KR20160113081A

KR20160113081A - 폐섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20160113081A
Application number: KR1020160118024A
Authority: KR
Inventors: 이윤진; 이해준; 장준호; 최서현
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2016-09-13
Filing date: 2016-09-13
Publication date: 2016-09-28

Abstract

본 발명은 화학식 1의 화합물, 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 포함하는 폐섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

폐섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물{A pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary fibrosis}

본 발명은 폐섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

폐섬유화(pulmonary fibrosis)는 폐포벽에 결합조직, 특히 콜라겐이 과도하게 참착되면서 호흡곤란을 일으키는 질환이다. 폐섬유화에서는 실질 폐 조직이 딱딱하게 굳어가며, 말랑하고 탄력적이어야 할 폐 조직이 굳은 부위에서는 호흡을 위한 수축과 팽창이 자유롭지 못하기 때문에 호흡량이 줄게 되며, 병증이 진행될수록 상대적으로 남아있는 폐 용적이 줄면서 폐 기능이 감소되고 최악의 경우 호흡곤란 또는 호흡부전으로 인해 사망까지도 할 수 있는 위험한 병증이다. 폐섬유화는 세균, 바이러스, 오염된 공기, 담배 연기, 먼지, 곰팡이, 방사선 피폭 등 외부의 다양한 유해인자에 의한 염증이 발생원인이 되며, 염증은 자가면역반응 등으로 원인이 불분명한 경우도 많다.

방사선 피폭에 의한 폐섬유화는 사고에 의한 방사선 피폭에 의해 발생될 수도 있으나, 암에 대한 방사선 치료 시 만성 부작용으로서 발생되는 경우가 많으며, 이는 방사선 치료의 후완치율을 저하시키게 된다. 최근, 방사선 치료 기술의 발달에 따라 방사선 치료를 받은 암환자의 생존률이 높아지고 있으나, 방사선에 의한 부작용으로서 발생되는 폐섬유화는 암 환자의 삶의 질을 저하시키는 큰 문제로서 제기되고 있다. 최근 방사선치료 장비 및 소프트웨어의 발달, 그리고 방사선생물학적 개념의 진화에 힘입어　1~수회(5회 내외)의 방사선 치료로 정상조직을 보호하면서 암 병소만 효과적으로 제어할 수 있는 방사선치료 기법이 개발되고 있으나, 암 진행단계 및 암 생성부위 등에 따라 아직 제한적으로 이용되고 있다.

이러한 방사선 치료기술의 발달에도 불구하고, 방사선 치료 시 불가피하게 발생하는 폐섬유화 같은 폐부작용은 흉부방사선 치료환자에게 흔히 나타나는 부작용이다. 폐암, 유방암, 또는 호치킨림프종의 치료를 위해, 흉부에 방사선 치료를 받은 환자들의 10-15%에서 2-3 개월 후 방사선 폐렴이 발생하고 6 개월 후에는 만성 부작용인 섬유화 질환으로 발전하게 된다. 이와 같이 진행된 폐섬유화는 2년 정도의 기간이 경과 되어도 여전히 유지되어 폐 기능 저하 및 환자의 고통과 생활의 불편함을 수반하게 된다 (비특허문헌 1). 따라서, 이에 따른 폐섬유화를 억제하는 약물의 발굴과 개발이 시급하다.

폐 혈관 섬유화 예측마커로는 TGF-b(SMAD), a-SMA, endothelin-1등이 증가된다고 보고되고 있다(비특허문헌 2 및 3). 폐섬유화증의 치료는 면역억제제가 주로 사용되는데 스테로이드나 세포독성약물 등을 사용할 수 있는데 스테로이드가 우선 사용된다. 방사선 피폭에 의한 폐섬유화의 치료제로는 현재 스테로이드와 아자티오프린 또는 사이클로포스파미드의 병합요법을 사용하고 있다(비특허문헌 4). 하지만, 이와 같은 치료법이 환자의 생존율이나 삶의 질을 향상시킨다는 명확한 근거는 없으며 지금까지 여러가지 섬유화 억제제가 동물 실험 및 소규모의 환자들에게 시도됐지만 뚜렷한 효과가 입증된 것은 없다. 따라서, 방사선에 의한 폐섬유화를 비롯한 폐섬유화 억제제의 발굴 및 개발은 매우 절실한 상황이다.

