CN113559089A - 阿魏酸在治疗放射性皮肤损伤中的应用 - Google Patents

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CN113559089A CN202110939565.6A CN202110939565A CN113559089A CN 113559089 A CN113559089 A CN 113559089A CN 202110939565 A CN202110939565 A CN 202110939565A CN 113559089 A CN113559089 A CN 113559089A
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Abstract

本发明涉及阿魏酸在治疗放射性皮肤损伤中的新应用，将阿魏酸制成凝胶形式，该产品具对60Coγ射线所致辐射损伤的细胞、动物模型均具有良好的保护作用，对正常的皮肤无刺激作用以及显著增强辐射损伤后HaCaT细胞的抗氧化能力。阿魏酸凝胶理化性质稳定，在使用阿魏酸凝胶之后，皮肤创口出现时间延迟，红肿及破损面积减少，创口处皮肤血流相较未用药组降低。阿魏酸凝胶能够抑制NLRP3炎症小体的激活，减少炎症因子IL‑18、IL‑1β产生，从而促使炎症减轻，减轻损伤水肿发生，从而对放射性皮肤损伤有较好的损伤修复作用，实现抗辐射的技术效果作用。

Description

阿魏酸在治疗放射性皮肤损伤中的应用
技术领域
本发明涉及药品应用领域，具体涉及阿魏酸在治疗放射性皮肤损伤中的应用。
背景技术
放射性皮肤损伤是指全身或局部受到一定剂量的某种射线照射后所产生的皮肤损伤， 常见于放疗、核泄漏、核安全事故中，具有潜伏性、迁延性、反复性、难愈性等特点。放射治疗作为临床中肿瘤治疗的常规治疗方法，但约有90％的患者会出现放射性皮肤损伤的不良反应，但常见的副作用皮肤损伤限制了其更广泛的应用，也给患者的生活质量和治疗带来了不良影响，因此研制防治放射性皮肤损伤药物具有重要意义。
放射性皮肤损伤根据其损伤时间的长短分为急性放射性皮炎和慢性放射性皮炎，损伤 短期会出现红斑、灼痛、麻木、肿胀等症状，首次红斑消退或症状减轻则会再次出现红斑、 肿胀、疼痛、水疱、糜烂、溃疡，长期处于放射环境中，出现脱毛和皮肤干燥、干性脱屑、湿性脱屑、萎缩变薄、粗糙和弹性差，或出现经久不愈的溃疡；手指出现指甲变形、增厚、 易劈裂等症状。放射性皮肤损伤的发病机制包括直接辐射损伤和炎症反应，造成表皮、真 皮和血管系统发生改变。电离辐射引起急性皮肤反应，通过黑素小体的迁移引起皮肤色素 沉着的变化，中断毛发生长，损害更深的真皮，而保留上表皮。真皮的损伤扰乱了皮肤细 胞再生的正常过程，最初由于真皮血管扩张和组胺样物质释放而导致红斑。高剂量的辐射 损伤时，皮肤会通过增加基底角质形成细胞层的有丝分裂来进行补偿。新细胞的更替速度 快于旧细胞的脱落，这会导致皮肤变厚、鳞片状，从而形成干燥脱皮。当基底层无法恢复， 渗出物被释放，则会形成湿性脱皮。这些不同程度的损伤损害了皮肤产生的物理屏障及其 免疫功能的完整性，从而增加了感染的风险。血管损伤导致的纤维化和组织缺氧导致ROS 的产生。活性氧会对细胞结构造成重大损害，并促进皮肤中炎性细胞因子的产生，促使人 体的保护性抗氧化系统不堪重负。因此针对放射性皮肤损伤的特点进行抗辐射、抗氧化、 抗炎治疗，是治疗放射性皮肤损伤的理论基础。
阿魏酸，化学名称为3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，化学式为C10H10O4，是肉桂酸的衍生 物之一，是一种普遍存在于植物中的酚酸类物质，是中药当归、川芎的有效成份，现代药理研究其具有抗炎、抗氧化、抗血栓、镇痛、抗辐射等多种作用。我们前期研究发现阿魏 酸在治疗放射性肠炎、放射性脑损伤，增加机体造血方面具有重要作用，但在治疗放射性 皮肤损伤上目前还没有报道。
