KR20160068953A

KR20160068953A - 질환-유도된 돌연변이를 확인하기 위한 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR20160068953A
Application number: KR1020167012614A
Authority: KR
Inventors: 데니즈 쿠랄
Original assignee: 세븐 브릿지스 지노믹스 인크.
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2016-06-15
Also published as: CN105849279A; US11447828B2; CA2927637A1; AU2014337093B2; EP3058093B1; EP3058093A1; SG11201603039PA; US20220411881A1; AU2014337093A1; CN105849279B; US20190169695A1; US20150197815A1; WO2015058097A1; US10053736B2; EP3680347A1; EP3680347B1; JP2016533182A

Abstract

본 발명은 개체, 상이한 질환 및 상기 질환의 상이한 병기 사이의 변이를 설명하는 다차원 참조 서열 구축물을 생성시킴으로써 질환-유도된 돌연변이를 확인하기 위한 방법 및 시스템을 포함한다. 일단 구축되면, 이들 참조 서열 구축물은 질환에 걸린 것으로 의심되는 환자 또는 질환을 가졌었고 의심되는 완화 상태에 있는 환자로부터의 유전자 샘플에 대응하는 서열 판독물을 정렬하는데 사용될 수 있다. 참조 서열 구축물은 또한 질환의 유전적 진행에 대한 통찰을 제공한다.

Description

질환-유도된 돌연변이를 확인하기 위한 방법 및 시스템 {METHODS AND SYSTEMS FOR IDENTIFYING DISEASE-INDUCED MUTATIONS}

관련 출원

본 출원은 2013년 10월 18일에 출원된 미국 특허 출원 번호 61/892,670을 우선권 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 암에 의해 야기된 것과 같은 질환-유도된 돌연변이를 확인하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로 진행성 질환, 예컨대 전이성 암의 원인이 될 수 있는 돌연변이를 확인하기 위한 방법을 제공한다.

많은 질환은 환자의 유전자 서열에서의 유전성 또는 무작위 돌연변이로부터 초래된다. 추가적으로, 암과 같은 질환에서, 진행성 병기의 질환은 이환 세포의 유전자 서열에서의 새로운 변화로서 나타날 수 있다. 따라서, 질환의 유형 또는 병기를 결정하기 위해, 예를 들어 생검으로부터의 이환 세포 또는 자유롭게 순환하는 이환 세포를 서열분석하는데 관심이 증가한다. 따라서, 질환에 대해 치료를 겪은 환자는 질환 재발 및/또는 진행을 모니터링하기 위해 새로운 생검 샘플을 서열분석할 수 있다. 이러한 모니터링은 재발의 사례에서 조기 개입을 가능하게 하고, 또한 변화가 검출되지 않을 때 불필요한 치료를 피한다.

유전자 스크리닝으로 유형 결정 및 추적될 수 있는 많은 질환이 존재하지만, 암 돌연변이 스크리닝이 가장 큰 주목을 받았다. 일부 경우에, 암의 유형은 하나의 숨길 수 없는 돌연변이, 예컨대 BRCA1 때문에 즉시 확인될 수 있다. 그러나, 대부분의 경우에, 암 유형 결정은 환자로부터 여러 서열을 발견하고 분석하는 것을 수반한다. 이들 샘플이 동일한 환자에서 기원하기 때문에, 샘플은 서로 독립적이 아니라 오히려 발생상 및 구조적으로 상호관련된다. 게다가, 대부분의 경우에, 종양의 정확한 유형 결정은 다음 3개 서열에 대한 지식을 요구한다: 대상체의 건강한 서열 (신체의 비-암성 부분에서 발견된 것), 주요 암성 클론의 서열 및 부차 클론의 서열 (종종 전이성일 수 있는 것).

