KR102106851B1 - 새로운 s6k1 억제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 또는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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KR102106851B1 KR1020180085009A KR20180085009A KR102106851B1 KR 102106851 B1 KR102106851 B1 KR 102106851B1 KR 1020180085009 A KR1020180085009 A KR 1020180085009A KR 20180085009 A KR20180085009 A KR 20180085009A KR 102106851 B1 KR102106851 B1 KR 102106851B1
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Abstract

본 발명은 새로운 S6K1 억제제인 로스마린 산 메틸 에스터(Rosmarinic acid methyl ester; RAME), 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 또는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 보다 구체적으로 mTOR(mammalian target of rapamycin) / S6K1(Ribosomal S6 kinase 1) 신호전달경로를 억제하여 자가포식(autophagy) 또는 사포사멸(apoptosis)을 유도하고, 시스플라틴(Cisplatin)에 대한 내성을 감소시키는 것을 확인하였는 바, 자궁경부암 또는 두경부암 개선 유도 및 자궁경부암 또는 두경부암 세포의 시스플라틴 내성을 극복할 수 있는 치료 전략을 제공할 수 있고, 특히 S6K1 신호전달체계억제 효과를 이용하므로, 분자적 작용 기전을 이용한 자궁경부암 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

새로운 S6K1 억제제를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 또는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{pharmaceutical composition for preventing or treating cervical cancer or head and neck cancer containing a novel S6K1 inhibitor as an active ingredient}
본 발명은 새로운 S6K1 억제제인 로스마린 산 메틸 에스터(Rosmarinic acid methyl ester; RAME), 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 또는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 보다 구체적으로 mTOR(mammalian target of rapamycin) / S6K1(Ribosomal S6 kinase 1) 신호전달경로를 억제하여 자가포식(autophagy) 또는 사포사멸(apoptosis)을 유도하고, 시스플라틴(Cisplatin)에 대한 내성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 또는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
자궁경부암은 인유두종 바이러스(HPV) 중에서도 고위험군 HPV의 감염에 의해 발생한다. 자궁경부암의 발생 원인은 다른 고형암들에 비해 비교적 명확히 밝혀져 있다. 약 12개의 고위험군 HPV 아형 (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) 중 하나 또는 그 이상의 고위험군 HPV 감염은 자궁경부암의 필수 조건이라고 알려져 있다. 인유두종 바이러스 (HPV) 감염은 대개 수개월 내에 자연 치유되며 2년 내에 90%의 감염이 사라지나, 12개월 이상 감염이 지속되면 악성 질환을 유발한다. 특히 고위험(high-risk) HPV의 경우 지속적 감염의 위험이 높으며 이 중 HPV 16, 18은 자궁경부암을 일으키는 대부분의 원인이다. 이러한 HPV 감염은 주로 성접촉에 의해 일어나며, 최근 성경험 연령이 빨라지면서 자궁경부암의 발병률이 급증하고 있다.
한편, 자궁경부암을 예방하는 HPV 백신은 기존에 개발되어 있다. Merck사가 판매하는 Gardasil과 GlaxoSmithKline사가 판매하는 서바릭스(Cervarix)의 경우 HPV 16형과 18형의 초기 감염을 막는다. 이러한 HPV 백신은 6개월에 걸쳐 3번의 주사를 맞으며 성관계 중 HPV에 노출된 경험이 없는 여성들에게 우선적으로 추천되고 있다. 세계보건기구(WHO)에서 자궁경부암 백신의 국가예방접종사업 도입을 권고하고 있으며, 현재 OECD 34개국 중 29개국이 자궁경부암 백신을 국가 예방접종사업에 도입하였다. 그러나 현실적으로 백신 접종율을 100%로 올리는 것은 불가능하며 체내에 항체가 형성되더라도 감염을 완전히 예방하지는 못한다. 따라서 치료제 개발을 통해 HPV 감염예방율과 더불어 치료율을 높여야 한다.
그러나, HPV 감염을 치료하는 약물에 대하여는 연구가 거의 진행되지 아니하고 있는 실정이었다. 따라서, 현재까지 자궁경부암 치료에는 수술을 통한 자궁적출, 방사선요법, 항암화학요법이 이용되고 있었다. 그러나, 현재 항암화학요법에 이용되는 약물인 시스플라틴(cisplatin), 파크리탁셀(paclitaxel) 등은 자궁경부암 세포뿐 아니라 환자의 정상 세포에까지 영향을 미치는 부작용을 일으키고, 내성이 발생하며 재발의 가능성이 매우 높은 실정이었다.
현재 바이오리더스 (BLS-PGA-C10, BLS-ILB-E710), 제넥신 (GX-17, GX-188E) 등의 제약사들에서 개발 중인 치료제는 주로 면역치료제로 HPV 단백질에 대한 면역반응을 지속시키는 원리이다. 그러나 면역치료제 또한 면역반응으로 인한 부작용이 예측된다. 한편 다양한 연구기관에서 RNAi, TALEN, CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 HPV를 유전자 발현을 억제하는 표적 치료제 개발을 위한 연구가 진행 중이나, 전달시스템 기술 확보에 난항을 겪고 있으며 임상 시험에는 돌입하지 못한 실정인 바, 보다 선택성이 높고 부작용이 적으며 전달시스템 기술이 확보된 자궁경부암 또는 두경부암 치료제에 대한 연구가 필요한 실정이었다.
