JP2005515156A - 反応性酸素種およびフリーラジカルの効力を中和するための単一アミノ酸に基づく化合物 - Google Patents

反応性酸素種およびフリーラジカルの効力を中和するための単一アミノ酸に基づく化合物 Download PDF

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Abstract

スーパーオキシドジスムターゼやカタラーゼのような抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートして、反応性酸素種やその他のフリーラジカルの有害な酸化作用を中和するための単一アミノ酸化合物および方法を記載した。該単一アミノ酸化合物は、反応性酸素種や他のフリーラジカルのレベルの望ましくない上昇を特徴とする疾患および状態を治療または予防するための組成物および方法に使用することができる。

Description

クロスリファレンス
本出願は、2001年5月25日に出願した米国仮出願第60/293,607号の優先権を主張する。
発明の属する技術分野
本発明は抗酸化化合物の分野に関する。特に、本発明は、反応性酸素種およびフリーラジカルの望ましくないレベルを特徴とする疾病および状態の治療および予防処置に用いられる組成物および方法に有用な単一アミノ酸に基づく化合物を提供する。
発明の背景
生物は、脳、心臓、肺および筋肉組織などの組織の正常な代謝活動の過程で、有害な反応性酸素種（ROS）や様々なフリーラジカルを発生している（Halliwell, B.およびGutteridge, J.M.C.編、Free Radicals in Biology and Medicine, (Oxford: Clarendon Press, 1989)）。最も反応性が高い、従って、有毒のROSおよびフリーラジカルとして、スーパーオキシドアニオン（O2・-）、一重項酸素、過酸化水素（H2O2）、過酸化脂質、ペルオキシニトライト、およびヒドロキシルラジカルが挙げられる。細胞中のROSまたはフリーラジカルレベルがわずかに上がるだけでも損傷を与える恐れがある。同様に、細胞外の体液中へのROSまたはフリーラジカルの放出もしくは増加は、周囲の組織を危険にさらし、組織破壊や壊死を引き起こす恐れがある。実際に、スーパーオキシドアニオンよりいくらか反応性が低い過酸化水素は、よく知られた広範なスペクトルの防腐剤化合物である。真核生物において、スーパーオキシドアニオンの主な供給源は、ミトコンドリアに存在する呼吸中の電子伝達系である。スーパーオキシドアニオンの大部分は、還元当量の２つの主な蓄積部位、すなわち、電子伝達機構におけるユビキノンが媒介する段階とNADH脱水素酵素が媒介する段階で発生する。過酸化水素は、小胞体では代謝により、ペルオキシソームでは金属触媒による酸化で、ミトコンドリアでは酸化的リン酸化で、また、キサンチンの細胞質ゾル酸化で、発生する（例えば、Somaniら、「物理・化学的ストレスに対する抗酸化剤系の応答 (Response of Antioxidant System to Physical and Chemical Stress)」, Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals, 第６章、pp. 125-141, Baskin, S.I.およびH. Salem編（TaylorおよびFrancis、ワシントンD.C.、1997）を参照）。
正常かつ健康な個体では、複数の天然の抗酸化防御系が、様々なROSまたはフリーラジカルを解毒し、これによって、正常な細胞および組織の統合性および機能を保存する。これらの解毒系は、特定の抗酸化酵素の協奏的活性により、ROSまたはフリーラジカルを、毒性が低い化学種へと段階的に変換する。これらの抗酸化酵素は、ROSまたはフリーラジカルを除去および解毒する能力を有する「酸素ラジカルスカベンジャー」もしくは「ラザロイド」として知られる大きいクラスの分子のメンバーである。ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、ならびに、βカロチン、レチノイドおよびリポ酸のような関連する抗酸化化合物もラザロイドである。健康な個体では、十分なレベルの抗酸化酵素およびその他のラザロイドが、細胞内および細胞外の両方に存在し、これによって、細胞および組織に対する酸化による深刻な損傷を防ぐのに十分な量のROSおよびフリーラジカルが効率的に除去される。
抗酸化酵素の中でも、最も重要で、研究されているものとして、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、カタラーゼ（CAT）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）が挙げられる。これらの酵素は、協奏的にROSおよびフリーラジカルを解毒する機能を有する。SODは、実質的にあらゆる酸素呼吸生物に存在し、そこでのその主な機能は、スーパーオキシドアニオンを過酸化水素へと不均化（分解）することである。過酸化水素それ自体も、高度に反応性かつ酸化性の分子であり、これをさらに還元することにより、細胞および組織に対する損傷を防がなければならない。好適な電子受容体（水素供与体）の存在下で、CATは、過酸化水素の水へのさらなる還元を触媒する。還元型グルタチオン（GSH）の存在下で、GSH-Pxも、別の経路により、過酸化水素の水への還元を媒介する。
上記抗酸化酵素の各々は、各種クラスへとさらに細分することができる。金属イオン含有量に基づき、SODの３つの異なるクラス：銅−亜鉛（Cu-Zn）、マンガン（Mn）および鉄（Fe）が存在する。哺乳動物では、Cu-ZnおよびMn SODクラスだけが存在する。哺乳動物の組織は、細胞質ゾルのCu-Zn SOD、ミトコンドリアのMn SOD、およびES-SODと呼ばれるCu-Zn SODを含み、これは、細胞外体液に分泌される。SODは、自然の速度より1000万倍速い速度で、毒性が極めて高いスーパーオキシドアニオンの不均化を触媒することができる（Somaniら、p.126を参照）。ほぼすべての哺乳動物細胞に存在するが、最高レベルのSOD活性は、高代謝活性を有する数種の主要臓器、すなわち、肝臓、腎臓、心臓および肺に存在する。SODをコードする遺伝子の発現は組織の酸素化と相関し、酸素テンションが高いと、ラットにおけるSOD生合成が高まる（Toyokuni, S., Pathol. Int., 49:91-102（1999））。
CATは、ほぼすべての哺乳動物細胞に存在する可溶性酵素であるが、CATレベルは、組織および細胞内位置に応じて広範に変動し得る。CATは、主として、肝臓および腎臓細胞中のペルオキシソーム（ミクロボディー）、また、その他の組織のミクロペルオキシソームにも存在する。
GSH-Pxには２つの異なるクラス、すなわち、セレン依存性クラスおよびセレン非依存性クラスがある。さらに、GSH-Px種は、細胞質ゾル中に可溶性タンパク質として、膜結合タンパク質および循環血漿タンパク質として見出すことができる。
様々な重要な疾病および薬物副作用におけるROSおよびフリーラジカルの役割の認識は、近年になってかなり高まっている。多くの研究から、多数の疾状態態や、治療薬の有害な副作用は、個体の抗酸化防御系が、ROSおよび各種フリーラジカルの発生速度に追いつけないことに関連することが明らかにされている（例えば、Chanら、Adv. Neurol., 71:271-279（1996）；DiGuiseppi, J.およびFridovich, I. Crit, Rev, Toxicol., 12:315-342（1984）を参照）。例えば、発作中に虚血により誘発される無酸素状態、または心筋梗塞中に心筋に発生した無酸素状態においては、異常に高いROSレベルが認められている（例えば、Walton, M.ら、Brain Res. Rev., 29:137-168（1999）；Pulsinelli, W.A.ら、Ann. Neurol., 11:499-502（1982）；Lucchesi, B.R., Am. J. Cardiol., 65:141-231（1990）を参照）。加うるに、ROSおよびフリーラジカルの上昇も、腎移植後の再灌流損傷と関連していた。さらに、酸化組織破壊と加齢に関連する脳機能不全との間の相関を示す研究が増加していて、様々な認知および運動機能、および／もしくは加齢とともに酸化により改変されたDNAおよびタンパク質の漸進的増加の加齢関係喪失によって立証されている（例えば、Coyleら, Science, 262:689-695 (1993)；Halliwell, J. Neurochem., 59:1609-1623 (1992)；Sohalら, Free Radical Biol. Med., 10:495-500 (1990)；Sohalら, Mech.Ageing Dev., 76:215-224 (1994)；Ames, Free Radical Res. Commun., 7:121-128 (1989)；およびStadtman, Science, 257 : 1220-1224 (1992)を参照）。従って、ROSおよびフリーラジカルの上昇は、下記を含む様々な疾病、薬物療法、外傷、および変性状態の進行およびその際に現れる合併症と関連している：加齢に伴なう酸化ストレス誘発性損傷、加齢に伴う運動機能の喪失、加齢に伴う認知機能の喪失、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、変性眼疾患、敗血症性ショック、頭部および脊髄損傷、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびその他の癌、ならびに、糖尿病（例えば、Ratafia, Pharmaceutical Executive, pp. 74-80（1991、４月）を参照）。
加齢過程における酸化損傷の影響を含む、有害なROSおよびフリーラジカルの上昇したレベルを下げる一手法は、ラザロイドの摂取を増やしてROSおよびフリーラジカルをスカベンジするかまたは低下させることに関わってきた。その結果、抗酸化酵素およびその他のラザロイドの市場は、世界規模で10億ドルを超えると見積もられる。当然、治療薬としての各種ラザロイドの研究および開発は極めて競争の激しい分野となった（Ratafia, Pharmaceutical Executive, pp.74-80(1991年4月)を参照）。また、治療薬としてSODを開発することへの関心も非常に高まってきた。これは、部分的には、承認された抗炎症薬としてのSODのステータスと、SODが非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）市場に浸透する手段を提供し得るという考えによるものである（同上、p.74）。
多年にわたる集中的な研究努力にもかかわらず、SODおよびその他のラザロイドの使用は、ROSおよびフリーラジカルの発生により起こる、もしくはこれを特徴とする疾病、障害およびその他の状態に対処する有効な予防または治療手段を提供していない。明らかに、上昇したレベルのROSおよびフリーラジカルの破壊作用を特徴とする疾病および状態を治療する新たな治療薬および方法が依然として求められている。
発明の概要
ここに記載の本発明は、ROSおよびフリーラジカルの上昇したレベルの破壊的酸化作用を如何にして中和するかという問題を、例えばスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)などの抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現を刺激する（アップレギュレートする）単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる組成物を提供して、細胞および組織中のROSとフリーラジカルのレベルの望ましくない上昇を抑制、排除または防止し、かつ構成的な抗酸化酵素の加齢に伴う減少を回復させることにより解決するものである。さらに、本発明のペプチド化合物は、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現を刺激するそれらの能力とは無関係に、抗酸化活性を有するものである。本明細書に記載するペプチド化合物の式および配列においては、当技術分野で公知の標準的な三文字または一文字表記を採用する。
本発明によれば、アミノ酸L-アスパラギン酸、およびその誘導体は、反応性酸素種およびフリーラジカルの効力を中和する抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)の発現をアップレギュレートする。
本発明は次式：