질환의 완전한 그림을 수득하기 위해 여러 샘플을 서열분석할 가능성은 유전자 서열분석에 있어서의 최근 진보로 인해 덜 위협적이다. 차세대 서열분석 (예를 들어, 전체-전사체 샷건 서열분석, 파이로시퀀싱, 이온 반도체 서열분석, 합성에 의한 서열분석)은 겨우 수일 이내에 전체 게놈을 포괄하는 수백만개의 판독물을 생성시킬 수 있다. 이러한 처리량을 달성하기 위해, NGS 서열분석은 함께 보다 큰 유전자 정보체, 예를 들어 염색체 또는 게놈을 구성하는 보다 작은 핵산 서열에서의 대규모 병렬화를 사용한다. 유전자 샘플에서 시작하여, 핵산 (예를 들어, DNA)이 절단되고, 증폭되며, 극한의 속도로 판독된다. 일단 판독물이 생성되면, 판독물은 콘티그로 알려져 있는 보다 긴 조립된 서열을 생성시키기 위해 컴퓨터를 사용하여 참조 게놈, 예를 들어 GRCh37에 대해 정렬된다. 차세대 서열분석기로부터의 서열 데이터는 종종 함께 표적 서열 전체를 나타내는 수백만개의 보다 짧은 서열을 포함하기 때문에, 판독물을 정렬하는 것은 복잡하고 컴퓨팅에 있어 고비용이다. 추가적으로, 무작위 서열분석 오차 (즉, 부정확한 서열분석 기계 출력)에 의해 야기되는 서열 왜곡을 최소화하기 위해, 프로빙된 서열의 각각의 부분을 다수회 (예를 들어, 2 내지 100회 또는 그 초과 횟수) 서열분석하여, 생성된 최종 정렬 및 출력 서열에 대한 임의의 무작위 서열분석 오차의 영향을 최소화한다.

일단 모든 핵산 판독물에 대응하는 모든 데이터가 수집되고, 판독물이 참조물에 대하여 정렬되고 나면, 판독물은 조립되고 참조물과 비교될 뿐만 아니라 서로 비교되어 샘플 사이의 관계가 결정된다. 이러한 분석을 위한 워크플로우는 도 1에서 그림으로 보여진다. 각각의 조립된 판독물은 전형적으로 참조물과 비교되며, 여기서 조립된 서열과 참조물 사이의 변이는 여러 허용되는 포맷 중 하나일 수 있는 변이체 파일로 알려져 있는 파일에 목록화된다. 이어서, 이들 변이체 파일은 질환 병기가 달라짐에 따라 유전 물질이 세포 사이에서 얼마나 상이하게 달라지는지를 결정하기 위해 서로 비교될 수 있다. 변이체 파일은 또한 재발 또는 질환 진행을 스크리닝하기 위해 환자로부터의 새로운 샘플과 후속 비교하기 위한 기재일 수 있다.

도 1에 도시된 워크플로우는 여러 결점을 안고 있다. 참조 서열과 환자 샘플의 서열 사이에 수백만개의 유전적 차이가 존재할 수 있기 때문에, 비-이환 조직과 이환 조직 사이의 주요 차이를 정확히 나타내는 것은 종종 매우 어렵다. 이론적으로, 이러한 문제는 이환 샘플의 서열과 비-이환 샘플의 서열을 직접적으로 비교함으로써 피할 수 있지만, 원래 정렬에 대한 참조 서열의 사용은 하류 분석을 "오염시킨다." 전형적으로, 참조물과 정렬되지 않은 환자 샘플의 특정 부분은 변이체 파일에서 그것이 실제로 동등하지 않을지라도 동등한 돌연변이로 처리된다. 게다가, 참조 서열과 환자 샘플 사이, 및 환자 샘플 자체 사이의 구조적 변이는 동일한 (또는 유사한) 돌연변이의 상이한 지수를 갖는 변이체 파일을 생성한다. 특히 재발 스크리닝의 경우에, 안정한 지수의 결여는 새로운 보다 작은 돌연변이를 확인하는 것을 어렵게 만든다.