한국등록특허공보 KR 10-0785397
본 발명자들은 새로운 S6K1 억제제인 로스마린 산 메틸 에스터(Rosmarinic acid methyl ester), 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 자궁경부암 또는 두경부암 세포의 자가포식(autophagy) 및 사멸(apotposis)를 유도하고 시스플라틴(Cisplatin) 내성을 감소시키는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 또는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112018072164902-pat00001
상기 화학식 1에서, R은 탄소수 1 내지 10의 선형 또는 분지형 알킬기이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 또는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018072164902-pat00002
상기 화학식 1에서, R은 탄소수 1 내지 10의 선형 또는 분지형 알킬기이다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 1에서 R은 메틸기일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 자궁경부암은 인유두종 바이러스(Human papilloma virus; HPV) 감염에 의해 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 mTOR(mammalian target of rapamycin) / S6K1(Ribosomal S6 kinase 1) 신호전달경로를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mTOR/ S6K1 신호전달경로를 억제하는 것은 S6K1과 mTOR의 상호작용을 차단하여 S6K1과 S6의 인산화를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 자가포식(autophagy) 또는 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 자가포식은 절단된 LC3-Ⅱ(microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ)의 증가, 자가소화포(Autophagosome)의 형성, 또는 ATG(Autophagy) 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ATG 유전자는 ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1), ATG5(Autophagy related 5), BECN1(Beclin-1), ATG7(Autophagy related 7), 및 ATG12(Autophagy related 12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포사멸은 세포사멸 관련 유전자 또는 DNA 복구 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포사멸 관련 유전자는 유전자는 Bax(BCL2 Associated X), Noxa(Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1), 및 Puma(P53 upregulated modulator of apoptosis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고, 상기 DNA 복구 유전자는 Gadd45α(Growth arerest and DNA-Damage-inducible gene 45 α )일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 시스플라틴(Cisplatin)과 병용투여하여 자가포식 또는 세포사멸을 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물과 시스플라틴의 병용투여는 시스플라틴 내성을 극복할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명자들은 새로운 S6K1 억제제인 로스마린 산 메틸 에스터(Rosmarinic acid methyl ester), 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 자궁경부암 또는 두경부암 세포의 자가포식(autophagy) 및 사멸(apotposis)를 유도하고 시스플라틴(Cisplatin) 내성을 감소시키는 효과를 확인하였는 바, 자궁경부암 또는 두경부암 개선 유도 및 자궁경부암 또는 두경부암 세포의 시스플라틴 내성을 극복할 수 있는 치료 전략을 제공할 수 있고, 특히 S6K1 신호전달체계억제 효과를 이용하므로, 분자적 작용 기전을 이용한 자궁경부암 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 로스마린 산 메틸 에스터(Rosmarinic acid methyl ester; RAME)의 구조를 나타낸 도이다.
도 1b는 자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 HeLa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리하였을 때 S6K1의 활성화와 하위 분자인 S6의 활성화가 억제된 것을 나타낸 도이다.
도 1c는 자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 SiHa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리하였을 때 S6K1의 활성화와 하위 분자인 S6의 활성화가 억제된 것을 나타낸 도이다.
도 2a는 자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 HeLa cell에 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3를 발현시키고 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 세포 자가포식(autophagy)의 마커인 LC3Ⅱ의 수준이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 2b는 자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 SiHa cell에 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3를 발현시키고 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 세포 자가포식(autophagy)의 마커인 LC3Ⅱ의 레벨이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 2c는 자궁경부암 세포주인 HeLa cell에 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3를 발현시키고 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 형광현미경으로 관찰했을 때, 자가소화포(autophagosome)가 생성된 것을 확인한 도이다.
도 2d는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3를 발현시키고 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 형광현미경으로 관찰했을 때, 자가소화포(autophagosome)가 생성된 것을 확인한 도이다.
도 2e는 자궁경부암 세포주인 HeLa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포 자가포식 마커 유전자들의 mRNA 수준이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 2f는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포 자가포식 마커 유전자들의 mRNA 수준이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 3a는 자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 HeLa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 세포사멸 (apoptosis)의 마커인 절단된(cleaved) PARP의 수준이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 3b는 자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 SiHa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 세포사멸 (apoptosis)의 마커인 절단된(cleaved) PARP의 수준이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 3c는 자궁경부암 세포주인 HeLa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포사멸 (apoptosis) 마커 유전자들의 mRNA 수준이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 3d는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 24시간 처리한 후 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포사멸(apoptosis) 마커 유전자들의 mRNA 수준이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 3e는 자궁경부암 세포주인 HeLa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 처리하고 24시간 및 48시간 후에 세포수를 측정한 결과, RAME 처리군에서 세포수가 현저히 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 3f는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 RAME를 40μM, 80μM로 처리하고 24시간 및 48시간 후에 세포수를 측정한 결과, RAME 처리군에서 세포수가 현저히 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 4a는 시스플라틴(Cisplatin) 내성을 보유하고 있는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3를 발현시키고 시스플라틴(5μM)과 RAME(80μM)를 24시간 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 세포 자가포식 (autophagy)의 마커인 LC3Ⅱ의 수준이 시스플라틴 단독처리에 비해 RAME와의 동시처리에 의해 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 4b는 시스플라틴 내성을 보유하고 있는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3를 발현시키고 시스플라틴(5μM)과 RAME (80μM)를 24시간 처리한 후 형광현미경으로 관찰했을 때, 자가소화포(autophagosome)의 생성이 시스플라틴 단독처리에 비해 RAME와의 동시처리에 의해 더욱 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 4c는 시스플라틴 내성을 보유하고 있는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 시스플라틴 (5μM)과 RAME (80μM)를 24시간 처리한 후 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포 자가포식 마커 유전자들의 mRNA 수준이 시스플라틴 단독처리에 비해 RAME와의 동시처리에 의해 더욱 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 4d는 시스플라틴 내성을 보유하고 있는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 시스플라틴(5μM)과 RAME (80μM)를 24시간 처리한 후 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포사멸 마커 유전자들의 mRNA 수준이 시스플라틴 단독처리에 비해 RAME와의 동시처리에 의해 더욱 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 4e는 시스플라틴 내성을 보유하고 있는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 시스플라틴 (5μM)과 RAME (80μM)를 24시간 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 세포사멸(apoptosis)의 마커인 절단된(cleaved) PARP의 수준이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 4f는 시스플라틴 내성을 보유하고 있는 자궁경부암 세포주인 SiHa cell에 시스플라틴 을 농도별로 처리하며 세포의 수를 측정하여 IC50를 구하였고, RAME를 동시 처리시 IC50 값이 감소하는 것을 확인한 도이다.