R1 Xaa R2（配列番号１）
［式中、
R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；
Xaaは抗酸化性酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、いずれかのアミノ酸かその誘導体であり；
R2は存在しないか、カルボキシ末端キャッピング基である］
を有し；かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる組成物を提供する。
好ましくは、上記式中のXaaは、L-アスパラギン酸、D-アスパラギン酸、L-アスパラギン、D-アスパラギン、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸、L-グルタミン、D-グルタミン、およびそれらの誘導体からなる群から選択されるアミノ酸である。
好ましい実施形態においては、本発明は、上記式（配列番号１）［式中、XaaはL-アスパラギン酸、L-アスパラギン、またはそれらの誘導体である］を有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる組成物を提供する。最も好ましくは、XaaはL-アスパラギン酸である。
好ましくは、本発明のアミノ酸化合物によりアップレギュレートされる抗酸化性酵素の遺伝子はスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)をコードする。
本発明の化合物に有用なアミノ末端キャッピング基（R1）は、存在する場合、限定されるものでないが、リポ酸部分（Lip）、グルコース-3-O-グリコール酸（Gga）部分、１〜６個の（好ましくは１または２個の）リシン残基（配列番号２）、１〜６個の（好ましくは１または２個の）アルギニン残基（配列番号２）、リシンおよびアルギニンを含有する２〜６個のアミノ酸残基のペプチド（配列番号２）、および式R3-CO-を有するアシル基［式中、COはカルボニル基を表しかつR3は炭素数１〜25の飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の炭化水素鎖である］、およびそれらの組合わせである。さらに好ましくはアミノ末端キャッピング基はLipまたはR3-CO-アシル基［式中、R3は炭素数１〜22の飽和または不飽和の炭化水素鎖である］。別の好ましい実施形態においては、アミノ末端キャッピング基は、アセチル基（Ac）、パルミチン酸（Palm）、またはドコサヘキサエン酸（DHA）であるアシル基である。
本発明の化合物に有用なカルボキシ末端キャッピング基（R2）は、存在する場合、限定されるものでないが、第一級アミンまたは第二級アミンである。
本発明の組成物および方法に有用なアミノ酸化合物は、特定の組成物または方法に対する必要性に依存して、酢酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩を含む１以上の様々な塩の形態で調製し使用することができる。
さらに本発明は細胞および組織中のROSとフリーラジカルの効力を中和する方法であって、細胞または組織に本明細書に記載のアミノ酸化合物を接触させることを含んでなる上記方法を提供する。本発明の好ましい実施形態においては、本発明のアミノ酸化合物は、ヒトや他の哺乳動物を含めた動物の細胞および組織においてROSとフリーラジカルを解毒することができるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)酵素などの抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現を刺激する（アップレギュレートする）。好ましくは、細胞または組織に本発明の化合物を接触させることによって、SODとCATの両タンパク質の遺伝子発現がアップレギュレートされる。本明細書に記載の単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる組成物を用いて細胞または組織を処理すると、SODおよび／またはCATをコードする遺伝子の発現を、未処理の細胞または組織と比較して、ROSとフリーラジカルの解毒を有意に増加させるのに十分なだけ高いレベルに上昇させることができる。
様々な疾病や状態をかかえた個体は、望ましくないROSおよび／またはフリーラジカルレベルを呈することが分かっている。本発明の好ましい実施形態では、ここに記載の単一アミノ酸化合物を含む組成物を治療的に用いて体内に含まれるROSとフリーラジカルの効力を中和したり、および／または、予防的に用いて特定の疾病、状態、薬物療法または障害と関連したROSとフリーラジカルの望ましくないレベル上昇を抑制または防止したりすることができる。詳しくは、本発明は、ここに記載の単一アミノ酸に基づく化合物を含む組成物を個体に投与して、ROSまたはフリーラジカルの毒性レベルを特徴とする疾患または状態を治療または予防する方法を提供し、かかる疾患または状態には、限定するものではないが、加齢による組織変性および／または認知退行（老化）、老衰、遅発性ジスキネジー、大脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、頭部外傷、脳および／または脊髄外傷、再灌流損傷、未熟児の酸素中毒、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、糖尿病、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびROSまたはフリーラジカルの上昇を特徴とする他の癌、加齢に関係したROSまたはフリーラジカル上昇、ダウン症、黄斑変性、白内障、精神分裂病、てんかん、敗血症性ショック、多外傷性ショック、熱傷、放射線により誘発されるROSおよびフリーラジカル上昇（UVにより誘発される皮膚損傷を含む）が含まれる。
特に好ましい実施形態において、本発明は、ここに記載の単一アミノ酸に基づく化合物を含む組成物を個体に投与して、ROSとフリーラジカルを発生する薬物療法により引き起こされる副作用を軽減または排除する方法を提供する。多数の薬物が有害な副作用として望ましくないROSやフリーラジカルを上昇させることは知られている。そのような薬物として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、BCNU（カルムスチン）および関連化合物（メチル-BCNUおよびCCNUなど）、神経弛緩薬（クロザピンなど）が挙げられる。そのような治療の補助剤として本発明の単一アミノ酸に基づく化合物を用いて、こうした有害な副作用を排除したり、その程度を軽減させたりすることができる。したがって、本発明のペプチドは、例えば遅発性ジスキネジーにおけるような神経弛緩薬による治療中に起こる、薬物により誘発されるROSまたはフリーラジカルの上昇を治療または予防するために投与しうる。
さらに別の実施形態では、ここに記載の単一アミノ酸化合物を非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)の代替品または補助剤として使用し、損傷からの痛み、関節炎、およびROSとフリーラジカルがある役割を担っている他の炎症状態を治療することができる。
本発明はまた、細胞または組織中の有害なレベルのROSまたはフリーラジカルの発生を排除、抑制、または防止する目的で個体に投与するための、本発明の単一アミノ酸化合物および製薬上許容される担体またはバッファーを含んでなる医薬組成物も提供する。
本発明の他の態様は、細胞または組織におけるSODおよび／またはCATなどの抗酸化酵素をコードする１以上の遺伝子の発現をアップレギュレートする、本明細書に記載の内在性アミノ酸化合物を含むか富化してある、生物（動物、植物または微生物）から取得または産生した天然源からの精製組成物を含有する食物補助剤組成物（「機能性食品」ともいう）を提供する。好ましくは、本発明の食物補助剤はさらに、本明細書に記載の外部から供給されるアミノ酸化合物を含む。
詳細な説明
本発明は、L-アスパラギン酸などの単一アミノ酸が反応性酸素種（ROS）およびフリーラジカルを解毒する細胞および組織中の抗酸化防御機構の主成分である酵素、すなわち、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびカタラーゼ（CAT）の相補的対をコードする一方または両方の遺伝子の発現を増強することができるという発見に基づくものである。ROSおよびフリーラジカルは、電子伝達および正常な呼吸、ならびに各種薬物の代謝のようなその他の代謝過程中に発生するので、速やかに解毒して細胞および組織に対する永続的かつ連続的損傷を防止しなければならない。さらに、加齢過程（老化）を含む多くの疾病または状態も、実際に細胞および組織を損なう毒性レベルへのROSおよび／またはフリーラジカルの増加が特徴であるとされている。従って、本発明に記載した単一アミノ酸に基づく化合物は、個体における有害レベルのROSおよびフリーラジカルの発生を中和する有用な治療および予防用化合物である。
本発明をさらによく理解できるように、下記の用語を定義する。
略語：本明細書に記載するアミノ酸残基は、当業者には公知の一般的な三文字または一文字表記によって略記する（例えば、Lehninger, A.L., Biochemistry, 第２版（Worth Publishers, Inc., ニューヨーク、1975）、p.72を参照）。一文字または三文字表記は、対応するD-型を示す接頭辞「D-」のない限り、L-アミノ酸を示すと理解される。さらに、あらゆるアミノ酸の名称はその塩またはイオン化型を含むと理解される。例えば、L-アスパラギン酸はまたL-アスパラギン酸塩も包含すると理解される。
本明細書で用いられるその他の略語として下記のものが挙げられる：ドコサヘキサエン酸部分のアシル型を意味する「DHA」；リポ酸部分のアシル型を意味する「Lip」；パルミチン酸部分のアシル型（すなわち、パルミトリル基）を意味する「Palm」；酢酸のアシル型を意味する「Ac」；グルコース-3-O-グリコール酸部分を意味する「Gga」；スーパーオキシドジスムターゼを意味する「SOD」；カタラーゼ（抗酸化酵素）を意味する「CAT」；グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを意味する「GAPDH」；および反応性酸素種を意味する「ROS」。これ以外にも、本文中必要に応じて他の略語を示す場合がある。
「炭化水素」とは、分枝もしくは非分枝、および飽和または不飽和の炭化水素鎖のいずれも意味する。本明細書に記載するアミノ酸化合物のいくつかに存在する好ましい炭化水素鎖は、炭素数１〜25を有する。さらに好ましい炭化水素鎖は、炭素数１〜22を有する。
本明細書で理解され、用いられる「反応性酸素種」、すなわち「ROS」は、呼吸中の正常な電子伝達系の過程で発生する、あるいは、疾病において、または特定の障害に対する所定治療薬による治療中に発生する、高度に反応性かつ毒性の酸素化合物である。ROSとしては、限定するものではないが、スーパーオキシドアニオン（O2・-）、過酸化水素（H2O2）、一重項酸素、過酸化脂質、およびペルオキシニトライトが挙げられる。ROSは分子、細胞、および組織に酸化損傷を起こすことができる。
本明細書で理解され、用いられる「フリーラジカル」は、奇数の（対になっていない）電子を有するあらゆる原子または分子または化合物を意味する。この定義によると、スーパーオキシドアニオンもまた、負に荷電したフリーラジカルと考えられる。本発明で特に関心のあるフリーラジカルは、高反応性で高酸化性の分子であり、このような分子は、正常な代謝中に、疾病状態で、もしくは化学治療薬による治療中に形成または発生する。このようなフリーラジカルは、高度に反応性で、分子、細胞および組織に酸化的損傷を起こすことができる。スーパーオキシドアニオン以外に、最も一般的で、破壊能力のあるタイプのフリーラジカルは、ヒドロキシルラジカルである。典型的には、スーパーオキシドアニオンまたは一重項酸素などのROSの発生により、１以上の他の有害なフリーラジカルも生じる。従って、本明細書で理解され、用いられる「ROSおよびフリーラジカル」または「ROSおよびその他のフリーラジカル」のような用語は、特に細胞および組織の代謝状態で発生する可能性がある、高反応性で酸化性の分子種もしくは化合物の全集団のいずれかまたは全部を包含するものとする（例えば、Somaniら、「物理・化学的ストレスに対する抗酸化剤系の応答（Response of Antioxidant System To Physical and Chemical Stress）」 Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals, 第６章：125-141（TaylorおよびFrancis, ワシントンD.C.、1997）を参照）。
