ITMI20122169A1 - Esteri dell'acido glicirretico, loro preparazione e loro applicazioni cosmetiche - Google Patents

Description

“ESTERI DELL’ACIDO GLICIRRETICO, LORO PREPARAZIONE E LORO APPLICAZIONI COSMETICHEâ€

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda esteri dell’acido glicirretico con poliglicerolosorbitolo e loro applicazioni in campo cosmetico.

STATO DELLA TECNICA

Il processo di invecchiamento della pelle consiste nella naturale evoluzione della struttura e dei tessuti a carico di quest’organo che si manifesta a partire dal periodo embrionale e continua fino alla tarda età.

Caratteristiche dell’invecchiamento cutaneo sono la riduzione del turnover e delle funzioni cellulari a cui segue una diminuzione delle sostanze strutturali (collagene, elastina, ecc.) che danno tono ed elasticità alla pelle che rappresenta di per sé una barriera fisica che il nostro corpo oppone all’ambiente esterno. Per questo motivo, la sua integrità e funzionalità sono il prerequisito per una buona condizione di salute della medesima.

Insulti ambientali come i raggi ultravioletti, l'esposizione al fumo di sigaretta e le sostanze inquinanti unitamente al naturale processo di invecchiamento contribuiscono alla formazione di una quantità maggiore di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e di radicali liberi che, quando in eccesso, possono brevemente condurre l’organismo in una condizione che va a discapito dell’integrità di proteine cellulari, membrane, geni e che viene descritta come stress ossidativo.

Questa condizione di stress, se protratta nel tempo, produce un’infiammazione sistemica che a sua volta determina i noti fenomeni di degenerazione cellulare strettamente correlati con l’invecchiamento, processo che à ̈ quindi collegato alla diminuzione della capacità protettive dell’organismo (difese antiossidanti, processi di riparazione del DNA, ecc.).

L’utilizzo di sostanze con proprietà antiinfiammatorie o lenitive rappresenta pertanto una strategia efficace per contrastare e prevenire l’insorgenza di questa condizione di stress.

I derivati della radice della liquirizia ( Glycyrrhiza glabra) sono da tempo impiegati come sostanze lenitive in preparazione per uso cutaneo e vi sono svariate condizioni per le quali l’applicazione topica di queste sostanze risulta vantaggiosa, ne sono un esempio il trattamento degli eczemi, delle dermatiti allergiche e da contatto e il trattamento della psoriasi.

Nella radice della liquirizia sono presenti un numero molto elevato di sostanze (es. sali dell’acido glicirrizico, asparagina, glabridina, glicirretolo, formonetina, ecc.) che in virtù delle loro proprietà possono svolgere un azione benefica nei confronti della cute. Tra queste sostanze i più rappresentativi dal punto di vista quantitativo sono i sali dell’acido glicirrizico.

L’acido 18-beta glicirretico à ̈ un triterpenoide pentaciclico che si ottiene dall’idrolisi dell’acido glicirrizico, saponina triterpenica naturalmente presente nella radice e nel rizoma della Glychyrrhiza Glabra.

L’acido 18-beta glicirretico che si origina dall'idrolisi dell’acido glicirrizico à ̈ la parte della molecola dotata di attività lenitiva:

COOH o

HOOC

HOOC

acido glicirrizico acido 18-beta glicirretico

Dal punto di vista chimico-fisico, l’acido 18-beta glicirretico si presenta come una polvere bianca, inodore, insolubile in acqua e negli oli, mentre à ̈ solubile in etanolo.

È noto che l’introduzione di una sostanza in un formulato può essere fatta secondo diverse modalità che dipendono in prima istanza dalle caratteristiche chimico-fisiche del principio attivo e del veicolo (o formulato) e che conseguentemente ne determinano la ripartizione o il passaggio del primo tra i vari strati di cui à ̈ composta la pelle, sino alla possibilità di raggiungere il sistema circolatorio e quindi i diversi tessuti deH’organismo.

Si parla in quest’ultimo caso di assorbimento percutaneo che dal punto di vista quantitativo può essere definito come la quantità di una certa sostanza riscontrabile a livello sistemico entro un dato intervallo di tempo dopo applicazione sulla cute.

Nella somministrazione topica il principio attivo deve viceversa ottenere massima efficacia locale con il minimo assorbimento sistemico.

Le molecole con elevato peso molecolare generalmente non sono in grado di penetrare negli strati più profondi. II loro destino, se non suscettibili di idrolisi, à ̈ di rimanere in superficie. È pertanto sentita l’esigenza di un prodotto in grado di incrementare l’efficacia lenitiva dell'acido glicirretico consentendo un passaggio preferenziale e modulato attraverso la via transdermica e il raggiungimento degli strati più profondi del derma, che sia al tempo stesso altamente biocompatibile e tollerabile dall’organismo.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

Tale scopo à ̈ stato raggiunto mediante un estere dell’acido glicirretico di formula (I):

Polygly

(I)

in cui

n à ̈ un numero intero da 1 a 3,

Sorb indica un residuo di sorbitolo, e

Polygly indica un residuo di glicerolo o poliglicerolo.

Sotto un altro aspetto, la presente invenzione concerne una composizione cosmetica comprendente almeno un estere dell’acido glicirretico di formula (I) ed almeno un veicolo cosmeticamente accettabile.

Sotto un ulteriore aspetto, la presente invenzione concerne il processo di sintesi di tale estere dell'acido glicirretico di formula (I).

Sotto un ancora ulteriore aspetto, la presente invenzione concerne l’uso di detto estere dell’acido glicirretico di formula (I) o di detta composizione cosmetica come anti-ageing nel trattamento topico esterno della pelle, in particolare di pelli sensibili.

Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione saranno evidenti dalla descrizione dettagliata di seguito riportata, dagli esempi realizzativi forniti a titolo illustrativo e non limitativo, e dalle annesse Figure, in cui:

- Figura 1 mostra i risultati del saggio MTT dell’acido 18-p-glicirretico (Esempio 5) dopo 24-48-72h di trattamento: % di vitalità rispetto alle cellule di controllo in cheranociti umani NCTC 2544 dopo 24-48-72 ore di trattamento con acido 18-βglicirretico a una concentrazione di 2.5-5-10-20-40-80Î1⁄4Îœ. I dati rappresentano medie ± deviazione standard. Ogni trattamento à ̈ stato condotto in duplicato.

- Figura 2 mostra i risultati del saggio MTT dell’estere di formula (la) (Esempio 5) dopo 24-48-72h di trattamento: % di vitalità in cheranociti umani NCTC 2544 dopo 24-48-72 ore di trattamento con l’estere di formula (la) a una concentrazione di 0.625-1.25-2-2.5-5-10-20-40-80Î1⁄4Îœ. I dati sono espressi come medie ± deviazione standard. Ogni trattamento à ̈ stato condotto in duplicato.