발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명자들은 본 발명자들은 새로운 S6K1 억제제인 로스마린 산 메틸 에스터(Rosmarinic acid methyl ester; RAME), 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 자궁경부암 또는 두경부암 세포의 자가포식(autophagy) 및 사멸(apotposis)를 유도하고 시스플라틴(Cisplatin) 내성을 감소시키는 효과를 확인하였는 바, 자궁경부암 또는 두경부암 개선 유도, 자궁경부암 또는 두경부암 세포의 시스플라틴 내성을 극복할 수 있는 치료 전략, 및 분자적 작용 기전을 이용한 자궁경부암 치료제 개발 가능성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에서는 자궁경부암에 RAME를 처리한 후 S6K1 신호전달체계에 미치는 영향을 관찰한 결과, RAME를 처리한 군에서 활성화된 S6K1(인산화된 S6K1) 및 S6K1의 하위 기질인 S6의 활성화 정도(인산화된 S6)가 감소함을 확인하였다(실시예 2).
본 발명의 다른 실시예에서는 자궁경부암에서 자가포식(autophagy)에 대한 RAME의 효과를 확인한 결과, RAME에 의해 세포 자가포식의 마커인 LC3Ⅱ의 수준이 증가하였고, 자가소화포(autophagosome) 형성시 나타나는 LC3Ⅱ 반점(punta)이 많이 생성되었으며, 농도의존적으로 자가포식 관련 유전자들의 mRNA 수준이 증가했음을 확인하였다(실시예 3).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 자궁경부암에서 세포사멸(apoptosis)에 대한 RAME의 효과를 확인한 결과, RAME에 의해 농도의존적으로 세포사멸 마커인 PARP의 절단부분(cleavage)이 증가하였고, 농도의존적으로 세포사멸 및 DNA 복구 관련 유전자들의 mRNA 수준이 증가하였으며, 농도의존적으로 실시예 1-2에 따른 HeLa 및 SiHa 세포의 수가 현저히 감소하는 것을 통해 세포사멸이 많이 일어났음을 확인하였다(실시예 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 자궁경부암의 약물내성을 극복하기 위해 시스플라틴(cisplatin) 내성을 가지는 자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 SiHa 세포에 RAME를 처리하며 그 효과를 관찰한 결과, RAME와 함께 처리하였을 시 S6 활성화가 억제되고 LC3Ⅱ의 수준이 증가하는 것을 확인하였고, 시스플라틴 처리에 의해 나타나는 LC3Ⅱ 반점(punta)이 RAME와의 동시처리에 의해 더욱 많이 생성되는 것을 확인하였으며, 시스플라틴과 RAME의 동시 처리에 의해 자가포식 관련 유전자들이 더욱 크게 증가하였고, 시스플라틴 단독 처리시에는 관찰되지 않던 세포사멸 마커인 절단된(cleaved) PARP가 RAME과의 동시처리에 의해 증가하는 것을 확인하였으며, SiHa 세포의 시스플라틴에 대한 IC50 값이 RAME에 의해 크게 감소하였음을 확인하였다(실시예 5).
두경부 암의 경우, 유두종 바이러스(HPV) 감염에 의해 주로 발생하며, mTOR/S6K1 신호전달경로를 거치는 바, 두경부 암의 경우에도 자궁경부암과 마찬가지로 mTOR/S6K1 신호전달경로가 분자적 작용 기전이 동일하므로, 이를 타겟으로 하는 본 발명을 통해 두경부 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 또는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112018072164902-pat00003
상기에서, R은 탄소수 1 내지 10의 선형 또는 분지형 알킬기일 수 있으며, 바람직하게는 메틸기이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 용어 "자궁경부암"은 자궁은 체부(corpus)와 경부(cervix)로 구성되는데, 질에 연결된 자궁경부에 발생하는 악성종양을 자궁경부암이라고 한다. 자궁경부암은 전 세계적으로 여성에게 발병하는 암 중 두 번째로 흔한 암이며, 자궁경부암의 약 80%는 아시아, 남미, 아프리카 등의 개발도상국에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 자궁경부암은 우리나라에서 발생하는 전체 암 중에서 4위를 차지하고 있으며, 중앙암등록본부의 보고(1999~2002년)에 의하면 연평균 전체 여성암 환자 46,476명 중 자궁경부암 환자가 4,394명으로 약 9.5%를 차지하고 있다. 발생원인으로는 성 접촉에 의한 인유두종 바이러스(HPV)가 주된 원인이며, 그밖에도 비위생적 환경, 빈약한 의료시설 무질서한 생활양식, 성교 대상자가 많은 경우, 16세 이전의 조기 성 경험자, 불결한 성생활, 흡연, 성병을 가지고 있거나 면역기능이 저하된 경우에 암이 발생하고, 바람직하게는 인유두종 바이러스 감염에 의해 발생되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 "두경부암"은 쇄골보다 상부에 발생하는 암 중에서 갑상샘을 제외한 암의 총칭. 상악암, 인두암, 설암, 후두암 등을 가리키며, 인두암은 다시 상인두암, 중인두암, 하인두암으로, 후두암은 성대암 등으로 나누어진다. 대부분의 조직형은 편평상피암이다. 흡연은 하인두암이나 후두암의 발생원인이 된다. 후두암은 목쉰소리, 설암은 혀의 응어리 등에 의해 처음 발견된다. 기능적으로 중요하고 섬세한 부위이기 때문에 수술 후 장애가 남는 경우가 많다. 인두암, 설암, 후두암 등은 방사선 중심의 치료가 좀더 양호하다는 주장이 많다. 수술과 병용하는 항암제투여는 효과를 인정받지 못하고 있다.