Benjamin M et al., Chest.111(4):1061-1076. 1997 Xie H et.al., Exp Biol Med (Maywood):238(9):1062-8. 2013. Andrew L et al., FASEB:816-827. 2004 Ochoa et al., Journal of Medical Case Reports , 6:413.2012

본 발명의 목적은 폐섬유화의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있는 약물을 개발하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약물을 투여하는 것을 포함하는 폐섬유화의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은

하기 화학식 1의 화합물, 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 포함하는 폐섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 C_1-3 알킬이다.

본 발명의 다른 일 양상은 치료학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1의 화합물, 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는 폐섬유화의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물, 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물은 폐섬유화 시 나타나는 폐포벽에 침착되는 콜라겐의 증가 및 폐섬유화 세포와 관련된 단백질 팔로이딘, CA-9, p-SMAD2/3, a-SMA양의 증가를 감소시킬 뿐만 아니라, 폐섬유화 시 감소되는 정상적인 폐 혈관내피세포 특이적 발현 단백질인 VE-cadherin을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 일 양상에 따른 약학 조성물은 폐섬유화, 특히 방사선 피폭에 의해 유발된 폐섬유화의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 뿐만 아니라, 폐암, 유방암, 또는 호치킨림프종과 같은 암에 대한 방사선 치료 시 부작용으로 나타날 수 있는 폐섬유화에도 효과적으로 사용될 수 있으므로, 암에 대한 방사선 치료의 장애를 극복할 수 있어 바람직하다.

<도면의 기호에 대한 설명>
No. IR : 대조군 (방사선 미조사군)
IR : 방사선 조사군
IR + 2Me : 방사선 조사 및 2-메톡시에스트라디올 처리군
도 1은 인간 폐혈관내피세포에 2-메톡시에스트라디올을 처리 또는 미처리 후 방사선을 조사한 다음, 형광염색하여 혈관내피세포 모양 변화와 폐섬유화 관련 단백질의 증감을 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2a는 마우스 동물모델에서 2-메톡시에스트라디올을 처리 또는 미처리 후 폐 부위에 방사선을 조사한 다음, 폐의 혈관내피 부위의 콜라겐을 트라이크롬염색법으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 2b는 도 2a에서 트라이크롬 염색법으로 폐 섬유화 관련 분자인 콜라겐의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 2-메톡시에스트라디올 처리 또는 미처리 후 방사선을 조사한 다음, 폐혈관내피세포주의 섬유화 관련 단백질인 p-SMAD, Smad 2/3 및 αSMA (alpha smooth muscle actin)의 발현 변화를 웨스턴블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 4는 마우스 폐암 모델에서 폐에 2-메톡시에스트라디올을 처리 또는 미처리 후 폐 부위에 방사선을 조사한 다음, 폐혈관내피 부위를 트라이크롬염색법을 수행하여 콜라겐의 발현정도를 촬영한 사진 및 폐혈관내피 부위를 H&E 염색법을 수행하여, 혈관내피 부위의 조직의 형태변화를 촬영한 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.　 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.　 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다.

본 발명자들은 폐섬유화에 효과적으로 사용될 수 있는 약물의 개발을 위해 연구한 결과, 2-메톡시에스트라디올로 대표되는 하기 화학식 1의 화합물이, 폐섬유화 시 나타나는 폐포벽에 침착되는 콜라겐의 증가 및 폐섬유화 세포와 관련된 단백질 양의 증가를 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 폐섬유화 시 감소되는, 정상적인 폐혈관내피세포 특이적 발현 단백질인 VE-cadherin을 증가시키는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 일 양상은

하기 화학식 1의 화합물, 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 포함하는 폐섬유화의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 C_1-3 알킬이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 상기 R₁이 메틸인 2-메톡시에스트라디올이다.

