ES2470673T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de la isquemia y de la lesión por isquemia y reperfusi�n - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que el compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo son al menos un 90 % enantioméricamente puro.

Description

Composiciones y métodos para el tratamiento de la isquemia y de la lesión por isquemia y reperfusi�n

Antecedentes de la invención

En Estados Unidos, la enfermedad cardiovascular es la principal causa de mortalidad tanto en hombres como en mujeres. Más de un millón de personas sufren ataques al corazón cada año solo en Estados Unidos. La isquemia cardiaca, una afección caracterizada por la reducción del flujo sanguíneo y del oxígeno que llega al músculo cardiaco, o miocardio, es una evidencia de la enfermedad cardiovascular que, en última instancia, puede conducir a un ataque al corazón o infarto de miocardio. La enfermedad cardiovascular también puede producir una restricción del flujo sanguíneo y una reducción del suministro de oxígeno a otras partes del cuerpo, generando lesiones isqu�micas a diversos órganos y tejidos, incluyendo el cerebro, lo que puede conducir a una apoplejía.

El restablecimiento del flujo sanguíneo, o reperfusi�n, y la reoxigenaci�n de la zona afectada tras un episodio isqu�mico son fundamentales para limitar un daño irreversible. Sin embargo, la reperfusi�n también trae consecuencias potencialmente perjudiciales tales como la lesión por reperfusi�n, que es causada por la restauración del flujo sanguíneo coronario tras un episodio isqu�mico, y se produce como consecuencia de la generación y acumulación de oxígeno reactivo y especies de nitrógeno durante la reperfusi�n. La lesión por isquemia y reperfusi�n se caracteriza bioqu�micamente por un agotamiento del oxígeno durante un episodio isqu�mico, un aumento resultante de los niveles de calcio intracelulares, seguido por la reoxigenaci�n y la generación concomitante de especies reactivas del oxígeno durante la reperfusi�n (Piper, H. M., Abdallah, C., Schafer, C., “The first minutes of reperfusion: a window of opportunity for cardioprotection”. Annals of Thoracic Surgery 2003, 75:644; Yellon, D. M., Hausenloy, D. J., “Myocardial reperfusion injury”. New England Journal of Medicine 2007, 357:1121). La lesión por reperfusi�n puede ser responsable de hasta un 50 % del daño producido al corazón tras un infarto de miocardio (Yellon, D. M., Hausenloy, D. J., “Myocardial reperfusion injury”. New England Journal of Medicine 2007, 357:1121).

La frecuencia de la enfermedad cardiovascular en Estados Unidos y en todo el mundo hace necesario el desarrollo de terapias y agentes terapéuticos que puedan prevenir, reducir o contrarrestar con eficacia la isquemia y la lesión por isquemia y reperfusi�n que se producen como consecuencia de un ataque al corazón o una apoplejía. Las terapias actuales para el tratamiento de la isquemia y la lesión por isquemia y reperfusi�n causadas por el infarto de miocardio, tales como el precondicionamiento isqu�mico mecánico, han demostrado ser poco prácticas cl�nicamente, mientras que otras terapias, tales como los antagonistas bloqueadores del flujo de entrada del calcio y los neutralizantes de especies reactivas del oxígeno, han dado resultados cl�nicos decepcionantes (Otani, H., “Ischemic preconditioning: From molecule mechanisms to therapeutic opportunities”. Antioxidants & Redox Signaling, 2008, 10:207; Yellon, D. M., Hausenloy, D. J., “Myocardial reperfusion injury”. New England Journal of Medicine 2007, 357:1121).

Por lo tanto, existe una gran necesidad de terapias y agentes terapéuticos nuevos y más eficaces para el tratamiento de la isquemia y las lesiones por isquemia y reperfusi�n que se producen como consecuencia de la enfermedad cardiovascular y otras afecciones.

Sumario de la invención

La invención descrita en el presente documento aborda la necesidad de tratar la isquemia, la lesión isqu�mica y la lesión por isquemia y reperfusi�n, incluyendo la isquemia y la lesión por isquemia y reperfusi�n mioc�rdica, mediante la activación de las quinasas que participan en las vías de se�alizaci�n celular que inhiben la apoptosis y mediante la neutralización de especies reactivas del oxígeno. En particular, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden los compuestos desvelados, o sales farmac�uticamente aceptables de los mismos, y a su uso eficaz como activadores de las quinasas citoprotectoras.

La invención se refiere a composiciones según lo definido en las reivindicaciones.

En una realización, la invención se refiere a composiciones según lo definido en la reivindicación 1 que comprenden un compuesto sustancialmente puro representado por la Fórmula estructural III:

En otra realización, la invención proporciona una composición para su uso en un método de tratamiento de la isquemia, una lesión isqu�mica o una lesión por isquemia y reperfusi�n en un sujeto mamífero que comprende una administración de múltiples dosis de la composición de la reivindicación 1.

En una realización particular, la invención se refiere a una composición para su uso en un método para el tratamiento de una lesión isqu�mica o una lesión por isquemia y reperfusi�n producida como consecuencia de una intervención terapéutica en un sujeto en necesidad de la misma, que comprende administrar al sujeto al menos dos

compuesto o de la sal farmac�uticamente aceptable del mismo y una dosis final del compuesto o de la sal

15 farmac�uticamente aceptable del mismo al sujeto. Como se describe en el presente documento, la dosis final se administra inmediatamente antes de la intervención terapéutica, y la dosis no final y la dosis final se administran a un intervalo de dosificación que potencia la eficacia del compuesto para el tratamiento de la lesión en comparación con la administración de una sola dosis del compuesto.

20 En otra realización más, la invención proporciona una composición para su uso en un método para el tratamiento de una lesión isqu�mica o una lesión por isquemia y reperfusi�n producida como consecuencia de una intervención terapéutica en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto al menos dos dosis de un compuesto

menos un 90 % enantiom�ricamente puro. El método comprende la administración de una dosis no final del compuesto o de la sal farmac�uticamente aceptable del mismo y una dosis final del compuesto o de la sal farmac�uticamente aceptable del mismo al sujeto. Como se describe en el presente documento, la dosis final se

30 administra al sujeto en un punto temporal incluido en aproximadamente dos semividas del compuesto antes de la intervención terapéutica y la dosis no final se administra al sujeto en un punto temporal que es al menos aproximadamente cuatro semividas del compuesto antes de la administración de la dosis final.

Los compuestos y los métodos descritos en el presente documento son inesperadamente eficaces en el tratamiento de la isquemia, la lesión isqu�mica y la lesión por isquemia y reperfusi�n. En particular, los compuestos de la presente invención que tienen un resto lipo�lo en la configuración "R" son más potentes in vivo cuando se proporcionan cada uno en forma de compuesto enantiom�ricamente puro en lugar de en forma de una mezcla 5 rac�mica y, además, son más eficaces que sus homólogos estereoisom�ricos que tienen el resto lipo�lo en la configuración "S". Además, aunque es un hecho bastante aceptado en los protocolos farmacol�gicos convencionales que la administración de múltiples dosis de un fármaco a un sujeto a intervalos regulares para mantener una concentración plasm�tica constante del fármaco en el sujeto (por ejemplo, la administración oral cada 4 o cada 12 horas), generalmente, mantendr� su eficacia, la administración de múltiples dosis de un compuesto de la presente invención a las dosis e intervalos de tiempo descritos en el presente documento no solo mantiene, sino que mejora la eficacia de los compuestos reivindicados para el tratamiento de la isquemia, la lesión isqu�mica, y la lesión por isquemia y reperfusi�n. En particular, como se describe en el presente documento, la administración de múltiples dosis de un compuesto reivindicado a intervalos de dosificación que permitan que la concentración plasm�tica del compuesto reivindicado descienda muy por debajo de la concentración máxima inicial del compuesto antes de la

15 administración de una dosis posterior se contradice con los protocolos farmacol�gicos convencionales, pero potencia de manera inesperada la eficacia del compuesto.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama que representa las vías de se�alizaci�n celular propuestas que explican los mecanismos potenciales de acción para RLip-EA-OH y compuestos relacionados. La Figura 2 es un gráfico que representa el efecto de RLip-EA-OH y RLip-OH a concentraciones variables en el nivel de fosforilaci�n de Akt en células A549. Los datos se presentan como la media ! ETM (n = 4) de la proporción de Akt fosforilada con respecto a la Akt total restado el fondo.

25 La Figura 3 es un gráfico que representa el efecto de RLip-EA-OH a concentraciones variables en el nivel de fosforilaci�n de Akt en células A549 solas o en presencia de LY294002, un inhibidor de fosfotidilinositol-3’quinasa conocido. Los datos se presentan como la media ! ETM (n = 4) de la proporción de Akt fosforilada con respecto a la Akt total restado el fondo. La Figura 4 es un gráfico que representa el efecto en concentraciones variables de RLip-EA-OH, Ac-EA-OH y RLip-OH sobre el flujo de calcio en células de ovario de h�mster chino (CHO). Los datos se presentan como la media ! ETM (n = 4) de la medición de los niveles de calcio citos�lico como un porcentaje de un control solo de tampón. La Figura 5 es un gráfico que representa la eficacia de RLip-EA-OH en un modelo de rata de lesión por isquemia y reperfusi�n mioc�rdica. Los datos se presentan como la proporción del tamaño del infarto de miocardio dividido

35 entre la superficie total en riesgo (IM/SR). Los resultados representan un metaan�lisis de los animales tratados mediante una inyección intracardiaca con RLip-EA-OH a 1 mg/kg (n = 64) frente al vehículo de solución salina (n = 54). Los animales tratados con RLip-EA-OH resultaron tener una superficie significativamente (p < 0,001) reducida (33 %) de infarto (tejido muerto) con respecto a la superficie en riesgo en comparación con los animales que recibieron vehículo de solución salina. La Figura 6 es un gráfico que representa el efecto del momento de la administración intracardiaca de RLip-EA-OH a 1 mg/ml en la reducción del daño mioc�rdico en un modelo de rata de lesión por isquemia y reperfusi�n cardiaca. Los datos se presentan como la proporción del tamaño del infarto de miocardio dividido entre la superficie total en riesgo (IM/SR), y se muestran como la media ! ETM (n = 12-15/grupo). Los resultados indican que el tratamiento con RLip-EA-OH reduce significativamente (p < 0,05) la muerte del tejido del miocardio cuando

45 se administra 15 minutos antes de la oclusión (preoclusi�n, 38 %), 15 minutos después de la oclusión (durante la oclusión, 24 %) y en el minuto posterior a la reperfusi�n (en la reperfusi�n, 32 %) en comparación con los animales que recibieron vehículo de solución salina 15 minutos antes de la oclusión. La Figura 7 es un gráfico que representa el efecto de diferentes dosis de RLip-EA-OH en un modelo de rata de lesión por isquemia y reperfusi�n mioc�rdica. El RLip-EA-OH se administr� 15 minutos antes de la oclusión por vía intravenosa (IV) o intracardiaca ventricular izquierda (IC). Los datos se presentan como la proporción del tamaño del infarto de miocardio dividido entre la superficie total en riesgo (IM/SR) y se muestran como la media ! ETM (n = 10-12/grupo). Los resultados indican que el tratamiento con RLip-EA-OH redujo significativamente (p < 0,05) la muerte del tejido del miocardio y de una manera dependiente de la dosis. La Figura 8 es un gráfico que compara la eficacia in vivo de diferentes pautas de una y varias dosis para RLip

55 EA-OH administrado por vía intravenosa, según lo evaluado en un modelo de rata de lesión por isquemia y reperfusi�n mioc�rdica. Las Figuras 9A y 9B son gráficos que representan la concentración media de RLip-EA-OH en plasma de seres humanos frente a los datos de tiempo a escala lineal (Figura 9A) y semilogar�tmica (Figura 9B).

Descripci�n detallada de la invención

Definiciones

El término "alquilo" significa un radical hidrocarburo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono e 65 incluye, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n

heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo y similares.

El término "cicloalquilo" significa un anillo de hidrocarburo saturado monoc�clico, bic�clico o tric�clico, que tiene de 3 a 10 átomos de carbono e incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, biciclo[2.2.2]octilo, biciclo[2.2.1]heptilo, espiro[4.4]onano, adamantilo y similares.

El término "arilo" significa un radical aromático que es un grupo fenilo, un grupo naftilo, un grupo indanilo o un grupo tetrahidronaftaleno. Un grupo arilo est� opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes. Los ejemplos de sustituyentes incluyen alquilo, alcoxi, alquiltio, alquilsulfonilo, halógeno, trifluorometilo, dialquilamino, nitro, ciano, CO2H, CONH2, amido sustituido con N-monoalquilo y amido sustituido con N,N-dialquilo.

El término "heteroarilo" significa un radical heteroarom�tico de 5 o 6 miembros que puede estar opcionalmente condensado a un anillo saturado o insaturado que contiene de 0 a 4 hetero�tomos seleccionados de entre N, O y S, e incluye, por ejemplo, un radical heteroarom�tico que es 2-o 3-tienilo, 2-o 3-furanilo, 2-o 3-pirrolilo, 2-, 3-o 4piridilo, 2-pirazinilo, 2-, 4-o 5-pirimidinilo, 3-o 4-piridazinilo, 1H-indol-6-ilo, 1H-indol-5-ilo, 1H-bencimidazol-6-ilo, 1Hbencimidazol-5-ilo, 2-, 4-, 5-, 6-, 7-o 8-quinazolinilo, 2-, 3-, 5-, 6-, 7-o 8-quinoxalinilo, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-o 8quinolinilo, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-o 8-isoquinolinilo, 2-, 4-o 5-tiazolilo, 2-, 3-, 4-o 5-pirazolilo, 2-, 3-, 4-o 5-imidazolilo. Un heteroarilo est� opcionalmente sustituido. Los ejemplos de sustituyentes incluyen alquilo, alcoxi, alquiltio, alquilsulfonilo, halógeno, trifluorometilo, dialquilamino, nitro, ciano, CO2H, CONH2, amido sustituido con Nmonoalquilo y amido sustituido con N,N-dialquilo, o con oxo para formar un N-óxido .

El término "heterociclilo" significa un anillo heteroc�clico saturado o parcialmente insaturado de 4, 5, 6 o 7 miembros que contiene de 1 a 4 hetero�tomos seleccionados, de manera independiente, de entre N, O y S. Los ejemplos de heterociclilos incluyen pirrolidina, pirrolidin-2-ona, 1-metilpirrolidin-2-ona, piperidina, piperidin-2-ona, 2-piridona, 4piridona, piperazina, 1-(2,2,2-trifluoroetil)piperazina, piperazin-2-ona, 5,6-dihidropirimidin-4-ona, pirimidin-4-ona, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, tetrahidrotiofeno, tetrahidrotiopirano, isoxazolidina, 1,3-dioxolano, 1,3-ditiolano, 1,3-dioxano, 1,4-dioxano, 1,3-ditiano, 1,4-ditiano, oxazolidin-2-ona, imidazolidin-2-ona, imidazolidin-2,4-diona, tetrahidropirimidin-2(1H)-ona, morfolina, N-metilmorfolina, morfolin-3-ona, 1,3-oxazinan-2-ona, tiomorfolina, tiomorfolin-1,1-di�xido, tetrahidro-1,2,5-tiaoxazol-1,1-di�xido, tetrahidro-2H-1,2-tiazin-1,1-di�xido, hexahidro-1,2,6tiadiazin-1,1-di�xido, tetrahidro-1,2,5-tiadiazol-1,1-di�xido e isotiazolidin-1,1-di�xido. Un heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido con 1-4 sustituyentes. Los ejemplos de sustituyentes incluyen alquilo, haloalquilo y oxo.

