CN102484267B - 用于执行电化学反应的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于将多种试剂递送给多个分析反应、并监测所述多个分析反应的装置和方法，所述多个反应在最小噪音条件下在大规模电子传感器阵列上进行。在一个方面，本发明提供了通过减去从不含有分析物或反应副产物的邻近传感器测得的输出信号均值，来改善来自感知分析物或反应副产物的电子传感器的输出信号的信噪比的方法。在其它方面，本发明提供了与用于限定进行分析反应的分析物和/或颗粒的微孔阵列集成的电子传感器阵列，和如下鉴别含有分析物和/或颗粒的微孔的方法：使传感器活性试剂在阵列之上经过，并将传感器响应时间与分析物或颗粒的存在与否相关联。含有分析物或颗粒的微孔的这种检测，可以用作其它噪音减小方法中的步骤。

Description

用于执行电化学反应的装置和方法

本申请是2010年5月24日提交的美国专利申请序列号12/785,716的继续申请，后者是2009年5月29日提交的美国专利申请序列号12/474,897和12/475,311的部分继续申请，且本申请要求这些申请和2010年2月22日提交的美国临时专利申请序列号61/306,924的利益。所有前述申请都通过引用整体并入本文。

背景技术

电化学检测是有吸引力的，因为它会提供高灵敏度、小尺寸、低成本、快响应、和与微制造工艺的相容性，例如Hughes等人，Science，254：74-80(1991)；Mir等人，Electrophoresis，30：3386-3397(2009)；Trojanowicz，Anal.Chim.Acta，653：36-58(2009)；Xu等人，Talanta，80：8-18(2009)；等。这些特征已经导致基于电流信号、电位信号或阻抗信号的多种传感器的开发以及它们装配进用于化学、生物化学和细胞用途的阵列中，例如Yeow等人，Sensors and Actuators B 44：434-440(1997)；Martinoia等人，Biosensors&Bioelectronics，16：1043-1050(2001)；Hammond等人，IEEESensors J.，4：706-712(2004)；Milgrew等人，Sensors and Actuators B 103：37-42(2004)；Milgrew等人，Sensors and Actuators B，111-112：347-353(2005)；Hizawa等人，Sensors and Actuators B，117：509-515(2006)；Heer等人，Biosensors and Bioelectronics，22：2546-2553(2007)；Barbaro等人，Sensors and Actuators B，118：41-46(2006)；Anderson等人，Sensors andActuators B，129：79-86(2008)；Rothberg等人，美国专利公开2009/0127589；Rothberg等人，英国专利申请GB24611127；等。具体地，这些开发中的几个涉及使用大规模电化学传感器阵列来监测被限制在这样的阵列上的大量分析物的多个反应步骤，例如Anderson等人(上面引用的)；Rothberg等人(上面引用的)；等。通常，在这样的系统中，将分析物随机地分布在限制区(诸如微孔或反应室)的阵列中，并由流控系统将试剂递送至这样的区域，所述流控系统引导试剂流通过含有传感器阵列的流动池。通过一个或多个与每个微孔关联的电子传感器，可以监测在其中发生反应的微孔以及在其中不发生反应的空孔。

这样的系统容易发生许多相关的现象，所述现象使得高灵敏度测量面临挑战，特别是在低信号条件下。这样的现象包括：电传感器的不稳定的参比电压、缺少关于哪个限制区含有分析物的知识、由流动流递送给被限制在阵列不同区域的分析物的试剂的量的差异性、顺序递送的试剂的潜在混合、仪器温度的变化、可能影响流体电势的流体泄漏、外来电干扰(例如60Hz噪音、手机)等，所有这些都可能影响收集的信号的质量。另外，对于特定用途，可能存在与下述因素有关的其它挑战：使用的特定试剂、传感器对待测分析物的灵敏度、干扰化合物(诸如其它反应副产物)的存在与否等。

考虑到上述方面，有利的是，具有克服了现有方案的缺陷的可利用的系统，所述系统用于对大量分析物平行地进行多试剂的电化学反应。

发明内容

本发明涉及用于将多个试剂递送给多个反应的装置和方法，所述多个反应在大规模电子传感器阵列上进行并由后者监测。在一个方面，本发明提供了用于减少由这样的电子传感器响应于反应条件的变化而产生的输出信号中的噪音的装置和方法。在许多实现和用途中例证了本发明，其中的一些总结在下面和在本说明书中。

在一个方面，本发明包括用于进行多步骤电化学反应的装置，其中穿过反应流动室将稳定的参比电压提供给监测这样的多步骤电化学反应的电子传感器。在一个实施方案中，所述装置包括：(a)一个或多个反应器，每个反应器连接至用于监测反应器中的产物的电子传感器，所述电子传感器产生与产物的浓度或存在有关的输出信号，所述输出信号依赖于参比电压；(b)用于将多种电解质一次一种电解质地顺序地递送给反应器的流控系统；和(c)与多种电解质中选择的电解质接触的参比电极，所述参比电极与反应室流体连通，并提供参比电压给每个电子传感器，且所述参比电极不接触任何未选择的电解质。如下面更完整地描述的，在一个实施方案中，所述一个或多个反应器是设置在chemFET传感器阵列上的微孔阵列，所述chemFET传感器又设置在与微孔流体连通的流动池中。

在另一个方面，本发明包括一种装置，所述装置包括传感器阵列，所述传感器阵列包括浮动闸离子敏感的场效应晶体管，在所述场效应晶体管上由流动池限定出流动通道，使得通过电连接它们的浮动闸，灭活在流动通道之外的阵列传感器。在一个方面，这样的装置包括：(a)传感器阵列，其包括形成在回路支持基质中的多个传感器，所述阵列的每个传感器包括具有浮动闸的化学敏感的场效应晶体管(chemFET)，所述chemFET被构造成产生至少一个与在其附近的一种或多种反应产物的浓度或存在有关的电信号；和微孔阵列，其设置在所述回路支持基质上，使得每个微孔被设置在至少一个传感器上，其中一个或多个微孔含有分析物；和(b)用于递送试剂给微孔阵列的流控系统，所述流控系统包括具有入口、出口和流动室的流动池，所述流动室限定试剂从入口至出口经过时试剂的流动通道，其中所述流动室被构造成在流动通道中经微孔的开放部分横向地递送试剂，且其中在流动通道之外的传感器的浮动闸被电连接并保持在共同电压。

在另一个方面，本发明包括用于定位分布在多个微孔中的分析物的方法，所述方法包括下述步骤：(a)提供多个设置在传感器阵列上的微孔，其中每个微孔具有与流动室流体连通的开口且能够保留至少一种分析物，且其中每个微孔被设置在至少一个传感器上，所述至少一个传感器构造成响应于在其附近的试剂提供至少一个输出信号；(b)将流动室中的试剂从第一试剂(传感器响应于该第一试剂产生第一输出信号)改变为第二试剂(传感器响应于该第二试剂产生第二输出信号)；和(c)将响应于所述改变的来自传感器的第二输出信号的时间延迟与分析物在它的对应的微孔中的存在相关联。

在一个有关的方面，本发明另外包括一种制品，所述制品包括：传感器阵列，所述传感器阵列包括形成在回路支持基质中的多个传感器，所述阵列的每个传感器被构造成产生至少一个与在其附近的一种或多种预定的物质的浓度或存在有关的电信号；和微孔阵列，其设置在所述回路支持基质上，使得其中的每个微孔具有在微孔阵列表面上的开口且被设置在至少一个传感器上；和多种随机地分布在微孔中的分析物，其位置可通过它的对应的传感器所产生的输出信号来确定。在一个实施方案中，这样的分析物各自包含颗粒，所述颗粒具有与其相连的核酸片段(诸如基因组DNA片段、cDNA片段等)的克隆群体。

在另一个方面，本发明提供了一种减少来自传感器阵列的输出信号中的噪音的方法，所述输出信号与设置在微孔阵列中的反应和/或分析物有关。这样的方法包括下述步骤：(a)将分析物设置在微孔阵列上，使得微孔中的部分含有分析物；(b)获得由含有分析物或反应副产物的微孔产生的输出信号；和(c)从这样的输出信号减去来自不含有分析物或反应副产物的邻近微孔的输出信号均值。

许多例证的实现和应用中，解释了本发明的这些上面表征的方面、以及其它方面，其中的一些显示在附图中，并表征在附随的权利要求部分中。但是，上面的简介无意描述本发明的每个例证的实施方案或每个实现。

附图说明

图1A图解了本发明的装置的一个实施方案的组件。

图1B图解了流体-流体参比电极界面的第一个实施例的横截面，其中参比电极引入在试剂通道中流动池的下游。

图1C和1D图解了构建装置来实现图1B的流体-流体界面的方法的2个替代实施例。

图1E图解了流体-流体参比电极界面的第二个实施例的横截面，其中参比电极引入在试剂通道中流动池的上游。

图2A图解了具有外部参比电极的流动池的断面，和一个示例性的电子传感器的放大图。

图2B图解了2种顺序试剂在一部分微孔阵列上的移动，在所述不同试剂之间具有理想的均匀流锋线。

图2C图解了颗粒如何延迟传感器活性试剂的前进，由此建立输出信号时间延迟，其可以用于测定颗粒在微孔中的存在。

图2D对比了来自含有颗粒的微孔和没有颗粒的微孔的输出信号数据。

图3A的图图解了穿过具有对角线相对的入口和出口的流动室的流动通道。

图3B是用于制造浮动闸chemFET的传感器阵列的掩模的顶视图，其中在对角线流动区以外的chemFET的浮动闸在制造过程中被电连接，以便消除由在对角线流动区以外的未使用的传感器产生的噪音或使其最小化。

图3C的图显示了在大规模微孔阵列中的分析物沉积物的密度，这通过暴露于阶跃函数pH变化所引起的传感器输出信号变化来测定。

图4A-4D显示了流动池组件的不同视图和它们与微孔-传感器阵列芯片的集成。

图4E显示了具有与微孔-传感器芯片集成的2个流动室的流动池。

图5A图解了随机地设置在微孔阵列的微孔中的分析物。

图5B和5C图解了鉴别在选择的微孔附近的空微孔的不同方法。

图6A-6F图解了使用来自局部微孔的信号来减少选择的微孔的传感器的输出信号中的噪音。

图7A-7C图解了适合基于pH的DNA测序的本发明装置的组件。

图8A-8C图解了用于顺序地递送不同试剂给用于DNA测序的流动池的流体回路，其中参比电极仅与洗涤溶液发生连续的流体接触。

具体实施方式

尽管本发明可发生多种修饰和替代形式，其细节已经通过实施例显示在附图中，并将详细描述。但是，应当理解，本发明不将发明限于所述的特定实施方案。相反，本发明意图覆盖落入本发明精神和范围内的所有修饰、等效方案和替代方案。例如，为了例证目的，在CMOS工艺中实现装置和阵列的微电子学部分。但是，应当理解，公开内容无意在这方面受到限制，因为其它基于半导体的工艺可以用于实现本文讨论的系统的微电子学部分的不同方面。关于制备本发明的阵列的指导，可以参见许多可利用的关于集成电路设计和制造及微型加工的参考文献和论文，包括，但不限于，Allen等人，CMOS Analog Circuit Design(Oxford University Press，第2版，2002)；Levinson，Principles of Lithography，第2版(SPIE Press，2005)；Doering和Nishi编，Handbook of Semiconductor ManufacturingTechnology，第2版(CRC Press，2007)；Baker，CMOS Circuit Design，Layout，and Simulation(IEEE Press，Wiley-Interscience，2008)；Veendrick，Deep-Submicron CMOS ICs(Kluwer-Deventer，1998)；Cao，Nanostructures&Nanomaterials(Imperial College Press，2004)；等，它们的相关部分特此通过引用并入。同样地，关于实现本发明的电化学测量的指导，可以参见许多可利用的关于该主题的参考文献和论文，包括，但不限于，Sawyer等人，Electrochemistry for Chemists，第2版(Wiley-Interscience，1995)；Bard和Faulkner，Electrochemical Methods：Fundamentals and Applications，第2版(Wiley，2000)；等，它们的相关部分特此通过引用并入。