상기 화학식 1의 화합물은 유기화학 분야에 공지되어 있는 통상의 지식을 이용하여 제조하거나 시판되는 화합물을 구입하여 사용할 수 있으며, 예를 들어　 Xin M et al., An efficient, practical synthesis of 2-methoxyestradiol. Steroids. 2010 Jan;75(1):53-6.; 또는 Hou Y et al., A Short, Economical Synthesis of 2-Methoxyestradiol, an Anticancer Agent in Clinical. J Org Chem. 2009 Aug 21;74(16):6362-4)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물은 유기화학분야에서 통상의 지식을 가진 자가 당해 기술분야에 공지된 지식을 이용하여 적절히 제조하거나 선택할 수 있다. 일 구체예에서 상기 용매화물은 수화물이다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 상기 화학식 1의 화합물이 유리산과 함께 염을 형성하는 산부가염으로 존재할 수 있다.　 상기 화학식 1의 화합물은 당해 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산부가염을 형성할 수 있다.　 상기 유리산으로는 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있고, 상기 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 상기 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartariac acid), 길초산, 발레르산, 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.　

상기 폐섬유화는 다양한 원인에 의해 발생되는 임의의 폐섬유화일 수 있으며, 본 발명의 일 구체예에서 상기 폐섬유화는 방사선 피폭에 의해 유발된 것이다. 또한, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 폐섬유화는 암에 대한 방사선 치료 시, 정상조직까지 피폭되어 발생된 방사선 치료 부작용이다. 상기 폐섬유화를 유발할 수 있는, 암에 대한 방사선 치료는 폐암, 유방암, 또는 호치킨림프종 등에 대한 방사선 치료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화학식 1의 화합물은 폐섬유화 시 나타나는 폐포벽에 침착되는 콜라겐의 증가 및 폐섬유화 세포와 관련된 단백질 팔로이딘, CA-9, p-SMAD2/3, a-SMA양의 증가를 감소시키고; 폐섬유화 시 감소되는, 정상적인 폐 혈관내피세포 특이적 발현 단백질인 VE-cadherin을 증가시키는 것으로 확인되었다.

방사선에 의한 폐섬유화 시, 폐혈관내피세포는 방사선에 의해 본래의 특성을 잃고 다른 형태의 세포 특성화, 특히 섬유화 세포와 관련되는 단백질의 양이 증가하는 현상이 관찰된다. 이것은 내피세포와 폐섬유화 관련 단백질의 양적 변화로 쉽게 구별이 가능하다. 본 발명자들은 실험 결과, 2-메톡시에스트라디올을 전 처리하였을 때, 인간 폐혈관내피세포(HPAEC)에서 방사선에 의해 감소하는 혈관내피세포 특이적 발현 단백질인 VE-cadherin의 발현이 미처리군에 비해 현저히 증가하고, 방사선에 의해 증가하는 폐섬유화 관련 단백질인 팔로이딘, CA-9, p-SMAD2/3, a-SMA의 활성화 및 양적인 증가가 미처리군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(실시예 1 및 3). 또한, 본 발명자들은 실제 실험동물(마우스)을 대상으로 폐 부위에 방사선 조사 시 대동맥 내벽에 콜라겐 증가와 같은 폐섬유화 증상이 나타나는 것을 확인하였으며, 2-메톡시에스트라디올 투여군에서는 미처리군에 비해 콜라겐 증가 정도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(실시예 2). 또한, 본 발명자들은 마우스 폐암모델을 대상으로 방사선 치료 후 폐암의 크기가 감소하지만, 대동맥 내벽에 콜라겐 증가와 같은 폐섬유화 증상이 나타나는 것을 확인하였으며, 2-메톡시에스트라디올 투여군에서는 미처리군에 비해 콜라겐 증가 정도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다 (실시예 4). 따라서, 이러한 실험 결과는 2-메톡시에스트라디올을 비롯한 화학식 1의 화합물이 방사선 피폭 또는 암에 대한 방사선 치료 시 나타나는 폐섬유화 증상을 현저히 감소시킬 수 있음을 보여준다.

