CN102775514B - 透明质酸酯、其制备和在皮肤病学中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及带有羟基‑肉桂酸的新型透明质酸酯衍生物、其流变学和抗自由基的特性以及作为保护剂在皮肤病学中的应用。本发明还涉及用于制备透明质酸酯的方法，以及包含该透明质酸酯的局部应用组合物。本发明的透明质酸酯具有增强弹性、保湿、软化活性的作用，并且具有在辐射引起红斑的情况下的抗红化或安抚活性。

Description

透明质酸酯、其制备和在皮肤病学中的应用
技术领域
本发明涉及葡萄糖胺（GAG）的新型酯衍生物，例如透明质酸（HA）与羟基-肉桂酸（如阿魏酸和咖啡酸）的衍生物。
背景技术
HA是一种GAG，GAG是由葡糖醛酸和N-乙酰-葡糖胺形成的二糖单元的重复序列。
HA具有若干种生物功能，从存在于组织中的水的调整到细胞的移动，而且还具有在真皮中通过与其他物质连接作为支撑骨架，以形成为皮肤提供致密性的大分子复合物的功能。
羟基-肉桂酸的衍生物（例如阿魏酸和咖啡酸）以游离形式或与木质素或生物聚合物共价结合的形式广泛分布于植物界的种子和叶中。由于酚核（phenolic nucleous）和侧链的延伸结合，它们形成苯氧基自由基，其通过共振而稳定化，在各种炎症病理学和在细胞暴露于紫外辐射的保护特征方面产生其强大的抗氧化和保护功能。
透明质酸是一种在皮肤层面通过保持经皮水而增加水分的物质。然而它是一种高度亲水的分子，难以穿过高度油性的角质层，此外它是易经受快速降解的物质。本发明的复合物的优势之一在于，改性的聚合物的羟基肉桂酸取代物的存在提供了防止存在于组织中的透明质酸酶对其进行酶降解；此外，相对于原本的聚合物（native polimer），羟基肉桂酸衍生物与HA的酯化（作用）使得能够获得具有增强的亲脂特性的复合物，并且因此其可以更容易被生物吸收而通过表皮。
考虑到其化学、物理和生物学性质，已经特别地研究了HA，并且其一直是结构改性的主题并且已有若干关于新型衍生物的出版物和专利。
开展了若干关于HA的网组化（reticulation）处理的工作，以便获得将主要用于关节疗法的关节内给药的粘弹性产物，如所描述的，例如，EP0341745，或也将用作手术后的抗粘合剂，如US4,582,865描述的。
涉及由HA的羟基与有机酸获得的酯的专利或出版物的数量相对较少。
在这些之中，我们可以参考US5,679,567，其描述了以不同的取代程度乙酰化的HA的制备。WO2005/092929和Inv.New drug(2004),22(3),207-217描述了HA与丁酸的酯衍生物，其被赋予抗增值活性并且这因此可能对抗癌的应用是有益的，然而WO2008/081255描述了HA与丁酸的另一种酯衍生物，但是具有高的网状程度，且其将主要作为粘性-弹性增强剂用于关节内给药。Picotti等在WO2009/080220中描述了HA的其他酯衍生物，其中用硫辛酸酯化HA，以用于皮肤化妆品或为关节内的治疗的医疗装置提供衍生物。
在我们的知识中，直到现在，还没有多糖酯，并且更具体地说，HA与羟基-肉桂酸的酯衍生物的描述，例如作为具有增强弹性、保湿、软化活性的化合物用于皮肤化妆品，或用作具有在辐射引起红斑的情况下的抗红化或安抚活性而用于医疗装置或作为粘性-弹性剂的阿魏酸和咖啡酸。
发明内容
本发明描述了透明质酸与羟基-肉桂酸（如阿魏酸和咖啡酸）的衍生物的新型酯衍生物，不同于先前所述的用不同的酸（如乙酸、丁酸和硫辛酸）酯化的多糖衍生物。
可以调节根据本发明的酯化透明质酸的取代程度并且其取决于应用的反应条件例如，举例来说，取决于透明质酸和用羰基二咪唑预活化的羟基-肉桂酸的衍生物之间的化学计量比、使用的催化性碱的量和反应的时间，并且包含在所研究的实验条件范围内，在2%至20%之间。