阿魏酸的用途非常广，如中国专利CN108714146A所公开了一种阿魏酸药物组合物及 其新用途：阿魏酸可通过提高Thbd蛋白表达量，促进蛋白C转化为aPC，进而对5.5Gy 60Coγ射线单次全身照射小鼠的骨髓细胞发挥防护作用，有效促进小鼠造血功能恢复。同 时，Thbd-aPC信号通路的激活，还可有效减少外周血中炎症因子的含量，从而抑制炎症反 应。阿魏酸能够提高受照小鼠小肠内绒毛长度，促使其形态逐渐向正常状态恢复，并有效 防治小肠绒毛内毛细血管损伤，从而促进肠隐窝干细胞增殖、分化，促进粘膜上皮细胞再 生；通过对阿魏酸防治放射性肠炎的作用机制进行探究，结果表明调节炎症因子HMGB1 为重要影响因素；同时，阿魏酸可以通过影响Thbd-aPC信号通路，改善受照小鼠造血系 统的细胞状态和功能，进而从多系统发挥抗辐射作用。
如中国专利CN1919202所公开了一种药物组合物，它包含红花黄色素和阿魏酸或其药 学上可接受的盐，两者之间的重量配比为1∶0.125～40，该组合物可以单独或与药学上可 接受的辅料混合制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型。两者协同作用，共同发挥抗 血小板聚集、抗血栓等药理作用，可用于预防和治疗动脉粥样硬化，外周循环障碍等心脑 血管系统疾病。
文献报道用于治疗放射性皮肤损伤的药物种类繁多，效果不显著且无统一的标准。同 时外用给药途径其有效成分是否被吸收利用的相关研究不充分，相关机制不明确。传统医 学对放射性皮炎有着很好的防治效果，但其对治疗放射性皮炎的作用机理不明确，药物的 使用多靠临床经验。目前的研究多以临床观察为主，缺乏深入的分子细胞学研究，且临床 研究多为中、小样本，缺乏大样本、多中心的研究。虽然阿魏酸作用很广泛，但是到目前 为止，并没有任何关于阿魏酸的发明或用阿魏酸制作的凝胶可以用来治疗放射性皮肤损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供阿魏酸的新用途，即阿魏酸在治疗放射性皮肤损伤中的应用；
优选地，阿魏酸制作成凝胶形式；
优选地，阿魏酸凝胶的使用方式为直接涂抹在皮肤损伤部位；
优选地，阿魏酸对60Coγ射线所致辐射损伤的细胞具有良好的保护作用；
优选地，阿魏酸能降低放射性损伤的皮肤的炎症反应；
优选地，阿魏酸凝胶的制备方法为：将0.75g卡波姆分散于75ml、80ml、85ml蒸馏水中进行充分溶胀24h，将不同浓度充分溶胀后的卡波姆分别加入5g甘油和0.001g的对 羟基苯甲酸乙酯，用搅拌棒混匀后分别加入5g、10g、15g阿魏酸混匀，最终定量凝胶加 入适量三乙醇胺进行PH值及粘稠度调节，定量到100g，得到三种不同浓度的阿魏酸凝胶。
为了更好地理解本发明，阿魏酸凝胶的理化性质检测结果，证明其具有良好的稳定性。
(1)配制完成的阿魏酸凝胶呈淡粉色，凝胶胶体整体均匀、细腻，在常温时保持胶状，无干涸及液化现象出现。
(2)阿魏酸凝胶具有很好的延展性，无气泡产生。
(3)利用Sartorius pH计检测阿魏酸凝胶PH值，测得阿魏凝胶的PH值为5.5左右，在正常人体皮肤表面PH值(5.0～7.0)范围中。阿魏酸凝胶的PH值在中性范围，适宜用 在皮肤上。
(4)供试品适量，置于载玻片上，涂成薄层，薄层面积相当于盖玻片面积，共涂3片，未测出大于180μm的粒子。
(5)将阿魏凝胶放入50ml无菌离心管中，密封放置于-20℃冰箱内24h，55℃恒温箱中6h，观察凝胶胶体，凝胶整体均匀、细腻，在常温时保持胶状，无干涸及液化现象出现。
综上所述，阿魏酸凝胶具有良好的稳定性。
本发明的优点和效果如下：
1、阿魏酸对60Coγ射线所致辐射损伤的细胞、动物模型均具有良好的保护作用。
2、阿魏酸凝胶对正常的皮肤无刺激作用。
3、阿魏酸凝胶理化性质稳定。
4、阿魏酸凝胶对放射性皮肤损伤具有良好的保护作用，在使用阿魏酸凝胶之后，皮 肤创口出现时间延迟，红肿、破损面积减少，阿魏酸凝胶给药组与照射组相比皮肤血流降 低能通过改变辐射损伤的皮肤血流变化，从而修复放射性皮肤损伤。
5、阿魏酸凝胶具有良好的抗炎作用，能够降低辐射后Wistar大鼠的皮肤炎症反应。
6、使用阿魏酸凝胶治疗后，大鼠照射损伤的皮肤水肿明显减轻，创面肉芽组织增生 明显，炎性细胞浸润减少。阿魏酸凝胶对放射性皮肤损伤有较好的损伤修复作用。
7、在使用阿魏酸凝胶后，皮肤损伤显著降低。因此阿魏酸凝胶能够通过抑制NLRP3炎症小体激活，降低炎性因子IL-18、IL-1β、TNF-α表达，减轻照射后炎症，防治放射性 皮肤损伤。
8、阿魏酸制成凝胶后，方便用药，涂抹简易，能显著降低放射性皮肤损伤的发生率， 及进展并且其副作用小，产品成熟。