「酸素ラジカルスカベンジャー」または「ラザロイド(lazaroid)」は、ROSおよびフリーラジカルを除去および解毒する能力を有するクラスの化合物である。ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、およびβカロテンやレチノイドのような関連する抗酸化化合物は、SODおよびCATなどの抗酸化酵素のように、この大きなクラスの化合物のメンバーである。健康な個体では、十分なレベルの抗酸化酵素および他のラザロイドが細胞内および細胞外の両方に存在するため、十分な量のROSおよびフリーラジカルを効率的に除去し、細胞および組織に対する深刻な酸化的損傷を阻止ことができる。
「アミノ酸化合物」、「単一アミノ酸化合物」、「単一アミノ酸に基づく化合物」、および類似の用語は、本明細書に記載のあらゆるキャッピング基とは別に、単一のD-またはL-アミノ酸を含有し、かつSODおよび／またはCATなどの抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる、本明細書に記載のあらゆる化合物を意味する。本明細書に記載の単一アミノ酸化合物の単一アミノ酸は非修飾であっても、本明細書に記載のアミノ酸の「誘導体」であってもよい。
本発明に記載する単一アミノ酸化合物の「アミノ末端キャッピング基」は、アミノ酸化合物のαアミノ基に共有結合で結合したもしくはコンジュゲートしたあらゆる化学的化合物または化学的部分である。このようなアミノ末端キャッピング基の主な目的は、分子内環化または分子間重合および他の分子との望ましくない反応を阻害または防止し、血液−脳関門を介したアミノ酸化合物の輸送を促進し、さらなる抗酸化活性を与え、またはこれらの特性の組合わせを与えることである。従って、アミノ末端キャッピング基を有する本発明のアミノ酸化合物は、非キャップ付加アミノ酸と比較して、その他の有利な活性、例えば、増強された効力や、低減された副作用などを有しうる。例えば、本明細書に記載する化合物に用いられるアミノ末端キャッピング基のいくつかはまた、その遊離状態で抗酸化活性も有し（例えば、リポ酸）、従って、非キャップ付加アミノ酸の抗酸化活性を改良または増強することができる。本発明によるアミノ酸化合物および組成物を調製する上で有用なアミノ末端キャッピング基の例として、限定されるものでないが、１〜６個のリシン残基（配列番号２）、１〜６個のアルギニン残基（配列番号２）、もしくは２〜６個の残基のリシンとアルギニン残基の組合わせ（配列番号２）；ウレタン、尿素化合物、リポ酸（「Lip」）またはパルミチン酸部分（すなわち、「Palm」）；グルコース-3-O-グリコール酸部分（「Gga」）；またはアミノ酸のαアミノ基に共有結合されたアシル基が挙げられる。本発明の組成物に有用なこのようなアシル基はカルボニル基および炭素数１（例えばアセチル部分）から炭素数25まで（例えば、炭素数22の炭化水素鎖を有するドコサヘキサエン酸「DHA」のような）の炭化水素鎖を有するものであってもよい。さらに、上記アシル基の炭素鎖は、パルミチン酸のように飽和していてもよいし、不飽和であってもよい。ある酸（DHA、Palm、またはLipのような）がアミノ末端キャッピング基として存在する場合、得られるアミノ酸化合物は非キャップ付加アミノ酸と酸との縮合生成物であると理解されるに違いない。
本明細書に記載のアミノ酸化合物の「カルボキシ末端キャッピング基」は、アミノ酸化合物のアミノ酸のαカルボキシル基に共有結合で結合したあらゆる化学的化合物または部分である。カルボキシ末端キャッピング基の主な目的は、分子間重合および他の分子との他の望ましくない反応を阻害または防止し、血液−脳関門を介したアミノ酸化合物の輸送を促進し、またはこれらの特性の組合わせを与えることである。カルボキシ末端キャッピング基を有する本発明のアミノ酸化合物はまた、非キャップ付加アミノ酸と比較して、有利な活性、例えば、増強された効力や、低減された副作用、増強された親水性、増強された疎水性、または、例えばカルボキシ末端キャッピング基が１個以上のスルフヒドリル基のような還元力源を有すれば、増強された抗酸化活性などを有しうる。本明細書に記載するアミノ酸化合物において特に有用なカルボキシ末端キャッピング基としては、アミド結合により、アミノ酸化合物のαカルボキシル基と結合した第一級または第二級アミンが挙げられる。本発明で有用な他のカルボキシ末端キャッピング基は、本明細書に記載するアミノ酸化合物のαカルボキシル基と結合してエステルを形成する、炭素数1〜26の脂肪族第一級または第二級アルコールおよびフラボノイドを含む芳香族フェノール誘導体を含む。
アミノ酸の「誘導体」は、非修飾アミノ酸残基の側鎖と結合した、好ましくは共有結合した、１以上の化学基を含むアミノ酸を意味する。好ましい本発明のアミノ酸の誘導体は、SODおよび／またはCATをコードする遺伝子のような抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするアミノ酸化合物の活性に有害な影響を与えないし破壊しない化学基を含有する。
本明細書で理解されかつ用いられる「精製された天然源」は、in vitro組換え核酸技術により遺伝的に改変されていない天然のまたは培養状態における生物または生物のコレクション由来の精製されたまたは抽出された物質の組成を記載し、限定されるものでないが、動物、飲料用および食用のあらゆる種の穀物、自然で成長する未栽培植物の種、植物育種から開発された植物の種、およびin vitro組換え技術により遺伝的に改変されていない微生物が含まれる。
本明細書で理解され、用いられる「放射線」とは、あらゆるタイプの伝播または放出エネルギー波、もしくはエネルギーを加えた粒子を意味し、電磁放射線、紫外線（UV）、ならびに、直射日光誘導放射線および放射能性放射線が含まれる。このような放射線の作用は、皮膚の表面または下層に影響を及ぼすか、身体の遠位部位に全身的損傷を生じる恐れがある。
本明細書で理解され、用いられる「アップレギュレート」および「アップレギュレーション」は、一般的に細胞または組織中の遺伝子産物の発現レベルの増加を意味する。本明細書では遺伝子発現の増加を、遺伝子産物、例えば転写物またはタンパク質の発現のより高いレベルと関係付けて検出するので、用語「アップレギュレート」および「アップレギュレーション」は適宜、遺伝子産物の発現レベルの増加を記載するのにも適用することができる。本明細書に記載するアミノ酸化合物は、該アミノ酸化合物で処理（接触）してない細胞または組織に通常存在するレベルを超えて、酵素スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）および／またはカタラーゼ（CAT）をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。従って、SODまたはCAT mRNA転写物レベル；SODまたはCAT遺伝子産物（タンパク質）合成；SODまたはCAT酵素活性レベルの増加は、抗酸化酵素をコードする遺伝子発現のアップレギュレーションを示す。SODまたはCAT遺伝子の発現は様々な方法により検出することができ、限定されるものでないが、SODおよび／もしくはCATをコードするmRNA転写物を検出するノーザンブロッティング、遺伝子産物、すなわちSODおよび／もしくはCATタンパク質を検出するウエスタンイムノブロッティング、またはSODもしくはCAT酵素活性の標準的アッセイが含まれる。
本明細書で理解され、用いられる「機能性食品（nutraceutical）」および「食物補助剤(dietary supplement)」は、類義語であり、栄養素および／または個体の健康に便益をもたらす特性または活性を含有する他の化合物の、調節されていない、経口投与される供給源として調製され市販される化合物を意味する。食物補助剤中に確認される望ましい成分化合物は、「機能性化学物質（nutrichemical）」と呼ばれる。機能性化学物質は微量しか存在しないが、依然として食物補助剤の望ましくかつ市場性の高い成分である。一般に知られている機能性化学物質には、微量金属、ビタミン、個体の健康に有益と考えられる活性を有する酵素、ならびに、このような酵素をアップレギュレートする化合物などがある。このような酵素として、反応性酸素種（ROS）およびその他のフリーラジカルの有害な酸化作用を阻止するスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびカタラーゼ（CAT）などの抗酸化酵素が挙げられる。従って、内在的に存在する、および／または食物補助剤としての販売のために製造された組成物に外部から添加される、本明細書に記載する１種以上の単一アミノ酸化合物は食物補助剤の機能性化学物質である。
その他の用語は、以下の説明で用いるうちに、明らかになるであろう。
単一アミノ酸化合物および組成物
本発明は、真核細胞において、SODおよび／またはCAT遺伝子発現をアップレギュレートする組成物および／または方法で使用するための単一アミノ酸化合物を提供する。細胞または組織中のSODおよび／またはCATのレベルをアップレギュレートすると、解毒系が増強され、これによって、細胞および組織中のROSおよびフリーラジカルの有害な酸化活性が防止、低減、または排除される。本発明の好ましい単一アミノ酸化合物は、SODおよびCATの両方をアップレギュレートする。本発明に記載した単一アミノ酸化合物のSODおよびCATをアップレギュレートする活性はin vitro、例えば組織培養中で、またはin vivo、いずれかの複数の利用しうる方法を用いて測定することができる。
本発明はまた、次式：
R1 Xaa R2（配列番号１）
［式中、
R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；
Xaaは抗酸化性酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする、いずれかのアミノ酸かその誘導体であり；
R2は存在しないか、カルボキシ末端キャッピング基である］
を有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる組成物も提供する。
好ましくは、上記式中のXaaは、L-アスパラギン酸、D-アスパラギン酸、L-アスパラギン、D-アスパラギン、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸、L-グルタミン、D-グルタミン、およびそれらの誘導体からなる群から選択されるアミノ酸であり、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする。L-アスパラギン酸が特に好ましい。
好ましい実施形態においては、本発明は上記式、すなわち、R1 Xaa R2（配列番号１）［式中、XaaはL-アスパラギン酸、L-アスパラギン、またはそれらの誘導体である］を有し、かつ抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる組成物を提供する。最も好ましくは、XaaはL-アスパラギン酸である。
好ましくは、本発明のアミノ酸化合物によりアップレギュレートされる遺伝子は抗酸化性酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および／またはカタラーゼ(CAT)をコードする。
本発明に有用な単一アミノ酸化合物として、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、D-アスパラギン酸、D-アスパラギン、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸、D-グルタミンからなる非修飾、非キャップ付加アミノ酸のグループが挙げられる。さらに好ましくは、本発明の単一アミノ酸化合物はL-アスパラギン酸またはL-アスパラギンであり、最も好ましくはL-アスパラギン酸である。
本明細書に記載した単一アミノ酸化合物は、該アミノ酸残基の側鎖に化学基の、好ましくは共有結合による、結合のようなさらなる修飾が行われているアミノ酸の誘導体を含有してもよいが、その際、このような修飾が抗酸化酵素の発現をアップレギュレートする該アミノ酸化合物の所望の活性を破壊しないことを条件とする。
