CN109400733B - 一种碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯及其制备方法和应用，属于高分子化学及药物化学领域。本发明的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯由碱溶性灵芝多糖和阿魏酸发生酯化反应而得，所述碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的取代度为0.15～0.25。本发明首次获得碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯，利用碱溶性灵芝多糖的羟基进行阿魏酸化学改性，大大提高了碱溶性灵芝多糖衍生物的水溶性和生物活性。

Description

一种碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯及其制备方法和应用，属于高分子化学及药物化学领域。

背景技术

灵芝多糖作为有着中华仙草之称的灵芝的主要活性成分，具有显著的生物活性，主要包括：如抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗突变、降血脂、降血糖，促进核酸、蛋白质的合成，消炎等功效，且毒性极低。常规的灵芝多糖提取方法为热水提取灵芝子实体或者菌丝体，浓缩过滤后用乙醇沉淀。水提法获得的为水溶性多糖，由于灵芝子实体木质素、纤维素、半纤维含量较高，灵芝多糖存在于灵芝子实体的细胞壁中，由于灵芝子实体结构紧密，致使灵芝多糖的提取时间过长和提取不完全，常规的热水提取法提取率较低(一般为1～2％左右)，获得的活性多糖一般为灵芝β-(1→3)-D-葡聚糖，生物活性较强，但由于得率较低，影响灵芝多糖的功效发挥。为了高效地获取灵芝多糖.科技工作者们先后采用超声波水提法、酶解法、微波水提法和超高压水提法等各种新型水提法，但水提灵芝多糖的提取率最高也只有3％左右。碱提法虽为化学手段，但可以大大提高灵芝多糖的得率(得率可高达5～8％)，由于碱提法获得的灵芝多糖一般为α-(1→3)-D-葡聚糖，不易溶于水，导致抗肿瘤活性不高，影响灵芝多糖的利用。

为了提高碱提灵芝多糖的生物活性，满足未来应用，只能通过改性法提高其水溶性。目前灵芝多糖改性的方法主要包括化学改性法和生物改性法。灵芝多糖的化学改性是指一定条件下通过羟基官能团进行的醚化、酯化或氧化反应。化学改性的方法主要有：羧甲基化、硫酸化、乙酰化、羟基化、季铵盐化、烷基化、接枝共聚等，生物法改性主要是酶降解多糖。灵芝多糖分子改性后能向其中引入亲水基团，提高其亲水性和水溶速度，从而增强其生物活性和生物利用度，使其应用更为安全、有效；灵芝多糖分子修饰后还可能改变其理化性能，拓宽其应用领域，改善其应用效果，能降低成本，合理利用资源。

目前灵芝多糖化学改性方法不多，一般常用的为羧甲基化和硫酸化。公开号为CN1133654C的专利公开了灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖羧甲基化衍生物及其用途和制备方法，公开号为CN1133653C的专利中公开了灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖硫酸酯衍生物及其用途和制备方法，通过将灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖进行羧甲基化和硫酸化，获得的衍生物基本上分别是灵芝多糖羧甲基化或者灵芝多糖硫酸酯化衍生物。该方法获得的灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖硫酸酯衍生物肿瘤抑制率为41％，且磺化时间较长，需要4～6小时；而羧甲基化获得的灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖羧甲基衍生物肿瘤抑制率为35.6％，且羧甲基化时间需要6～8小时，反应效率均不高。公开号为CN103408674A的专利公开了一种乙酰化灵芝多糖及其制备方法，将灵芝子实体用80～120℃水进行提取，然后将水提液通过透析袋进行透析，进行阴离子交换柱层析，浓缩干燥得到灵芝多糖；再将灵芝多糖用乙酸酐-吡啶法进行乙酰化修饰，其制备的灵芝乙酰化衍生物仅做了细胞实验，表明有刺激巨噬细胞产生NO的作用，并未进行动物体内的抑瘤实验，无法评估其肿瘤抑制率活性，且水提法获得的灵芝多糖为水溶性多糖，即使进行乙酰化修饰，并没有增加灵芝多糖的水溶性，对灵芝多糖活性改善作用有限。此外，暂无其他功能基团的引入报告，因此，大大限制了灵芝多糖功效的发挥。