上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了能够更清楚了解本申请的技术手段，从而 可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本申请的上述和其他目的、特征和优点能够更 明显易懂，以下以本申请的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
根据下文结合附图对本申请具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本 申请的上述及其他目的、优点和特征。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技 术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一 些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这 些附图获得其他的附图。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。 附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为不同浓度的阿魏酸溶液对HaCaT细胞活力的影响；图1A为不同浓度的阿魏酸溶液对正常HaCaT细胞活力的影响，图1B不同浓度阿魏酸对照射后致辐射损伤的HaCaT 细胞活力的影响。
Figure RE-GDA0003262800590000041
###P＜0.001与正常组对比，*P＜0.05，**P＜0.01vs，***P ＜0.001与照射组比较；
图2为不同浓度阿魏酸对60Coγ射线照射后HaCaT细胞内ROS的变化，
Figure RE-GDA0003262800590000042
###P＜0.001与正常组对比，*P＜0.05，**P＜0.01vs，***P＜0.001与照射组比较；
图3为不同浓度阿魏酸对60Coγ射线照射后HaCaT细胞内SOD的变化，
Figure RE-GDA0003262800590000043
###P＜0.001与正常组对比，*P＜0.05，**P＜0.01vs，***P＜0.001与照射组比较；
图4为阿魏酸对60Coγ射线照射后HaCaT细胞上清炎症因子表达的影响；
图5为不同浓度阿魏酸对HaCaT细胞NLRP3炎性小体相关蛋白表达的影响，
Figure RE-GDA0003262800590000044
Figure RE-GDA0003262800590000045
*P＜0.05，**P＜0.001，***P＜0.001与正常组对比，&P＜0.05，&&P＜0.01vs，&&&P ＜0.001与照射组比较；
图6阿魏酸凝胶对Wistar大鼠皮肤的刺激反应；
图7照射后不同时间Wistar大鼠体重变化；
图8照射后不同时间Wistar大鼠皮肤变化；
图9照射后不同时间Wistar大鼠皮肤Douglas and Fowler放射性皮炎评分变化；
图10为60Coγ射线照射后Wistar大鼠皮肤血流变化；
图11不同时间阿魏酸凝胶对60Coγ射线照射后Wistar大鼠皮肤的OCTB-scan影像学 变化；
图12为照射后21天、28天Wistar大鼠血清中NLRP3炎性因子变化；
A图照射后21天炎性因子变化；B图照射后28天炎性因子变化。
Figure RE-GDA0003262800590000046
#P<0.05， ##P<0.01，###P<0.001与照射组相比；
图13为照射后不同时间大鼠皮肤的病理变化；
图14为照射后不同时间大鼠皮肤中NLRP3免疫荧光变化；
具体实施例
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的 附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本 申请一部分实施例，而不是全部的实施例。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件 的特定细节仅仅是为了帮助全面理解本申请的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚， 可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本申请的范围和精神。另外，为了 清楚和简洁，实施例中省略了对已知功能和构造的描述。
