CN102802622A

CN102802622A - 用于治疗缺血和缺血再灌注损伤的组合物和方法

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Publication number: CN102802622A
Application number: CN2010800314795A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·B·巴奎西; 莱尼尔·必优克斯; 罗夫·卡萨尔; 史蒂芬·A·凯特斯; 艾伦·S·雷得
Original assignee: Ischemix LLC
Current assignee: Ischemix LLC
Priority date: 2009-05-14
Filing date: 2010-05-13
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2030-05-13
Also published as: JP5570590B2; US20160264622A1; EP2429519A1; WO2010132657A1; US20140274917A1; BRPI1012182A2; JP2014077003A; PL2429519T3; JP2012526842A; IL237820A; US8772250B2; HK1167082A1; CN102802622B; CA2761798C; US9540417B2; US20100292313A1; AU2010249001A1; US20110160294A1; CA2761798A1; US7928067B2

Abstract

在一些实施方案中，本发明涉及包括由结构式(I)表示的一种基本上纯的化合物的组合物：

Description

用于治疗缺血和缺血再灌注损伤的组合物和方法

相关申请

本申请是2009年5月14日提交的美国申请号12/466,170的部分继续申请。上述申请的全部传授内容通过引用结合在此。

背景技术

在美国，心血管疾病是对于男性和女性的主要死亡原因。仅仅在美国每年就有多于一百万人遭受心脏病发作。心肌缺血，特征在于到达心肌、或心肌层的血流量和氧减少的一种病症，是心血管疾病的一个标志，它可能最终导致心脏病发作、或心肌梗死。心血管疾病还可能导致到身体其他区域的血流量受限制以及氧供应减少，导致不同器官和组织(包括脑)的缺血性损伤，这可能导致中风。

在缺血发作之后受累的区域的血流量的重建、或再灌注，以及再氧合对于限制不可逆性损伤是关键的。然而，再灌注也带来了潜在性损伤后果，如再灌注损伤，它是由一次缺血发作之后的冠状动脉血流量的恢复引起的并且是由于再灌注过程中产生和积累的活性氧和氮类引起的。缺血再灌注损伤的生物化学特征在于缺血事件过程中的氧的耗损、作为结果的细胞内钙水平的提高，随后是再氧合并且在再灌注过程中伴随地产生活性氧种类(Piper，H.M.，Abdallah，C.，Schafer，C.，The first minutes of reperfusion：a window of opportunity forcardioprotection.Annals of Thoracic Surgery 2003，75：644；Yellon，D.M.，Hausenloy，D.J.，Myocardial reperfusion injury.New England Journal ofMedicine 2007，357：1121)。再灌注损伤可能是形成差不多50％的心脏损害的原因，其后是心肌梗死(Yellon，D.M.，Hausenloy，D.J.，Myocardial reperfusioninjury.New England Journal of Medicine 2007，357：1121)。

在美国以及在世界各地，心血管疾病的流行使得能够有效预防、减少、或消除由于心脏病发作引起的缺血和缺血再灌注损伤或中风的疗法和治疗剂的开发成为必需。已经证明当前的用于治疗由心肌梗死引起的缺血和缺血再灌注损伤的疗法(如机械性缺血预适应)是临床上不实际的，而其他疗法(如阻断钙流入的拮抗剂和活性氧种类清除剂)产生了令人失望的临床结果(Otani，H.，Ischemic preconditioning：From molecule mechanisms to therapeuticopportunities.Antioxidants&Redox Signaling，2008，10：207；Yellon，D.M.，Hausenloy，D.J.，Myocardial reperfusion injury.New England Journal of Medicine2007，357：1121)。

因此，对于新的并且更有效的用于治疗由心血管疾病和其他病症引起的缺血和缺血再灌注损伤的疗法和治疗剂存在着显著的需要。

发明内容

在此所述的本发明，通过活化涉及抑制细胞凋亡的细胞信号传导途径的激酶并且通过清除活性氧，着手解决用于治疗缺血、缺血性损伤以及缺血再灌注损伤(包括心肌缺血和缺血再灌注损伤)的需要。具体地，本发明涉及包括所披露的化合物、或它们的药学上可接受的盐的组合物，以及它们的作为细胞保护性激酶的活化剂的有效用途。

在一个实施方案中，本发明涉及包括由以下结构式I表示的一种基本上纯的化合物的组合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在另一个实施方案中，本发明涉及包括由以下结构式II表示的一种基本上纯的化合物的组合物：

或它的一种药学上可接受的盐。

在一个进一步的实施方案中，本发明涉及包括由以下结构式III表示的一种基本上纯的化合物的组合物：

在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括：i)一种药学上可接受的载体或稀释剂；以及ii)由以下结构式I表示的一种基本上纯的化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在一个另外的实施方案中，本发明涉及在细胞中活化至少一种细胞保护性激酶(例如，Akt激酶、IRK激酶、IGF1R激酶、Src激酶)的一种方法，包括使这种细胞与一个有效量的由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐相接触：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。在一个具体的实施方案中，该细胞保护性激酶是Akt激酶、或在与Akt激酶相同的细胞信号传导途径中起作用的一种激酶(例如，IRK激酶)。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗在哺乳动物个体体内的缺血或缺血再灌注损伤的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。在一个具体的实施方案中，该缺血或缺血再灌注损伤是心肌缺血或缺血再灌注损伤。

在又另一个实施方案中，本发明涉及一种抑制在个体体内的细胞凋亡的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在一个进一步的实施方案中，本发明涉及一种预防在个体体内的胞质钙超载的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种增加在个体(例如，遭受缺血的个体)体内的过氧化自由基吸收的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗在哺乳动物个体体内的缺血、缺血性损伤或缺血再灌注损伤的方法，包括多剂给予在此所述的这些化合物。在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于治疗对其有需要的个体体内的缺血性损伤或缺血再灌注损伤的方法，包括向该个体给予至少两剂的由以下结构式表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐，其中在该化合物中的R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团，并且该化合物或它的一种药学上可接受的盐是至少90％对映体纯的。该方法包括向该个体给予一个非最终剂的该化合物或它的药学上可接受的盐以及一个最终剂的该化合物或它的药学上可接受的盐。如在此所述，该最终剂是在损伤之前立即给予的，并且该非最终剂和该最终剂是以一个给药间隔给予的，这与该化合物的单剂给予相比增强了该化合物用于治疗该损伤的疗效。

在又另一个具体的实施方案中，本发明提供了一种用于治疗在对其有需要的个体体内的缺血性损伤或缺血再灌注损伤的方法，包括向该个体给予至少两剂的由以下结构式表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐，其中在该化合物中的R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团，并且该化合物或它的一种药学上可接受的盐是至少90％对映体纯的。该方法包括向该个体给予一个非最终剂的该化合物或它的药学上可接受的盐以及一个最终剂的该化合物或它的药学上可接受的盐。如在此所述，该最终剂是在损伤之前在该化合物的大约两个半衰期之内的一个时间点给予该个体的，并且该非最终剂是在给予该最终剂之前在该化合物的至少大约四个半衰期的一个时间点给予该个体的。

在此所述的化合物和方法在治疗缺血、缺血性损伤以及缺血再灌注损伤方面是出乎意料地有效的。具体地，在“R”构型中具有一个硫辛酰部分的本发明的这些化合物在体内是更有效的(当各自作为对映体纯的化合物而不是作为消旋混合物提供时)，并且此外比它们的在“S”构型中具有硫辛酰部分的立体异构对应物是更有效的。此外，虽然在标准药理学方案中广泛承认以规则的间隔向个体给予一种药物的多剂(例如，每4小时或每12小时口服给予)以维持该药物在该个体体内的恒定血浆浓度通常将会维持它的疗效，以在此所述的剂数和时间间隔给予多剂的一种本发明的化合物不但维持了而且增强了所要求的化合物用于治疗缺血、缺血性损伤和缺血再灌注损伤的疗效。具体来说，如在此所述，以允许所要求的化合物的血浆浓度在给予一个后续剂之前适当地下降到该化合物的初始最大浓度以下的给药间隔给予多剂的所要求的药物对于标准药理学方案而言是违反直觉的，但是导致了料想不到的该化合物的疗效的增强。

附图说明

图1是一个描述所提出的细胞信号传导途径的简图，解释了对于RLip-EA-OH和相关化合物的潜在作用机理。

图2是一个描述了处于不同浓度的RLip-EA-OH和RLip-OH对于A549细胞中的Akt磷酸化水平的影响的曲线图。将数据呈现为磷酸化的Akt与总Akt的比率(减去背景)的平均值±标准平均误差(N＝4)。

图3是一个描述了处于不同浓度的RLip-EA-OH(单独地或在一种已知的磷脂酰肌醇-3’-激酶抑制剂LY294002的存在下)对于A549细胞中的Akt磷酸化水平的影响的曲线图。将数据呈现为磷酸化的Akt与总Akt的比率(减去背景)的平均值±标准平均误差(N＝4)。

图4是一个描述了处于不同浓度的RLip-EA-OH、Ac-EA-OH和RLip-OH对于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的钙流动的影响的曲线图。将数据呈现为测量胞质钙水平(作为仅有缓冲液的对照的百分比)的平均值±标准平均误差(N＝4)。

图5是一个描述了RLip-EA-OH在心肌缺血再灌注损伤的大鼠模型中的疗效的条形图。将数据呈现为心肌梗死面积除以处于风险的总面积的比例(MI/AR)。结果表示了通过用1mg/kg的RLip-EA-OH(N＝64)对盐水载体(N＝54)的心脏内注射治疗的动物的荟萃分析。与接受盐水载体的那些动物相比，用RLip-EA-OH治疗的动物具有显著(p＜0.001)减小的(33％)梗死面积(死亡组织)与处于风险的面积的比率。

图6是一个描述了以1mg/mL心内给予RLip-EA-OH对于心肌缺血再灌注损伤的一个大鼠模型的心肌损伤的减轻的时间效应的条形图。将数据呈现为心肌梗死面积除以处于风险的总面积的比率(MI/AR)并且显示为平均值±标准平均误差(N＝12-15/每组)。结果表明，与接受盐水载体15分钟前阻塞的那些动物相比，当在阻塞前15分钟(阻塞前，38％)、在阻塞之后15分钟(阻塞过程中，24％)、以及在再灌注之后1分钟之内(处于再灌注，32％)给予时，用RLip-EA-OH治疗显著(p＜0.05)减少了心肌组织死亡。

图7是一个描述了不同剂量的RLip-EA-OH在心肌缺血再灌注损伤的一个大鼠模型中的作用的条形图。在阻塞前15分钟通过静脉内(IV)给予或左心室内(IC)给予RLip-EA-OH。将数据呈现为心肌梗死面积除以处于风险的总面积的比率(MI/AR)并且显示为平均值±标准平均误差(N＝10-12/每个组)。结果表明，用RLip-EA-OH治疗显著(p＜0.05)减少了心肌组织死亡并且是剂量依赖性的。

图8是对于静脉内给予的RLip-EA-OH比较了不同的单次和多次给药方案的体内疗效的条形图，如在心肌缺血再灌注损伤的一个大鼠模型中所评定的。

图9A和9B是按线性比例(图9A)和半对数比例(图9B)绘制了人平均血浆RLip-EA-OH浓度对时间数据的曲线图。

具体实施方式

定义

术语“烷基”是指具有1-10个碳原子的一种直链或支链的烃基团，并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等等。

术语“环烷基”表示具有3-10个碳原子的一种单环、二环或三环的饱和烃环，并且包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、二环[2.2.2]辛基、二环[2.2.1]庚基、螺[4.4]壬烷、金刚烷基等等。

术语“芳基”表示一种芳香族基团，它是一个苯基基团、一个萘基基团、一个茚满基基团或一个四氢萘基团。一种芳基基团是任选地用1-4个取代基取代的。示例性的取代基包括烷基、烷氧基、烷硫基、烷基磺酰基、卤素、三氟甲基、二烷氨基、硝基、氰基、CO₂H、CONH₂、N-单烷基-取代的酰氨基以及N，N-二烷基-取代的酰氨基。

术语“杂芳基”表示一种5元或6元的杂芳香族基团，它可以任选地稠合到包含选自N、O、和S的0-4个杂原子的一种饱和或不饱和环上，并且包括例如一种杂芳香族基团，它是2-或3-噻吩基、2-或3-呋喃基、2-或3-吡咯基、2-，3-，或4-吡啶基、2-吡嗪基、2-，4-，或5-嘧啶基、3-或4-哒嗪基、1H-吲哚-6-基、1H-吲哚-5-基、1H-苯并咪唑-6-基、1H-苯并咪唑-5-基、2-，4-，5-，6-，7-或8-喹唑啉基、2-，3-，5-，6-，7-或8-喹喔啉基、2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-喹啉基、1-，3-，4-，5-，6-，7-或8-异喹啉基、2-，4-，或5-噻唑基、2-，3-，4-，或5-吡唑基、2-、3-、4-、或5-咪唑基。一种杂芳基任选地是被取代的。示例性的取代基包括烷基、烷氧基、烷硫基、烷基磺酰基、卤素、三氟甲基、二烷氨基、硝基、氰基、CO₂H、CONH₂、N-单烷基-取代的酰氨基以及N，N-二烷基-取代的酰氨基、或通过氧代以形成一种N-氧化物。

术语“杂环基”表示含有独立地选自N、O、以及S的1到4个杂原子的一种4-、5-、6-或7-元的饱和或部分不饱和的杂环。示例性的杂环基包括吡咯烷、吡咯烷-2-酮、1-甲基吡咯烷-2-酮、哌啶、哌啶-2-酮、2-吡啶酮、4-吡啶酮、哌嗪、1-(2，2，2-三氟乙基)哌嗪、哌嗪-2-酮、5，6-二氢嘧啶-4-酮、嘧啶-4-酮、四氢呋喃、四氢吡喃、四氢噻吩、四氢噻喃、异噁唑烷、1，3-二氧戊环、1，3-二硫戊环、1，3-二噁烷、1，4-二噁烷、1，3-二噻烷、1，4-二噻烷、噁唑烷-2-酮、咪唑啉-2-酮、咪唑啉-2，4-二酮、四氢嘧啶-2(1H)-酮、吗啉、N-甲基吗啉、吗啉-3-酮、1，3-噁嗪(oxazinan)-2-酮、硫代吗啉、硫代吗啉1，1-二氧化物、四氢-1，2，5-噻噁唑1，1-二氧化物、四氢-2H-1，2-噻嗪1，1-二氧化物、六氢-1，2，6-噻二嗪1，1-二氧化物、四氢-1，2，5-噻二唑1，1-二氧化物以及异噻唑烷1，1-二氧化物。一种杂环基可以任选地被1-4个取代基取代。示例性的取代基包括烷基、卤烷基以及氧基。

某些所披露的化合物可以不同的立体异构形式存在。立体异构体是仅在它们的空间排布方面不同的化合物。对映异构体是立体异构体对，它们彼此是非重叠的镜像，最常见地是因为它们含有一个充当手性中心的不对称取代的碳原子。“对映异构体”是指彼此镜像的并且是不可重叠的一对分子中的一个。非对映异构体是不作为镜像而相关的立体异构体，最常见地是因为它们含有两个或更多个不对称取代的碳原子。一个结构式中的符号“*”表示一个手性碳中心的存在。“R”和“S”表示在一个或多个手性碳原子周围的取代基的构型。因此，“R*”和“S*”表示在一个或多个手性碳原子周围的取代基的相对构型。