碱提法可获得较高的灵芝多糖得率，但是碱提法获得的灵芝多糖水溶性不足，影响其抗肿瘤活性。

阿魏酸(Ferulic Acid，简称FA)，又名3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，化学式为C₁₀H₁₀O₄，是植物界普遍存在的一种酚酸，广泛分布于植物中，它在阿魏、当归、川芎、升麻、酸枣仁等中药材中的含量较高，是这些中药的有效成分之一，它与细胞壁中的多糖和蛋白质结合，成为细胞壁的骨架。现已发现，阿魏酸至少具有以下功能：抗动脉粥样硬化、抗血小板凝集、抗血栓，清除亚硝酸盐、氧自由基、过氧化亚硝基，抗菌消炎、抗肿瘤、抗突变、增强免疫功能、增强人体精子活力和运动性等。阿魏酸能为人体吸收，并易于从尿中排出，不会在体内累积，因此是一种安全性极高的药物。临床主要用于冠心病、脑血管病、脉管炎、白细胞和血小板减少等疾病的防治，阿魏酸最显著的作用是其抗肿瘤、抗癌功效。有报道说阿魏酸可以预防癌细胞的扩散和极度的发育不良，也有报道指出阿魏酸可作为一种预防结肠癌所造成的化学损伤的前体物质。但是，游离的阿魏酸不能进入人体的肝肠循环，无论是口服还是通过静脉注射，阿魏酸均难以进入结肠。膳食纤维中的阿魏酸虽能以结合物的状态到达结肠，并在结肠微生物的作用下释放出部分的阿魏酸，但其浓度不足以充当预防化学损伤的前体物质。曾有报道说抗酶解淀粉(能在结肠中几乎完全发酵的一种膳食纤维)是一种理想的载体，其与阿魏酸酯化后的产物，可以顺利地到达结肠，并在结肠微生物作用下，释放出大部分的阿魏酸作用于结肠，达到改善结肠微生物菌群的目的。

灵芝多糖分子中主要官能团是羟基，阿魏酸具有羧基基团，可以利用碱溶性灵芝多糖的羟基进行阿魏酸化学改性，以提高其水溶性和抗肿瘤活性。发明人希望能通过阿魏酸与活性多糖功能大分子物质结合起来，在大分子的保护下，避免其在人体肝肠循环中的代谢，使其能安全到达人体的结肠，并在结肠中释放出来，作用于结肠，达到预防和治疗结肠癌的目的。而灵芝多糖作为一种功能因子，本身已具有了抗肿瘤的作用，如果能与阿魏酸结合在一起，将有可能大大地提高其生理活性，这不失是一个很好的设想。且研究表明，阿魏酸在植物体内与多糖以醚键或酯键的形式结合存在的，可见使阿魏酸通过化学合成的方法与一些功能性大分子结合是有可能的。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯及其制备方法和应用，该碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯能提高灵芝多糖衍生物的水溶性和抗肿瘤活性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯，所述碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯由碱溶性灵芝多糖和阿魏酸发生酯化反应而得，所述碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的取代度为0.15～0.25。

所述阿魏酸的分子量为194.18，纯度为98％，所述阿魏酸的结构式如下式(I)：

作为本发明所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的优选实施方式，所述碱溶性灵芝多糖的主要成分为灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖，所述碱溶性灵芝多糖的平均相对分子量范围为2.0×10⁵～2.4×10⁵Da。

所述灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖可能的结构式如下式(II)：

第二方面，本发明提供了上述碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法，将碱溶性灵芝多糖溶于溶剂中，在催化剂的作用下与阿魏酸发生酯化反应而得。

参照相关的酯化反应机理，提出碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯化反应式如下：

作为本发明所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法的优选实施方式，如下(a)～(d)中的至少一项：