应该理解，说明书通篇中提到的“一个实施例”或“本实施例”意味着与实施例有关的特定特征、结构或特性包括在本申请的至少一个实施例中。因此，在整个说明书各处出现的“一个实施例”或“本实施例”未必一定指相同的实施例。此外，这些特定的特征、 结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。
此外，本申请可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚 的目的，其本身并不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。
本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系， 例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文 中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以 表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后 关联对象是一种“或”关系。
本文中术语“至少一种”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种 关系，例如，A和B的至少一种，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B 这三种情况。
还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体 或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在 任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在 涵盖非排他性的包含。
实施例1
本实例介绍一种阿魏酸凝胶的制备方法，具体的包括以下内容：
阿魏酸凝胶的制备方法为：将0.75g卡波姆分散于75ml、80ml、85ml蒸馏水中进行充分溶胀24h；将不同浓度充分溶胀后的卡波姆分别加入5g甘油和0.001g的对羟基苯甲 酸乙酯，用搅拌棒混匀后分别加入5g、10g、15g阿魏酸混匀；最终定量，在凝胶中加入 适量三乙醇胺进行PH值及粘稠度调节，定量到100g，得到三种不同浓度的阿魏酸凝胶。
实施例2
本实施例对不同浓度的阿魏酸溶液对HaCaT细胞活力的影响进行说明。
在本实施例中，使用不同浓度的阿魏酸(300、200、100、50、25μg/ml)对HaCaT细 胞进行处理，给药24h后，检测HaCaT细胞的细胞活力变化。在对状态良好的HaCaT细 胞阿魏酸给药24h后，与未给药对照组相比，各浓度阿魏酸对正常的HaCaT细胞活力无明 显变化如图1A所示：图1A为不同浓度的阿魏酸溶液对正常HaCaT细胞活力的影响；以 60Coγ射线照射HaCaT细胞，形成放射性皮肤损伤的细胞模型，以维生素C作为阳性对照 药，使用不同浓度的阿魏酸(200、100、50、25μg/ml)对照射的HaCaT细胞进行处理， 检测不同浓度的阿魏酸对损伤的细胞活力的影响。
与对照组相比，18Gy的吸收剂量下，HaCaT细胞的细胞活力显著降低；
与照射组相比，维生素C能显著提高照射后HaCaT细胞的细胞活力；
与照射组相比，经过50μg/ml的阿魏酸溶液处理后，细胞生存率显著提高；
与照射组相比，100μg/ml的阿魏酸溶液处理后的照射后细胞，活力显著提高。
200μg/ml的阿魏酸对照射后HaCaT细胞活力影响不大，如图1B所示，图1B为不同浓度阿魏酸对照射后致辐射损伤的HaCaT细胞活力的影响。(
Figure BDA0003214247990000061
n＝6)，###P＜0.001与正常组对比，*P＜0.05，**P＜0.01vs，***P＜0.001与照射组比较。
综上所述，阿魏酸对60Coγ射线所致辐射损伤有保护作用。
实施例3