Algunos de los compuestos desvelados pueden existir en diversas formas estereoisom�ricas. Los estereois�meros son compuestos que solo difieren en su disposición espacial. Los enanti�meros son pares de estereois�meros que son imágenes especulares no superponibles entre s�, más comúnmente debido a que contienen un átomo de carbono sustituido asim�tricamente que actúa como un centro quiral. "Enanti�mero" significa uno de un par de moléculas que son imágenes especulares entre s� y no son superponibles. Los diastere�meros son estereois�meros que no est�n relacionados como imágenes especulares, más comúnmente debido a que contienen dos o más átomos de carbono sustituidos asim�tricamente. El símbolo “*" en una fórmula estructural representa la presencia de un centro de carbono quiral. "R" y "S" representan la configuración de los sustituyentes alrededor de uno o más átomos de carbono quirales. Por lo tanto, "R" y "S" indican las configuraciones relativas de los sustituyentes alrededor de uno o más átomos de carbono quirales.

"Racemato" o "mezcla rac�mica" significa un compuesto de cantidades equimolares de dos enanti�meros, en el que dichas mezclas no presentan actividad óptica; es decir, no giran el plano de luz polarizada.

"Levógiro" significa que la luz polarizada es girada a la izquierda cuando pasa a través de un compuesto asimétrico. El prefijo para designar levógiro es "1".

"Dextrógiro" significa que la luz polarizada es girada hacia la derecha cuando pasa a través de un compuesto asimétrico. El prefijo para designar levógiro es "d".

"Isómero geométrico" significa isómeros que difieren en la orientación de los átomos sustituyentes con respecto a un doble enlace carbono-carbono, a un anillo de cicloalquilo o a un sistema bic�clico puenteado. Los átomos (distintos de hidrógeno) de cada lado de un doble enlace carbono-carbono pueden estar en una configuración E (los sustituyentes est�n en lados opuestos del doble enlace carbono-carbono) o Z (los sustituyentes est�n orientados en el mismo lado).

Cuando se nombra o representa la estereoqu�mica de un compuesto desvelado mediante una estructura, el estereois�mero nombrado o representado es al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 % en peso con respecto al resto de estereois�meros. Cuando se nombra o se representa un solo enanti�mero mediante la estructura, el enanti�mero representado o nombrado es al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 % en peso �pticamente puro. El porcentaje de pureza óptica en peso es la proporción del peso del enanti�mero con respecto al peso del enanti�mero más el peso de su isómero óptico.

Cuando un compuesto desvelado tiene al menos un centro quiral y se nombra o representa por una estructura sin indicar la estereoqu�mica, se ha de entender que el nombre o la estructura abarca un enanti�mero del compuesto libre del correspondiente isómero óptico, una mezcla rac�mica del compuesto y mezclas enriquecidas en un enanti�mero con respecto a su correspondiente isómero óptico.

5 Cuando un compuesto desvelado tiene al menos dos centros quirales y se nombra o representa por una estructura sin indicar la estereoqu�mica, se ha de entender que el nombre o la estructura abarca una diastere�mero libre de otros diastere�meros, un par de diastere�meros libres de otros pares diastereom�ricos, mezclas de diastere�meros, mezclas de pares diastereom�ricos, mezclas de diastere�meros en las que un diastereois�mero est� enriquecido

10 con respecto al/a los otro/s diastereois�mero/s y mezclas de pares diastereom�ricos en las que un par diastereom�rico est� enriquecido con respecto al/a los otro/s par/es diastereom�rico/s.

En los compuestos que contienen uno o más dobles enlaces, las designaciones "E", "Z", "cis" y "trans", indican las configuraciones con respecto a la molécula del núcleo.

15 Pueden existir amino�cidos en diversas formas estereoisom�ricas. La convención de Fischer se usa comúnmente para describir la configuración de los grupos en torno al átomo de carbono asimétrico de un amino�cido en comparación con la disposición de los grupos en torno al átomo de carbono asimétrico de gliceraldeh�do. Para los ∀amino�cidos, los grupos amino, carboxilo, R (es decir, la cadena lateral) y H en torno al átomo C∀ corresponden a

El L-gliceraldeh�do y los L-∀-amino�cidos tienen la misma configuración relativa y el D-gliceraldeh�do y los ácidos D∀-amino�cidos tienen la misma configuración relativa. La designación L o D no indica la capacidad del amino�cido para girar el plano de luz polarizada. Muchos L-amino�cidos son dextr�giros.

25 Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" significa que el compuesto representado o nombrado es al menos aproximadamente un 60 % en peso. Por ejemplo, "sustancialmente puro" puede significar aproximadamente un 60%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% o un porcentaje entre el 70% y el 100%. En una

30 realización, sustancialmente puro significa que el compuesto representado o nombrado es al menos aproximadamente un 75 %. En una realización específica, sustancialmente puro significa que el compuesto representado o nombrado es al menos aproximadamente un 90 % en peso. La composición sustancialmente pura que comprende un compuesto representado por la Fórmula estructural I puede comprender los cuatro compuestos representados por las Fórmulas estructurales IV, V, VI o VII, bien solos o en cualquier combinación de los mismos.

35 Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para lograr un efecto deseado en las condiciones de administración, in vitro, in vivo o ex vivo, tal como, por ejemplo, una cantidad suficiente para activar una o más quinasas citoprotectoras en una célula, una cantidad suficiente para inhibir la apoptosis de una célula y una cantidad suficiente para inhibir (por ejemplo, prevenir, retrasar) la isquemia y la lesión

40 por isquemia y reperfusi�n (por ejemplo, en un sujeto). La eficacia de una terapia se puede determinar mediante métodos adecuados conocidos por los expertos en la materia, incluyendo los descritos en el presente documento.

Como se define en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico o profiláctico deseado en un sujeto que lo necesita en las condiciones de administración, tal como, por ejemplo, una cantidad suficiente para inhibir (por ejemplo, prevenir, retrasar) la isquemia y la lesión por isquemia y reperfusi�n en un sujeto (por ejemplo, mediante la inhibición de la apoptosis de una o más células afectadas en el sujeto). La eficacia de una terapia se puede determinar mediante métodos adecuados conocidos por los expertos en la materia.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los solicitantes de que los compuestos derivados de ácido lipoico descritos en el presente documento tienen propiedades citoprotectoras y antioxidantes. En particular, los solicitantes han demostrado que un cierto derivado de ácido lipoico, RLip-EA-OH, activa la Akt quinasa y otras quinasas (por ejemplo, IRK, IGF1R, Src) que se sabe que median en las vías de se�alizaci�n celular que inhiben la apoptosis y potencian la supervivencia celular (Figura 1). Los solicitantes han demostrado además que RLip-EA-OH puede reducir la extensión de la isquemia y la lesión por isquemia y reperfusi�n en un modelo animal de lesión por isquemia y reperfusi�n mioc�rdica.

Los compuestos de la invención pueden estar presentes en forma de sales farmac�uticamente aceptables. Para su uso en medicamentos, las sales de los compuestos de la invención se refieren a sales farmac�uticamente aceptables no tóxicas.

Las sales farmac�uticamente aceptables de los compuestos desvelados incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. La expresión "sales farmac�uticamente aceptables" abarca las sales usadas comúnmente para formar sales de metales alcalinos y para formar sales de adición de ácidos libres o bases libres. La naturaleza de la sal es irrelevante, siempre que sea farmac�uticamente aceptable.

Las sales de adición de ácido farmac�uticamente aceptables adecuadas de los compuestos desvelados se pueden preparar a partir de un ácido inorgánico o un ácido orgánico. Los ejemplos de dichos ácidos inorgánicos son ácido clorhídrico, bromh�drico, yodh�drico, nítrico, carbónico, sulfúrico y fosf�rico. Los ácidos orgánicos apropiados se pueden seleccionar de las clases de ácidos orgánicos alif�ticos, cicloalif�ticos, aromáticos, arilalif�ticos, heteroc�clicos, carbox�licos y sulf�nicos, cuyos ejemplos son el ácido f�rmico, acético, propi�nico, succ�nico, glic�lico, gluc�nico, maleico, emb�nico (pamoico), metanosulf�nico, etanosulf�nico, 2-hidroxietanosulf�nico, pantot�nico, bencenosulf�nico, toluenosulf�nico, sulfan�lico, mes�lico, ciclohexilaminosulf�nico, esteárico, alg�nico, #-hidroxibut�rico, mal�nico, galáctico y galactur�nico. Las sales ácidas/ani�nicas farmac�uticamente aceptables también incluyen sales de acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartrato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloruro, citrato, diclorhidrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gliceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, bromhidrato, clorhidrato, hidroxinaftoato, yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, hidrogenosulfato, tanato, tartrato, teoclato, tosilato y trietyoduro.

Las sales de adición de base farmac�uticamente aceptables adecuadas de los compuestos desvelados incluyen, pero sin limitación, sales met�licas preparadas a partir de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y cinc o sales orgánicas preparadas a partir de N,N’-dibenciletilendiamina, cloroproca�na, colina, dietanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina, lisina, arginina y proca�na. Todas estas sales se pueden preparar por medios convencionales a partir del compuesto correspondiente representado por el compuesto desvelado mediante el tratamiento de, por ejemplo, de los compuestos desvelados con el ácido o la base apropiada. Las sales básicas/cati�nicas farmac�uticamente aceptables también incluyen las sales de dietanolamina, amonio, etanolamina, piperazina y trietanolamina.

En una realización, la sal farmac�uticamente aceptable comprende un cati�n monovalente o un cati�n divalente. En una realización particular, la sal farmac�uticamente aceptable es una sal de lisina.

En otra realización, el cati�n monovalente es un cati�n de metal monovalente y el cati�n divalente es un cati�n de metal divalente. En una realización particular, el cati�n de metal monovalente es un cati�n de sodio.

En otra realización, la invención se refiere a composiciones según lo definido en las reivindicaciones que comprenden un compuesto sustancialmente puro representado por la Fórmula estructural II:

o una sal farmac�uticamente aceptable del mismo. Como se usa en el presente documento, RLip-EA-OH se refiere a la Fórmula estructural II.

En una realización adicional, la invención se refiere a composiciones según lo definido en las reivindicaciones que

con métodos de administración de fármacos conocidos. Los compuestos se pueden administrar solos o en combinación con al menos otro agente conocido o considerado por los solicitantes como útil para la activación de las 10 quinasas citoprotectoras y/o el tratamiento de las lesiones isqu�micas o las lesiones de isquemia y reperfusi�n.

Como alternativa, una composición puede comprender un compuesto representado por los compuestos desvelados

o una sal farmac�uticamente aceptable de los mismos como el único agente farmac�uticamente activo de la composición.

15 Las composiciones farmac�uticamente aceptables de la presente invención comprenden una o más composiciones según lo definido en la reivindicación 1 en combinación con uno o más vehículos y/o diluyentes y/o adyuvantes y/o excipientes farmac�uticamente aceptables no tóxicos, denominados colectivamente en el presente documento “vehículos”, y, si se desea, otros principios activos.

20 En una realización particular, la invención se refiere a una composición para su uso en un método de tratamiento de una isquemia o lesión por isquemia y reperfusi�n en un sujeto mamífero, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición según lo definido en la reivindicación 1, que comprende un compuesto

En otra realización, la invención se refiere a una composición para su uso en un método de tratamiento de una isquemia o lesión por isquemia y reperfusi�n en un sujeto mamífero, que comprende administrar al sujeto una 30 cantidad eficaz de una composición según lo definido en la reivindicación 1, que comprende un compuesto representado por la Fórmula estructural III:

Como se usa en el presente documento, la "lesión producida como consecuencia de la isquemia," el "daño causado por la isquemia" y la "lesión isqu�mica" se refieren a una lesión en una célula, un tejido o un órgano causada por la isquemia, o un suministro insuficiente de sangre (por ejemplo, debido a una arteria bloqueada), y, por lo tanto, de oxígeno, que genera un daño o una disfunción del tejido u órgano (Piper, H. M., Abdallah, C., Schafer, C., “Annals of Thoracic Surgery”, 2003, 75:644; Yellon, D. M., Hausenloy, D. J., New England Journal of Medicine 2007, 357:1121). Las lesiones producidas como consecuencia de la isquemia pueden afectar a diversos tejidos y órganos. Dichas lesiones se pueden tratar mediante los compuestos y los métodos de la invención, incluyendo, por ejemplo, las lesiones causadas por la isquemia cardiovascular, isquemia cerebrovascular, isquemia renal, isquemia hepática, cardiomiopat�a isqu�mica, isquemia cut�nea, isquemia de colon, isquemia intestinal, isquemia gástrica, isquemia pulmonar, isquemia de páncreas, isquemia del músculo esquel�tico, isquemia de los músculos abdominales, isquemia de las extremidades, colitis isqu�mica, isquemia mesent�rica e isquemia silenciosa. Por lo tanto, una lesión producida como consecuencia de la isquemia puede afectar, por ejemplo, al corazón, ri��n, hígado, cerebro, músculo, intestino, estómago, pulmón o piel.

En una realización particular, la lesión producida como consecuencia de la isquemia es el resultado de una isquemia mioc�rdica. Una lesión producida como consecuencia de una isquemia de miocardio se puede deber, por ejemplo, a un infarto de miocardio (por ejemplo, un infarto agudo de miocardio) en un individuo.

En otra realización, la lesión producida como consecuencia de la isquemia es una lesión que se debe a la isquemia cerebral (por ejemplo, una apoplejía) en un individuo.

En otra realización, la lesión producida como consecuencia de la isquemia es una lesión por isquemia y reperfusi�n. Como se usa en el presente documento, la expresión "lesión por isquemia y reperfusi�n" se refiere a una lesión debida al restablecimiento del flujo sanguíneo en una superficie de un tejido u órgano que previamente había experimentado un flujo de sangre deficiente debido a un episodio isqu�mico. El estr�s oxidativo asociado con la reperfusi�n puede dañar los tejidos u órganos afectados. La lesión por isquemia y reperfusi�n se caracteriza bioqu�micamente por un agotamiento del oxígeno durante un episodio isqu�mico seguido por la reoxigenaci�n y la generación simultánea de especies reactivas del oxígeno durante la reperfusi�n (Piper, H. M., Abdallah, C., Schafer, C., Annals of Thoracic Surgery 2003, 75:644; Yellon, D. M., Hausenloy, D. J., New England Journal of Medicine 2007, 357:1121).

Una lesión por isquemia y reperfusi�n se puede deber, por ejemplo, a un suceso natural (por ejemplo, el restablecimiento del flujo sanguíneo tras un infarto de miocardio), a un traumatismo o a uno o más procedimientos quirúrgicos u otras intervenciones terapéuticas que restablezcan el flujo sanguíneo en un tejido u órgano que ha sufrido una disminución del suministro de sangre. Dichos procedimientos quirúrgicos incluyen, por ejemplo, cirugía de injerto de derivación de arterias coronarias, angioplastia coronaria, cirugía de trasplante de órganos y similares (por ejemplo, cirugía de derivación cardiopulmonar). En una realización particular, los compuestos y métodos de la invención son útiles para el tratamiento del daño cardíaco perioperatorio causado por una lesión de isquemia o de isquemia y reperfusi�n.