在一个方面，本发明涉及用电子传感器实现和监测多个多步骤反应的装置和方法。所述多步骤反应可以是循环的，诸如在DNA测序反应、DNA合成反应等中，其中进行一个或多个步骤的重复循环，或者它们可以是非循环的，诸如在多组分标记反应中，例如，在使用酶标记的夹心试验中。多步骤反应也可以源自生物材料(诸如活细胞或组织样品)的存在，其中响应于一系列的试剂暴露而检测应答(例如代谢物的存在与否)，所述试剂可以是药物候选分子等。优选地，将本发明的电子传感器集成在传感器阵列中，所述传感器阵列适用于测知在阵列表面上或附近处发生的单个反应。在一个实施方案中，反应限制区阵列与这样的传感器阵列是一体的。反应限制区阵列可以是通过常规的微制造或纳米制造技术制备的微孔阵列或反应室阵列的形式，例如，描述于：Rothberg等人，美国专利公开US2009/0127589和Rothberg等人，英国专利申请GB24611127。在一个实施方案中，这种阵列中的每个微孔或反应室具有至少一个处于传感关系中的传感器，使得可以检测或测量微孔或反应室中的反应的一个或多个特征。通常，本发明的电子传感器会直接地或间接地(例如，通过使用结合化合物或标记)测量反应副产物，包括，但不限于，反应产生的化学物质或由反应造成的物理变化，诸如温度的升高或降低，例如如在Rothberg等人(上面引用的美国和英国专利公开)中所公开的。优选地，本发明的电子传感器会将反应副产物的存在、浓度或量的变化转化为输出信号，所述输出信号可以是电压水平或电流水平的变化，其又可以被处理，以产生关于反应的信息。阵列的电子传感器或这样的传感器的子集，也可以用于监测反应物、指示剂分子、或其它试剂(诸如用于鉴别含有分析物的微孔的试剂(下面更完整地描述))的存在或浓度。与本发明一起使用的传感器的结构和/或设计可以宽泛地变化，如通过引用并入本文的下述参考文献所例证的：Rothberg等人，美国专利公开US2009/0127589；Rothberg等人，英国专利申请GB24611127；Barbaro等人，美国专利7,535,232；Sawada等人，美国专利7,049,645；Kamahori等人，美国专利公开2007/0059741；Miyahara等人，美国专利公开2008/0286767和2008/0286762；O’uchi，美国专利公开2006/0147983；Osaka等人，美国专利公开2007/0207471；Esfandyarpour等人，美国专利公开2008/0166727；等。在一个优选的实施方案中，所述阵列的传感器包括至少一个化学敏感的场效应晶体管，其构造成产生至少一个与在其附近的化学反应的性质有关的输出信号。这样的性质可以包括反应物或产物的浓度(或浓度的变化)，或诸如温度等物理性质的值(或这样的值的变化)。下面更完整地描述了电子传感器阵列和微孔阵列的理想构型和物理特性。在这样的传感器阵列的一个实施方案中，所述传感器的chemFET包括浮动闸。在本发明的另一个实施方案中，所述阵列的电子传感器各自产生输出信号，所述输出信号部分地依赖于与微孔阵列流体接触的参比电极的电压值。在具体实施方案中，提供单个参比电极，使得每个传感器用相同的参比电压产生输出信号。

在图1A中图解了本发明的一个实施方案的组件。流动池和传感器阵列(100)包括与传感器阵列可操作地关联的反应限制区阵列(其可以包括微孔阵列)，所以，例如，每个微孔具有适用于检测目标分析物或反应性质的传感器。优选地，微孔阵列与传感器阵列集成为单个芯片，如下面更完整地解释的。流动池可以具有多种用于控制试剂经过微孔阵列的路径和流量的设计。在有些实施方案中，流动池是微流控装置。也就是说，它可以用微型加工技术或精确模塑来制造，以包括额外的流控通道、室等。在一个方面，流动池包括入口(102)、出口(103)和流动室(105)，所述流动室(105)用于限定试剂经过微孔阵列(107)的流动通道。下面更完整地描述了流动池的实施方案。在离开流动池和传感器阵列(100)以后，试剂被排入废物容器(106)中。根据本发明，所述装置的功能是，将不同的试剂以预定的次序、预定的流量递送至流动池和传感器阵列(100)预定的持续时间，并测量微孔中的物理和/或化学参数，所述参数会提供关于在微孔中发生的反应的状态的信息，或在空孔的情况下，提供关于流动池中的物理和/或化学环境的信息。为此，流控控制器(118)通过线(120和122)来控制多种试剂(114)的驱动力，且通过常规仪器控制软件(例如Lab View(National Instruments，Austin，TX))控制对阀门(例如，112和116)的操作。通过泵、气压、或其它常规方法，可以驱动所述试剂穿过流体通道、阀门和流动池。在将单个参比电极(108)设置在流动池和传感器阵列(100)上游的实施方案中，优选地，在整个多步骤反应过程中，使单个流体或试剂接触参比电极(108)。这通过图1A所示的构型来实现，其中试剂1至K(114)穿过通道(109)被引导至流动池(105)。当那些试剂流动时，阀门(112)被关闭，从而防止任何洗涤溶液流入通道(109)中。尽管洗涤溶液的流动被停止，在参比电极、通道(109)、和传感器阵列(107)之间仍然存在不间断的流体和电通信。在大多数情况下，试剂1至K当流过通道(109)时会扩散进通道(111)中，但是选择参比电极(108)与通道(109)和(111)的连接点之间的距离，使得在共同通道(109)中流动的试剂几乎没有或不会到达参比电极(108)。尽管图1A和其它图图解了电极(例如，参比电极108)为与流体通道(例如，111)同心的圆柱体，诸如(108)等参比电极可以具有多种不同的形状。例如，它可以是插入(111)的内腔中的丝。在一个方面，参比电极(108)构成通道(112)的一部分，所述通道由诸如不锈钢、金等传导性材料制成。优选地，所述材料相对于与它接触的试剂而言是惰性的。在一个实施方案中，参比电极(108)是由传导性材料制成的管，其形成通道(112)的一部分。一般而言，在附图中，每当将电极表示为与流动通道同心的圆柱体时，这样的图元件意图包括具有指出的多种构型的电极，但是优选的构型是围成流动通道的一部分的传导性材料的管。

参比电压的值取决于电极和所述电极所接触的溶液之间的界面。已经观察到并理解(例如)，不同的三磷酸核苷的溶液会造成参比电压的变化，从而造成不希望的传感器的输出信号的变化。对于使用频繁的洗涤步骤的多步骤反应而言，可以选择洗涤溶液(110)作为与参比电极(108)连续接触的试剂，如图1A所示。(也就是说，洗涤溶液将是“选择的电解质”或“选择的试剂”，且dNTP试剂将是“未选择的电解质”或“未选择的试剂”，它们是本文别处使用的术语)。如下面进一步描述的，在某些DNA测序方法中，在每次导入三磷酸核苷以后，进行洗涤；因而，在这样的方法中，洗涤溶液优选地与参比电极连续接触。这样的接触可以如下实现：包括蓄池，其用于容纳选择的电解质，诸如洗涤溶液，所述蓄池通过分支通道(例如111)连接至共同通道(例如109)，以用于将电解质递送给反应器。在一个方面，所述分支通道具有设置在蓄池(例如，110)和与共同通道的连接点之间的阀门，其中所述参比电极被设置在阀门和连接点之间的分支通道中，使得参比电极与反应器流体连通，并使得每当阀门(例如112)被关闭且在分支通道内的流体是静止时，基本上没有未选择的电解质接触参比电极。未选择的电解质向分支通道中的唯一转移是通过扩散；因而，参比电极可以放置得离所述连接点足够远，使得在选择的电解质是静止的时间内，微量的或没有未选择的电解质达到它。

该实施方案的其它组件包括阵列控制器(124)，其用于提供偏压电压(bias voltage)和计时和控制信号给传感器阵列(如果这样的组件没有集成在传感器阵列中)，并用于收集和/或处理输出信号。通过用户界面(128)，可以显示和输入来自流动池和传感器阵列(100)的信息以及仪器设置和控制。对于有些实施方案(例如，核酸测序)，控制流动池和传感器阵列(100)的温度，使得在已知的且优选地预定的温度发生反应并进行测量。通过常规的温度控制装置，例如，Peltier装置等，可以控制这样的温度。在一个方面，通过控制流过流动池的试剂的温度，方便地控制温度。由于阵列内的温度差或由于温度波动导致的输出信号中的噪音，可以被阵列内的温度参照传感器记录下来，如在Rothberg等人(上面引用的公开的专利申请)中所述。然后可以使用常规的信号处理技术，从输出信号中减去这样的噪音。

图2A是流动池(200)的放大和横截面视图，其显示了流动室的一部分(206)，其中试剂流(208)经微孔的开放端流过微孔阵列(202)的表面。优选地，微孔阵列(202)和传感器阵列(205)一起形成集成的单元，其形成流动池(200)的底壁或底板。在一个实施方案中，参比电极(204)流体地连接至流动室(206)。以放大图显示了微孔(201)和传感器(214)。通过常规微制造技术，可以形成微孔(201)，如下面简单描述的。微孔容积、形状、高径比(例如，基底宽度与孔深度之比)等是设计选项，其取决于特定用途，包括发生的反应的性质以及试剂、副产物、和采用的标记技术(如果有的话)。传感器(214)是具有浮动闸(218)的chemFET，所述浮动闸具有传感器板(220)，该传感器板(220)与微孔内部被钝化层(216)隔开。传感器(214)主要对在传感器板(220)的对面的钝化层(216)上存在的电荷(224)的量做出响应(并产生与其有关的输出信号)。电荷(224)的变化会造成FET的源(221)和排出(222)之间的电流的变化，该变化可以直接地用于提供基于电流的输出信号，或间接地与额外的电路一起提供电压输出信号。反应物、洗涤溶液、和其它试剂主要通过扩散(240)从流动室(206)移动进微孔中。