可以改变根据本发明获得的衍生物的化学、物理和流变学性质，因此通过用羟基-肉桂酸组分改变透明质酸的酯化程度。这样的衍生物可以局部用作保湿剂、增强弹性剂、抗老化剂、抗痤疮剂或，或者也可以用于对不同性质的皮肤损伤的治疗，如创伤、特应性皮炎、不同性质的辐射引起的皮肤过热。
本发明还要求保护制备这样的衍生物的方法，其与现有技术是不同的并且是新的。事实上这样的方法意在通过用丙酮沉淀的方式回收反应产物，之后用甲醇处理进行纯化、过滤并在真空下干燥，随后通过冻干或喷雾干燥的方法回收期望的最终产物，这使得在不需要使用费时的和成本高昂的工艺（如渗析或切向过滤）的情况下，能够去除合成过程中的杂质。
具体而言，本发明涉及一种带有羟基-肉桂酸衍生物的透明质酸酯。
在一种实施方式中，该羟基-肉桂酸衍生物是阿魏酸和咖啡酸。
在一种实施方式中，该透明质酸的分子量是200,000至400,000道尔顿。
在一种实施方式中，多糖上的咖啡酸和阿魏酸的取代程度为2%至20%之间。
本发明还涉及用于制备本发明的透明质酸（HA）酯的方法，其中，将透明质酸钠盐溶解于甲酰胺中，所述盐在相当量的三元碱存在下与在室温下预先用羰基二咪唑（CDI）活化的羟基-肉桂酸的衍生物反应，所获得的粘性物质用NaCl水溶液稀释，用丙酮沉淀回收反应产物，之后用甲醇纯化、过滤并在真空下干燥。
在一种实施方式中，该衍生物是羟基-肉桂酸、阿魏酸。
在一种实施方式中，该衍生物是羟基-肉桂酸、咖啡酸。
在一种实施方式中，根据所期望的在2%到20%之间的酯化程度，所述用CDI活化的酸以相对于HA的比率在0.25到1之间当量存在。
在一种实施方式中，根据所期望的在2%到20%之间的酯化程度，使得HA与用CDI活化的所述酸的反应时间在1至24小时之间。
在本发明的一个方面，本发明还涉及透明质酸酯用于如创伤、溃疡、皮炎、银屑病、辐射引起的过热的皮肤损伤的局部治疗的应用。
在本发明的另一个方面，涉及本发明的透明质酸酯用于作为润肤霜、弹性剂、抗老化剂或抗痤疮剂的局部治疗的应用。
在本发明的又一个方面，涉及本发明的透明质酸酯作为粘度补充剂用于关节内治疗的应用。
本发明还涉及一种局部组合物，其包含本发明的透明质酸酯，以及皮肤病学可接受的惰性赋形剂
在一种实施方式中，本发明的局部组合物包含以所述组合物的重量计0.1%至5%之间的透明质酸酯。
在一种实施方式中，本发明的局部组合物为乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、水性或水醇洗剂、油/水或水/油乳剂的形式。
在一种实施方式中，本发明的透明质酸酯中的羧基是用钠成盐的。
附图说明
图1是示出了实施例1的化合物1的NMR图。
图2是示出了实施例2的化合物的NMR图。
图3是示出了实施例3的化合物的NMR图。
图4是示出了实施例4的化合物的NMR图。
图5a和图5b是示出了实施例1的样品的假塑性类型的流变学的图。
具体实施方式
实施例
通过使用Bruker Avance 400仪器记录NMR实验。将化合物溶解于使用浓度约为5mg/mL的KOD滴定至pH12的D2O中。
由于酯化作用，在6ppm至8ppm之间的芳香区域能够观察到芳香信号，而在约1.8ppm处可见到透明质酸的甲基单峰（singlet）的极强信号。这些信号的积分提供了样品的酯化程度。
实施例1：具有中等取代程度的透明质酸的阿魏酸的制备（化合物1）
在90°C下将3g透明质酸钠（mw 404；7.9meq.单体单元中；分子量300kD）溶解在60mL甲酰胺中。在室温下冷却后，使1.05mL三乙胺（7.5meq）和0.5g阿魏酰基咪唑啶（feruloylimidazolide）（mw 244；1.99meq）悬浮于10mL甲酰胺中，并且按照Molecules 2007,12,p 2540-2544中的描述制备化合物12，将其加入由此获得的溶液中。
在室温下反应过夜之后，用15mL的5%NaCl稀释反应混合物。最初的高度粘性的溶液因此变得更加流体化，将其逐滴倾注到1L无水丙酮中。过滤由此获得的沉淀物，使其再次经过与400mL无水丙酮一起进行搅拌，再次过滤并再次与200mL无水甲醇一起进行搅拌。