- Figura 3 mostra l’espressione del gene del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-a) in cheratinociti umani NCTC 2544 come determinato mediante RT-PCR nell’Esempio 6. Le cellule NCTC 2544 sono state trattate a 37°C per 16, 24 e 48 ore, al 5% di C02, con: terreno di coltura basale, contenente 2,5% di siero fetale bovino (controllo negativo) e con: terreno di coltura basale, contenente 2,5% di siero fetale bovino addizionato con LPS (5pg/ml) (controllo positivo). I valori rappresentano le medie di 2 esperimenti in duplicato.

- Figura 4 mostra l’espressione del gene del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-a) in cheratinociti umani NCTC 2544 come determinato mediante RT-PCR nell’Esempio 6. Le cellule NCTC 2544 sono state trattate a 37°C per 48 ore, al 5% di C02, con: terreno di coltura basale, contenente 2,5% di siero fetale bovino (controllo negativo), con: terreno di coltura basale, contenente 2,5% di siero fetale bovino addizionato con LPS (5pg/ml) (controllo positivo), con: terreno di coltura basale, contenente 2,5% di siero fetale bovino addizionato con LPS (5pg/ml) e acido ΙΠ́-β-glicirretico (18-β) ad una concentrazione di 2.5-5-10 Î1⁄4Îœ, con: terreno di coltura basale, contenente 2,5% di siero fetale bovino addizionato con LPS (5pg/ml), e POLY-GLY-S a una concentrazione di 2.5-5-10 Î1⁄4Îœ. I risultati sono espressi come percentuale di infiammazione rispetto alle cellule trattate con LPS. I valori rappresentano le medie di 2 esperimenti in duplicato.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione concerne pertanto un estere dell’acido glicirretico di formula (I):

Polygly

(l)

in cui

n à ̈ un numero intero da 1 a 3,

Sorb indica un residuo di sorbitolo, e

Polygly indica un residuo di glicerolo o poliglicerolo.

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine †̃poliglicerolo’ si intendono i prodotti di condensazione tra molecole di glicerolo, ossia dimeri, trimeri, oligomeri e polimeri di glicerolo. Il più semplice esempio à ̈ il diglicerolo o diglicerina che si ottiene dalla condensazione di due molecole di glicerolo. La reazione di disidratazione può interessare tutti e tre i gruppi ossidrilici della molecola e pertanto si possono avere condensazioni tipo alfa-alfa (α-α, cioà ̈ tra due ossidrili legati ad atomi di carbonio primari di due molecole di glicerolo), betabeta (β-β, cioà ̈ tra due ossidrili legati ad atomi di carbonio secondari di due molecole di glicerolo) e alfa-beta (α-β, cioà ̈ tra un ossidrile legato ad un atomo carbonio primario di una molecola di glicerolo e un ossidrile legato ad un atomo carbonio secondario di un’altra molecola di glicerolo), come nelle strutture riportate sotto:

α-α-diglicerolo β-β-diglicerolo α-β-diglicerolo

Con l’aumentare del grado di polimerizzazione aumenta anche il numero dei possibili isomeri, ad esempio si passa da tre differenti isomeri lineari per il diglicerolo a otto differenti isomeri lineari per il triglicerolo.

Reazioni intramolecolari possono anche portare alla formazione di prodotti ciclici. Tipicamente, i processi attualmente disponibili per ottenere poligliceroli di elevata purezza si possono dividere in due tipologie:

- metodi finalizzati all’allontanamento di prodotti ciclici e secondari, ad esempio descritti nel brevetto americano US 3,968,169 il cui contenuto viene qui interamente incorporato come riferimento,

- metodi per ottenere prodotti lineari con elevata purezza ad esempio descritti nel brevetto americano US 6,620,904, il cui contenuto viene qui interamente incorporato come riferimento.

Per gli scopi dell’invenzione, si sono rivelati particolarmente preferiti i residui di glicerolo e dei suoi oligomeri contenenti fino a 10 unità del monomero (poliglicerolo-10); infatti, all’aumentare del grado di polimerizzazione dei poligliceroli corrisponde una diminuzione della purezza dei medesimi, unitamente alla presenza di un sempre più alto numero di frazioni a differente peso molecolare, che rendono sempre meno omogenee le proprietà chimico-fisiche dei poliesteri finali. Inoltre, c’à ̈ da considerare che all’aumentare del grado di polimerizzazione, e quindi del peso molecolare, si ha un aumento della viscosità e una diminuzione dell’igroscopia della molecola.

Tipicamente, i poligliceroli possono essere sintetizzati ricorrendo a metodi che prevedono la condensazione del glicerolo con catalisi alcalina (sua disidratazione) con eliminazione di acqua. Il risultato di questa sintesi à ̈ normalmente una miscela di oligomeri che può comprendere glicerolo non reagito, prodotti ciclici e oligomeri molto alti. Condizioni di temperatura, tipicamente al di sopra dei 200°C, di durata della sintesi e di vuoto, privilegiano la formazione delle strutture volute. Per disidratazione della glicerina si ottengono diversi polimeri dove le molecole di glicerina sono legate tra loro mediante un ponte di ossigeno. Dal glicerolo che contiene tre gruppi ossidrilici, il numero degli -OH aumenta di uno ogni per ogni molecola di glicerina che si condensa; pertanto, il diglicerolo ha quattro gruppi -OH liberi, il triglicerolo cinque gruppi -OH liberi, il tetraglicerolo sei e così via.

Preferibilmente, nell'estere dell’Invenzione, Polygly indica un residuo di poliglicerolo con un grado di polimerizzazione da 1,5 a 10, più preferibilmente indica un residuo di poliglicerolo con un grado di polimerizzazione da 3 a 5.

In alcune forme di realizzazione dell’invenzione, Polygly à ̈ un residuo di poliglicerolo-3, più preferibilmente il trimero in cui le tre unità di glicerolo sono legate tra loro in configurazione α-α:

OH OH OH

Il residuo di sorbitolo, ossia Sorb, à ̈ presente nell’estere dell’invenzione in numero da 1 a 3; preferibilmente, l’estere dell’invenzione comprende un solo residuo di sorbitolo, n à ̈ 1.

Secondo una forma di realizzazione preferita, l’estere della presente invenzione comprende un residuo di poliglicerolo-3, in cui le tre unità di glicerolo sono legate tra loro in configurazione α-α, ed un residuo di sorbitolo, avendo formula (la):

In altre forme di realizzazione, l’estere dell’invenzione ha le seguenti formule:

Sotto un altro aspetto, la presente invenzione concerne un procedimento per la preparazione dell’estere dell’acido glicirretico di formula (I), comprendente le fasi di:

i) fare reagire glicerolo o poliglicerolo con sorbitolo a dare un etere; e

ii) fare reagire detto etere con acido glicirretico a dare l’estere di formula (I).

