CN110623960A

CN110623960A - 一种小分子化合物在制备抑制Tau蛋白表达量的药物中的应用

Info

Publication number: CN110623960A
Application number: CN201910546206.7A
Authority: CN
Inventors: 曾长江; 赵�权; 刘明
Original assignee: Chengdu Shanquanjiang Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Shanquanjiang Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-06-22
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2039-06-21
Also published as: WO2020253179A1; CN110623960B

Abstract

本发明公开了一种小分子化合物在制备抑制Tau蛋白表达量的药物中的应用，2’，3’‑二醛腺苷(ADDA)或其体内代谢产物、互变异构体、立体异构体、药学上可接受的盐、水合物和/或溶剂合物在制备Tau蛋白抑制剂中的用途。本发明涉及治疗中枢神经系统疾病的药物。本发明首次阐明ADDA这种化合物在抑制人Tau蛋白表达中的作用，为治疗老年性痴呆(Alz‑heimer disease，AD)和帕金森氏症提供了候选药物。

Description

一种小分子化合物在制备抑制Tau蛋白表达量的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及一种小分子化合物在制备抑制Tau蛋白表达量的药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。【Burns A et al，BMJ.，338：467-471，2009；WHO，″Dementia Fact sheet N°362″，2015】主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能【National Institute on Aging，″About Alzheimer′s Disease：Symptoms″，2012】。随着人口的老龄化，AD的发病率逐年上升，严重危害老年人的身心健康和生活质量，给病人造成深重的痛苦，给家庭和社会带来沉重的负担，已成为严重的社会问题，引起各国政府和医学界的普遍关注。2018年3月20日，美国阿兹海默症协会发布今年数据，美国阿兹海默症人口持续上升，照护费每人花逾42万美元【美国阿兹海默症人口持续上升，照护费每人花逾42万美元_绿政公署_澎...澎湃新闻2018-03-22】。

AD的病因和发病机制复杂，目前并不十分清楚。通常认为与基因突变、Aβ的沉积、胆碱能缺陷、Tau蛋白过度磷酸化、线粒体缺陷、神经细胞凋亡、氧化应激、自由基损伤及感染、中毒、脑外伤和低血糖等有关。AD的危险因素包括年龄、性别(女性高于男性)、受教育程度、脑外伤，AD也与遗传、甲状腺功能减退、接触重金属、有毒化学物质和有机溶剂等有关，其他如脑血管病，糖尿病以及老年期首发的抑郁症也是AD的危险因素【Querfurth HW，LaFerla FM，NEJM，362(4)：329-44，2010)】。

1993年FDA批准抑制乙酰胆碱酯酶的tacrine上市，使其成为治疗阿尔兹海默病的第一个药物。然而由于该药物副作用过大，已于2012年5月撤出美国市场【tacrine(Discon-tinued)-Cognex″.Medscape Reference.WebMD，Retrieved 8 October 2013】。阿尔茨海默病的疾病进展过程很缓慢，至今为止针对疾病的发病机制主要存在四种假说：淀粉蛋白级联假说、APOE4、Tau蛋白和ASC(PYCARD)蛋白假说。1992年，英国伦敦大学学院的JohnHardy针对疾病的起源提出了一个大胆的假说：淀粉蛋白级联假说(Amyloid cascade hypoth-esis)。Hardy认为该疾病起始于脑内beta淀粉蛋白的形成，而tangles、神经元细胞死亡、记忆力衰退以及痴呆症都是淀粉蛋白对脑内破坏引起的二级事件。由神经元产生的淀粉蛋白片段在细胞外不断累积能够导致斑块的形成。随着时间的推移斑块体积会逐渐增大，并逐渐开始影响正常神经元细胞间的通讯，从而影响神经元的正常功能，引发神经元内缠结的形成，最终导致神经元的死亡。【Hardy JA，Higgins GA，Science，256(5054)：184-5，1992】.该理论有众多证据支持，比如在1995年科学家证实，携带人APP突变基因的小鼠脑内会产生淀粉蛋白斑块以及认知功能也会下降。淀粉蛋白级联假说不仅对疾病的进程提出了相对合理的假设，更重要的是它为新药研发提供了切实可行的靶点。【Octave JN，Rev Neurosci.，6(4)：287-316，1995】

但实际上并不是所有人都认同淀粉蛋白假说。Allen Roses与同事发现APOE4携带者的早发型和迟发型阿尔茨海默病风险均明显升高，携带一个基因拷贝会使风险提高4倍，而携带两个基因拷贝将会使风险提高12倍。APOE4会影响脑内血糖的正常摄取，使脑内处于能量缺乏的状态。相比APOE2和APOE3携带者，APOE4携带者血糖代谢速率更低。大脑由于处于长期的能量缺乏状态会导致神经元功能受损，进而导致斑块和缠结的形成，最终导致神经元凋亡。由于神经元很难再生，所以该过程并不可逆，神经元只能逐个死亡。APOE4理论相比淀粉蛋白理论对疾病的起源有更加清楚的解释。但很遗憾的是，相比淀粉蛋白假说很难针对APOE4假说来研发新药。【Roses A，et al.，Alzheimer’s&Dementia，12(6)：687-694，2016】

以上两种理论都存在很多缺陷，也就为Tau蛋白理论的提出提供了可能。Tau蛋白(微管相关蛋白，Tubulin associated unit)的一个主要功能是维持轴突微管的稳定性。Tau蛋白的过度磷酸化会导致神经元内缠结的形成，致使微管脱落并影响神经递质以及其他物质在神经元内的运输，并逐渐导致突触退化，轴突消失，最后只剩下神经元残存的细胞体。Tau蛋白理论的独特之处在于它并没有阐述发病的诱因。无论引发疾病的是淀粉蛋白还是APOE4，亦或是其他因素，他们都会使神经元走向一个共同的命运：Tau蛋白的异常磷酸化以及突触退化和神经元的死亡。虽然Tau蛋白假说也能为新药开发提供靶点，但Tau蛋白假说的一个很大缺陷是目前支撑该假说的基因证据很少。【Mudher M，Lovestone S，Trendsin Neurosciences，25：22-6，2002.】