Para el tratamiento de las lesiones isqu�micas y de isquemia y reperfusi�n causadas por intervenciones terapéuticas tales como los procedimientos quirúrgicos, es preferible que los compuestos de la invención se administren a un sujeto sometido a tratamiento antes de la intervención terapéutica (por ejemplo, cirugía cardiaca, trasplante de órgano). Por ejemplo, se puede administrar un compuesto de la invención a un sujeto sometido a tratamiento, por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o aproximadamente 48 horas antes de la intervención terapéutica. También se puede administrar un compuesto de la invención a un sujeto sometido a tratamiento, por ejemplo, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 45 minutos antes de la intervención terapéutica.

Como alternativa, o además, los compuestos de la invención se pueden administrar a un sujeto sometido a tratamiento en el momento de, o durante, la intervención terapéutica. Por ejemplo, se puede administrar un compuesto una o más veces en el transcurso de una intervención terapéutica a intervalos (por ejemplo, intervalos de

15 minutos). Como alternativa, se puede administrar un compuesto de forma continua a lo largo de una intervención terapéutica.

Adem�s, los compuestos de la invención se pueden administrar a un sujeto sometido a tratamiento tras una intervención terapéutica. Por ejemplo, se puede administrar un compuesto de la invención a un sujeto sometido a tratamiento, por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o aproximadamente 48 horas después de la intervención terapéutica. También se puede administrar un compuesto de la invención a un sujeto sometido a tratamiento, por ejemplo, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 45 minutos después de la intervención terapéutica.

Los compuestos de la invención también se pueden usar para inhibir una isquemia o lesión por isquemia y reperfusi�n en una célula, tejido u órgano, ex vivo, antes de una intervención terapéutica (por ejemplo, un tejido empleado en un procedimiento de injerto, un órgano empleado en una cirugía de trasplante de órganos). Por ejemplo, antes del trasplante de un órgano en un individuo huésped (por ejemplo, durante el almacenamiento o el transporte del órgano en un ambiente estéril), se puede poner el órgano en contacto con un compuesto de la invención (por ejemplo, bañarlo en una solución que comprenda un compuesto de la invención) para inhibir la lesión por isquemia o por isquemia y reperfusi�n.

Las preparaciones farmacéuticas desveladas en el presente documento se preparan de acuerdo con procedimientos convencionales, y se administran en dosis que se seleccionan para reducir, prevenir o eliminar, o para ralentizar o detener la progresión de, la afección que se est� tratando (Véase, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, PA, y “The Pharmaceutical Basis of Therapeutics” de Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, N. Y., para una descripción general de los métodos de administración de diversos agentes para terapia humana). Las composiciones de un compuesto representado por los compuestos desvelados se pueden administrar usando sistemas de administración de liberación controlada o sostenida (por ejemplo, cápsulas, matrices biodegradables). Los ejemplos de sistemas de administración de liberación retardada para la administración de fármacos que serían adecuados para la administración de las composiciones de los compuestos desvelados se describen en las patentes de Estados Unidos N� US 5.990.092 (expedida a Walsh); 5.039.660 (expedida a Leonard); 4.452.775 (expedida a Kent); y 3.854.480 (expedida a Zaffaroni).

Para preparar composiciones farmacéuticas a partir de los compuestos de la presente invención, los vehículos farmac�uticamente aceptables pueden ser bien sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios y gránulos dispersables. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden estar en forma de polvo para su reconstitución en el momento de la administración. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que pueden actuar también como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes disgregantes de comprimidos o un material encapsulante. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que se encuentra mezclado con el principio activo finamente dividido.

En los comprimidos, el principio activo se mezcla con el vehículo que tiene las propiedades de unión necesarias en proporciones adecuadas, y se compacta en la forma y el tamaño deseados.

Los polvos y comprimidos contienen preferentemente del aproximadamente uno al aproximadamente setenta por ciento de principio activo. Los vehículos adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao, y similares. Los comprimidos, polvos, sellos, pastillas, tiras de fusión rápida, cápsulas y pastillas se pueden usar como formas de dosificación sólidas que contienen el principio activo adecuado para la administración oral.

Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones, enemas de retención y emulsiones, por ejemplo, agua o soluciones acuosas de propilenglicol. Para la inyección parenteral, las preparaciones líquidas se pueden formular en solución acuosa de polietilenglicol.

Las soluciones acuosas adecuadas para la administración oral se pueden preparar disolviendo el principio activo en agua y añadiendo colorantes, aromatizantes, agentes estabilizantes y agentes espesantes adecuados según se desee. Las suspensiones acuosas para la administración oral se pueden preparar dispersando el principio activo finamente dividido en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sádica, y otros agentes de suspensión bien conocidos.

La composición farmacéutica est� preferentemente en forma de dosificación unitaria. En dicha forma, la composición se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del principio activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades diferenciadas de, por ejemplo, comprimidos, polvos y cápsulas en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser un comprimido, sello, cápsula o pastilla en s�, o puede ser la cantidad apropiada de cualquiera de éstos en forma

envasada. La cantidad de principio activo de una preparación de dosis unitaria puede variarse o ajustarse de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1000,0 mg, preferentemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg (por ejemplo, para la administración intravenosa) o de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 1.000 mg (por ejemplo, para la administración oral). Las dosis, sin embargo, pueden variarse dependiendo de las necesidades del paciente, la gravedad de la afección que se est� tratando, el compuesto y la vía de administración que se emplee. La determinación de la dosis apropiada para una situación particular est� dentro del alcance de la técnica. Además, la composición farmacéutica puede contener, si se desea, otros agentes terapéuticos compatibles.

En general, los métodos para la administración de los compuestos desvelados y las composiciones farmacéuticas de la invención utilizan in vivo protocolos reconocidos en la técnica para administrar el agente, siendo la única modificación sustancial del procedimiento la sustitución de los compuestos representados con uno cualquiera de los compuestos desvelados para los fármacos en los protocolos reconocidos en la técnica.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía, preferentemente en forma de una composición farmacéutica adaptada a dicha vía, y dependiendo de la afección que se est� tratando. Los compuestos y las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, por vía intravascular, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral o típica. Ser� evidente para los expertos en la materia que las siguientes formas de dosificación pueden comprender como principio activo, bien los compuestos o una sal farmac�uticamente aceptable correspondiente de un compuesto de la presente invención. Un método preferido de administración para los compuestos de la invención es la administración intravenosa.

En algunas realizaciones, la composición se puede administrar por vía parenteral mediante inyección. La administración parenteral puede incluir, por ejemplo, intraarticular, intramuscular, intravenosa, intraventricular, intraarterial, intratecal, subcutánea o intraperitoneal. Las formulaciones para la administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones estériles, isot�nicas, acuosas o no acuosas para inyección. Estas soluciones o suspensiones se pueden preparar a partir de polvos o gránulos estériles que tienen uno o más de los vehículos mencionados para su uso en las formulaciones para la administración oral. Los compuestos se pueden disolver en polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, alcohol benc�lico, cloruro de sodio y/o diversos tampones (por ejemplo, bicarbonato de sodio, hidróxido de sodio).

Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de, por ejemplo, un comprimido, una cápsula, una suspensión o un líquido. La composición se prepara preferentemente en forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del principio activo. Los ejemplos de dichas unidades de dosificación son comprimidos y cápsulas. Para fines terapéuticos, los comprimidos y las cápsulas pueden contener, además del principio activo, vehículos convencionales tales como agentes aglutinantes, por ejemplo, goma arábiga, gelatina, polivinilpirrolidona, sorbitol o tragacanto; cargas, por ejemplo, fosfato de calcio, glicina, lactosa, almidón de maíz, sorbitol o sacarosa; lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, polietilenglicol, sílice o talco; disgregantes, por ejemplo, almidón de patata, agentes aromatizantes o colorantes, o agentes humectantes aceptables. Las preparaciones líquidas orales generalmente en forma de soluciones acuosas

o aceitosas, suspensiones, emulsiones, jarabes o elixires pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes no acuosos, conservantes, agentes colorantes y agentes aromatizantes. Los ejemplos de aditivos para las preparaciones líquidas incluyen goma arábiga, aceite de almendras, alcohol etílico, aceite de coco fraccionado, gelatina, jarabe de glucosa, glicerina, grasas comestibles hidrogenadas, lecitina, metilcelulosa, metil-o propil-para-hidroxibenzoato, propilenglicol, sorbitol o ácido s�rbico .

Para uso t�pico, los compuestos de la presente invención también se pueden preparar en formas adecuadas para ser aplicadas a la piel, o las membranas mucosas de la nariz y la garganta, y pueden tomar la forma de cremas, pomadas, aerosoles líquidos o inhaladores, pastillas, o pinturas garganta. Tales formulaciones típicas pueden incluir además compuestos químicos tales como dimetilsulf�xido (DMSO) para facilitar la penetraci�n superficial del principio activo. Los vehículos adecuados para la administración típica incluyen aceite-en-agua o agua-en-aceite de emulsiones con aceites minerales, vaselina y similares, as� como geles tales como hidrogel. Formulaciones típicas alternativas incluyen preparaciones de champú, pastas orales y enjuague bucal.

Para la aplicación en los ojos o los oídos, los compuestos de la presente invención se pueden presentar en forma líquida o semil�quida formulada en bases hidrófobas o hidrófilas como pomadas, cremas, lociones, pinturas o polvos.

Para la administración rectal, los compuestos de la presente invención se pueden administrar en forma de supositorios mezclados con vehículos convencionales tales como manteca de cacao, cera u otro glic�rido. Para preparar supositorios, primero se funde una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glic�ridos de ácidos grasos o manteca de cacao, y se dispersa homog�neamente el principio activo en la misma, como por agitaci�n. A continuación, se vierte la mezcla homogénea fundida en moldes de un tamaño conveniente, se dejan enfriar, y de ese modo, solidificar.

La administración también puede ser por inyección en el cerebro o una cavidad corporal de un paciente o mediante el uso de sistemas de administración de matriz de liberación sostenida o controlada, o mediante la administración in

situ usando micelas, geles y liposomas. Los dispositivos de nebulizaci�n, los inhaladores de polvo y las soluciones en aerosol son representativos de los métodos que se pueden usar para administrar dichas preparaciones en el tracto respiratorio. La administración puede ser in vitro, in vivo o ex vivo.

Por ejemplo, las dosis intravenosas adecuadas para un compuesto de la invención pueden ser de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal por tratamiento. La determinación de la dosis y la vía de administración para un agente, paciente e isquemia o lesión por isquemia y reperfusi�n en particular es competencia de un experto en la materia. Preferentemente, la dosis no causa efectos secundarios adversos o produce efectos secundarios adversos mínimos.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención se puede administrar solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos adecuados que son útiles para el tratamiento de las lesiones isqu�micas, que se pueden administrar en combinación con un compuesto de la invención, incluyen, pero sin limitación, bloqueadores de los canales de calcio, bloqueadores #, nitroglicerina, aspirina, agentes antiinflamatorios, factores natriur�ticos, vasodilatadores , trombol�ticos y agentes antitromb�ticos.

Por lo tanto, un compuesto de la invención se puede administrar como parte de una terapia de combinación (por ejemplo, con uno o más de otros agentes terapéuticos). El compuesto de la invención se puede administrar antes, después o simultáneamente con uno o más de otros agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, un compuesto de la invención y otro agente terapéutico se pueden coadministrar simultáneamente (por ejemplo, al mismo tiempo), bien como formulaciones separadas o como una formulación conjunta. Como alternativa, los agentes se pueden administrar de forma secuencial, como composiciones separadas, en un marco temporal apropiado, según lo determinado por el practicante cl�nico (por ejemplo, un tiempo suficiente para permitir un solapamiento de los efectos farmacéuticos de las terapias). Un compuesto de la invención y uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar en una sola dosis o en dosis múltiples, en un orden y en un horario adecuados para lograr un efecto terapéutico deseado (por ejemplo, una reducción y/o inhibición de la inflamación articular; una reducción y/o inhibición de la isquemia, una reducción y/o inhibición de una lesión isqu�mica; una reducción y/o inhibición de una lesión por isquemia y reperfusi�n). Las dosis y las pautas de administración adecuadas pueden ser determinadas por un m�dico, y dependen del/de los agente/s seleccionado/s, la formulación farmacéutica y la vía de administración, varios factores del paciente y otras consideraciones.

Como se describe en el presente documento, la presente invención se basa además en el sorprendente descubrimiento de que la administración de múltiples dosis de un compuesto de la invención a intervalos de dosificación prolongados no convencionales puede potenciar la eficacia del compuesto para el tratamiento de una lesión isqu�mica o lesión por isquemia y reperfusi�n con respecto a la administración de una sola dosis del compuesto. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la invención se refiere a una composición para su uso en un método para el tratamiento de una lesión isqu�mica o una lesión por isquemia y reperfusi�n resultado de una intervención terapéutica en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto múltiples dosis (es decir, 2 o más) de un compuesto de la invención. En una realización particular, el método comprende administrar al sujeto al menos dos dosis de un compuesto de la invención, o una sal farmac�uticamente aceptable del mismo, antes de la intervención terapéutica, en el que las dosis comprenden una dosis no final y una dosis final. Como se usa en el presente documento, "dosis final" se refiere a la última dosis de un compuesto de la invención que se administra al sujeto antes de la intervención terapéutica. Preferentemente, la dosis final se administra inmediatamente antes de la lesión. Como se usa en el presente documento, el término "inmediatamente" en asociación con "dosis final" y "lesión" significa cerca o muy cerca en el tiempo, de modo que no existe una dosis intercalada entre la dosis final y la lesión. Como se define en el presente documento, "inmediatamente antes de la lesión" significa un punto temporal en el intervalo de aproximadamente 0 minutos (por ejemplo, al iniciarse la lesión) a aproximadamente 2 horas antes de la lesión. Los puntos temporales a modo de ejemplo para la administración de la dosis final incluyen, por ejemplo, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos y aproximadamente 90 minutos antes de la lesión.

La expresión "dosis no final" se refiere a una dosis de un compuesto de la invención que precede a la dosis final, de modo que no hay dosis intermedias del compuesto administrado al sujeto entre las dosis no final y final. En general, la dosis no final se administrar� al sujeto en un punto temporal incluido dentro de aproximadamente 48 horas antes de la lesión, preferentemente dentro de aproximadamente 24 horas antes de la lesión, más preferentemente dentro de aproximadamente 12 horas antes de la lesión (por ejemplo, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 6 horas o aproximadamente 4 horas antes de la lesión).

De acuerdo con la invención, la dosis no final y la dosis final se administran en un intervalo de dosificación que potencia la eficacia del compuesto para el tratamiento de la lesión con respecto a la administración de una sola dosis del compuesto. Como se usa en el presente documento, el término "potenciar" significa mejorar o aumentar el efecto de un fármaco, o promover o reforzar una acción o un efecto bioquímico o fisiológico de un fármaco. Como se usa en el presente documento, la expresión "potencia la eficacia del compuesto" significa mejora o aumenta una acción o un efecto bioquímico o fisiológico del compuesto en el sujeto, en particular, en lo que se refiere al tratamiento de uno

o más síntomas de la lesión isqu�mica o la lesión por isquemia y reperfusi�n que se est� buscando tratar.