본 발명에 사용되는 용어 "알킬기"는 일반식은 CnH2n+1－로 표시되며 약호는 R이다. 알킬기라는 이름은 모체가 되는 포화탄화수소(알케인, alkane)의 어미를 -yl로 바꾸고 알킬 alkyl로 표현한다.　특정 탄소수를 지니는 알킬기의 구조는 동일한 탄소수의 알케인(alkane)과 동일하지만 단지 수소원자가 하나 결여되어 있다. 예를 들어, 메테인(methane)의 수소 1개를 제외한 CH3-는 메틸(methyl)이 된다. 이 밖에 에틸 C2H5-를 비롯하여 프로필 CH3CH2CH2-, 뷰틸 CH3CH2CH2CH2－ 등이 잘 알려져 있다. 메틸기·에틸기에는 이성질체 구조는 없지만, C3 이상의 것에는 노말 사슬구조와 가지가 있는 것이 있으며, 바람직하게는 메틸기이나 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 mTOR(mammalian target of rapamycin) / S6K1(Ribosomal S6 kinase 1) 신호전달경로를 억제하는 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 S6K1과 mTOR의 상호작용을 차단하여 S6K1과 S6의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 "mTOR"은 mammalian target of rapamycin의 약자인데, 포유류 등인 동물에서 세포 내 신호전달에 관여하는 단백질 인산화효소(세린; serine, 트레오닌　인산가수분해효소; threonine phosphatase)의 일종이며, FRAP, RAFT1이라고도 한다. 유기화합물인 라파마이신(rapamycin)의 세포 내 표적단백질인데, 포유동물에 존재하는 분자량이 29만인 거대한 세린-트레어닌인산화효소(serine-threonine kinase)이다. 진화적으로 고도로 보존되며, 일반적으로 TOR로 약칭하고 있다. mTOR은 랍터(raptor) 등과 같이 라파마이신(rapamycin)의 표적으로서 발견하기 때문에 mammalian target of rapamycin, 즉 포유류 라파마이신 표적단백질의 약자로서 명명한 것이다. 별명으로는 FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1(약칭 FRAP1)등이 있고, 사람인 경우는 이것을 코드 하는 유전자는 FRAP1 유전자로 명명하였다. 단백질복합체를 형성하며, 세포증식인자, 세포환경 내 아미노산 농도균형(balance), 에너지상태에 의해 제어되고 있다. 리포솜단백질 S6인산화효소 등을 인산화시킴으로써 단백질합성을 제어함과 동시에 세포 크기 조절를 하는 것으로 추정하고 있다. 또한 인슐린(insulin) 또는 다른 성장인자, 영양, 에너지상태、산화환원 상태 등, 세포 내외의 환경전보를 통합하여 전사, 번역 등을 통하여, 이들에 따른 세포의 크기, 분열, 생존 등인 조절에도 중심적인 역할을 하는 것으로 생각하고 있다.
본 발명에 사용되는 용어 "S6"는 S6K로 약기하기도 한다. 증식인자로 자극한 세포 혹은 제노푸스의 난에서 40S 리보솜의 S6소단위를 인산화하는 인산화효소로 정제하고 복제된 인산화효소이다. 분자량은 70kDa이고 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소(PI3-인산화효소)의 하류에 있는 p70S6K와, 분자량이 약 90kDa로 MAP 인산화효소의 하류에 있는S6인산화효소Ⅱ(=RSK, pp90rsk)의 2개가 알려져 있다. p70S6K에는 p70과 p85의 2개의 이어맞추기 변이체가 있어 전자는 세포질에, 후자는 핵에 의존한다. 여러 가지 증식인자수용체, G 단백질, 공역수용체, 인터류킨2수용체 등을 매개로 하여 활성을 나타내며 40S리보솜 S6소단위의 인산화, 전달인자CREM의 인산화 및 항S6K 항체의 현미주입법에 의한 G1기에서 S기로의 이행 저지 등에서 단백질합성과 세포증식의 분화, 증식에 깊이 관여하는 것으로 생각되지만 아직 그 명확한 기작은 알려져 있지 않다.
본 발명에 사용되는 용어 "S6K1"은 Ribosomal protein S6 kinase 1이며 p70S6 키나아제 (p70S6K, p70-S6K)로도 알려져 있으며, 인체에 RPS6KB1 유전자에 의해 암호화되는 효소(특히 단백질 키나아제)이다. 이것은 PI3 키나아제 경로에서 PIP3 및 포스포이노시티드 의존성 키나아제-1(phosphoinositide-dependent kinase-1)의 하류에서 작용하는 세린 / 트레오닌 키나아제이다. 표적 기질은 S6 리보솜 단백질이며, S6의 인산화는 리보솜에서 단백질 합성을 유도한다. 쓰레오닌 389(threonine 389)에서 p70S6K의 인산화는 mTOR에 의한 활성화의 특징으로 사용되었으며 다양한 상황에서의 자가포식(autophagy) 억제와 상관 관계가 있다.