但由于淀粉蛋白假说的锋芒太盛，很长一段时间内Tau蛋白假说并没有得到像淀粉蛋白假说一样的关注度。但当淀粉蛋白假说遭遇重重阻碍之时，一部分淀粉蛋白假说的支持者开始转向Tau假说。目前为止以Tau蛋白假说为支撑的疗法主要有以下几个方向：靶向tau蛋白相关的激酶/磷酸酶，或主动与被动免疫，通过抗Tau蛋白聚集抑制剂等策略来减少Tau蛋白的磷酸化或者抑制Tau蛋白聚集。

2002年专注于Tau蛋白聚集抑制研究的TauRx Therapeutics公司成立，并于2004年将首个药物亚甲蓝推进临床试验。2008年，TauRx在一次会议中公布了II期临床试验结果，但该结果却引起了很大争议：数据显示该药物的两个低剂量方案对于中度患者有效(非早期患者)，而且临床设计方案也遭受严重质疑，会后该公司也未发表临床试验的完整数据。在2016年，该公司公布其两个临床试验失败。Tau蛋白聚集抑制没能取得好的进展。

Tau蛋白磷酸化与去磷酸化过程失衡导致的磷酸化状态异常，在神经纤维缠结的形成过程中可能具有非常重要的作用，能够导致Tau蛋白与微管脱离，进而相互聚集。而磷酸化状态异常则有可能是由于激酶活性升高或者是磷酸酶活性降低导致的。GSK-3对于生理和病理状态下的Tau蛋白磷酸化过程具有关键作用。但GSK-3抑制剂的开发却异常困难，难以获得选择性高的化合物，由于GSK-3底物太多也难以控制毒副作用。

尽管如此，还是有一些抑制剂进入了临床研究。Noscira公司的tideglusib其临床IIa期实验显示安全性良好，但接下来的IIb期试验却未达到临床试验终点。而磷酸酶(如PP2A)激动剂的开发虽然理论上具有弥补激酶抑制剂研发失败的可能性，但目前并没有药物进入临床试验。

由于微管与Tau蛋白相互脱离会导致微管功能异常，致使细胞体与轴突的物质转运过程受阻并最终导致突触功能受损，所以微管稳定剂的开发也成了潜在的治疗该疾病的药物。微管稳定剂是肿瘤化疗中的常用药。与GSK-3抑制剂类似，该类药物的毒副作用也比较难控制。2012年百时美施贵宝(BMS)公司开始临床I期试验，评价微管稳定剂epothiloneD的安全性，但在该临床试验结束后BMS便终止了该适应症的开发。

另一种理论是利用免疫系统来清除病原性Tau蛋白。Tau蛋白的免疫疗法也分为主动免疫和被动免疫两种。主动免疫是用抗原激活人体的免疫细胞产生对抗某一类型的病原性Tau蛋白的抗体，而被动免疫则是直接使用单克隆抗体。目前为止，主动免疫疗法进入临床的有两款疫苗：Axon Neuroscience SE的AADvac-1，以及Janssen的ACI-35。ACI-35正在进行Ib期临床试验，而AADvac-1则将于2019年完成有效性验证的临床试验。被动免疫疗法中艾伯维的单抗ABBV-8E12正在进行II期临床试验。默沙东在Verubecestat失败之后于日本帝人株式会社(Teijin)购买了一款Tau单抗的权益。百健从BMS公司购买的BMS-986168也正处于II期临床。

到2017年止，5大AD防治的临床药物有：1)the API Autosomal-Dominant AD(ADAD)，2)API APOE4 Trial，3)the DIAN-Trials Unit(DIAN-TU)，4)the Anti-AmyloidTreatment in Asymptomatic Alzheimer’s Disease(A4)trial，和5)the TOMMORROWTrial.这些临床试验药物都试图从淀粉蛋白致病理论上阻止疾病的扩展和恶化。然而这些药物的疗效并不好，虽然能够在一定程度上改善患者的记忆及认知功能，但却不能延缓疾病进程【Hsu D and Marshall G，Curr Alzheimer Res.14(4)：426-440，2017】。

帕金森氏症(Parkinson′s disease，简称PD)是另一种慢性中枢神经系統退化疾病，主要影响运动神经系統。此病以英国医生詹姆士·帕金森为名，他在1817年发表了《论震颤性麻痹》(An Essay on the Shaking Palsy)一书，书中首次详述了帕金森氏症的相关症狀。帕金森氏症的症状通常隨時间缓慢出現，早期最明显的症狀為颤抖、肢体僵硬、运动功能減退和步态异常，也可能有认知和行为问題【Parkinson′s Disease InformationPage.NINDS.2016-06-30】。失智症在病情严重的患者中相当常見，超过三分之一的病例也会发生重性抑郁障碍和焦虑症。其它可能伴隨的症状包括知觉、睡眠、情绪问题【ShulmanJM et al，Annual Review of Pathology，6：193-222，2011】。

帕金森氏症(Parkinson′s disease，PD)一般指原发性的帕金森症候群，同時也是最常见的一种帕金森症候群。帕金森氏症通常归类为运动性疾病，但它也会引起其他非运动性的症状，例如感觉障碍、认知困难和睡眠障碍【Samii A et al，Lancet，363(9423)：1783-1193，2004】。近年來发现数个基因与帕金森氏症有直接关联，因此一般也將和帕金森氏症病程类似的遗传性帕金森症候群纳入帕金森氏症，并用“家族性帕金森氏症”和“偶发性帕金森氏症”来区别遗传性和真正病因不明的帕金森症候群【Davie CA，Br.Med.Bull，86(1)：109-27，2008】。帕金森附加症候群则是在原发性帕金森氏症的基础外还有其他附加症状，包括多重系统退化、进行性上眼神经核麻痺、大脑皮质基底核退化和路易氏体型失智【Nuytemans K et al，Human Mutation，31(7)：763-780，2010】。典型的帕金森氏症主要靠症状诊断，神经成像也能協助排除其他疾病的可能性【Sveinbjornsdottir S，Journal ofNeurochemistry，139：318-324，2016】。

2015年，全球约有620万人患有帕金森氏症，并造成11.7万人死亡【GBD，Lancet，388(10053)：1459-1544，2016】。帕金森氏症通常发生在60岁以上的老人，約有1％的老人罹患该病；男性较女性容易得到帕金森氏症。若患者在小于50岁发病，则称为早发性帕金森氏症。帕金森氏症确症后的预期余命约为7-14年【Sveinbjornsdottir S，Journal ofNeurochemistry，139：318-324，2016】。