Por lo general, la eficacia de un agente farmacol�gico est� directamente relacionada con su concentración en plasma, de modo que la eficacia se reduce a medida que desciende la concentración en plasma Por lo tanto, en las pautas convencionales de múltiples dosis, se administra un agente farmacol�gico en una pauta de dosificación que est� diseñada para mantener una concentración en plasma predeterminada u óptima en el sujeto sometido a tratamiento. Cuando se administra el agente a intervalos de dosificación que son mayores que el/los intervalo/s óptimo/s, su concentración en plasma puede caer hasta niveles indeseablemente bajos, antes de administrarse la siguiente dosis, con la consecuente disminución de la eficacia. Sin embargo, como se describe en el presente documento, la administración de múltiples dosis de un compuesto de la invención a intervalos de dosificación que son mucho mayores que los intervalos convencionales (por ejemplo, a intervalos de dosificación de al menos aproximadamente 4 semividas del compuesto) mejora inesperadamente la eficacia del compuesto.

Un experto en la materia puede evaluar fácilmente la eficacia de un compuesto para el tratamiento de una lesión isqu�mica o una lesión por isquemia y reperfusi�n mediante la medición de parámetros bioquímicos o fisiológicos en el sujeto antes y después del tratamiento del sujeto mediante el uso de ensayos convencionales para el/los parámetro/s que se est�/n midiendo. Por ejemplo, se puede determinar la eficacia de un compuesto de la invención mediante el análisis de los niveles de biomarcadores cardíacos sustitutos, incluyendo ciertas enzimas cardíacas (por ejemplo, creatina quinasa (CK-MB), troponina-T, troponina-I), en muestras de sangre obtenidas de un sujeto en diversos puntos temporales antes y después de la lesión isqu�mica o la lesión por isquemia y reperfusi�n, de modo que una reducción estadísticamente significativa en los niveles de las enzimas indica el compuesto que tiene eficacia en el tratamiento de la lesión. En una evaluación a modo de ejemplo, se recogen una o más muestras de sangre de un sujeto antes de la lesión (por ejemplo, de aproximadamente 6 a aproximadamente 48 horas antes de la lesión) y se analizan los niveles de CK-MB y troponina-T. A continuación, se recogen muestras de sangre del sujeto en diversos puntos temporales tras la lesión (por ejemplo, a las 6,0, 12,0, 18,0 y 24,0 horas de la lesión) y se analizan los niveles de CK-MB y troponina-T en una o más de estas muestras.

La eficacia de un compuesto de la invención también se puede determinar mediante monitorización de electrocardiograma (ECG). Por ejemplo, se puede realizar una monitorización ECG continua de 12 derivaciones convencional tras colocar al sujeto un dispositivo de monitorización ECG continua de 12 derivaciones con almacenamiento electrónico de datos antes de la dosificación (por ejemplo, aproximadamente 5 minutos antes de la dosificación). A continuación, se pueden obtener lecturas del ECG antes y después de la lesión (por ejemplo, hasta aproximadamente 24 horas después de la lesión). Un cambio de una traza de ECG anómala a una traza de ECG normal (por ejemplo, una reducción de un segmento ST elevado) indica el compuesto que tiene eficacia en el tratamiento de la lesión.

Adem�s, como se describe en el Ejemplo 8 del presente documento, la eficacia de un compuesto de la invención también se puede evaluar determinando la proporción de la superficie del infarto de miocardio (IM) con respecto a la superficie isqu�mica en riesgo (SR), de modo que una reducción estadísticamente significativa de la proporción IM/SR indica el compuesto que tiene eficacia en el tratamiento de la lesión.

Con el uso de cualquier medida adecuada de la eficacia, incluyendo las descritas anteriormente (por ejemplo, los niveles de enzimas cardíacas, trazas de ECG, proporciones IM/SR), un experto en la materia puede determinar si la eficacia de un compuesto es superior cuando el compuesto se administra como dosis múltiples en comparación con la administración de una sola dosis. Por ejemplo, se puede comparar una medida de la eficacia de un compuesto para una pauta posol�gica múltiple con una medida correspondiente de su eficacia para la administración de una sola dosis por la misma vía. La medición de la eficacia correspondiente para una cantidad de dosis dada (por ejemplo, 5,0 mg/kg por vía intravenosa) cuando se administra como una sola dosis puede ser, por ejemplo, una medición de la eficacia típica o convencional basada en un estudio de población previo (por ejemplo, un ensayo cl�nico). Como alternativa, la eficacia de la administración de una sola dosis de una dosis dada de compuesto se puede determinar experimentalmente en otro paciente que se est� tratando por la misma lesión.

M�s específicamente, los datos de estudios cl�nicos realizados siguiendo los protocolos convencionales que miden estos parámetros se pueden usar para determinar las dosis y los intervalos de dosificación adecuados para potenciar la eficacia de los compuestos de la invención en una población dada (por ejemplo, una población que comprende los sujetos en necesidad de tratamiento, tales como pacientes sometidos a ciertos procedimientos quirúrgicos descritos en el presente documento). Una disminución o un aumento estadísticamente significativo de un parámetro medido en el sujeto o en la población de sujetos indica la/s dosis y el/los intervalos de dosificación que potencian la eficacia del compuesto para el tratamiento de una lesión isqu�mica o una lesión por isquemia y reperfusi�n.

Los intervalos de dosificación entre la dosis no final y la dosis final que potencian la eficacia de un compuesto de la invención en métodos de varias dosis con respecto a la administración de una sola dosis del compuesto son normalmente de al menos aproximadamente 4 horas de duración, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas, preferentemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 horas, más preferentemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 horas.

Como se ha descrito anteriormente, la eficacia de un agente farmacol�gico est� generalmente correlacionada con su concentración en plasma, de modo que la eficacia se reduce cuando cae la concentración en plasma. Como la concentración en plasma de un compuesto est� directamente relacionada con su semivida, a menudo, se usa la semivida del compuesto para determinar un intervalo de dosificación apropiado para mantener una concentración en 5 plasma predeterminada u óptima en el sujeto sometido a tratamiento. Por lo tanto, los intervalos de dosificación para potenciar la eficacia de un compuesto también se pueden definir en términos de la semivida del compuesto. As� pues, en otra realización, la invención se refiere a una composición para su uso en un método para el tratamiento de una lesión isqu�mica o una lesión por isquemia y reperfusi�n resultado de una intervención terapéutica en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto dos dosis de un compuesto de la invención, o una sal

10 farmac�uticamente aceptable del mismo, antes de la intervención terapéutica, en el que las dos dosis comprenden una dosis no final y una dosis final, y en el que:

(a) la dosis final se administra al sujeto en un punto temporal incluido en aproximadamente dos semividas del compuesto antes de la intervención terapéutica; y

15 (b) la dosis no final se administra al sujeto en un punto temporal que es al menos aproximadamente cuatro semividas del compuesto antes de la administración de la dosis final.

Preferentemente, la dosis final del compuesto se administra al sujeto en un punto temporal del intervalo de aproximadamente 0,25 semividas a aproximadamente 2 semividas del compuesto antes de la intervención

20 terapéutica, más preferentemente de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 1 semivida del compuesto antes de la intervención terapéutica. Por lo tanto, la dosis final se puede administrar al sujeto en aproximadamente 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75 o aproximadamente 2,0 semividas del compuesto antes de la intervención terapéutica.

La dosis no final se administra al sujeto en un punto temporal que es al menos aproximadamente 4 semividas del

25 compuesto antes de la administración de la dosis final, incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 4 semividas, aproximadamente 5 semividas, aproximadamente 6 semividas, aproximadamente 7 semividas, aproximadamente 8 semividas, aproximadamente 9 semividas, aproximadamente 10 semividas, aproximadamente 12 semividas, aproximadamente 15 semividas, aproximadamente 20 semividas y aproximadamente 30 semividas antes de la administración de la dosis final. Los ejemplos de intervalos son mayores de los que se suelen emplear en

30 las pautas posol�gicas convencionales por las razones descritas en el presente documento.

La semivida de un compuesto es una medida del tiempo requerido para que la concentración del compuesto se reduzca a la mitad (50 %) de su valor máximo (inicial), y puede ser determinada por un experto en la materia usando metodolog�as convencionales. As� pues, por ejemplo, en 1 semivida, la concentración relativa del compuesto 35 es el 50 % de su concentración inicial (es decir, punto temporal 0), mientras que, en 2 semividas, el compuesto est� presente al 25 % de su concentración inicial, en 3 semividas, el compuesto est� presente al 12,5 % de su concentración inicial, en 4 semividas, el compuesto est� presente al 6,25 % de su concentración inicial, en 5 semividas, el compuesto est� presente al 3,12 % de su concentración inicial, en 6 semividas, el compuesto est� presente al 1,56 % de su concentración inicial, etc. Por consiguiente, la semivida de un compuesto sirve como

40 medida de la tasa de disminución de su concentración en la sangre de un sujeto que ha recibido el compuesto.

donde k es cualquier constante de velocidad de primer orden.

45 Un experto en la materia puede determinar la semivida de un compuesto de la invención, por ejemplo, mediante la administración del compuesto a un sujeto, la obtención de muestras de sangre del sujeto en diversos puntos temporales tras la administración del compuesto, el análisis de los niveles y/o la concentración del compuesto en la muestra de sangre (por ejemplo, mediante espectrometr�a de masas) y el procesamiento de los datos usando

50 cualquier programa inform�tico o algoritmo adecuado. Por ejemplo, la semivida de un compuesto y otros parámetros PK se pueden calcular fácilmente usando los productos inform�ticos WinNolin∃ (Pharsight∃; Mountain View, California).

Los datos de estudios cl�nicos realizados siguiendo los protocolos convencionales que miden la semivida se pueden

55 usar para determinar la semivida de cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento. Esta información puede ser usada por un practicante cl�nico o m�dico en la determinación de una o varias dosis adecuadas y uno o varios intervalos de dosificación que potencien la eficacia del compuesto para el tratamiento de una lesión isqu�mica o una lesión por isquemia y reperfusi�n.

60 En las Tablas 15-17 de los Ejemplos 12 y 13 del presente documento, se describen las semividas para diferentes dosis del compuesto RLip-EA-OH en ratas y seres humanos.

Preferentemente, la concentración de un compuesto, o sal farmac�uticamente aceptable del mismo, de la invención es inferior o igual al aproximadamente 10 % de su concentración máxima (Cm�x) o nivel máximo observado en plasma (o sangre) tras la dosificación, en una muestra de sangre (por ejemplo, suero, plasma, sangre entera) obtenida del sujeto en el momento de la administración de la dosis final. Por ejemplo, la concentración del compuesto, o de la sal farmac�uticamente aceptable del mismo, puede ser del aproximadamente 0 %, aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 6 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 % de su concentración máxima (Cm�x) en una muestra obtenida del sujeto en el momento de la administración de la dosis final. La Cm�x de un compuesto se puede determinar, por ejemplo, tomando muestras de sangre de un sujeto que haya recibido el compuesto y luego analizando las muestras en cuanto a la concentración del compuesto usando un método analítico apropiado (por ejemplo, espectrometr�a de masas). Con los datos obtenidos, la Cm�x normalmente se calcula usando un algoritmo o programa inform�tico adecuado, (por ejemplo, los productos inform�ticos WinNolin∃ (Pharsight∃; Mountain View, California)). La determinación de la Cm�x de un compuesto en un sujeto puede ser fácilmente realizada por un practicante cl�nico o m�dico.

En una realización, las dosis no final y final son equivalentes. Como alternativa, la dosis no final y la dosis final pueden variar en cantidad (por ejemplo, una dosis no final de aproximadamente 1,0 mg/kg y una dosis final de aproximadamente 0,5 mg/kg, administrándose ambas dosis por vía intravenosa) y/o en la vía de administración (por ejemplo, una dosis no final intravenosa y dosis final intracardiaca). Preferentemente, las dosis no final y final se administran a un sujeto por vía intravenosa a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5,0 mg/kg. Otras vías preferidas de administración para los compuestos de la invención incluyen, por ejemplo, intracardiaca (IC), intraperitoneal (IP) y oral (PO). Como se describe en el presente documento, el compuesto RLip-EA-OH fue eficaz en un modelo de rata de lesión por I/R cuando se administr� por vía intravenosa (por bolo IV y por infusión), por vía oral y mediante administración intracardiaca.

Las dosis de un compuesto de la invención proporcionadas a un sujeto pueden variar dependiendo de las necesidades del paciente, la gravedad de la afección que se est� tratando, la vía de administración y el compuesto que se est� empleando. La determinación de la dosis apropiada para una determinada situación pertenece al alcance de la técnica. Por ejemplo, las dosis adecuadas para la administración a seres humanos se pueden extrapolar a partir de los datos obtenidos en los experimentos realizados en modelos animales (por ejemplo, rata). Las directrices para la extrapolación de los datos de dosis de modelos animales no humanos a las dosis para seres humanos se puede encontrar, por ejemplo, en “FDA Draft Guidance: Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers” (2005).

Los múltiples métodos de dosificación de la invención descritos en el presente documento, en ciertas realizaciones, también pueden comprender la etapa de administrar una o más dosis adicionales de un compuesto de la invención. Dichas dosis adicionales se pueden administrar antes de, pero no entre, la dosis no final y la dosis final (es decir, antes de la dosis no final). Por lo general, dichas dosis anteriores se administran en el plazo de aproximadamente 7 días antes de la intervención terapéutica, por ejemplo, en el plazo de aproximadamente 6 días, en el plazo de aproximadamente 5 días, en el plazo de aproximadamente 4 días, en el plazo de aproximadamente 3 días, en el plazo de aproximadamente 2 días o en el plazo de aproximadamente 1 día antes de la intervención terapéutica. Otros puntos temporales adecuados para la administración de un compuesto de la invención antes de la administración de la dosis no final en una pauta posol�gica múltiple incluyen, pero sin limitación, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 10 horas y aproximadamente 8 horas antes de la intervención terapéutica.

Como alternativa, o además, se pueden administrar una o más dosis del compuesto al sujeto en una pauta posol�gica múltiple de la invención tras la lesión isqu�mica o lesión por isquemia y reperfusi�n. Los puntos temporales adecuados para la administración de las dosis de un compuesto de la invención tras una lesión isqu�mica o lesión por isquemia y reperfusi�n incluyen los descritos anteriormente en el presente documento, por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3 o aproximadamente 4 horas después de la lesión.

Por consiguiente, se puede administrar un compuesto de la invención a un sujeto que lo necesita en 2 o más dosis, tal como, por ejemplo, 2 dosis, 3 dosis, 4 dosis, 5 dosis, 6 dosis, 7 dosis, 8 dosis, 9 dosis o 10 dosis. Dichas dosis pueden abarcar un período de tiempo de aproximadamente 7 días antes de una lesión isqu�mica o lesión por isquemia y reperfusi�n resultado de una intervención terapéutica a aproximadamente 7 días después de una lesión isqu�mica o lesión por isquemia y reperfusi�n, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 2 días antes de una lesión isqu�mica o lesión por isquemia y reperfusi�n resultado de una intervención terapéutica a aproximadamente 1 día después de una lesión isqu�mica o lesión por isquemia y reperfusi�n.