本発明の単一アミノ酸化合物は、アミノ酸のαアミノ基と結合したアミノ末端キャッピング基（上記式中の「R1」）を含んでもよい。このようなキャッピング基は様々な機能を提供することができ、それらの機能としては、限定されるものでないが、単一アミノ酸に基づく化合物の二量体もしくは他の多量体を形成する、他の姉妹（sister）単一アミノ酸に基づく化合物を含む他の分子との望ましくない重合を防止するかまたは所望の重合を可能にする手段を提供すること；単一アミノ酸に基づく化合物を、基質、例えば、マイクロタイタープレートのウェルの樹脂粒子、膜、表面などと結合する手段を提供すること；または血液-脳関門を介した単一アミノ酸化合物の輸送を促進する手段を提供すること（例えば、WO 99/26620を参照）が挙げられる。後者の特性は、単一アミノ酸化合物を脳組織および中枢神経系の部分中のSODおよび／またはCATのような抗酸化酵素に対する遺伝子の発現をアップレギュレートするために用いるときに、特に重要である。血液-脳関門を介した単一アミノ酸化合物の輸送を促進するアミノ末端キャッピング基はまた、他の分子との望ましくない反応から生じる単一アミノ酸化合物も防止することができる。
好ましいアミノ末端キャッピング基として、リポ酸（「Lip」）部分があり、これは、アミド結合により、ペプチドのアミノ末端アミノ酸のαアミノ基と結合させることができる。遊離形態のリポ酸（Lip）は独立した抗酸化活性を有し、従って、アミノ末端キャッピング基として用いると、本発明の単一アミノ酸化合物の抗酸化活性をさらに増強することができる。アミノ末端に結合したリポ酸部分は、２個のスルフヒドリル基を含む還元形態か、あるいは、スルフヒドリル基が酸化されて分子内ジスルフィド結合、従って、複素環構造を形成する酸化形態をしていると考えられる。上記以外に、本発明の単一アミノ酸化合物を調製するのに有用なアミノ末端キャッピング基は、グルコース-3-O-グリコール酸部分（Gga）であり、これは、アミド結合で、単一アミノ酸化合物のアミノ酸のαアミノ基と結合させることができる。また、グルコース部分は、グルコース部分の１個以上のヒドロキシル基を置換するアルコキシ基のような修飾をさらに含んでもよい。
本明細書に記載する単一アミノ酸化合物に有用なアミノ末端キャッピング基の別の例は、アシル基であり、これは、アミド結合で、単一アミノ酸化合物のアミノ酸残基のαアミノ基と結合させることができる。アシル基は、飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）で、分枝または非分枝で、好ましくは長さが炭素数１〜25の炭化水素鎖と結合したカルボニル基を有し、そしてさらに好ましくは、アシル基の炭化水素鎖は、DHAと同様に、長さが炭素数１〜22である。アシル基はアセチル基または脂肪族アシル基であるのが好ましい。脂肪族アシルアミノ末端キャッピング基として用いられる脂肪酸は、飽和または不飽和で、分枝または非分枝いずれかの炭化水素鎖を含んでいてよい。好ましくは、脂肪酸の炭化水素鎖の長さは炭素数１〜25であり、さらに好ましくは、炭化水素鎖の長さは炭素数１〜22である。例えば、本発明のアミノ酸化合物の脂肪族アシルアミノ末端キャッピング基として有用な脂肪酸には、限定されるものでないが、下記のものが挙げられる：カプリル酸（C8:0）、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、パルミチン酸（Palm）（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、C16:2、ステアリン酸（C18:0）、オレイン酸（C18:1）、バクセン酸（C18:1-7）、リノール酸（C18:2-6）、α-リノレン酸（C18:3-3）、エレオステアリン酸（C18:3-5）、β-リノレン酸（C18:3-6）、C18:4-3、ゴンドイン酸（gondoic acid）（C20:1）、C20:2-6、ジホモ-γ-リノレン酸（C20:3-6）、C20:4-3、アラキドン酸（C20:4-6）、エイコサペンタエン酸（C20:5-3）、ドコセン酸（C22:1）、ドコサテトラエン酸（C22:4-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-3）、ドコサヘキサエン酸（DHA）（C22:6-3）、ならびに、ネルボン酸（C24:1-9）。本明細書に記載する単一アミノ酸化合物のアシルアミノ末端キャッピング基として用いられる特に好ましい脂肪酸は、パルミチン酸（Palm）およびドコサヘキサエン酸（DHA）である。DHAおよびその他の各種脂肪酸部分は、それらが血液−脳関門を介してそれらの結合分子の輸送
を促進すると思われる（例えば、PCT国際公開WO99/40112およびPCT国際公開WO99/26620を参照）。従って、本明細書に記載する単一アミノ酸化合物を投与することにより、脳組織および／または中枢神経系のその他の部分におけるROSおよびフリーラジカルの酸化作用を中和する場合には、このような脂肪族アシル部分が特に好ましい。
さらに、場合によっては、アミノ末端キャッピング基はリシン残基またはポリリシンペプチドでもよく、その際、ポリリシンペプチドが２、３、４、５または６個のリシン残基（配列番号２）からなって単一アミノ酸化合物のそれ自身または他の分子との環化、架橋、もしくは重合を防止できることが好ましい。また、おそらく、これより長いポリリシンペプチドを用いることもできる。本明細書に記載する単一アミノ酸化合物に用いることができる別のアミノ末端キャッピング基は、アルギニン残基またはポリアルギニンペプチドであり、その際、該ポリアルギニンペプチドは、２、３、４、５または６個のアルギニン残基（配列番号２）からなるのが好ましいが、これより長いポリアルギニンペプチドを用いることもできる。また、本明細書に記載する単一アミノ酸化合物のアミノ末端キャッピング基は、リシンおよびアルギニンの両方を含むペプチドでもよく、その際、該リシンおよびアルギニン含有ペプチドは、両アミノ酸の２、３、４、５または６残基のどんな順序でもよい組合せ（配列番号２）からなるのが好ましいが、おそらくこれより長いリシンおよびアルギニン含有ペプチドを用いることもできる（すなわち、配列番号２の多量体）。本明細書に記載する単一アミノ酸化合物においてアミノ末端キャッピング基として用いられるリシンおよびアルギニン含有ペプチドは、単一アミノ酸化合物の合成に用いられるあらゆる工程に好都合に組み込むことができ、これによって、アミノ末端キャッピング基を含む最終産物化合物が得られる。
本発明の組成物および方法に有用な単一アミノ酸化合物は、カルボキシ末端キャッピング基（「R2」は上記の式）を含むことができる。この基の主な目的は、他分子との望ましくない反応ならびに分子内環化の防止、あるいは、分子間架橋または重合の不活性化である。しかし、上記のように、カルボキシ末端キャッピング基は、これに加えて、効力の増強、副作用の低減、抗酸化活性の増強、および／または望ましい生化学的特性などの便益を単一アミノ酸化合物にさらに賦与することができる。このような有用なカルボキシ末端キャッピング基の例として、該化合物のアミノ酸残基のαカルボキシル基とアミド結合による第一級または第二級アミンがある。標準的なアミド化反応化学を用いて、このようなアミンをペプチドのカルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基に付加することもできる。
以上記したように、本明細書に記載する単一アミノ酸化合物は、単一アミノ酸化合物がSODおよび／またはCATのような、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートする限り、アミノ酸残基のＬまたはＤ型を含んでもよい。対応するL-アミノ酸残基の代わりに、D-アミノ酸残基を使用すると、特にin vivoで、アミノ酸化合物にさらなる安定性を付与することができ、有利である。特定のアミノ酸または異性体を選択するときには、毒性およびその他の副作用のような他の通常の因子も考慮しなければならない。
本明細書に記載するアミノ酸化合物は、標準的方法を用いて生産することもできるし、市販のものから入手することもできる。ＬおよびＤ型両方のアミノ酸は市販されているし、様々な供給源から精製することができる。アミノ酸へのキャッピング基の付加は標準の化学反応、例えば、アシル化、アミド化、および縮合により実施することができる。もしキャッピング基が１以上のアミノ酸からなるのであれば、そのようなアミノ酸を、標準ペプチド結合形成によりまたは単一アミノ酸とキャッピング基のアミノ酸残基との間で形成されるペプチドの直接合成により、化合物の単一アミノ酸と結合することができ、これらの合成方法は当業者にはよく知られている（Stewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis（W.H. Freeman Co.、サンフランシスコ、1989）；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154（1963）；BodanszkyおよびBodanszky, The Practice of Peptide Synthesis（Springer-Verlag、ニューヨーク、1984）；いずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明の組成物および方法に有用な単一アミノ酸化合物は、塩形態で調製して使用することも可能である。典型的には、アミノ酸化合物の塩形態は、特定のpHでアミノ酸化合物の実効イオン電荷に対する対イオンとして働く１個以上のイオンの存在下で、酸または塩基によりアミノ酸化合物を含む組成物のpHを調節することによって存在するだろう。本明細書に記載するアミノ酸化合物の様々な塩形態は、当業者には公知の各種方法、例えば、各種イオン交換クロマトグラフィー方法を用いて、形成または相互交換することができる。本明細書に記載する組成物に用いることができるカチオン性対イオンとして、限定するものではないが、アンモニウムイオンのようなアミン；金属イオン、特にアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム、バリウム）、遷移金属（例えば、鉄、マンガン、亜鉛、カドミウム、モリブデン）、その他の金属（例えば、アルミニウム）の１価、２価、または３価イオン；ならびに、これらの組合せが挙げられる。本明細書に記載する組成物に用いることができるアニオン性対イオンとしては、限定するものではないが、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、硫酸、炭酸、クエン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、グルタル酸、ケトグルタル酸の各イオン、ならびに、これらの組合せが挙げられる。本明細書に記載するアミノ酸化合物のトリフルオロ酢酸塩は、典型的には、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いてトリフルオロ酢酸バッファーで精製する際に形成される。一般にin vivo用途には適していないが、本明細書に記載する単一アミノ酸化合物のトリフルオロ酢酸塩形態は、アミノ酸化合物の活性または効力を試験するのに実施される各種in vitro細胞培養実験またはアッセイにおいて好適に用いることができる。次に、アミノ酸化合物を、トリフルオロ酢酸塩から、より毒性の低い塩に（例えば、イオン交換法により）変換するかまたは合成し、そして医薬品または食物補助剤（機能性食品）組成物に許容できる塩形態として生産することができる。
本発明に有用な単一アミノ酸化合物は、個体に医薬組成物または機能性食品として投与することが許容される精製された形態で取得されることが好ましい。精製のために利用しうる多数の標準方法があり、標準クロマトグラフィ技術および逆相高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）の様々な方法が含まれる。HPLCカラム上で投入材料の95％以上に当たる単一ピークを得るアミノ酸化合物が好ましい。さらには、HPLCカラム上で投入材料の（増加する優先度の順で）97％以上、98％以上、99％以上、あるいは、99.5％である単一ピークを得る化合物がより好ましい。
単一アミノ酸化合物の同一性を確実にするために、当業者には公知の各種分析方法のいずれかを用いて、化合物組成の分析を定量することができる。このような組成分析は、特定のアミノ酸の試験および高分解質量分析法を用いて実施することができる。本発明のアミノ酸の真性を証明するために薄層クロマトグラフィ（TLC）法を利用してもよい。
本明細書に記載した様々な単一アミノ酸化合物は、本発明の組成物および方法において、SODおよび／またはCATなどの抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートし、これにより、抗酸化活性を発生させて、例えば、加齢の過程（老化）、疾病および各種薬物治療で生じるようなROSおよびフリーラジカルの望ましくない破壊的酸化活性を阻止するのに有用である。