帕金森氏症的成因目前还不清楚，但普遍认为和遗传与环境因子相关。家族中有帕金森氏症患者的人较可能得到此病，暴露于特定农药、曾有头部外伤者风险也比较高。帕金森氏症带來的主要运动症狀合称为帕金森症候群。帕金森氏症主要的运动症状导因于中脑黑质细胞死亡，使患者相关脑区的多巴胺不足。细胞死亡的原因目前了解很少，但已知和神经元蛋白质组成路易氏体的过程有关【Kalia LV；Lang AE，Lancet，386(9996)：896-912，2015】。

就病理生理学而言，由于α-突触核蛋白以路易氏体的形式堆积，帕金森氏症被视为一种突触核蛋白病变，这和阿茲海默症当中Tau蛋白堆积形成的神经纤维纠缠不同。然而，突触核蛋白病和Tau蛋白病在临床上有重叠的地方，严重的帕金森氏症患者往往也会出現典型的阿茲海默症症状(失智)，他们的脑内也常会发现神经纤维纠缠【Galpern WR，LangAE，Annals of Neurology，59(3)：449-458，2006】。

最新的研究表明，Tau是神经退行性疾病的重要参与者，并且与帕金森氏症有关。脑脊液(CSF)中总Tau(t-Tau)浓度以及脑脊液/血清白蛋白比率在帕金森症的H和Y阶段逐渐增加。同时，PD患者CSF中t-Tau水平与脑脊液/血清白蛋白比值和运动功能障碍之间呈正相关。在认知完整的帕金森氏症患者中进行的研究证实了CSF中Tau蛋白水平和血脑屏障(BBB)损伤以及PD病理学进展的逐渐增加。由于血脑屏障确保从脑中清除Tau蛋白，整个疾病进展过程中血脑屏障的功能障碍可能导致PD中CSF中Tau蛋白水平的同时增加【LiguoriC et al，CNS Neurol Disord Drug Targets，16(3)：339-345，2017】。

帕金森氏症目前无法治愈。初期症状常用L-多巴治疗，当L-多巴效果降低后则配合使用多巴胺激动剂。隨著病程恶化，神经元将持续流失，因此必須隨之增加药物剂量，但药量刚增加時又会产生以不自主抽动为首的异动症副作用。对于药物无效的严重患者，可以考虑神经外科的脑深层刺激手术，这种手术利用微电极放电以减少运动症狀。至于非运动相关症狀的帕金森氏症(如以睡眠干扰或情绪问題为主的患者)治疗效果通常较差【TheNational Collaborating Centre for Chronic Conditions，Symptomaticpharmacological therapy in Parkinson′s disease.Parkinson′s Disease.London：Royal College of Physicians.2006：59-100.：Kalia LV，Lang AE，Lancet，386(9996)：896-912，2015.】。

由此可见，目前对于老年性痴呆和帕金森氏症并无特别有效的治疗药物，而寻找新的、可以顺利通过血脑屏障的Tau蛋白表达量抑制剂将是一条出路。

组蛋白翻译后修饰(PTM)调节脊椎动物基因组的组织和功能，并且是基因活性表观遗传调控的关键参与者【Di Lorenzo A，Bedford MT，FEBS Letters，585(13)：2024-2031，2011】。到目前为止，大多数PTM的修饰酶已经通过分离，利用体外修饰或化学抑制或沉默/过表达的方法研究过。几个证据表明，翻译后修饰(PTMs)调节了Tau的功能，包括：其亚细胞定位，清除，聚集，毒性和病理蔓延【Coughlin D，Irwin D，Current Neurology andNeuroscience Reports，17(9)：72，2017；Hanger DP，et a1.，Trends in MolecularMedicine，15(3)：112-119，2009】。最近，半合成策略的进步允许特定站点引入单种或多种不同的PTM成重组体蛋白质，成功证明了K乙酰化，Y和S磷酸化Tau的微管结合结构域。这样的战略为调查其他类型的PTM在Tau或其他严重翻译后修饰蛋白质提供了新的机会【Haj-Yahya M，Lashuel HA，Journal of the American Chemical Society 140：6611-6621，2018】。

精氨酸的单和二甲基化由三种类型的蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)催化，哺乳动物中报告了11个PRMT：PRMT1，3，4，6和8属于I型，PRMT5和9属于II型，PRMT7是III型甲基转移酶。PRMT通过使用S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)来催化精氨酸甲基化，形成单甲基精氨酸(MMA)和非对称(u-NG，u-NG-dimethyl-arginine or ADMA)(I型)或对称(u-NG，u-N0G-dimethylarginine or SDMA)(II型)【Bedford MT，Clarke SG，Molecular Cell，33：1-13，2009】。PRMT通过转录激活，抑制及其与染色质屏障元件的相互作用参与染色质结构和功能的调节【Aravind L，et al.，Progress in Molecular Biology and TranslationalScience，101：105-76，2011】。PRMT还参与前mRNA剪接，核/细胞质穿梭，细胞周期和DNA修复【Bezzi M，et al.，Genes&Development，27：1903-1916，2013】。

PRMT8是I型PRMT，主要存在于脑的神经元区域，可以非对称双甲基化组蛋白H4R3形成H4R3me2a【Scaramuzzino C，PLoS One，8：e61576，2013】。该酶的亚细胞定位在质膜内，因为它能利用其N-末端豆蔻酰化基序与膜脂质相互作用。N末端区域还含有两个富含脯氨酸的基序，使其能够与几个SH3结构域以及PRMT2相互作用。该酶的酶活性存在于其N-末端的构象中，并随着该结构域的丧失其酶活性增加【SayeghJ，et al.，Journal ofBiological Chemistry，282：36444-36453，2007】。

ADDA(adenosine-2’，3’-dialdehyde)，2’，3’-二醛腺苷，其C₁₀H₁₁N₅O₄分子量265.23，结构式为：

目前尚未有将ADDA用于制备Tau蛋白的抑制物，以及在制备治疗老年痴呆和帕金森氏症的药物中的应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供ADDA用于制备Tau蛋白的抑制物，以及在制备治疗老年痴呆和帕金森氏症的药物中的新用途。