상기 약학적 조성물은 자가포식(autophagy)을 유도하는 것을 특징으로 하고, 상기 자가포식은 절단된 LC3-Ⅱ(microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ)의 증가, 자가소화포(Autophagosome)의 형성, 또는 ATG(Autophagy) 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 "자가포식(autophagy)"은 자가포식(autophagy)은 그리스어로 스스로(auto), 먹는다(phagy)는 뜻의 단어가 합쳐진 말이다. 세포 내부의 물질이 세포 스스로에 의해 제거되기 때문에 붙여진 이름이다. 세포질의 노폐물, 퇴행성 단백질이나 수명이 다하거나 변성되어 기능이 저하된 세포소기관(organelle)들이 자가포식에 의해 제거된다. 제거 대상 단백질/세포소기관은 세포 안에서 이중 막(double membrane)으로 된 자가소화포(autophagosome)라고 불리는 소포(vesicle) 내에 격리되고, 이 소포는 다시 리소솜 (lysosome)과 결합하여 자가소화포(autophagolysosome)을 형성하고 그 안에서 리소솜 효소에 의해 분해가 일어난다. 이렇게 분해된 물질들은 세포의 생존에 필요한 에너지를 만들거나 새로운 세포소기관을 생성하는 데에 이용된다. 즉, 자가포식이란 세포 안에서 이루어지는 재활용 시스템이라고 할 수 있다. 재활용을 위한 지나친 세포 물질 제거는 결국 세포의 사멸을 초래할 수 있기 때문에 자가포식이 세포사멸을 유도할 수도 있다고 생각되어 제2형 세포예정사 (programmed cell death)로도 불리기도 한다. 실제로 대부분의 경우 자가 포식은 세포 자신에게 에너지와 대사물질을 제공해줄 수 있는 작용이라는 점에서 세포사멸과는 반대로 세포의 생존에 기여한다.
본 발명에 사용되는 용어 "자가소화포(autophagosome)"는 자가포식소체, 또는 초기자가탐식포(initial autophagic vacuole)라고도 한다. 거대자가소화작용(macroautophage) 과정에서 형성되는 소포이다. 거대자가소화작용에서는 먼저, 격리막(isolation membrane)이라고 부르는 평평한 주머니모양인 막 구조가 세포질에 나타나서 그것이 신장하면서 세포질의 일정공간을 포장함으로서 직경이 약 1㎛가량인 자가소화포를 형성한다. 세포에 침입한 병원성 세균 포획을 시도하는 경우는 예외적으로 통상의 10배 이상인 거대한 자가소화포가 형성된다. 격리막 자신이 주머니모양인 막구조이기 때문에 자가소화포는 2중막을 갖추게 된다. 리소좀(lysosome)이 자가소화포와 융합하여 자가포식용해소체(autolysosome)가 되면 리소좀의 가수분해효소 군에 의해 내막 및 밀폐된 세포기질(cytosol) 또는 세포소기관이 소화된다. 이 과정은 수 십분에 걸쳐 시행된다. 리소좀과 융합이전에는 엔도솜(endosome)이 성숙화하여, 리소좀과 인 융합도 가능한 것으로 생각하게 된다. 이 단계를 중간형자가탐식포(intermediated autophagic vacuole; Avid), 혹은 암피솜(amphisome)이라고 부르는 경우도 있다. 자가소화포 결합단백질로서 LC3/Atg8이 알려져 있어, 표지로 사용하고 있다. LC3/Atg8에는 가용성인 1형과 1형에 인지질이 공유한 Ⅱ형이 있어, 전자는 세포질에, 후자는 격리l막 및 자가소화포막에 국재한다. 또 결리막에는 Atg58를 포함한 단백질복합체가 결합하여 격디막 신장을 촉진하지만, 자가소화포가 완성되면 이탈한다.
본 발명에 사용되는 용어 "LC3-Ⅱ(microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ)"은 자가포식의 기질 선택 및 자가소화포 생물발생설(autophagosome biogenesis)에서 작동하는 자가포식 경로의 중심 단백질이다. LC3는 자가소화포 내에서 가장 널리 사용되는 마커이며 세포의 자식작용 활성화의 지표로 활용된다. 원래 LC3은 쥐의 두뇌에서 미세 소관 관련 단백질로 확인되었으나, LC3의 주요 기능은 세포질 성분의 대량 분해를 포함하는 과정인 자가포식(autophagy)에 있음이 밝혀졌다.
본 발명에 사용되는 용어 "ATG(Autophagy) 유전자"는 자가포식과 관련된 유전자로서 자식작용에 중추적인 역할을 담당한다. Atg8의 수준은 자가소화포 크기를 결정하는 반면, Atg9의 수준은 그 숫자에 비례하며 Atg7의 양은 자식작용 진폭(amplitude)와 관련된 것으로 알려져 있으며, 바람직하게는 ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1), ATG5(Autophagy related 5), BECN1(Beclin-1), ATG7(Autophagy related 7), 및 ATG12(Autophagy related 12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것을 특징으로 하고, 상기 세포사멸은 세포사멸 관련 유전자 또는 DNA 복구 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.
상기 세포사멸 관련 유전자는 유전자는 Bax(BCL2 Associated X), Noxa(Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1), 및 Puma(P53 upregulated modulator of apoptosis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고, 상기 DNA 복구 유전자는 Gadd45α(Growth arerest and DNA-Damage-inducible gene 45 α )인 것을 특징으로 하나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 약학적 조성물은 시스플라틴(Cisplatin)과 병용투여하여 자가포식 또는 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하고, 상기 약학적 조성물과 시스플라틴의 병용투여는 시스플라스틴 내성을 극복하는 것을 특징으로 하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 용어 "시스플라틴(Cisplatin)"는 시스-다이암민다이클로로백금(II)[Pt(NH3)2Cl2 로써 암 치료에 널리 사용되는 항암제 가운데 하나로, 백금 원자에 2개의 염소와 암모니아가 배위된 화합물이다. 특히, 고환 종양에 효과가 있으며, 주로 빈블라스틴과 함께 사용하기도 하는데 독소루비신과 함께 사용하면 난소, 방광, 머리, 목의 종양에도 효과가 있다. 이처럼 시스플라틴은 많은 암에 유효성을 띄는 띄어난 항암제이지만 불행히도 신장의 심각한 손상을 입히는 등의 여러 가지 부작용을 나타낸다. 시스플라틴은 암세포의 재생산 능력을 DNA의 배열 변화에 의하여 저지함으로써 항암 작용을 나타낸다. 즉, 암세포는 세포 분열을 억제하지 못하여 계속적으로 증식이 일어나는 특징을 보이는데, 시스플라틴이 세포분열을 억제하기 때문에 암세포의 증식을 막아 더 이상 암이 진행되지 못하게 막을 수 있다는 뜻이다. 어떤 경우에는 시스플라틴이 암세포의 증식을 저지하는 것뿐만 아니라 이미 존재하고 있는 암세포의 크기까지 감소시킨다. 그러나, 시스플라틴은 그 자체가 국제 암 연구소에 의하여 2A등급 발암물질로 분류된 바 있다. 화학적 내성의 기본이 되는 다요인 메커니즘(multifactorial mechanisms) 중 Akt / mTOR 경로의 과발현 또는 활성화는 p53 활성을 약화시킴으로써 시스플라틴 내성에 결정적으로 기여한다.