通常，在微孔(202)中进行的反应是分析反应，以鉴别或测定目标分析物的特征或性质。这样的反应会直接地或间接地产生副产物，所述副产物会影响在传感器板(220)附近的电荷的量。(例如，如果使用在结合目标分析物以后会影响传感器的副产物螯合剂或其它结合化合物，或者如果采用标记部分，诸如酶(作为结合事件等的结果，所述酶可以产生第二副产物)，可能发生间接检测)。如果这样的副产物以小量产生，或者快速地衰变或与其它组分反应，则可以在微孔(201)中同时分析同一分析物的多个拷贝，以便增加最终产生的输出信号。在一个实施方案中，可以在沉积在微孔中之前或之后，将分析物的多个拷贝连接至固相支持物(212)上。固相支持物(212)可以包括固体的且多孔的微粒、纳米颗粒、珠子，包括凝胶等。对于核酸分析物，通过滚环扩增(RCA)、指数RCA等技术，可以制备多个连接的拷贝，以生产扩增子，而不需要固体支持物。

如上所述，在一个方面，本发明的流动池含有试剂，所述试剂经微孔阵列以层流横向移动。流量是一个设计选择，其取决于进行的反应的性质、流动室和微孔阵列的几何形状和尺寸等。但是，通常，当将不同试剂顺序递送给微孔时，在从一种试剂转换为另一种试剂的过程中，随着所述试剂流过流动室，流动池会以均匀流锋线递送每个新的试剂流。也就是说，选择流动池设计和试剂流量，使得随着一种试剂跟随另一种试剂，在顺序流体之间的边界处几乎不发生或不发生混合。图2B图解了流过微孔阵列的部分(234)的两种试剂之间的均匀流锋线。“均匀流锋线”是指，随着顺序的试剂(例如试剂1(232)和试剂2(230))流过微阵列，它们几乎不发生或不发生混合，所以随着它移动经过微阵列，保持试剂1(232)和试剂2(230)之间的狭窄边界(236)。对于具有在它们的流动室的相对端处的入口和出口的流动池，这样的边界可以是直线的，或者对于具有中央入口(或出口)和周边出口(或入口)的流动池，这样的边界可以是曲线的。

电子传感器阵列的参比电极

流体-电极界面会影响参考电势向流体传递的方式。也就是说，流体和电极之间的界面电势会随着流体的组成(其可能是一定程度上紊流的和不均匀的)而波动，将电压偏移导入主体流体的电势(其随时间而变化，也可能随位置而变化)中。通过移动参比电极的位置，使得它与流体组成的变化基本上分离，可以实现明显更大的参考电势稳定性。这可以如下实现：将具有一致组成的传导性溶液引到电极表面的至少一部分上(下文中称作“电极溶液”或“选择的电解质”)，排列所述电极以避免它直接接触流动池中的变化的流体，作为替代，排列电极溶液(而不是电极)以与流动池中的流体发生电接触。结果是参考电势向流动池溶液(它是试剂溶液或洗涤溶液或其它溶液)的转移，认为所述转移比将电极直接插入流动池溶液中所得到的明显更稳定。我们将该排列称作液体-液体或流体-流体参比电极界面。所述流体-流体界面可以建立在流动池的下游、流动池的上游(如图1A所示)或在流动池中。这样的替代实施方案的实施例如图1B-1E所示。

首先返回图1B，它显示了一个实施方案的图示，其中流体-流体界面是建立在流动池的下游。在该实施例中，如上所述的流动池装置131安装在含有传感器阵列(未显示)的芯片132上。流动池装置包括入口孔133和出口孔134。也就是说，试剂流体经由导管134被引入孔133中，它们经由孔134离开。流体“T形”连接体137的第一个孔136经由常规连接器连接至流动池出口孔134上，以接纳从流动池离开的流体。经由不漏流体的连接器139，将参比电极(诸如中空的导电管138)插入T形连接体的另一个孔中。将参比电极连接至参考电势源140，使合适的电极溶液141流入电极管的中心孔腔中。

2个工作模式是可能的。根据第一个模式，电极溶液可以以一定速率流动，所述速率足够高，以避免从流动池流出的流体的返流或扩散。根据第二个模式，在电极溶液已经填充电极并接触来自流动池的出口流以后，可以关闭阀门(未显示)，以阻断电极溶液进一步流入电极中，且由于电极溶液是不可压缩的液体，基本上不会流入或流出电极，而流体-流体界面将保持完整。当然，这假设没有气泡和其它可压缩的组分。为了用流体-流体界面替代金属-流体界面，将电极138的尖部142定位在T形连接体内停止，所述T形连接体缺少流出流动池的流体，所以是“电极溶液”(而不是电极本身)会遇到来自流动池的出口流(在143处指出)，并将来自电极的参考电势携带至离开流动池的试剂溶液。所述2个流体流在143处与T形连接体相互作用，且如果电极溶液是流动的，它会与试剂流一起流出T形连接体的第三个孔144，成为待处理的废物流体流。该方案消除了在电极表面处的界面电势变化。使用流体-流体界面将来自参比电极的稳定参考电势传递至流动池，不同的替代实施方案是可行的。

在图1C所示的一个替代方案中，参比连接点(即，流体-流体界面)可以移动进形成流动池的部件的结构中，或甚至移动进传感器芯片本身中，但是电极溶液绝不进入流动池。例如，可以在流动室本身之外的流动池组件中形成歧管151，其具有用于容纳电极溶液的入口152和与流动池的出口导管134流体连通的出口153。所述电极可以是设置在歧管中的单独元件，或者它可以是施加在歧管内表面上的金属化。

或者，可以如下将所述歧管形成在芯片本身的基质中：在基质中制造中空区域，所述中空区域可以用作导管，以实现从入口端至出口端的流体通道。经由单独的入口孔152，可以向其中插入电极，或者，可以在制造过程中，将导管的部分表面(内表面或外表面，根据需要)金属化，以用作电极。试剂流体离开流动室所用的流动通道可以包括导管部分，且所述电极导管/歧管可以将电极溶液递送至试剂流体出口导管，其中所述两种流体发生接触，以提供将参比电极电压施加于流动池上的流体-流体界面。

在每种情况下，所述电极可以是中空的，并具有穿过它的内部递送的电极溶液，或者，所述电极溶液可以在电极的外部递送。例如，如图1C所示，所述电极可以是中空的，诸如是歧管151的内表面，且它可以具有使用任意合适的结构和材料与流动池绝缘化的外部(未显示，以避免基础想法的混乱)。

所述电极组件因而可以构建在传感器芯片本身中，或在流动池或它的壳体中，连接至流体入口，从所述流体入口中可以导入电极溶液。试剂流体离开流动室所用的流动通道可以包括导管部分134，其中存在电极溶液，且其中两种流体流发生接触，以提供流体-流体界面。所述电极溶液可以是流动的或静止的。

作为如图1D所示的另一个替代实施方案，电极结构可以集成或设置在流动池本身内。这可以以两种明显不同的方法来实现。首先，可以将电极溶液导入流动室中，从入口154流入流动池(为该目的而提供)，流至出口孔134，电极溶液和试剂流从该出口孔134离开流动室。如果将两种流体都排列成以层流移动通过该室，在它们到达出口之前，它们不会相互混合(或存在极少的混合和相互作用)。所以，在两种流体之间不需要屏障。它们的整个接触区是流体-流体分界部位，与其它例证的替代方案相比，这可以为该界面提供明显更多的表面。其次，可以将流体导管提供在流动室附近，或者甚至完全或部分地在流动室内，所述流动室具有非传导性的外部。电极可以沿着导管的内部在电极流体入口和流体出口之间延伸，所述流体出口允许电极溶液与试剂流分界，诸如在共同出口导管134中。

在前述实施例中，将参考电势导入在流动池中或其下游。但是，将电极提供在流动池下游的相同方案是可能的，如在图1E中所图示。其中，133是流动池的入口孔，134是出口孔，如图1B所示。具有4个孔的交叉连接体171具有连接至入口孔上的第一个孔172。第二个孔173经由入口导管135接受要反应或测量的溶液(例如，试剂)。第三个孔174用作废物出口孔。第四个孔175以与前面在图1B中所示的相同方式接受电极。在交叉连接体内，电极溶液和要反应/测量的溶液相互反应，以将参考电势传递进流动池中。但是，不同于一些其它的替代实施方案，该实施方案的至少一些实现可能要求，要反应/测量的溶液必须具有足够高的流量，以防止电极溶液流入流动室中。但是，使用交叉连接体的正确构造，仍然可能避免对连续流动电极溶液的需要。

电子传感器用于定位微孔中的分析物的应用

在本发明的一个方面，使用电子传感器来定位含有分析物和/或颗粒的微孔和空的微孔。这样的方法是有用的，因为来自空孔的输出信号允许估测共有的噪音组分，所述噪音组分可以从由含有分析物的微孔测得的输出信号减去，从而提高信噪比。此外，在许多实施方案中，如下将分析物和/或颗粒随机地设置在微孔中：把它们放入溶液中，并使它们流入流动室，在这里它们随机地沉入微孔中，如图3A所示，并如Rothberg等人(上面引用的美国专利公开)所进一步例证的；因而，需要电子地鉴别哪个微孔含有分析物和哪个微孔是空的方法。

通常，仅将单个分析物设置在单个微孔中。在一个方面，将相同分析物的多个拷贝连接在固体支持物(诸如珠子或颗粒)上，并选择所述固体支持物，以在大小和形状方面与微孔匹配，使得仅单个固体支持物适合进入单个微孔，从而确保仅一类分析物在单个微孔中。如上所述，对于有些类型的分析物，诸如核酸，可以使用诸如滚环扩增(RCA)等方法来构建连接的扩增子，所述扩增子形成可以排它地占据微孔的单个主体，例如如在Drmanac等人，美国专利公开2009/0137404中所公开的。在将分析物随机地分布进微孔中以后，可以使用对表面电荷的变化做出响应的电子传感器来鉴别含有分析物的微孔。因而，在一个方面，本发明的方法包括：导入传感器活性试剂，其可以与在目标分析过程中使用的试剂相同或不同，所述试剂能够随着它的浓度的变化而改变在传感器附近的电荷。

在一个实施方案中，本发明的该方面可以包括下述步骤：(a)将流动室中的试剂从第一试剂(传感器响应于该第一试剂产生第一输出信号)改变为第二试剂(传感器响应于该第二试剂产生第二输出信号)；和(b)将传感器响应于所述改变而产生第二输出信号的时间延迟与分析物在它的对应的微孔中的存在相关联。在本发明的该方面，可以使用任意类型的电化学传感器，包括电位传感器、阻抗传感器或电流传感器，只要输出信号取决于电极或其它分析物-敏感的表面和传感器活性试剂(其到达被微孔中的物理或化学阻碍所延迟)的相互作用。在一个实施方案中，所述传感器活性试剂是洗涤溶液，所述洗涤溶液的pH不同于它替代的试剂，所述试剂也可以是洗涤溶液。改变试剂的步骤包括：记录阵列中传感器的输出信号，从而得到信号值(或其数字表示)的连续时间记录，可以对其进行分析，以确定与传感器活性试剂到达各个传感器的时间相对应的输出信号的变化时机。通过常规的数据获取和分析组件，可以进行这样的数据记录和分析。