(a)所述酯化反应的反应容器为微波电场药物反应器，所述酯化反应先进行高压电场处理，然后进行微波加热反应；

(b)所述溶剂为二甲基亚砜，所述催化剂为4-二甲基氨基吡啶；

(c)所述碱溶性灵芝多糖与阿魏酸的质量比为(4～8)：5，所述阿魏酸与催化剂的质量比为50：(2～6)；

(d)所述酯化反应还加入甲苯作为带水剂，所述阿魏酸与甲苯的质量体积比为50g：(10～40)mL。

本方法结合前人的阿魏酸酯化方法，创新性的采用了改进后的微波电场酯化法，大大提高了反应效率，将常规的4～6小时，缩短为5～20分钟，并且反应温度也由90～95℃降低到50～80℃，防止产物糊化。

作为本发明所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法的优选实施方式，所述微波电场药物反应器的电场强度为40～60kV/cm，高压电场处理时间为5～20S，所述微波加热反应的功率为150～250W，微波加热反应的温度为50～80℃，微波加热反应的时间为5～20min。

作为本发明所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法的优选实施方式，所述微波电场药物反应器的电场强度为45～55kV/cm，高压电场处理时间为10～15S，所述微波加热反应的功率为180～220W，微波加热反应的温度为60～70℃，微波加热反应的时间为10～15min。

作为本发明所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法的优选实施方式，所述碱溶性灵芝多糖与阿魏酸的质量比为(5～7)：5，所述阿魏酸与催化剂的质量比为50：(3～5)。

作为本发明所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法的优选实施方式，所述阿魏酸与甲苯的质量体积比为50g：(20～30)mL。

第三方面，本发明提供了上述碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明首次获得碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯，利用碱溶性灵芝多糖的羟基进行阿魏酸化学改性，大大提高了碱溶性灵芝多糖衍生物的水溶性和生物活性。

附图说明

图1为碱溶性灵芝多糖的红外光谱图。

图2为碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的红外光谱图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明碱溶性灵芝多糖的制备方法为：将灵芝子实体粉碎，用75～85％的乙醇预处理，去除醇溶性组分，料水比为1:10～20，采用3000L的超声波循环提取罐，提取时间为2～3h，提取温度为40～60℃，超声功率为6～10KW，超声提取1次，得到灵芝水溶性多糖提取液；水提液过滤后的料渣烘干后再进一步进行碱溶性多糖的提取，碱提温度为50～70℃，碱提时间为60～80min，碱提NaOH浓度为4～7％，碱提液料比为10～20：1，灵芝碱提液过滤后，用稀HCL中和，然后透析袋透析48～72小时，真空冷冻干燥得到碱溶性灵芝多糖粗品。碱溶性灵芝多糖经聚酰胺、DEAE Sepharose Fast Flow层析、Sephacryl S-500HR层析后，得到碱溶性灵芝多糖组分，再通过HPLC及CE鉴定碱溶性灵芝多糖组分的均一性。结果表明，灵芝碱溶性多糖组分ACP主要成分为灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖，且其平均相对分子量范围为2.0×10⁵～2.4×10⁵Da。

实施例1

取50g阿魏酸溶解于0.25M二甲基亚砜溶液，再称取50g的碱溶性灵芝多糖加入溶液中，置于微波电场药物反应器中，加入5g的4-二甲基氨基吡啶催化剂及20mL甲苯带水剂，40kV/cm电场强度的高压电场处理20S后，再用250W的微波升温到设定的80℃，反应5min，停止加热，自然冷却到室温，用三倍量无水乙醇沉淀，醇沉，直至阿魏酸反应为阴性。抽滤至干，再分别用甲醇、乙醇洗涤产物，旋转蒸发干燥，即得碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯。