本发明的技术方案包括：

式(I)所示化合物或其体内代谢产物、互变异构体、立体异构体、药学上可接受的盐、水合物和/或溶剂合物在制备Tau蛋白抑制剂中的用途；式(I)：

根据前述的用途，所述Tau蛋白抑制剂是抑制Tau蛋白表达的药物。

根据前述的用途，所述Tau蛋白抑制剂是抑制组蛋白H4第三位精氨酸残基非对称性双甲基化的药物。

根据前述的用途，所述Tau蛋白抑制剂是抑制脑部Aβ老年斑形成的药物。

根据前述的用途，所述药物是治疗中枢神经系统疾病的药物。

根据前述的用途，所述药物是治疗中枢神经系统慢性疾病的药物。

根据前述的用途，所述药物是治疗老年痴呆和帕金森氏症的药物。

一种治疗中枢神经系统疾病的药物，它是以式(I)所示化合物或其体内代谢产物、互变异构体、立体异构体、药学上可接受的盐、水合物和/或溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂；式(I)：

根据前述的药物，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。

根据前述的药物，所述制剂是注射制剂、口服制剂。

根据前述的药物，所述注射制剂为粉针剂。

术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。

所述药学上可接受的辅料，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明的ADDA可有效抑制Tau蛋白的表达，从而理论上可用于治疗Tau蛋白引起的各种中枢神经系统疾病，尤其是神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森氏症。

2)本发明的ADDA可抑制组蛋白H4第三位精氨酸残基非对称性双甲基化。

3)本发明的ADDA具有穿透血脑屏障的能力，适于多种给药方式。

4)本发明的ADDA可以抑制脑部Aβ老年斑的形成，从而理论上可用于治疗AD；同时，本发明的实验也证明了ADDA可以用于治疗AD。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：不同浓度ADDA对人星形胶质细胞中Tau基因的转录影响的统计图。

图2：不同浓度ADDA处理下人星形胶质细胞中Tau蛋白的Westernblot检测图。

图3：PRMT8表达干扰后对组蛋白修饰H4R3me2a水平的影响图。

图4：PRMT8与Tau基因的表达检测图。

图5：眼眶血(血清样品0～4h)和脑组织(脑组织0～4h)中ADDA含量的HPLC检测图。

图6：ADDA对小鼠大脑皮层原代神经元细胞中Tau mRNA的表达量影响的统计图。

图7：ADDA处理下小鼠大脑皮层原代神经元细胞Tau蛋白免疫印迹检测图。

图8：ADDA处理下小鼠大脑皮层原代神经元细胞中H4R3me2a免疫印迹图。

图9：水迷宫实验中AD模型小鼠的逃避潜伏期和逃避路径图。

图10：AD模型小鼠脑部区域的老年斑形成检测图。

具体实施方式

材料：ADDA(adenosine-2’，3’-dialdehyde，2’，3’-二醛腺苷)购自美国Sigma公司。

实施例1本发明抗老年痴呆和帕金森氏症药物的制备

取ADDA(adenosine-2’，3’-dialdehyde，2’，3’-二醛腺苷)，加上药物上可接受的辅料，制成药物，即可。

以下用试验例的方式来验证本发明的有益效果：

试验例1.Real-time PCR检测ADDA对Tau mRNA表达的影响

利用人星形胶质细胞SVG p12作为研究对象，使用不同ADDA浓度处理细胞，探讨不同ADDA对SVG p12中Tau mRNA表达的影响。如图1所示，在人星形胶质细胞SVG p12中与对照组相比，ADDA可以显著抑制Tau mRNA表达；并且，ADDA浓度越高，对Tau mRNA抑制效果越明显。

具实施步骤如下：

首先用0.04MHCl配制1mM的ADDA母液，并将母液加入培养基中，使ADDA的终浓度分别为1μM、2μM、4μM和8μM，0.04M HCl作为对照，每隔24h重新加药一次；ADDA处理细胞72h后，胰酶消化细胞，1000rpm离心收集细胞，并用1′PBS洗涤细胞两次后加入1mL Trizol温和吹匀细胞，将这些细胞溶液全部转移至一个1.5mL的EP管内(RNA提取过程中所使用的EP管、Tip头均须经过0.1％DEPC水处理，湿热灭菌后使用)，室温静置5min；补加200mL三氯甲烷(氯仿)，剧烈震荡15s，室温静置2～3min。12000′g，4℃，离心15min。吸取上层水相转移至一个新的无酶EP管内，加500mL异丙醇，室温静置10min。12000g，4℃，离心10min。去上清，加1ml 75％的预冷乙醇(0.1％的DEPC水配制)，涡旋片刻。7500′g，4℃，离心5min。去上清，干燥，溶于20mL的0.1％DEPC水中，55℃放置10min促溶，利用分光光度计测定浓度和纯度，并进行如下RNA逆转录程序：

在RNase free的EP管中配制如下混合液：

用移液器温和吹打混匀，42℃2min。之后加入5×qRT SuperMix II，用移液器轻轻吹打混匀，按如下程序合成cDNA：

25℃ 10min

50℃ 30min

85℃ 5min

产物可立即用于PCR反应，或在-30℃保存备用。

Real-time PCR使用的是Gene公司Corbett Research的Rotor-gene 6000定量PCR仪，试剂是Roche FastStart Universal SYBR_Green Master Mix，反应体系如下：

Real-time PCR反应条件如下：

Tau引物列表如下：

试验例2.Western blot检测ADDA对Tau蛋白表达的影响

图2结果显示，ADDA处理星形胶质细胞SVG p12后，与对照(0.04M HCl)相比，Tau蛋白水平明显下调，表明在星形胶质细胞SVG p12中，ADDA可以抑制Tau蛋白表达。

具体实施步骤如下：

利用人星形胶质细胞SVG p12作为研究对象，使用不同ADDA浓度处理细胞，探讨不同ADDA对SVG p12中Tau蛋白表达的影响。处理细胞前，首先用0.04M HCl配制1mM的ADDA母液，并将母液加入培养基中，使ADDA的终浓度分别为2μM、4μM和8μM，每隔24h重新加药一次；ADDA处理细胞72h后，胰酶消化细胞，1000rpm离心收集细胞，并用1′PBS洗涤细胞两次，加入RIPA细胞裂解液(有效裂解成份为1％Triton X-100)，冰上裂解30分钟后14000rpm离心10分钟，收集蛋白上清，用BSA法测定蛋白质浓度，-30℃保存备用。