전형적으로, 서열 정렬은 2개의 선형인 서열 정보 스트링들 (이중 하나는 표준 참조물임) 사이의 쌍별 정렬을 모으는 것에 의해 구축된다. 정렬의 예로서, 2개의 스트링 S1 (서열 15: AGCTACGTACACTACC) 및 S2 (서열 16: AGCTATCGTACTAGC)가 서로에 대하여 정렬될 수 있다. S1은 전형적으로 판독물에 대응하고, S2는 참조 서열의 일부분에 대응한다. 서로에 대해, S1 및 S2는 치환, 결실 및 삽입으로 이루어질 수 있다. 전형적으로, 상기 용어는 스트링 S1의 스트링 S2로의 변환과 관련하여 정의된다: 치환은 S2에서의 문자 또는 서열이 S1에서의 동일한 길이의 상이한 문자 또는 서열에 의해 대체되는 경우에 이루어지고, 결실은 S2에서의 문자 또는 서열이 S1의 대응하는 부문에서 "생략되는" 경우에 이루어지고, 삽입은 S2에서는 인접하고 있는 2개 위치 사이에 S1에서는 문자 또는 서열이 발생하는 경우에 이루어진다. 예를 들어, 2개 서열 S1 및 S2는 하기와 같이 정렬될 수 있다. 하기 정렬은 13개의 매치, 1개 길이의 결실, 2개 길이의 삽입 및 1개의 치환을 나타낸다:

(S1) AGCTA-CGTACACTACC (서열 15)

(S2) AGCTATCGTAC- -TAGC (서열 16)

관련 기술분야의 통상의 기술자는 서열 정렬을 위한 정확한 알고리즘 및 대략적 알고리즘이 존재한다는 것을 인지할 것이다. 정확한 알고리즘은 최고 점수화 정렬을 찾게 될 것이나, 컴퓨팅에 있어 고비용일 수 있다. 2개의 가장 널리 알려져 있는 정확한 알고리즘은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) (J Mol Biol, 48(3):443-453, 1970) 및 스미스-워터맨(Smith-Waterman) (J Mol Biol, 147(1):195-197, 1981; Adv. in Math. 20(3), 367-387, 1976)이다. 고토(Gotoh)에 의한 스미스-워터맨의 추가의 개선 (J Mol Biol, 162(3), 705-708, 1982)은 계산 시간을 O(m²n)에서 O(mn)으로 감소시키는데, 여기서 m 및 n은 비교되는 서열 크기이며, 병렬 프로세싱으로 더욱 수정될 수 있다. 생물정보학 분야에서, 이는 종종 스미스-워터맨 알고리즘으로 지칭되는 고토의 변형된 알고리즘이다. 스미스-워터맨 접근법은 병렬 컴퓨팅 자원이 보다 광범위하고 저비용으로 이용가능하게 되기 때문에, 보다 큰 참조 서열에 대하여 보다 큰 서열 세트를 정렬하는데 사용되고 있다. 예를 들어, http://aws.amazon.com에서 이용가능한 amazon.com의 클라우드 컴퓨팅 자원을 참조한다. 모든 상기 학술지 논문은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

스미스-워터맨 (SW) 알고리즘은 서열 내 염기 사이의 중첩을 보상하고 서열 사이의 갭에 벌점을 부여하는 것에 의해 선형인 서열을 정렬한다. 스미스-워터맨은 또한 보다 짧은 서열이 보다 긴 서열을 기재하는 문자 스트링에 걸쳐있을 것을 필요로 하지 않는다는 점에서 니들만-분쉬와는 상이하다. 즉, SW는 하나의 서열이 다른 서열 전체의 판독물이라고 가정하지 않는다. 추가로, SW는 스트링의 전체 길이에 걸쳐 연장되는 정렬을 찾아야 할 의무가 없기 때문에, 2개 서열 내의 어느 곳에서나 국부 정렬이 시작 및 종료될 수 있다.

SW 알고리즘은 길이 n 및 m의 2개 스트링을 나타내는 n x m 행렬 H에 대해 하기 방정식 (1)의 관점에서 용이하게 표현된다:

상기 방정식에서, s(a_i,b_j)는 매치 가산점 (a_i = b_j인 경우) 또는 미스매치 벌점 (a_i ≠ b_j인 경우)를 나타내며, 삽입 및 결실에는 각각 벌점 W_in 및 W_del이 주어진다. 대부분의 경우, 생성된 행렬은 0인 요소를 다수 갖는다. 이러한 표시는 행렬의 상위로부터 하위로, 우측으로부터 좌측으로 백트랙을 용이하게 함으로써, 정렬을 확인한다.