抗酸化酵素をコードする遺伝子をアップレギュレートしかつ本発明の組成物および方法に有用である単一アミノ酸化合物としては、限定されるものでないが、L-アスパラギン酸、D-アスパラギン酸、L-アスパラギン、D-アスパラギン、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸、L-グルタミン、D-グルタミン、およびそれらの誘導体が挙げられる。特にL-アスパラギン酸とその誘導体が好ましい。
生物学的および生化学的活性
本発明の組成物および方法で単一アミノ酸化合物は、細胞および／または組織、特に哺乳動物細胞において、SODおよび／またはCATなどの抗酸化酵素をアップレギュレートする能力を有するが、その際、上記細胞がそのような酵素をコードする機能的遺伝子を含むものとする。機能的遺伝子は、特定の酵素をコードするだけでなく、コード配列内外の必要な遺伝情報を提供し、これにより、遺伝子の転写が起こり、mRNA転写物が機能性遺伝子産物、例えばこの場合は、抗酸化酵素に翻訳されうる。
再び目的とする細胞内にSODおよびCATの両酵素の機能的遺伝子が存在すると想定すると、本明細書に記載したある特定の好ましい単一アミノ酸化合物は両酵素をアップレギュレートすることができる。SODおよびCAT両方のアップレギュレーションにより、望ましくないROSおよびフリーラジカルを解毒する効力を増強することができる。特定の機構または理論に拘束されるわけではないが、SOD遺伝子発現のアップレギュレーションの結果、SODタンパク質のレベルが増加するときに、CATレベルにも増加があると、優れた抗酸化効力が達成されると考えられる。CAT遺伝子のアップレギュレーションにより、増強したSOD活性により発生し得る更なる過酸化水素およびその他のROSまたはフリーラジカルを中和および解毒する能力が高くなる。SODおよびCAT両方のアップレギュレーション活性を有する本明細書に記載された単一アミノ酸化合物は、細胞および組織に、ROSおよびフリーラジカルを解毒する増強された抗酸化酵素活性の完全な相補体を提供する。例えば、組織培養中の哺乳動物細胞に、SODおよびCAT両方のアップレギュレーション活性を有する本明細書に記載された単一アミノ酸化合物を接触させると、典型的には、イムノブロッティングにより検出し、未処理細胞と比較して、SODおよびCATタンパク質のレベルが約２倍、さらに増加するほど好ましく、少なくとも約３倍、４倍、および６〜８倍増加する。このようなSODおよびCAT遺伝子発現のレベルの増加により、有害な副作用を伴なうことなく、ROSおよびフリーラジカルの解毒能力が有意に増強された細胞が提供される。
SODおよびCATをコードする遺伝子の発現は、様々な方法により測定することができる。標準的酵素アッセイを用いて、細胞または組織抽出物または生物体液中のSODおよびCATのレベルを検出することができる（Fridovich, Adv. Enzymol., 41:35-97（1974）；BeyerおよびFridovich, Anal. Biochem., 161:559-566（1987））。さらに、SODおよびCATに対する抗体は入手可能であり、容易に作製することもできる。各タンパク質に特異的なこのような抗体を用いて、標準的イムノブロット（例えば、ウェスタンブロット）およびその他の免疫学的技法により、様々な混合物、細胞抽出物、もしくはその他の生物材料のサンプル中のSODおよびCATのレベルを測定することができる。また、目的とする細胞の翻訳機構に欠陥のないことが確かであれば、SODおよびCATをコードする遺伝子の発現レベルは、特定のmRNA種を測定するための標準的ノーザンブロットまたは標準的ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、RT-PCR）を用いて、mRNA転写物のレベルを検出することにより、測定することも可能である。
治療および予防用途
本発明に有用な単一アミノ酸に基づく化合物は、ヒトおよびその他の動物などの動物の細胞および組織中のSODおよび／またはCATのような抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする。好ましくは、本発明のアミノ酸に基づく化合物は、SODおよびCATの両方の発現をアップレギュレートする。前述したように、SODおよびCATは、ROSおよびフリーラジカルを反応性および有害性が低い化合物に還元することにより、これら分子を解毒することができる身体の主要な酵素抗酸化活性の成分である。様々な疾病状態の進行および薬物の副作用に対するROSおよびその他のフリーラジカルの寄与は現在よく知られるところである。
例えば、ROSおよびフリーラジカルのレベル増加が、虚血後の再灌流中に細胞および組織に生じることがわかっている。このようにしてROSおよびフリーラジカルのレベルが増加すると、すでにストレスを受けているか衰弱した臓器または組織に相当の損傷を与える恐れがある。SODおよび／またはCATをアップレギュレートする本発明の単一アミノ酸化合物を用いることにより、卒中、心臓発作、または腎疾患および腎移植などの疾病や状態に起こる再灌流損傷を治療することができる。卒中や心臓発作のように、虚血がすでに起こっている場合には、本明細書に記載する単一アミノ酸化合物を含んでなる組成物を個体に投与することにより、血液や、影響を受けた組織または臓器にすでに存在するまたは現れる増加したROSおよびフリーラジカルを解毒する。あるいは、臓器移植のように、虚血が予想される場合には、手術または虚血事象の前に、予防処置として本明細書に記載する単一アミノ酸化合物を含んでなる組成物を投与することができる。
主な用途は、虚血−再灌流損傷の治療であるが、本明細書に記載する単一アミノ酸化合物を用いて、望ましくないレベルのROSおよびフリーラジカルに関連するあらゆる疾病または状態を治療したり、あるいは、望ましくないレベルのROSおよびフリーラジカルによって起こるあらゆる疾病、障害または状態を予防することもできる。さらに、本発明によれば、本明細書に記載する単一アミノ酸化合物を投与し、上記以外の様々な疾病および状態に関連する増加したROSおよびフリーラジカルの治療または予防処置を提供することができる。このような疾病および状態として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：早産児における酸素毒、組織および臓器の熱傷および物理的外傷、敗血症性ショック、多外傷性ショック、頭部外傷、脳外傷、脊椎損傷、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病、加齢に関連するROSおよびフリーラジカルの増加、老化、潰瘍性大腸炎、ヒト白血病およびその他の癌、ダウン症、関節炎、黄斑変性、精神分裂病、てんかん、放射線損傷（紫外線誘発性皮膚損傷など）、ならびに、ROSおよびフリーラジカルの薬物誘発性増加。
ROSおよびフリーラジカルの形成による酸化ストレスは、加齢とともに漸進的に増加する（例えば、Mecocci, P.ら、Free Radic. Biol. Med., 28:1243-1248（2000）を参照）。これは、ラット組織（Erdincler, D.S.ら、Clin. Chim. Acta, 265:77-84（1997））、および高齢のヒト患者の血液細胞（Congi, F.ら、Presse. Med., 24:1115-1118（1995））における過酸化脂質形成の増加を調べることにより、検出されている。近年の研究（Niki, E., Intern, Med., 39:324-326（2000））では、ROSおよびフリーラジカルによる組織の損傷の増加は、加齢の過程で起こる抗酸化酵素SODおよびCATのレベルの減少に起因する可能性があることが報告されている。例えば、マウスのゲノムに余剰SOD遺伝子を挿入することにより作製したトランスジェニック動物は、ROSおよびフリーラジカルによる損傷のレベルが低下していることが認められた。このような動物は、寿命も延びている。さらに近年、SOD活性を模擬する少量のマンガンポルフィリン化合物を投与することにより、線虫Caenorhabditis elegansの寿命が44％延びたことが証明されている（S. Melowら、Science, 289;1567-1569（2000））。従って、SODおよび／またはCAT遺伝子の発現をアップレギュレートして、抗酸化酵素のレベルを増加させることができる本明細書に記載する単一アミノ酸化合物は、加齢に伴なって起こるROSおよびフリーラジカルのレベル上昇による組織損傷の増加および寿命の短縮を予防および／または阻止する方法にも十分に適している。
現在の治療用途に用いられる多様な薬物は、組織特異的な有毒副作用を発生するが、これは、ROSおよびその他のフリーラジカルのレベル上昇と相関している。このような薬物として、神経弛緩薬、抗生物質、鎮痛薬、およびその他のクラスの薬物が挙げられる。このような薬物に誘発された毒性の影響を受ける組織には、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓および血液など、１以上の主要臓器および組織が含まれる可能性がある。従って、本発明の一態様においては、ROSおよびフリーラジカルを増加することがわかっているかまたは思われる薬物の投与前に、同時に、または投与後に、本明細書に記載の単一アミノ酸化合物を個体にしてもよい。
医薬への適用
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の単一アミノ酸化合物またはその製薬上許容されるその塩、とともに製薬上許容される担体、成分、賦形剤、アジュバントもしくはビヒクルを含む。
本発明の医薬組成物を、その他の治療用、予防用もしくは診断用薬、特に治療用ホルモンペプチドと同様の手法で、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。投与すべき用量、および投与様式は、年齢、体重、性別、患者の状態および遺伝的因子を含む、各種の要因に応じて異なり、最終的には主治医もしくは獣医によって決定されることとなる。一般的には、診断の感度もしくは治療効能のために必要とされる用量は約0.001〜25.0μg／kg（体重）の範囲となる。
本発明の単一アミノ酸化合物の製薬上許容される塩として、例えば製薬上許容される無機および有機の酸ならびに塩基から誘導されるものが含まれる。好適な酸の例として以下の酸が含まれる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、パモ酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびベンゼンスルホン酸。シュウ酸などの、それ自体は製薬上許容されないその他の酸でも、本発明の化合物および製薬上許容されるその酸付加塩を取得する際の、中間体として有用な塩の調製において利用することができる。適切な塩基から誘導される塩として、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびN-(C1-4アルキル)4 +塩が含まれる。
本発明はまた、本明細書に開示した単一アミノ酸化合物の任意の塩基性窒素含有基の「第四級化」も想定しているが、その際、この第四級化が、SODおよびCATをコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単一アミノ酸化合物の能力を破壊しないものとする。第四級化された単一アミノ酸化合物のαカルボキシル基がアミド基に変換されていて、そのカルボキシル基と他分子にもしくは化合物自身に存在するあらゆる遊離アミノ基との反応を防止することが特に好ましい。当業者に知られた任意の薬剤によって、いかなる塩基性窒素でも第四級化することができる。これらとして例えば、以下のものが含まれる：塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチルなどの低級ハロゲン化アルキル；硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルを含む硫酸ジアルキル；塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルなどの長鎖ハロゲン化物；ならびに臭化ベンジルおよびフェネチルを含むハロゲン化アラルキル。こうした第四級化、または酢酸および塩酸などの酸によって、水もしくは油に可溶性もしくは分散性の生成物を取得することができる。