根据蛋白分子量的大小，配制合适浓度的浓缩胶和分离胶。取40～60μg蛋白样品，与4′SDS上样缓冲液1∶4混合。然后100℃加热5min，12000rpm高速离心5min。将蛋白样品加入到上样孔道中，在样品左侧孔道加入5μL蛋白Marker。上样完毕，接通电源，调恒压90V电泳，待蛋白样品进入到分离胶后，将电压调成120V继续电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶最底端时，终止电泳，取出凝胶。拆卸凝胶夹层，取出凝胶。根据蛋白质Marker所指示的条带位置，切下目的条带相应凝胶。剪切与胶大小相应的PVDF膜，置于甲醇中浸泡活化，转膜滤纸置于半干转缓冲液中浸泡10min。在转膜仪中组装转膜夹层，按从上至下滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序依次装入，并注意夹层中不能出现气泡，调电压至24V，根据蛋白大小设定转膜时间。转膜结束后，将PVDF膜放在含5％脱脂奶粉的PBST溶液中。室温封闭1小时后弃封闭液，加入相应的一抗和内参GAPDH抗体(根据抗体说明书稀释一抗)，并在4℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜，使用1′PBST洗涤4次，每次10min。加入HRP标记的抗鼠或兔二抗室温孵育1小时。二抗孵育完毕，使用1′PBST洗涤4次，每次10min。滴加ECL发光液于PVDF膜上，在暗室中，裁取合适尺寸的X胶片，放入压片夹中压片1～5min，打开压片夹并取出光片显影、定影，冲洗并烘干，扫描胶片，观察结果。

试验例3.Western blot检测PRMT8表达干扰后对组蛋白修饰H4R3me2a水平的影响

在人星形胶质细胞SVG p12利用特异的干扰小RNA(siRNA)沉默蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT8基因表达，检测PRMT8潜在的催化底物H4R3me2a(组蛋白H4第三位精氨酸残基非对称性双甲基化)的水平变化情况。图3结果显示，干扰PRMT8表达后H4R3me2a修饰水平明显降低。

具实施步骤如下：

利用人星形胶质细胞SVG p12作为研究对象，首先利用人工合成的PRMT8干扰小RNA(siRNA；干扰序列为GACAGUACAAGGACUUCAA)转染人星形胶质细胞SVGp12，转染前一天将生长状态良好的细胞接种到六孔板中，次日待细胞融合度达到60％～70％时可进行转染。将PRMT8 siRNA和Lipo3000转染试剂分别在两个EP管中轻轻混匀，然后将二者轻轻混合在一起，室温静置10～15分钟后将转染试剂混合液滴加到细胞培养基中。培养72h后，胰酶消化细胞，离心收集细胞，用1′PBS洗涤细胞两次。将细胞分成两份，一份提取全细胞蛋白，另一份提取核内组蛋白。对于全细胞蛋白提取，加入RIPA细胞裂解液(有效裂解成份为1％Triton X-100)，冰上裂解30分钟后14000rpm离心10分钟，收集蛋白上清，用BSA法测定蛋白质浓度，-30℃保存备用。对于核内组蛋白提取，采用Triton提取液(含有0.5％Triton X-100，2mmol/L的PMSF和0.02％NaN₃)重悬细胞，在冰上裂解10分钟，6500′g离心10分钟，弃上清，用前一步半量的Triton提取液洗涤细胞后加入0.2M的HCl悬浮细胞团，4℃过夜，6500′g离心10分钟收集上清，测定浓度后于-30℃保存备用。

接下来进行Western blot实验，根据蛋白分子量的大小，配制合适浓度的浓缩胶和分离胶。取40～60μg蛋白样品，与4′SDS上样缓冲液1∶4混合。然后100℃加热5min，12000rpm高速离心5min。将蛋白样品加入到上样孔道中，在样品左侧孔道加入5μL蛋白Marker。上样完毕，接通电源，调恒压90V电泳，待蛋白样品进入到分离胶后，将电压调成120V继续电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶最底端时，终止电泳，取出凝胶。拆卸凝胶夹层，取出凝胶。根据蛋白质Marker所指示的条带位置，切下目的条带相应凝胶。剪切与胶大小相应的PVDF膜，置于甲醇中浸泡活化，转膜滤纸置于半干转缓冲液中浸泡10min。在转膜仪中组装转膜夹层，按从上至下滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序依次装入，并注意夹层中不能出现气泡，调电压至24V，根据蛋白大小设定转膜时间。转膜结束后，将PVDF膜放在含5％脱脂奶粉的PBST溶液中。室温封闭1小时后弃封闭液，加入相应的一抗和内参抗体(根据抗体说明书稀释一抗)，并在4℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜，使用1′PBST洗涤4次，每次10min。加入HRP标记的抗鼠或兔二抗室温孵育1小时。二抗孵育完毕，使用1′PBST洗涤4次，每次10min。滴加ECL发光液于PVDF膜上，在暗室中，裁取合适尺寸的X胶片，放入压片夹中压片1～5min，打开压片夹并取出光片显影、定影，冲洗并烘干，扫描胶片，观察结果。

试验例4.PRMT8调控Tau基因的表达

在人星形胶质细胞SVG p12利用特异的干扰小RNA(siRNA)沉默蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT8基因表达，检测Tau mRNA的表达变化。图4结果显示，与对照相比干扰PRMT8表达Tau mRNA表达水平明显降低。