상기 본 발명에 따른 폐섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 제형으로는 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 경구투여제 또는 주사제로 제제화될 수 있다. 상기 경구 투여용 제형은 예를 들어, 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제로 제조할 수 있다.

상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다.　

경구투여제로 제제화 시 상기 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다.　 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈; 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐; 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검; 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.

또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료; 천연과즙; 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소; 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분; 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.　

상기 본 발명에 따른 약학 조성물을 주사제로 제제화 시, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여 시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수도 있으며, 투여 시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다.

이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며, 이와 관련하여 the Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4thedition, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 20^th edition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2000); Remington's Pharmaceutical Sciences (19^th ed., 1995) 등을 참조할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학 조성물은 폐섬유화 예방 또는 치료 효과를 획득하기 위해, 성인을 기준으로 1 일 총 투여량이 화학식 1의 화합물로서 약 0.1-100 mg/kg 이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 폐섬유화의 종류, 원인, 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중 등에 따라 적절히 적절히 증감될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 치료학적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 화합물, 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 폐섬유화의 예방 또는 치료 방법을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 C_1-3 알킬이다.

상기 폐섬유화의 예방 또는 치료 방법의 상세는 상기 본 발명의 일 양상에 따른 폐섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.

상기 동물은 인간, 가축, 및 애완동물을 포함한 임의의 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위함인 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

(1) 사용세포주의 배양

인간 폐혈관내피세포 (HPAEC)는 Promocell 회사에서 구입하였으며, 혈관내피세포에 필요한 다양한 성장인자들이 포함되어있는 배지를 이용하였으며, 섭씨 37도, 5 % CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

(2) HPAEC에 대한 방사선 조사

HPAEC를 3.5, 6, 10 cm 배양접시에 깔아서 37℃ CO₂ 배양기에서 70-80% 정도 자랄 때까지 배양한 뒤, 시험군에 따라 2-메톡시에스트라디올을 선택적으로 전처리 한 후, 감마선(137Cs) (Atomic Energy of Canada, Ltd., Canada)을 3.81 Gy/분의 선량률로 조사하였다. 총 10 Gy를 조사하였다.

(3) 세포 면역형광염색법

HPAEC를 커버 슬라이드 위에 배양한 다음, 시험군에 따라 선택적으로 2-메톡시에스트라디올 전처리 후 방사선을 조사한 다음, 10 % 의 중성포르말린으로 하루 동안 고정시키고 염색 전에 PBS (Phosphate buffered saline) 로 세척하였다. 일차항체 반응 전에 2 % 소 혈청의 알부민 용액 (PBS에 녹임)으로 블로킹처리를 하고, 1:100 비율로 희석한 VE-cadherin, HIF-1a(Hypoxia-inducible factor 1-alpha), SMAD, p-SMAD2/3, αSMA 항체를 섭씨 4℃ 에서 16 시간동안 반응시켰다. PBS로 세척 후, 형광물질이 붙은 이차항체를 1:500 비율로 희석하여 섭씨 25℃ 에서 1시간 반응시켰다. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 형광물질을 이용하여 핵 염색을 하였다. PBS로 세척한 후, 글리세롤을 한 방울 떨어뜨려 슬라이드 유리에 염색된 세포를 부착한 후, 공초점현미경으로 관찰하였다.

(4) 전기영동과 면역반응을 이용한 단백질 분석

배양세포를 방사선 조사한 다음, 세포 내 단백질을 관찰하기 위해 150 mM sodium chloride, 40mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.1% NP-40로 이루어진 용액에 세포를 용해시킨 시료를 만들었다. 이 시료들을 SDS (sodium dodecyl sulfate) 가 포함된 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 웨스턴블랏을 수행하였다. 전기영동으로 분리된 단백질들은 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겨졌고, 그 후 면역 블롯팅 방법으로 해당 단백질들의 발현 양을 분석하였다.