일단 행렬이 점수로 완전히 채워지고 나면, SW 알고리즘은 정렬을 결정하기 위한 백트랙을 수행한다. 행렬의 최대값에서 시작하여, 알고리즘은 각각의 셀에 대한 최종 최대값을 컴퓨팅하는데 3개 값 (H_i-1,j-1, H_i-1,j, 또는 H_i,j-1) 중 어느 것이 사용되었는지에 기초하여 백트랙할 것이다. 0에 도달할 경우에, 백트랙은 중단된다. 예를 들어, 선행 기술을 나타내는 것이 아니라 백트랙의 개념 및 백트랙이 판독될 때의 대응하는 국부 정렬에 대해 도시하고 있는 도 4의 B를 참조한다. 따라서, 알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 "최고 정렬"은 가능한 최소 수를 초과하는 삽입 및 결실을 함유할 수 있지만, 가능한 최대 수보다 훨씬 더 적은 치환을 함유할 것이다.

SW 또는 SW-고토로서 적용되는 경우에, 상기 기술은 동적 프로그래밍 알고리즘을 사용하여 각각 크기 m 및 n인 2개 스트링 S 및 A의 국부 서열 정렬을 수행한다. 이러한 동적 프로그래밍 기술은 매치 점수를 보존하고 연속되는 셀에 대한 재컴퓨팅을 피하기 위해 표 또는 행렬을 사용한다. 스트링의 각각의 요소는 서열의 문자에 대해 색인화될 수 있으며, 즉 S가 스트링 ATCGAA인 경우에, S[1] = A, S[4] = G 등이다. H_i,j (상기)로서 최적 정렬을 나타내는 대신에, 하기 방정식 (2)의 B[j,k]로서 최적 정렬이 나타내어질 수 있다:

최대 함수의 인수 B[j,k]는 하기 방정식 (3)-(5)에서 요약되며, 여기서 미스매치_벌점(MISMATCH_PENALTY), 매치_가산점(MATCH_BONUS), 삽입_벌점(INSERTION_PENALTY), 결실_벌점(DELETION_PENALTY) 및 개방_벌점(OPENING_PENALTY)은 모두 상수이고, 매치_가산점을 제외하고는 모두 음수이다. 매치 인수 p[j,k]는 하기 방정식 (3)으로 주어지고:

삽입 인수 i[j,k]는 하기 방정식 (4)로 주어지고:

결실 인수 d[j,k]는 하기 방정식 (5)로 주어진다:

모든 3개 인수에 있어서, 백트랙이 완료에 이르는 것을 보장하기 위해 [0,0] 요소는 0으로 설정되며, 즉 p[0,0] = i[0,0] = d[0,0] = 0이다.

점수화 파라미터는 다소 임의적이며, 컴퓨팅의 거동을 달성하도록 조정될 수 있다. DNA용 점수화 파라미터 설정의 한 예 (Huang, Chapter 3: Bio-Sequence Comparison and Alignment, ser. Curr Top Comp Mol Biol. Cambridge, Mass.: The MIT Press, 2002)는 다음일 것이다:

매치_가산점: 10

미스매치_벌점: -20

삽입_벌점: -40

개방_벌점: -10

결실_벌점: -5

상기 갭 벌점 (삽입_벌점, 개방_벌점) 사이의 관계는, 갭 개방 대가보다 더 높은 갭 삽입 벌점을 설정하는 것에 의해 갭 개방의 수를 제한하도록 도우며, 즉 갭을 함께 그룹화하는 것을 선호한다. 물론, 미스매치_벌점, 매치_가산점, 삽입_벌점, 개방_벌점 및 결실_벌점 사이의 대안적 관계가 가능하다.

상기 기재된 정렬 방법이 차세대 서열분석 기술에 의해 생성된 판독물을 조립하는데 유용하였지만, 이는 복잡하고 시간-소모적이다. 추가적으로, 이들 기술은 달라지는 질환 상태의 이환 세포 사이에 중요한 뉘앙스를 확인하는데 부적합한데, 이는 통상적인 참조물에 대해 판독물을 정렬하는 것으로 인한 불확실성이 종종 게놈에서의 작은 변화를 빠트리기 때문이다.