Nella fase i) il glicerolo o il poliglicerolo possono essere usati puri oppure in miscela tra loro.

In alcune forme di realizzazione dell’invenzione, si usa glicerolo o poliglicerolo in forma pura.

La fase ii) di esterificazione può essere catalizzata da acidi o basi. In alcune forme di realizzazione dell’invenzione si impiega un catalizzatore acido, per esempio acido paratoluensolfonico o acido metansolfonico, oppure nessun catalizzatore aggiunto, sfruttando in questo caso l’acidità dell’acido glicirretico stesso.

La sintesi di laboratorio può essere effettuata utilizzando attrezzature diverse. Per esempio, à ̈ possibile impiegare un reattore sferico in vetro (pallone) posizionato all’interno di un forno a microonde, munito di agitatore ad ancora, termometro a contatti, pescante per l’azoto, un distillatore Claisen completato in testa da un distillatore di Graham e nell'ultimo collo un imbuto gocciolatore. Alternativamente à ̈ possibile usare un reattore costituito da un pallone in vetro pyrex a due colli, posizionato all’interno di un forno elettrico da laboratorio e collegato ad un candelabro in vetro a tre colli, che consente il passaggio dell’asta metallica per l’agitazione meccanica del prodotto (asta centrale) e la circolazione di un flusso di azoto. Le temperature di reazione sono variabili, e possono andare da circa 145 °C a 180 °C nel caso di sintesi in forno a microonde, e da circa 130 °C a 220 °C nel caso di sintesi in forno elettrico.

Per la sintesi tipicamente si impiegano quantità circa equimolari di glicerolo o suoi oligomeri e acido glicirretico o viene introdotto in alimentazione un leggero eccesso di glicerolo o poliglicerolo, ad esempio del 5-10%.

Regolando opportunamente i rapporti molari tra i reagenti e i tempi di reazione si può arrivare ad avere nel prodotto di reazione una prevalenza dell’estere desiderato.

Sotto un ulteriore aspetto, l’invenzione riguarda un estere di formula (I) ottenibile dal procedimento di sintesi sopra descritto.

La caratterizzazione dell’estere di formula (I) dell’Invenzione può essere fatta per via cromatografica, in particolare con la tecnica SEC (Size Exclusion Chromatography). Con questa tecnica si ottengono dei cromatogrammi che riportano picchi, corrispondenti all’uscita di una sostanza o frazione dallo strumento, in funzione del tempo; dopo aver calibrato lo strumento con composti di riferimento, convenientemente aventi volume idrodinamico simile a quelli delle molecole o polimeri da rilevare; per esempio, un polistirene di peso molecolare noto, la tecnica fornisce come risultati tra gli altri i valori:

- Mn, peso molecolare medio numerale (media aritmetica dei pesi);

- Mw, peso molecolare medio ponderale (media pesata);

- D (polidispersità), rapporto Mw/Mn.

Tanto più il valore di D si avvicina a 1, tanto maggiore à ̈ la purezza della molecola. In accordo ad un suo ulteriore aspetto, l’invenzione riguarda composizioni cosmetiche, in particolare composizioni per uso topico, che comprendono almeno un estere dell’acido glicirretico di formula (I) ed almeno un veicolo cosmeticamente accettabile.

Veicoli cosmeticamente accettabili adatti alla composizione dell’invenzione possono essere ingredienti scelti tra modificatori reologici, plasticizzanti, emulsionanti, tensioattivi, bagnanti, surgrassanti, solubilizzanti, coloranti, lubrificanti, stabilizzanti, condizionanti, profumi, olii essenziali, adsorbenti, conservanti, agenti tamponanti, agenti antimicrobici, antiossidanti, agenti antiseborroici, agenti antistatici, agenti assorbenti, filtri solari chimici o fisici, agenti astringenti, agenti chelanti, agenti condizionanti cutanei, agenti coprenti, agenti denaturanti, agenti depigmentanti, agenti emollienti, agenti emulsionanti, agenti filmogeni, agenti idratanti, agenti idrotropi, agenti lenitivi, agenti leviganti, agenti opacizzanti o pedanti, agenti protettivi cutanei, agenti riducenti, agenti rinfrescanti, agenti seborestitutivi, solventi, agenti stabilizzanti delle emulsioni, agenti tonificanti, agenti umettanti, o loro miscele.

Le composizioni per l’uso topico dell’invenzione possono essere da risciacquo e non ed hanno proprietà idonee per le applicazioni in ambito cosmetico e dermatologico.

In accordo ad alcune forme di realizzazione, almeno un estere dell’acido glicirretico di formula (I) à ̈ presente nella composizione cosmetica dell'invenzione in quantità da 0,01 a 20% in peso, preferibilmente da 0,05 a 5% in peso, sul peso della composizione.

La composizione cosmetica dell'invenzione può presentarsi in una qualsiasi forma idonea all’applicazione locale o topica.

La composizione dell’invenzione può presentarsi in forma liquida ad esempio come lozione, soluzione, sospensione, shampoo, latte oppure in forma solida o semi-solida o fluida ad esempio come balsamo, siero, unguento o crema.

In certe forme di realizzazione, la composizione dell’invenzione à ̈ in forma liquida, ad esempio in forma di lozione a base acquosa contenente uno o più veicoli e/o eccipienti idonei per le applicazioni cosmetiche.

Nella forma liquida, la composizione può generalmente contenere da circa 1 al 99.9% in peso di acqua. In alcune forme di realizzazione, l’acqua à ̈ presente in quantità da 5 a 95% in peso. In altre forme di realizzazione, l’acqua à ̈ presente in quantità da 10 a 90% in peso.

In alcune forme di realizzazione dell’invenzione, la composizione cosmetica à ̈ anidra o contiene una quantità d’acqua inferiori al 10% in peso.

In altre forme di realizzazione dell’invenzione, il veicolo cosmeticamente accettabile à ̈ anidro o contenente un quantitativo d’acqua inferiore al 2% in peso, confinata all’interno di una capsula di gelatina molle.

In alcune forme di realizzazione, il veicolo della composizione dell’invenzione à ̈ un preparato base per le formulazioni cosmetiche, preferibilmente per la formulazione di preparati fluidi idonei all’applicazione cutanea.

La composizione dell’invenzione può essere applicata, in un quantitativo efficace, direttamente sulla parte da trattare, tipicamente la pelle del viso o del corpo, o il cuoio capelluto.