(5) 생체조직에 대한 헤마톡실린( hematoxilin ) 및 에오진 (Eosin) 염색법 (H&E staining)

마우스의 조직은 10 % 의 중성포르말린 (neutral formalin)으로 하루 동안 고정시키고 파라핀섹션을 만들었다. 염색을 위해 조직 주변의 파라핀을 제거하기 위해 파라섹션을 자일렌(xylene), 95, 90, 및 70 % 에탄올 용액에 각각 5 분간 순서대로 반응시켰으며, 헤마톡실린 용액에 1 분 담궈 핵을 염색하고 흐르는 물에 10분 세척하였다. 그 다음 에오진 용액에 30 초 담궈 세포질을 염색하고 50, 70, 90, 및 95 % 에탄올 용액, 자일렌 용액에 순서대로 담근 후 마운팅 용액(mounting solution)을 한 방울 떨어뜨린 후 커버 슬라이드(cover slide)를 덮고 현미경 (Carl Zeiss Vision)으로 관찰하였다.

(6) 생체조직에 대한 트라이크롬 ( Trichrome ) 염색법

마우스의 조직은 10 % 의 중성포르말린(neutral formalin)으로 하루 동안 고정시키고 파라핀 섹션을 만들었다. 염색을 위해 조직 주변의 파라핀을 제거하기 위해 자일렌(xylene), 95, 90, 70 % 에탄올 용액에 5 분씩 순서대로 담갔다. 조직의 항원활성화를 위하여 0.1 M 농도의 시트르산 (pH 6.0) 용액에 조직을 담가 20 분 동안 끓였다.

그런 다음, Bouin's solution에 1분, Weigert's hematoxylin 10분, Phosphotunstic/phosphomolydic acid에 10분, 아닐린 블루(aniline blue)에 5분, 1% 아세트산에 1 분 동안 순차적으로 반응시킨 다음, 탈수과정을 진행 후 커버글라스로 봉입하였다. 봉입 후, 공초점현미경으로 관찰하였다.

실시예 1: 면역형광염색법을 이용한 방사선에 의한 세포 수준에서의 폐섬유 화 현상 억제 시험

방사선 10 Gy를 조사한 인간 폐혈관내피세포를 10% 포르말린으로 고정하였고 팔로이딘, CA-9, 및 VE-cadherin 항체를 반응시킨 후 형광물질이 연결된 2차 면역항체를 사용하였다. 현미경 관찰을 통해 CA9은 빨간색, 팔로이딘은 초록색, VE-cadherin은 흰색으로 보일 수 있게 하였다. 세포핵은 DAPI 형광물질을 이용하여 파란색으로 보이게 하였다. 2-메톡시에스트라디올 처리군은 인간 폐혈관내피세포주에 방사선 조사 전 10 ng/ml의 농도로 12 시간 전 처리 후 10 Gy의 세기로 방사선 조사하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 인간 폐혈관내피세포에 2-메톡시에스트라디올을 처리 또는 미처리 후 방사선을 조사한 다음, 형광염색하여 혈관내피세포 모양 변화와 폐섬유화 관련 단백질의 증감을 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 1에 따르면, VE-cadherin은 폐혈관내피세포주의 세포막에 존재하는 단백질이어서 방사선 미조사군인 대조군(No. IR)의 사진에서는 세포막에 주로 흰색이 보이는 것을 알 수 있다. 반면, 방사선 조사군(IR)에서는 세포막 주변의 흰색이 크게 감소한 것으로 나타났다. 팔로이딘 및 CA-9은 폐섬유화 관련 단백질로서, 대조군에서는 염색되지 않았지만, 방사선 조사군에서는 초록색과 빨간색으로 표시되는 각각의 단백질들을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 2-메톡시에스트라디올 처리군(IR+2Me)에서는 세포막 주변의 흰색이 방사선 조사군에 비해 현저히 증가하고, 팔로이딘 및 CA-9는 현저히 감소한 것으로 나타났다.