实施例2

取50g阿魏酸溶解于0.25M二甲基亚砜溶液，再称取40g的碱溶性灵芝多糖加入溶液中，置于微波电场药物反应器中，加入3g的4-二甲基氨基吡啶催化剂及10ml甲苯带水剂，45kV/cm电场强度的高压电场处理5S后，再用180W的微波升温到设定的70℃，反应10min，停止加热，自然冷却到室温，用三倍量无水乙醇沉淀，醇沉，直至阿魏酸反应为阴性。抽滤至干，再分别用甲醇、乙醇洗涤产物，旋转蒸发干燥，即得碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯。

实施例3

即取50g阿魏酸溶解于0.25M二甲基亚砜溶液，再称取70g的碱溶性灵芝多糖加入溶液中，置于微波电场药物反应器中，加入2g的4-二甲基氨基吡啶催化剂及30ml甲苯带水剂，60kV/cm电场强度的高压电场处理10S后，再用150W的微波升温到设定的60℃，反应15min，停止加热，自然冷却到室温，用三倍量无水乙醇沉淀，醇沉，直至阿魏酸反应为阴性。抽滤至干，再分别用甲醇、乙醇洗涤产物，旋转蒸发干燥，即得碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯。

实施例4

即取50g阿魏酸溶解于0.25M二甲基亚砜溶液，再称取80g的碱溶性灵芝多糖加入溶液中，置于微波电场药物反应器中，加入6g的4-二甲基氨基吡啶催化剂及40ml甲苯带水剂，55kV/cm电场强度的高压电场处理15S后，再用220W的微波升温到设定的50℃，反应20min，停止加热，自然冷却到室温，用三倍量无水乙醇沉淀，醇沉，直至阿魏酸反应为阴性。抽滤至干，再分别用甲醇、乙醇洗涤产物，旋转蒸发干燥，即得碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯。

实施例5

对制得的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯(FACP)进行红外光谱的验证。取适量的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯和KBr混合研磨压片，进行测定。碱溶性灵芝多糖的红外光谱图如图1所示，碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的红外光谱图如图2所示。由图1和图2可以看出，碱溶性灵芝多糖含有多羟基，所以在3400cm^-1附近有较强的-OH伸缩振动吸收峰，由于阿魏酸酯化后也有大量的-OH存在，故在碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的红外光谱中，3400cm^-1附近也存在较强的-OH伸缩振动吸收峰；碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯在1720cm^-1附近显示出一个明显的酯的特征吸收峰，而碱溶性灵芝多糖红外谱上并没有，说明阿魏酸是以酯键连接到葡聚糖链上；在碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的红外光谱中，1650～1450cm^-1处，可见部分尖锐的呼吸振动峰，这是芳环骨架的振动峰，这说明了复合物中苯环的存在，在1057cm^-1处，也有一个吸收峰，说明环内醚振动C-O-C的存在，而其他位置的特征峰没有明显改变。因此，本发明的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯合成成功。

效果例1碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响

对6种灵芝多糖提取物进行细胞试验，初步比较其对小鼠淋巴细胞增殖的影响。观察6种灵芝多糖提取物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响，以研究其对小鼠脾淋巴细胞免疫功能和抑瘤活性的作用。试验结果如表1所示。

表1改性多糖对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响(

n＝6)

注：a～h表示分别为与对照组、茯苓多糖组、6种灵芝多糖提取物相比较，Ρ＜0.05。WCP为水溶性灵芝多糖，ACP为碱溶性灵芝多糖，CACP为羧甲基碱溶性灵芝多糖，AACP为碱溶性灵芝多糖乙酰水杨酸酯，SACP为碱溶性灵芝多糖硫酸酯，FACP为碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯。

由表1可以看出，与对照组相同剂量比较，茯苓多糖中剂量、茯苓多糖高剂量对ConA诱导的淋巴细胞增殖能力显著升高(P＜0.05)，说明茯苓多糖阳性对照物对小鼠细胞免疫功能具有提高作用，实验造模成功。

与对照组相同剂量比较，CACP(羧甲基碱溶性灵芝多糖)中剂量组、AACP(碱溶性灵芝多糖乙酰水杨酸酯)中剂量组、SACP中剂量组(碱溶性灵芝多糖硫酸酯)、AACP高剂量组和FACP(碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯)中、高剂量组ConA诱导的淋巴细胞增殖能力显著升高(P＜0.05)，说明该灵芝多糖提取物对小鼠细胞免疫功能具有提高作用。