“外消旋体”或“外消旋混合物”是指等摩尔量的两种对映异构体的一种化合物，其中此类混合物不展示出光学活性；即，它们不使偏振光平面旋转。

“左旋的”表示当偏振光通过一种不对称化合物时被旋转到左侧。指代左旋的前缀是“l”。

“右旋的”表示当偏振光通过一种不对称化合物时被旋转到右侧。指代右旋的前缀是“d”。

“几何异构体”是指取代基原子取向不同的异构体，与碳碳双键、一个环烷基环、或一个桥联双环系统有关。在一个碳碳双键的每侧上的原子(除了氢之外)可以是一个E(取代基是在碳碳双键的对侧上)构型或Z(取代基是取向在相同侧上)构型。

当所披露的化合物的立体化学是通过结构来命名或描述时，所命名或描述的立体异构体相对于其他立体异构体按重量计是至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％。当一种单一的对映异构体是通过结构来命名或描述时，所描述或命名的对映异构体按重量计是至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％光学上纯的。按重量计的百分比光学纯度是对映异构体的重量与对映异构体的重量加上它的光学异构体的重量的比率。

当一种所披露的化合物具有至少一个手性中心并且通过结构来命名或描述而没有指示立体化学时，应当理解的是该命名或结构涵盖了不含有相应的光学异构体的该化合物的一种对映异构体、该化合物的一种外消旋混合物以及富含一种对映异构体(相对于它的相应的光学异构体)的混合物。

当一种所披露的化合物具有至少两个手性中心并且通过结构来命名或描述而没有指示立体化学时，应当理解的是该命名或结构涵盖了不含其他非对映异构体的一种非对映异构体、不含其他非对映异构体对的一种非对映异构体对、非对映异构体的混合物、非对映异构体对的混合物、其中一种非对映异构体相对于其他一种或多种非对映异构体是富含的非对映异构体混合物、以及其中一种非对映异构体对相对于其他一种或多种非对映异构体对是富含的非对映异构体对混合物。

在含有一个或多个双键的本发明的化合物中，命名“E”、“Z”、“顺式”、和“反式”表明了相对于核心分子的构型。

氨基酸可以不同的立体异构形式存在。Fischer协定通常用来描述一个氨基酸的不对称碳原子周围的基团的构型，如与甘油醛的不对称碳原子周围的基团的排列相比。对于α-氨基酸，在C_α原子周围的氨基、羧基、R(即，侧链)和H基团分别对应于甘油醛的羟基、醛、CH₂OH、以及H基团：

L-甘油醛和L-α-氨基酸具有相同的相对构型，并且D-甘油醛和D-α-氨基酸具有相同的相对构型。L或D命名不指示氨基酸的使偏振光平面旋转的能力。许多L-氨基酸是右旋的。

如在此所使用的，“基本上纯的”表示所描述或命名的化合物是按重量计至少大约60％。例如，“基本上纯的”可以表示大约60％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％，或在70％与100％之间的百分比。在一个实施方案中，基本上纯的是指所描述或命名的化合物是至少大约75％。在一个具体的实施方案中，基本上纯的表示所描述或命名的化合物是按重量计至少大约90％。包括由结构式I表示的一种化合物的基本上纯的组合物可以包括由结构式IV、V、VI或VII表示的四种化合物(单独地抑或处于它们的任何组合)。

如在此所使用的，一个“有效量”是在体外、体内或离体给药的条件下足以达到所希望的效果的一个量，例如足以在细胞中活化一种或多种细胞保护性激酶的一个量、足以在细胞中抑制细胞凋亡的一个量以及足以抑制(例如，预防、延缓)缺血和缺血再灌注损伤(例如，在一个个体体内)的一个量。一种疗法的有效性可以通过适合的本领域的普通技术人员已知的方法来确定，包括在此所述的那些。

如在此所定义的，一个“治疗有效量”是在给药的条件下足以在对其有需要的个体体内达到所希望的治疗或预防效果的一个量，例如像足以在个体体内抑制(例如，预防、延缓)缺血和缺血再灌注损伤的一个量(例如，通过抑制该个体体内一种或多种受累的细胞的凋亡)。一种疗法的效果可以通过本领域普通技术人员已知的合适的方法来确定。

本发明是部分基于诸位申请人的以下发现：即在此所述的硫辛酸衍生化合物具有细胞保护和抗氧化特性。具体地，诸位申请人已经展示，某种硫辛酸衍生物RLip-EA-OH活化已知介导抑制细胞凋亡并促进细胞存活的细胞信号传导途径(图1)的Akt激酶和其他激酶(例如，IRK、IGF1R、Src)。诸位申请人进一步展示，RLip-EA-OH可以在心肌缺血再灌注损伤的动物模型体内降低缺血和缺血再灌注损伤的程度。

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

如在此所使用的，术语“可水解基团”是指一个部分，当它作为本发明的一个分子呈现时经水解产生一种羧酸或它的盐。水解例如可以在生理环境(例如，血液、代谢活性组织例如像肝、肾、肺、脑)中在酸性或碱性条件下自发地发生，或可以通过一种或多种酶(例如，酯酶、肽酶、水解酶、氧化酶、脱氢酶、裂解酶或连接酶)来催化。一种可水解基团可以向本发明的化合物赋予在体内的有利特性，如改进的水溶性、在血液中改进的循环半衰期、改进的摄入、改进的作用持续时间、或改进的作用开始。

在一个实施方案中，该可水解基团不破坏该化合物的生物活性。在一个替代实施方案中，具有一种可水解基团的一种化合物可以是无生物活性的，但是可以在体内转化成一种生物活性化合物。

包括可水解基团的本发明的化合物可以充当药物前体。如在此所使用的，术语“药物前体”表示这样一种化合物，它可以被水解、氧化、代谢或否则在生物条件下反应以提供本发明的化合物。药物前体在生物条件下经过这种反应后可以变得有活性，或它们能以它们的未反应的形式具有活性。一种药物前体在生理条件下可以经历降低的代谢(例如，由于存在一种可水解基团)，由此导致了改进的该药物前体的循环半衰期(例如，在血液中)。药物前体可以典型地使用熟知的方法来制备，如由Burger’s Medicinal Chemistry and DrugDiscovery(1995)172-178，949-982(Manfred E.Wolff ed.，5^th ed)所描述的那些。

在一个实施方案中，该可水解基团是选自下组，该组由以下各项组成：(C₁-C₁₀)烷基、(C₂-C₁₀)链烯基、(C₂-C₁₀)炔基、(C₁-C₁₀)烷氧基(C₁-C₁₀)烷基、(C₁-C₁₀)烷氧基(C₁-C₁₀)烷氧基(C₁-C₁₀)烷基、芳基以及芳基(C₁-C₁₀)烷基，其中各自是用选自下组的1到3个取代基任选地取代的，该组由以下各项组成：卤素、硝基、氰基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、氨基、(C₁-C₆)烷氨基、二(C₁-C₆)烷氨基、(C₁-C₆)烷基、卤(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷氧基、卤(C₁-C₆)烷氧基、吗啉代、苯基、以及苄基。

在另一个实施方案中，该可水解基团是选自下组，该组由以下各项组成：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、烯丙基、乙氧基甲基、甲氧基乙基、甲氧基乙氧基甲基、甲氧基乙氧基乙基、苄基、五氟苯基、2-N-(吗啉)乙基、二甲基氨乙基以及对甲氧苄基。

可水解基团的水解作用产生了一种羧酸。例如，在弱酸性的条件下，化合物A中的叔丁基被切割以产生化合物B中的羧酸基团：

R¹和R²可以是不同的可水解基团，产生了一种如化合物C的化合物，其中出现两种不同的酯。不同的可水解基团的使用可能允许一种特定的酯的选择性水解。例如，R¹或R²可以是对于酸性环境稳定的一种可水解基团并且另一个可以是对于碱性环境稳定的一种可水解基团。在一个替代实施方案中，R¹或R²可以是被一种特定酶切割的一种可水解基团，而另一个不被那种酶切割。在一些实施方案中，两种酯的水解可以同时发生。替代地，两种酯的水解可以是分步的。在另一个实例中，化合物C中的叔丁基基团在弱酸性的条件下被切割，而2-N-吗啉乙基部分可以用来自红泡刺藤(R.niveus)的脂肪酶来酶切：

用于选择、引入并且随后去除可水解基团的方法对于本领域的普通技术人员是熟知的(T.W.Greene and P.G.M.Wuts“Protective Groups in organicSynthesis”John Wiley&Sons，Inc.，New York 1999)。

可替代地，R¹或R²中仅有一个可以存在，导致了一种单一酯的水解以产生羧酸或它的盐：

本领域的普通技术人员将理解到，其他可水解的保护基团可以与本发明的化合物一起使用以获得本说明所涵盖的药物前体。

本发明的化合物能以药学上可接受的盐的形式存在。对于用于药物，本发明的这些化合物的盐是指无毒的药学上可接受的盐。

所披露的化合物的药学上可接受的盐包括酸加成盐以及碱加成盐。术语“药学上可接受的盐”包括通常用于形成碱金属盐以及形成游离酸或游离碱的加成盐的盐。该盐的性质不是关键的，条件是它是药学上可接受的。

所披露的化合物的适合的药学上可接受的酸加成盐可以从一种无机酸或一种有机酸来制备。此类无机酸的实例是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸以及磷酸。适合的有机酸可以选自脂肪酸、脂环酸、芳香族酸、芳基脂肪族酸、杂环酸、羧酸以及磺酸类别的有机酸，实例是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、马来酸、双羟萘酸(扑酸)、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、泛酸、苯磺酸、甲苯磺酸、对氨基苯磺酸、甲磺酸、环己基氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸(algenic acid)、β-羟丁酸、丙二酸、乳酸(galactic acid)、以及半乳糖醛酸。药学上可接受的酸性/阴离子盐还包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二氢氯化物、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(glyceptate)、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、氢溴化物、盐酸化物、羟萘酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、鞣酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、以及三乙碘的盐类。

所披露的化合物的适合的药学上可接受的碱加成盐包括但不局限于：由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属性盐或由N，N′-双苄乙-二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲葡糖胺、赖氨酸、精氨酸和普鲁卡因制成的有机盐。所有这些盐可以通过常规方法由相应的由所披露的化合物表示的化合物来制备，例如通过用适当的酸或碱处理的所披露的化合物。药学上可接受的碱性/阳离子盐还包括二乙醇胺、铵、乙醇胺、哌嗪和三乙醇胺盐。

在一个实施方案中，药学上可接受的盐包括一种一价阳离子或一种二价阳离子。在一个具体的实施方案中，该药学上可接受的盐是一种赖氨酸盐。

在另一个实施方案中，该一价阳离子是一种一价金属阳离子并且该二价阳离子是一种二价金属阳离子。在一个具体的实施方案中，该一价金属阳离子是一种钠阳离子。

或它的一种药学上可接受的盐。如在此所使用的，RLip-EA-OH是指结构式II。

在另一个实施方案中，本发明涉及包括由以下结构式IV表示的一种基本上纯的化合物的组合物：

或它的一种药学上可接受的盐。R¹和R²的值是如以上对于结构式(I)所定义的。

在另一个实施方案中，本发明涉及包括由以下结构式V表示的一种基本上纯的化合物的组合物：

在另一个实施方案中，本发明涉及包括由以下结构式VI表示的一种基本上纯的化合物的组合物：

在另一个实施方案中，本发明涉及包括由以下结构式VII表示的一种基本上纯的化合物的组合物：

本发明的一种组合物可以可替代地或除了所披露的化合物之外还包括由所披露的化合物所表示的一种化合物的一种药学上可接受的盐、或这样一种化合物或盐的一种药物前体或药学活性代谢物以及一种或多种药学上可接受的载体，并且根据已知的药物递送方法被递送到一个个体(优选一个人)上。本发明的这些化合物可以单独给予或与至少一种已知的或诸位申请人认为对于活化细胞保护性激酶和/或治疗缺血性损伤或缺血再灌注损伤有用的其他药剂组合给予。

可替代地，本发明的一种组合物可以包括由所披露的化合物表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐作为组合物中的唯一的药物活性剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括：i)一种药学上可接受的载体或稀释剂；以及ii)由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

本发明的这些药学上可接受的组合物包括在此披露的一种或多种化合物与一种或多种无毒的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或辅助剂和/或赋形剂，在此共同称为“载体”材料，并且如果希望的话，称为其他活性成分。

本发明还涉及在细胞内活化一种细胞保护性激酶的方法。如在此所使用的，术语“细胞保护性激酶”是指一种激酶，当被活化时，它使得一个或多个促进细胞存活/抑制细胞死亡(例如，细胞凋亡)的细胞信号传导途径的组分磷酸化。因此，在一个实施方案中，本发明涉及在细胞中活化一种细胞保护性激酶(例如，胰岛素受体激酶、Akt激酶、胰岛素样生长因子1受体激酶、Src激酶)的一种方法，包括使该细胞与一个有效量的由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐进行接触：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及活化一种激酶的方法，该激酶的途径在细胞中是细胞保护性的，该方法包括使该细胞与一个有效量的由结构式II表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐进行接触：

在另一个实施方案中，本发明涉及在细胞中活化一种细胞保护性激酶的一种方法，该方法包括使该细胞与一个有效量的由结构式III表示的一种化合物进行接触：

一种细胞保护性激酶的活化可以导致包括该细胞保护性激酶的一个或多个细胞保护性细胞信号传导途径的活化。在一个具体的实施方案中，在细胞中一种或多种细胞保护性激酶被本发明的化合物的活化可以抑制(例如，预防、延缓)其中这一种或多种激酶被活化的细胞的凋亡。

本发明的涉及活化细胞保护性激酶的方法可以在体外(例如，使用培养的细胞、使用分离的细胞)或在体内(例如，通过向一个活体生物给予本发明的一种或多种化合物)进行。在一个具体的实施方案中，本发明的这些化合物用于活化人体内的一种或多种细胞中的一种或多种细胞保护性激酶的方法中。

在一个实施方案中，该细胞保护性激酶是Akt激酶。Akt激酶的活化可以导致一个或多个Akt细胞信号传导途径(是细胞保护性的)的活化。Akt激酶，还称为Akt、PKB和Rac-PK，属于丝氨酸-苏氨酸激酶Akt/PKB家族并且已经显示出涉及多种不同信号传导途径(Alessi，and Cohen，Curr.Opin.Genet.Dev.8(1998)，55-62)，包括与细胞存活和增殖有关的途径(Song，G.，Ouyang，G.，andBao，S.，The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival.J Cell MolMed 2005 9：59；Hausenloy，D.J.，Yellon，D.M.，Reperfusion injury salvage kinasesignaling：taking a RISK for cardioprotection.Heart Fail Rev 2007，12：217)。Akt由一个N端脂质结合血小板-白细胞C激酶底物同源结构域和一个C端催化结构域组成。在静息细胞中，所有的Akt同种型位于细胞质中但是在用外部配体刺激后转移到质膜上。易位以及随后的活化是通过一些不同的配体诱导的，这些配体包括PDGF、IGF、EGF、βFGF以及胰岛素。这种活化取决于PI3激酶活性并且要求Akt的Thr308和Ser473分别被PDK-1和PDK-2分级磷酸化(Alessi et al.，Curr.Biol.8(1998)，69-81)。一旦被活化，Akt介导一些不同的功能，包括防止细胞凋亡、诱导分化和/或增殖、蛋白质合成以及胰岛素的代谢作用。