選択的生物学的性質、特にSODおよび／またはCATの発現をアップレギュレートする能力を強化するために、適切な機能付加によって、本発明の単一アミノ酸化合物を改変してもよいものと理解すべきである。こうした改変は当技術分野で知られており、これらとして以下のものが含まれる：単一アミノ酸化合物の所定の生物学的系（例えば脳、中枢神経系、血液、リンパ系）内への貫通もしくは被輸送能力の増大、経口利用性の増大、注射による投与を可能にするための溶解性の増大、単一アミノ酸化合物の代謝の変更、ならびに単一アミノ酸化合物の排出率の変更。その外に、本発明の単一アミノ酸化合物をプロドラッグ形態に改造して、そのプロドラッグに関する代謝もしくはその他の生化学的経路の作用の結果として、患者の体内で所望の単一アミノ酸化合物が創製されるようにしてもよい。こうしたプロドラッグ形態は典型的にはin vitroアッセイでは活性をほとんどまたは全く表示しない。プロドラッグ形態の例のいくつかとして、ケトンもしくはアルデヒト基を含有する化合物のケタール、アセタール、オキシム、およびヒドラゾン形態が含まれる。プロドラッグ形態のその他の例として、ヘミケタール、ヘミアセタール、アシルオキシケタール、アシルオキシアセタール、ケタールおよびアセタール形態が含まれる。
本発明の医薬組成物に使用することができる、製薬上許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとして、限定するわけではないが以下のものが含まれる：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などのバッファー物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素2ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウムなどの塩または電解質、ポリビニルピロリドン、セルロースを基礎とする物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびラノリンなど。
本発明の医薬組成物を各種の経路もしくは様式によって投与することができる。これらとして、限定するわけではないが、非経口、経口、気管内、舌下、経肺、局所、経直腸、経鼻、バッカル、舌下、経腟、またはインプラントレザバー経由が含まれる。経口投与が好ましい。インプラントレザバーは機械的、浸透圧またはその他の手段によって機能させることができる。本明細書で解釈され、かつ使用される用語「非経口」には、静脈内、頭蓋内、腹腔内、脊椎傍、関節周囲、骨膜内、皮下、皮内、動脈内、筋内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄膜内および病変部内注射または注入技法が含まれる。こうした組成物を好ましくは非経口投与用に、最も好ましくは静脈内、頭蓋内もしくは動脈内投与用に製剤化する。一般的に、また特に投与が静脈内もしくは動脈内の場合は、医薬組成物をボーラスとして、時間間隔をとった2回以上の投与として、または一定もしくは非線形流速注入として投与する。
医薬組成物は、例えば注射用の無菌水性もしくは油脂性懸濁液として、無菌の注射用調製品の形態とすることができる。この懸濁液は好適な分散剤もしくは湿潤剤（例えばTween80など）および懸濁剤を使用して、当技術分野で知られた技法にしたがって製剤化することができる。無菌注射用調製品は、非経口的に許容される非毒性の希釈剤もしくは溶媒中の無菌注射液もしくは懸濁液、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液としてもよい。使用が可能な許容されるビヒクルおよび溶媒として、マンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。その外に、溶媒もしくは懸濁用媒質として、無菌の不揮発性油が通常使用される。この目的のためには、合成モノもしくはジグリセリドを含む、いかなるブランドの不揮発性油でも使用することができる。注射剤の調製において、オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体が有用であり、またオリーブ油もしくはひまし油などの天然の製薬上許容される油、特にそのポリオキシエチル化物も有用である。これらの油溶液もしくは懸濁液に、Pharmacoplia Halselicaに記載されたものなどの長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤を含ませてもよい。
本発明の医薬組成物を経口用に許容されるあらゆる投与剤型として経口投与することができる。これらとして限定するわけではないが、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、水性もしくは油脂性懸濁液剤および溶液剤、シロップ剤またはエリキシル剤が含まれる。経口用途の錠剤の場合、普通に使用される担体としてラクトースおよびコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的に添加される。カプセル形態での経口投与用には、有用な希釈剤としてラクトースおよび乾燥コーンスターチがある。カプセル剤、錠剤、丸剤およびカプレット剤を遅延もしくは持続放出用に製剤してもよい。
水性懸濁液を経口投与する場合、本発明の単一アミノ酸化合物を乳化剤および／または懸濁剤と配合するのが有利である。所望ならば、ある種の甘味剤および／または香味剤および／または着色剤を添加してもよい。経口投与用製剤は活性成分を10％〜95％、好ましくは25％〜70％含む。好ましくは、経口投与用の医薬組成物は、消化器系による単一アミノ酸化合物の加水分解は防止または抑制されるが血流中への吸収は可能になる混合物中の、本発明の単一アミノ酸化合物を供給する。
本発明の医薬組成物を膣もしくは直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、室温では固体であるが、体温では液体であることによって、活性成分の放出に関わる身体部域では融解する好適な非刺激性賦形剤と、本発明の化合物とを混合することによって、調製することができる。こうした物質として、限定するわけではないが、カカオバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが含まれる。坐薬による投与のための製剤は活性成分を0.5％〜10％、好ましくは1％〜2％含む。
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の処理が、創傷または手術中などの局所適用によって接近し得る部位もしくは器官に関わる場合に有用である。局所適用のためには、担体中に懸濁または溶解させた活性成分を含有する好適な軟膏として、医薬組成物を製剤化することができる。本発明の単一アミノ酸化合物の局所投与用の担体として、限定するわけではないが、鉱物油、液状石油(liquid petroleum)、白色石油(white petroleum)、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれる。あるいは、製薬上好適な担体中に懸濁または溶解させた単一アミノ酸化合物を含有する、好適なローションまたはクリームとして、医薬組成物を製剤化することができる。好適な担体として、限定するわけではないが、鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれる。適切な場合、医薬組成物をゼリー剤、ゲル剤もしくは軟化剤として、局所またはその他の適用のために製剤化することができる。本発明の医薬組成物を直腸坐剤によるかまたは好適な浣腸剤中で、下部腸管に局所適用することもできる。局所投与は経皮パッチによって達成することもできる。これは健康な皮膚組織を維持し、また酸化による皮膚の損傷（例えばUVもしくは放射線に誘発された皮膚損傷）を回復させるために有用である。
本発明の医薬組成物を経鼻投与することができる。この場合、鼻の粘膜を経由するか、または肺中への吸入によって、吸収が生じる。こうした投与様式には典型的に、組成物を粉末、溶液もしくは液状懸濁物として準備し、次にこれを気体（例えば空気、酸素、窒素その他、またはそれらの組合せ）と混合して、液滴もしくは粒子のエアロゾルもしくは懸濁物を生成させることが必要となる。こうした組成物は医薬製剤の分野で周知の技法にしたがって調製されるが、ベンジルアルコールもしくはその他の好適な保存剤、生物学的利用能を強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で既知のその他の可溶化剤もしくは分散剤を使用し、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
本発明の医薬組成物を、その投与剤型および投与様式に適切な各種の方法でパッケージすることができる。これらとして、限定するわけではないが、バイアル、ビン、カン、パケット(packet)、アンプル、カートン、柔軟性容器、吸入器、およびネブライザーが含まれる。これらの組成物を同一の容器から単回または多数回投与するようにパッケージすることができる。投与の直前に混合するようにした、乾燥粉末状または凍結乾燥形態の組成物と適切な希釈剤の両方を含む、１回以上の投与のためのキットを提供することが可能である。医薬組成物を、単回用の充填済み注射器、またはオートインジェクターおよび無針ジェットインジェクター用のカートリッジ中にパッケージすることもできる。
多数回使用用パッケージ製造には、細菌、真菌などの増殖を防止するが、個体に投与したとき毒性ではない濃度での、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムなどの抗微生物剤の添加を必要とする。
製薬業界において現在使用され、また当業者に公知である、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（GMP）に一致することであるが、医薬品と接触するかこれを含むすべての成分を殺菌しなければならず、また業界基準にしたがって定期的に無菌性について試験しなければならない。殺菌の方法として、限外濾過、オートクレーブ、乾式もしくは湿式加熱、エチレンオキサイドなどの気体への曝露、次亜塩素酸ナトリウム（ブリーチ）を含む酸化剤などの液体への曝露、紫外線光、X線もしくはガンマ線などの高エネルギー電磁放射線への曝露および電離性放射線への曝露が含まれる。所望の生物学的機能、すなわち問題の医薬物質であるSODもしくはCATをアップレギュレートする能力を有意に変更することなく、最も有効な殺菌効果をもたらす、殺菌方法の選択は、当業者がなし得るところである。水溶液もしくは懸濁液である医薬組成物のためには限外濾過が好ましい殺菌方法である。
投与量、投与剤型、投与様式、組成物などの詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版., Alfonso R.Gennaro, 編. (Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)などの標準的薬学指導書中で考察されており、これを参照として本明細書に組み入れる。
当技術分野で周知のように、アミノ酸の構造および生物学的機能は、温度、pH、酸化および還元剤、凍結、振盪ならびに剪断応力などの化学的および物理的環境条件に対して感受性がある。分解に対するこの固有の感受性のため、薬剤が製造され、パッケージされ、流通され、保存され、調剤されて適格な医師によって投与されるまでの時間、医薬組成物中に存在する本発明の単一アミノ酸化合物の生物学的活性が保持されることを確実にする必要がある。
天然源からの精製組成物および食物補助剤
本発明はまた、生物（すなわち動物、植物もしくは微生物）から取得した、天然源からの精製組成物を含む、食物補助剤（「機能性食品」とも称される）としての使用のための組成物、およびその組成物の製造方法も提供する。この精製組成物は、細胞もしくは組織内でSODおよび／またはCATなどの抗酸化酵素をコードする１種以上の遺伝子の発現をアップレギュレートする、本明細書に記載した内在性単一アミノ酸もしくは単一アミノ酸化合物を含有する。本発明の単一アミノ酸化合物はある種の天然源から高度に精製された形態で取得することができる。天然物中のこうした単一アミノ酸化合物のレベルはかなり低いか、存在しても痕跡量しか存在しないこともあり、従って、利用しうる量を得るために本明細書に記載の単一アミノ酸化合物は合成して作ってもよい。従って、本発明の食物補助剤組成物はさらに、SODおよび／またはCATなどの抗酸化酵素をコードする１種以上の遺伝子の発現をアップレギュレートする、外部から供給された本明細書に記載したアミノ酸または単一アミノ酸化合物を含むものであってもよい。本発明の食物補助剤を製造するのに使用される精製組成物の好ましい天然源として、植物、動物、および微生物が挙げられる。