如图2C所示，当传感器活性试剂流入流动室中时，它穿过含有颗粒(212)的微孔(201)以及穿过微孔(250)从流动室(206)扩散，并到达在传感器板(220)对面的钝化层(216)区域。只要微孔(201)含有分析物或颗粒(212)，装载试剂的扩散锋线(252)就会相对于空孔(250)中的锋线(254)延迟，无论是通过分析物/颗粒在扩散通道中的物理阻碍，还是通过与分析物/颗粒或它结合的固体支持物的化学相互作用(如果存在的话)。因而，通过将传感器的输出信号的变化的时间延迟(256)与分析物/颗粒的存在相关联，可以确定含有分析物的微孔。在一个实施方案中，在将传感器构造成测量pH的情况下，装载试剂是具有预定pH的溶液，其用于替代在不同的预定pH的第一试剂。在用于核酸测序的实施方案中，氢离子扩散的延迟受到分析物和/或颗粒的物理阻碍和缓冲容量二者的影响。优选地，第一试剂pH是已知的，且试剂的改变会有效地将微孔的传感器暴露于pH的阶跃函数变化，这将产生它们各自的传感器板上的电荷的快速变化。在一个实施方案中，第一试剂和装载试剂(或有时在本文中称作“第二试剂”或“传感器活性的”试剂)之间的pH变化是2.0pH单位或更小；在另一个实施方案中，这样的变化是1.0pH单位或更小；在另一个实施方案中，这样的变化是0.5pH单位或更小；在另一个实施方案中，这样的变化是0.1pH单位或更小。使用常规试剂，例如HCl、NaOH等，可以产生pH变化。用于基于pH的DNA测序反应的这种试剂的示例性浓度是在5至200μM或10至100μM范围内。测量在传感器板对面的微孔表面处的电荷的变化，其指示分析物(或分析物的反应所产生的副产物)的存在与否，并记录为传感器的输出信号的相关变化，例如电压水平随时间的变化。图2D显示了来自阵列上的传感器的数据，所述阵列根据Rothberg等人，美国专利公开2009/0127589来生产，其具有在图10、11A、和19中所述的传感器布局、间距(9μm)、和平面图。给与第一传感器相对应的微孔装载5.9μm直径珠子(其连接有模板、引物和聚合酶)，且与第二传感器相对应的微孔是空的。当流动池中的试剂从pH7.2变成pH 8.0并在pH 8.0值维持5.4秒时，记录来自每个传感器的输出信号。曲线(270)显示了来自第一传感器(其微孔含有珠子)的输出信号的值，曲线(272)显示了来自第二传感器(其微孔是空的)的输出信号的值。两条曲线都显示了从与pH 7.2相对应的高值改变为与pH 8.0相对应的低值。但是，与携带珠子的微孔的对应信号相比，空孔的对应信号明显更快地达到低值。使用常规数据分析技术，可以容易地测定各个输出信号达到更低值的时间差Δt(274)或相当的度量。通过多种方法，包括作为等高线图或“热”图，如图3C所示，可以用图形显示阵列内含有颗粒的微孔的位置和密度。

在本发明的一个方面，可以给微孔阵列提供随机分布的待测分析物的位置。这样的产品或制品包括：(i)传感器阵列，其包括多个形成在回路支持基质中的传感器，所述阵列的每个传感器被构造成产生至少一个与在其附近的一种或多种预定的物质的浓度或存在有关的电信号；和微孔阵列，其设置在回路支持基质上，使得它的每个微孔具有在微孔阵列的表面上的开口并设置在至少一个传感器上；和(ii)多个随机地分布在微孔中的分析物，所述分析物的位置可通过它的对应的传感器所产生的输出信号来确定。在一个实施方案中，所述分析物包含颗粒，所述颗粒具有与其相连的核酸片段(诸如基因组DNA片段、cDNA片段等)的克隆群体。

流动池和输出信号收集

许多构型的流动池设计是可行的；因而，本文提供的系统和方法不依赖于特定流动池构型的使用。本发明的流动池的设计和性能规范包括、但不限于下述的：(i)使改变分析物所暴露的试剂所需的时间最小化，(ii)使顺序的试剂的混合最小化，也就是说，在顺序的试剂之间提供均匀的流锋线，(iii)提供流体在阵列上的层流和均匀的渡越时间(包括消除或最小化截留流体从而可以发生顺序流之间的混合的任意区域(诸如死体积))，(iv)提供足够的流过微孔的体积(例如，通过在微孔阵列的上方提供足够体积的流动室)，使得在微孔容积和流之间通过扩散发生有效的物质交换)，(v)使气泡形成最小化(包括减少会促进气泡形成的尖锐的拐角或边缘，控制试剂中溶解的气体，和提供可被水性试剂容易地润湿的表面)，(vi)使参比电极的放置简易化，(vii)使分析物向阵列的微孔或反应室中的装载简易化等。

在一个方面，本发明的流动池将试剂流导向微孔阵列，使得随着试剂被递送至阵列，每个微孔基本上同时暴露于基本上相同的经过微孔阵列的流动条件(包括流量、浓度等)。在提及这样的暴露时，“基本上同时”是指，与微孔暴露于任一种试剂的时间长度相比，2种顺序试剂之间的边界穿过流动室的渡越时间较小。对于有些流动池构型，在每个微孔处相同的流量是不可能的，例如具有位于流动室的对角处的入口和出口的流动池被限制为直线空间。尽管如此，一个优选的设计特征是，不同的微孔所经历的流动条件(诸如流量)的差异被流动室和它限定的流动通道最小化。如上所述，流动池可以具有多种用于实现上述性能和生产标准的设计，诸如公开在：Rothberg等人，美国专利公开2009/0127589；Rothberg等人，英国专利申请GB24611127。满足这样的设计和性能标准的本发明的流动池如图4A-4E所示。图解的设计提供了简单的生产，其中通过将具有入口和出口的组件连接至芯片或包裹的微孔阵列-传感器阵列单元上，形成流动池。在该实施方案中，流动室是当将这样的组件相组合或彼此连接时形成的内部空间。在该设计中，将入口定位在流动室的拐角处，将出口定位在对角线相对的拐角处。该设计是简单的，因为它仅需要2个生产的组件，且入口和出口的对角线定位会使截留试剂或延迟它们的渡越时间的流动室区域最小化(例如在图3A中的(301))。图3A图解了试剂的流动通道(300)，所述试剂沿着流动室的对角线轴从入口(302)至出口(304)穿过流动室。在一个实施方案中，参照这样的流动通道来定义流动室，如图3B所示。也就是说，在图4A的实施例中，使壁(410)和边界(307)(限定在下面更完整地描述的“塞住的”传感器)的形状基本上符合试剂穿过具有对角线相对的入口和出口的正方形或矩形流动室时所流经的流动通道。结果是，试剂流被限制在中央区(308)和拐角区(306)，使得试剂发生混合或形成涡流的区域不可接近。可以估测边界(307)的曲率(例如使用一部分二次方程或类似的标准曲线)，或可以使用下述可商业得到的流体动力学软件来计算它：例如，来自Dassault Systems(Concord，MA)的SolidWorks；来自FlowMaster USA，Inc.(Glenview，IL)的Flowmaster；和OpenFOAM(在环球网www.opencfd.co.uk上可得到的用于计算流体动力学的开放源代码)。在采用浮动闸chemFET作为传感器的实施方案中，优选地，在试剂不可接近区域(306)中的传感器被电连接，所以不会将假电压水平导入在传感器阵列的那些部分中产生的输出信号中。也就是说，在这样的实施方案中，传感器阵列的读出回路连续读出所有列和所有行，所以不需要专门的回路或编程来避免不可接近区域中的传感器。相反，从这样的区域中的传感器记录恒定的预定输出信号。

在本发明的上述的一个方面，通过将顺序的试剂(在本文中称作第一试剂和预定试剂)导入流动池，所述流动池以预定的方式改变阵列的传感器所感知的电荷，可以鉴别出含有分析物的反应室或微孔。如图3C所示，这样的鉴别的结果可以显示为微孔阵列(310)在流动室中的密度图谱，其中用色度(312)指示分析物在阵列微孔内的分布。在该实施方案中，色度(312)指示在整个阵列中含有分析物的微孔的局部百分比(例如100个微孔的每个不重叠区域的百分比)，除了未使用的区域(306)以外。

可以以多种方式用微孔阵列和传感器阵列装配流动池，诸如公开在：Rothberg等人，美国专利公开2009/0127589和Rothberg等人，英国专利申请GB24611127，它们通过引用并入。在图4A-4D所示的一个实施方案中，通过将流控接口部件连接至含有传感器芯片的壳体上，制备流动池。通常，将集成的微孔-传感器阵列(即，传感器芯片)安装在保护芯片的壳体或封装件中，并提供用于与其它装置连通的电接触件。将流控接口部件设计成提供试剂在其中穿过的腔或流动室(当它密封地连接至这样的封装时)。在一个方面，通过将组件粘合在一起，实现这样的连接。图4A显示了本发明流动池的组件(400)的底视图(或正面)(下面称作“直线主体”)。在图解的实施方案中，通过将组件(400)连接至含有传感器阵列的封装件上，形成完整的流动池(如图4C和4D所示)。隆起物(401)从表面(413)隆起，并在与图4C所示的芯片(430)配合时，形成椭圆形流动室(408)的壁(410)。可以将组件(400)粘合至芯片壳体(430)(下面统称为“直线接口封装件”)上以形成不透流体的密封件。图4B显示了组件或部件(400)的顶视图(或正面)(416)，其显示了入口环(418)和出口环(420)，它们允许流动池密封地连接至流控系统。入口管和出口管连接至插入环(418)和(420)中的弹性体环形部件上，使得弹性体材料形成沿着底板和环(418)和(420)的壁的密封件。可以使用将流动池连接至流控系统上的其它方式，包括其它类型的压力配合、基于卡箍的配合、螺旋配合等，它们是普通技术人员的设计选择。用简单的设计变化，可以改造组件(400)，以适应不同尺寸的芯片，如通道(422)和(424)所示。也就是说，对于图4C所示的小阵列(434)，具有在入口环(418)和出口环(420)的中心处的开口的通道，可以被这样的通道引向组件或部件(400)的中心，在阵列(430)上到达入口孔和出口孔。同样地，对于图4D所示的大阵列(436)，类似的通道(442和444)可以被引导远离组件(400)的中心，并到达阵列(436)的入口和出口。这具有提供单个基础流动池设计的优点，所述单个基础流动池设计可以与多个传感器阵列尺寸一起使用。突出部(412)和斜角(414)用于确保芯片以正确的朝向放入互补的插座或装置中，以用于产生与装置的剩余部分的流控连接和电连接。