如在此实例2中所述，本发明的化合物增加了基于细胞的体外测定中的Akt磷酸化。细胞中的Akt激酶磷酸化可以使用本领域已知的一种或多种体外Akt激酶磷酸化测定法来评定，这些测定法包括例如从商业供应商可得的用于测试细胞中的AKT磷酸化的试剂盒和测定(例如，Cellomics磷酸化AKT活化试剂盒，Thermo Scientific；Akt活性测定试剂盒，BioVision Incorporated；用于磷酸化AKT(S473)的FACE^TMAKT细胞内蛋白质分析，Active Motif；PathScan

磷酸化Akt(Thr308)Sandwich ELISA试剂盒，Cell SignalingTechnology；AlphaScreen

SureFire

磷酸化AKT测定试剂盒，Perkin Elmer；Akt活性免疫测定试剂盒，EMD Biosciences)。用于评定Akt激酶磷酸化的一种示例性测定法在此描述于实例2中(Chen，H.，Kovar，J.，Sissons，S.，et.al.Acell based immunocytochemical assay for monitoring kinase signaling pathwaysand drug efficacy.Analyt Biochem 2005 338：136)。

Akt活化还可以在体内评定，例如通过在从个体体内获得的细胞样品上进行的免疫检测法。一些Akt特异性抗体，包括磷酸化特异性Akt抗体(例如，对于磷酸化Ser473特异的、对于磷酸化Thr308特异的)通常是商业上可得的(例如，Perkin Elmer)。

在另一个实施方案中，该细胞保护性激酶是胰岛素受体激酶(“IRK”)(Diesel，B.，Kulhanek-Heinze，S.，Holtje，M.，et.al.，α-Lipoic Acid as a directlybinding activator of the insulin receptor：protection from hepatocyte apoptosis.Biochemistry，2007 46：2146；Hausenloy，D.J.，Yellon，D.M.New directions forprotecting the heart against ischemia-reperfusion injury：targeting the reperfusioninjury salvage kinase(RISK)-pathway.Cardiovasc Res 2004 61：448)。IRK活化导致了Akt的磷酸化和活化(Alessi，D.R.，Andjelkovic，M.，Caudwell，B.，Cron，P.，Morrice，N.，Cohen，P.，Hemmings，B.A.Mechanism of activation of protein kinaseB by insulin and IGF-1.EMBO J 1996 15：6541-6551)。IRK的活化可以导致一个或多个IRK细胞信号传导途径(是细胞保护性的)的活化。如在此实例3中所述，本发明的化合物在体外生化测定中活化了IRK。IRK活化可以使用本领域已知的一种或多种体外IRK活化测定法来评定。用于评定IRK活化的一种示例性的测定法描述于实例3中(Mobility Shift Kinase Assay，Caliper LifeSciences，Hanover，MD)。

在另一个实施方案中，该细胞保护性激酶是胰岛素样生长因子1受体(“IGF1R”)激酶。IGF1R激酶的活化可以导致一个或多个IGF1R细胞信号传导途径(是细胞保护性的)的活化。如在此实例4中所述，本发明的化合物在体外的一个生化测定中活化了IGF1R激酶。IGF1R激酶活化可以使用本领域已知的一种或多种体外IGF1R激酶活化测定法来评定。用于评价IGF1R激酶活化的一种示例性测定法在此描述于实例4中。

在一个进一步的实施方案中，该细胞保护性激酶是Src激酶。Src激酶的活化可以导致一个或多个Src细胞信号传导途径(是细胞保护性的)的活化。如在此实例4中所述，本发明的化合物在体外生化测定中活化了Src激酶。Src激酶活化可以使用本领域已知的一种或多种体外Src激酶活化测定法来评定。

IGF1R和Src酪氨酸激酶在保护心脏免受缺血再灌注损伤方面起作用(Buddhadeb，D.，Takano，H.，Tang，X.-L.，et al.Role of Src protein tyrosinekinase in late preconditioning against myocardial infarction.Am J Physiol 2002283：H549；Pasdois，P.，Quinlan，C.L.，Rissa，A.，et al.Ouabain protects rat heartsagainst ischemia-reperfusion injury via pathway involving Src kinase，mitoKATP，and ROS.Am JPhysiol 2006，292：H1470；Suzuki，Y.J.Growth factor signaling forcardioprotection against oxidative stress-induced apoptosis.Antiox Redox Signal2003，5：741；Hausenloy，D.J.，Yellon，D.M.，New directions for protecting the heartagainst ischaemia-reperfusion injury：Targeting the Reperfusion Injury SalvageKinase(RISK)-pathway.Cardiovasc Res 2004 61：448)。

根据本发明，在细胞中的一种或多种细胞保护性激酶被本发明的化合物的活化可以抑制(例如，预防、延缓)该细胞的凋亡。评定细胞凋亡的方法在本领域是熟知的。典型地使用用于可视化凋亡细胞(例如，通过检测与细胞凋亡相关的形态学变化，如染色质凝聚和细胞质皱缩)的显微镜分析(例如，光学显微术、电子显微术、共聚焦显微术、激光扫描显微术)来研究凋亡细胞。

在琼脂糖凝胶中的DNA片段化研究同样被认为指示了细胞凋亡。多种技术利用了DNA片段化用于标记片段并且因此用于量化凋亡细胞的比例。每个DNA片段具有一个3′-OH末端部分。该末端片段能以不同的方法进行标记(例如，在一个修饰的末端脱氧核苷酰转移酶的帮助下)，从而标记率是与DNA片段化的程度成比例的。

具体地，TdT介导的dUTP缺口末端标记(或TUNEL)是一种用于检测片段化(发生在细胞凋亡过程的最后步骤附近)的DNA的技术。使用酶末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)，凋亡细胞的片段化的DNA在DNA末端的3’-OH处可以结合荧光素-dUTP，形成一个多聚尾(使用TUNEL测定的原理)。标记的DNA然后可以通过荧光显微术直接可视化或通过流式细胞术定量。

一些当前的技术利用膜磷脂中的变化，它发生在凋亡细胞的早期。对于凋亡细胞，暴露于外部环境的带负电的膜磷脂被标有荧光染料结合的分子，因此可以容易地量化荧光细胞的百分比。

细胞凋亡还可以使用荧光染料结合的膜联蛋白V进行检测。膜联蛋白V是一种抗凝蛋白，它优选结合带负电的磷脂类。细胞凋亡过程的早期阶段是膜磷脂不对称性的中断，将磷脂酰丝氨酸(PS)暴露于细胞质膜外叶(outer leaflet)上。荧光结合的膜联蛋白V可以用来检测完整活细胞上的磷脂酰丝氨酸的外化。通常结合碘化丙锭作为一种第二荧光染料以检测坏死的细胞。诱导细胞凋亡导致了半胱天冬酶-3酶原溶蛋白性裂解以产生一种活性的18kDa半胱天冬酶-3片段，它然后靶向细胞凋亡途径的关键调节剂(包括用于裂解的聚-ADP-核糖聚合酶以及其他半胱天冬酶)。在凋亡细胞中用于检测其他活性半胱天冬酶的测定法在本领域中是已知的(例如，Caspase-Glo

Assays，Promega)。

还可以使用活性18kDa半胱天冬酶-3片段作为一个标志物来检测凋亡细胞。诱导细胞凋亡导致了半胱天冬酶-3酶原溶蛋白性裂解以产生一种活性的18kDa半胱天冬酶-3片段，它然后靶向细胞凋亡途径的关键调节剂(包括用于裂解的聚-ADP-核糖聚合酶以及其他半胱天冬酶)。仅识别活性18kDa片段的一些抗体是从商业供应商可得的(例如，BD Biosciences，Chemicon，CellSignaling Technology，Trevigen)。

此外，还可以使用流式细胞术测定法来监测并且量化与凋亡细胞相关的核变化。

用于检测细胞凋亡的抑制的一种示例性测定法在此描述于实例5中。

细胞的细胞保护性激酶的活化还在治疗由受累的组织或器官中的过度的或不想要的凋亡细胞死亡引起的病症(导致了损伤和机能障碍)中具有效用。此类症状除其它之外包括缺血和缺血再灌注损伤。因此，本发明还涉及治疗在哺乳动物个体体内的一种缺血或缺血再灌注损伤的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及治疗在哺乳动物个体体内的一种缺血或缺血再灌注损伤的一种方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式II表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗在哺乳动物个体体内的一种缺血或缺血再灌注损伤的一种方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式III表示的一种化合物：

如在此所使用的，“由缺血导致的损伤”、“由缺血引起的损伤”以及“缺血性损伤”是指由缺血、或血液供应不足(例如，由于动脉阻塞)并且因此氧供应不足引起的细胞、组织或器官的损伤，导致该组织或器官的损害或机能障碍(Piper，H.M.，Abdallah，C.，Schafer，C.，Annals of Thoracic Surgery 2003，75：644；Yellon，D.M.，Hausenloy，D.J.，New England Journal of Medicine 2007，357：1121)。由缺血导致的损伤可以影响不同的组织和器官。可以用本发明的化合物和方法来治疗此类损伤，包括例如，由心血管缺血、脑血管缺血、肾缺血、肝缺血、缺血性心肌病、皮肤缺血、肠缺血(bowel ischemia)、肠缺血(intestinal ischemia)、胃缺血、肺缺血、胰缺血、骨骼肌缺血、腹肌缺血、肢缺血、缺血性结肠炎、肠系膜缺血和无症状心肌缺血(silent ischemia)引起的损伤。因此，由缺血导致的一种损伤可以影响例如心脏、肾、肝、脑、肌肉、肠、胃、肺或皮肤。

在一个具体的实施方案中，由缺血引起的损伤是心肌缺血的结果。由心肌缺血引起的一种损伤可以由例如在个体中的心肌梗死(例如，急性心肌梗死)引起。

在另一个实施方案中，由缺血引起的损伤是由在个体中的脑缺血(例如，中风)引起的。

在另一个实施方案中，由缺血引起的损伤是缺血再灌注损伤。如在此所使用的，术语“缺血再灌注损伤”是指由到一种组织或器官的一个区域的血流量的恢复引起的一种损伤，该组织或器官之前经历了由于缺血事件造成的血流量不足。与再灌注有关的氧化应激可以引起对受累组织或器官的损伤。缺血再灌注损伤的生物化学特征在于缺血事件过程中的氧的耗损，随后是在再灌注过程中的再氧合并且伴随地产生活性氧种类(Piper，H.M.，Abdallah，C.，Schafer，C.，Annals of Thoracic Surgery 2003，75：644；Yellon，D.M.，Hausenloy，D.J.，NewEngland Journal of Medicine 2007，357：1121)。

一种缺血再灌注损伤可以例如通过一种天然事件(例如，心肌梗死之后的血流量的恢复)、一种创伤、或通过一种或多种手术操作或其他恢复一个组织或器官(已经遭受了血液供应的减少)的血流量的治疗介入引起。这些手术操作包括例如冠状动脉旁路移植手术、冠状动脉血管成形术、器官移植手术等等(例如，心肺旁路手术)。在一个具体的实施方案中，本发明的这些化合物和方法对于治疗由一种缺血或缺血再灌注损伤引起的手术期间的心肌损害是有用的。

对于治疗由治疗介入如手术操作引起的缺血或缺血再灌注损伤，优选的是，将本发明的化合物在治疗介入之前给予一个经历治疗的个体(例如，心脏外科手术、器官移植)。例如，可以将本发明的化合物在治疗介入例如大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约12小时、大约24小时、或大约48小时之前给予一个经历治疗的个体。还可以将本发明的化合物在治疗介入例如大约5分钟、大约10分钟、大约15分钟、大约20分钟、大约30分钟或大约45分钟之前给予一个经历治疗的个体。

可替代地，或此外，本发明的化合物可以在治疗介入时或过程中给予一个经历治疗的个体。例如，可以将该化合物在一个治疗介入过程中一次给予或多次给予(例如，间隔15分钟)。可替代地，可以将一种化合物在一个治疗介入期间自始至终连续给予。

此外，可以将本发明的化合物在治疗介入之后给予一个经历治疗的个体。例如，可以将本发明的化合物在治疗介入例如大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约12小时、大约24小时、或大约48小时之后给予一个经历治疗的个体。还可以将本发明的化合物在治疗介入例如大约5分钟、大约10分钟、大约15分钟、大约20分钟、大约30分钟或大约45分钟之后给予一个经历治疗的个体。

本发明的化合物还可以用来在治疗介入之前抑制一种离体细胞、组织或器官(例如，用于移植操作的一种组织、用于器官移植手术中的一个器官)的缺血或缺血再灌注损伤。例如，在一个器官移植到一个宿主个体体内之前(例如，在无菌环境中储存或运输该器官的过程中)，可以使该器官与本发明的化合物进行接触(例如，浸在一种包括本发明的化合物的溶液中)以抑制缺血或缺血再灌注损伤。

如在此所述，由缺血引起的病症，以及由缺血或缺血再灌注引起的损伤可以诱导受累的细胞、组织或器官中的凋亡细胞死亡，导致损伤和机能障碍。因此，本发明的化合物还在抑制一种细胞、一种组织或一个器官(例如，一种移植组织或器官，或个体体内的一种细胞、组织或器官)中的细胞凋亡的方法中具有效用，其中该细胞、组织或器官已经经历了缺血或其他的导致过度的和不想要的细胞凋亡的病症或失调。这些方法包括使这些细胞、组织或器官与一个有效量的由结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐进行接触(或向该个体给予一个有效量的由结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐)：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种抑制在细胞、组织或器官中的细胞凋亡的方法，其中该细胞、组织或器官已经经历了缺血或其他导致过度的和不想要的细胞凋亡的病症或失调，该方法包括向该个体给予一个有效量的由结构式II表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种抑制在细胞、组织或器官中的细胞凋亡的方法，其中该细胞、组织或器官已经经历了缺血或其他导致过度的和不想要的细胞凋亡的病症或失调，该方法包括向该个体给予一个有效量的由结构式III表示的一种化合物：

用于评定细胞、组织或器官中的细胞凋亡的方法在本领域中是已知的并且包括在此所述的那些。

通过本发明的化合物和方法可治疗的与不想要的和/或过度细胞凋亡相关的病症包括但不局限于：与过度细胞凋亡相关的神经变性疾病(例如，帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、癫痫)、与过度细胞凋亡相关的血液病(例如，再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、T CD4+淋巴细胞减少症、G6PD缺乏症)、与过度细胞凋亡相关的组织损伤(例如，心肌梗死、脑血管意外、缺血性肾损伤、多囊性肾病)、AIDS、以及先兆子痫。

缺血再灌注损伤的一个标志是胞质钙水平的升高，产生于缺血事件过程中的氧的耗损(Piper，H.M.，Abdallah，C.，Schafer，C.，Annals of Thoracic Surgery2003，75：644；Yellon，D.M.，Hausenloy，D.J.，New England Journal of Medicine2007，357：1121)。已经假设的是，胞质钙增加与自由基增加的结合触发了细胞凋亡(Chen，X.，Zhang，X.，Hubo，H.，et al.，Circ Res 2005，97：1009；Lopes-Neblina，F.，Toledo，A.H.，Toledu-Pereyra，L.H.J Invest Surg 2005，18：335)。然而，迄今为止，用阻断钙流入的拮抗剂或用活性氧种类清除剂治疗患有急性心肌梗死的患者各自产生了令人失望的临床结果(Yellon，D.M.，Hausenloy，D.J.，New England Journal of Medicine 2007，357：1121)。