본 발명에 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 자궁경부암 또는 두경부암에 걸리기 전에 선제적으로 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 자궁경부암 또는 두경부암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 자궁경부암 또는 두경부암에 걸린 후에 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 자궁경부암 또는 두경부암 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
이에, 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소, 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 치료효과를 증진시키기 위하여, 바람직하게는 병용되는 약물과 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있고, 시스플라틴 내성을 극복하기 위해 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 시스플라틴(Cisplatin)을 병용투여하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사, 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험 준비 및 방법
1-1. 시약(Reagents)
항-p70 S6K1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SC-230), 항-포스포 (T389) p70 S6K1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA; # 9205), 항-S6 (세포 신호 전달 기술, # 2217), 항-포스포 (S235 / 236) S6 (세포 신호 전달 기술; # 4856), 항-GFP (Santa Cruz Biotechnology; SC-9996), 항-PARP-1 (Santa Cruz Biotechnology; SC-7150), 항-Akt1 / 2 / 3 (Santa Cruz Biotechnology; SC-8312), 항-포스포 (S473) Akt (Santa Cruz biotechnology; SC-7958), 항-액틴 (Millipore, Temecula, CA, mab1501) 항체를 사용하였다.
1-2. 세포 배양(Cell culture)
HeLa 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 얻었고, SiHa 세포는 최정혜(Kyung Hee University)교수님이 주셨다. 세포를 ATCC의 지침에 따라 배양하고, 37℃에서 95 % 공기 및 5 % CO2의 완전 가습 분위기하에 유지시켰다. 세포를 분석에 사용하기 전에 80-90 %의 confluency로 성장시켰다.
1-3. 천연 화합물 라이브러리의 가상 스크리닝(Virtual screening of natural product compound library)
도킹 스크리닝은 Windows 7의 Sybyl-X 2.1.1 패키지를 사용하여 수행되었다. PF-470871과 복합체를 이루는 S6K1 키나아제 도메인 (PDB ID : 3WE4)의 X 선 구조는 RCSB 단백질 데이터 뱅크(http : /www.rcsb.org/pdb/home/home.do)에서 다운로드되었다. 구조는 다음과 같이 정제되었다 : 모든 물 분자를 제거하고 리간드를 추출하고 기본 매개 변수를 사용하여 Sybyl의 단백질 준비 모듈로 단백질 구조를 최적화했다. Sybyl에 내장된 Surflex-Dock 모듈은 519 개의 천연 제품 화합물을 포함하는 사내 라이브러리의 도킹 스크리닝을 수행하는 데 사용되었다. 결합된 리간드 PF-470871의 X-레이 포즈는 도킹된 리간드가 정렬되는 수용체의 결합 구멍을 정의하는 프로토몰(protomol)을 생성하도록 지정되었다. 프로토몰은 임계값 매개 변수 0.50과 부풀음 매개 변수 0
Figure 112018072164902-pat00004
을 사용하여 생성되었다. 주요 설정은 화합물당 50 솔루션이었고 다른 매개 변수는 Surflex-Dock Geom 기본 설정을 허용했다. Surflex-Dock의 스코어링 기능은 -log Kd 단위로 표시되는 해리 상수 (Kd)를 평가하도록 훈련되었다. 최종 처리목록 화합물은 합의 점수 함수 CScore(합의 점수> 3), Surflex-Dock 총 점수(> 8) ,및 Lipinski의 규칙 5 필터를 결합한 바인딩을 평가 한 후에 선택되었다. 유사성-기반 가상 스크리닝은 Sybyl에 주입된 신축성 있는 리간드 중첩 알고리즘 FlexS를 사용하여 수행되었다. 주형 분자로는 PF-470871 (PDB ID : 3WE4)의 X선 포즈를 사용했다. 높은 유사성 점수는 시험된 분자와 주형 분자의 더 큰 유사성을 나타냈다(최대 점수는 10.0이다).
1-4. 면역블롯팅(Immunoblotting)
Pro-Prep(iNtRON Biotechnology, Korea)에서 세포 또는 조직을 용해시킨 후 13,000 rpm에서 18분간 원심분리하였다. 면역블로팅을 위해, 각 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE)에 제공 하였다. 세미-드라이 트랜스퍼 장치(semi-dry transfer apparatus) (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride; PVDF) 막으로 옮겼다. 막을 지시된 1차 항체와 함께 밤새 배양한 후, 1시간 동안 고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 2차 항체로 배양하였다(Abcam). 화학발광 시약을 사용하여 신호를 검출 하였다(AbClon, 한국).
1-5. 면역 형광법(Immunofluorescence)
GFP-LC3B 벡터의 이소성 발현을 위해, 실시예 1-2에 따른 HeLa 및 SiHa 세포를 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 형질 감염시켰다.