具体实验步骤如下：

利用人星形胶质细胞SVG p12作为研究对象，首先利用人工合成的PRMT8干扰小RNA(siRNA；干扰序列为GACAGUACAAGGACUUCAA)转染人星形胶质细胞SVGp12，转染前一天将生长状态良好的细胞接种到六孔板中，次日待细胞融合度达到60％～70％时可进行转染。将PRMT8 siRNA和Lipo3000转染试剂分别在两个EP管中轻轻混匀，然后将二者轻轻混合在一起，室温静置10～15分钟后将转染试剂混合液滴加到细胞培养基中。培养72h后，胰酶消化细胞，离心收集细胞，用1′PBS洗涤细胞两次后加入1mL Trizol温和吹匀细胞，将这些细胞溶液全部转移至一个1.5mL的EP管内(RNA提取过程中所使用的EP管、Tip头均须经过0.1％DEPC水处理，湿热灭菌后使用)，室温静置5min；补加200mL三氯甲烷(氯仿)，剧烈震荡15s，室温静置2～3min。12000′g，4℃，离心15min。吸取上层水相转移至一个新的无酶EP管内，加500mL异丙醇，室温静置10min。12000g，4℃，离心10min。去上清，加1ml 75％的预冷乙醇(0.1％的DEPC水配制)，涡旋片刻。7500′g，4℃，离心5min。去上清，干燥，溶于20mL的0.1％DEPC水中，55℃放置10min促溶，利用分光光度计测定浓度和纯度，并进行如下RNA逆转录程序：

在RNase free的EP管中配制如下混合液：

25℃ 10min

50℃ 30min

85℃ 5min

产物可立即用于PCR反应，或在-30℃保存备用。

Real-time PCR使用的是Gene公司Corbett Research的Rotor-gene 6000定量PCR仪，试剂是Roche FastStart Universal SYBR Green Master Mix，反应体系如下：

Real-time PCR反应条件如下：

Tau引物列表如下：

试验例5.ADDA透过小鼠血脑屏障实验

药物透过血脑屏障的能力是治疗老年痴呆的前提条件。利用尾静脉注射的方式将ADDA注入小鼠体内，观察分析ADDA是否存在于小鼠血液和脑组织中，以验证ADDA能否透过小鼠血脑屏障，如图5所示，尾静脉注射ADDA后我们观察到ADDA存在于小鼠的血液和脑组织中，并在注射2～3h后ADDA含量达到峰值。

具实施步骤如下：

实验用小鼠购自于南京大学模式动物研究所，雌性，6～8周龄。配制ADDA母液浓度为0.25mg/100μL，溶剂为0.04M HCl，采用尾静脉注射的方式将100μL ADDA溶液注入小鼠体内。ADDA尾静脉注射0、1、2、3、4、5小时后脱颈处死小鼠，进行眼眶取血和脑组织提取。对于血清样品，在血液中加入1倍量的生理盐水，10000rpm离心10分钟，吸取上清液，0.22μm过滤备用。对于脑组织样品，将取出的脑组织用生理盐水洗去血迹，滤纸吸干，剥离脑膜血管，按脑组织∶生理盐水＝1∶1.5(W/V)的比例匀浆，离心10min，取上清液，0.22μm过滤备用。进样前严格过滤色谱纯流动相，根据需要选择不同的滤膜。对抽滤后的流动相进行超声脱气20～30分钟。打开色谱工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。对于更换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，冲洗时速度不过高。调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000psi。选用合适的流速。设定不同样品的检测器分析参数。等基线走稳即可进样分析，分析样品时对样品的前处理非常重要。在样品进行高效液相色谱分析(HPLC)之前，先对ADDA标准品进行分析，摸索ADDA检测分析的色谱柱、流动相以及确定标准品的检测波长，确定标准品出峰的时间和位置。然后，将样品分析结果与标准品的分析结果进行比对分析。

试验例6.Real-time PCR检测ADDA对小鼠大脑皮层原代神经元细胞Tau mRNA表达的影响

利用小鼠大脑皮层原代神经元细胞作为研究对象，探讨不同ADDA处理浓度对小鼠神经元细胞Tau mRNA表达的影响。发现随着ADDA浓度的升高，Tau mRNA表达量降低。

具体实施步骤如下：

首先提取小鼠皮层原代神经元细胞。断颈处死孕鼠(C57BL/6J)，利用解剖剪剖开孕鼠腹腔取出胎鼠(E12.5)，并将胎鼠大脑侵泡于预冷的PBS中，在解剖显微镜下用眼科镊剪开头皮，去颅骨，分离胎鼠皮层组织，置于预冷的HBSS(Hanks balanced salt solution)中。在解剖显微镜下用眼科镊和镊子剔除脑膜和表层血丝至组织呈乳白色。剪碎皮层组织后移至15mL培养皿中，加入0.25％EDTA胰酶置于37℃消化30min，每隔10min置于显微镜下观察消化情况。加入等量含有10％FBS的Neurobasal培养基终止消化。离心，然后用Neurobasal完全培养基(包含2％B27和2mM Glutamine)重悬细胞，并以1.5×105cells/cm²的密度种入D-多聚赖氨酸(Poly-D-lysine，PDL)包被好的24孔板培养，待细胞贴壁后，使用不同ADDA浓度处理小鼠神经元细胞。

用0.04M HCl配制1mM的ADDA母液，并将母液加入培养基中，使ADDA的终浓度分别为2μM、4μM、8μM和16μM，0.04M HCl作为对照，每隔24h重新加药一次；ADDA处理细胞72h后，胰酶消化细胞，1000rpm离心收集细胞，并用1′PBS洗涤细胞两次后加入1mL Trizol温和吹匀细胞，将这些细胞溶液全部转移至一个1.5mL的EP管内(RNA提取过程中所使用的EP管、Tip头均须经过0.1％DEPC水处理，湿热灭菌后使用)，室温静置5min；补加200μL三氯甲烷(氯仿)，剧烈震荡15s，室温静置2～3min。12000′g，4℃，离心15min。吸取上层水相转移至一个新的无酶EP管内，加500μL异丙醇，室温静置10min。12000g，4℃，离心10min。去上清，加1ml 75％的预冷乙醇(0.1％的DEPC水配制)，涡旋片刻。7500′g，4℃，离心5min。去上清，干燥，溶于20μL的0.1％DEPC水中，55℃放置10min促溶，利用分光光度计测定浓度和纯度，并进行如下RNA逆转录程序：

在RNase free的EP管中配制如下混合液：

25℃ 10min

50℃ 30min

85℃ 5min

产物可立即用于PCR反应，或在-30℃保存备用。

Real-time PCR反应条件如下：

Tau引物列表如下：

试验例7.Western blot检测ADDA对小鼠大脑皮层原代神经元细胞中Tau蛋白表达的影响

ADDA处理小鼠大脑皮层原代神经元细胞后，与对照(0.04M HCl)相比，利用Western blot检测Tau蛋白表达水平。发现其ADDA处理过的小鼠大脑皮层原代细胞中Tau蛋白随ADDA浓度升高而降低(图7)。