在一个方面，本发明包括流动池部件(在图4A和4B中图解)，其用于形成与设置在直线接口封装件中的不同直线尺寸的传感器阵列的流控界面。这样的部件包括下述元件：(a)具有上面和下面的直线主体，且直线主体的形状与直线接口封装件的形状匹配，使得直线主体的下面可结合直线接口封装件，以形成传感器阵列的不透流体的外壳，其中在上面的一端设置有入口，在上面的相对端设置有出口；(b)位于直线主体内部的入口通道，所述入口通道提供从入口至不透流体的外壳的流体通道，形成位于传感器阵列的上方且在传感器阵列一端处的直线主体的下面中的入口孔；和(c)位于直线主体内部的出口通道，所述出口通道提供从出口至不透流体的外壳的流体通道，形成位于传感器阵列的上方且在所述传感器阵列的与入口孔相对的一端处的直线主体的下面中的出口孔。在一个实施方案中，所述入口与入口环同心地设置在所述上面的拐角中，且所述出口与出口环同心地设置在所述上面的与所述入口和入口环对角地相对的拐角中。在另一个实施方案中，所述入口环和出口环各自具有半径，且其中所述入口孔和所述出口孔各自分别在所述入口环和出口环的半径的垂直突出部内定位在所述直线主体的所述下面上。在另一个实施方案中，当使直线主体连接至直线接口封装件上时，形成多个不透流体的外壳，如图4E所示。

图4E图解了如何使用上面的设计概念来制做多个单独的流动池，其中使用单个大传感器阵列。流控接口部件(462)安装在壳体(未显示)上且与其密封连接，所述壳体容纳传感器阵列(450)，并限定2个流动室(451)和(453)，每个流动室具有单独的入口(分别是454和456)和单独的对角线相对的出口(分别是458和460)，它们分别连接至共同的试剂源和共同的废物管线。通过把流控接口部件(452)连接至芯片壳体上所形成的内壁(480、482、484和486)会限定穿过流动室(451)和(453)的流动通道，并防止对角区域(470、474、476、和478)接触穿过流动室的试剂。优选地，在采用浮动闸FET的实施方案中，在拐角区(470、474、476、和478)中的传感器如上所述被塞住。同样地，在中央隔离物(462)所限定的区域中或在其下面的传感器也被塞住，使得它们不产生有源传感器的输出信号噪音。

通过多种方法和材料，可以制造本发明的流动池和流控回路(下面描述)。在选择材料时应当考虑的因素包括：需要的化学惰性程度、工作条件(例如温度等)、要递送的试剂的体积、是否需要参比电压、可制造性等。对于小规模流体递送，微流控制造技术非常适用于制造本发明的流控回路，这样的技术的指导是本领域普通技术人员可容易地得到的，例如Malloy，Plastic Part Design for Injection Molding：An Introduction(Hanser Gardner Publications，1994)；Herold等人编，Lab-on-a-ChipTechnology(Vol.1)：Fabrication and Microfluidics(Caister AcademicPress，2009)；等。对于中规模和更大规模的流体递送，常规的加工技术可以用于制造可装配进本发明的流动池或流控回路中的部件。在一个方面，可以使用塑料诸如聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等来制造本发明的流动池和流控回路。

如上所述，将分析物随机地分布在阵列的微孔中，如在图5A中关于阵列部分(500)所示，其中微孔是空的(501)，或含有分析物(502)，诸如珠子。从空孔收集的输出信号可以用于减少或减去从含有分析物的微孔的传感器收集的输出信号中的噪音。空孔输出信号含有在阵列的局部区域内的所有微孔共有的信号噪音组分，使得使用常规信号处理技术，可以从空孔输出信号得到这样的共同噪音组分，并从含有分析物的微孔的输出信号中减去。换而言之，通过减去从邻近空孔的输出信号测得的噪音组分，会改善来自含有分析物的孔的输出信号。在一个方面，这样的共同噪音的测量是基于来自多个邻近空孔的输出信号的均值。如下面更完整地描述的，在DNA测序的情况下，从邻近微孔得到的信息的类型和如何使用它，可以随进行和测量的试验的性质而变化。本文使用的术语“均值”包括加权均值和均值的函数，例如，基于在微孔中发生的物理过程和化学过程的模型。在均值中使用的微孔的类型可以推广在特定用途中，其中，例如，可以分析其它微孔集合关于共同噪音的其它信息，例如，除了空孔以外，可以包括含有颗粒、但没有分析物的孔，以此类推。在一个实施方案中，可以将平均空孔噪音的时域函数转化成频域表示，且可以使用傅里叶分析(例如使用快速傅里叶变换)从来自非空孔的输出信号去除共同噪音组分。如上所述，以此方式减去的空孔信号可以是在目标微孔附近的空孔的空孔信号的均值。可以选择用于这样的计算的局部空孔的数目和位置，并以多种方式进行。用于进行这种选择的示例性方案如图5B和5C所示。在图5B中，对于每个含有分析物(504)的微孔，可以用7x7平方(505)的微孔来限定固定的区域(506)。在其它实施方案中，这样的固定的区域可以在3x3至101x101范围内或在3x3至25x25范围内变化。这样的区域的尺寸的选择取决于几种因素，包括微孔中分析物的装载程度、在一步中可用于计算的时间的量等。返回图5B，在上面的减法计算中使用来自区域(506)中的空孔的输出信号。或者，空孔区域可以由离开目标微孔的距离来确定，如图5C所示。固定的圆形区域(512)由离开目标微孔(504)的距离(510)来限定，并在上面的减法计算中使用来自完全落入区域(512)中(也就是说，在区域(508)中)的空孔的空孔信号。不需要使用在给定区域中的所有空孔信号。例如，当给微孔阵列稀少地装载分析物或颗粒时，例如装载小于25％的微孔时，在限定的区域(例如512)中的一部分空孔可以用于背景减去。在一个方面，这样的部分或子集可以是随机选择的可利用的空孔的子集。在有些情况下，可以有利地使用尽可能最少数目的空孔输出信号，以便使用于测定来自非空孔的输出信号的计算时间最小化。为测定平均空孔信号所选择的孔的面积和/或数目，可以随微孔中分析物的密度而变化。例如，根据空孔的可用性，可以选择局部区域的尺寸。如果必须测量最小N个(例如10、20、或30个)空孔输出信号以确保局部噪音的可靠代表，则可以增加局部区域例如(512)，直到存在这样的数目。在一个方面，每当阵列中95％或更少的微孔含有分析物时，使用利用固定区域的局部噪音减去。在有些实施方案中，除了空孔以外，或作为空孔的替代，可以给携带分析物的颗粒掺入不含有分析物的颗粒，并可以相对于用含有无分析物的颗粒的微孔记录的平均信号，进行背景噪音减去。

用于核酸测序的系统

在一个方面，本发明提供了用于实现无标记的DNA测序和具体的基于pH的DNA测序的方法和装置。无标记的DNA测序(包括基于pH的DNA测序)的概念，已经描述在文献中，包括通过引用并入本文的下述参考文献：Rothberg等人，美国专利公开2009/0026082；Anderson等人，Sensors and Actuators B Chem.，129：79-86(2008)；Pourmand等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，103：6466-6470(2006)；等。简而言之，在基于pH的DNA测序中，通过测量作为聚合酶-催化的延伸反应的天然副产物所产生的氢离子，测定碱基掺入。在一个实施方案中，将模板(其各自具有可操作地结合的引物和聚合酶)装载进反应室(诸如在上面引用的Rothberg等人中公开的微孔)中，然后进行重复的三磷酸脱氧核苷(dNTP)加入和洗涤的循环。在有些实施方案中，这样的模板通常作为克隆群体连接至固体支持物(诸如微粒、珠子等)上，并将这样的克隆群体装载进反应室中。例如，可以如在美国专利7,323,305(其通过引用并入)中所公开地，制备模板。本文使用的“可操作地结合”是指，引物与模板退火，使得引物的3□末端可以被聚合酶延伸，且聚合酶结合到这样的引物-模板双链体上或在其附近，使得无论何时加入dNTP，都可以发生结合和/或延伸。在循环的每个加入步骤中，只有当模板中的下一个碱基是加入的dNTP的补体时，聚合酶才会通过掺入加入的dNTP来延伸引物。如果存在一个互补的碱基，则发生一次掺入，如果存在2个互补的碱基，则发生2次掺入，如果存在3个互补的碱基，则发生3次掺入，以此类推。每次这样的掺入会释放出氢离子，释放氢离子的模板群体一起改变反应室的局部pH。氢离子的生成与模板中相邻互补碱基的数目(以及参与延伸反应的具有引物和聚合酶的模板分子的总数)单一地相关。因而，当在模板中存在许多相邻的相同的互补碱基(即同聚物区域)时，产生的氢离子的数目和引起的局部pH变化的量级与相邻的相同的互补碱基的数目成比例。(对应的输出信号有时称作“1-聚体“、“2-聚体“、“3-聚体”输出信号，以此类推)。如果模板中的下一个碱基与加入的dNTP不互补，则不发生掺入且不释放氢离子(在该情况下，输出信号有时称作“0-聚体”输出信号)。在循环的每个洗涤步骤中，使用在预定pH的未缓冲的洗涤溶液来去除前一步骤的dNTP，以便防止以后的循环中的错误掺入。通常，将4种不同的dNTP顺序地加入反应室中，使得每个反应每次暴露于4种不同的dNTP之一，诸如以下述次序：dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP，以此类推，每次暴露之后跟随着洗涤步骤。对于连接到固相支持物(680)上的具有引物结合位点(681)的模板(682)，在图6D中图解了该方法。引物(684)和DNA聚合酶(686)可操作地结合至模板(682)上。在加入(688)dNTP(显示为dATP)以后，聚合酶(686)掺入一个核苷酸，因为“T”是模板(682)中的下一个核苷酸。然后进行洗涤步骤(690)，之后加入下一个dNTP(dCTP)(692)。任选地，在加入dNTP的每个步骤以后，可以进行额外的步骤，其中用诸如腺苷三磷酸双磷酸酶等dNTP-破坏剂处理反应室，以消除该室中残留的任何残余的dNTP，它们可能在以后的循环中导致假延伸。

在一个实施方案中，使用本发明的装置，可以以下述步骤进行在图6D中例证的测序方法：(a)将多个模板核酸放入设置在传感器阵列上的多个反应室中，所述传感器阵列包括多个传感器，且每个反应室设置在至少一个传感器上并与所述至少一个传感器成传感关系，所述至少一个传感器构造成提供至少一个表示在其附近的测序反应副产物的输出信号，且其中每个模板核酸与测序引物杂交并结合至聚合酶上；(b)将已知的三磷酸核苷酸导入反应室中；(c)检测测序反应副产物对一个或多个三磷酸核苷酸在测序引物3’末端处的掺入(如果这样的一个或多个三磷酸核苷酸与模板核酸中的对应核苷酸互补)；(d)洗涤来自反应室的未掺入的三磷酸核苷酸；和(e)重复步骤(b)至(d)，直到对多个模板核酸测序完。对于其中将氢离子测量为反应副产物的实施方案，所述反应另外应当在弱缓冲条件下进行，使得最大数目的氢离子与传感器反应，且不与外来组分(例如可能具有表面缓冲容量的微孔或固体支持物)或化学组分(尤其是缓冲pH的化合物)反应。在一个实施方案中，弱缓冲允许检测所述反应室中至少±0.1的pH变化，或所述反应室中至少±0.01的pH变化。