本实例对不同浓度阿魏酸对60Coγ射线照射后HaCaT细胞内ROS的变化进行说明。
当60Coγ射线照射皮肤后，会诱导ROS产生，当皮肤氧化还原平衡被打破时就会造成皮肤发生氧化损伤。给予18Gy吸收剂量的60Coγ射线刺激HaCaT细胞，在照射前给予 VC和阿魏酸进行干预。使用不同浓度的阿魏酸(200、100、50、25μg/ml)对照射的HaCaT 细胞进行处理，照射后24h，检测不同浓度的阿魏酸对HaCaT细胞ROS水平的影响。
如图2所示，图2为不同浓度阿魏酸对60Coγ射线照射后HaCaT细胞内ROS的变化(
Figure BDA0003214247990000071
Figure BDA0003214247990000073
n＝3)，###P＜0.001与正常组对比，*P＜0.05，**P＜0.01vs，***P＜0.001与照射组比较。
与对照组相比，照后24h，18Gy的吸收剂量下HaCaT细胞ROS水平显著升高；
与照射组相比，维生素C能降低HaCaT细胞ROS的生成；
与照射组相比，经过25μg/ml的阿魏酸溶液处理后，能抑制ROS的生成；
50μg/ml的阿魏酸溶液对照射后HaCaT细胞ROS的生成具有抑制作用，100μg/ml的阿魏酸溶液对照射后HaCaT细胞ROS的生成具有显著抑制作用；200μg/ml的阿魏酸溶液 对照射后HaCaT细胞ROS的生成无明显影响。
综上所述，阿魏酸对照射后HaCaT细胞ROS的生成有抑制作用。
实施例4
本实施例对不同浓度阿魏酸对60Coγ射线照射后HaCaT细胞内SOD的变化进行说明， 在皮肤受到60Coγ射线照射后超氧化物歧化酶会被活化，进而对抗细胞氧化毒性，维持皮 肤的氧化还原平衡。超氧化物歧化酶抑制率能反应其活性降低，研究发现在18Gy 60Coγ射线照射后HaCaT细胞内超氧化物歧化酶抑制率显著升高，活性降低，细胞出现氧化损伤。如图3所示，图3为不同浓度阿魏酸对60Coγ射线照射后HaCaT细胞内SOD的变化(
Figure BDA0003214247990000072
n＝3)，###P＜0.001与正常组对比，*P＜0.05，**P＜0.01vs，***P＜0.001与照射组比较。
与照射组对比，维生素C能降低照射后HaCaT细胞内超氧化物歧化酶抑制率，增加其抗氧化能力；不同浓度的阿魏酸(200、100、50、25μg/ml)均能降低照射后超氧化物歧 化酶抑制率，提高其活性，增加其抗氧化能力。综上所述，阿魏酸能够显著增强辐射损伤 后HaCaT细胞的抗氧化能力。
实施例5
本实施例对不同浓度阿魏酸对HaCaT细胞NLRP3炎性小体相关蛋白表达的影响进行 说明。参照图5所示试验变化。
当18Gy吸收剂量的60Coγ射线照射HaCaT细胞，在照射前给予不同浓度的阿魏酸溶液，照射后24h，收集并检测HaCaT细胞上清液中NLRP3炎症小体、caspase-1、IL-18、 IL-1β含量变化如图4，阿魏酸对60Coγ射线照射后HaCaT细胞上清炎症因子表达的影响。 照射后24h，与对照组相比，NLRP3炎症小体分泌增加，caspase-1也随之升高，从而使IL-18、 IL-1β分泌增加，细胞出现炎症损伤；与照射组相比，维生素C能够抑制NLRP3炎症小体 分泌，降低炎性因子IL-18、IL-1β表达，减轻辐射损伤；与照射组相比，使用阿魏酸处理 后，50μg/ml、100μg/ml的阿魏酸溶液能显著抑制NLRP3炎症小体在细胞上清中表达， caspase-1分泌降低，IL-18、IL-1β表达降低，降低炎性反应。
综上所述，阿魏酸能够通过抑制NLRP3炎症小体分泌激活，显著降低辐射所致的炎症损伤。
实施例6
本实施例在上述实施例的基础上对上述不同浓度阿魏酸对HaCaT细胞NLRP3炎性小 体相关蛋白表达的影响急需进行说明。
60Coγ射线刺激HaCaT细胞会激活NLRP3炎症小体并促进其组装，进一步激活可自身催化的caspase-1，并将pro-IL-1β和pro-IL-18加工为IL-1β和IL-18，使NLRP3炎症小体及其下游因子表达增加，从而介导炎症反应。炎症的发生发展在辐射损伤中具有重要作用，在检测了60Coγ射线照射后24h，HaCaT细胞中NLRP3炎症小体相关蛋白表达变化。如 图5，图5为不同浓度阿魏酸对HaCaT细胞NLRP3炎性小体相关蛋白表达的影响。(