1-6. 정량 실시간 PCR (Quantitative real-time PCR; qPCR)
Easy-Blue 시약(iNtRON Biotechnology)을 사용하여 총 RNA를 추출했다. 이후 역전사 키트(Reverse Transcription kit, Promega, USA)를 사용하여 1 μg의 전체 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 정량 실시간 PCR은 CFX96TM 또는 Chromo4TM 실시간 PCR 검출기(Bio-Rad)가 있는 KAPATM SYBR FAST qPCR(KAPABIOSYSTEMS)을 사용하여 수행되었다. 상대 mRNA 수준은 각 반응에 대한 GAPDH mRNA 수준으로 표준화되었다. 사용된 qPCR 프라이머 서열은 다음과 같다 : GAPDH forward, 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'; GAPDH reverse, 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'; ULK1 forward, 5'-GGACACCATCAGGCTCTTCC-3'; ULK1 reverse, 5'-GAAGCC GAAGTCAGCGATCT-3'; ATG5 forward, 5'-AGCAACTCTGGATGGGATTG-3'; ATG5 reverse, 5'-CACTGCAGAGGTGTTTCCAA-3'; BECN1 forward, 5'-AACCTCAGCCGAAGACTGAA-3'; BECN1 reverse, 5'-GACGTTGAGCTGAGTGTCCA-3'; ATG7 forward, 5'-ACCCAGAAGAAGCTGAACGA-3'; ATG7 reverse, 5'-AGACAGAGGGCAGGATAGCA-3'; ATG12 forward, 5'-GGCAGTAGAGCGAACACGAA-3'; ATG12 reverse, 5'-GGGAAGGAGCAAAGGACTGA-3'; ATG13 forward, 5'-CCCAGGACAGAAAGGACCTG-3'; ATG13 reverse, 5'-AACCAATCTGAACCCGTTGG-3'; Bax forward, 5'-TCTACTTTGCCAGCAAACTGG-3'; Bax reverse, 5'-TGTCCAGCCCATGATGGTTCT-3'; Noxa forward, 5'-AGAGCTGGAAGTCGAGTGT-3'; Noxa reverse, 5'-GCACCTTCACATTCCTCTC-3'; Puma forward, 5'-GACCTCAACGCACAGTA-3'; Puma reverse, 5'-CTAATTGGGCTCCATCT-3'; Gadd45α forward, 5'-TGCGAGAACGACATCAACAT-3'; Gadd45α reverse, 5'-TCCCGGCAAAAACAAATAAG-3'; p21 forward, 5'-CACCGAGACACCACTGGAGG-3'; p21 reverse, 5'-GAGAAGATCAGCCGGCGTTT-3'; 14-3-3σ forward, 5'-TTTCCTCTCCAGACTGACAAACTGTT-3'; 14-3-3σ reverse, 5'-TAGAACTGAGCTGCAGCTGTAAA-3'.
1-7. 세포 생존율 분석(Cell viability assay)
실시예 1-2에 따른 HeLa 및 SiHa 세포를 각각 6 x 105 및 2 x 105 세포의 밀도로 6개의 웰 플레이트에 도말하였다. 세포를 24시간 및 48시간 동안 DMSO 또는 RAME (40, 80 μM)로 처리 한 후 세포를 세었다. 세포를 세기 위해, 혈구 계산기(haemocytometer)를 사용하여 트립신 EDTA를 사용하여 트립신 처리한 세포의 개수를 세었다.
1-8. 시험관 내 키나아제 분석(In vitro kinase assay)
재조합 S6K1(R & D systems, Minneapolis, MN, 896-KS) 및 GST-S6(Abnova, Taipei city, Taiwan, H00006194-P01)을 사용하였다. 100μM 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate; ATP) 및 키나아제 반응 완충액 [25mM Tris-HCl (pH 7.5), 5mM β-글리세롤포스페이트(β-glycerophosphate), 2mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol ; DTT), 0.1mM Na3VO4, 10mM MgCl2 존재 하에, 반응을 37℃에서 45분간 수행하였다. 5×Laemmli 로딩 완충액으로 반응을 멈추고 실시예 1-5에 따라 면역 블롯팅 분석을 수행하였다.
실시예 2. 로스마린 산 메틸 에스터(Rosmarinic acid methyl ester; RAME) 처리시 자궁경부암의 S6K1 신호전달체계에 미치는 영향
자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 HeLa 세포를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 포함하는 DMEM배지에서 배양하였다. 상기 배양된 HeLa 세포에 RAME를 40μM, 80μM로 각각 처리하였다. 24시간 후 전-준비시약(Pro-prep reagent)를 이용하여 세포의 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, RAME를 처리한 군에서 활성화된 S6K1(인산화된 S6K1) 및 S6K1의 하위 기질인 S6의 활성화 정도(인산화된 S6)가 감소하였다(도 1b). 또 다른 자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 SiHa 세포에 같은 실험을 수행하였을 때에도 RAME에 의해 농도의존적으로 활성화 S6K1과 활성화 S6의 수준이 감소하는 것을 확인하였다(도 1c).
실시예 3. 자궁경부암에서 자가포식 (autophagy)에 대한 RAME의 효과
자궁경부암 세포주인 실시예 1-2에 따른 HeLa 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent)를 사용하여 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3 벡터를 도입하였다. 6시간 후 RAME를 40μM, 80μM로 각각 처리하였고, 24시간 후 전-준비 시약(Pro-prep reagent)를 이용하여 세포의 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, RAME에 의해 세포 자가포식의 마커인 LC3Ⅱ의 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 2a). 실시예 1-2에 따른 SiHa 세포에서도 같은 실험을 통해 마찬가지의 결과를 확인할 수 있었다(도 2b).
또한, 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3 벡터를 도입한 HeLa 세포주에 RAME를 40μM, 80μM로 각각 처리하고 24시간 후에 형광현미경을 통해 관찰한 결과, RAME에 의해 자가소화포(autophagosome) 형성시 나타나는 LC3Ⅱ 반점(punta)이 많이 생성되는 것을 관찰하였다(도 2c). SiHa 세포에서도 같은 결과를 확인하였다(도 2d).