이러한 도 1의 결과로부터, 2-메톡시에스트라디올의 처리는 폐혈관내피세포주에 대한 방사선 조사에 의해 증가되는 폐섬유화 관련 증상을 현저히 감소시키고, 방사선 조사에 의한 세포막 손상을 현저히 저하시킨다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: 실험동물모델에서의 폐섬유화 현상 억제 시험

방사선 치료 후 발생되는 폐섬유화 증상에서 혈관내피세포의 폐섬유화 현상이 나타나는지를 관찰하기 위하여, C57BL/6 마우스의 폐 부위에 16 Gy의 방사선을 조사하였다. 마우스로부터 폐를 적출한 다음 폐조직의 대동맥 단면에 대해, 폐 혈관내피세포의 섬유화 시 나타나는 단백질인 콜라겐을 트라이크롬 염색법으로 확인하였다. 2-메톡시에스트라디올 처리군은 방사선 조사 1시간 전에 150 mg/kg의 양으로 복강내 투여하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2a는 마우스 동물모델에서 2-메톡시에스트라디올을 처리 또는 미처리 후 폐 부위에 방사선을 조사한 다음, 폐의 혈관내피 부위의 콜라겐을 트라이크롬염색법으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.

도 2b는 도 2a에서 폐 섬유화 관련 분자인 콜라겐의 발현 정도를 트라이크롬 염색법을 실시하여 통계적으로 나타낸 그래프이다. 또한 유의확률(**: P<0.01)을 통하여 방사선 조사로 인하여 섬유화 현상이 증가된 실험군과 증가되었던 섬유화 현상이 2-메톡시에스트라디올을 처리함에 따라 감소된 실험군 사이의 2-메톡시에스트라디올의 효과가 통계적 유의성이 있음을 나타내었다.

도 2에 따르면, 방사선을 조사하지 않은 대조군(사진 미도시)의 대동맥 내벽에서는 콜라겐 염색부위인 파란색 부위가 거의 관찰되지 않았으나, 방사선조사군(IR)의 대동맥 내벽에는 파란색이 상대적으로 현저히 증가한 것으로 관찰되었다. 따라서, 마우스의 폐 부위에 방사선 조사 후, 폐섬유화가 진행된 것이 확인되었다. 이에 반해, 2-메톡시에스트라디올 처리군(IR+2Me)에서는 폐섬유화 관련 단백질인 콜라겐의 파란색 부위가 방사선 조사군(IR)에 비해 현저히 감소되는 것으로 나타났다. 도 2a에서 파란색이 관찰되는 부위는 백색선의 사각형으로 표시하였다.

도 2의 결과로부터, 2-메톡시에스트라디올이 방사선에 의한 폐혈관내피세포의 섬유화 현상을 현저히 저해함을 알 수 있다.

실시예 3: 방사선에 의한 폐혈관내피세포주 ( HPAEC ) 의 폐섬유화 현상의 억제 시험

2-메톡시에스트라디올(0.5 uM, 1uM)의 농도에 따른 인간 폐혈관내피세포주의 폐섬유화 관련 단백질들의 발현양의 변화를 살펴보기 위해, 배양된 인간 폐혈관내피세포주에 2-메톡시에스트라디올을 0.5uM 또는 1uM의 농도로 12시간 전 처리 후 10 Gy의 세기로 방사선을 조사하였다. 그런 다음, p-SMAD, Smad 2/3 및 αSMA (alpha smooth muscle actin)의 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 단백질의 동량정량 확인을 위해 β-actin 항체로 웨스턴블랏팅을 실시하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 2-메톡시에스트라디올 처리 또는 미처리 후 방사선을 조사한 다음, 폐혈관내피세포주의 섬유화 관련 단백질인 p-SMAD, Smad 2/3 및 αSMA (alpha smooth muscle actin)의 발현 변화를 웨스턴블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.