当在与传感器阵列集成的微孔阵列中进行大量电化学反应时，几种潜在的噪音源可能影响来自传感器的输出信号，诸如Rothberg等人(上面引用的)所述。这样的噪音源包括传感器的热敏感性、流体中的电势扰动(诸如流体中的阻力噪音或热噪音、由接触参比电极的不同流体引起的参比电压变化等)和经过传感器阵列的流体中的大量变化引起的pH变化(在本文中称作“试剂变化噪音”)。在DNA测序应用中，其它的噪音源也可以源自采用的特定DNA测序化学试剂的性质。例如，由于聚合酶功能的随机行为(不完全延伸)或在特定步骤中没有完全洗涤掉所有dNTP(不适当的掺入)，可能产生噪音，例如Chen等人，国际专利公开WO/2007/098049。

如下解决传感器阵列的热敏感性：在预定温度维持传感器阵列，所述预定温度适合延伸反应，且允许测量氢离子浓度和/或pH的变化。在一个方面，这样的温度是在25℃至75℃范围内。优选地，在整个多步骤反应过程中，预定温度是恒定的。通过常规技术，例如Peltier装置等，可以调节这样的温度。在一个实施方案中，如下维持温度：控制流过流动池的试剂的温度，使得流体的流量和热容量足以去除由传感器或分析反应产生的多余的热。

如上所述，参比电压中的扰动源自多个来源，包括参比电极所接触的流体类型的变化、和来自流控系统的其它组件的噪音。例如，流控系统的其它组件可以起外来电噪音的天线的作用，所述外来电噪音例如60Hz噪音、来自电源的噪音等，它们会影响参比电压。根据本发明，提供了一种参比电极，其在整个测序工作中仅接触一类试剂，由此消除了参比电压变异性的组件。在另一个方面，可以如下减小或消除导入流控系统中的低频噪音：将参比电极电容地耦合至流控系统的其它组件上，诸如流控系统中的试剂通道的一部分，如图7B和7C所示。

当顺序的试剂流穿过传感器阵列时，可能产生另一个噪音源(即，试剂变化噪音)。这样的噪音的量级取决于几种因素，包括进行的测量的性质(例如pH、无机焦磷酸盐(PPi)、其它离子等)、试剂变化中的先导或拖尾试剂是否具有影响传感器性能的性质或组分(例如pH)和影响的量级、与要监测的反应信号相比试剂变化作用的相对量级，诸如此类。对于基于pH的DNA测序应用(例如)，pH-敏感的传感器可以响应于试剂变化而产生信号，其与由氢离子副产物产生的信号相比更大，如图6A的数据所示。在这样的应用中，不同的试剂(诸如含有不同dNTP的溶液)具有稍微不同的缓冲容量和pKa，使得在不同试剂流(例如洗涤溶液流、继之以dNTP流)的边界处，传感器记录显著的电压变化，如图2D和6A所示。图6A显示了来自DNA测序芯片的不同微孔的4个输出信号的量级，如在Rothberg等人(上面引用的)中所公开的，其采用常规的离子敏感的场效应晶体管(ISFET)传感器。曲线(606)解释了在没有试剂变化的洗涤步骤过程中来自微孔的信号。曲线(600)显示了来自含有颗粒的微孔的输出信号，所述颗粒连接有模板，其中模板上的引物已经延伸了一个核苷酸。曲线(602)是来自含有颗粒的微孔的输出信号，所述颗粒具有模板，所述模板没有延伸。区域(604)是2个输出信号((602)和(604))之间的差异，所述差异是由于氢离子在已经发生延伸的微孔中的产生。在图6B中的曲线(608)(它是曲线(600)和(602)的值之间的差异)是曲线(600)的粗输出信号的一部分，所述粗输出信号是由于在延伸反应中生成的氢离子，即目标信号。根据本发明，通过使用来自由邻近微孔产生的输出信号的信息，可以从选择的传感器的输出信号中减去局部微孔集合共有的这样的试剂变化噪音和其它噪音组分。在一个实施方案中，从来自多个邻近孔的输出信号的至少一个平均值，得到这样的邻近微孔信息。在另一个实施方案中，从空孔的输出信号，得到邻近微孔信息。在另一个实施方案中，从不发生延伸反应的非空微孔的输出信号，得到邻近微孔信息。通过减去试剂变化噪音而对粗输出信号的校正，可以在每个试剂变化以后进行(基于每个这样的变化以后计算出的均值)，或可以使用从以前的试剂变化计算出的均值，进行这样的校正，其取决于在多步骤或多循环电化学过程中均值的变化速率。例如，在一个DNA测序实施方案中，可以为循环中的每个不同的dNTP流计算均值(其中将顺序的4种不同的dNTP导入反应室中)，并用于校正来自1至5个试剂变化循环的粗输出信号。

如图2D所指出的，可以相对于来自目标微孔的信号，系统地改变来自邻近微孔的输出信号，其取决于为噪音减去选择的邻近微孔的类型。例如，在图2D中，允许检测空孔的相同现象(例如，信号延迟)也可能这样要求：如果从目标信号减去是合理的，必须转化这样的信号以补偿这种差异。例如，因为颗粒在目标微孔中的存在会扭曲与试剂变化相对应的信号(由与颗粒的化学相互作用引起的延迟和展平)，因此必须修饰空孔信号以去除由缺少颗粒和化学相互作用引起的变化，这可以使用常规数值分析容易地实现。如果邻近微孔信息被限于仅0-聚体邻孔，则这样的转化会少得多或不需要以便从目标信号减去试剂变化噪音。如上所述，邻近微孔输出信号的“均值”可以包括邻近微孔的平均输出信号的加权均值或转化，以反映选择的微孔和它的邻孔的不同的物理和化学条件。这样的过程的一个实施方案的步骤如图6C所示。选择的微孔Mi的传感器所记录的粗输出信号RSi(j)(对于时间j＝l，2..t)被读出(660)。“粗输出信号”是指，在数据分析之前记录的输出信号的值。限定邻近微孔(662)，使得邻近微孔的粗输出信号RNk(j)也可以被读出(664)。邻孔的定义可以包括从中收集邻孔信号的局部区域，例如，如关于图5A-5C所述，且这样的定义可以包括采取输出信号的邻近微孔的类型，例如空孔、具有分析物或颗粒、但是没有反应的微孔等。在一个方面，从与Mi微孔物理上和化学上类似的邻近微孔，选择邻近输出信号，除了来自要检测或测量的分析物的信号(例如pH水平)的存在以外。在读出来自邻近微孔的粗输出信号以后，计算出(666)均值A(j)，并从粗输出信号RSi(j)减去(668)，以得到减去噪音的输出信号Si(j)。

图6E图解了另一个实施方案，其使用平均邻孔信号来从目标信号去除噪音(例如由核苷酸掺入导致的pH变化)。该图显示了在4个不同时间的2个邻近微孔(631)和(641)：在导入下一试剂之前(t0)，在下一试剂暴露于微孔之后立即(t1)，在用微孔内容物平衡下一试剂过程中的时间(t2)，和在已经达到平衡以后(t3)。由这样的试剂变化引起的传感器信号的变化被描述为2个隔室模型，其中一个隔室是在微孔开口附近的区域(638)中的下一试剂(例如下一个dNTP流)，且另一个隔室是在传感器附近的微孔底部处的表面(640)。在新试剂(630)进入流动池以后，立即建立2个隔室之间的浓度差(636)，使得在具有颗粒的微孔φb(632)中和在空孔φe(634)中建立氢离子流。对于在其中发生延伸反应的具有颗粒(633)的微孔，也建立氢离子，其加入该流中。最终达到平衡(642)，氢离子流归零。本领域普通技术人员会认识到，多种替代模型和不同复杂性的模型可用于描述在微孔中发生的电化学反应的物理和化学现象。返回图6E的模型，通过简单的反应-扩散方程，可以描述延伸反应的氢离子产生和穿过具有珠子的微孔和没有珠子的微孔的流，它们导致在传感器处的氢离子浓度的变化，如下述方程所解释的：

其中αb和αe是溶剂中氢离子的扩散常数，βb和βe是反映氢离子与微孔壁和/或微孔中的颗粒或分析物的相互作用(例如缓冲)的常数。这些项的处理和微分的积分法，会产生随着Se而变化的Sb以及Sb和Se之间的差的积分。向该表达式中添加源项Iext，表示在延伸反应中产生的氢离子。

$s_b=s_{e}R+\frac{{\∫s}_e-s_b}{{\mathrm{\τ}}_b}$

$+I_{\mathrm{ext}}$

其中R＝(αeβe/αbβb)。在数字上可容易地产生Sb的曲线，用于拟合数据，以去除试剂变化噪音。图6F图解了这样的模型的数据拟合和该模型用于减去试剂变化噪音的应用。图(650)显示了来自下述微孔的传感器的输出信号(652)(“NN数据”)：在所述微孔中，当暴露于dATP和dGTP流时，发生延伸反应。曲线(654)(“模型背景”)来自试剂变化噪音的上述模型。图(656)显示了对试剂变化噪音和氢离子产生建立模型的曲线(658)。图(659)显示了在已经减去试剂变化噪音以后的输出信号(657)。

在图6D中，每个模板包括校正序列(685)，其提供对最初dNTP的导入做出响应的已知信号。优选地，校正序列(685)含有每类核苷酸中的至少一个。在一个方面，校正序列(685)的长度是4至6个核苷酸，且可以含有同聚物，或可以是非同聚的。来自邻近微孔的校正序列信息可以用于确定哪个邻近微孔含有能够延伸的模板，这又允许鉴别可以在后续的反应循环中产生0-聚体信号、1-聚体信号等的邻近微孔。来自邻近微孔的这种信号的信息，可以用于从目标输出信号中减去不希望的噪音组分。在其它实施方案中，通过考虑下述因素，可以对平均0-聚体信号建模(在本文中称作“虚拟的0-聚体”信号)：(i)在给定的循环中的邻近空孔输出信号，和(ii)颗粒和/或模板的存在对试剂变化噪音曲线的形状的影响。如在图2D中所指出的，后一种因素是延迟，其反映在含有颗粒的微孔的输出信号相对于空孔的输出信号在正时间方向的扁平化和迁移中。如指出的，这样的影响可以容易地建模，以将空孔输出信号转化成虚拟的0-聚体输出信号，后者可以用于减去试剂变化噪音。