此外，通过由Akt活化的促存活途径(pro-survival pathway)，抑制了胞质钙超载(Joseph，S.K.，Hajnoczky，G.，Apoptosis 2007，12：951；Pinton，P.，Rizzuto，R.，Cell Death Diff 2006，13：1409；Khan，M.T.，Wagner，L.II，Yule，D.I.，Bhanumathy，C.，Joseph，.S.K.2006，Akt kinase phosphorylation of inositol1，4，5-triphosphate receptors.J Biol Chem 281：3731)。Akt依赖性信号传导途径还通过调节Bcl-2防止了细胞内钙超载(Raphael，J.，Abedat，S.，Rivo，J.，et al.，JPharmacol Exp Ther 2006，318：186；Thomenius，M.J.and Distelhorst，C.W.，JCell Sci 2003，116：4493)。

因此，诱导Akt活化的本发明的化合物还在降低在一种细胞、组织或器官(例如，在遭受缺血的一个个体体内)中的胞质钙的方法中具有效用。该方法包括向该个体给予一个有效量的由结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种降低在细胞、组织或器官中的胞质钙的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式II表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种降低在细胞、组织或器官中的胞质钙的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式III表示的一种化合物：

用于检测胞质钙水平的一种示例性测定法在此描述于实例6中。

本发明的化合物还展示出增强的对于过氧化自由基的吸收能力。生物有机体在如脑、心脏、肺、以及肌肉组织的组织的正常代谢活动过程中产生了有害的活性氧种类(ROS)以及各种自由基(Halliwell，B.and Gutteridge，J.M.C.，eds.(Oxford：Clarendon Press，1989))。在最近几年可观地形成了在许多种重要疾病和药物副作用中ROS和自由基的作用的认识。多项研究证明，大量的疾病状态和治疗药物的有害副作用是与一个个体的抗氧化防御系统(跟得上产生ROS和各种自由基的速率)的失效相关联的(参见例如Chan，et al.，Adv.Neurol.，1996，71：271-279；DiGuiseppi，J.and Fridovich，I.，Crit.Rev.Toxicol.，1984，12：315-342)。例如，在中风过程中由缺血引出的缺氧或在心肌梗死过程中在心肌中产生的缺氧的条件下，发现了异常高的ROS水平(参见例如Walton，M.et al.，Brain Res.Rev.，1999，29：137-168；Pulsinelli，W.A.et al.，Ann.Neurol.，1982，11：499-502；Lucchesi，B.R.，Am.J.Cardiol.，1990，65：141-231)。此外，ROS和自由基的升高可能与肾移植之后的再灌注损伤相关联。

因此，ROS和自由基的升高与在许多疾病中发展的进展和并发症、药物治疗、创伤、以及退行性病症(包括年龄相关性氧化应激诱导的损伤、迟发性运动障碍、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、退行性眼病、脓毒性休克、头和脊髓损伤、阿尔茨海默病、溃疡性结肠炎、人白血病和其他癌症、以及糖尿病)相关联(参见，例如Ratanis，Pharmaceutical Executive，pp.74-80(April 1991))。

例如，已知在细胞和组织中在缺血事件之后的再灌注过程中产生了升高水平的ROS和自由基。此类增加水平的ROS和自由基可能引起相当大的对于已经应激的或衰弱的器官和组织的损伤。显示出过氧化自由基吸收能力的本发明的化合物可以用于治疗在疾病和病症如中风、心脏病发作、或肾脏病和肾移植中出现的再灌注损伤之后呈现的高水平的有害自由基。如果已经发生了缺血事件，如在中风和心脏病发作中，可以向个体给予在此所述的一种化合物以使已经呈现在血液和受累组织或器官中的升高的ROS和自由基解毒。

可替代地，如果预料到如在器官移植或可能导致缺血性损伤或缺血再灌注损伤的其他操作(例如，冠状动脉旁路移植手术、冠状动脉血管成形术、心肺旁路手术)中的缺血事件，那么可以将在此所述的这些化合物在操作或缺血事件之前以在此所述的给药间隔预防性地给予以增强所要求的化合物的疗效。

在此所述的这些化合物可以用于治疗与不希望的水平的ROS和自由基相关的任何疾病或病症，或用于预防由不希望的水平的ROS和自由基引起的任何疾病、失调或病症。根据本发明，还可以给予在此所述的这些化合物以提供对于与以下多种其他疾病和病症相关的升高的ROS和自由基的治疗性的或预防性的治疗，这些疾病和病症包括但不局限于：早产儿中的氧中毒、组织和器官的烧伤和物理创伤、脓毒性休克、多发创伤性休克(polytraumatous shock)、头部创伤、脑外伤、脊髓损伤、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、年龄相关性ROS和自由基升高、衰老、溃疡性结肠炎、人白血病和其他癌症、唐氏综合征、关节炎、黄斑变性、精神分裂症、癫痫、辐射损伤(包括紫外线诱导的皮肤损伤)、以及药物诱导的ROS和自由基升高。

由于ROS和自由基的形成的氧化应激的进行性上升还可以发生在老化过程中(参见例如Mecocci，P.et al.，Free Radio.Biol.Med.，2000，28：1243-1248)。这已经通过发现大鼠组织(Erdincler，D.S.，et al.，Clin.Chim.Acta，1997，265：77-84)以及老年人类患者的血细胞(Congi，F.，et al.，Presse.Med.，1995，24：1115-1 118)中的脂质过氧化物形成的增加而检测到。因此，能够吸收过氧化自由基的在此所述的化合物同样很好地适合用于预防和/或消除组织损伤的增加和预期寿命的降低(由于伴随老化过程的ROS和自由基水平的升高)的方法中。

因此，本发明的这些化合物在治疗由有害的活性氧种类(ROS)和其他自由基引起的病症和失调中具有效用。因此，本发明进一步涉及增加在个体(例如，遭受缺血的个体)的一种组织中的过氧化自由基吸收的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式I表示的一种化合物或它的一种药学上可接受的盐：

其中R¹和R²各自独立地是H或一个可水解基团。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种增加在个体的一种组织内的过氧化自由基吸收的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式II表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种增加在个体的一种组织内的过氧化自由基吸收的方法，包括向该个体给予一个有效量的由以下结构式III表示的一种化合物：

用于检测过氧化自由基吸收的一种示例性测定法在此描述于实例7中。检测自由基吸收的其他方法描述于美国专利号6,890,896中，将其内容通过引用结合在此。

被本发明的化合物活化的Akt激酶在治疗由细胞中降低的或不足的Akt活性引起的症状(包括但不局限于缺血性损伤)中具有效用。适合于使用本发明的这些化合物和方法治疗的由AKT活性的降低产生的病症包括，例如：以血管化不足为特征的疾病或失调(例如，糖尿病性溃疡、坏疽、需要新生血管形成以促进愈合的创伤、伯格氏综合征、高血压、以微脉管系统的减少为特征的病症)、以及某些神经疾病或失调(例如，帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁、焦虑、躁狂抑郁症、创伤后应激障碍、轻度认知损害(MCI)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑退行性疾病、多发性硬化(MS)、皮克病、精神分裂症、焦虑性神经症、强迫性神经症、头部创伤、脊髓损伤、脑血管障碍、脑血管痴呆、无症状脑梗死、多聚谷氨酰胺疾病、朊病毒病、皮质延髓神经节退行性变、进行性核上性麻痹、AIDS脑病、肌肉萎缩症、糖尿病性神经病变)。

可以使用本发明的这些化合物和方法治疗的由Akt活性的降低引起的其他病症包括但不局限于：糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、肝硬化、酒精性肝炎、以自我再生能力降低为特征的老年病、非代谢性骨病、代谢性骨病、关节疾病、牙周病、巨细胞病毒感染、类风湿性关节炎、莱姆病、痛风、脓毒综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、牙周病、肾小球肾炎、慢性非感染性肺部炎症、肉样瘤病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥、移植物抗宿主病、慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、肿瘤性疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖性糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、银屑病、慢性B淋巴细胞性白血病、常见变异型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、系统性硬化病、脑脊髓炎、肺部炎症、高IgE综合征、癌症转移、癌瘤生长、过继性免疫疗法、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症、器官移植、以及脱发。

由AKT活性的降低引起的AKT介导的失调还披露于US 2004/0122077；US 2006/0241168；以及US 2007/0219139中，将它们的内容通过引用结合在此。

在此披露的药物制剂是根据标准步骤制备的并且是以被选择以减少、防止、或消除、或减慢或停止被治疗的病症的进展的剂量而给予的(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA，以及Goodman and Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，N.Y.，将其内容通过引用结合在此，用于一般性描述针对给予不同的药剂用于人类治疗的方法)。由所披露的化合物表示的一种化合物的组合物可以使用控制释放的或持续释放的递送系统(例如，胶囊，可生物降解的基质)来递送。适合用于给予所披露的化合物的组合物的用于药物递送的示例性的缓释递送系统描述于美国专利号US 5,990,092(颁发给Walsh)；5,039,660(颁发给Leonard)；4,452,775(颁发给Kent)；以及3,854,480(颁发给Zaffaroni)，将它们的所有传授内容通过引用结合在此。

为了从本发明的这些化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体抑或液体。固体形式制剂包括粉末、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂、以及可分散粒剂。例如，本发明的这些化合物可以处于用于在递送时复原的粉末形式。一种固体载体可以是还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂、或一种包封材料的一种或多种物质。在粉末中，该载体是精细分割的固体，它是在具有精细分割的活性成分的混合物中。

在片剂中，该活性成分是与具有必需的粘合特性的载体以适当的比例混合的并且以所希望的形状和大小紧密结合。

这些粉末和片剂优选含有从大约百分之一至大约百分之七十的活性成分。适合的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、一种低熔点蜡、可可脂、等等。片剂、粉末、扁囊剂、锭剂、速熔条(fast-melt strip)、胶囊和丸剂可以用作适合口服给予的含有活性成分的固体剂型。

液体形式制剂包括溶液、悬浮液、保留灌肠剂、以及乳液，例如水或水丙二醇溶液。对于注射剂，可以在水性聚乙二醇溶液中将液体制剂配制成溶液。

适合用于口服给予的水溶液可以通过将活性成分溶解在水中并且加入适合的着色剂、调味剂、稳定剂、以及增稠剂(如所希望的)来制备。用于口服给予的水性悬浮液可以通过将精细分割的活性成分分散在具有粘性材料的水中来制备，这些粘性材料如天然或合成的胶质、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、以及其他所熟知的助悬剂。

该药物组合物是优选处于单位剂量的形式。以这种形式，该组合物被再分成含有适当量的活性成分的单位剂量。该单位剂型可以是一种包装的制品，该包装含有例如在小瓶或安瓿中的不连续量的片剂、粉末、以及胶囊。同样，该单位剂型自身可以是一种片剂、扁囊剂、胶囊剂、或锭剂，或它可以是适当量的处于包装形式的任何这些。在单位剂量制剂中的活性成分的量可以在从大约0.1mg到大约1000.0mg、优选从大约0.1mg到大约100mg(例如，用于静脉给药)或从大约1.0mg到大约1000mg(例如，用于口服给药)的范围变化或调节。然而这些剂量可以根据患者的要求、所治疗的病症的严重性、所采用的化合物和给药途径而变化。针对具体情况的适当剂量的确定在本领域的技术之内。同样，该药物组合物可以包含(如果希望的话)其他的相容的治疗剂。

通常，用于在体内递送本发明的所披露的化合物和药物组合物的方法利用了本领域公认的用于递送药剂的方案，仅有的实质性程序改变是用由所披露的化合物中的任何一种表示的化合物替换本领域公认的方案中的药物。

本发明的这些化合物可以通过任何途径给予，优选处于适合于这种途径的一种药物组合物的形式，并且将取决于所治疗的病症。这些化合物和组合物可以例如血管内、肌内、皮下、腹膜内、口服或局部给予。对于本领域的普通技术人员显而易见的是，以下剂型可以包括或者本发明的化合物抑或一种化合物的药学上可接受的相应的盐作为活性成分。对于本发明的这些化合物，一种优选的给予方法是静脉给药。

在一些实施方案中，该组合物可以经由注射肠胃外地给予。肠胃外给药可以包括例如关节内、肌内、静脉内、心室内、动脉内、鞘内、皮下、或腹膜内给药。用于肠胃外给药的配制品可以处于水性或非水性等渗的无菌注射溶液或悬浮液的形式。这些溶液或悬浮液可以从无菌粉末或粒剂来制备，这些无菌粉末或粒剂具有提及的一种或多种使用于口服给予的配制品中的载体。可以将这些化合物溶解在聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苯甲醇、氯化钠、和/或各种缓冲剂(例如，碳酸氢钠、氢氧化钠)中。

对于口服给药，这些药物组合物可以处于例如一种片剂、胶囊剂、悬浮液或液体的形式。该组合物优选是以一种含有一个治疗有效量的活性成分的剂量单位的形式来制作的。此类剂量单位的实例是片剂和胶囊剂。出于治疗目的，这些片剂和胶囊剂除了活性成分之外还可以含有常规的载体，如粘合剂，例如阿拉伯胶、明胶、聚乙烯吡咯酮、山梨糖醇、或黄蓍胶；填充剂，例如磷酸钙、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨糖醇、或蔗糖；润滑剂，例如硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化硅、或滑石；崩解剂，例如马铃薯淀粉、调味剂或着色剂、或可接受的湿润剂。通常处于水性或油性溶液、悬浮液、乳液、糖浆、或酏剂的形式的口服液体制剂可以包含常规添加剂，如助悬剂、乳化剂、非水性试剂、防腐剂、着色剂以及调味剂。用于液体制剂的添加剂的实例包括阿拉伯胶、杏仁油、乙醇、分馏椰子油、明胶、葡萄糖浆、甘油、氢化食用脂肪、卵磷脂、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、丙二醇、山梨糖醇、或山梨酸。

对于局部应用，本发明的化合物还能以施用到皮肤、或鼻和咽喉粘膜上的适合的形式来制备，并且可以采取乳膏剂、软膏、液体喷雾剂或吸入剂、锭剂、或涂咽剂的形式。这些局部配制品可以进一步包括化合物如二甲基亚砜(DMSO)以协助活性成分的表面渗透。适合于局部给药的载体包括水包油或油包水乳剂(使用矿物油、凡士林等等)以及凝胶剂如水凝胶。可替代的局部配制品包括洗发香波制剂、口服糊剂以及口腔清洗剂。

对于施用到眼或耳，本发明的化合物能以在疏水基或亲水基中配制的液体或半液体形式提供，如软膏、乳膏剂、洗剂、涂剂或粉末。

对于直肠给药，本发明的化合物能以与常规载体如可可脂、蜡或其他甘油酯混合的栓剂的形式给予。对于制备栓剂，首先将一种低熔点蜡(如脂肪酸甘油酯的混合物)或可可脂熔化并且将活性成分如通过搅拌均匀分散到其中。然后将熔化的均匀的混合物倒入常规大小的模具中，允许冷却，并且由此进行固化。

递送还可以是通过注射或通过使用一种定时释放或持续释放基质递送系统进入病人的脑或体腔中，或通过使用微粒、凝胶和脂质体的现场递送。喷雾装置、粉末吸入装置、以及雾化溶液是可以用于将这些制剂给予到呼吸道中的方法的代表。递送可以是在体外的、体内的、或离体的。

例如，对于本发明的化合物适合的静脉内剂量可以是(每治疗按体重计)从大约0.001mg/kg至大约100mg/kg、从大约0.01mg/kg至大约100mg/kg、从大约0.01mg/kg至大约10mg/kg、从大约0.01mg/kg至大约1mg/kg。针对一种具体的药剂、病人以及缺血或缺血再灌注损伤来确定剂量和给药途径是在本领域普通技术人员的能力之内的。优选地，该剂量不引起或产生最小的不良副作用。