본 발명은 질환, 특히 암에 의해 유도되거나 그와 연관된 돌연변이를 확인하기 위한 개선된 방법 및 시스템을 제공한다. 방법은 진행성 병기의 질환과 연관된 특정 변화가 보다 덜 이환된 세포로부터 용이하게 구별되도록 하여, 돌연변이의 크기 및 위치와 질환의 진행 사이의 관계에 대한 통찰을 제공한다. 이러한 통찰은 다른 환자에서의 질환 진행을 확인하는데 사용될 수 있고, 상기 관계는 또한 질환 진행 또는 재발을 모니터링하기 위해 동일한 환자로부터 나중에 수집된 샘플을 보다 신속하고 보다 정확하게 유형 결정할 수 있게 한다.

본 발명은 새로운 서열 샘플을 질환과 관련된 다수의 서열과 동시에 비교하도록 하는 다차원 참조 서열 구축물 및 정렬 알고리즘을 사용하여, 질환 확인 및 유형 결정에 있어서 증가된 속도 및 정확도를 제공한다. 게다가, 본 발명의 참조 서열 구축물은 샘플 사이의 구조적 변이, 결실, 삽입 및 다형성을 간단한 방식으로 수용하여, 환자의 전체 염색체 또는 전체 게놈에 걸쳐 단일 구축물이 조립되게 한다. "회고" 유형 분석을 사용하여, 기재된 알고리즘은 또한 질환 진행의 다양한 병기의 서열로부터의 요소를 포함하는 다차원 공간에서 새로운 판독물을 정렬하는데 사용되어 보다 낮은 오류율을 달성하면서 서열 판독물의 보다 정확한 정렬을 제공할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 구축물은 유사한 질환 병기를 갖는 개체 또는 코호트 사이의 변이를 확인 및/또는 연구하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 삽입, 결실 및 치환을 비롯한 샘플에서의 서열 변이를 설명하는 분지점에 걸쳐있는 일련의 방향성 비순환 서열에 대해 서열 판독물을 정렬함으로써 실행된다. 종종 방향성 비순환 그래프 (DAG)로 나타내어지는 이러한 구축물은 기존의 가변 서열 파일로부터 조립될 수 있거나 또는 구축물은 시작점으로서 표준 참조물을 사용하여 신생 제작될 수 있다.

일단 상이한 이환 샘플 사이의 서열 변이를 설명하는 서열 구축물이 제작되었다면, 그러한 구축물은 동일한 개체로부터의 새로운 샘플 또는 일부 경우에 다른 개체로부터의 새로운 샘플에서 질환 위험성을 확인하는데 사용될 수 있다. 특히, 서열 구축물의 부분이 2차 정보, 예컨대 "전이성"으로 태그부착될 수 있기 때문에, 참조 게놈에 대비한 돌연변이를 알려져 있는 돌연변이의 표와 비교하는 후속 단계가 배제될 수 있다. 따라서, 그것은 단지 질환 또는 병기를 나타내는 구축물 내의 서열에 대해 정렬될 샘플을 확인하는 문제이다. 대안적으로, 돌연변이가 알려져 있지 않은 (즉 참조 서열 구축물에 나타나 있지 않은) 경우에, 정렬이 찾아질 것이며, 이에 의해 변이체는 새로운 돌연변이로 확인될 수 있다. 따라서, 이러한 반복적 과정을 사용하여, 주요 암 클론과 부차 암 클론 사이, 또는 전암성 샘플과 암성 샘플 사이의 차이를 비교 및/또는 확인하는 것이 가능하다.

본 발명은 추가적으로 본 발명의 방법을 실행하기 위한 시스템을 포함한다. 한 실시양태에서, 시스템은 복수의 서열 (즉, 핵산 서열, 아미노산 서열)을 게놈 또는 게놈의 영역에서 관찰된 변이를 나타내는 참조 서열 구축물 (예를 들어, DAG)과 비교할 수 있는 프로세서 및 기억장치의 분포 네트워크를 포함한다. 상기 시스템은 추가적으로 효율적인 정렬 알고리즘을 사용하여 핵산 판독물을 정렬함으로써 연속 서열을 생성시킬 수 있다. 참조 서열 구축물이 대단히 많은 양의 풍부한 정보를 압축하고 있기 때문에, 및 정렬 알고리즘이 매우 효율적이기 때문에, 판독물은 상업적으로 입수가능한 자원을 사용하여 전체 게놈 상에 태그부착 및 조립될 수 있다. 상기 시스템은 복수의 판독물과 참조 서열 구축물 사이의 복수의 비교를 동시에 실행하는 복수의 프로세서를 포함한다. 비교 데이터는 축적되어 건강 관리 제공자에게 제공될 수 있다. 비교가 컴퓨팅에 있어 다루기 쉽기 때문에, 서열 판독물을 분석하는 것이 더 이상 NGS 서열분석과 환자의 유전적 위험성에 대한 의미있는 논의 사이의 장애가 되지는 않을 것이다.