Figure BDA0003214247990000081
n＝3)，*P＜0.05，**P＜0.001，***P＜0.001与正常组对比，&P＜0.05，&&P＜0.01vs，&&&P ＜0.001与照射组比较。
照射后24h，与对照组相比，NLRP3炎症小体被激活，表达增加，进而催化caspase-1从而使IL-18、IL-1β表达增加，细胞出现损伤；
与照射组相比，维生素C能够抑制NLRP3炎症小体被激活，降低炎性因子IL-18、IL-1β 表达，减轻辐射损伤；
与照射组相比，使用阿魏酸处理后，50μg/ml、100μg/ml的阿魏酸溶液能显著抑制NLRP3炎症小体表达，caspase-1催化降低，IL-18、IL-1β表达降低，降低炎性反应。
综上所述，通过对照射后的HaCaT细胞上清和蛋白检测，阿魏酸给药干预后炎性因子 显著降低。
实施例7
该实施例通过阿魏酸凝胶对Wistar大鼠皮肤的刺激反应进行说明阿魏酸凝胶的影响。
当放射性皮肤损伤在皮肤，内服给药途径很难到达病灶形成良好的疗效。因此，选择 合适的剂型在治疗放射性皮肤损伤中具有重要作用。凝胶剂具有无油腻性、释药快、润滑 舒适、易于涂展、对皮肤和黏膜无刺激性等优点适宜进行皮肤类疾病用药，与中药组合进 行皮肤用药具有独特优势。
阿魏酸分子量为194.14，熔点为174℃，饱和水溶液pH约为5.8，但阿魏酸口服吸收半衰期短，吸收快，代谢快，须多次给药才能达到有效给药浓度，且不容易到达皮肤。
在本实施例中，采用Valia-Chien扩散池和HPLC法，在离体裸鼠皮肤上验证了阿魏酸 本身有很好的透皮吸收功能；等通过文献综述研究发现，作为分子型的阿魏酸易透过皮肤， 若将其制备成透皮剂型，不但能延长用药时间，减少给药次数，更能提高病人的服药顺应 性。因此使用阿魏酸凝胶剂治疗放射性皮肤损伤具有可行性。
如图6所示，图6阿魏酸凝胶对Wistar大鼠皮肤的刺激反应，在正常Wistar大鼠臀背 部褪毛处理后，进行阿魏酸凝胶刺激实验。在涂抹空白机制及不同浓度的阿魏酸凝胶的第 1、6、12、24小时，涂药部位与正常组相比，未出现明显变化，未出现红斑和焦痂，未有 水肿形成。依据皮肤反应记分系统进行记分，所有涂药组得分均为0，且无其它异常情况 的出现。
综上所述，阿魏酸凝胶对正常的大鼠皮肤无刺激作用，适宜进行皮肤给药。
实施例8
在上述实施例基础上，本实施例中，照射后的Wistar大鼠与正常组相比，在照后的前 7天，Wistar大鼠开始食欲变差，毛色变暗、毛糙，体重呈缓慢降低的趋势，因此60Coγ 射线照射后初期会对大鼠体重造成影响较大，如图7所示，图7照射后不同时间Wistar大 鼠体重变化。
在照射后第七天Wistar大鼠体重停止下降，出现缓慢增加的趋势。在照射后第十天， 依据分组对照射后Wistar大鼠进行阿魏酸凝胶给药。照射后的Wistar大鼠，第14天体重 变化开始平稳，在阿魏酸凝胶干预后损伤出现时间延后，程度降低，体重恢复更快。在照射后第1、7、14、21、28天我们对照射后的大鼠进行了拍照。
如图8所示，图8照射后不同时间Wistar大鼠皮肤变化。研究发现，照射后7天大鼠皮肤有少许红斑出现，照后14天均不同程度的脱皮、红肿，照后21天损伤进一步加重， 出现溃疡、出血、坏死，28天后损伤不再呈现进行性发展。
我们依据Douglas and Fowler放射性皮炎评分标准在照射后1、3、5、7、14、21、28天对Wistar大鼠皮肤进行评分。随着照射时间的延长，照射后Wistar大鼠皮肤Douglas andFowler放射性皮炎评分逐渐升高，在第21天，评分达到最高分，提示第21天皮肤损伤损 伤程度达到最严重。在照射后第10天，给予不同浓度的阿魏酸凝胶，以及阳性对照药芦 荟凝胶后发现，与照射组相比，在照射后第14天评分低于照射组。在照射后第21天，给 药组Douglas and Fowler放射性皮炎评分显著低于照射组，如图9所示，图9照射后不同 时间Wistar大鼠皮肤Douglas and Fowler放射性皮炎评分变化。
综上所述，阿魏酸凝胶能够降低放射性皮肤损伤的发生和损伤程度。
实施例9
本实施例对60Coγ射线照射后Wistar大鼠皮肤血流变化进行说明。
60Coγ射线对皮肤具有损伤作用，影响皮肤血流的分布，通过检测正常组、照射组、阳性对照组、5％浓度的阿魏酸凝胶、10％浓度的阿魏酸凝胶、15％浓度的阿魏酸凝胶组，在照射后14天、21天、28天的皮肤血流变化，从而研究阿魏酸凝胶对放射性皮肤损伤的 治疗作用。