可以单独地、或与一种或多种其他治疗剂联合给予一个治疗有效量的本发明的化合物。可以与本发明的化合物联合给予的对于治疗缺血性损伤有用的适合的治疗剂包括但不限于：钙通道阻滞剂类、β阻滞剂类、硝酸甘油、阿司匹林、抗炎剂类、利钠因子类、血管扩张剂类、血栓溶解以及抗血栓形成剂类。

因此，本发明的化合物可以作为联合治疗的一部分来给予(例如，与一种或多种其他治疗剂联合)。本发明的化合物可以在一种或多种其他治疗剂之前、之后或与之同时给予。在一些实施方案中，本发明的化合物以及其他治疗剂能够作为分开配制品抑或作为结合配制品同时地(例如同时发生地)共同给予。可替代地，这些药剂能够在适当的时间范围内(由熟练的临床医师确定(例如，足以允许这些治疗的药物作用重叠的时间))作为分开的组合物依次给予。本发明的化合物和一种或多种其他治疗剂能够以单剂或以多剂、以一定顺序并且按照适合于实现所希望的治疗效果的时间表来给予(例如，减轻和/或抑制关节炎症、减轻和/或抑制缺血、减轻和/或抑制缺血性损伤、减轻和/或抑制缺血再灌注损伤)。适合的给药剂量和方案可以由临床医生确定并且取决于选择的一种或多种药剂、药物配方和给药途径、各种病人因素以及其他考虑因素。

如在此说明的，本发明是进一步基于这个令人惊讶的发现，即相对于本发明的化合物的单剂给药而言，以非标准的延长给药间隔给予多剂的该化合物可以增强该化合物用于治疗缺血性损伤或缺血再灌注损伤的疗效。因此，在某些实施方案中，本发明涉及用于治疗对其有需要的个体体内的缺血性损伤或缺血再灌注损伤的一种方法，包括向该个体给予多个(例如2个或更多个)剂的本发明的化合物。在一个具体的实施方案中，该方法包括在缺血性损伤或缺血再灌注损伤之前向该个体给予至少两剂的本发明的化合物或它的一种药学上可接受的盐，其中这些剂包括一个非最终剂以及一个最终剂。如在此使用的，“最终剂”是指在缺血性损伤或缺血再灌注损伤之前给予该个体的本发明的化合物的最后剂。优选地，该最终剂即刻在损伤之前给予。如在此使用的，与“最终剂”以及“损伤”相关联的术语“即刻”表示在时间上接近或非常接近，其中在该最终剂与该损伤之间没有插入剂。如在此定义的，“即刻在损伤之前”是指在该损伤之前大约0分钟(例如，在该损伤开始时)至大约2小时的范围内的一个时间点。用于给予最终剂的示例性时间点包括例如在损伤之前大约5分钟、大约10分钟、大约15分钟、大约30分钟、大约45分钟、大约60分钟、以及大约90分钟。

术语“非最终剂”是指在最终剂之前的本发明的化合物的一个剂，其中在该非最终剂与最终剂之间没有向该个体给予该化合物的插入剂。通常地，该非最终剂能够在损伤之前大约48小时之内的一个时间点给予个体，优选在损伤前大约24小时之内，更优选在损伤前大约12小时之内(例如，在损伤前大约10小时、大约8小时、大约6小时、或大约4小时)。

根据本发明，该非最终剂和该最终剂是以这样的给药间隔来给予的，即相对于单剂给予该化合物而言该给药间隔增强了该化合物用于治疗损伤的疗效。如在此使用的，术语“增强”表示提高或增加一种药物的效果，或表示促进或加强一种药物的生物化学或生理学作用或效应。如在此使用的，用语“增强该化合物的疗效”表示提高或增加个体体内该化合物的生物化学或生理学作用或效应，特别是当它涉及正在探寻其治疗方法的缺血性损伤或缺血再灌注损伤的一种或多种症状的治疗时。

典型地，药理学药剂的疗效与它的血浆浓度直接相关，其中疗效随着血浆浓度下降而降低。因此，在标准的多次给药方案中，根据被设计为维持经历治疗的个体的体内预定的或最佳的血浆浓度的剂量日程表来给予一种药理学药剂。当该药剂以长于最佳的一个或多个间隔的给药间隔给药时，在给予下一剂之前它的血浆浓度可以下降到所不希望的低水平，其中伴随着疗效的降低。然而，如在此所述的，以比标准间隔长得多的给药间隔(例如，以该化合物的至少大约4个半衰期的给药间隔)给予多剂的本发明的化合物出乎意料地增强了该化合物的疗效。

本领域的普通技术人员可以容易地通过使用针对正在测量的该一个或多个参数的标准测定法通过测量在治疗该个体之前以及之后在该个体体内的生物化学或生理学参数来评定一种化合物用于治疗缺血性损伤或缺血再灌注损伤的疗效。例如，可以通过分析在缺血性损伤或缺血再灌注损伤之前和之后不同时间点处从个体获得的血样中的替代心脏生物标记(包括某些心脏酶类(例如肌酸激酶(CK-MB)、肌钙蛋白-T、肌钙蛋白-I))的水平来确定本发明的化合物的疗效，其中这些酶的水平的统计显著性降低表明该化合物在治疗该损伤方面具有疗效。在一个示例性评定中，在损伤之前(例如，在损伤之前大约6小时至大约48小时)从个体采集一个或多个血样并且针对CK-MB和肌钙蛋白-T的水平进行分析。然后在损伤之后的不同时间点(例如在损伤后6.0、12.0、18.0、以及24.0小时)从个体获得血样并且在这些样品的一个或多个中对CK-MB和肌钙蛋白-T的水平进行分析。

还可以通过心电图(ECG)监测来确定本发明的化合物的疗效。例如，在给药之前(例如，在给药之前约5分钟)在为该个体装配具有电子数据存储的连续12导联ECG监测设备之后可以进行标准的连续12导联ECG监测。然后可以获得在损伤之前和之后的ECG读数(例如，直至损伤之后大约24小时)。从异常ECG图到正常ECG图的改变(例如，升高的ST段的降低)表明该化合物在治疗该损伤方面具有疗效。

此外，如在此实例8中所述，还可以通过确定心肌梗死面积(MI)与处于风险的缺血面积(AR)的比率来评定本发明的化合物的疗效，其中MI/AR比率的统计显著性降低表明该化合物在治疗损伤方面具有疗效。

使用任何适合的疗效的量度，包括上述的那些(例如，心脏酶水平、ECG图、MI/AR比率)，本领域的普通技术人员可以确定当该化合物以多剂给药时该化合物的疗效相对于单剂给药是否是更大的。例如，可以将针对多次给药方案的一种化合物的疗效的量度与它的使用相同路径的单剂给药疗效的相应的量度进行比较。当以单剂给予时，对于给定剂量数值(例如，5.0mg/kg静脉内)的相应的疗效测量值可以是例如基于先前的人群研究(例如，临床试验)的一个典型的或标准的疗效测量值。可替代地，可以在针对相同损伤的正在治疗的另一个病人体内实验性地确定给定剂量化合物的单剂给药的疗效。

更具体地说，可以使用遵循测量这些参数的标准实验方案的临床研究数据来确定在给定人群(例如，包括需要治疗的个体(如，经受在此所述的某些手术操作的病人)的人群)中用于增强本发明的化合物疗效的适合剂量和给药间隔。个体或个体群体的测量参数的统计显著性降低或增加表明一或多剂和给药间隔增强了该化合物用于治疗缺血损伤或缺血再灌注损伤的疗效。

相对于该化合物的单剂给药，在多次给药方法中增强本发明的化合物的疗效的在非最终剂与最终剂之间的给药间隔典型地是至少大约4小时长度，例如，在大约4小时至大约12小时的范围内，优选地大约4小时至大约8小时，更优选地大约4小时至大约6小时。

如上所述，药理学药剂的疗效通常与它的血浆浓度相关联，其中疗效随血浆浓度的下降而降低。因为，化合物的血浆浓度是与它的半衰期直接相关的，通常使用化合物的半衰期来确定适当的用于维持经历治疗的个体体内预定的或最佳的血浆浓度的给药间隔。因此，还可以根据化合物的半衰期来定义用于增强化合物疗效的给药间隔。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗对其有需要的个体体内缺血性损伤或缺血再灌注损伤的一种方法，包括在损伤之前向该个体给予两剂的本发明的化合物或它的一种药学上可接受的盐，其中这两剂包括一个非最终剂以及一个最终剂，并且其中：

(a)在该损伤之前在该化合物的大约2个半衰期之内的一个时间点向该个体给予最终剂；以及

(b)在给予该最终剂之前在该化合物的至少大约4个半衰期的一个时间点向该个体给予非最终剂。

优选地，在损伤之前在该化合物的大约0.25个半衰期至大约2个半衰期的范围内(更优选在损伤之前在该化合物的大约0.25至大约1个半衰期)的一个时间点向该个体给予该化合物的最终剂。因此，可以在损伤之前在该化合物的大约0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75或大约2.0个半衰期时向该个体给予该最终剂。

在给予该最终剂之前在该化合物的至少大约4个半衰期，包括但不限于在给予该最终剂之前大约4个半衰期、大约5个半衰期、大约6个半衰期、大约7个半衰期、大约8个半衰期、大约9个半衰期、大约10个半衰期、大约12个半衰期、大约15个半衰期、大约20个半衰期、以及大约30个半衰期的一个时间点向该个体给予非最终剂。出于在此所述的原因，示例性的间隔比典型地用于标准给药方案中的那些更长。

化合物的半衰期是该化合物的浓度降到它的(初始)最大值的一半(50％)所需要的时间的量度并且本领域的普通技术人员可以使用标准方法来确定。因此，例如，在1个半衰期时，化合物的相对浓度是其初始浓度(即时间0)的50％，而在2个半衰期时，该化合物以其初始浓度的25％存在；在3个半衰期时，该化合物以其初始浓度的12.5％存在；在4个半衰期时，该化合物以其初始浓度的6.25％存在；在5个半衰期时，该化合物以其初始浓度的3.12％存在；在6个半衰期时，该化合物以其初始浓度的1.56％存在，等。因此，化合物的半衰期用作在已经给予该化合物的个体的血液中其浓度的下降速率的量度。

在一个一级过程(first order process)中，半衰期计算如下：

t_{1 / 2} = \frac{Ln 2}{k} = \frac{0.693}{k}

其中k是任何一个一级速率常数。

本领域的普通技术人员可以例如通过向个体给予该化合物，在给予该化合物之后在不同时间点从个体获得血样，分析血液中的该化合物的水平和/或浓度(例如，通过质谱法)并且使用任何适合的软件程序或算法处理数据，由此确定本发明的化合物的半衰期。例如，可以容易地使用WinNolin

软件产品(Pharsight

Mountain View，加利福尼亚州)来计算化合物的半衰期和其他PK参数。

可以使用遵循测量半衰期的标准实验方案的来自临床研究的数据来确定在此所述的任何化合物的半衰期。临床医生或医师可以使用这种信息来确定适合的增强化合物用于治疗缺血性损伤或缺血再灌注损伤的疗效的一或多剂以及一个或多个给药间隔。

在实例12和13中的表15-17中，在此说明了在大鼠和人类体内不同剂量的化合物RLip-EA-OH的半衰期。

优选地，在给药后，在给予最终剂的时间点从个体获得的血样(例如，血清、血浆、全血)中，本发明的化合物或它的药学上可接受的盐的浓度是小于或等于其最大浓度(C_max)或观察的血浆(或血液)水平最大值的大约10％。例如，在给予该最终剂的时间从个体获得的样品中，该化合物或它的药学上可接受的盐的浓度可以是其最大浓度(C_max)的大约0％、大约1％、大约2％、大约3％、大约4％、大约5％、大约6％、大约7％、大约8％、大约9％或大约10％。例如，通过从给予了该化合物的个体采取血样，并且然后使用适当的分析方法(例如，质谱法)针对该化合物的浓度对这些样品进行分析，由此可以确定化合物的C_max。使用获得的数据，典型地使用适合的算法或软件程序(例如，WinNolin

软件产品(Pharsight

Mountain View，加利福尼亚州))来计算C_max。在个体体内的该化合物的C_max可以容易地由熟练的临床医生或医师实施而确定。

在一个实施方案中，该非最终剂和最终剂是相等的。可替代地，该非最终剂和最终剂的在量方面(例如，非最终剂为大约1.0mg/kg并且最终剂为大约0.5mg/kg，其中这两剂是静脉提供的)和/或在给药途径方面(例如，静脉内给予非最终剂并且心内给予最终剂)可以不同。优选地，以大约0.5mg/kg至大约5.0mg/kg范围内的一个剂量静脉地向个体给予该非最终剂和最终剂。给予本发明的化合物的其他优选途径包括例如心内(IC)、腹膜内(IP)以及口服(PO)。如在此所说明的，当静脉给予(通过静脉推注和通过输注)、口服给予以及通过心内给予时，化合物RLip-EA-OH在I/R损伤的大鼠模型中是有效的。

提供给个体的本发明的化合物的剂量可以依赖于病人的要求、正在治疗的病症的严重性、给药途径以及正在使用的化合物而改变。针对具体情况的适当剂量的确定在本领域的技术之内。例如，可以根据在动物(例如，大鼠)模型上进行的实验中所获得的数据外推给予人类的适合剂量。用于将非人类动物模型剂量数据外推到人类剂量上的指南可以例如在FDA Draft Guidance：Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in AdultHealthy Volunteers(2005)中找到。

在某些实施方案中，在此所述的本发明的多次给药方法还可以包括给予一个或多个另外剂的本发明的化合物的步骤。这种另外的剂可以在该非最终剂与最终剂(即，在非最终剂之前)之前但不在它们之间给予。这种之前的剂典型地是在损伤之前大约7天之内，例如损伤之前大约6天之内，大约5天之内，大约4天之内，大约3天之内，大约2天之内或大约1天之内给予。在多次给药方案中在给予非最终剂之前，用于给予本发明的化合物的其他适合的时间点包括但不限于：在损伤之前大约18小时、大约15小时、大约12小时、大约10小时以及大约8小时。

可替代地，或另外地，在缺血性损伤或缺血再灌注损伤已经发生之后，在本发明的一个多次给药方案中可以向该个体给予一个或多个剂的化合物。在缺血性损伤或缺血再灌注损伤之后，适合的用于给予多剂的本发明的化合物的时间点包括之前在此说明的那些，例如在损伤之后大约1小时、大约2小时、大约3小时或大约4小时。

因此，能够以2或更多剂向对其有需要的个体给予本发明的化合物，像例如2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂、8剂、9剂或10剂。这些剂可以跨越缺血性损伤或缺血再灌注损伤之前的大约7天至缺血性损伤或缺血再灌注损伤之后的大约7天的一个时期，优选地在缺血性损伤或缺血再灌注损伤之前的大约2天至缺血性损伤或缺血再灌注损伤之后的大约1天的范围内。

该非最终剂之前和/或损伤之后的另外剂可以按照与该非最终剂和最终剂相同的给药间隔和/或给药途径来给予或可以按照与该非最终剂和最终剂不同的给药间隔和/或给药途径来提供。例如，能够以三剂向对其有需要的个体给予本发明的化合物，其中在损伤之前8小时(即，在非最终剂之前的另外剂)、5小时(即，非最终剂)和0.25小时(即，最终剂)提供这些剂。