In forme di realizzazione particolarmente preferite, la composizione dell’invenzione presenta le seguenti formulazioni, in cui la concentrazione di ciascun componente à ̈ espressa in % in peso sul peso complessivo della composizione:

Formulazione 1 - SIERO IDRATANTE

Componente Concentrazione p/p (%) Copolimero VP Acriloil dimetil taurato di ammonio 0,10-1,50 Potassio sorbato 0,01 - 0,10 Sodio Benzoato 0,01 - 0,10 Pentilenglicole 0,50 - 4,00 Estere di formula (I) 0,05 -1,00 Propandiolo 0,50-8,00 Sodio idrossido 0,005-0, 20 Acido Citrico q.b. a pH 5, 2-5, 4 Glicerolo 0,50-8,00

PEG-8 Dimeticone 0,50-8,00 Acqua q.b. a 100

Formulazione 2 - SHAMPOO LENITIVO

Componente Concentrazione p/p (%) Disodio Laureth Solfosuccinato 1,00-7,00

Di-PPG-2-Mireth-10 Adipato 0,50-3,00 Disodio Cocoanfodiacetato 0,50-3,00 Ammonio Lauril Solfato 0,50-3,00 Poliquaternio-10 0,10-0,50 Tetrasodio EDTA 0,05-0,20 Profumo 0,10-1,50 Idrossipropiltrimonio amido di mais idrolizzato 0,05-1,00

BHA 0,005-0,015 Cloruro di potassio 0,50-1,50 Dimeticone PEG-7 Isostearato 0,5-1,50 PEG-120 Metil Glucosio Dioleato 0,10-0,90 Laureth-3 0,01-0,80 PEG-90 Gliceril Isostearato 0,10-0,80 PEG-8 Caprilic/Capric Gliceridi 0,50-1,00 Estere di formula (I) 0,05-1,00 Sodio idrossimetilglicinato 0,20-0,45 Acido citrico q.b. a pH 5,5 - 6,0 Acqua q.b. a 100

Formulazione 3 - STRUCCANTE

Componente Concentrazione p/p (%) Acqua q.b. a 100 Etilesilglicerina 0,25-0,50 PEG-40 Olio di ricino idrogenato 0,50 - 6,00 PPG-26-Buteth-26 0,50 -6,00 Metilpropandiolo 0,50 -4,00 Propandiolo 0,10-6,00 Disodio EDTA 0,025-0,05 Fenossietanolo 0,20-0,80 Sodio idrossido q.b to pH 5,2 Estere di formula (I) 0,05 -1,80

Formulazione 4 - LATTE CORPO

Componente Concentrazione p/p (%) Glicerina 1,00-6,00 Metilpropandiolo 1,00-6,00 Cetil idrossietilcellulosa 0,10-0,40 Gomma xantana 0,10-0,40 Amido di Tapioca 1,00-2,00 Disodio EDTA 0,025-0,20 Sorbitan stearato 2,00-5,00 Saccarosio cocoato 0,10-1,00 Etilesil palmitato 1,00-5,00 Polidecene idrogenato 100-5,00 Caprilic/capric trigliceridi 1,00-5,00 Burro di karité ( Butyrospermum parkii ) 1,00-5,00

Olio di semi di Meadowfoam ( Limnanthes alba) 1,00-3,00 Dimeticone 1,00-3,00 Sodio idrossimetilglicinato 0,10-0,20 Estere di formula (I) 0,05-1,00 Fenossietanolo 0,70-0,90 Acido lattico q.b. a pH 5,5 - 6,0 Profumo 0,30

Delta tocoferolo 0,02-0,25 Sorbitil furfurale 0,10-0,90 Acqua q.b. a 100

Formulazione 5 - ACQUA TONIFICANTE

Componente Concentrazione p/p (%) Glicerina 1,00-5,00 Estere di formula (I) 0,50-10,0 Inositolo 0,05-0,50 Trealosio 0,50-1,00 Allantoina 0,001-0,10 Profumo 0,05-0,30 Fenossietanolo 0,3-0,60 Sodio idrossimetilglicinato 0,05-0,20 Acido lattico q.b. pH 5,5 ±0,15 PEG-40 Olio di ricino idrogenato 2,00-15,00 Metilpropandiolo 1,00-6,00 Estere di formula (I) 0,05-1,50 Acqua q.b. a 100

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, à ̈ fornito un metodo di trattamento cosmetico che comprende l’applicazione locale di un quantitativo efficace di una composizione cosmetica del tipo precedentemente descritto.

Le composizioni cosmetiche dell’invenzione offrono vantaggi rispetto all'uso cosmetico o dermatologico dell’acido glicirretico tal quale o di composizioni cosmetiche che lo contengono, come si vedrà dagli Esempi che seguono.

Il glicerolo o il poliglicerolo sono sostanze di impiego sicure e hanno la possibilità di formare strutture polimeriche anche molto diverse tra loro, lineari, ramificate e iper-ramificate, con caratteristiche di solubilità e citotossicità migliori rispetto ai polimeri del glicole polietilenico (usato in composizioni note). Inoltre, selezionando un determinato peso molecolare della catena poliglicerica, à ̈ possibile modulare le proprietà delle composizioni che la contengono, siano queste proprietà di tipo chimico fisico, ad esempio la solubilità, o la cinetica di assorbimento del principio attivo, fino ad arrivare alla realizzazione di forme di rilascio modificato dell’acido glicirretico regolate da un meccanismo chimico, in virtù del fatto che il legame estereo può, in talune condizioni, essere suscettibile di scissione idrolitica o enzimatica in situ.

Applicato sulla pelle, l’estere dell’invenzione, in virtù della presenza di numerosi gruppi idrossilici in grado di formare ponti idrogeno con altrettante molecole d’acqua, si comporta come un serbatoio polifunzionale di acido glicirretico, in grado di normalizzare ed idratare la pelle anche in profondità.

L’estere dell’invenzione risulta infine particolarmente vantaggioso, alla luce della maggior tollerabilità rispetto all’acido glicirretico, al fine di produrre un'azione sebo normalizzante nei confronti della cute. Infatti come à ̈ noto, a livello delle ghiandole sebacee la concentrazione degli ormoni androgeni à ̈ il più importante fattore regolatore della secrezione del sebo; in particolare l’enzima 5 alfa reduttasi converte il 4-androstenedione in diidrotestosterone, un metabolita in grado di aumentare significativamente la secrezione sebacea.

Un ulteriore vantaggio ottenuto con l’impiego cosmetico dell’estere dell’invenzione à ̈ riferibile all’azione antimicrobica dell’acido glicirretico, che produce nel complesso una diminuzione dell’attività lipasica di origine batterica, associata ad una minor produzione di acidi grassi liberi che determina un’azione sebo normalizzante nei confronti della cute.