Las dosis adicionales previas a la dosis no final y/o posteriores a la lesión se pueden administrar en el mismo intervalo de dosis y/o vía de administración que las dosis no final y final o se pueden proporcionar en un intervalo de dosis y/o vía de administración que difiera del de las dosis no final y final. Por ejemplo, un compuesto de la invención se puede administrar a un sujeto que lo necesita en tres dosis, de modo que las dosis se proporcionan a las 8 horas (es decir, dosis adicional previa a la dosis no final), 5 horas (es decir, dosis no final) y 0,25 horas (es decir, dosis

final) antes de la intervención terapéutica.

Del mismo modo, cada una de las dosis adicionales administradas antes de la dosis no final o después de la lesión se puede proporcionar, bien en una dosis que es equivalente a la dosis no final o final, o en una o más otras dosis diferentes. Por ejemplo, un compuesto de la invención se puede administrar a un sujeto que lo necesita en tres dosis, que comprenden una dosis no final, una dosis final y una dosis adicional, de modo que las dosis no final y final se proporcionan por vía intravenosa a 0,5 mg/kg y la dosis adicional se proporciona por vía intravenosa a 1,0 mg/kg.

La determinación de una pauta posol�gica múltiple apropiada para un compuesto en particular de la invención, el paciente y la isquemia o lesión por isquemia y reperfusi�n es competencia de un experto en la materia.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis de compuestos

Materiales y Métodos:

S�ntesis de RLip-EA-OH (Lip-EA)

Se disolvió ácido RLipoico (RLip-OH, 1,00 g) en dioxano. Se protegió la solución de la luz directa, cubriendo el matraz de reacción con papel de aluminio. Se añadieron DIEA (0,845 ml) y DSC (1,24 g) secuencialmente, y se agit� la reacción durante toda la noche con ventilación a temperatura ambiente, formándose Lip-NHS in situ. Se prepar� una solución acuosa de glutamil-alanina (H-EA-OH, 1,11 g) y DIEA (2,65 ml), y se a�adi� a la solución de Lip-NHS. Se agit� la solución combinada durante una noche y después se transfirió a un embudo de separación. Se a�adi� acetato de etilo seguido de KHSO4 (ac.) al 5 % a la mezcla de reacción. Se recogió la fase orgánica y se lav� con KHSO4 (ac) al 5 % seguido de NaCl (ac) saturado. Se volvió a recoger la fase orgánica, se secó con Na2SO4 anhidro y, tras la filtración, se evapor� al vacío, produciendo RLip-EA-OH en bruto en forma de una espuma de color amarillo claro. Se disolvió una porción de la espuma en bruto para la purificación por RP-HPLC con agua-acetonitrilo 2:1 (HOAc al 0,5 %) y se aisl� el producto en una columna de fase inversa C18 YMC Pack Pro usando un gradiente creciente de acetonitrilo (ácido acético al 0,5 %) en agua (ácido acético al 0,5 %). Se identificaron las fracciones que contenían el producto por HPLC analítica, se combinaron, congelaron y liofilizaron, proporcionando RLip-EA-OH (165 mg) a una pureza según la HPLC del 100 % (% de superficie a 220 nm). La RMN del producto coincidió con la estructura y result� tener una masa observada de 405 (M-1), calculada de 406.

Se prepararon R/SLip-EA-OH y sLip-EA-OH usando un procedimiento similar. Se obtubieron materiales de partida RLip-OH y SLip-OH �pticamente puros para la preparación de RLip-EA-OH y SLip-EA-OH, respectivamente. Se ensay� la pureza óptica mediante rotación óptica y result� cumplir las especificaciones de liberación. Se confirmaron la estructura del producto y la identidad por EM, HPLC con desplazamiento de tiempos de retención (con respecto al material de partida Lip-OH) y, en la mayoría de los casos, RMN. En la Tabla 1, se incluyen las estructuras, los nombres y las abreviaturas adecuadas de los compuestos descritos en el presente documento. Los datos analíticos sobre los compuestos descritos en el presente ejemplo se muestran en la Tabla 2.

RLip-OH se adquirió del mercado (Labochim, Milán, Italia). R/sLip-Ea-OH y Ac-EA-OH se obtuvieron mediante contrato.

Preparaci�n de la sal de dilisina de RLip-EA-OH (Lip-EA)

Se disolvió RLip-EA-OH (20,0 g) en etanol-agua (19:1). Se añadieron dos equivalentes de lisina (14,4 g) a la solución etan�lica de RLip-EA-OH y se calentó la suspensión a reflujo. Tras someter a reflujo durante 30 minutos, se dej� enfriar la solución hasta la temperatura ambiente. Se recuper� el producto de sal de dilisina de RLip-EA-OH por filtración, se enjuag� con etanol absoluto y se secó hasta obtenerse un peso constante para una recuperación del 96 % de la sal de dilisina de RLip-EA-OH.

Tabla 1. Abreviaturas, estructuras y nombres químicos de los compuestos Tabla 2. Datos analíticos para los compuestos enumerados en la Tabla 1

Abreviaturas del compuesto

Estructura del compuesto Nombre completo*

RLip-OH

ácido (R)-lipoico

RLip-LGlu-LAla-OH; RLip-EA-OH

N-(R)-lipoil-L-glutamil-L-alanina

R/SLip-LGlu-LAla-OH; R/SLip-EA-OH

N-(R/S)-lipoil-L-glutamil-L-alanina

SLip-LGlu-LAla-OH; SLip-EA-OH

N-(S)-lipoil-L-glutamil-L-alanina

R/sLip-LGlu-DAla-OH; R/SLip-Ea-OH

N-(R/S)-lipoil-L-glutamil-D-alanina

Ac-LGlu-LAla-OH; Ac-EA-OH

N-acetil-L-glutamil-L-alanina

* Se us� la nomenclatura convencional para los amino�cidos naturales y análogos comunes [J. Biol. Chem. 1972, 247:977-983]; Lipoil = 1,2-ditiolan-3-pentano�lo

Compuesto

RMN* Pureza seg�nHPLC# Espectroscopiade masas Rotación óptica

RLip-OH†

ND 99,9 % ND + 121,7

RLip-LGlu-LAla-OH

Ditiolan-CH-S-m, 1H, % 3,10 Glutamil, Alaninil ∀C-H m, 2H, % 4,38 100 % Calc.: 406 Encont. (M-1): 405 +36,1

R/SLip-LGlu-LAla-OH†

Ditiolan-CH-S-m, 1H, % 3,10 Glutamil, Alaninil ∀C-H m, 2H, % 4,38 99,6 % Calc: 406 Encont.: 406 -24,2

sLip-LGlu-LAla-OH

ND 96,5 % Calc: 406 Encont. (M-1): 405 -69,5

R/SLip-LGlu-DAla-OH†

ND 99,6 % Calc: 406 Encont.: 406 ND

Ac-LGlu-LAla-OH†

ND 99,6 % Calc: 261 Encont.:261 ND

*RMN de 1H obtenida bien en metanol (d4) o en DMSO (d6) # Porcentaje de superficie a & = 220 nm † Datos analíticos adquirido en el mercado o mediante contrato de certificado de análisis ND = no disponible

Ejemplo de referencia 2: el tratamiento con RLip-EA-OH induce la fosforilaci�n/activación de Akt de una manera dependiente de la dosis en células cultivadas

Akt se activa a través de la fosforilaci�n mediante la activación de vías de transducci�n de señales a través de receptores conocidos de la membrana plasm�tica de las células. La Akt fosforilada se detecta fácilmente con anticuerpos específicos in situ en células fijadas y permeabilizadas.

Materiales y métodos:

Ensayo de citotransferencia para la activación de Akt

La capacidad de RLip-EA-OH para aumentar la Akt fosforilada se ensay� usando una transferencia Western en células o citotransferencia. Se seleccionaron las células A549 (línea celular de cáncer de pulmón no microc�tico humano) porque estas células se pueden manipular para aumentar o disminuir el nivel de Akt fosforilada. Se inocularon las células en placas de cultivo y se permitió su adherencia a la parte inferior, y a continuación, se trataron, se fijaron y se permeabilizaron. Tras la permeabilizaci�n, se trataron las células con anticuerpos específicos bien de Akt fosforilada o Akt total. Entonces, se trataron las células con anticuerpos secundarios fluorescentes para cuantificar la cantidad de anticuerpo primario unido. Se detectaron simultáneamente la Akt total y la Akt fosforilada.

Se sembraron células A549 en placas de microtitulaci�n tratadas con cultivo celular, de fondo transparente y paredes negras, de 384 pocillos con a una confluencia del 70 %. Se incubaron las células durante una noche para permitir la unión celular. Se cambi� el medio a bajo en suero (0,1 %, suero bovino fetal [FBS]) y se incubaron las células durante otras 24 horas. Se trataron las células con compuestos de ensayo, se fijaron y se permeabilizaron para el ensayo de Akt. El fijador fue formaldeh�do al 3,7 % en tampón fosfato salino. El tampón de permeabilizaci�n fue Triton X-100 al 0,5 % en tampón fosfato salino. Tras la permeabilizaci�n de las células, se determinaron las cantidades de Akt total y Akt fosforilada en cualquiera de los dos sitios de fosforilaci�n (treonina-308 y serina-473) a 7 concentraciones de ensayo, realizándose cada una de ellas por cuadruplicado. Los datos de Akt fosforilada se normalizaron con respecto a la Akt total y se rest� el fondo para su análisis.

Tras la privación de suero durante una noche para reducir la fosforilaci�n de Akt basal, se estimularon las células con vehículo, RLip-EA-OH o RLip-OH. Se trataron las células durante 45 minutos o 3 horas y se estudi� la fosforilaci�n en serina-473 o treonina 308, respectivamente.

Ensayo inmunohistoqu�mico para Akt fosforilada

Se ensay� la capacidad de RLip-EA-OH para aumentar la Akt fosforilada en células H9c2 mediante inmunocitoqu�mica seguida de la visualización mediante microscop�a. Las células H9c2 son una línea celular derivada de miocitos cardiacos de rata, y se pueden manipular para aumentar o disminuir el nivel de Akt fosforilada. Se inocularon las células en placas de cultivo y se permitió su adherencia a la parte inferior, se trataron, se fijaron y se permeabilizaron. Tras la permeabilizaci�n, se trataron las células inicialmente con anticuerpos específicos de Akt fosforilada, seguidos por anticuerpos secundarios fluorescentes para cuantificar la cantidad de anticuerpo primario unido.

Se sembraron células H9c2 en placas tratadas con cultivo celular de 12 pocillos a una confluencia del 70 %. Se incubaron las células durante una noche para permitir la unión celular. Se cambi� el medio a bajo en suero (0,5 %, suero bovino fetal [FBS]) y se incubaron las células durante otras 48 horas. Se trataron las células durante 3 horas, bien con vehículo, RLip-EA-OH (50 ∋M) o en cotratamiento con LY294002 (25 ∋M), se fijaron con formaldeh�do al 3,7 % en tampón fosfato salino y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % en tampón fosfato salino. Tras la permeabilizaci�n, se trataron las células con anticuerpo específico de la Akt fosforilada en treonina-308, seguido del tratamiento con un anticuerpo secundario marcado fluorescente.

Resultados:

Se evalu� el efecto de RLip-EA-OH y RLip-OH en la fosforilaci�n de Akt con respecto a la Akt total en células A549 usando un ensayo de citotransferencia como se ha descrito. Se observ� un aumento de 3 veces y de 2 veces en la Akt fosforilada en la serina 473 a los 45 minutos del tratamiento con RLip-EA-OH y RLip-OH, respectivamente (Figura 2). Tanto RLip-EA-OH como RLip-OH aumentaron la cantidad de Akt fosforilada con respecto a la Akt total de una manera dependiente de la dosis. RLip-EA-OH fue más eficaz que RLip-OH en la mayoría de niveles de dosis.

Tambi�n se evalu� el tratamiento con RLip-EA-OH en presencia y ausencia de LY294002, un inhibidor conocido de la fosfotidilinositol-3’-quinasa (Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F., “A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002)”. J Biol Chem 1994, 269:5241-5248). Se trataron las células durante 3 horas y se estudi� la fosforilaci�n en tirosina-308. Se observ� un aumento de la fosforilaci�n de Akt tras 3 horas de tratamiento solo con RLip-EA-OH. El aumento de la fosforilaci�n de Akt en respuesta al tratamiento con RLip-EA-OH fue completamente inhibido por el cotratamiento con LY294002 5 ∋M (Figura 3). Además, se evalu� el efecto de RLip-EA-OH en la fosforilaci�n de Akt en células H9c2 usando un ensayo de inmunohistoqu�mica como se ha descrito. Se compar� el tratamiento con RLip-EA-OH bien con el tratamiento con vehículo o con el tratamiento con RLip-EA-OH en presencia de LY294002. Las células tratadas con vehículo mostraron poca fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia fue mucho mayor en las células que fueron tratados durante 3 horas con RLip-EA-OH. El cotratamiento de las células con LY294002 durante otros 30 minutos antes de la adición de RLip-EA-OH disminuyó la intensidad de la fluorescencia de la fosforilaci�n de Akt.

Ejemplo de referencia 3: RLip-EA-OH activa la tirosina quinasa receptora de la insulina (IRK)

Materiales y métodos: ensayo de activación de IRK

5 La actividad de la quinasa receptora de insulina se midió fácilmente mediante un ensayo de cambio de la movilidad usando un calibrador LabChip∃ 3000 y un sistema Sipper-12 LabChip∃ para detectar el sustrato tanto fosforilado como no fosforilado (Caliper Life Sciences, Discovery Alliances and Services Division, Hanover, MD). El ensayo de cambio de la movilidad de las quinasas usa un chip microflu�dico para medir la conversión de un sustrato pept�dico fluorescente en un producto fosforilado. Se introdujo la mezcla de reacción de un pocillo de la placa de

10 microtitulaci�n a través de un sistema Sipper capilar colocado sobre el chip, y se separaron el sustrato no fosforilado y el producto fosforilado por electroforesis y se detectaron a través de la fluorescencia inducida por láser. El comportamiento de la señal de fluorescencia a lo largo del tiempo revel� la extensión de la reacción. Las subunidades catalíticas de las tirosina quinasas tienen niveles end�genos de actividad en presencia de ATP y sustrato, por lo tanto, los resultados se presentan como el % de control.

15 En concreto, se diluyó cada compuesto de ensayo hasta 25 veces su concentración de ensayo con DMSO al 100 % y se a�adi� a 12 ∋l de una solución tampón de ensayo (HEPES 100 mM, MnCl2 10 mM, B-GP 5 mM y Brij al 0,002 %) que contenía ditioteritol (DTT, 2 mM) y dominio quinasa receptora de insulina (catálogo de Millipore N� 14466, 80 nM) antes de la preincubaci�n a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras la preincubaci�n, se a�adi�

20 tampón de ensayo (12 ∋l) que contenía 3 ∋M de un sustrato pept�dico fluorescente y ATP (1.620 ∋M), y se incub� la mezcla adicionalmente a temperatura ambiente durante 1,5 horas más, momento en el que aproximadamente el 50 % del sustrato se había convertido en producto. Se colocaron las muestras en el LabChip 3000 para medir la cantidad de sustrato precursor y de producto fosforilado.

25 Resultados:

Usando el ensayo de activación de IRK descrito anteriormente, se evalu� la capacidad de los compuestos a 100 ∋M para activar la tirosina quinasa receptora de insulina (IRK). Los resultados de este ensayo se muestran en la Tabla

3.