在40°C的真空下过滤和干燥之后，回收3.1g无水样品。
通过IR、NMR光谱和元素分析的方法分析由此获得的化合物。
通过计算HA的甲基信号之间的信号的积分信号（NMR）和阿魏酸的双峰信号之比，获得8%的取代程度（酯化）（参见，图1的NMR）。
实施例2：具有低取代程度的透明质酸的阿魏酸酯（ferulic ester）制备
依照实施例1中同样的程序，然而在加入NaCl之前将反应时间减少为仅为2小时。得到2.8g酯化程度为4%的无水化合物（参见，NMR图2）。
实施例3：具有高取代程度的透明质酸的阿魏酸酯的制备
依照实施例1的程序，而在加入NaCl之前将反应时间增加至24小时并将咪唑啶（四氢咪唑，imidazolide）的量增加至1.9g（7.9meq）。得到3.3g酯化程度为17%的无水化合物（参见，NMR图3）。
实施例4：透明质酸的咖啡酸的制备
向无水THF（10mL）中的咖啡酸（0.51g，2.83mmoles）的溶液中加入1,1′-羰基二咪唑（CDI，0.92g，5.67mmol）。在回流下使得到的混合物保持1h，并且该反应混合物直接用于以下步骤。
在置于沙浴中的双颈圆底烧瓶（2-neck balloon）中，在70°C下在1h内将透明质酸钠（3.0g，7.92mmol单体单元）溶解于甲酰胺（60mL）中。在室温下冷却由此获得的粘性无色溶液，并加入TEA（1.1ml，7.92mmol）和咪唑的THF溶液（约2.8mmol）。搅拌混合物直到获得均匀的橙红色溶液。溶液的粘度和稠度增加从而在几分钟内导致形成凝胶状橙红色（橡胶状且具有弹性的）团聚物。在室温下静置保持过夜后，将团聚物加入到5%（w/v）的NaCl溶液（15mL）中。
用200mL丙酮处理所获得的凝胶，过滤，用100mL甲醇搅拌两次使其再悬浮，过滤并在真空下干燥。获得2.5g黄赭色的无水产物。
使约6mg的聚合物样品在0.7mL D2O中膨胀，以获得完全透明的和无色的凝胶。将该凝胶转移到NMR管中，并且分析（图4）显示在6ppm和7.2ppm之间有双峰信号，其可以归因于酯化的咖啡酸的芳香氢和在1.8ppm处甲基的强单峰信号。加入一滴NaOD的40%D2O溶液能够量化透明质酸钠的衍生程度，确定其等于7%。
实施例5：抗酶降解作用的评估
表皮上的微生物的存在引起皮肤上的由透明质酸酶实施的相关的生物学活性，这种活性是以各种酶功能的形式表现的。由于所述酶的存在，透明质酸会发生自然降解，该酶通过多糖链的单体间1,4-β-糖苷键的水解而催化其降解。交联的HA高度抗透明质酸酶的酶解作用，并且这样的抗性随着交联程度的增加而增加。HA与具有根据本发明的适合化学结构的分子（如羟肉桂酸的衍生物）的酯化作用使得能够获得具有可比得上交联的HA的流变学性质的化合物，同时保持在水中的良好溶解度。
如在前文中描述的合成中使用的，使用商品化的HA钠盐（分子量300kD），以及使用如在以上实施例2和3中分别描述的HA的利用阿魏酸酯化的低酯化程度和高酯化程度的两种样品。
实验根据常规的程序实施。
不久后，将保持在37°C并包含酶的量等于0.1mg/mL（牛睾丸透明质酸酶，I-S型，Sigma，1000U/mg）的多糖溶液（1mg/mL）在37°C下温育。以规定的时间间隔，在0-2小时范围内，取出0.5ml的量的样品并将其置于100°C中保持5分钟，过滤以去除酶，之后通过尺寸排阻色谱分析的方法进行分析：色谱的过程使得能够确定分子量分布。
在与酶一起温育30分钟后，商品化的非酯化的HA经历强烈的降解，从约300kD的平均分子量变为约低10倍的数值。具有约4%的酯化程度的实施例2的样品经历约60%的降解，而具有高的酯化程度的实施例3的样品仅经历了有限的降解过程，平均分子量变为约250kD。
实施例6：对用阿魏酰酯化的HA样品的流变学研究
根据本发明的化合物（实施例1的化合物），与根据本发明用作起始原料以制备酯的HA的钠盐（分子量300kD）的流变学行为进行比较。