具体实施步骤如下：

按试验例6所述的方法提取小鼠大脑皮层原代神经元细胞，使用不同ADDA浓度处理细胞，探讨不同ADDA对神经元细胞中Tau蛋白表达的影响。处理细胞前，首先用0.04M HCl配制1mM的ADDA母液，并将母液加入培养基中，使ADDA的终浓度分别为2μM、4μM、8μM和16μM，每隔24h重新加药一次；ADDA处理细胞72h后，胰酶消化细胞，1000rpm离心收集细胞，并用1′PBS洗涤细胞两次，加入RIPA细胞裂解液(有效裂解成份为1％Triton X-100)，冰上裂解30分钟后14000rpm离心10分钟，收集蛋白上清，用BSA法测定蛋白质浓度，-30℃保存备用。

根据蛋白分子量的大小，配制合适浓度的浓缩胶和分离胶。取40～60μg蛋白样品，与4′SDS上样缓冲液1∶4混合。然后100℃加热5min，12000rpm高速离心5min。将蛋白样品加入到上样孔道中，在样品左侧孔道加入5μL蛋白Marker。上样完毕，接通电源，调恒压90V电泳，待蛋白样品进入到分离胶后，将电压调成120V继续电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶最底端时，终止电泳，取出凝胶。拆卸凝胶夹层，取出凝胶。根据蛋白质Marker所指示的条带位置，切下目的条带相应凝胶。剪切与胶大小相应的PVDF膜，置于甲醇中浸泡活化，转膜滤纸置于半干转缓冲液中浸泡10min。在转膜仪中组装转膜夹层，按从上至下滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序依次装入，并注意夹层中不能出现气泡，调电压至24V，根据蛋白大小设定转膜时间。转膜结束后，将PVDF膜放在含5％脱脂奶粉的PBST溶液中。室温封闭1小时后弃封闭液，加入相应的一抗和内参抗体(根据抗体说明书稀释一抗)，并在4℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜，使用1′PBST洗涤4次，每次10min。加入HRP标记的抗鼠或兔二抗室温孵育1小时。二抗孵育完毕，使用1′PBST洗涤4次，每次10min。滴加ECL发光液于PVDF膜上，在暗室中，裁取合适尺寸的X胶片，放入压片夹中压片1～5min，打开压片夹并取出光片显影、定影，冲洗并烘干，扫描胶片，观察结果。

试验例8.Western blot检测ADDA对小鼠大脑皮层原代神经元H4R3me2a水平的影响

利用小鼠大脑皮层原代神经元细胞作为研究对象，探讨ADDA处理对小鼠神经元细胞H4R3me2a水平的影响。

结果显示，4μM ADDA处理过的细胞，其H4R3me2a已经检测不到(图8)。

具体实施步骤如下：

按实施例6所述的方法提取小鼠大脑皮层原代神经元细胞，使用ADDA处理小鼠大脑皮层神经元细胞，探讨ADDA对神经元细胞中H4R3me2a水平的影响。处理细胞前，首先用0.04MHCl配制1mM的ADDA母液，并将母液加入培养基中，使ADDA的终浓度为4μM，每隔24h重新加药一次；ADDA处理细胞72h后，胰酶消化细胞，1000rpm离心收集细胞，并用1×PBS洗涤细胞两次，采用Triton提取液(含有0.5％Triton X-100，2mmol/L的PMSF和0.02％NaN3)重悬细胞，在冰上裂解10分钟，6500×g离心10分钟，弃上清，并加入0.2M的HCl悬浮细胞团，4℃过夜，6500×g离心10分钟收集上清，测定浓度后于-30℃保存备用。

配制合适浓度的浓缩胶和分离胶。将蛋白样品与4×SDS上样缓冲液1∶4混合。然后100℃加热5min，12000rpm高速离心5min。将蛋白样品加入到上样孔道中，在样品左侧孔道加入5μL蛋白Marker。上样完毕，接通电源，调恒压90V电泳，待蛋白样品进入到分离胶后，将电压调成120V继续电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶最底端时，终止电泳，取出凝胶。拆卸凝胶夹层，取出凝胶。根据蛋白质Marker所指示的条带位置，切下目的条带相应凝胶。剪切与胶大小相应的PVDF膜，置于甲醇中浸泡活化，转膜滤纸置于半干转缓冲液中浸泡10min。在转膜仪中组装转膜夹层，按从上至下滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序依次装入，并注意夹层中不能出现气泡，调电压至24V，根据蛋白大小设定转膜时间。转膜结束后，将PVDF膜放在含5％脱脂奶粉的PBST溶液中。室温封闭1小时后弃封闭液，加入相应的一抗和内参抗体(根据抗体说明书稀释一抗)，并在4℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜，使用1×PBST洗涤4次，每次10min。加入HRP标记的抗鼠或兔二抗室温孵育1小时。二抗孵育完毕，使用1×PBST洗涤4次，每次10min。滴加ECL发光液于PVDF膜上，在暗室中，裁取合适尺寸的X胶片，放入压片夹中压片1～5min，打开压片夹并取出光片显影、定影，冲洗并烘干，扫描胶片，观察结果。

试验例9.ADDA对AD小鼠空间学习和记忆能力的影响

利用APP/PS1双转基因阿尔茨海默病模型小鼠(C57BL/6J)作为研究对象，经腹腔注射给药后，观察ADDA对APP/PS1小鼠空间学习和记忆能力的影响。

如图9所示，水迷宫实验表明，随着训练天数的增加，对照组和给药组小鼠寻找水下平台的时间明显缩短。并且，从第四天开始，与对照组APP/PS1小鼠相比(0.04M HCl处理)，ADDA给药组小鼠的寻找水下平台的时间明显更短。表明ADDA处理后会提高APP/PS1小鼠的空间学习和记忆能力。