30 Tabla 3. Efecto de los compuestos a 100 ∋M sobre la actividad de la quinasa receptora de insulina.

Compuesto

% de actividad de AVG frente al control (� ETM)

RLip-EA-OH

78 ! 15

R/SLip-EA-OH

14 ! 1

SLip-EA-OH

4 ! 12

R/SLip-Ea-OH

1 ! 6

Ejemplo de referencia 4: RLip-EA-OH activa la quinasa IGF1R y la tirosina quinasa Src

35 Materiales y métodos: ensayo de activación de las tirosina quinasas IGF1 y Src.

Las tirosina quinasas IGF1R y Src tienen niveles end�genos de actividad en presencia de ATP y sustrato. Esta actividad se mide fácilmente usando un ensayo de cambio de movilidad con un calibrador LabChip∃ 3000 y un sistema 12-Sipper LabChip∃ para detectar el sustrato tanto fosforilado como no fosforilado (Caliper Life Sciences,

40 Discovery Alliances and Services Division). Las concentraciones de enzima, sustrato y ATP se optimizaron para cada ensayo. Para el ensayo de IGF1R, las concentraciones finales de enzima, p�ptido y ATP fueron de 20 nM, 1,5 ∋M y 1220 ∋M, respectivamente. Para el ensayo de Src, las concentraciones finales de enzima, p�ptido y ATP fueron de 2,5 nM, 1,5 ∋M, y 17 ∋M, respectivamente.

45 RLip-EA-OH se evalu� a múltiples concentraciones en cuanto a un efecto sobre la activación de la quinasa receptora IGF1 (IGF1R) y Src. Los efectos de una concentración 100 ∋M de diferentes compuestos Lip-EA sobre la activación de la quinasa se muestran en la Tabla 4a. Los compuestos ensayados activaron IGF1R y Src con diferentes selectividades.

Tambi�n se evalu� el efecto de RLip-EA-OH o RLip-OH 300 ∋M en la activación de diferentes tirosina quinasas (Tabla 4b). A esta concentración, RLip-EA-OH indujo una activación significativamente mayor de las tirosina quinasas tanto IRK como Src que la de RLip-OH, en relación con el control de vehículo.

Tabla 4a. Efecto de los compuestos a 100 ∋M sobre la actividad de las quinasas IGF1R y Src.

Compuesto

% de actividad de IGF1R frente al control (� ETM) % de actividad de Src frente al control (� ETM)

RLip-EA-OH

42 ! 1 70 ! 1

R/SLip-EA-OH

27 ! 3 43 ! 1

R/SLip-Ea-OH

17 ! 12 29 ! 1

SLip-EA-OH

-4 ! 10 19 ! 1

Tabla 4b. Efecto de RLip-EA-OH y RLip-OH a 300 ∋M sobre la actividad de las tirosina quinasas IRK, IGF1R y Src. Los datos son el % de aumento de actividad frente al control de vehículo.

Tirosina quinasa

% de aumento de actividad a 300 M

RLip-EA-OH

R-∀-Lip-OH

IRK

77 ! 7 48 ! 1

IGF1R

33 ! 3 37 ! 4

Src

78 ! 2 15 ! 1

10 Ejemplo de referencia 5: RLip-EA-OH evita la apoptosis y potencia la supervivencia celular en células cultivadas

Materiales y métodos: ensayo de supervivencia celular en células Jurkat

Se evalu� la capacidad de RLip-EA-OH para evitar la apoptosis y potenciar la supervivencia celular usando células

15 Jurkat deficientes en proteína de interacción con receptores (RIP), una proteína mediadora de la muerte celular. La línea de células Jurkat se obtiene de linfocitos T humanos. Las células Jurkat deficientes en RIP son susceptibles a la apoptosis cuando se tratan con factor de necrosis tumoral ∀ (TNF∀). Se trataron estas células bien con vehículo o con RLip-EA-OH y, a continuación, se activ� la apoptosis con TNF∀. Se midió la supervivencia celular para evaluar si RLip-EA-OH protegía las células contra la apoptosis inducida por TNF∀.

20 Se sembraron células Jurkat deficientes en RIP en placas de 96 pocillos a 20.000 células por pocillo y se trataron durante 2 horas con RLip-EA-OH (6 pocillos para cada concentración) o DMSO. Tras el pretratamiento, se expusieron 3 pocillos para cada dosis de fármaco a 10 ng/ml de TNF∀ recombinante humano (no se a�adi� TNF∀ a los otros 3 pocillos). Veinticuatro horas después del tratamiento con TNF∀, se determin� la viabilidad celular de ATP

25 (CellTiter-Glo, Promega) y se usaron los valores para calcular el % de supervivencia de las células.

En ausencia de RLip-EA-OH, aproximadamente el 20 % de las células no sobrevivió al tratamiento con TNF∀. El tratamiento de las células con RLip-EA-OH evit� la muerte celular inducida por TNF∀ de una manera dependiente de la dosis (Tabla 5).

30 Tabla 5. Efecto de RLip-EA-OH sobre la apoptosis inducida por TNF∀ en células Jurkat deficientes en RIP.

RLip-EA-OH (∋M)

0* 0,006 0,012 0,05 0,1 0,2 1,5

% de supervivencia(%)

82 84 95 96 98 101 106

DE

0,1 3 7 5 3 6 3

* Control

Ejemplo de referencia 6: RLip-EA-OH inhibe los aumentos estimulados por carbacol en el calcio intracelular de una forma dependiente de la dosis en células cultivadas 35 Materiales y métodos: Ensayo de sobrecarga de calcio citos�lico

Cuando se estimulan con carbacol los aumentos del calcio citos�lico en las células CHO M 1-WT3 ([Molecular Devices, “FlexStation Application Note 2, Comparison of FLIPR� and FLEXstation™ for Calcium Mobilization 40 Assays”]), se pueden detectar con un colorante fluorescente que se une al calcio. Un aumento en la fluorescencia

tras la estimulaci�n con carbacol se interpreta como un aumento del calcio citos�lico. Se permitió la adherencia de células de ovario de h�mster chino (CHO) a la parte inferior de una placa de cultivo de 96 pocillos. Se colocaron el colorante fluorescente y una muestra de ensayo en la placa, y se dej� que fueran absorbidos por las células. Se midió el nivel de fluorescencia cada dos segundos usando un lector de placas (Flexstation II, Molecular Devices,

5 Sunnyvale CA). Se estimularon las células con carbacol, y se presentaron los datos de fluorescencia como el aumento máximo en la fluorescencia por encima de la línea basal tras la estimulaci�n con carbacol. Los datos se normalizaron con respecto a la respuesta máxima al carbacol obtenida en la muestra de control.

Se cultivaron células CHO de la línea celular CHO-M1-WT3 en medio Hams F12 suplementado con FBS al 10 % y

10 5 ∋g/ml de G418 para mantener la expresión del receptor muscar�nico M1. Se sembraron las células la noche anterior al experimento a una concentración de 30.000 células/pocillo en un volumen de 100 ∋l por pocillo de microplacas de 96 pocillos, de fondo transparente y paredes negras ("placas de ensayo"). Se incubaron las células a 37 �C y CO2 al 5 % durante una noche. Al día siguiente, se incubaron las células a 37 �C durante 60 minutos con Fluo-4 NW o calcio-3 en solución salina equilibrada de Hank, junto con probenecid hidrosoluble 2,5 mM y el

15 compuesto de ensayo a las concentraciones indicadas o el vehículo. El volumen final en cada pocillo fue de 200 ∋l. Se colocaron las células en el sistema FlexStation para monitorizar la fluorescencia antes y después de la adición de 50 ∋l de carbacol 1 ∋M para una concentración final de 200 nM. Se midió la fluorescencia durante 17 segundos antes de la adición de carbacol y 43 segundos después de la adición de carbacol. El colorante Fluo-4 se excit� a una longitud de onda de 485 nm y emisión medida a 525 nm. El colorante de calcio-3 se excit� a una longitud de onda de

20 494 nm y emisión medida a 525 nm. La respuesta del calcio se present� como el pico de fluorescencia menos la fluorescencia de línea basal calculada como la media de la fluorescencia antes de la adición del carbacol.

Resultados:

25 Se determin� la capacidad de RLip-EA-OH, RLip-OH y Ac-EA-OH para evitar la sobrecarga de calcio en las células M1-WT3 CHO. Se midió el aumento máximo en el calcio citos�lico de células CHO que expresaban el receptor muscar�nico M1 en respuesta a la estimulaci�n con carbacol. RLip-EA-OH disminuyó el flujo de calcio citos�lico de una manera dependiente de la dosis, mientras que RLip-OH y Ac-EA-OH tuvieron un efecto mínimo (Figura 4). RLip-EA-OH tuvo un efecto inhibidor sobre los aumentos estimulados por carbacol en el calcio citos�lico y la inhibición

30 dependió de la dosis. RLip-OH y Ac-EA-OH solo tuvieron una actividad modesta de disminución del calcio citos�lico.

Ejemplo de referencia 7: RLip-EA-OH demuestra una mayor capacidad de absorción de radicales peroxilo que RLip-OH

35 Materiales y métodos: Ensayo de capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC)

Los radicales peroxilo son una de las especies del oxígeno reactivo producidas por las células durante la reperfusi�n. La presencia de radicales peroxilo se puede detectar por la oxidación de la fluoresce�na. En presencia de radicales peroxilo, la fluorescencia de la fluoresce�na decaer� con el tiempo. En presencia de un neutralizador de

40 radicales de oxígeno, la velocidad de disminución se ve reducida. El cambio en la velocidad de disminución entre el control y en presencia de neutralizadores se usa para medir la capacidad de un compuesto de ensayo para neutralizar los radicales peroxilo.

Se diluyó cada compuesto ensayado a una concentración que variaba de 25 ∋M a 250 ∋M en tampón de fosfato

45 10 mM (pH = 7,4) que contenía fluoresce�na 10 nM. Se incubaron el tampón y el compuesto a 37 �C durante 10 minutos. Tras la incubaci�n, se midió la fluorescencia de la fluoresce�na usando un lector de placas (Molecular Devices Flexstation II, Ex = 485, Em = 520). Se registraron las mediciones de fluorescencia de línea basal durante 15 minutos antes de la adición de diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-metilpropionamidina) (AAPH). Se registr� la disminución de la fluorescencia durante 90 minutos. Se rest� la disminución de la fluorescencia sin compuesto de la

50 disminución de la fluorescencia con el compuesto. La pendiente de la disminución frente a la concentración se presenta como la capacidad de absorción.

Resultados:

55 Se determin� la capacidad de absorción de radicales peroxilo para compuestos que contenían lipo�lo (Tablas 6a y 6b). RLip-EA-OH mostr� una mayor capacidad de absorción de radicales peroxilo que RLip-OH. Los resultados también indican que el resto lipo�lo es fundamental para la neutralización de los radicales peroxilo en el ensayo ORAC, pues la acetil-glutamilalanina no result� tener una capacidad de absorción de radicales peroxilo apreciable.

60 Tabla 6a. Resultados del ensayo ORAC relativos a RLip-OH.

Compuesto

Valor de ORAC

RLip-OH

100 ! 6*

RLip-EA-OH

131 ! 6

50 Tabla 6b. Resultados del ensayo ORAC relativos a RLip-EA-OH

Compuesto

Valor de ORAC

RLip-EA-OH

100 ! 11

R/SLip-EA-OH

102 ! 10

SLip-EA-OH

89 ! 4

Los valores son la media de 3-4 experimentos.

Ejemplo 8: RLip-EA-OH protege el miocardio contra la lesión por isquemia y reperfusi�n in vivo

Materiales y métodos: Modelo de rata de lesión por I/R de miocardio

Se us� un modelo de rata de lesión por I/R de miocardio como modelo de exploración in vivo para determinar si ciertos compuestos derivados de ácido lipoico son cardioprotectores (por ejemplo, contra la lesión por isquemia y reperfusi�n de miocardio). Este modelo es similar a la lesión por isquemia y reperfusi�n observada en pacientes cardíacos tras oclusiones coronarias y procedimientos de cirugía cardiaca, tales como la implantación de injertos de derivación de la arteria coronaria (CABG) (Matsui, T., Tao, J., del Monte, F., Lee, K.-H. et al., “Akt Activation Preserves Cardiac Function and Prevents Injury After Transient Cardiac Ischemia In vivo”, Circulation 2001, 104:330).

Procedimiento general

Se ligó temporalmente la rama circunfleja de la arteria coronaria izquierda para inducir una isquemia regional en la masa ventricular izquierda, tras lo que se inyectaron microesferas fluorescentes para delimitar la región isqu�mica. Se sacrificaron los animales aproximadamente 24 horas después de la reperfusi�n y se extirparon los corazones, se seccionaron y se tiñeron con trifeniltetrazolio. Se determin� el impacto directo de la intervención farmacol�gica midiendo la superficie del infarto de miocardio (IM), la superficie isqu�mica en riesgo (SR) y la superficie del ventrículo izquierdo (VI). La reducción del IM frente a la SR (proporción de IM/SR) se us� como la principal medida de la eficacia del fármaco con respecto a los controles de vehículo.

Procedimiento detallado

Para estos experimentos, se usaron ratas macho Sprague-Dawley de entre 300 y 350 g. Se indujo la anestesia con isoflurano al 3-4 % en una cámara de inducción. Tras la inducción, se mantuvo la anestesia en un plano quirúrgico con isoflurano al 1,5-2,0 %, administrado por un respirador para roedores a través de un angiocat�ter de calibre 16 introducido por vía oral en la tráquea. El respirador se fij� en 2,5 cm3 a una velocidad de 60-65 respiraciones por minuto para mantener la respiración durante la cirugía. Se monitoriz� la temperatura central del animal y se mantuvo a 37 �C usando una sonda rectal y una lámpara de calentamiento conectada a un controlador de la temperatura.

Se realizó una toracotom�a anterior izquierda y se descubrió el corazón mediante un pericardotom�a vertical. Se ligó la rama circunfleja de la arteria coronaria izquierda (LCx) a aproximadamente 4 mm de la aorta usando una sutura cardiovascular con monofilamento 7.0 en una aguja de 11 mm para inducir la isquemia en el ventrículo izquierdo.

Se inyectaron microesferas fluorescentes (300 ∋l) en la cavidad ventricular izquierda 10-20 minutos después de la ligadura para delimitar la superficie isqu�mica. Se retir� la sutura 30 minutos después de la ligadura para realizar una reperfusi�n en la superficie isqu�mica, y se comprob� la reperfusi�n de la superficie isqu�mica.

A continuación, se cerr� el pecho en capas con sutura absorbible (Dexon 5-0) para las capas musculares y sutura de monofilamento de nylon 5-0 para cerrar la capa cut�nea. Se dej� que los animales se recuperaran y, seguidamente, se devolvieron a la colonia.

Veinticuatro horas después de la reperfusi�n, se indujo la anestesia con clorhidrato de quetamina y se abrió el pecho. Se sacrificaron los animales inyectando una solución acuosa de cloruro de potasio al 15 % (p/v) en la cavidad del ventrículo izquierdo para detener el corazón en di�stole. Se extirp� el corazón distal a la válvula a�rtica y se lav� con solución salina para eliminar la sangre. Se hicieron cortes sagitales del corazón entre la base del ventrículo y el ápice. Se obtuvieron cinco cortes de tejido cardíaco, cada uno con un espesor de 2 mm. Se sumergieron los cortes en cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) al 1 % en solución salina y luego se almacenaron a oscuras durante 30 minutos para que se tiñeran.