도 1은 서열 판독물을 참조 서열에 대해 정렬하고, 변이체 파일을 확인한 다음, 변이체 파일을 비교하여 질환 유형 또는 질환 진행과 연관된 변이를 결정하기 위한 최신 기술 방법을 도시한다.
도 2는 참조 서열 내 유전자 변이를 나타내는 방향성 비순환 그래프 (DAG)의 구축을 도시한다. 도 2a는 시작 참조 서열 및 결실의 부가를 도시한다. 도 2b는 삽입 및 SNP의 부가를 도시하며, 그에 따라 정렬에 사용되는 최종 DAG로 귀결된다.
도 3은 방향성 비순환 그래프로 나타내어지는 3개의 변이체 지명 포맷 (VCF) 등재물을 도시한다.
도 4의 A는 삽입 사례뿐만 아니라 참조 서열을 설명하는 구축물에 대하여 핵산 서열 판독물을 정렬하는 것에 대한 그림 표현을 도시한다.
도 4의 B는 핵산 서열 판독물 "ATCGAA"의 적절한 위치를 확인하는데 사용되는 행렬 및 백트랙을 도시한다.
도 5는 환자의 "정상" 게놈과 이환 샘플에 대응하는 환자의 게놈 사이의 변이에 추가로, 환자의 "정상" 게놈과 허용되는 참조물 사이의 변이를 설명하는 참조 서열 구축물을 생성시키는 워크플로우를 도시한다.
도 6은 참조 서열, 삽입에 의해 참조 서열과 상이한 비-이환 샘플, 및 암과 연관된 다형성에 의해 비-이환 샘플과 상이한 이환 샘플을 기초로 한 참조 서열 구축물을 도시한다.
도 7은 환자의 "정상" 게놈, 주요 암성 클론 및 부차 암성 클론 사이의 변이를 설명하는 참조 서열 구축물을 생성시키는 워크플로우를 도시한다. 부차 암성 클론은 전이성 질환을 유발할 수 있다.
도 8은 환자의 "정상" 게놈, 주요 암성 클론 및 여러 부차 암성 클론 사이의 변이를 설명하는 참조 서열 구축물을 생성시키는 워크플로우를 도시한다.
도 9는 환자의 "정상" 게놈, 주요 암성 클론 및 여러 부차 암성 클론 사이의 변이를 설명하는 참조 서열 구축물을 생성시키는 워크플로우를 도시한다.
도 10은 병렬 프로세싱을 위한 연상 컴퓨팅 모델을 도시한다.
도 11은 병렬 컴퓨팅의 아키텍처를 도시한다.

본 발명은 개체, 상이한 질환 및 상기 질환의 상이한 병기 사이의 변이를 설명하는 다차원 참조 서열 구축물을 생성시킴으로써 질환-유도된 돌연변이를 확인하기 위한 방법 및 시스템을 포함한다. 일단 구축되면, 이들 참조 서열 구축물은 질환에 걸린 것으로 의심되는 환자 또는 질환을 가졌었고 의심되는 완화 상태에 있는 환자로부터의 유전자 샘플에 대응하는 서열 판독물을 정렬하는데 사용될 수 있다. 정렬된 서열은 샘플의 성질, 예를 들어 전이성 성질을 갖는 것에 관한 즉각적 정보를 제공한다. 따라서, 참조 서열 구축물은 질환, 예컨대 암의 재발 또는 진행에 대해 환자를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 참조 서열 구축물은 또한 질환 사이 및/또는 질환 상태 사이의 구조적 관계를 연구하는데 사용될 수 있다. 참조 서열 구축물은 이전에 결정된 변이체 파일로부터 제작될 수 있거나 또는 참조 서열 구축물은, 예를 들어 환자에서 기원하는 샘플로부터 신생 생성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 참조 서열 구축물은 하기 기재된 바와 같은 방향성 비순환 그래프 (DAG)일 수 있으나, 참조 서열은 구축물이 정렬용으로 포맷화된다는 전제하에, 종 내 상이한 유기체의 서열의 유전적 가변성을 반영하는 임의의 대표물일 수 있다. 구축물에 나타난 유전적 가변성은 개체 내의 상이한 조직 또는 세포 사이에 존재할 수 있다. 구축물에 나타난 유전적 가변성은 상이한 개체 사이에 또는 상이한 유기체 사이에 존재할 수 있다. 구축물에 나타난 유전적 가변성은 질환의 상이한 병기에 있는 유사한 조직 또는 세포의 사이에 존재할 수 있다.