È da intendersi che tutti gli aspetti identificati come preferiti e vantaggiosi per l’estere dell’invenzione sono da ritenersi analogamente preferiti e vantaggiosi anche per la composizione cosmetica, il procedimento di preparazione e gli usi dell’estere e della composizione cosmetica.

Si riportano di seguito Esempi di preparazione dei composti secondo la presente invenzione, nonché esempi di valutazione della loro efficacia, forniti a titolo illustrativo e non limitativo.

Nel lavoro sperimentale riferito negli esempi, sono stati usati i seguenti materiali di partenza:

acido glicirretico, titolo 98% minimo, Selectchemie, Milano - Italia; poliglicerolo-3, poliglicerolo-4 e poliglicerolo-6, CAS 25618-55-7: rispettivamente Pure Vegetable PG-3 Pure Vegetable PG-4 e Pure Vegetable PG-6, Spiga Nord, Carasco (Genova), Italia;

poliglicerolo-10, CAS 25618-55-7: Natrulon H10, Lonza;

sorbitolo 70% Neosorb 70/70B non cristallizzabile Roquette Freres SA, (F); sorbitolo polvere Neosorb P100 T Roquette Freres SA, (F).

Il poliglicerolo Pure Vegetable PG-3, preferito per gli scopi dell'invenzione, à ̈ stato caratterizzato con prova SEC prima del suo impiego, dando i seguenti risultati: Mn = 4818; Mw = 4931; Mp = 4693; D = 1,023. L’indice di polidispersità pari a 1,02 indica un prodotto molto puro, essenzialmente costituito solo da unità poliglicerolo-3.

Per quanto riguarda la purezza dei poligliceroli, si fa rilevare che i prodotti commerciali utilizzati possono contenere anche monomeri e oligomeri a più basso e alto grado di polimerizzazione. Ad esempio, il Poliglicerolo-3 può contenere sino aM’1 % di glicerolo come anche poligliceroli a più alto peso molecolare.

ESEMPI

Esempio 1. Preparazione dell’estere formula (la)

i) Preparazione dell’etere di poliglicerolo-3 e sorbitolo

240 g di poliglicerolo-3 sono stati posti in un reattore sferico in vetro (pallone) posizionato all’interno di un forno a microonde. Il pallone à ̈ munito di agitatore ad ancora, termometro a contatti, pescante per l’azoto, un distillatore Claisen completato in testa da un distillatore di Graham e nell'ultimo collo inserito un imbuto gocciolatore.

Dopo una preliminare bonifica con l’azoto, ed erano attivati sia il riscaldamento che una lenta agitazione. Raggiunta la temperatura di 90/95°C, il sistema era posto sotto un lievissimo flusso di azoto.

0,25 g di acido metansolfonico erano aggiunti, impostando una vigorosa agitazione all'interno del reattore.

A questo punto, la miscela di reazione era posta sotto alto vuoto e 260 g di sorbitolo (soluzione 70%) erano fatti gocciolare lentamente nel pallone.

Una volta terminata l'aggiunta del sorbitolo (circa 60 minuti) si lasciava reagire per altre 2 ore, sempre alla temperatura di 90-95°C. Quindi si raffreddava la miscela di reazione.

ii) Preparazione dell’estere formula (la)

404 g di etere di poliglicerolo-3 e sorbitolo ed 470 g di acido glicirretico sono stati posti in un reattore sferico in vetro (pallone) posizionato all’interno di un forno a microonde.

Dopo una preliminare bonifica con l’azoto, era attivato il riscaldamento. Raggiunta la temperatura di 120°C, la miscela di reazione era posta sotto vuoto, il sistema era posto sotto blanda agitazione e blando flusso di azoto. A 160°C, si impostava una vigorosa agitazione all'interno del reattore.

La distillazione dell’acqua di reazione iniziava a 146°C ca. In 80 minuti ca. si distillava circa il 20% dell’acqua totale di reazione. A questo punto, il decorso dell’esterificazione era seguito con la determinazione dell’indice di acidità (indicatore: fenolftaleina).

Quando l’indice di acidità raggiungeva un valore inferiore a 5 e la temperatura 180°C (generalmente dopo 60 minuti di reazione), l’esterificazione era da considerarsi compiuta.

Il sistema era raffreddato a 80°C ed il reattore scaricato.

La distillazione dell’acqua di reazione si riduceva drasticamente quando il prodotto raggiungeva 160°C ca. La durata della reazione di laboratorio era di 3 ore circa. Si otteneva un prodotto denso, leggermente ambrato e quasi privo di odore.

Esempio 2. Preparazione dell’estere formula (la)

i) Preparazione dell’etere di poliglicerolo-3 e sorbitolo

Nel caso si utilizzi un sistema di riscaldamento tradizionale, e non il forno a microonde dell’Esempio 1 , sono state considerate le seguenti variazioni:

Dopo la bonifica con azoto e la lenta agitazione, il poliglicerolo era scaldato a 120-140 °C e una volta raggiunta tale temperatura, si aggiungeva il catalizzatore (acido metansolfonico 0,20-0,35%).

Facoltativamente si poteva aggiungere anche Io 0,1 % di acidi ipofosforoso per proteggere il prodotto dall’eccessiva colorazione.

Successivamente il sistema era posto sotto vuoto a - 0,5 bar rispetto alla pressione atmosferica.

182,17 g di sorbitolo in polvere erano inseriti lentamente a più riprese. Il sistema era mantenuto a 140 °C sempre sotto vuoto a 0,5 bar fino a completamento della reazione (indicativamente 3-5 ore) ed all’ottenimento di un prodotto liquido omogeneo monofasico altamente viscoso trasparente,

ii) Preparazione dell’estere formula (la)

404 g di etere di poliglicerolo-3 e sorbitolo ed 470 g di acido glicirretico sono stati posti in un reattore sferico in vetro (pallone).

Dopo la bonifica con azoto e la lenta agitazione, la temperatura di reazione era portata a 150 ±10 °C.

Raggiunta la temperatura desiderata era aggiunto il catalizzatore, acido paratoluensolfonico, alla percentuale dello 0,3%.

Se necessario si aggiungeva anche lo 0,1 % di acido ipofosforoso per proteggere il prodotto dall’eccessiva colorazione.

Il sistema era posto sotto vuoto a - 0,5 bar (rispetto alla pressione atmosferica). Dopo circa 3-4 ore la reazione era andata a completamento, ottenendo un prodotto liquido omogeneo "monofasico†altamente viscoso, di color ambra.

Il decorso dell’esterificazione era seguito con la determinazione dell’indice di acidità che raggiungeva un valore inferiore a 5 (indicatore: fenolftaleina).

Esempio 3. Preparazione dell’estere formula (Ib)

Si à ̈ proceduto come nell’Esempio 1, tranne che in questo caso sono stati impiegati 314 g di poliglicerolo-4 e successivamente (esterificazione con acido 18 beta glicirretico) quantità equimolari dei due reagenti.

