромой до (изображение 1) и через три месяца после лечения иматиниба мезилатом (изображение 2). МРТ сканирование до и после трехмесячного лечения показало заметное, приблизительно на 70%, уменьшение объема опухоли (фиг. 6). После шестимесячного лечения у пациента отсутствовали побочные эффекты, в течение шести месяцев после прекращения лечения у пациента не наблюдалось рецидива симптомов заболевания.

На фиг. 13А снимки в рядах А и В являются последовательными фронтальными Т1-взвешенными МРТ-изображениями, обработанными с помощью программы 8ΤΙΚ, до (ряд А) и после шестимесячного лечения иматиниба мезилатом, соответственно (ряд В). На этих снимках видны признаки сильного уменьшения размера опухоли после лечения, по сравнению с размерами до лечения.

На фиг. 13В в обеих сериях изображений обращает на себя внимание заметное сужение верхних дыхательных путей (показано стрелкой) со смещением вправо из-за опухоли до лечения иматиниба мезилатом (ряд С) по сравнению с состоянием после лечения иматиниба мезилатом (изображения в ряду Ό). Изображения, полученные после лечения иматиниба мезилатом, показывают, что имеет место заметное улучшение в состоянии дыхательных путей, заключающееся в их расширении и смещение назад к средней линии. Области опухоли указаны на соответствующих изображениях.

Эти результаты служат явным доказательством того, что фармацевтическое воздействие на организм человека химического соединения иматиниба мезилат привело к значительному уменьшению размера плексиформной нейрофибромы. Несмотря на то, что эти поразительные результаты отражают течение болезни только одного пациента, они согласуются с доклиническими исследованиями, проводимыми на мышиной модели.

Хотя примеры осуществления изобретения, содержащие принципы различных аспектов и вариантов осуществления, были раскрыты выше, настоящее изобретение не ограничивается раскрытыми вариантами осуществления. Напротив, данная заявка подана с целью защиты любых изменений, применений или усовершенствований информации, раскрытой с использованием общих принципов, описанных здесь. Кроме того, данная заявка подана с целью защиты таких отклонений от настоящего раскрытия, которые возникают в связи с известной или сложившейся практикой в той области техники, к которой относится данное изобретение, и которые находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения, а также их эквивалентов.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения плексиформной нейрофибромы, включающий введение пациенту от примерно 200 до примерно 500 мг соединения, соответствующего формуле (2) или ее фармацевтически приемлемой соли, в котором указанная доза этого соединения вводится пациенту по меньшей мере один раз в день.
2. Способ по п.1, в котором соединение является фармацевтически приемлемой солью соединения формулы (2).

- 13 022611
3. Способ по п.1, в котором соединение, соответствующее формуле (2), вводят в дозе от примерно 350 до примерно 450 мг и данная доза этого соединения вводится пациенту по меньшей мере один раз в день.
4. Способ по п.1, в котором соединение, соответствующее формуле (2), вводят в дозе примерно 400 мг и данная доза этого соединения вводится пациенту два раза в день.
5. Способ лечения плексиформной нейрофибромы, включающий введение пациенту от примерно 200 до примерно 500 мг соединения, соответствующего формуле (3) где данная доза этого соединения вводится пациенту по меньшей мере один раз в день.
6. Способ по п.5, в котором соединение, соответствующее формуле (3), вводят в дозе от примерно 350 до примерно 450 мг и данная доза этого соединения вводится пациенту по меньшей мере один раз в день.
7. Способ по п.5, в котором соединение, соответствующее формуле (3), вводят в дозе примерно 400 мг и данная доза этого соединения вводится пациенту два раза в день.