本発明の食物補助剤製剤は、本明細書に記載する内在性単一アミノ酸化合物を含む天然源の精製組成物を含むものであってもよい。本発明の別の食物補助剤製剤は、SODおよび／またはCATをアップレギュレートすることができる内在性アミノ酸または単一アミノ酸化合物を含有する天然源の精製組成物を含有し、かつ１種以上の外部から供給された本明細書に記載する単一アミノ酸化合物を配合した組成物である。後者のタイプの製剤の利点は、天然源の精製組成物に十分な量の外部から供給された本明細書に記載する単一アミノ酸化合物を配合して、その食物補助剤を摂取するかまたは投与される個体中で所望のレベルもしくはレベルの範囲のアップレギュレートされた抗酸化酵素をもたらす食物補助剤を製造することができる点である。従って、本発明の食物補助剤組成物は、天然源の精製組成物からの内在性化合物としての本明細書に記載する単一アミノ酸化合物、ならびに、もしそのように製剤すれば、本明細書に記載する外部から供給される単一アミノ酸化合物を含有することができる。
本明細書に記載された各種の方法またはそれらと同等の方法のいずれかによって、天然源の精製組成物を１種以上の単一アミノ酸化合物の存在についてアッセイし、かつSODおよび／またはCATをコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする活性を哺乳動物細胞においてin vitroまたはin vivoでアッセイすることができる。このような分析から、栄養補助剤を摂取した個体にロット間で同一または実質的に同一の抗酸化活性を提供するための、適切な量の単一アミノ酸化合物を含有する、経口食物補助剤製品の規格化されたロットの終始一貫した生産を可能にする情報が提供される。規格化された量の目的の成分を含む同一の経口食物補助剤製品の販売ロットを終始一貫して生産および供給できることは、食物補助剤市場においてきわめて望ましい。なぜならば、製品の一貫性は特定の製品に対する消費者の信頼および顧客を確立する上で重要な役割を果たすからである。
本発明のその他の態様は、以下の実施例において、さらに理解され、また例示されるであろう。以下の実施例に含まれる特定のパラメーターは本発明およびその各種の様相の実施を例示することを意図するものであって、本発明の範囲を何らかの意味で限定するために提供するものではない。
実施例１：初代ラット皮質培養物に対するL-アスパラギン酸の効果
100ユニット/mlのペニシリンＧ、100μg/mlのストレプトマイシン、および10％ウシ胎仔血清を補充したDulbecco改変Eagle培地で新生ラット脳皮質細胞を増殖させることによって、皮質一次培養物を取得した。Cornell-Bellら、Science, 247:470-473(1990)およびCell Calcium, 12:185-204(1991)に記載されているように、ラット脳のE21皮質から細胞を単離し、1ｘ105／mlの密度でプレーティングし、そして37℃、空気および5％CO2を含有する雰囲気中で、4〜5日以内に密集化するように増殖させた。培養物を20mlフラスコ中で単層となるように培養し、その後、SODに関する遺伝子のアップレギュレーションに対する効果を研究するために、各種濃度のL-アスパラギン酸に曝露した。ラット脳皮質細胞の培養物を0.00、0.01、0.13、1.30、および13.30μg/mlのL-アスパラギン酸とともに5時間インキュベートした。対照培養物はL-アスパラギン酸を加えずに同じ方法で処理した。
細胞質タンパク質を、公表された方法（Adamsら、J.Leukoc.Biol., 62:865-873(1997)）にしたがって単離した。20 mM EDTAを含有するリン酸バッファー塩(PBS)溶液で細胞培養物を１回洗浄し、次に用時調製した溶解用バッファー（20 mM Hepes, pH7.9、10 mM KCl、300 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.1％ Triton X-100非イオン界面活性剤、20％グリセロール、0.5 mM ジチオトレイトール（DTT）、Adamsら 、J.Biol.Chem., 77:221-233(2000)に記載されたようなインヒビターを用時補充）250μlに懸濁させた。次に、懸濁液を氷上で少なくとも10分間インキュベートして、細胞を溶解させ、その後遠心分離（14,000ｘg、4℃で5分間）して、細胞破砕物をペレット化した。上清の細胞質画分を取り出し、分析のために-80℃でアリコートに分けて保存した。細胞質画分のタンパク質濃度は2〜6μg/μlの範囲で変化した。
ゲル上で5μg／レーンを使用するSDS-PAGEによって、細胞質タンパク質を分離した。ゲルをウェスタンイムノブロットのために、基本的にAdamsら（General Cellular Biochemistry, 77:221-233(2000)）による記載に従って処理し、SODのアップレギュレーションを測定した。SOD発現はウェスタンブロットにおいて抗SODウサギポリクローナル抗体（Rockland, Inc., Gilbertville, PA）を使用して検出した。SODタンパク質のアップレギュレーションを定量するために、さらに、このウェスタンブロットをレーザーデンシトメトリーによっても分析した。これらの実験の対照は、ビヒクル単独（すなわち、L-アスパラギン酸を含まないバッファー）で処理した同一の培養フラスコとした。結果を下表に示すが、ここでSODおよびCATのアップレギュレーションは無処理の対照培養物に対する結果と比較した倍数増加で表した。
Figure 2005515156
アスパラギン酸は、培養中10ng/mlまでの低用量においてはSODアップレギュレーションまたは組織培養特性の状況に影響を与えなかった。しかし、L-アスパラギン酸のレベルが130 ng/mlに上昇すると、表１に示すようにSODのアップレギュレーションがある。濃度が10倍の1.3μg/mlまで上昇すると、SODおよびCATの両方がアップレギュレートされる。13.3μg/mlの濃度では、ウェスタンブロット分析法により測定したSODの実質的な増加があった。
実施例２：L-アスパラギン酸のin vivo薬理学的活性
Sprague-Dawleyラット（300〜325g）においてL-アスパラギン酸の溶液を用いてin vivo実験を行った。動物の尾静脈に、L-アスパラギン酸を静脈（iv）注射した。各動物に生理食塩水中のL-アスパラギン酸を0.00、0.75、1.50、3.00、および6.00mg L-アスパラギン酸/kg体重に等しい全用量にて１回注射するか、または0.00もしくは60.0mg/kg体重に等しい用量にて経口胃管強制栄養により与えた。動物を注射後6時間に断頭により動物を屠殺し、解剖して脳器官を単離し、これを-70℃で冷凍して後にウェスタンイムノブロットにより分析した。
各脳組織を解凍し、10倍量の均質化緩衝液を用いてDown'sホモジェナイザーでホモジェナイズし（Adamsら, General Cellular Biochemistry, 77:221-233(2000)を参照されたい；緩衝液はAdamsら, J. Leukoc. Biol., 62:865-875(1967)）に記載されたもの）、粗細胞質画分を得た。Adamsら（J. Cell. Biochem., 77:221-233(2000)）に記載されたように、脳組織ホモジェネートを遠心分離し（14,000×gで4℃にて5分間）、ウェスタンブロット分析用の上清精製細胞質タンパク質画分を得た。次に、10μgの各タンパク質画分のサンプルをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離し、上記のようにウェスタンブロットアッセイによりSODおよびCAT含有量について分析した。
SODの非刺激レベルを測定するための対照は、ビヒクルのみ（すなわちL-アスパラギン酸なし）を注射するか胃管強制栄養し、注射後６時間経って屠殺したラットから得た。両方ともほぼ同じ非刺激レベルのSODを有した。標準的量（10μg）の各細胞質画分をゲルのレーンに載せて電気泳動分離およびウェスタンイムノブロット分析にかけた（Adamsら, J. Cell. Biochem., 77:221-233(2000)）。染色したゲルの写真を撮り、レーザーデンシメトリーにより走査して、対照ビヒクル処理ラットの酵素レベルと比べた強度を定量した。
結果を下表２に示す。データは、ビヒクルだけを与えた対照動物と比較した倍数増加として表現した。静脈（i.v.）注射は生理食塩水中の0.3mlとして5分間に投与した。経口投与は1ml生理食塩水中の溶液として強制胃管栄養により投与した。
Figure 2005515156
SODおよびCATのアップレギュレーションが観察される迄に、in vivo、3mg/Kgの用量静脈注射を必要とする。6mg/Kgにおいて、CATのアップレギュレーションがSODより高くなった。本化合物は経口でも活性があったが、この場合、ラットにおいて効果を見るために60mg/Kgの使用を必要とする。このレベルにおいて毒性影響はない。しかし、軽度の排尿増加があった。その他の点では、動物の行動は正常であった。
本発明の範囲または特許請求の範囲の精神から逸脱することなく、当業者には、本明細書中に記載された本発明の他のバリエーションおよび実施形態が自明であろう。
上記に引用した全ての特許、特許出願および刊行物は本明細書中に参考として組み込まれる。
【配列表】
Figure 2005515156
Figure 2005515156

Claims (41)

  1. 次式：
    R1 Xaa R2（配列番号１）
    ［式中、
    R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；
    Xaaは、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするいずれかのアミノ酸、またはその誘導体であり；そして
    R2は存在しないかまたはカルボキシ末端キャッピング基である］で表され；かつ
    抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる組成物。
  2. 上記抗酸化酵素がスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）またはカタラーゼ（CAT）である、請求項１に記載の組成物。
  3. 上記Xaaが、L-アスパラギン酸、D-アスパラギン酸、L-アスパラギン、D-アスパラギン、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸、L-グルタミン、D-グルタミン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  4. 上記Xaaは、L-アスパラギン酸、L-アスパラギンであるかまたはそれらの誘導体である、請求項３に記載の組成物。
  5. R1が、存在する場合、リポ酸部分（Lip）、グルコース-3-O-グリコール酸（Gga）部分、１〜６個のリシン（配列番号２）、１〜６個のアルギニン残基（配列番号２）、リシンおよびアルギニンを含有する２〜６個のアミノ酸残基のペプチド（配列番号２）、式R3-CO-を有するアシル基［式中、COはカルボニル基を表しかつR3は炭素数１〜25の飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の炭化水素鎖である］、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 上記アミノ末端キャッピング基R1がリポ酸（Lip）である、請求項５に記載の組成物。
  7. 上記アミノ末端キャッピング基R1が式R3-CO-［ここで、COはカルボニル基を表し、R3は炭素数１〜25の飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の炭化水素鎖である］を有するアシル基である、請求項５に記載の組成物。
  8. 上記アミノ末端キャッピング基R3が炭素数1〜22の飽和または不飽和の炭化水素鎖である、請求項７に記載の組成物。