도 3에 따르면, 2-메톡시에스트라디올을 0.5 uM 또는 1 uM을 처리하였을 때, 미처리군에 비해 모든 농도에서 폐섬유화 현상관련 단백질인 p-SMAD, Smad 2/3 및 αSMA 가 상대적으로 감소하며, 1 uM 에 특히 감소하는 것을 알 수 있다.

실시예 4: 방사선 조사 후 관찰된 혈관 내피 세포의 섬유화 현상 및 억제 확 인

미국의 Jackson laboratory에서 Trp53<tm1Brn>/J와 B6.129S4-Kras<tm4Tyj>/J를 구입하여 p53유전자와 ras 유전자의 변형을 갖는 마우스를 교배하여 얻고, 자발적 비소세포폐암 동물모델을 만들었다(M*, Dooley AL*, Jacks T. 2009. Conditional mouse lung tumor models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature protocols, 4(7): 1064-1072. PMCID: PMC2757265))

획득한 마우스 폐암 모델의 폐 부위에 16 Gy 세기의 방사선을 조사하였다. 마우스로부터 폐를 적출한 다음, 적출된 폐 기관을 상기 헤마톡실린 및 에오진 염색법(H&E staining), 또는 상기 트라이크롬염색법에 따라 염색한 후 혈관내피세포의 모양을 현미경을 통하여 관찰하였다. 이 염색법으로 조직을 관찰하면 핵은 파란색, 세포질은 분홍색으로 관찰된다. 2-메톡시에스트라디올 단독 투여군은 150mg/kg의 양을 복강으로 투여하였다. 2-메톡시에스트라디올 및 방사선 복합처리군은 방사선 조사 1시간 전에 150mg/kg의 양으로 복강내 투여하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 마우스 폐암 모델에서 폐에 2-메톡시에스트라디올을 처리 또는 미처리 후 폐 부위에 방사선을 조사한 다음, 폐혈관내피 부위를 트라이크롬염색법을 수행하여 콜라겐의 발현정도를 촬영한 사진 및 폐혈관내피 부위를 H&E 염색법을 수행하여, 혈관내피 부위의 조직의 형태변화를 촬영한 사진이다. 도 4에서 검정색 점선 부위는 폐 기관의 암 발생 부위를 표시한 것이고, 백색 사각형 부위는 폐 혈관 부위를 나타낸 것이다.

도 4에 따르면, 방사선을 조사하지 않은 대조군의 암 크기가 방사선 조사군(IR)에서는 감소됨을 확인할 수 있다. 또한, 방사선 조사군(IR)에서는 암 크기의 감소와 함께 폐섬유화 현상을 나타내는 혈관내피부근의 푸른색의 콜라겐 부위가 증가하였다. 이에 반해, 2-메톡시에스트라디올 처리군(IR+2Me)에서는 푸른색의 콜라겐 부위가 방사선 조사군(IR)에 비해 현저히 감소되는 것으로 나타났다.

도 4의 결과로부터, 2-메톡시에스트라디올이 폐암 치료를 위한 방사선 요법에서 부작용으로서 나타나는 폐혈관내피세포의 섬유화 현상을 현저히 저해함을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물, 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 포함하는 방사선 피폭에 의해 유발된 폐섬유화 예방용 약학 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 C_1-3 알킬이다.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 상기 R¹이 메틸인 2-메톡시에스트라디올인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폐섬유화는 방사선 치료에 의해 유발된 부작용인 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 방사선 치료는 폐암, 유방암, 또는 호치킨림프종에 대한 방사선 치료인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 경구투여제 또는 주사제로 제제화된 약학 조성물.
치료학적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 화합물, 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방사선 피폭에 의해 유발된 폐섬유화의 예방 방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 C_1-3 알킬이다.
제6항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 상기 R¹이 메틸인 2-메톡시에스트라디올인 방법.
제6항에 있어서, 상기 폐섬유화는 방사선 치료에 의해 유발된 부작용인 방법.
제8항에 있어서, 상기 방사선 치료는 폐암, 유방암, 또는 호치킨림프종에 대한 방사선 치료인 방법.