类似地，在该非最终剂之前或该损伤之后给予的这些另外剂的每一个能够以等于该非最终剂或最终剂的一个剂抑或以一个或多个其他的不同剂来提供。例如，能够以三剂(包括一个非最终剂、一个最终剂以及一个另外剂)向对其有需要的向个体给予本发明的化合物，其中该非最终剂和最终剂是以0.5mg/kg静脉提供的并且该另外剂是以1.0mg/kg静脉提供的。

确定针对本发明的具体化合物、病人以及缺血或缺血再灌注损伤的适当的多次给药方案完全在本领域的普通技术人员的能力之内。

实例

实例1：化合物的合成

材料与方法：

RLip-EA-OH(Lip-EA)的合成

将R硫辛酸(RLip-OH，1.00g)溶于二噁烷中。通过用箔片覆盖反应烧瓶来保护该溶液免受直射光。依次加入DIEA(0.845mL)和DSC(1.24g)并且将该反应物在室温下搅拌、通风过夜从而在原位形成Lip-NHS。制备谷氨酰丙氨酸(H-EA-OH，1.11g)和DIEA(2.65mL)的一种水溶液并且加入Lip-NHS的溶液中。将合并的溶液搅拌过夜并且然后转移到一个分液漏斗中。将乙酸乙酯随后5％KHSO₄(含水)加入该反应混合物中。收集有机相并且用5％KHSO₄(含水)随后用饱和NaCl(含水)洗涤。再次收集有机相，用无水Na₂SO₄干燥并且在过滤之后真空蒸发从而产生粗制的RLip-EA-OH，为一种浅黄色泡沫。将粗制泡沫的一部分溶解，用2∶1水乙腈(0.5％HOAc)通过RP-HPLC来纯化，并且使用在水(0.5％乙酸)中的逐渐增加的乙腈(0.5％乙酸)的一个梯度在YMC Pack Pro C18反相柱上分离产物。通过分析型HPLC来鉴定包含产物的馏分、收集、冷冻、并且冻干从而以100％HPLC纯度(220nm处面积％)提供RLip-EA-OH(165mg)。该产物NMR与结构一致并且具有405(M-1)的观测质量(observed mass)，计算值为406。

使用类似步骤制备R/SLip-EA-OH和SLip-EA-OH。获得了光学纯的RLip-OH和SLip-OH起始材料，用于对应地制备RLip-EA-OH和SLip-EA-OH。光学纯度是通过旋光度测定的并且符合放行规格。通过MS、HPLC保留时间漂移(相对于Lip-OH起始材料)并且在大多数情况下用NMR来确认产物结构和特征。表1中包含了在此所述的这些化合物的化合物结构、名称、以及适当的缩写。表2中显示了在这个实例中所述的这些化合物的分析数据。

RLip-OH是商业获得的(Labochim，米兰，意大利)。通过合约获得R/SLip-Ea-OH和Ac-EA-OH。

RLip-EA-OH(Lip-EA)的二赖氨酸盐的制备

将RLip-EA-OH(20.0g)溶于乙醇水(19∶1)中。将两个当量的赖氨酸(14.4g)加入RLip-EA-OH的乙醇溶液中并且将该浆料加温至回流。在回流30分钟之后，允许将溶液冷却至室温。通过过滤回收RLip-EA-OH的产物二赖氨酸盐，用无水乙醇洗涤并且干燥至恒重(对于RLip-EA-OH的二赖氨酸盐的回收率为96％)。

表1.化合物缩写、结构、以及化学名。

^*标准命名法用于天然氨基酸以及常用的类似物[J.Biol.Chem.1972，247：977-983]；硫辛酰基＝1，2-二硫戊环-3-戊酰基

表2.表1中列出的化合物的分析数据。

^*在甲醇(d₄)抑或DMSO(d₆)中获得¹H NMR

^#在λ＝220nm处的面积百分比

商购或通过合约购买的，来自分析证明书的分析数据。

NA＝不可获得。

实例2：RLip-EA-OH治疗在培养细胞中以剂量依赖方式诱导Akt磷酸化/活化

Akt是通过活化通过细胞质膜中已知受体的信号转导路径经由磷酸化而活化的。用特异性抗体易于在原位检测在固定并透膜的(permeabilized)细胞中的磷酸化Akt。_＜0

材料与方法：

用于Akt活化的细胞印迹测定

使用细胞内蛋白质印迹(in-cell western blot)、或细胞印迹来测定RLip-EA-OH的增加磷酸化Akt的能力。选择A549细胞(人非小细胞肺癌细胞系)，因为可以操作这些细胞来增加或降低磷酸化Akt的水平。将这些细胞接种到培养平板上并且允许粘附到底部、然后处理、固定、并且使其透膜。在透膜之后，用对磷酸化Akt或总Akt具有特异性的抗体来处理这些细胞。然后用荧光第二抗体来处理这些细胞从而对结合的第一抗体的量进行定量。同时检测总Akt和磷酸化Akt。

在70％会合时将A549细胞铺板于384孔黑壁、透明底、细胞培养物处理的微孔板中。将这些细胞孵育过夜从而允许细胞附着。将培养基改变成低血清(0.1％，胎牛血清[FBS])并且将这些细胞孵育另外的24小时。用测试化合物来处理这些细胞，固定并且使其透膜用于Akt测定。固定剂是在磷酸盐缓冲盐水中的3.7％甲醛。透膜缓冲液是在磷酸盐缓冲盐水中的0.5％Triton X-100。在细胞透膜之后，在7个测试浓度下(每个浓度进行一式四份)确定在这两个磷酸化位点(苏氨酸-308和丝氨酸-473)之一上的总Akt和磷酸化Akt的量。针对总Akt将磷酸化Akt数据归一化并且减去背景用于分析。

在过夜血清饥饿以降低基础Akt磷酸化之后，用载体、RLip-EA-OH、或RLip-OH来刺激这些细胞。将细胞处理45分钟或3小时并且对应地针对在丝氨酸-473或苏氨酸308上的磷酸化进行研究。

磷酸化Akt的免疫组织化学测定

通过免疫细胞化学随后使用显微镜目测来测定RLip-EA-OH在H9c2细胞中增加磷酸化Akt的能力。H9c2细胞是从大鼠心肌细胞衍生的一个细胞系，并且可以操作以增加或降低磷酸化Akt的水平。将这些细胞接种到培养平板上并且允许粘附到底部、处理、固定、并且使其透膜。在透膜之后，最初用特异性磷酸化Akt抗体紧接着用荧光第二抗体来处理细胞从而对结合的第一抗体的量进行定量。

在70％会合时将H9c2细胞铺板于12孔细胞培养物处理的板上。将这些细胞孵育过夜以允许细胞附着。将培养基改变成低血清(0.5％，胎牛血清[FBS])并且将这些细胞孵育另外48小时。用载体、RLip-EA-OH(50μM)抑或与LY294002(25μM)一起共处理将细胞处理3小时，用在磷酸盐缓冲盐水中的3.7％甲醛固定并且用在磷酸盐缓冲盐水中的0.5％Triton X-100使其透膜。在透膜之后，用对于在苏氨酸-308处磷酸化的Akt具有特异性的抗体来处理这些细胞，紧接着用一种荧光标记第二抗体处理。

结果：

相对于总Akt，使用如所述的细胞印迹测定法评定了在A549细胞中RLip-EA-OH和RLip-OH对Akt磷酸化的影响。在对应地用RLip-EA-OH和RLip-OH处理45分钟之后观察到磷酸化Akt(在丝氨酸473处)的3倍和2倍增加(图2)。相对于总Akt，RLip-EA-OH和RLip-OH两者以剂量依赖方式增加了磷酸化Akt的量。在多数剂量水平下RLip-EA-OH比RLip-OH更有效。

还评估了在存在和缺乏LY294002(一种已知的磷脂酰肌醇-3’-激酶抑制剂(Vlahos，C.J.，Matter，W.F.，Hui，K.Y.，Brown，R.F.A specific inhibitor ofphosphatidylinositol 3-kinase，2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one(LY294002).J Biol Chem 1994，269：5241-5248))下的RLip-EA-OH处理。将这些细胞处理3小时并且针对在酪氨酸-308处的磷酸化进行研究。在单独地用RLip-EA-OH处理3小时之后，观察到增加的Akt磷酸化。通过用5μMLY294002共处理完全抑制了响应于RLip-EA-OH处理的Akt磷酸化增加(图3)。

此外，使用一种如所说明的免疫组织化学测定法评定了在H9c2细胞中RLip-EA-OH对Akt磷酸化的影响。在LY294002存在下将RLip-EA-OH处理与载体处理抑或RLip-EA-OH处理进行比较。用载体处理的细胞显示很少的荧光。在用RLip-EA-OH处理3小时的细胞中荧光强度是亮得多的。在加入RLip-EA-OH之前用LY294002共处理细胞持续另外的30分钟减弱了来自Akt磷酸化的荧光强度。

实例3：RLip-EA-OH活化胰岛素受体酪氨酸激酶(IRK)

材料与方法：IRK活化测定法

使用一台Caliper LabChip3000和一台12-吸头LabChip

来检测磷酸化的和未磷酸化的底物两者(Caliper Life Sciences，Discovery Alliances andServices Division，Hanover，MD)通过迁移率变化分析易于测量胰岛素受体激酶活性。该迁移率变化激酶测定法使用一种微流控芯片来测量荧光肽底物至磷酸化产物的转化。将来自微孔板孔的反应混合物通过一个毛细管吸头引入到该芯片上，并且通过电泳分离未磷酸化的底物和磷酸化的产物，然后通过激光诱导的荧光进行检测。随着时间的过去，荧光信号的标记显示了反应的程度。在ATP和底物的存在下，酪氨酸激酶的催化亚基具有内源活性水平，因此这些结果表示为对照的a％。

具体地说，用100％DMSO将每个测试化合物稀释至25倍其测定浓度，并且在室温下预孵育15分钟之前加入到含有二硫苏糖醇(DTT，2mM)以及胰岛素受体激酶结构域(Millipore目录#14-466，80nM)的12μL测定缓冲溶液(100mM HEPES，10mM MnCl₂，5mM B-GP，以及0.002％Brij)中。在预孵育之后，加入含有3μM荧光肽底物和ATP(1620μM)的测定缓冲液(12μL)，并且在室温下将该混合物进一步孵育另外的1.5小时，这时大致50％的底物转化成产物。将这些样品置于LabChip 3000上以测量母体底物和磷酸化产物的量。

结果：

使用上述IRK活性测定法，在100μM下针对化合物的活化胰岛素受体酪氨酸激酶(IRK)的能力对它们进行评估。表3中显示了这个测定的结果。

表3.在100μM下化合物对胰岛素受体激酶活性的影响。

化合物	超过对照的AVG％活性(±SEM)
		RLip-EA-OH	78±15
R/SLip-EA-OH	14±1
		SLip-EA-OH	4±12
R/SLip-Ea-OH	1±6

实例4：RLip-EA-OH活化IGF1R激酶和Src酪氨酸激酶

材料与方法：IGF1和Src酪氨酸激酶活性测定

在ATP和底物的存在下，IGF1R和Src酪氨酸激酶具有内源活性水平。使用一台Caliper LabChip

3000和一台12-吸头LabChip

来检测磷酸化的和

未磷酸化的底物两者(Caliper Life Sciences，Discovery Alliances andServices Division)使用迁移率变化分析易于测量这种活性。针对每个测定优化酶、底物以及ATP浓度。对于IGF1R测定而言，酶、肽以及ATP的最终浓度对应地是20nM、1.5μM、和1220μM。对于Src测定而言，酶、肽以及ATP的最终浓度对应地是2.5nM、1.5μM、和17μM。

针对在多个浓度下的RLip-EA-OH对IGF1受体激酶(IGF1R)和Src的活化的影响进行评估。100μM浓度的不同Lip-EA化合物对激酶活化的影响示于表4a中。测试的这些化合物以不同的选择性活化IGF1R和Src。

还评估了300μM RLip-EA-OH或RLip-OH对不同酪氨酸激酶的活化的影响(表4b)。在这个浓度下，相对于载体对照，RLip-EA-OH相比于RLip-OH诱导了显著更强的IRK和Src酪氨酸激酶两者的活化。

表4a.在100μM下化合物对IGF1R和Src激酶活性的影响。

表4b.在300μM下RLip-EA-OH和RLip-OH对IRK、IGF1R以及Src酪氨酸激酶活性的影响。这些数据是超过载体对照的活性增加％。

实例5：在培养细胞中RLip-EA-OH防止细胞凋亡以及促进细胞存活

材料与方法：在Jurkat细胞中的细胞存活测定

使用在受体相互作用蛋白(RIP)(一种细胞死亡介导蛋白)方面有缺陷的Jurkat细胞来评定RLip-EA-OH的防止细胞凋亡以及促进细胞存活的能力。该Jurkat细胞系是从人T-淋巴细胞衍生的。当用肿瘤坏死因子α(TNFα)处理时RIP缺陷型Jurkat细胞易于凋亡。用载体抑或RLip-EA-OH处理这些细胞，进而用TNFα触发细胞凋亡。对细胞存活进行评定从而评估RLip-EA-OH是否保护了细胞免受TNFα诱导的细胞凋亡。

将RIP-缺陷型Jurkat细胞以20,000个细胞/孔种于96孔板中并且用RLip-EA-OH(每个浓度6个孔)或DMSO处理2小时。在处理之后，将药物每个剂量3个孔暴露于10ng/mL的人重组TNFα(TNFα未加入到其他3个孔中)。在TNFα理之之后24小时，确定ATP细胞成活力(CellTiter-Glo，Promega)并且使用这些值来计算这些细胞的存活率％。

在缺乏RLip-EA-OH下，大致20％的细胞在TNFα处理后不存活。用RLip-EA-OH处理细胞以剂量依赖方式防止了TNFα诱导的细胞死亡(表5)。

表5.在RIP-缺陷型Jurkat细胞中RLip-EA-OH对TNFα诱导的细胞凋亡的影响。

^*对照

实例6：在培养的细胞中RLip-EA-OH以剂量依赖的方式抑制了卡巴胆碱刺激的细胞内钙的增加

材料与方法：胞质钙超载测定

当用卡巴胆碱刺激时在CHO M1-WT3细胞中的胞质钙增加([MolecularDevices，FlexStation Application Note 2，Comparison of FLIPR

andFLEXstation^TM for Calcium Mobilization Assays])并且可以用结合钙的荧光染料来检测。将在卡巴胆碱刺激之后荧光的增加解释为胞质钙的增加。允许中国仓鼠卵巢(CHO)细胞粘附到96孔培养板的底部。将荧光染料和试样置于该平板上并且允许被这些细胞吸收。使用一台酶标仪(Flexstation II，MolecularDevices，Sunnyvale CA)每2秒测量荧光水平。用卡巴胆碱刺激这些细胞并且将荧光数据报告为在卡巴胆碱刺激之后的在基线上的荧光峰增加。针对对照样品中的峰值卡巴胆碱响应将数据归一化。