Esempio 4. Preparazione dell’estere formula (le)

Si à ̈ proceduto come nell’Esempio 1, tranne che in questo caso sono stati impiegati 462 g di poliglicerolo-6 e successivamente (esterificazione con acido 18 beta glicirretico) quantità equimolari dei due reagenti.

Esempio 5. Preparazione dell’estere formula (Id)

Si à ̈ proceduto come nell’Esempio 1, tranne che in questo caso sono stati impiegati 758 g di poliglicerolo-10 e successivamente (esterificazione con acido 18 beta glicirretico) quantità equimolari dei due reagenti.

Esempio 6. Valutazione dell’attività antiinfiammatoria dell’estere formula (la) Sono stati investigati gli effetti antiinfiammatori dell’estere di formula (la) dell’Esempio 1 (denominato per brevità ’POLY-GLY-S’) in un modello di infiammazione in vitro, su cheratinociti umani NCTC2544, ed utilizzando il lipopolisaccaride (LPS) da E. coli come mediatore dello stato infiammatorio o irritativi. L’effetto del derivato nei modelli utilizzati à ̈ stato comparato con quello dell’acido 18-p-glicirretico (denominato per brevità Ί8-β’).

È stato inoltre determinato il potenziale irritante in vitro di POLY-GLY-S nei confronti di un controllo positivo (cellule trattate con 5pg/ml di lipopolisaccaride). I dati ottenuti sono stati paragonati con quelli ottenuti, nello stesso modello sperimentale, utilizzando 18-β.

MATERIALI

Modello biologico

La linea di cheratinociti umani NCTC2544 (Perry V.P. et Al., 1957) à ̈ stata ottenuta dall’Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova, Italia.

Coltura e propagazione della linea cellulare

Si utilizzava la linea immortalizzata di cheratinociti umani NCTC 2544 (Perry V.P. et al., 1957) mantenuta in coltura in fiasche sterili (25 cm<3>), incubate a 37°C in atmosfera umida al 5% di C02in terreno di coltura MEM (Minimum Essential Medium) addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS), glutammina 2mM, 1% di aminoacidi non essenziali, in presenza di 1% di penicillina e streptomicina.

Lo split 1 :3 si effettua ogni 2 giorni al raggiungimento del monostrato mediante lavaggio con PBS 1X (tampone fosfato senza Ca<2+>e Mg<2+>) e distacco delle cellule con una soluzione di tripsina-EDTA a 37°C per 2 minuti.

Reagenti e strumentazioni utilizzate

REAGENTI DITTA EMEM (EBSS) senza L-glutammina Lonza (BE12-125F) Soluzione di amminoacidi (100X) Lonza (BE13-114E) FBS ES Lonza (DE14-850F) PEN STREP MIX

Lonza (DE17-602F) (Penicillina 10.000 Ul/ml, Streptomicina 10.000 Ul/ml)

L- glutammina 200mM Lonza (BE17-605E) DMSO SIGMA (D1435)

PBS 1X senza Ca<2+>o Mg<2+>Lonza (BE17-516F) Miscela di tripsina-versene (EDTA) (1X) Lonza (BE17-161E) Trypan Blue Sigma (T8154-20ML) MEM Eagle EBSS (2X), W/O L-GIn, rosso fenolo Lonza (BE12-668-E) MTT Sigma (M2128 1G)

Cloroformio Sigma (366919)

Agarosio Sigma (A9539)

Soluzione di etidio bromuro Sigma (E1510)

Gel Loading Buffer Sigma (G2526)

Tri-Reagent Sigma (T9424)

2- Propanolo Sigma (59304)

Tris Acetate-EDTA buffer Sigma (T9650)

Acqua Sigma (95284)

Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (4368814)

Applied Biosystems TaqMan® Universal POR Master Mix, No AmpErase® UNG

(4324018)

Lipopolisaccaride da E. Coli Sigma (L4391) TRUMENTAZIONE DITTA icroscopio a contrasto di fase invertito Leica

appa a flusso laminare Steril Manifacturing

Division ncubatore HeraCell C02 ( Mod:150 ADV) Thermo Scientific agno digitale termostatato Stuart

reezer orizzontale -80°C Elcold

amera di Burker Carlo Erba ilancia (Mod. AM100) Mettler

ettore spettrofotometrico di micropiastre (Mod: ELX808) BioTek

en5 Software

pettrofotometro UV-visibile (MOD:6715, BS-6715B0) JenWay

ortex analogico (Mod. Sa8, BS-SAB) Stuart

istema per Reai time PCR (Mod: Mx3000P) Stratagene cDell Software MX3000P version 1.2 e 2.00 Stratagene rans-UV (ACDM-ECXF15M) Vilber Lourmat amera elettroforetica orizzontale (MOD:250-5159) Ward limentatore per camera elettroforetica (MOD:36-51 12) Ward otocamera digitale dispositivo di protezione per UV (S630) Samsung entrifuga da banco (Galaxy 7d) VWR

ixer (TR13) Girmy

Composti attivi testati

NOME. †̃POLY-GLY-S’ Ί8-β’

NOME ÙNIVOCO Estere di formula (la) Acido 18-beta-glicirretico IDENTIFICATIVO (Esempio 1)

CONSERVAZIONE rt rt

CONCENTRAZIONI 0.625, 1.25, 2, 2.5, 5, 10, 2.5, 5, 10, 20, 25, 40, 50,

20, 25, 40, 50, 80 Î1⁄4Îœ* 80 Î1⁄4Îœ*

*Tutte le concentrazioni sono riferite al composto attivo nella matrice di utilizzo

Controllo

Controllo negativo: Cheratinociti umani NCTC2544 mantenuti in coltura in EMEM (EBSS) al 2,5% FBS, supplementato con L-glutammina 2mM, 1% di soluzione di amminoacidi e 1% di miscela di penicillina (10.000 U/ml)/streptomicina (10.000 Ug/ml) a 37°C, 5% C02.

Controllo positivo: Cheratinociti umani NCTC2544 trattati con LPS (5pg/ml) in EMEM (EBSS) al 2,5% FBS, supplementato con L-glutammina 2mM , 1% di soluzione di amminoacidi e 1% di miscela di penicillina (10.000 U/ml)/streptomicina (10.000 Ug/ml) a 37°C, 5% C02.

METODI

Saggio MTT

Il MTT test à ̈ utile per la valutazione della vitalità cellulare in vitro in seguito al trattamento con composti diluiti. Il metodo MTT à ̈ stato usato come misura indiretta di vitalità cellulare.

Sono stati esaminati gli effetti sulla proliferazione delle cellule NCTC 2544 da parte dei composti 18-β e POLY-GLY-S a diverse concentrazioni.