如图10所示，图10为60Coγ射线照射后Wistar大鼠皮肤血流变化。我们发现正常组在第14天、21天、28天皮肤血流变化无明显差异；40Gy照射组随着皮肤损伤创口的出现， 皮肤血流增加，且在21天皮肤血流变化最为明显，这可能与皮肤出现肿胀、炎症反应有 关；与照射组相比阳性对照药组，能减缓皮肤血流增加的时间和程度；阿魏酸凝胶低、中、 高浓度剂量组，在用药之后，皮肤创口出现时间延迟，红肿、破损面积减少，皮肤血流与 照射组相比降低。
综上所述，阿魏酸凝胶能通过改变辐射损伤的皮肤血流变化，从而修复放射性皮肤损 伤。
实施例10
本实施例利用OCT影像能够实现皮肤组织深度约1.5mm的结构信息提取，反应照射过后的Wistar大鼠皮肤的结构变化。
如图11所示，图11不同时间阿魏酸凝胶对60Coγ射线照射后Wistar大鼠皮肤的OCTB-scan影像学变化。不同时间阿魏酸凝胶对60Coγ射线照射后Wistar大鼠皮肤的 OCTB-scan影像学变化。正常Wistar大鼠皮肤结构完整，组织结构清晰。
40Gy照射组随着皮肤损伤创口的出现，OCT影像显示大鼠皮肤损伤面积逐渐增大、损伤深度也逐渐增加，皮肤损伤部位的组织结构变得越来越混乱。与照射组相比阳性对照药组，通过OCT影像我们发现芦荟凝胶能减缓照射后大鼠的皮肤结构出现混乱损伤的时间，及损伤程度；阿魏酸凝胶组低、中、高浓度剂量组，在用药之后，对大鼠的皮肤结构 具有良好的保护作用，使照射后的Wistar大鼠皮肤的结构变化程度低，损伤恢复时间快。
综上所述，阿魏酸凝胶能够降低60Coγ射线对Wistar大鼠皮肤结构的破坏，从而实现 良好的保护作用。
实施例11
辐射能够激活NLRP3炎性小体，引起炎症反应，加重辐射形成的皮肤损伤。在照射后21天和28天，麻醉后取动脉血，离心后取血清进行检测。检测了NLRP3炎性小体及 其下游因子caspase-1、IL-18、IL-1β的表达情况。
如图12所示，图12为照射后21天、28天Wistar大鼠血清中NLRP3炎性因子变化； A图照射后21天炎性因子变化；B图照射后28天炎性因子变化。(
Figure BDA0003214247990000111
n＝3)，#P<0.05， ##P<0.01，###P<0.001与照射组相比。照射后21天、28天Wistar大鼠血清中NLRP3炎性因 子变化A.照射后21天炎性因子变化B.照射后28天炎性因子变化#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与照射组相比*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001，(
Figure BDA0003214247990000112
n＝3)。与对照组相比， 40Gy照射后Wistar大鼠血清中NLRP3表达显著增加，NLRP3下游因子caspase-1、IL-18、 IL-1β的表达均增加；使用芦荟凝胶后，Wistar大鼠血清中NLRP3表达降低，NLRP3下游 因子caspase-1、IL-18、IL-1β的表达均降低；使用高中低浓度的芦荟凝胶凝胶后，Wistar 大鼠血清中NLRP3表达显著下降，NLRP3下游因子caspase-1、IL-18、IL-1β的表达均降 低。
综上所述，阿魏酸凝胶具有良好的的抗炎作用，能够降低辐射后Wistar大鼠血清中炎 性因子产生。
实施例12
正常组、照射组、阳性对照组、5％浓度的阿魏酸凝胶、10％浓度的阿魏酸凝胶、15％ 浓度的阿魏酸凝胶组，在照射后14天、21天、28天麻醉后进行照射部位皮肤取材。经过脱水、包埋、制片、和HE染色后，在光镜下观察拍摄，结果如图13所示，图为13照射 后不同时间大鼠皮肤的病理变化。
在照射后的14天、21天、28天正常的皮肤组织皮肤层结构正常，真皮层的毛囊、皮脂腺、汗腺，形态结构正常，皮下组织血管无充血、淤血及炎性细胞浸润；40Gy吸收剂量 照射14天后，大鼠照射局部表皮层增厚，鳞状上皮细胞数量增多，血管结构完整，真皮 层胶原纤维基本正常、排列规则，可见汗腺、毛囊、皮脂腺等附属器官，有轻度肿胀，有 轻度的炎症反应。照后21天，40Gy大鼠皮肤在光镜下可见部分表皮坏死，真皮组织中有 大量炎症细胞浸润，真皮层胶原纤维被破坏、真皮组织中有大量炎症细胞，皮肤损伤严重。 照射后28天，大鼠表皮层明显增厚，角质化加重，汗腺、毛囊、皮脂腺等附属器官结构 被破坏，皮肤附属器数量减少，使皮肤失去了正常功能。