Se obtuvieron imágenes de los cortes en campo claro (para observar la tinción con TTC) y bajo fluorescencia (para observar las microesferas). La superficie en riesgo se determin� por la ausencia de microesferas y la superficie del infarto se determin� por la ausencia de tinción con TTC.

5 Resultados:

Un metaan�lisis de los animales tratados con RLip-EA-OH (n = 64) frente a los animales tratados con vehículo de solución salina (n = 54) en el modelo de isquemia y reperfusi�n de miocardio demostr� que RLip-EA-OH administrado mediante inyección en la cavidad intraventricular (1 mg/kg IC) redujo eficazmente el tamaño del infarto

10 de miocardio (IM) con respecto a la superficie en riesgo (SR). Las proporciones de IM/SR para los animales tratados con vehículo y con RLip-EA-OH fueron de 0,373 (n = 54) y 0,250 (n = 64), correspondiendo respectivamente a una diferencia del 33 % entre los grupos (p < 0,001) (Figura 5). Se observ� una reducción significativa en la superficie del daño cardíaco en las secciones de tejido de miocardio tras el tratamiento con RLip-EA-OH.

15 Se examin� el momento de la administración de RLip-EA-OH en el modelo de isquemia y reperfusi�n de miocardio de rata. Se administr� RLip-EA-OH a 1 mg/kg IC antes de la isquemia (15 minutos antes de la oclusión), durante la isquemia (15 minutos después de la oclusión) o después de la isquemia (a menos de 1 minuto de la reperfusi�n). RLip-EA-OH redujo significativamente (p < 0,05) la muerte del tejido del miocardio antes de la oclusión (38 %), durante la oclusión (24 %) y en la reperfusi�n (32 %) en comparación con los animales que recibieron vehículo de

20 solución salina (Figura 6). RLip-EA-OH fue eficaz a 1 mg/kg IC en la reducción del daño mioc�rdico tanto administrado profiláctica como terapéuticamente. Además, RLip-EA-OH fue eficaz a varias dosis cuando se administr� por vía intravenosa 15 minutos antes de la oclusión (Figura 7). Estos resultados indican que la administración de RLip-EA-OH disminuye eficazmente el daño al corazón debido a la lesión por isquemia y reperfusi�n.

25 Ejemplo 9: El enanti�mero de RLip-EA-OH es más eficaz que el resto precursor RLip-OH, la mezcla rac�mica R/sLip-EA-OH y el enanti�mero de SLip-EA-OH para reducir la lesión por isquemia/reperfusi�n de miocardio.

Se emple� el modelo de rata de lesión por isquemia y reperfusi�n de miocardio descrito en el Ejemplo 8 del presente

30 documento para comparar la eficacia del enanti�mero de RLip-EA-OH puro con la eficacia del resto precursor RLip-OH, SLip-EA-OH puro y la mezcla rac�mica R/SLip-EA-OH en el tratamiento de la lesión por I/R de miocardio.

Resultados:

35 En la Tabla 7, se muestra un metaan�lisis de los animales tratados bien con RLip-OH (2 mg/kg IC) o RLip-EA-OH (1 mg/kg IC) como un % de la reducción en comparación con un control de vehículo de solución salina. También se evalu� Ac-EA-OH, un compuesto que no contenía lipo�lo, y se encontr� que era estadísticamente similar al vehículo (datos no presentados). Este resultado demuestra que la cardioprotecci�n de la lesión por I/R tras el tratamiento con RLip-EA-OH fue mejor que el tratamiento con RLip-OH.

40 Tabla 7. Comparación de la eficacia de RLip-OH con respecto a RLip-EA-OH examinada en el modelo de rata de lesión por isquemia y reperfusi�n de miocardio.

Compuesto

Reducción de la proporción de IM:SR con respecto alveh�culo (%)

RLip-EA-OH

31 ! 3*

RLip-OH

19 ! 7#

* Resultados basados en un metaan�lisis de los animales tratados con RLip-EA-OH (n = 75) frente a los animales tratados con vehículo (n = 89). # Resultados basados en un metaan�lisis de los animales tratados con RLip-OH (n = 18) frente a los animales tratados con vehículo (n = 19).

En la Tabla 8, se muestra un análisis de los animales tratados bien con RLip-EA-OH (1 mg/kg IC) o R/SLip-EA-OH

45 (1 mg/kg IC) como un % de la reducción en comparación con un control de vehículo de solución salina. Este resultado demuestra que la cardioprotecci�n de la lesión por I/R tras el tratamiento con RLip-EA-OH fue mejor que el tratamiento con R/SLip-EA-OH.

Tabla 8. Comparación de la eficacia de RLip-OH con respecto a R/SLip-EA-OH examinada en el modelo de rata de 50 lesión por isquemia y reperfusi�n de miocardio.

Compuesto

Reducción de la proporción de IM:SR con respectoal vehículo (%)

RLip-EA-OH

31 ! 3*

R/SLip-EA-OH

19 ! 5#

* Resultados basados en un metaan�lisis de los animales tratados con RLip-EA-OH (n = 75) frente a los animales tratados con vehículo (n = 89). # Resultados basados en un metaan�lisis de los animales tratados con R/SLip-OH (n = 26) frente a los animales tratados con vehículo (n = 25).

En la Tabla 9, se muestran los resultados del estudio que compara los compuestos de un solo isómero RLip-EA-OH y Slip-EA-OH. Los compuestos se administraron bien a 1 mg/kg o 2 mg/kg con un solo bolo (IC) 15 minutos antes del episodio isqu�mico. Se prepar� una mezcla rac�mica añadiendo cantidades iguales de RLip-EA-OH y SLip-EA

5 OH. También se evalu� la R/SLip-EA-OH rac�mica. Los datos se presentan como la reducción del tamaño del infarto de miocardio (IM) con respecto a la superficie en riesgo (SR). Este resultado demuestra que la cardioprotecci�n de la lesión por I/R tras el tratamiento con RLip-EA-OH fue mejor que el tratamiento con el correspondiente SLip-EA-OH.

10 Tabla 9. Reducción del tamaño del infarto de miocardio (IM) con respecto a la superficie en riesgo (SR) en los animales tratados con Lip-EA-OH. Resultados basados en 9-10 animales/grupo.

Compuesto

Tratamiento (mg/kg) IM/SR ETM

RLip-EA-OH

2 0,290 0,038

RLip-EA-OH + sLip-EA-OH

1 + 1 0,331 0,035

RLip-EA-OH

1 0,337 0,02

SLip-EA-OH

2 0,400 0,042

SLip-EA-OH

1 0,401 0,026

Ejemplo 10: El aumento de la dosis de RLip-EA-OH mediante la administración del compuesto en múltiples dosis a 15 intervalos de dosificación prolongados no convencionales potencia su eficacia in vivo

Materiales y métodos:

Procedimiento detallado

20 Se realizaron experimentos in vivo empleando un modelo de rata de lesión por I/R de miocardio como se describe en el Ejemplo 8. Se ensayaron varias pautas posol�gicas de una sola dosis y de varias dosis como se muestra en la Tabla 10. Se usaron ratas cateterizadas (vena yugular) para la administración de una dosis intravenosa en puntos temporales previos a y/o incluyendo 0,25 h.

25 Resultados:

La administración de un solo bolo de RLip-EA-OH demostr� una eficacia en la reducción del daño del IM a través de un período de tiempo amplio en relación con la lesión por I/R (es decir, 15 min, 3 h, 6 h o 24 h antes de la cirugía; en

30 el momento de la oclusión del vaso; y en el momento de la reperfusi�n en el vaso). El fármaco también demostr� ser eficaz en el momento de la oclusión de la arteria y en el momento de la reperfusi�n, pero no del todo hasta el grado observado en ciertos puntos temporales previos (por ejemplo, -15 min). Este amplio período de tiempo de eficacia en relación con la lesión por I/R en el modelo de rata es paradójico si se tiene en cuenta la corta semivida en suero de RLip-EA-OH (es decir, aproximadamente 9 minutos en ratas a una Cm�x de 20 ∋g/ml a una dosis de 30 mg/kg).

35 RLip-EA-OH mostr� una curva de respuesta a la dosis en forma de campana en el modelo de rata de lesión por I/R cuando se administr� a diferentes dosis antes de la isquemia como un solo bolo IV (Tabla 10, entradas 1, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a y 4b). Una sola dosis de bolo de 10 mg/kg IV administrada 15 min antes de la isquemia o 3 h antes de la isquemia produjo aproximadamente una reducción del 33 % en el daño del IM en el modelo de rata (véase la Tabla

40 10, entrada 4a frente a 7), mientras que la administración de la misma dosis en puntos temporales anteriores (6 h o 24 h) antes de la isquemia produjeron reducciones ligeramente más bajas en el daño del IM (Tabla 10, entradas 8, 9). Las dosis únicas inferiores de RLip-EA-OH (1, 3 o 5 mg/kg) no fueron tan eficaces y la dosis únicas superiores de RLip-EA-OH (20 mg/kg o 40 mg/kg) no mejoraron la reducción en los daños del IM observados con dosis inferiores óptimas cuando se administraron en puntos temporales similares y, en algunos casos, tuvieron un efecto perjudicial

45 sobre la eficacia (Tabla 10, comparar las entradas 4a y 6, 7 y 10 o 11). Por lo tanto, una dosis de 10 mg/kg administrada antes del procedimiento present� una mejor eficacia que las dosis únicas inferiores y superiores en el modelo de rata. A las dosis más elevadas ensayadas, la eficacia no cayó por debajo del nivel de placebo. La administración de RLip-EA-OH 15 min antes de la isquemia en un solo bolo IV o en forma de infusión 60 min antes de la isquemia proporcion� una reducción similar en el daño del IM (Tabla 10, comparar las entradas 2a y 2b, 3a y

50 3b, 4a y 4b).

Inesperadamente, el aumento de la dosis de RLip-EA-OH mediante la administración de múltiples (2 o 3) dosis mejor� la reducción del daño del IM en comparación con las dosis únicas óptimas (Tabla 10, entradas 12 frente a 15, 7 frente a 15, Tabla 11, entrada 1a frente a 1b; entrada 2a frente a 2b, Tabla 12, entrada B frente a C). En particular, la administración de 2 o 3 dosis de RLip-EA-OH proporcion� mejoras en la reducción del daño del IM con respecto a

5 dosis únicas cuando la dosis final se administr� aproximadamente 0,25 horas antes de la isquemia (Tabla 10, entradas 12 13 y 15 frente a 14, 16 y 17) y no en el momento de la reperfusi�n (Tabla 10, comparar las entradas 12 y 15 frente a 16 y 17).

El metaan�lisis revel� que las dosis únicas óptimas en bolo (10 mg/kg a -3 h) redujeron el IM en un 29 %, mientras 10 que las dosis múltiples (10 mg/kg a -3 h y -0,25 h) redujeron el IM en un 43 % (Tabla 12 ).

Tabla 10. Eficacia de RLip-EA-OH en comparación con los controles de vehículo en el modelo de rata de lesión por I/R

Entrada

Dosis (mg/kg) Momento (h) % de reducción de IM/SR en comparación con el vehículo

1

1

-0,25 3

2a 2b

3 (bolo) 3 (1 h de infusión) -0,25 -1 h 6 12

3a 3b

5 (bolo) 5 (1 h de infusión) -0,25 -1 h 27* 27*

4a 4b

10 (bolo) 10 (1 h de infusión) -0,25 33* 33*

5

15 -0,25 30*

6

20 -0,25 9

7

10 -3 33*

8

10 -6 24*

9

10 -24 24*

10

20 -3 26*

11

40 -3 17

12

10 y 10 -3 y -0,25 43*

13

20 y 10 -3 y -0,25 38*

14

10 y 10 -24 y -3 32*

15

10 y 10 y 10 -24 y -3 y -0,25 42*

16

10 y 10 y 10 -3 y -0,25 y en la reperfusi�n 15

17

10 y 10 -3 y en la reperfusi�n 34*

* Los resultados fueron significativamente mejores que el vehículo, p < 0,05.

Tabla 11. Eficacia comparativa de pautas de una sola dosis o múltiples dosis de RLip-EA-OH en modelo de rata de lesión por I/R

Entrada

Dosis (mg/kg) Momento (h) % de Reducción de IM/SR�

1a 1b

10 y 10 10 -3 y -0,25 -3 43* 29

2a 2b

10 y 10 10 -3 y -0,25 -0,25 43* 28

* Los resultados fueron significativamente mejores que una sola dosis, p < 0,05. � Se compar� el porcentaje de reducción de IM/SR con los controles de vehículo.

Tabla 12. Metaan�lisis de la eficacia de RLip-EA-OH para una sola dosis o múltiples dosis en modelo de rata de lesión por I/R

Entrada

IM/SR Número DE EE Ensayo t Valor de P

A -Vehículo

0,366 25 0,076 0,015 B frente a A 7,66E-06

B – Una sola dosis (10_0)

0,261 26 0,073 0,014 C frente a A 3,17E-11

C – Múltiples dosis (10_10)

0,207 25 0,052 0,010 C frente a B 0,0039

Ejemplo 11: La administración de múltiples dosis de RLip-EA-OH a intervalos de dosificación prolongados no 5 convencionales reduce la incidencia de la disfunción cardiaca y la mortalidad

Materiales y métodos

Se examin� la incidencia de la disfunción cardiaca aguda asociada con la arritmia y el paro cardíaco que requiere

10 intervención y la incidencia de la mortalidad debida a estas comorbilidades en el modelo de rata de lesión por I/R de miocardio descrito en el presente documento para diferentes dosis y pautas posol�gicas de administración de RLip-EA-OH. Los experimentos in vivo se realizaron como se describe en el Ejemplo 8, usando los intervalos de dosificación descritos en el Ejemplo 10. Los tratamientos (es decir, vehículo, RLip-EA-OH) se administraron en forma de una inyección aplicada en el ventrículo izquierda, bolo IV, infusión IV o por vía oral. En concreto, se observaron la

15 incidencia de la disfunción de no auto-resolución (es decir, arritmia auricular extendida, paro cardiaco súbito) durante la isquemia y con necesidad de ser intervenida (resucitaci�n cardiaca mecánica directa) y la mortalidad asociada con la disfunción cardiaca.

Resultados:

20 La administración de una y varias dosis de RLip-EA-OH redujo la incidencia de las disfunciones cardiacas con peligro de muerte y la necesidad asociada de una intervención para paliarlas, as� como la mortalidad asociada con estas disfunciones cardíacas con peligro de muerte con respecto al control de vehículo (Tabla 14). Las pautas de múltiples dosis mostraron una eficacia significativamente mayor que la administración de una sola dosis.

25 Tabla 14. Incidencia de la disfunción cardiaca aguda y la mortalidad asociada en el modelo de rata de la lesión por I/R tras la administración de una y varias dosis de RLip-EA-OH

Tratamiento

Vehículo Múltiples dosis (x 3) Múltiples dosis (x 2) Una sola dosis

Intervenci�n debida a arritmia/paro (%)

14/20 (70) 4\18 (22) 3\19 (16) 6\17 (35)

Mortalidad (%)

5/20 (25) 1\18 (5) 1\19 (5) 2\17 (12)

30 Ejemplo 12: Evaluación farmacocin�tica de RLip-EA-OH en ratas

Para evaluar la exposición sist�mica a RLip-EA-OH, se administraron a grupos de ratas dosis únicas de vehículo mediante infusión intravenosa (2/sexo) o RLip-EA-OH a los mismos niveles de dosis de 30, 100 o 200 mg/kg (6/sexo/grupo). Para el grupo tratado con vehículo, se recogieron muestras de sangre de todas las ratas antes de la

35 dosificación y 30 minutos (+2 minutos) después de la dosificación solamente. Para los grupos tratados con RLip-EA-OH, se recogieron muestras de sangre de tres ratas/sexo/grupo a los 10 minutos, 30 minutos, 45 minutos y 1, 2, 3 y 4 horas (!2 minutos) de la dosificación.