Le cellule sono state piastrate a densità bassa e trattate con differenti concentrazioni di composti attivi e di controllo negativo, in terreno di coltura EMEM, senza rosso fenolo integrato al 10% con FCS, 2 mM L-glutammina, 1% di soluzione NEAA e 1% di miscela antibiotica, per 24, 48 e 72 ore, e la vitalità delle cellule à ̈ stata valutata,mediante il saggio MTT. La percentuale di vitalità cellulare rispetto al controllo (Figure 1-2) à ̈ stata calcolata dopo 24, 48 e 72 ore di incubazione.

Il test ha evidenziato che dopo 24 ore di incubazione nessuna delle concentrazioni di acido 18-p-glicirretico (Figura 1) e dell’estere di formula (la) (Figura 2) mostrava un effetto citotossico sulle NCTC2544, rispetto al controllo. Gli stessi risultati sono stati ottenuti dopo una esposizione prolungata (48-72h) delle cellule ai composti testati per tutte le concentrazioni considerate.

Saggio valutazione dell infiammazione

L'espressione genica del TNF-α sulle cellule NCTC 2544 à ̈ stata valutata mediante RT-PCR.

L’analisi dell’espressione genica comporta quattro fasi:

1. Trattamento delle cellule con composti attivi per 48h;

2. Estrazione dell’RNA;

3. retrotrascrizione del cDNA;

11684PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.

4. RT-PCR quantitativa.

Trattamento delle cellule NCTC2544

Nelle condizioni sperimentali, in relazione con i risultati ottenuti nel precedente saggio MTT, POLY-GLY-S e 18-β sono stati testati ad una concentrazione di 20Î1⁄4Îœ (concentrazione finale nel terreno di coltura). Sia il controllo positivo che negativo sono stati testati.

Test anti-infiammatorio su NCTC2544

Giorno 1: semina delle cellule

Quando le cellule (cheratinociti umani NCTC 2544) hanno raggiunto circa l’80% di confluenza, sono state staccate con tripsina / EDTA e seminate a una densità di 1 x 10<6>cellule/ml in piastre da 12 pozzetti e poi incubate a 37°C, 5% C02(24h). Giorni 2-3: esposizione alle sostanze per48h

Quando le cellule hanno raggiunto circa i’80% di confluenza, il mezzo completo à ̈ stato rimosso; le cellule sono state lavate con PBS 1X e incubate in EMEN (EBSS) con 2.5% di FBS, integrato con 2mM di L-giutammina, 1% di una soluzione di NEAA ed 1% di una miscela di antibiotici a 37°C, 5% C02per almeno 4h.

POLY-GLY-S e 18-β sono stati sciolti in EMEN integrato con 2.5% di FBS, 2mM di L-glutammina, 1% di una soluzione di NEAA ed 1% di una miscela penicillina (10,000 U/ml)/streptomicina (10,000 pg/ml).

I controlli contenenti soltanto terreno di coltura (controllo negativo) e terreno di coltura più LPS (5pg/ml) (controllo positivo) sono stati inclusi in ogni piastra.

Le cellule sono state esposte a concentrazioni crescenti dei composti da testare, ossia 2.5-5-10Î1⁄4Îœ.

A ciascun pozzetto era aggiunto LPS ad una concentrazione di 5pg/ml. Ciascun composto à ̈ stato testato in duplicato.

Le cellule sono state poi incubate a 37°C, 5% C02per 24h.

Estrazione dell’RNA

L’RNA totale à ̈ stato estratto dalle cellule usando una singola soluzione omogenea il Tri-reagent (Sigma Aldrich), per l'isolamento dell’RNA seguendo le indicazioni del fornitore.

La purezza di RNA totale estratto à ̈ stata valutata leggendo l'assorbanza a 260 nm, ossia la λ alla quale l'acido nucleico ha la massima assorbanza. È stata anche letta l'assorbanza a 280 nm, per valutare la contaminazione da proteine o fenolo. L'RNA à ̈ considerato di buona qualità, se il rapporto R = A260/A280 à ̈ > 1,4.

Dopo aver determinato la concentrazione totale di RNA e la purezza ciascun campione di RNA à ̈ stato diluito in acqua DEPC ad una concentrazione finale di 2 pg/ml. Questa à ̈ la concentrazione richiesta dal kit di retro-trascrizione. È stata anche eseguita una corsa elettroforetica su gel per verificare l'integrità del RNA totale estratto.

Retrotrascrìzione in c DNA

L'RNA totale, estratto e quantificato, à ̈ stato amplificato utilizzando il "High-Capacity cDNA Reverse transcription Kit†(Applied Biosystems).

Primer casuali sono stati utilizzati al fine di garantire una efficace sintesi del primo filamento del mRNA.

Per l'amplificazione à ̈ stato usato il RT-PCR System Mx3000P (Stratagene) e ciascun RNA totale à ̈ stato amplificato in duplicato.

Condizioni di amplificazione<:>Step 1: Step 2: Step 3: Step 4:

Temperatura 25° C 37°C 85° C 25° C Tempo 10 min 120 min 60 sec hold

Dopo l’amplificazione, i campioni sono stati diluiti con 30 pi di acqua DEPC e conservati a -20°C fino all'uso.

Reai Time PCR

La RT-PCR à ̈ stata eseguita, usando sonde TaqMan lineari (Applied Biosystems). Queste sonde sono il sistema di rilevazione più diffuso e pubblicato per le applicazioni qPCR.

Le sonde inventariate e primer sono stati scelti in base precedenti studi bibliografici specifici.

È stato utilizzato il metodo di quantificazione relativa in cui viene confrontata la concentrazione relativa del gene di interesse (bersaglio) in campioni sconosciuti ad un calibratore o campione di controllo (cellule non trattate).

Sono utilizzati i seguenti geni:

Programma di Lunghezza GENE NAME TAQMAN ASSAY ID

amplificazione Amplicon 95°C 15s

GAPDH

Hs99999905_m1 60°C 60s 122 (housekeeping)

per 40 cicli

95°C 15s

TNF-α (target) Hs00174128_m1 60°C 60s 105

per 40 cicli

Procedura Sperimentale

La RT-PCR Ã ̈ stata eseguita usando i cDNA delle cellule trattate a differenti tempi di trattamento e delle cellule controllo.