图7A图解了一种可以用于实现基于pH的核酸测序的装置，根据Rothberg等人，美国专利公开2009/0026082。含有流控回路(702，在下面更完整地描述)的壳体(700)通过入口连接至试剂蓄池(704、706、708、710、和712)，连接至废物蓄池(720)，并通过通道(732)连接至流动池(734)，所述通道(732)将流控结点(730)连接至流动池(734)的入口(738)。通过多种方法(包括压力、泵诸如注射泵、重力进料等)，可以将试剂从蓄池(704、706、708、710、和712)驱动至流控回路(702)，并选择成受阀门(714)控制。控制系统(718)包括阀门(714)的控制器，所述控制器产生用于经由电连接(716)进行打开和关闭的信号。控制系统(718)也包括该系统的其它组件的控制器，诸如通过(722)与其相连的洗涤溶液阀门(724)。阵列控制器(719)包括流动池(734)的控制和数据获取功能和参比电极(728)。在一个工作模式中，在控制系统(718)的程序控制下，流控回路(702)将一系列选择的试剂(1、2、3、4、或5)递送至流动池(734)，从而启动和洗涤在二者之间的选择的试剂流流控回路(702)，并洗涤流动池(734)。进入流动池(734)的流体穿过出口(740)离开，并储存在废物容器(736)中。在这样的工作中，在流动池(734)中发生的反应和/或测量具有稳定的参比电压，因为流控回路(702)会给参比电极(728)和流动池(734)提供连续的(即不间断的)电解质通道，但是仅与洗涤溶液发生物理接触。

图7B和7C图解了可以用于减小导入流控系统的其它部件中的噪音的其它措施，所述噪音可能影响参比电压。在图7B中，形成废物流(754)的一部分的电极(752)被电容器(750)连接至参比电极(728)，所述电容器(750)会过滤导入废物流(754)中的低频噪音。同样地，如图7C所示，这样的电极(761、763、765、767、和769)可以安装在过程试剂(诸如试剂1至5)的流动通道上，并通过单独的电容器(分别是760、762、764、766、和768)连接至参比电极(728)上。

用于顺序试剂递送的流控回路

如上所述，在一个实施方案中，通过使用流控回路，诸如在图7A中的(702)，保持本发明的参比电极仅接触单个试剂。图8A-8C图解了流控回路的一个实施方案，其会提供参比电极的这种接触，并在平面回路结构中接纳5个输入试剂。图8A是含有流控回路(802)的透明主体或壳体(800)的顶视图，所述流控回路(802)可以包括微流控装置。壳体(800)可以由多种材料构成，所述多种材料包括金属、玻璃、陶瓷、塑料等。透明的材料包括聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等。入口(或入孔)(804、806、808、810、和812)通过通道连接至它们各自的连接槽(814)，所述连接槽(814)位于壳体(800)的底侧(显示为与入口同心的双环)，试剂从这里进入流控回路(802)。入口(804、806、808、810、和812)与通道(分别是805、807、809、811、和813)流体连通，所述通道又连接至曲线通道(分别是824、826、828、830、和832)。每个曲线通道由2条腿组成，诸如(836)和(838)，识别为在“T”连接点(835)处的曲线通道(824)，也识别为唯一曲线通道(824)。一条腿是内腿(例如(838))，其将它的各个入口连接至结点(或多用途中央口)(801)，另一条腿是外腿(例如(836))，其将它的各个入口连接至废物通道(或环)(840)。如上所述，可以选择曲线通道的内腿和外腿的横截面面积和长度，以在“T”连接点处和在结点(801)处实现希望的流平衡。穿过通道(844)，废物通道(或管道)(840)与废物口(845)流体连通，所述废物口(845)通过在主体(800)底侧上的连接槽(846)连接至废物蓄池(未显示)。结点(801)通过通道(861)与孔(860)流体连通，所述通道(861)在该实施方案是在主体(800)的外部，且用虚线来图解。在其它实施方案中，通道(861)可以形成在主体(800)中，使得不需要结点(801)和孔(860)的连接槽。孔(860)通过通道(863)连接至洗涤溶液入口(862)，在这里形成“T”连接点，并连接至连接槽(864)，所述连接槽(864)又提供了通向流动池、反应室等的导管。图8B和8C图解了使用该流控回路来向流动池分配流体的3个模式中的2个。由与每个输入试剂和与洗涤溶液关联的阀门(850)，实现工作模式。在第一个工作模式(选择的试剂阀门是打开的，所有其它试剂阀门被关闭，洗涤溶液阀门被关闭)(图8B)中，选择的试剂被递送至流动池；在第二个工作模式(选择的试剂阀门是打开的，所有其它试剂阀门被关闭，洗涤溶液阀门是打开的)(图8C)中，启动流控回路来递送选择的试剂；在第三个工作模式(所有试剂阀门被关闭，洗涤溶液阀门是打开的)(未显示)中，洗涤流控回路中的所有通道。如上所述，阀门(850)与每个入口关联，所述阀门(850)可以被打开，以允许流体穿过它各自的入口进入流控回路(802)(如关于阀门(852)所示的)，或被关闭，以阻止流体进入回路(802)(如关于除了阀门(852)以外所有阀门所示的)。在每种情况下，当入口的阀门打开且其它阀门(包括洗涤溶液阀门)被关闭时，如在图8B中关于入口(870)所示，流体穿过通道(854)流至“T”连接点(856)，在这里它被分成2个流，其中的一个被引导至废物通道(840)、然后到达废物口(845)，其中的另一个被引导至结点(801)。从结点(801)，该第二个流再次分成多个流，其中的一个穿过通道(861)离开结点(801)，然后穿过通道(863)并到达流动池，其它流则流至连接结点(801)和其它入口的每个通道，然后流至废物通道(840)和废物口(845)。所述后面的流穿过其它入口，携带从这里扩散或泄漏的任何物质，并引导它至废物口(845)。通过打开选择的试剂的阀门并同时关闭所有未选择的试剂和洗涤溶液的阀门，可以将一系列不同的试剂引导至流动池。在一个实施方案中，这样的顺序可以通过流控回路的工作模式序列来实现，诸如：洗涤，投入试剂x1，递送试剂x1，洗涤，投入试剂x2，递送试剂x2，洗涤，以此类推。试剂投入工作模式如图8C所示。像在试剂递送模式中一样，除了与选择的试剂相对应的阀门以外，所有试剂入口阀门都被关闭。但是，不同于试剂递送模式，洗涤溶液阀门是打开的，并选择选择的试剂流和洗涤溶液流的相对压力，使得洗涤溶液流动穿过通道(861)并进入结点(801)，然后它在这里穿过连通废物通道(840)的所有通道(除了连通选择的试剂入口的通道以外)离开。

定义

“扩增子”是指多核苷酸扩增反应的产物；也就是说，多核苷酸的克隆群体，所述多核苷酸可以是单链的或双链的，它们从一个或多个起始序列复制得到。一个或多个起始序列可以是相同序列的一个或多个拷贝，或它们可以是含有被扩增的共同区域的不同序列的混合物，所述共同区域例如在从样品提取的DNA片段的混合物中存在的特定外显子序列。优选地，通过扩增单个起始序列，形成扩增子。扩增子可以通过多个扩增反应来生成，所述扩增反应的产物包括一个或多个起始核酸或靶核酸的复制。在一个方面，生成扩增子的扩增反应是“模板-驱动的”，因为反应物(核苷酸或寡核苷酸)的碱基配对具有在模板多核苷酸中的补体，所述补体是建立反应产物所必需的。在一个方面，模板-驱动的反应是核酸聚合酶的引物延伸或核酸连接酶的寡核苷酸连接。这样的反应包括、但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、线性聚合酶反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增等，它们公开在通过引用并入本文的下述参考文献中：Mullis等人，美国专利4,683,195、4,965,188、4,683,202、4,800,159(PCR)；Gelfand等人，美国专利5,210,015(使用“taqman”探针的实时PCR)；Wittwer等人，美国专利6,174,670；Kacian等人，美国专利5,399,491(“NASBA”)；Lizardi，美国专利5,854,033；Aono等人，日本专利公开JP 4-262799(滚环扩增)；等。在一个方面，通过PCR，产生本发明的扩增子。本文使用的术语“扩增”是指进行扩增反应。“反应混合物”是指含有进行反应必需的所有反应物的溶液，所述反应物可以包括、但不限于：在反应过程中维持pH在选择的水平的缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。“固相扩增子”是指固相支持物(诸如颗粒或珠子)，其具有连接的核酸序列克隆群体，其已经通过诸如乳液PCR方法或类似技术来生产。

“分析物”是指目标分子或生物细胞，其直接地影响在样品保留区(诸如微孔)处的电子传感器，或通过反应的副产物间接地影响这样的电子传感器，所述反应涉及位于这样的样品保留区或反应限制区(诸如微孔)中的这样的分子或生物细胞。在一个方面，分析物是进行测序反应的核酸模板，所述测序反应又产生影响电子传感器的反应副产物，诸如氢离子。术语“分析物”也包括连接到固体支持物(诸如珠子或颗粒)上的分析物(诸如蛋白、肽、核酸等)的多个拷贝。在一个实施方案中，术语“分析物”是指核酸扩增子或固相扩增子。

“微流控装置”是指一个或多个互连的且流体连通的室、孔和管道的集成系统，并设计成单独地或与一定装置或仪器协同地实现分析反应或过程，所述一定装置或仪器会提供支持功能，诸如样品导入、流体和/或试剂驱动装置、温度控制、检测系统、数据收集和/或集成系统等。微流控装置可以另外包括阀门、泵和在内壁上的专门的功能涂层，例如以防止样品组分或反应物的吸附、促进试剂的电渗移动等。这样的装置通常制造在固体基质中或制造成固体基质，所述固体基质可以是玻璃、塑料、或其它固体聚合材料，且通常具有平面形式，以便于检测和监测样品和试剂运动，特别是通过光学或电化学方法。微流控装置的部件通常具有小于几百平方微米的横截面尺寸，且通道通常具有毛细管尺寸，例如具有约500μm至约0.1μm的最大横截面尺寸。微流控装置通常具有在1μL至几nL(例如10-100nL)范围内的容积容量。微流控装置的制造和工作是本领域众所周知的，如在通过引用并入本文中的下述参考文献中所例证的：Ramsey，美国专利6,001,229、5,858,195、6,010,607和6,033,546；Soane等人，美国专利5,126,022和6,054,034；Nelson等人，美国专利6,613,525；Maher等人，美国专利6,399,952；Ricco等人，国际专利公开WO 02/24322；Bjornson等人，国际专利公开WO 99/19717；Wilding等人，美国专利5,587,128、5,498,392；Sia等人，Electrophoresis，24：3563-3576(2003)；Unger等人，Science，288：113-116(2000)；Enzelberger等人，美国专利6,960,437。