HeLa 세포주에 RAME를 40μM, 80μM로 각각 처리하고, 24시간 후에 Easy-blue reagent를 이용하여 RNA를 수득하고 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포자가포식 관련 유전자들(ULK1, ATG5, BECN1, ATG7, ATG12, ATG13)의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, RAME에 의해 농도의존적으로 자가포식 관련 유전자들의 mRNA 수준이 증가하였다(도 2e). SiHa 세포에서도 같은 결과를 얻었다(도 2f).
실시예 4. 자궁경부암에서 세포사멸(apoptosis)에 대한 RAME의 효과
실시예 1-2에 따른 HeLa 세포주에 RAME를 40μM, 80μM로 각각 처리하고, 24시간 후에 전-준비Pro-시약(prep reagent)를 이용하여 세포의 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, RAME에 의해 농도의존적으로 세포사멸 마커인 PARP의 절단(cleavage)이 증가하였다(도 3a). 실시예 1-2에 따른 SiHa 세포에서도 같은 결과를 관찰하였다(도 3b).
HeLa 세포주에 RAME를 40μM, 80μM로 각각 처리하고, 24시간 후에 Easy-blue reagent를 이용하여 RNA를 수득하고 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포사멸(Bax, Noxa, Puma), DNA 복구(Gadd45α), 세포주기억제(p21, 14-3-3σ) 관련 유전자들의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, RAME에 의해 농도의존적으로 세포사멸 및 DNA 복구 관련 유전자들의 mRNA 수준이 증가하였다(도 3c). SiHa 세포에서도 같은 결과를 얻었다(도 3d).
상기와 같이 HeLa 세포에 RAME를 40μM, 80μM로 각각 처리하고 24시간 및 48시간 후에 세포의 수를 측정한 결과, RAME에 의해 농도의존적으로 세포의 수가 현저히 감소하는 것을 통해 세포사멸이 많이 일어났음을 확인하였다(도 3e). SiHa 세포에서도 같은 결과를 확인할 수 있었다(도 3f).
실시예 5. 시스플라틴(Cisplatin) 내성을 가지는 자궁경부암 세포주인 SiHa 세포에 RAME를 처리시 자궁경부암의 시스플라틴 내성 극복
우선 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3 벡터를 도입한 실시예 1-2에 따른 SiHa 세포에 시스플라틴을 24시간동안 단독 처리하거나 RAME와 동시 처리한 후 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, 시스플라틴 단독 처리시에는 S6 활성화와 LC3Ⅱ의 레벨이 변하지 않았으나 RAME와 함께 처리하였을 시 S6 활성화가 억제되고 LC3Ⅱ의 레벨이 증가하는 것을 확인하였다(도 4a).
또한, 실시예 1-5에 따른 GFP-LC3 벡터를 도입한 실시예 1-2에 따른 SiHa 세포주에 시스플라틴을 24시간동안 단독 처리하거나 RAME와 동시처리한 후 형광현미경을 통해 관찰한 결과, 시스플라틴 처리에 의해 나타나는 LC3Ⅱ 반점(punta)이 RAME와의 동시처리에 의해 더욱 많이 생성되는 것을 확인하였다(도 4b).
다음으로, SiHa 세포에 24시간동안 시스플라틴을 단독 처리하거나 RAME와 동시처리한 후 Easy-blue reagent를 이용하여 RNA를 수득하고 실시예 1-6에 따른 RT-qPCR을 통해 세포자가포식 관련 유전자들(ULK1, ATG5, BECN1, ATG7, ATG12, ATG13)의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, 시스플라틴과 RAME의 동시 처리에 의해 자가포식 관련 유전자들이 더욱 크게 증가하였다(도 4a). 또한 이러한 시너지 효과는 세포사멸 및 DNA 복구 관련 유전자들의 mRNA 수준에서도 마찬가지로 나타났다(도 4d).
SiHa 세포에 24시간동안 시스플라틴을 단독 처리하거나 RAME와 동시처리한 후 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과, 시스플라틴 단독 처리시에는 관찰되지 않던 세포사멸 마커인 절단된(cleaved) PARP가 RAME과의 동시처리에 의해 증가하는 것을 확인하였다(도 4e).
마지막으로, SiHa 세포에 시스플라틴을 농도별로 24시간 동안 처리한 후 세포의 수를 세어 50%의 세포에 사멸을 일으키는 농도 (IC50) 값을 측정하였다. 그 결과, SiHa 세포의 시스플라틴에 대한 IC50 값이 RAME에 의해 크게 감소하였다(도 4f).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
    상기 약학적 조성물은 시스플라틴(Cisplatin)과 병용투여하여 자가포식 또는 세포사멸을 유도하며,
    상기 시스플라틴과 병용투여는 시스플라틴 내성을 극복하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112020040895990-pat00005

    상기 화학식 1에서, R은 탄소수 1 내지 10의 선형 또는 분지형 알킬기이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1에서 R은 메틸기인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자궁경부암은 인유두종 바이러스(Human papilloma virus; HPV) 감염에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 mTOR(mammalian target of rapamycin) / S6K1(Ribosomal S6 kinase 1) 신호전달경로를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 mTOR/ S6K1 신호전달경로를 억제하는 것은 S6K1과 mTOR의 상호작용을 차단하여 S6K1과 S6의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자가포식은 절단된 LC3-Ⅱ(microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ)의 증가, 자가소화포(Autophagosome)의 형성, 또는 ATG(Autophagy) 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 ATG 유전자는 ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1), ATG5(Autophagy related 5), BECN1(Beclin-1), ATG7(Autophagy related 7), 및 ATG12(Autophagy related 12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 세포사멸은 Bax(BCL2 Associated X), Noxa(Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1), 및 Puma(P53 upregulated modulator of apoptosis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포사멸 관련 유전자; 또는
    Gadd45α(Growth arerest and DNA-Damage-inducible gene 45 α)인 DNA 복구 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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