照射后14天、21天、28天，与照射组相比，使用芦荟凝胶治疗后，照射后14天，在使用阿魏酸凝胶治疗放射性皮肤损伤后，表皮出现红斑，无明显肿胀出现。表皮真皮层的毛囊、皮脂腺、汗腺，形态结构正常，损伤较照射组程度降低。使用不同浓度阿魏酸凝胶后， 照射后14天，皮肤损伤出现时间延后。照射后21天，与正常组相比，大鼠在光镜下可见照 射部位表皮增厚，真皮层浅层水肿，汗腺、毛囊、皮脂腺数量有所降低。阿魏酸凝胶能显 著降低放射性皮肤损伤程度，减轻炎症反应。照射后28天，使用阿魏酸凝胶治疗后，大鼠 照射损伤的皮肤水肿明显减轻，创面肉芽组织增生明显，炎性细胞浸润减少。
综上所述，阿魏酸凝胶对放射性皮肤损伤有较好的损伤修复作用。
实施例13
请参考图14，图为14照射后不同时间大鼠皮肤中NLRP3免疫荧光变化。
利用免疫荧光标记法检测NLRP3在大鼠皮肤中的表达。在正常的大鼠皮肤组织中，在表皮、真皮层及毛囊、皮脂腺、汗腺等附属器中NLRP3表达较少；与对照组相比，照 射后第14天NLRP3表达增加，到照射后21天NLRP3表达显著增加；照射后28天，NLRP3 的表达与照射后21天相比有所降低。辐射会激活NLRP3炎症小体，导致炎症产生，导致 放射性皮肤损伤加重。使用芦荟凝胶后，NLRP3表达降低。使用5％浓度的阿魏酸凝胶、 10％浓度的阿魏酸凝胶、15％浓度的阿魏酸凝胶后，能够显著降低照射后大鼠皮肤中NLRP3 的表达。因此阿魏酸凝胶能够抑制NLRP3炎症小体的激活从而实现抗辐射的作用。
对照射后21天、28天的Wistar大鼠皮肤取材，WesternBlot检测NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β在皮肤中的表达。在照射后21天NLRP3炎症小体表达明显上升，NLRP3炎 症小体激活后，Caspase-1表达增加，炎性因子IL-18、IL-1β表达增加，皮肤炎症明显。在 使用阿魏酸凝胶后，皮肤中NLRP3炎症小体被明显抑制，炎性因子表达降低。照后28天， 在使用阿魏酸凝胶后，皮肤损伤显著降低。
综上所述，阿魏酸凝胶能够通过抑制NLRP3炎症小体表达，减轻辐射损伤后炎症，治疗放射性皮肤损伤。
通过上述实施例，从细胞和动物水平验证了阿魏酸治疗放射性皮肤损伤的的可行性， 同时根据放射性皮肤损伤的特点研制阿魏酸凝胶剂型，从而实现放射性皮肤损伤的防治。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本 领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通 过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实 施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.阿魏酸在医学上的新用途，其特征在于，阿魏酸在治疗放射性皮肤损伤中的应用。
2.根据权利要求1所述阿魏酸在医学上的新用途，其特征在于，阿魏酸制作成凝胶形式。
3.根据权利要求2所述阿魏酸在医学上的新用途，其特征在于，阿魏酸凝胶的使用方式为直接涂抹在皮肤损伤部位。
4.根据权利要求3任一项所述阿魏酸在医学上的新用途，其特征在于，阿魏酸对60Coγ射线所致辐射损伤的细胞具有良好的保护作用。
5.根据权利要求4任一项所述阿魏酸在医学上的新用途，其特征在于，阿魏酸能降低放射性损伤的皮肤的炎症反应。
6.根据权利要求2-4任一项所述阿魏酸在医学上的新用途，其特征在于，阿魏酸凝胶的制备方法为：将0.75g卡波姆分散于75ml、80ml、85ml蒸馏水中进行充分溶胀24h，将不同浓度充分溶胀后的卡波姆分别加入5g甘油，和0.001g的对羟基苯甲酸乙酯，用搅拌棒混匀后分别加入5g，10g，15g阿魏酸混匀，最终定量凝胶加入适量三乙醇胺进行PH值及粘稠度调节，定量到100g，得到三种不同浓度的阿魏酸凝胶。
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