与“反应室”互换使用的“微孔”是指“反应限制区”的特殊情况，也就是说，固体基质的物理或化学属性允许限制目标反应。反应限制区可以是特异性地结合目标分析物的基质表面的离散区域，诸如具有共价地连接在这样的表面上的寡核苷酸或抗体的离散区域。通常，反应限制区是具有界限清楚的形状和容积的穴或孔，它们生产在基质中。这后一类反应限制区在本文中称作微孔或反应室，且可以使用常规微制造技术来制造，例如公开在下述参考文献中：Doering和Nishi编，Handbook of SemiconductorManufacturing Technology，第2版(CRC Press，2007)；Saliterman，Fundamentals of BioMEMS and Medical Microdevices(SPIE Publications，2006)；Elwenspoek等人，Silicon Micromachining(Cambridge UniversityPress，2004)；等。微孔或反应室的优选构型(例如间距、形状和容积)公开在：Rothberg等人，美国专利公开2009/0127589；Rothberg等人，英国专利申请GB24611127，它们通过引用并入。微孔可以具有正方形、矩形、或八角形的横截面，且在表面上排列成直线阵列。微孔也可以具有六角形横截面，并排列成六角形阵列，与直线阵列相比，其允许在单位面积上设置更高密度的微孔。示例性的微孔构型如下：在有些实施方案中，反应室阵列包含102、103、104、105、106或107个反应室。本文使用的阵列是诸如传感器等元件或孔的平面排列。阵列可以是一维的或二维的。一维阵列是这样的阵列：其具有在第一维的一个元件列(或行)，和在第二维的多个列(或行)。在第一维和第二维中的列(或行)的数目可以相同或不同。优选地，所述阵列包括至少100,000个室。优选地，每个反应室具有高径比为约1∶1或更小的水平宽度和垂直深度。优选地，反应室之间的间距不超过约10微米。简而言之，在一个实施方案中，可以如下制造微孔阵列：在形成传感器阵列的半导体结构以后，将微孔结构施加于半导体管芯的这种结构上。也就是说，可以在管芯上直接形成微孔结构，或可以单独形成，然后固定到管芯上，任一个方案都是可接受的。为了在管芯上形成微孔结构，可以使用不同的方法。例如，整个管芯可以旋转涂布例如负性光刻胶，诸如Microchem的SU-82015或正性阻蚀胶(resist)/聚酰亚胺诸如HD Microsystems HD8820，以达到希望的微孔高度。通过在一个或多个层中以预定速率(这可以通过参考文献和生产商手册来找到，或根据经验)旋涂适当的阻蚀胶，可以达到希望的在光刻胶层中的孔高度(例如，在每孔一个像素的实例中，约3-12μm，尽管通常不限于此)。(通常根据传感器像素的侧面尺寸，选择孔高度，优选标称的1∶1-1.5∶1长宽比，高度∶宽度或直径)。或者，可以施加多层不同的光刻胶，或可以沉积另一种形式的电介质材料。不同类型的化学气相沉积也可以用于构筑适合在其中形成微孔的材料层。在一个实施方案中，在四乙基原硅酸盐(TEOS)层中形成微孔。本发明包括这样的装置，其包括至少一个反应室二维阵列，其中每个反应室连接至化学敏感的场效应晶体管(“chemFET”)，且每个反应室的体积不大于10μm3(即，1pL)。优选地，每个反应室的体积不大于0.34pL，更优选不大于0.096pL，或甚至0.012pL。反应室在顶部的横截面面积可以任选地是22、32、42、52、62、72、82、92、或102平方微米。优选地，所述阵列具有至少102、103、104、105、106、107、108、109、或更多个反应室。反应室可以电容地耦合至chemFET，且优选地电容地耦合至chemFET。

“引物”是指天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体以后，能够起核酸合成的开始点的作用，并从它的3’末端沿着模板延伸，从而形成延伸的双链体。引物的延伸通常用核酸聚合酶(诸如DNA或RNA聚合酶)来进行。加入延伸过程中的核苷酸序列，由模板多核苷酸序列决定。一般而言，用DNA聚合酶延伸引物。引物通常具有在14至40个核苷酸范围内或在18至36个核苷酸范围内的长度。引物被用于多种核酸扩增反应中，例如，使用单一引物的线性扩增反应，或采用两种或更多种引物的聚合酶链式反应。关于选择用于特定用途的引物的长度和序列的指南，是本领域普通技术人员众所周知的，如通过引用并入本文的下述参考文献所证实的：Dieffenbach编，PCR Primer：A LaboratoryManual，第2版(Cold Spring Harbor Press，New York，2003)。

Claims (11)

1.一种用于进行多步骤电化学反应的装置，所述装置包括：

在反应室中的一个或多个反应器，每个反应器连接至用于监测所述反应器中的产物的电子传感器，所述电子传感器产生与产物的浓度或存在有关的输出信号，所述输出信号依赖于参比电压；

用于将多种电解质一次一种电解质地顺序递送给所述一个或多个反应器的流控系统，所述流控系统包括多个电解质蓄池和洗涤溶液蓄池，所述多个电解质蓄池存储所述多种电解质并通过阀体流体连通到共同通道，所述共同通道在所述阀体与所述一个或多个反应器之间流体连通，所述洗涤溶液蓄池与所述共同通道经由分支通道流体连通，所述分支通道与所述共同通道在所述阀体和所述一个或多个反应器之间的连接点处连接；和

与所述分支通道内的洗涤溶液接触的参比电极，所述参比电极与反应室流体连通，所述参比电极通过从所述分支通道延伸并通过所述共同通道的流体与所述一个或多个反应器电连通，所述参比电极提供所述参比电压给每个电子传感器，且所述参比电极不接触所述多种电解质中的任何电解质。

2.如权利要求1所述的装置，其中所述一个或多个反应器是设置在chemFET传感器阵列上的微孔阵列，且其中所述流控系统包括与所述微孔流体连通的流动池，并构造成以基本上相同的流量向每个微孔递送反应物电解质。

3.如权利要求1所述的装置，其中，所述分支通道具有设置在所述洗涤溶液蓄池和与所述共同通道的所述连接点之间的洗涤溶液阀门，其中所述参比电极被设置在所述洗涤溶液阀门和所述连接点之间的所述分支通道中，使得所述参比电极与所述反应器流体连通，并使得每当所述洗涤溶液阀门被关闭且在所述分支通道内的流体是静止时，基本上没有所述多种电解质接触所述参比电极。

4.如权利要求1所述的装置，其中所述流控系统包括多个通道，所述多个通道将所述多种电解质从所述多个电解质蓄池递送至所述反应室和至少一个废物蓄池，所述多个通道中的每一个连接至与所述参比电极电容地相连的电极上。

5.一种用于对多种分析物进行分析反应的装置，所述装置包括：

传感器阵列，其包括在回路支持基质中形成的多个传感器，所述阵列的每个传感器被构造成产生至少一个与在其附近的一种或多种反应产物的浓度或存在有关的电信号；和微孔阵列，其设置在所述回路支持基质上，使得每个微孔被设置在至少一个传感器上，其中一个或多个微孔含有分析物；和

流控系统，其用于顺序地递送多种试剂和洗涤溶液给所述微孔阵列，并用于为所述传感器阵列的所述传感器提供参比电压，所述流控系统包括多个试剂蓄池和洗涤溶液蓄池，所述多个试剂蓄池存储所述多种试剂并且通过阀体流体连通至共同通道，所述共同通道在所述阀体与所述微孔阵列之间流体连通，所述洗涤溶液蓄池存储所述洗涤溶液并且经由分支通道与所述共同通道流体连通，所述分支通道在所述阀体和所述微孔阵列之间的连接点处与所述共同通道连接，所述参比电压由在所述微孔阵列上游并与所述微孔阵列连续流体连通的参比电极提供，在向所述微孔阵列顺序地递送所述多种试剂和所述洗涤溶液的过程中，所述参比电极设置在所述分支通道中并且仅接触所述洗涤溶液，所述参比电极通过所述共同通道与所述传感器阵列电连通。

6.一种用于对多种分析物进行分析反应的装置，所述装置包括：

传感器阵列，其包括形成在回路支持基质中的多个传感器，所述阵列的每个传感器包括具有浮动闸的化学敏感的场效应晶体管chemFET，所述chemFET被构造成产生至少一个与在其附近的一种或多种反应产物的浓度或存在有关的电信号；和微孔阵列，其设置在所述回路支持基质上，使得每个微孔被设置在至少一个传感器上，其中一个或多个微孔含有分析物；和

用于递送多种试剂和洗涤溶液给所述微孔阵列的流控系统，所述流控系统包括具有入口、出口和流动室的流动池，所述流动室限定试剂从所述入口至所述出口经过时所述试剂的流动通道，其中所述流动室被构造成在所述流动通道中经所述微孔的开放部分横向地递送所述试剂，且其中在所述流动通道之外的传感器的所述浮动闸被电连接并保持在共同电压，所述流控系统还包括多个试剂蓄池和洗涤溶液蓄池，所述多个试剂蓄池存储所述多种试剂并且通过阀体流体连通至共同通道，所述共同通道在所述阀体与所述流动池之间流体连通，所述洗涤溶液蓄池存储所述洗涤溶液并且经由分支通道与所述共同通道流体连通，所述分支通道在所述阀体和所述微孔阵列之间的连接点处与所述共同通道连接，参比电压由在所述流动池上游并与所述流动池连续流体连通的参比电极提供，在向所述流动池顺序地递送所述多种试剂和所述洗涤溶液的过程中，所述参比电极设置在所述分支通道中并且仅接触所述洗涤溶液，所述参比电极通过所述共同通道与所述传感器阵列电连通。

7.如权利要求6所述的装置，其中所述传感器阵列是CMOS装置，且其中通过将在所述流动通道之外的所述传感器的浮动闸形成为连续金属层来电连接所述浮动闸。

8.一种用于定位分布在多个微孔中的分析物的方法，所述方法包括下述步骤：

提供多个设置在传感器阵列上的微孔，其中每个微孔具有与流动池的流动室流体连通的开口且能够保留至少一种分析物，且其中每个微孔被设置在至少一个传感器上，所述至少一个传感器构造成响应于在其附近的试剂提供至少一个输出信号；

将所述流动室中的试剂从多种试剂中的传感器响应于它产生第一输出信号的第一试剂改变为所述多种试剂中的传感器响应于它产生第二输出信号的第二试剂，流控系统递送多种试剂给所述传感器阵列，所述流动池具有入口、出口和所述流动室，所述流动室限定试剂从所述入口至所述出口经过时所述试剂的流动通道，其中所述流动室被构造成在所述流动通道中经所述微孔的开放部分横向地递送所述试剂，所述流控系统还包括多个试剂蓄池，所述多个试剂蓄池存储所述多种试剂并且通过阀体流体连通至共同通道，所述共同通道在所述阀体与所述流动池之间流体连通，洗涤溶液蓄池存储所述洗涤溶液并且经由分支通道与所述共同通道流体连通，所述分支通道在连接点处与所述共同通道连接，参比电压由在所述流动池上游并与所述流动池连续流体连通的参比电极提供，在向所述流动池递送所述多种试剂和所述洗涤溶液的过程中，所述参比电极设置在所述分支通道中并且仅接触所述洗涤溶液，所述参比电极通过所述共同通道与所述传感器阵列电连通；和

将响应于所述改变的来自传感器的第二输出信号的时间延迟与分析物在其对应的微孔中的存在相关联。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述分析物包含颗粒。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述第一试剂是在第一pH，且所述第二试剂是在不同于所述第一pH的第二pH，且其中所述传感器中的至少一个产生与在其附近的pH有关的输出信号。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述改变步骤包括：在所述传感器中的至少一个处，使pH改变至少0.1pH单位。