具体实施步骤如下：

实验用APP/PS1双转基因阿尔茨海默病模型小鼠(C57BL/6J)购自于南京大学模式动物研究所，雄性，6月龄起开始给药。利用0.04M HCl作为溶剂溶解ADDA，给药剂量为12.5mg/kg，对照组小鼠(Control)注射同等体积的0.04M HCl溶剂，采用腹腔注射的方式将100μL配制好的ADDA溶液和对照溶剂注入小鼠体内，每两天注射一次，持续时间为2.5个月。水迷宫实验是检测小鼠空间学习和记忆能力的经典手段，主要包括一个直径1.5m的圆形游戏池，可拆卸的平台，以及视频追踪系统组成。实验中将游泳池分为四个象限，整个实验应该保持安静的环境，水温维持在23±1℃。实验前，让小鼠适应熟悉环境，将所有小鼠依次放入游泳池中，让其自由游泳1min后引导小鼠在平台上停留20秒，帮助其熟悉周围环境。正式实验中，按顺序依次将小鼠放在不同象限中进行训练，使小鼠面向池壁，轻轻的放入水中，记录小鼠在水中的游泳时间(逃避潜伏期)。时间为1min，如果小鼠能在1min内找到隐藏的平台并在平台上停留5s，视为成功找到平台。如果小鼠未能在1min内找到平台，人为引导至平台停留20秒，且游泳时间(逃避潜伏期)默认为1min。每次训练结束后，及时擦干其身上水分，保持体温，训练间隔不少于30min，总共持续5天，每天同一时间训练，利用视频分析系统记录分析小鼠活动轨迹。

试验例10.硫磺素-S(Thioflavin-S)和免疫组化染色方法检测ADDA处理AD小鼠后对老年斑形成的影响

Aβ(β-淀粉样蛋白)沉积是脑部老年斑出现的主要原因，对应的老年斑，称为Aβ老年斑。根据淀粉蛋白级联假说，Aβ老年斑形成是阿尔茨海默病(AD)最主要的病理表现。

本试验例所指老年斑，是Aβ老年斑。

APP/PS1双转基因阿尔茨海默病模型小鼠(C57BL/6J)在4月龄时大脑皮层和海马区域会出现老年斑，并且随着月龄增加老年斑的数量及大小也随之增加。为了研究ADDA是否会影响小鼠老年斑的形成，我们利用硫磺素-S(Thioflavin-S)和免疫组化染色方法检测老年斑在对照组小鼠、ADDA处理组小鼠的的脑部皮层和海马区域的形成。

从图10染色结果所示，对照组小鼠比，ADDA处理组小鼠的的脑部皮层和海马区域的老年斑形成明显减少。表明ADDA会抑制AD小鼠脑部区域的老年斑形成。

具体实施步骤如下：

脱颈处死AD小鼠模型后，迅速打开小鼠胸腔，利用一次性注射器将4％多聚甲醛从左心室灌注，以排除大脑里的血液。随后利用解剖剪剥离小鼠颅骨，暴露大脑，将大脑分离出来放入福尔马林固定液中，分别制备石蜡切片(厚度为4μm)和冰冻切片(厚度为30μm)。其中石蜡切片进行免疫组化染色，冰冻切片进行硫磺素-S染色。对于硫磺素-S染色，切片经过二甲苯和酒精脱蜡后放入0.25％高锰酸溶液中漂染30min，去离子水漂洗5min后放入0.25％醋酸溶液中漂洗5s；去离子水漂洗5min后放入封闭液(BSA)中封闭30min；去离子水漂洗5min后滴上硫磺素-S染液(50％乙醇配制)染色5～8min；50％乙醇和去离子水分别漂洗2次后利用甘油凝胶封片，于荧光显微镜下观察拍照。对于免疫组化染色，脱蜡前先将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤2h。分别在二甲苯和梯度乙醇中浸泡脱蜡，用0.5％TritonX-100室温孵育15min，PBS漂洗5min；将切片浸入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)，加热至沸腾10～8min，取出后自然冷却至室温，PBS洗涤后用3％H₂O₂室温孵育10min，清除内源性过氧化物酶。PBS洗涤后使用山羊血清封片30min，滴加Aβ抗体(1∶200)，室温孵育1h，室温洗涤3次后滴加山羊抗小鼠二抗稀释液孵育30min；PBS洗涤后，滴加DAB显色液，镜下观察染色情况；去离子水冲洗后滴加苏木素复染5min，去离子水冲洗；切片再次经过酒精梯度脱水和二甲苯透明后，封片，拍照。

综上，本发明的ADDA可用于抑制中老年痴呆和帕金森氏症疾病相关基因/蛋白Tau的表达，容易透过血脑屏障，发挥治疗中老年痴呆和帕金森氏症疾病的作用。ADDA还能抑制组蛋白H4甲基化(H4R3me2a)，该抑制过程可能是通过抑制PRMT8实现的。

ADDA无色无味、易溶解、作用浓度低、性质稳定、安全等特点，其在大脑退行性疾病的治疗中具有广阔的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都山权江生物科技有限公司

<120> 一种小分子化合物在制备抑制Tau蛋白表达量的药物中的应用

<130> GY746-2019P016796CC

<150> 201810651268X

<151> 2018-06-22

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 1

ccaagtgtgg ctcattaggc a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 2

ccaatcttcg actggactct gt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 3

gagccacatc gctcagacac 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 4

catgtagttg aggtcaatga agg 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 5

attaaggcca accacttgga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 6

aatcgctacc acgtacaaag 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 7

cctgagcaaa gtgacctcca ag 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 8

caaggagcca atcttcgact gg 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 9

catcactgcc acccagaaga ctg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial SEQ.)

<400> 10

atgccagtga gcttcccgtt cag 23

Claims

1.式(I)所示化合物或其体内代谢产物、互变异构体、立体异构体、药学上可接受的盐、水合物和/或溶剂合物在制备Tau蛋白抑制剂中的用途；式(I)：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述Tau蛋白抑制剂是抑制Tau蛋白表达的药物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述Tau蛋白抑制剂是抑制组蛋白H4第三位精氨酸残基非对称性双甲基化的药物。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述Tau蛋白抑制剂是抑制脑部Aβ老年斑形成的药物。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗中枢神经系统疾病的药物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗中枢神经系统慢性疾病的药物。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗老年痴呆和帕金森氏症的药物。

8.一种治疗中枢神经系统疾病的药物，其特征在于：它是以式(I)所示化合物或其体内代谢产物、互变异构体、立体异构体、药学上可接受的盐、水合物和/或溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂；式(I)：

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。

10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述制剂是注射制剂、口服制剂。

11.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述注射制剂为粉针剂。