  9. 上記アシル基が酢酸、カプリル酸（C8:0）、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、パルミチン酸（Palm）（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、C16:2、ステアリン酸（C18:0）、オレイン酸（C18:1）、バクセン酸（C18:1-7）、リノール酸（C18:2-6）、α-リノレン酸（C18:3-3）、エレオステアリン酸（C18:3-5）、β-リノレン酸（C18:3-6）、C18:4-3、ゴンドイン酸（gondoic acid）（C20:1）、C20:2-6、ジホモ-γ-リノレン酸（C20:3-6）、C20:4-3、アラキドン酸（C20:4-6）、エイコサペンタエン酸（C20:5-3）、ドコセン酸（C22:1）、ドコサテトラエン酸（C22:4-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-3）、ドコサヘキサエン酸（DHA）（C22:6-3）、ならびに、ネルボン酸（C24:1-9）からなる群から選択される酸のアシル形態である、請求項７に記載の組成物。
  10. 上記アシル基が酢酸、パルミチン酸、およびドコサヘキサエン酸（DHA）からなる群から選択される酸のアシル形態である、請求項９に記載の組成物。
  11. 上記R2が、存在する場合、第一級アミンまたは第二級アミンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 上記単一アミノ酸に基づく化合物が塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 哺乳動物の細胞または組織中のスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、またはその両方の発現レベルをアップレギュレートする方法であって、哺乳動物の細胞または組織に、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートするために有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を接触させることを含んでなる上記方法。
  14. 哺乳動物の細胞または組織中の反応性酸素種およびフリーラジカルの酸化効果を中和する方法であって、哺乳動物の細胞または組織に、式：
    R1 Xaa R2（配列番号１）
    ［式中、
    R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；
    Xaaは、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするいずれかのアミノ酸、またはその誘導体であり；そして
    R2は存在しないかまたはカルボキシ末端キャッピング基である］で表され；かつ
    抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる、組成物を接触させることを含む上記方法。
  15. 上記抗酸化酵素がスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）またはカタラーゼ（CAT）である、請求項１４に記載の方法。
  16. 上記Xaaが、L-アスパラギン酸、D-アスパラギン酸、L-アスパラギン、D-アスパラギン、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸、L-グルタミン、D-グルタミン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  17. 上記Xaaは、L-アスパラギン酸、L-アスパラギンであるかまたはそれらの誘導体である、請求項１６に記載の方法。
  18. R1が、存在する場合、リポ酸部分（Lip）、グルコース-3-O-グリコール酸（Gga）部分、１〜６個のリシン（配列番号２）、１〜６個のアルギニン残基（配列番号２）、リシンおよびアルギニンを含有する２〜６個のアミノ酸残基のペプチド（配列番号２）、式R3-CO-を有するアシル基［式中、COはカルボニル基を表しかつR3は炭素数１〜25の飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の炭化水素鎖である］、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  19. 上記アミノ末端キャッピング基R1が式R3-CO-［ここで、COはカルボニル基を表し、R3は炭素数１〜25の飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の炭化水素鎖である］を有するアシル基である、請求項１８に記載の方法。
  20. 上記アミノ末端キャッピング基R3が炭素数1〜22の飽和または不飽和の炭化水素鎖である、請求項１９に記載の方法。
  21. 上記アシル基が酢酸、カプリル酸（C8:0）、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、パルミチン酸（Palm）（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、C16:2、ステアリン酸（C18:0）、オレイン酸（C18:1）、バクセン酸（C18:1-7）、リノール酸（C18:2-6）、α-リノレン酸（C18:3-3）、エレオステアリン酸（C18:3-5）、β-リノレン酸（C18:3-6）、C18:4-3、ゴンドイン酸（gondoic acid）（C20:1）、C20:2-6、ジホモ-γ-リノレン酸（C20:3-6）、C20:4-3、アラキドン酸（C20:4-6）、エイコサペンタエン酸（C20:5-3）、ドコセン酸（C22:1）、ドコサテトラエン酸（C22:4-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-3）、ドコサヘキサエン酸（DHA）（C22:6-3）、ならびに、ネルボン酸（C24:1-9）からなる群から選択される酸のアシル形態である、請求項１９に記載の組成物。
  22. 上記アシル基が酢酸、パルミチン酸、およびドコサヘキサエン酸（DHA）からなる群から選択される酸のアシル形態である、請求項２１に記載の方法。
  23. 上記R2が、存在する場合、第一級アミンまたは第二級アミンからなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 上記単一アミノ酸に基づく化合物が塩である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 哺乳動物の細胞または組織中のスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、またはその両方の発現レベルをアップレギュレートする方法であって、細胞または組織に、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートするために有効な量の請求項１、３、および４のいずれか１項に記載の組成物を接触させることを含んでなる方法。
  26. 哺乳動物の細胞または組織中の反応性酸素種およびその他のフリーラジカルの望ましくないレベル上昇を低下または防止する方法であって、該細胞または組織に、抗酸化酵素の発現をアップレギュレートするために有効な量の請求項１、３、および４のいずれか１項に記載の組成物を接触させることを含んでなる上記方法。
  27. その細胞または組織中の反応性酸素種およびその他のフリーラジカルのレベルに望ましくない上昇を示す哺乳動物の疾患または状態を治療する方法であって、上記哺乳動物に、式：
    R1 Xaa R2（配列番号１）
    ［式中、
    R1は存在しないか、アミノ末端キャッピング基であり；
    Xaaは、抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートするいずれかのアミノ酸、またはその誘導体であり；
    そしてR2は存在しないかまたはカルボキシ末端キャッピング基である］で表され；かつ
    抗酸化酵素をコードする遺伝子の発現をアップレギュレートする単一アミノ酸に基づく化合物を含んでなる組成物を投与することを含む上記方法。
  28. 上記Xaaが、L-アスパラギン酸、D-アスパラギン酸、L-アスパラギン、D-アスパラギン、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸、L-グルタミン、D-グルタミン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 上記抗酸化酵素がスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）またはカタラーゼ（CAT）である、請求項２７に記載の方法。
  30. 上記疾患または状態が脳虚血、心筋梗塞、腎再灌流、アテローム性動脈硬化症、頭部外傷、脳外傷、脊髄外傷、未熟児の酸素中毒、神経変性疾患、関節炎、炎症、糖尿病、潰瘍性大腸炎、癌、ダウン症、黄斑変性症、白内障、精神分裂病、てんかん、敗血症性ショック、多外傷性ショック、熱傷、放射線により誘発される反応性酸素種または他のフリーラジカル上昇、および薬物により誘発される反応性酸素種または他のフリーラジカル上昇からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
  31. 上記疾患または状態が神経変性疾患である、請求項３０に記載の方法。
  32. 上記神経変性疾患がハンチントン舞踏病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 上記疾患または状態が加齢過程に関係する疾患または状態である、請求項２７に記載の方法。
  34. 加齢過程に関係する上記疾患または状態が認知機能低下、運動機能低下、老化、アルツハイマー病、早老、および平均余命低下からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. R1が、存在する場合、リポ酸部分（Lip）、グルコース-3-O-グリコール酸（Gga）部分、１〜６個のリシン（配列番号２）、１〜６個のアルギニン残基（配列番号２）、リシンおよびアルギニンを含有する２〜６個のアミノ酸残基のペプチド（配列番号２）、式R3-CO-を有するアシル基［式中、COはカルボニル基を表しかつR3は炭素数１〜25の飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の炭化水素鎖である］、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  36. 上記アミノ末端キャッピング基R1が式R3-CO-［ここで、COはカルボニル基を表し、R3は炭素数１〜25の飽和または不飽和（モノ−またはポリ不飽和）の炭化水素鎖である］を有するアシル基である、請求項３５に記載の方法。
  37. 上記アミノ末端キャッピング基R3が炭素数1〜22の飽和または不飽和の炭化水素鎖である、請求項３６に記載の方法。
  38. 上記アシル基が酢酸、カプリル酸（C8:0）、カプリン酸（C10:0）、ラウリン酸（C12:0）、ミリスチン酸（C14:0）、パルミチン酸（Palm）（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、C16:2、ステアリン酸（C18:0）、オレイン酸（C18:1）、バクセン酸（C18:1-7）、リノール酸（C18:2-6）、α-リノレン酸（C18:3-3）、エレオステアリン酸（C18:3-5）、β-リノレン酸（C18:3-6）、C18:4-3、ゴンドイン酸（gondoic acid）（C20:1）、C20:2-6、ジホモ-γ-リノレン酸（C20:3-6）、C20:4-3、アラキドン酸（C20:4-6）、エイコサペンタエン酸（C20:5-3）、ドコセン酸（C22:1）、ドコサテトラエン酸（C22:4-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-6）、ドコサペンタエン酸（C22:5-3）、ドコサヘキサエン酸（DHA）（C22:6-3）、ならびに、ネルボン酸（C24:1-9）からなる群から選択される酸のアシル形態である、請求項３６に記載の方法。
  39. 上記アシル基が酢酸、パルミチン酸、およびドコサヘキサエン酸（DHA）からなる群から選択される酸のアシル形態である、請求項３８に記載の方法。
  40. 上記R2が、存在する場合、第一級アミンまたは第二級アミンである、請求項２７に記載の方法。
  41. 上記単一アミノ酸に基づく化合物が塩である、請求項２７に記載の方法。
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