使来自细胞系CHO-M1-WT3的CHO细胞在添加有10％FBS和5μg/mLG418的Hams F12培养基中生长以维持M1毒蕈碱受体的表达。在实验前夜以30,000细胞/孔的浓度将细胞以100μL/孔的体积接种于黑壁、透明底、96孔微孔板(“测定板”)中。在37℃和5％CO₂下将细胞孵育过夜。第二天，在37℃下用在Hank平衡盐溶液中的氟-4NW或钙-3连同2.5mM的水溶性丙磺舒和指示浓度的测试化合物或载体一起将细胞孵育60分钟。每个孔中最终体积是200μL。将细胞置于FlexStation系统中，用来监测加入50μL 1μM的卡巴胆碱至终浓度为200nM之前和之后的荧光。在加入卡巴胆碱之前测量荧光持续17秒，并且在加入卡巴胆碱之后持续43秒。在485nm波长下激发氟-4染料并且在525nm下测量发射。在494nm波长下激发钙-3染料并且在525nm下测量发射。将钙响应报告为峰值荧光减去基线荧光(计算为加入卡巴胆碱之前的平均荧光)。

结果：

确定RLip-EA-OH、RLip-OH和Ac-EA-OH在CHO M1-WT3细胞中防止钙超载的能力。测量出表达毒蕈碱M1受体的CHO细胞响应于卡巴胆碱刺激的胞质钙的峰上升。RLip-EA-OH以一种剂量依赖方式降低了胞质钙的流动，而RLip-OH和Ac-EA-OH具有最小的影响(图4)。RLip-EA-OH对卡巴胆碱刺激的胞质钙增加具有抑制作用并且该抑制作用是剂量依赖性的。RLip-OH和Ac-EA-OH仅具有中度的胞质钙降低活性。

实例7：RLip-EA-OH展示出比RLip-OH更强的过氧化自由基吸收能力

1.材料与方法：氧自由基吸收能力(ORAC)测定

过氧化自由基是在再灌注过程中由细胞产生的一个种类的活性氧。过氧化自由基的存在可以通过荧光素氧化来检测。在过氧化自由基的存在下，荧光素荧光将随着时间衰减。在氧自由基清除剂的存在下，衰减率降低。使用在对照与存在清除剂之间的衰减率的改变来测量测试化合物的过氧化自由基清除能力。

在含有10nM荧光素的10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，将每个测试化合物稀释至范围从25μM至250μM的一个浓度。在37℃下将该缓冲液和化合物孵育10分钟。在孵育之后，使用一台酶标仪(Molecular DevicesFlexstation II，Ex＝485，Em＝520)来测量荧光素的荧光。在加入2，2’-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐(AAPH)之前记录基线荧光测量值持续15分钟。记录荧光衰减持续90分钟。从具有化合物的荧光衰减中减去没有化合物的荧光衰减。将衰减对浓度的斜率报告为吸收能力。

结果：

确定包含硫辛酰基化合物的过氧化自由基吸收能力(表6a和6b)。RLip-EA-OH展示出比RLip-OH更强的过氧化自由基吸光度能力。这些结果还表明在ORAC测定中硫辛酰基部分对于清除过氧化自由基是关键的，因为乙酰基-谷氨酰基丙氨酸不具有可观的过氧化自由基吸收能力。

表6a.相对于RLip-OH的ORAC测定结果。

这些值是3-4次实验的平均值。

表6b.相对于RLip-EA-OH的ORAC测定结果

化合物	ORAC值
		RLip-EA-OH	100±11
R/SLip-EA-OH	102±10
		SLip-EA-OH	89±4

这些值是3-4次实验的平均值。

实例8：RLip-EA-OH体内保护心肌免受缺血再灌注损伤

材料与方法：心肌I/R损伤的大鼠模型

心肌I/R损伤的大鼠模型用作体内筛选以确定某些硫辛酸衍生化合物是否是心肌保护性的(例如，抗心肌缺血再灌注损伤)。这种模型类似于在冠状动脉闭塞以及心外科手术操作(如冠状动脉旁路移植术(CABG)(Matsui，T.，Tao，J.，del Monte，F.，Lee，K.-H.et al.，Akt Activation Preserves Cardiac Functionand Prevents Injury After Transient Cardiac Ischemia In vivo，Circulation 2001，104：330))之后在心脏病人体内观察到的缺血再灌注损伤。

一般程序

将左冠状动脉的旋支临时结扎从而诱导左心室质量(left ventricular mass)中的局部缺血，紧接着注射荧光微球来划出该缺血区域的轮廓。在再灌注之后大约24小时将动物处死并且将心脏切下、切片并且用三苯四唑染色。通过测量心肌梗死面积(MI)、处于风险的缺血面积(AR)以及左心室面积(LV)来确定药理学介入的直接影响。MI对于AR(MI/AR比率)的降低被用作相对于载体对照的药物疗效的主要量度。

详细步骤

将在300与350gm之间的雄性斯普拉-道来大鼠用于这些实验。在诱导室中用3％-4％异氟烷诱导麻醉。在诱导之后，在手术面上用1.5％-2.0％的异氟烷保持麻醉(通过一个啮齿动物通气装置通过经口引入气管的一个16规格的血管导管给药)。将该通气装置设置在2.5cc，在每分钟60至65次的呼吸频率，从而维持手术过程的通气。使用一个直肠探条以及附连到一个温度控制器上的一个加热灯来监测动物的体中心温度并且维持在37℃。

进行左前胸切口并且使用竖式心包切开术将心脏暴露。使用在一个11mm的针上的心血管7.0单丝缝合线在距离主动脉大致4mm处将左冠状动脉(LCx)的旋支结扎，从而诱导左心室缺血。

在结扎之后10-20分钟将荧光微球(300μL)注射入左心室腔中，以划出缺血区域的轮廓。在结扎之后30分钟将缝线去除，从而使缺血区域再灌注，并且针对再灌注检查该缺血区域。

然后使用用于肌肉层的可吸收缝线(Dexon 5-0)将胸部的多个层缝合，并且使用单丝尼龙5-0缝线将皮肤层缝合。允许这些动物苏醒，然后返回到群体中。

再灌注之后24小时，使用盐酸氯胺酮来诱导麻醉并且将胸部打开。将15％氯化钾水溶液(w/v)注射到LV腔中以使心脏在舒张期停止跳动从而将动物处死。在主动脉瓣远端将心脏切除并且用盐水洗涤以去除血液。获得在心室底部与顶部之间的心脏的矢状切片。获得5个心脏组织的切片，每个2mm厚。将这些切片浸入在盐水溶液中的1％2，3，5-三苯基-2H-四唑鎓氯化物(TTC)中，并且然后存储在暗处持续30分钟用于染色。

获得在明视野下(用来观察TTC染色)以及在荧光下(用于观察微球)的切片图像。根据微球的缺乏来确定处于风险的面积并且通过TTC染色的缺乏来确定梗死面积。

结果：

在心肌缺血再灌注模型中RLip-EA-OH治疗的动物(n＝64)对盐水载体治疗(n＝54)动物的荟萃分析证明，相对于处于风险的面积(AR)，作为心室内腔注射(1mg/kg IC)给予的RLip-EA-OH有效地降低了心肌梗死(MI)的尺寸。对于载体与RLip-EA-OH治疗的动物而言，MI∶AR比率对应地是0.373(n＝54)和0.250(n＝64)，相应于33％的组间差异(p＜0.001)(图5)。在RLip-EA-OH治疗之后，在心肌组织切片中观察到心肌损害面积显著降低。

在大鼠心肌缺血再灌注模型中研究了给予RLip-EA-OH的定时。在缺血前(阻塞前15分钟)、缺血中(阻塞之后15分钟)、或缺血后(再灌注之后1分钟之内)以1mg/kg IC给予RLip-EA-OH。与接收盐水载体的那些动物相比较，RLip-EA-OH显著地(p＜0.05)降低了心肌组织死亡(阻塞前(38％)、阻塞期间(24％)、以及在再灌注时(32％))(图6)。无论是预防性地还是治疗性地给予处于1mg/kg IC的RLip-EA-OH都有效地减少了心肌损伤。此外，当在阻塞前15分钟静脉给予时，处于不同剂量下的RLip-EA-OH是有效的(图7)。这些结果表明给予RLip-EA-OH有效地降低了由于缺血再灌注损伤对心脏的损害。

实例9：对于降低心肌缺血/再灌注损伤而言，RLip-EA-OH对映异构体比母体部分RLip-OH、外消旋混合物R/SLip-EA-OH、以及SLip-EA-OH对映异构体是更有效的。

在此使用实例8中所述的心肌缺血再灌注损伤的大鼠模型来比较在治疗心肌I/R损伤方面纯RLip-EA-OH对映异构体的疗效与母体部分RLip-OH、纯SLip-EA-OH以及外消旋混合物R/SLip-EA-OH的疗效。

结果：

相比于盐水载体对照，用RLip-OH(2mg/kg IC)抑或RLip-EA-OH(1mg/kgIC)治疗的动物的荟萃分析以降低％示于表7中。还评估了Ac-EA-OH(一种包含非硫辛酰基的化合物)并且发现统计上类似于载体(数据未显示)。这个结果证明，与用RLip-OH治疗相比较，用RLip-EA-OH治疗之后的免于I/R损伤的心脏保护作用是更好的。

表7.在心肌缺血再灌注损伤的大鼠模型中检验的RLip-OH与RLip-EA-OH的疗效比较。

化合物	相对于载体的MI∶AR比率的降低(％)
		RLip-EA-OH	31±3^*
RLip-OH	19±7^#

^*基于RLip-EA-OH治疗的动物(n＝75)对载体治疗(n＝89)的动物的荟萃分析的结果

#基于RLip-OH治疗的动物(n＝18)对载体治疗(n＝19)的动物的荟萃分析的结果

相比于盐水载体对照，用RLip-EA-OH(1mg/kg IC)抑或R/SLip-EA-OH(1mg/kg IC)治疗的动物的分析以降低％示于表8中。这个结果证明，与用R/SLip-EA-OH治疗相比较，用RLip-EA-OH治疗之后的免于I/R损伤的心脏保护作用是更好的。

表8.在心肌缺血再灌注损伤的大鼠模型中验证的RLip-EA-OH与R/SLip-EA-OH的疗效比较。

化合物	相对于载体的MI∶AR比率的降低(％)
		RLip-EA-OH	31±3^*
R/SLip-EA-OH	19±5^#

#基于R/SLip-EA-OH治疗的动物(n＝26)对载体治疗(n＝25)的动物的荟萃分析的结果

单一的异构体化合物RLip-EA-OH与SLip-EA-OH的比较研究结果示于表9中。在缺血发作之前15分钟以快速灌注方式(IC)以1mg/kg抑或2mg/kg给予这些化合物。通过加入等量的RLip-EA-OH和SLip-EA-OH制备一种外消旋混合物。还评估了外消旋的R/SLip-EA-OH。将数据表示为心肌梗死(MI)的尺寸相对于处于风险的面积(AR)的降低。这个结果证明，与用相应的SLip-EA-OH治疗相比较，用RLip-EA-OH治疗之后的免于I/R损伤的心脏保护作用是更好的。

表9.相对于处于风险的面积(AR)，在Lip-EA-OH治疗的动物体内的心肌梗死(MI)尺寸的降低这些结果是基于9-10个动物/组。

实例10：通过以非标准的延长的给药间隔以多剂给予RLip-EA-OH来增加该化合物的剂量而增强了它的体内疗效

材料与方法：

详细步骤

如实例8中所述，进行使用心肌I/R损伤的大鼠模型的体内实验。如表10中所示，测试了若干单次和多次给药方案。插管的(颈静脉)大鼠用于在0.25h之前和/或包括0.25h的时间点进行静脉内剂给药。

结果：

相对于I/R损伤，给予单个的RLip-EA-OH快速注射在横跨宽的时期中降低MI损伤方面展示出疗效(即，在手术之前在15分钟、3小时、6小时、或24小时；在血管阻塞的时间；以及在进入血管的再灌注时间)。该药物还显示在动脉阻塞时以及在再灌注时是有效的，但是不及在某些早期时间点(例如，-15分钟)所看到的程度。当考虑RLip-EA-OH的短血清半衰期时(即，在30mg/kg的剂量下在20μg/mL的C_max下在大鼠体内约9分钟)，在该大鼠模型中这个宽时期的疗效相对于该I/R损伤是矛盾的。

在I/R损伤的大鼠模型中，当在缺血之前以单次静脉推注以不同剂量给药时，RLip-EA-OH显示了一个钟形剂量反应曲线(表10，条目1、2a、2b、3a、3b、4a、以及4b)。在大鼠模型中在缺血之前15分钟或在缺血之前3小时给予一个单次10mg/kg静脉推注剂产生了MI损伤的大约33％降低(参见表10，条目4a对7)，而在缺血之前较早的时间点(6小时或24小时)给予相同剂量导致了MI损伤的略微下降的降低(表10，条目8、9)。更低的单剂量的RLip-EA-OH(1、3或5mg/kg)不是同样有效的，并且更高的单剂量的RLip-EA-OH(20mg/kg或40mg/kg)并没有改善MI损伤的降低，其中当在类似时间点并且在一些情况下给予最佳低剂量对疗效具有有害作用(表10，比较条目4a对6、7对10或11)。因此，在大鼠模型中在该步骤之前给予10mg/kg剂量显示出比更低和更高单剂量更好的疗效。在测试的最高剂量下，疗效不落在安慰剂水平之下。在缺血之前15分钟以单次静脉推注抑或在静脉缺血之前以60分钟输注方式给予RLip-EA-OH提供了类似的MI损伤的降低(表10，比较条目2a对2b、3a对3b、4a对4b)。

出人意料的是，与最佳单剂相比较，通过给予多(2或3)剂来增加RLip-EA-OH的剂量改进了MI损伤的降低(表10，条目12对15、7对15；表11，条目1a对1b；条目2a对2b；表12，条目B对C)。具体地，当最终剂是在缺血之前大约0.25小时给予(表10，条目12、13和15对14、16和17)并且不是在再灌注时给予(表10，比较条目12和15对16和17)时，相对于单剂，给予2或3剂的RLip-EA-OH提供了MI损伤降低的改进。

荟萃分析显示最佳的快速灌注剂量(10mg/kg在-3h时)将MI降低29％，而多次给药(10mg/kg，在-3h和-0.25h时)将MI降低43％(表12)。

表10.RLip-EA-OH相比于载体对照的在I/R损伤的大鼠模型中的疗效

^*结果是显著地好于载体的，p＜0.05。

表11.在I/R损伤的大鼠模型中RLip-EA-OH单剂和多剂方案的比较疗效

^*结果显著地好于单剂，p＜0.05。

^§相比于载体对照的MI/AR的降低百分比。

表12.在I/R损伤的大鼠模型中对于单剂和多剂而言的RLip-EA-OH疗效的荟萃分析

项目	MI/AR	数量	SD	SE	t检验	P值
							A-载体	0.366	25	0.076	0.015	B对A	7.66E-06
B-单剂(10_0)	0.261	26	0.073	0.014	C对A	3.17E-11
							C-多剂(10_10)	0.207	25	0.052	0.010	C对B	0.0039

实例11：以非标准的延长的给药间隔给予多剂的RLip-EA-OH降低了心功能障碍以及死亡发生率

材料与方法

针对用于给予RLip-EA-OH的不同剂量以及剂量方案，在此处说明的心肌I/R损伤的大鼠模型中检验了与需要介入的心律失常以及心脏停搏相关联的急性心功能障碍的发病率以及由于这些并存病导致的死亡发生率。如在实例8中所述使用实例10中所述的给药间隔进行了体内实验。以左心室内注射、静脉推注、静脉输注、或口服方式给予治疗(即，载体、RLip-EA-OH)。具体地说，在缺血以及需要介入(直接的机械心脏复苏)期间观察非自愈性(non-self-resolving)心功能障碍(即，延长的纤维性颤动心律失常、心搏骤停)的发生率以及与心功能障碍相关的死亡率。