使用Rotovisco 1-Haake流变仪，plate/plate系统，Rheowin 323软件，来实施流变学的测量。利用圆盘的速度梯度方法测量粘度，“剪切速率”，从0.01s-1到500s-1并以2%的量将样品溶解于5%的NaCl盐溶液中。
实施例1的样品显示出假塑性类型的流变学行为，其中粘度随着剪切速率的增加而降低（参见，图5a和5b）。通过应用Ostwald de Waele关系获得流体图的经计算的参数，分别是：K（Pa.s），即流体稠度指数，等于9.97+/-0.53（n=3）和n=0.47（流动行为指数，即粘度曲线的斜率，作为速度梯度的函数，使用对数标度）。
实际上，这个结果得出了这样的结论，即HA与阿魏酸的酯化提供了在低剪切时具有不可忽视的非线性位阻构象的链，它们能够彼此发生相互作用。通过增加所施加的剪切力，链往往会趋向于与流动对齐，从而使系统还原到原本行为。
相反，未经改性的天然HA的溶液的典型特征（profile typical of thesolution），其具有极低K值（K=0.40Pa.s）。
实施例7：HA阿魏酰酯化合物（实施例1）对活化的人嗜中性白细胞的抗ROS活性
研究了根据本发明的化合物是否能够保持用于酯化HA的羟基-肉桂酸底物的抗氧化抗自由基净化活性。
我们已经研究了化合物1在体外抑制由人嗜中性白细胞产生的活性氧分子（ROS）的活性的能力，该人嗜中性白细胞在鲁米诺（Luminol）存在下用十四烷酰-佛波醇-乙酸酯（Phorbol-Miristate-Acetate）（PMA）活化，鲁米诺为在氧化剂（例如H2O2）存在时表现化学发光的物质。
因此，用在鲁米诺（5μM）存在时溶解于适当的缓冲液中的化合物1温育大量白细胞的细胞悬液（106个细胞/mL）。用化合物1或用浓度为0.02和0.2mM的HA的原本钠盐，在37°C下温育细胞10分钟。此后，用0.1μM的PMA活化细胞，用荧光读数器（fluorescence reader）HTS7000（PerkinElmer）以4分钟的时间间隔监测化学发光20分钟。
化合物1在较高的测试浓度下显示78%的最大抑制，而HA实际上是不活泼的，显示了在多糖中引入阿魏酸降低了初始底物的抗自由基活性。
实施例8：具有日光滤光（solar filter）功能的O/W软膏剂的制备
作为本发明的非限制实施例，制备包含根据本发明的酯衍生物的乳膏制剂，通过加入赋予日光防护因子（UVB）的物质（例如γ-谷维素）强化，由此整合改性的多糖中发色团部分（cromophore moiety）的作用。
该制剂含有浓度为2%的实施例1中描述的化合物1，与在皮肤病学中使用的常规赋形剂混合，如乳化剂、防腐剂、安抚剂、溶剂和针对日光辐射具有保护活性的产品，即γ-谷维素。
简言之，制备过程如下：
a）油脂相：通过加热至约80°C，在溶解器中在搅拌下溶解碳酸二辛酯（di-caprilyl carbonate）、辛酸椰油醇酯、聚甘油-2-二聚-硬脂酸羟基酯和苯氧乙醇；溶解后，加入γ-谷维素；
b）水相：将水、脱氢醋酸钠和化合物1装入涡轮式乳化器中；在加热至约60°C直到溶解后，在持续的轻微搅动下加入另外的组分，即乳化混合物月桂基葡糖苷羧酸钠/月桂基葡糖苷和防腐剂混合物甲基丙二醇/苯丙醇；
c）乳状液：在搅动下将油脂相倒入水相中，并使涡轮机运行10分钟；在持续搅动下使反应物质最终缓慢冷却，降至20/25°C的温度。
获得具有以下组成（按重量计的%）的乳膏剂：
实施例9：皮肤化妆品活性的功能化验
通过使用在前述实施例中所示的原型制剂，利用特地训练的志愿者小组对皮肤化妆品的功能活性（如皮肤水合作用和弹性）进行了研究。在研究中，每天两次治疗两组志愿者，持续四周（时间T0和T4w），将实施例8的制剂的活性与没有活性成分的相同制剂（对照）作对比。