La administración se realizó por infusión IV en un catéter colocado quirúrgicamente en la vena femoral usando una 40 bomba de jeringa a una velocidad de inyección no superior a 0,2 ml/min. El volumen de dosis para cada animal se bas� en la medición más reciente del peso corporal y las dosis se redondearon al 0,1 ml más cercano.

Se extrajeron muestras de sangre venosa entera de aproximadamente 0,5 ml de la vena de la cola de los animales toxicocin�ticos para proporcionar plasma en el que se midieron las concentraciones de RLip-EA-OH.

45 Se colocaron las muestras en tubos que contenían K3EDTA y se almacenaron en hielo hasta que se centrifugaron, bajo refrigeración, durante al menos diez minutos a 3.000 rpm. Tras la centrifugaci�n, se retir� el plasma y almacen� congelado a o por debajo de menos 70 �C hasta que se envi� a BASi en West Lafayette, IN para el análisis.

50 Las concentraciones de RLip-EA-OH en plasma se midieron en BASi en West Lafayette, IN, usando un método de CL/EM/EM validado con pulverización de iones positivos turbo, en el modo de monitorización de múltiples

reacciones. El intervalo cuantificable para el ensayo fue de 0,05 a 50 ∋g/ml y se incluyeron muestras de control de calidad a 0,15, 10 y 37,5 ∋g/ml. Se realizó un análisis toxicocin�tico usando WinNonlin versión 5.1 mediante el cálculo de los parámetros convencionales.

Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15. Datos farmacocin�ticos de las ratas para RLip-EA-OH a una dosis de 30 mg/kg

Cm�x ( g/ml)

T1/2 (h) ABC0-( (h*∋g/ml) CL (l/h/kg) Vss (l/kg)

20

0,15 ~7,0 4,5 1,2

Ejemplo 13: Evaluación farmacocin�tica de RLip-EA-OH en los seres humanos

Materiales y métodos:

Metodolog�a bioanal�tica

Las concentraciones en plasma y orina de RLip-EA-OH se midieron en BASi, Inc. (West Lafayette, IN) usando un método CL/EM/EM con pulverización de iones positivos turbo, en el modo de monitorización de múltiples reacciones. El intervalo cuantificable para el plasma humano fue de 1,00 a 500 ng/ml y se incluyeron muestras de control de calidad a 3,00, 75,0 y 375 ng/ml.

Conjuntos de datos analizados

La población de evaluación farmacocin�tica incluyó sujetos que recibieron RLip-EA-OH y que tenían ) 1 medida farmacocin�tica tras la dosificación. En el caso de encontrarse algún sujeto que no cumpliera con la dosificación o que tuviera los datos incompletos, se decidía caso por caso si se incluía o no en el análisis. Se analizaron muestras de plasma de 24 sujetos (6 sujetos RLip-EA-OH por cohorte) (Tablas 16 y 17).

Resultados:

La concentración media de RLip-EA-OH en plasma frente a los datos de tiempo se representa en las Figuras 9A y 9B a escalas lineal y semilogar�tmica, respectivamente. Las concentraciones plasm�ticas decayeron rápidamente de una manera multif�sica.

En la Tabla 14 y la Tabla 15, se proporciona un resumen de los parámetros farmacocin�ticos de ambos métodos no compartimental y compartimental. El t1/2 medio en la fase terminal de RLip-EA-OH fue corto y vari� de una media de 0,86 horas a la dosis de 2 mg a 1,45 horas a la dosis de 300 mg. El aumento de ABCinf fue ligeramente mayor que el aumento de la dosis y vari� de 583 a 16.483 h*ng/ml. El CL disminuyó ligeramente al aumentar la dosis y vari� de 19,3 l/h para la dosis de 300 mg a 35,3 l/h para la dosis de 20 mg. El volumen de distribución del compartimento central (Vc) fue relativamente bajo, de aproximadamente 6 litros. El Vss fue de 2 a 3 veces mayor, variando de aproximadamente 12 a 18 litros, y disminuyó al aumentar la dosis.

Los datos de excreci�n urinaria indicaron que aproximadamente del 30 al 45 % de la dosis administrada se excret� sin cambios por la orina en un intervalo de recogida de 16 horas. La mayor parte de la excreci�n urinaria se produjo en las primeras 4 horas.

Tabla 16. Resumen de parámetros farmacocin�ticos del método no compartimental

RLip-EA-OH 20 mgRLip-EA-OHRLip-EA-OH 150 mgRLip-EA-OH 300 mg(n = 6) 60 mg (n = 6) (n = 6) (n = 6)

Cm�x (ng/ml) Media (DE) Mediana

1827 (475) 1845 6557 (1086) 6840 17067 (1980) 16950 42233 (9569) 42150

M�nimo, máximo

1220, 2420 5190, 7990 14900, 20000 32000, 58100

ABC0-t (ng-h/m)

Media (DE) Mediana

581 (108) 556 2252 (586) 1975 6976 (1473) 6901 16453 (4383) 16516

M�nimo, máximo

466, 717 1718, 3109 4972, 9328 11633, 23073

ABCinf (ng-h/m)

Media (DE) 583 (108) 2256 (587) 6989 (1478) 16463 (4383) Mediana 558 1978 6922 16524

M�nimo, 467, 1722, 4977, 11644, máximo 718 3114 9341 23082

Vss (l)

Media (DE) 18,5 (3,1) 14,9 (2,4) 13,6 (2,4) 11,7 (2,2)

Mediana 18,7 14,8 13,2 11,1 Mínimo, 14,4, 11,3, 9,9, 8,9, máximo 22,4 18,6 16,6 15,1

CL (l/h) Media (DE) 35,3 (6,3) 28,0 (6,4) 22,3 (4,8) 19,3 (5,1) Mediana 35,9 30,3 21,8 18,2 Mínimo, 27,9, 19,3, 16,1, 13,0,

m�ximo 42,8 34,9 30,1 25,8

t1/2 (h) Media (DE) 0,86 (0,31) 1,21 (0,23) 1,23 (0,19) 1,45 (0,58) Mediana 0,76 1,26 1,25 1,14 Mínimo, 0,61, 0,84, 0,97, 0,99,

m�ximo 1,41 1,50 1,52 2,35

% Excretado

invariable Media (DE) 28,5 (9,6) 39,1 (4,0) 32,5 (13,9) 43,6 (8,8)

Mediana 31,0 40,6 33,3 46,3 Mínimo, 16,2, 32,4, 17,5, 32,4, máximo 37,6 43,0 48,3 54,9

Eliminaci�n renal

(l/h) Media (DE) 10,09 (3,94) 10,85 (2,36) 7,44 (4,29) 8,47 (2,59)

Mediana 11,15 11,25 5,88 8,42 Mínimo, 4,85, 8,09, 3,51, 5,11, máximo 15,28 13,18 14,56 11,98

Tabla 17. Resumen de parámetros farmacocin�ticos del método compartimental Mínimo, 474, 1771, 4889, 11503, máximo 787 3163 9608 22598

RLip-EA-OH 20 mg(n = 6)

RLip-EA-OH60 mg (n = 6) RLip-EA-OH 150 mg(n = 6) RLip-EA-OH 300 mg(n = 6)

Cm�x estimada

(ng/ml)

Media (DE)

2358 (771) 6867 (1441) 18085 (2342) 46257 (13787)

Mediana

2477 6288 18442 43432

M�nimo,

1365, 5525, 14178, 31037,

m�ximo

3337 9048 20643 70140

V-1 (l)

Media (DE)

6,61 (3,20) 6,62 (1,65) 6,09 (1,42) 4,91 (1,56)

Mediana

6,13 6,69 5,86 5,59

M�nimo,

2,56, 4,68, 4,04, 2,50,

m�ximo

10,7 8,68 8,32 6,53

ABCinf (ng-h/m))

Media (DE)

621 (130) 2259 (612) 7034 (1581) 16450 (4422)

Mediana

614 1912 6925 16424

28

Vss (l) 16 14 13 11 Media (DE) (4) (2) (3) (3) Mediana 16 15 13 11 Mínimo, 11, 10, 9, 8,

m�ximo 20 17 17 16

CL (l/h) Media (DE) 33,4 (7,0) 28,0 (6,5) 22,2 (5,1) 19,4 (5,3) Mediana 32,7 31,4 21,8 18,3 Mínimo, 25,4, 19,0, 15,6, 13,3,

m�ximo 42,2 33,9 30,7 26,1

t1/2 (h) Media (DE) 1,0 (0,4) 1,5 (0,5) 1,8 (0,8) 1,5 (0,6) Mediana 0,8 1,4 1,4 1,2 Mínimo, 0,6, 1,1, 1,1, 1,0,

m�ximo 1,6 2,6 3,3 2,5

Referencias

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15 Raphael, J., Abedat, S., Rivo, J., et al., “Volatile anesthetic preconditioning attenuates myocardial apoptosis in rabbits after regional ischemia and reperfusion via Akt signaling by modulation of Bcl-2 family proteins”. J Pharmacol Exp Ther 2006, 318:186. Ratanis, Pharmaceutical Executive, pág. 74-80 (abril de 1991). “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, PA.

20 Rosamond W, Flegal K, Furie K, et al., “Heart disease and stroke statistics -2008 update: A report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommitte”. Circulation 2008, 117:e25e146. Suzuki, Y. J., “Growth factor signaling for cardioprotection against oxidative stress-induced apoptosis”. Antiox Redox Signal 2003, 5:741.

25 Thomenius, M. J. y Distelhorst, C. W., “Bcl-2 on the endoplasmic reticulum: protecting the mitochondria from a distance”. J Cell Sci 2003, 116:4493. Patente de Estados Unidos N� US 3.854.480 (expedida a Zaffaroni). Patente de Estados Unidos N� US 4.452.775 (expedida a Kent). Patente de Estados Unidos N� US 5.039.660 (expedida a Leonard).

30 Patente de Estados Unidos N� US 5.990.092 (expedida a Walsh). Patente de Estados Unidos N� 6.890.896. US 2004/0122077. US 2006/0241168. US 2007/0219139

35 Vlahos C. J, Matter W. F., Hui K. Y., Brown R. F. “A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002)”. J Biol Chem 1994, 269:5241-5248 Walton, M. et al., Brain Res. Rev., 29:137-168 (1999). Yellon D. M., Hausenloy D. J., “Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine 2007”, 357:1121.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición que comprende un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural:

   o una sal farmac�uticamente aceptable del mismo, en la que el compuesto o la sal farmac�uticamente aceptable del mismo son al menos un 90 % enantiom�ricamente puro.

   10 o una sal farmac�uticamente aceptable del mismo, compuesto que tiene un porcentaje de pureza óptica del al menos el 90 % en peso con respecto al resto de estereois�meros.
2. 3. La composición de la reivindicación 1, o el compuesto de la reivindicación 2, en los que la sal farmac�uticamente

   aceptable comprende un cati�n monovalente o un cati�n divalente. 15

3. 4.

   La composición o el compuesto de la reivindicación 3, en los que el cati�n monovalente es un cati�n de metal monovalente y el cati�n divalente es un cati�n de metal divalente.

4. 5.

   La composición de la reivindicación 1, o el compuesto de la reivindicación 2, en donde el compuesto est�

5. 6.

   El compuesto de la reivindicación 2, en donde el compuesto tiene un porcentaje de pureza óptica del al menos el 99 % en peso.

   25 7. Una composición que comprende: i) un vehículo o un diluyente farmac�uticamente aceptables; y ii) una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, o un compuesto de las reivindicaciones 2 a 6, o una sal farmac�uticamente aceptable del mismo.
6. 8. Una composición según lo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, o un compuesto según lo 30 definido en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, para su uso en el tratamiento de una lesión isqu�mica o de

   una lesión por isquemia y reperfusi�n en un sujeto que lo necesita.

7. 9.

   Una composición según lo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, o un compuesto según lo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, para su uso en el tratamiento de una lesión isqu�mica o de una lesión por isquemia y reperfusi�n en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método la administración al sujeto de una dosis única del compuesto o de una sal farmac�uticamente aceptable.

8. 10.

   Una composición según lo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, o un compuesto según lo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, para su uso en un método para el tratamiento de una lesión isqu�mica o de una lesión por isquemia y reperfusi�n producida como resultado de una intervención terapéutica en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método la administración al sujeto de al menos dos dosis del compuesto, o de una sal farmac�uticamente aceptable del mismo, en donde se administran una dosis no final del compuesto y una dosis final del compuesto al sujeto antes de la intervención terapéutica y en donde:

   (a)

   la dosis final es administrada al sujeto en un punto temporal incluido en aproximadamente dos semividas del compuesto antes de la intervención terapéutica; y

   (b)

   la dosis no final es administrada al sujeto en un punto temporal que es al menos aproximadamente cuatro semividas del compuesto antes de la administración de la dosis final.

9. 11.

   La composición o el compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, siendo la dosis final administrada al sujeto en un punto temporal incluido en el intervalo de aproximadamente 0,25 semividas a aproximadamente 2 semividas del compuesto antes de la intervención terapéutica, opcionalmente, siendo la dosis final administrada al sujeto aproximadamente una semivida del compuesto antes de la intervención terapéutica.

10. 12.

    La composición o el compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde:

    el método comprende además la administración de una o más dosis adicionales del compuesto al sujeto antes de la dosis no final; el método comprende además la administración de una o más dosis adicionales del compuesto al sujeto después de la intervención terapéutica; todas las dosis son equivalentes; y/o el compuesto es administrado intravenosamente y cada dosis tiene una concentración que varía de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5,0 mg/kg.

11. 13.

    La composición o el compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, siendo la lesión isqu�mica una lesión isqu�mica de miocardio.

12. 14.

    La composición o el compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, siendo la lesión isqu�mica el resultado de una isquemia seleccionada del grupo que consiste en una isquemia cardiovascular, una isquemia cerebrovascular, una isquemia renal, una isquemia hepática, una cardiomiopat�a por isquemia y reperfusi�n, una isquemia cut�nea, una isquemia de colon, una isquemia intestinal, una isquemia gástrica, una isquemia pulmonar, una isquemia de páncreas, una isquemia del músculo esquel�tico, una isquemia de los músculos abdominales, una isquemia de las extremidades, una colitis por isquemia y reperfusi�n, una isquemia mesent�rica y una isquemia silenciosa.

13. 15.

    La composición o el compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, siendo la lesión isqu�mica el resultado de una isquemia renal.

14. 16.

    La composición o el compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, estando la intervención terapéutica seleccionada del grupo que consiste en una cirugía de injerto de derivación de arterias coronarias, una cirugía de angioplastia coronaria, una cirugía de trasplante y una cirugía de derivación cardiopulmonar.

15. 17.

    La composición o el compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, siendo la intervención terapéutica un transplante de ri��n.