Al cDNA sono stati aggiunti 10 pi di TaqMan 2X Gene Expression master Mix e 1 pi di 20X TaqMan Gene Expression. Ogni campione biologico à ̈ stato trattato in duplicato e amplificato come indicato in tabella:

STEP jstep 1: Step 2: Activation of Step 3: PCR

iUDG incubation AmpliTaq Gold DNA

Polymerase

Hold Hold Cycle (50 cycles)

Denature Anneal/Extend Temperatura 50°C 95°C 95° C 60° C Tempo 2 min 10 min 15 sec Hold

Raccolta dei Dati

I dati forniti dallo strumento Stratagene Mx3000P sono stati registrati dal software interno MXpro v.4.01. Quando l'amplificazione à ̈ stata completata, il software applica automaticamente il metodo del 2<"MCt>. I valori di Ct del target e del normalizzatore idealmente dovrebbe essere entro circa dieci cicli l’uno dall'altro. La quantizzazione comparativa derivante à ̈ un diagramma comparativo relativo. Un valore pari a uno indica nessun cambiamento nell'espressione genica del gene target tra il campione in studio e il calibratore, mentre se maggiore, indica upregolazione, se inferiore ad uno indica la down-regolazione. Un valore à ̈ significativamente accettato come significativo se à ̈ superiore o inferiore di una volta (up-regolato o down-regolato) rispetto al calibratore.

Risultati

Il TNF -a à ̈ tipicamente over-espresso neH'epidermide di soggetti affetti da psoriasi (Kristensen et al, 1993; Ettehadi et al, 1994) e ha un ruolo fondamentale nella patogenesi della patologia stessa. Il ruolo chiave del TNF-α à ̈ inoltre supportato sia dall’evidenza che nella psoriasi altri geni che vengono regolati dal TNF-a risultano over-espressi e che antagonisti del TNF-α sono utilizzati come agenti terapeutici altamente efficaci nella maggior parte dei pazienti (Richardson e Gelfand, 2008). Recentemente, à ̈ stato suggerito che TNF-α inibisce l'espressione delle proteine barriera (per esempio, FLG e LOR), che antagonisti del TNF-a possono contribuire al miglioramento clinico dei pazienti affetti da psoriasi aumentando l'espressione delle proteine barriera (Kim et al., 2011).

McRitchie et al. (1997) hanno recentemente dimostrato che 10 pg/ml di LPS da E. coli stimola in modo massiccio la produzione TNF-α da parte delle cellule epiteliali alveolari entro le 4 h.

Nello studio intrapreso, à ̈ stato trovato che il trattamento con LPS da E. coli (5pg/ml) ha avuto un effetto simile sull’induzione del TNF-α e quindi del processo infiammatorio su cellule NCTC 2544 a partire dalle 16h di trattamento.

Infatti, à ̈ stato verificato che il trattamento NCTC2544 per 16, 24 e 48 ore con LPS (5pg/ml) in EMEM a basso tenore di FBS (2,5%) stimolava significativamente la produzione di TNF-α e quindi à ̈ stata studiata l'espressione del gene TNF-α su cellule NCTC 2544 dopo esposizione ai due composti in esame.

A 16h di incubazione, à ̈ stata trovata una significativa (P <0,05) differenza tra l'espressione del gene TNF-α rispetto al controllo negativo e le cellule NCTC 2544 trattate con LPS (5pg/ml) (controllo positivo) (Figura 3). Rispetto al controllo negativo, l'espressione del gene TNF-α in cellule NCTC 2544 aumentava significativamente (P <0,05) di circa tre volte dopo 24 ore di trattamento con LPS (5pg/ml) e questo effetto à ̈ mantenuto anche dopo 48 h di incubazione (Figura 3). Dopo questo esperimento di validazione preliminare, l'espressione del gene TNF-α à ̈ stata valutata mediante RT-PCR su cellule NCTC 2544, dopo trattamenti con 2,5-5 e 10 pm di 18-β, e 2,5-5 e 10 pm di POLY-GLY-S, aggiunti sulle cellule con LPS a 5pg/ml in EMEM a basso contenuto di FBS (2,5%). Per una migliore rappresentazione dei dati raccolti, i risultati sono stati espressi come rapporto percentuale rispetto alle cellule trattate con il solo LPS.

Dopo 48 ore di trattamento (Figura 4), 18-β non aveva più effetto antiinfiammatorio. Al contrario, POLY-GLY-S (Figura 4) a tutte le concentrazioni testate, era significativamente (P <0,05) efficace nell'inibire l’espressione del gene TNF-α. D’altra parte, le percentuali di inibizione dell’espressione del gene TNF-a erano superiori alle stesse concentrazioni di 18-β. In particolare, 2,5, 5 e 10 Î1⁄4Îœ di POLY-GLY-S producevano un’inibizione di 43,99%, 40,71% e 54,36%, rispettivamente.

Conclusioni

Sulla base dei dati ottenuti, si osservava che, quando usati a 2,5-5 e 10 Î1⁄4Îœ, sia 18-β che POLY-GLY-S erano ben tollerati dai cheratinociti umani NCTC2544.

Per quanto riguarda il saggio antinfiammatorio, dapprima à ̈ stata valutata la validazione del metodo utilizzato poiché à ̈ stato osservato un netto aumento di TNF-α dopo trattamento delle cellule con LPS 5pg/ml rispetto alle cellule non trattate.

Il POLY-GLY-S ha mostrato un effetto antinfiammatorio sull’espressione del gene TNF-α, dopo 48 ore di incubazione. A tutte le concentrazioni testate, POLY-GLY-S à ̈ stato in grado di ridurre di almeno il 50% l’espressione del gene TNF-a producendo un effetto inibitorio superiore a quello prodotto da 18-β.

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1 . Estere dell’acido glicirretico di formula (I): Polygly (l) in cui n à ̈ un numero intero da 1 a 3, Sorb indica un residuo di sorbitolo, e Polygly indica un residuo di glicerolo o poliglicerolo.
2. 2. L’estere di rivendicazione 1 , in cui Polygly indica un residuo di poliglicerolo con un grado di polimerizzazione da 1 ,5 a 10.
3. 3. L'estere di rivendicazione 2, in cui Polygly indica un residuo di poliglicerolo con un grado di polimerizzazione da 3 a 5.
4. 4. L’estere di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui n à ̈ 1 .
5. 5. L’estere di rivendicazione 1 di formula (la): OH OH
6. 6. Composizione cosmetica comprendente almeno un estere di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 ed almeno un veicolo cosmeticamente accettabile.
7. 7. Uso dell’estere di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 come agente antiageing topico nel trattamento della pelle, in particolare della pelle sensibile.
8. 8. Uso dell’estere di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 come agente lenitivo topico nel trattamento della pelle, in particolare della pelle sensibile.
9. 9. Uso della composizione cosmetica di rivendicazione 6 per il trattamento topico cosmetico della pelle, in particolare della pelle sensibile.
10. 10. Procedimento per la preparazione dell’estere dell’acido glicirretico di formula (I), comprendente le fasi di: i) fare reagire glicerolo o poliglicerolo con sorbitolo a dare un etere; e ii) fare reagire detto etere con acido glicirretico a dare l’estere di formula (I).