结果：

相对于载体对照，多次和单次给予RLip-EA-OH降低了威胁生命的心功能障碍的发病率以及对于介入以缓解它们的相关需要，以及与这些威胁生命的心功能障碍相关联的死亡率(表14)。与单剂给药相比，多次给药方案显示显著更好的疗效。

表14.在I/R损伤的大鼠模型中在单剂和多剂给予RLip-EA-OH之后急性心功能障碍的发病率以及相关死亡率

实例12：RLip-EA-OH在大鼠体内的药物代谢动力学评估

为了评估对于RLip-EA-OH的全身暴露，对多组大鼠以30、100、或200mg/kg(6只/性别/组)的相同剂量水平给予单次静脉输注剂的载体(2只/性别)或RLip-EA-OH。对于载体治疗的组，在给药之前并且仅在给药之后30分钟(+2分钟)从所有大鼠体内收集血样。对于RLip-EA-OH治疗的组，在给药后10分钟、30分钟、45分钟以及1、2、3、和4小时(±2分钟)从三只大鼠/性别/组中收集血样。

使用注射器泵以不大于0.2mL/min的注射速率通过静脉输注将药物给予到在股静脉中的经手术放置的导管中。每个动物的剂量体积是基于最近的体重测量值，并且这些剂量被四舍五入到最近的0.1mL。

从毒物代谢动力学动物的尾静脉中收集大致0.5mL的全静脉血样品以提供血浆，测量其中的RLip-EA-OH浓度。

将这些样品置于含有K3EDTA的管中并且储存在冰上直至在冷藏条件下在3000rpm下离心持续至少10分钟。在离心之后，将血浆移开并且在负70℃或以下冷冻保存直至运输到印第安纳州西拉法叶市的BASi公司进行分析。

在印第安纳州西拉法叶市的BASi公司使用验证的LC/MS/MS方法以正压涡轮离子喷射(positive turbo ion spray)以多反应监测模式来测量血浆RLip-EA-OH浓度。该测定的可量化范围是0.05至50μg/mL，并且QC样品被包括在0.15、10以及37.5μg/mL。使用WinNonlin版本5.1通过计算标准参数进行了毒物代谢动力学分析。

这个分析的结果显示在表15中。

表15.30mg/kg剂量的RLip-EA-OH的大鼠药物代谢动力学数据

实例13：RLip-EA-OH在人体内的药物代谢动力学评估

材料与方法：

生物分析方法

在BASi公司(印第安纳州西拉法叶市)使用LC/MS/MS方法以正压涡轮离子喷射以多反应监测模式来测量血浆和尿液RLip-EA-OH浓度。人血浆的可量化范围是1.00至500ng/mL，并且QC样品被包括在3.00、75.0以及375ng/mL。

数据集分析

PK群体包括接受RLip-EA-OH的个体并且具有≥1次的给药后PK测量。如果发现任何个体对于给药不依从或者发现具有不完全数据时，在逐项的基础上做出决定从而使它们包括在该分析中。对来自24个个体的血浆样品(6位RLip-EA-OH个体/同期组群)进行了分析(表16和17)。

结果：

图9A和9B中对应地以线性比例和半对数比例展示了平均血浆RLip-EA-OH浓度对时间的数据。血浆浓度以多相方式快速衰减。

将非房室法和房室法两者的PK参数的汇总提供在表14和表15中。RLip-EA-OH的平均末相t_1/2是短的，并且其范围在从20mg剂量下的平均值0.86小时至在300mg剂量下的1.45小时。AUC_inf的增加稍微大于剂量的增加，并且其范围在从583至16483h*ng/mL。CL随着剂量的增加而稍微降低，并且其范围在从19.3L/h(对于300mg剂量)至35.3L/hr(对于20mg剂量)。中央室(Vc)的分布体积是相对小的，大致6升。Vss是2倍至3倍大的，范围在从大致12升至18升，并且随着剂量增加而降低。

尿排泄数据表明，在经过16小时的收集间隔中大致30％至45％的给予剂量被排泄(在尿液中没有变化)。大多数尿排泄发生在第一个4小时。

表16.非房室药物代谢动力学参数的汇总

表17.房室药物代谢动力学参数的汇总

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在此引用的所有专利、公开申请以及参考文献的传授内容都通过引用以其全部内容结合在此。

虽然通过参考其实例性的实施方案对本发明已经进行了具体的展示和说明，本领域普通技术人员应当理解的是，在其中可以在形式和细节方面作出不同的改变，而不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围。

Claims

1.一种组合物，包括按重量计至少90％的由以下结构式表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐，其中在该化合物中R¹和R²各自独立地是H或一种可水解基团，并且其中该化合物或它的药学上可接受的盐是至少90％对映体纯的。

2.如权利要求1所述的组合物，其中该化合物是由以下结构式表示的：

或它的一种药学上可接受的盐，其中在该化合物中R¹和R²各自独立地是H或一种可水解基团。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中该可水解基团是选自下组，该组由以下各项组成：(C₁-C₁₀)烷基、(C₂-C₁₀)链烯基、(C₂-C₁₀)炔基、(C₁-C₁₀)烷氧基(C₁-C₁₀)烷基、(C₁-C₁₀)烷氧基(C₁-C₁₀)烷氧基(C₁-C₁₀)烷基、芳基以及芳基(C₁-C₁₀)烷基，其中每一个任选地被选自下组的1至3个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、硝基、氰基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、氨基、(C₁-C₆)烷氨基、二(C₁-C₆)烷氨基、(C₁-C₆)烷基、卤代(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷氧基、卤代(C₁-C₆)烷氧基、吗啉代、苯基、以及苄基。

4.如权利要求3所述的组合物，其中该可水解基团是选自下组，该组由以下各项组成：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、烯丙基、乙氧基甲基、甲氧基乙基、甲氧基乙氧基甲基、甲氧基乙氧基乙基、苄基、五氟苯基、2-N-(吗啉代)乙基、二甲氨基乙基以及对-甲氧苄基。

5.如权利要求1所述的组合物，其中该药学上可接受的盐包括一种一价阳离子或一种二价阳离子。

6.如权利要求5所述的组合物，其中该一价阳离子是一种一价金属阳离子并且该二价阳离子是一种二价金属阳离子。

7.如权利要求1所述的组合物，其中该化合物是由以下结构式表示的：

或它的一种药学上可接受的盐。

8.如权利要求1所述的组合物，其中该化合物是由以下结构式表示的：

9.一种组合物，包括：i)一种药学上可接受的载体或稀释剂；以及ii)按重量计至少90％的如权利要求1所述的一种化合物，或它的一种药学上可接受的盐。

10.一种用于治疗在对其有需要的个体体内的缺血性损伤或缺血再灌注损伤的方法，包括向个体给予一个有效量的如权利要求1至9的任一项所述的组合物。

11.一种用于治疗在对其有需要的个体体内的缺血性损伤或缺血再灌注损伤的方法，包括向该个体给予至少两剂的由以下结构式表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐，其中该化合物中R¹和R²各自独立地是H或一种可水解基团，并且该化合物或它的药学上可接受的盐是至少90％对映体纯的，该方法包括：

在损伤之前向该个体给予该化合物或它的一种药学上可接受的盐的非最终剂、以及该化合物或它的一种药学上可接受的盐的最终剂，其中：

(a)在损伤之前即刻给予该最终剂；并且

(b)以相对于单剂给予该化合物增强该化合物用于治疗该损伤的疗效的给药间隔而给予该非最终剂以及该最终剂。

12.如权利要求11所述的方法，其中在该非最终剂与该最终剂之间的给药间隔是至少大约4小时。

13.如权利要求12所述的方法，其中在该非最终剂与该最终剂之间的给药间隔是至少大约6小时。

14.如权利要求13所述的方法，其中在该非最终剂与该最终剂之间的给药间隔是至少大约8小时。

15.如权利要求11至14的任一项所述的方法，其中在损伤之前在大约0分钟至大约90分钟的范围内的一个时间点向该个体给予该最终剂。

16.如权利要求15所述的方法，其中在损伤之前至少大约30分钟向该个体给予该最终剂。

17.如权利要求16所述的方法，其中在损伤之前至少大约60分钟向该个体给予该最终剂。

18.如权利要求11至17的任一项所述的方法，其中在给予该非最终剂之后并且即刻在给予该最终剂之前在从该个体获得的血样中该化合物或它的药学上可接受的盐具有一个低于其C_max的10％的浓度。

19.如权利要求11至18的任一项所述的方法，其中在损伤之前大约48小时内的一个时间点向该个体给予该非最终剂。

20.如权利要求11至19的任一项所述的方法，进一步包括在给予该非最终剂之前向该个体给予一个或多个另外剂的该化合物。

21.如权利要求20所述的方法，其中在损伤之前向该个体给予三剂的该化合物。

22.如权利要求11至21的任一项所述的方法，进一步包括在损伤之后向该个体给予一个或多个另外剂的该化合物。

23.如权利要求11至22的任一项所述的方法，其中每剂是相等的。

24.如权利要求11至23的任一项所述的方法，其中该化合物是静脉给予的并且每剂具有一个范围从大约0.5mg/kg至大约5.0mg/kg的浓度。

25.如权利要求11至24的任一项所述的方法，其中该缺血性损伤是心肌缺血损伤。

26.如权利要求11至24的任一项所述的方法，其中该缺血性损伤由选自下组的缺血引起的，该组由以下各项组成：心血管缺血、脑血管缺血、肾缺血、肝缺血、缺血再灌注心肌病、皮肤缺血、肠缺血(bowel ischemia)、肠缺血(intestinal ischemia)、胃缺血、肺缺血、胰缺血、骨骼肌缺血、腹肌缺血、肢缺血、缺血再灌注结肠炎、肠系膜缺血以及无症状心肌缺血。

27.如权利要求11至24的任一项所述的方法，其中该缺血再灌注损伤是心肌缺血再灌注损伤。

28.如权利要求27所述的方法，其中该心肌缺血再灌注损伤是由心肌梗死引起的。

29.如权利要求28所述的方法，其中该心肌梗死是急性心肌梗死。

30.如权利要求11至24的任一项所述的方法，其中该缺血再灌注损伤是脑缺血再灌注损伤。

31.如权利要求30所述的方法，其中该脑缺血再灌注损伤是由中风引起的。

32.如权利要求11至24的任一项所述的方法，其中该缺血再灌注损失是选自下组，该组由以下各项组成：脑血管缺血再灌注损伤、肾缺血再灌注损伤、肝缺血再灌注损伤、缺血再灌注心肌病、皮肤缺血再灌注损伤、肠缺血再灌注损伤(bowel ischemia-reperfusion injury)、肠缺血再灌注损伤(intestinalischemia-reperfusion injury)、胃缺血再灌注损伤、肺缺血再灌注损伤、胰缺血再灌注损伤、骨骼肌缺血再灌注损伤、腹肌缺血再灌注损伤、肢缺血再灌注损伤、缺血再灌注结肠炎、肠系膜缺血再灌注损伤以及无症状心肌缺血再灌注损伤。

33.如权利要求11至32的任一项所述的方法，其中该损伤包括围手术期心肌损害。

34.如权利要求11至33的任一项所述的方法，其中该损伤是由治疗介入引起的。

35.如权利要求34所述的方法，其中该治疗介入是选自下组，该组由以下各项组成：冠状动脉旁路移植手术、冠状动脉血管成形术、移植手术以及心肺旁路手术。

36.如权利要求11至35的任一项所述的方法，其中该个体是一个人。

37.一种用于治疗在对其有需要的个体体内的缺血性损伤或缺血再灌注损伤的方法，包括向该个体给予至少两剂的由以下结构式表示的一种化合物：

或它的一种药学上可接受的盐，其中在该化合物中R¹和R²各自独立地是H或一种可水解基团，并且该化合物或它的药学上可接受的盐是至少90％对映体纯的，该方法包括：

(a)在损伤之前在该化合物的大约2个半衰期之内的一个时间点向该个体给予该最终剂；以及

(b)在给予该最终剂之前在该化合物的至少大约4个半衰期的一个时间点向该个体给予该非最终剂。

38.如权利要求37所述的方法，其中在损伤之前在该化合物的大约0.25个半衰期至大约2个半衰期的范围内的一个时间点向该个体给予该最终剂。

39.如权利要求38所述的方法，其中在损伤之前在该化合物的大约一个半衰期向该个体给予该最终剂。

40.如权利要求37至39的任一项所述的方法，其中在给予该非最终剂之后并且在即刻给予最终剂之前在从该个体获得的血样中该化合物或它的药学上可接受的盐具有低于它的C_max的10％的浓度。

41.如权利要求37至40的任一项所述的方法，进一步包括在给予该非最终剂之前向该个体给予一个或多个另外剂的该化合物。

42.如权利要求37至41的任一项所述的方法，进一步包括在损伤之后向该个体给予一个或多个另外剂的该化合物。

43.如权利要求37至42的任一项所述的方法，其中每剂是相等的。

44.如权利要求37至43的任一项所述的方法，其中该化合物是静脉给予的，并且每剂具有一个范围从大约0.5mg/kg至大约5.0mg/kg的浓度。

45.如权利要求37至44的任一项所述的方法，其中该缺血性损伤是心肌缺血损伤。

46.如权利要求37至45的任一项所述的方法，其中该缺血性损伤是由选自下组的缺血引起的，该组由以下各项组成：心血管缺血、脑血管缺血、肾缺血、肝缺血、缺血再灌注心肌病、皮肤缺血、肠缺血(bowel ischemia)、肠缺血(intestinal ischemia)、胃缺血、肺缺血、胰缺血、骨骼肌缺血、腹肌缺血、肢缺血、缺血再灌注结肠炎、肠系膜缺血以及无症状心肌缺血。

47.如权利要求37至44的任一项所述的方法，其中该缺血再灌注损伤是心肌缺血再灌注损伤。

48.如权利要求47所述的方法，其中该心肌缺血再灌注损伤是由心肌梗死引起的。

49.如权利要求48所述的方法，其中该心肌梗死是急性心肌梗死。

50.如权利要求37至44的任一项所述的方法，其中该缺血再灌注损伤是脑缺血再灌注损伤。

51.如权利要求50所述的方法，其中该脑缺血再灌注损伤是由中风引起的。

52.如权利要求37至44的任一项所述的方法，其中该缺血再灌注损伤是选自下组，该组由以下各项组成：脑血管缺血再灌注损伤、肾缺血再灌注损伤、肝缺血再灌注损伤、缺血再灌注心肌病、皮肤缺血再灌注损伤、肠缺血再灌注损伤(bowel ischemia-reperfusion injury)、肠缺血再灌注损伤(intestinalischemia-reperfusion injury)、胃缺血再灌注损伤、肺缺血再灌注损伤、胰缺血再灌注损伤、骨骼肌缺血再灌注损伤、腹肌缺血再灌注损伤、肢缺血再灌注损伤、缺血再灌注结肠炎、肠系膜缺血再灌注损伤以及无症状心肌缺血再灌注损伤。

53.如权利要求37至52的任一项所述的方法，其中该损伤包括围手术期心肌损害。

54.如权利要求37至53的任一项所述的方法，其中该损伤是由治疗介入引起的。

55.如权利要求54所述的方法，其中该治疗介入是选自下组，该组由以下各项组成：冠状动脉旁路移植手术、冠状动脉血管成形术、移植手术以及心肺旁路手术。

56.如权利要求37至55的任一项所述的方法，其中该个体是一个人。