同时可以发现，经过羧甲基改性后的产物CACP、SACP、AACP、FACP生物活性优于改性前的碱溶性多糖ACP，而阿魏酸酯化的碱溶性多糖FACP的生物活性优于CACP、AACP，与SACP接近，说明碱溶性多糖阿魏酸酯对灵芝多糖的免疫活性优于羧甲基化和乙酰水杨酸酯化，与硫酸酯化法接近，但均比改性前有提高作用。

效果例2碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯对小鼠环磷酰胺的协同抑瘤作用

对不同剂量的WCP、ACP、FACP进行对小鼠环磷酰胺的协同抑瘤作用的试验，以研究其对小鼠环磷酰胺的协同抑瘤作用。试验结果如表2所示。

表2改性多糖对小鼠环磷酰胺的协同抑瘤作用

注：表中同一列内不同的字母表示具有显著性差异(p<0.05)。

可以发现，经过阿魏酸改性后的产物FACP(碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯)生物活性优于改性前的碱溶性多糖ACP，说明阿魏酸酯化对碱溶性灵芝多糖的抗肿瘤活性有提高作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯，其特征在于，所述碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯由碱溶性灵芝多糖和阿魏酸发生酯化反应而得，所述碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的取代度为0.15~0.25，所述碱溶性灵芝多糖的主要成分为灵芝α-(1→3)-D-葡聚糖，所述碱溶性灵芝多糖的平均相对分子量范围为2.0×10⁵ ~2.4×10⁵Da；

所述碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法为，将碱溶性灵芝多糖溶于溶剂中，在催化剂的作用下与阿魏酸发生酯化反应而得；

其中，所述酯化反应的反应容器为微波电场药物反应器，所述酯化反应先进行高压电场处理，然后进行微波加热反应；所述溶剂为二甲基亚砜，所述催化剂为4-二甲基氨基吡啶；所述碱溶性灵芝多糖与阿魏酸的质量比为(4~8)：5，所述阿魏酸与催化剂的质量比为50：（2~6）；所述酯化反应还加入甲苯作为带水剂，所述阿魏酸与甲苯的质量体积比为50 g：（10~40）mL；

其中，所述微波电场药物反应器的电场强度为40~60kV/cm，高压电场处理时间为5~20S，所述微波加热反应的功率为150~250W，微波加热反应的温度为50~80℃，微波加热反应的时间为5~20min。

2.如权利要求1所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法，其特征在于，将碱溶性灵芝多糖溶于溶剂中，在催化剂的作用下与阿魏酸发生酯化反应而得；

所述酯化反应的反应容器为微波电场药物反应器，所述酯化反应先进行高压电场处理，然后进行微波加热反应；所述溶剂为二甲基亚砜，所述催化剂为4-二甲基氨基吡啶；所述碱溶性灵芝多糖与阿魏酸的质量比为(4~8)：5，所述阿魏酸与催化剂的质量比为50：（2~6）；所述酯化反应还加入甲苯作为带水剂，所述阿魏酸与甲苯的质量体积比为50 g：（10~40）mL；

所述微波电场药物反应器的电场强度为45~55kV/cm，高压电场处理时间为10~15S，所述微波加热反应的功率为180~220W，微波加热反应的温度为60~70℃，微波加热反应的时间为10~15min。

3.如权利要求2所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法，其特征在于，所述碱溶性灵芝多糖与阿魏酸的质量比为（5~7）：5，所述阿魏酸与催化剂的质量比为50：（3~5）。

4.如权利要求2所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯的制备方法，其特征在于，所述阿魏酸与甲苯的质量体积比为50 g：（20~30）mL。

5.如权利要求1所述的碱溶性灵芝多糖阿魏酸酯在制备抗肿瘤药物中的应用。

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