a）皮肤弹性：对皮肤弹性的评估通过“皮肤测试仪”（“skin meter”）进行其为在探针自身内部产生持续时间为1秒的负压（吸力），紧接着释放的方式的通过施加于皮肤的探针进行测量的测量仪器。通过残余变形和皮肤的最大延伸之间的比率来计算弹性。在文献中已知的作为参数R2的这样的比率显示皮肤在压力事件后恢复到其初始放松状态的能力。这样的数值越接近1，皮肤的弹性就越高。
对涉及到实施例8的制剂的组中的治疗参照初始时间T0时的27.5%，给出了参数R2在T4w时刻的百分数变化（p<0.05t检验），而发现对照组中相同百分数变化不显著。这样的结果显示，根据本发明的化合物1具有相关弹性增强的活性，导致参数R2的增加，这未在制备的具有相同赋形剂的对照组中发现。
b）皮肤水合：脸部皮肤的水合水平用“皮肤水分测试仪（corneometer）”测量，其为基于电容的物理原理测量皮肤水合的仪器。该仪器包括面积为49mm2的方形传感器。通过在脸部皮肤的平坦区域上按压传感器表面，该仪器提供与角质层的含水率成正比的数字。该数字因此提供皮肤表面的皮肤水合的测量，以皮肤水分测量单位（corneometric unit）（从0到150c.u）表达，其为该仪器的任意单位。
在测试结束时，用实施例8的制剂治疗的组记录了等于4.8%的皮肤水合值的百分数变化增加，相对而言，作为比较的对照组无变化。然而发现这样的增加接近显著性极限（significance limit），其结果很有可能是由于使用的小组中的成员数（n=10）相对较少。

Claims (16)

1.带有羟基-肉桂酸衍生物的透明质酸酯，其中，所述羟基-肉桂酸衍生物是阿魏酸或咖啡酸。
2.根据权利要求1所述的透明质酸酯，其中，所述透明质酸的分子量是200,000至400,000道尔顿。
3.根据权利要求1所述的透明质酸酯，其中，透明质酸上的咖啡酸或阿魏酸的取代程度为2％至20％之间。
4.用于制备根据权利要求1的透明质酸(HA)酯的方法，其中，将透明质酸钠盐溶解于甲酰胺中，所述盐在相当量的叔碱(tertiary base)存在下与在室温下预先用羰基二咪唑(CDI)活化的羟基-肉桂酸的衍生物反应，所获得的粘性物质用NaCl水溶液稀释，用丙酮沉淀回收反应产物，之后用甲醇纯化、过滤并在真空下干燥。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述衍生物是阿魏酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述衍生物是咖啡酸。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，根据所期望的在2％到20％之间的酯化程度，所述用CDI活化的酸以相对于HA的比率在0.25到1之间当量存在。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，根据所期望的在2％到20％之间的酯化程度，使得HA与用CDI活化的所述酸的反应时间在1至24小时之间。
9.根据权利要求1所述的透明质酸酯，用于皮肤损伤的局部治疗。
10.根据权利要求9所述的透明质酸酯，其中，所述皮肤损伤为创伤、溃疡、皮炎、银屑病、或辐射引起的过热。
11.根据权利要求1所述的透明质酸酯，用于作为润肤霜、弹性剂、抗老化剂或抗痤疮剂的局部治疗。
12.根据权利要求1所述的透明质酸酯，作为粘度补充剂用于关节内治疗。
13.局部组合物，包含根据权利要求1所述的透明质酸酯，以及皮肤病学可接受的惰性赋形剂。
14.根据权利要求13所述的局部组合物，包含以所述组合物的重量计，0.1％至5％之间的透明质酸酯。
15.根据权利要求13的局部组合物，其为乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、水性或水醇洗剂、油/水或水/油乳剂的形式。
16.根据权利要求1所述的透明质酸酯，其中，所述羧基是用钠成盐的。
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