일반적으로, 참조 서열 구축물은 샘플링된 서열 사이에 동일한 부분 및 가변적인 부분을 포함할 것이다. 따라서, 상기 구축물은 동일한 서열(들)을 포함하는 위치 (즉, 일부 정규 배열에 따른 것), 및 유전적 가변성을 반영하는 대안적 서열을 포함하는 일부 위치를 갖는 것으로 생각될 수 있다. 본 출원은 추가적으로 상기 구축물 내 위치에 대한 핵산 판독물의 정렬에 기초하여 질환 또는 질환 병기를 확인하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 유전자 서열분석 및 돌연변이 스크리닝 분야에 광범위하게 적용가능하다.

참조 서열 구축물

핵산 판독물을 정렬하고 유전자형 결정하는데 단일 참조 서열을 사용하는 선행 기술 서열 정렬 방법과 달리, 본 발명은 종, 집단 내에 또는 심지어 단일 유기체 내의 상이한 세포 사이에서 유전자 서열의 가변성을 설명할 수 있는 구축물을 사용한다. 유전자 변이의 대표물은 방향성 비순환 그래프 (DAG) (상기에서 논의됨) 또는 행-칼럼 정렬 행렬로 제시될 수 있으며, 이들 구축물은 정렬 알고리즘의 파라미터가 적절하게 설정된다는 전제하에, 본 발명의 정렬 방법과 함께 사용될 수 있다 (하기에서 논의됨).

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 구축물은 방향성 비순환 그래프 (DAG), 즉 방향을 가지며 순환하지 않는 경로를 갖는 것이다. (즉, 서열 경로는 1회 초과로 참조 구축물 상의 위치를 통과할 수 없다.) DAG에서, 서열 내 유전자 변이는 대안적 노드로 나타내어진다. 상기 노드는 보존된 서열, 또는 유전자, 또는 간단히 핵산의 부문일 수 있다. 구축물을 통과하는 상이한 가능한 경로는 알려져 있는 유전자 변이를 나타낸다. DAG는 유기체의 전체 게놈에 대해 구축될 수 있거나, 또는 DAG는 게놈의 일부분, 예를 들어 염색체 또는 보다 작은 유전자 정보 분절에 대해서만 구축될 수 있다. 일부 실시양태에서, DAG는 1000개 초과의 핵산, 예를 들어 10,000개 초과의 핵산, 예를 들어 100,000개 초과의 핵산, 예를 들어 1,000,000개 초과의 핵산을 나타낸다. DAG는 종 (예를 들어, 호모 사피엔스(homo sapiens)) 또는 선택된 집단 (예를 들어, 유방암을 갖는 여성), 또는 심지어 보다 작은 하위집단, 예컨대 동일한 개체 내에서 상이한 종양 세포 사이에서의 유전자 변이를 나타낼 수 있다.

DAG 구축물의 간단한 예가 도 2에서 도시된다. 도 2a에 도시된 바와 같이, DAG는 서열 1: CATAGTACCTAGGTCTTGGAGCTAGTC로서의 도 2a에 도시된 참조 서열로 시작한다. 실제로, 참조 서열은 종종 훨씬 더 길며, 전체 게놈일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 상기 서열은 FASTA 또는 FASTQ 파일이다. (FASTQ는 차세대 서열분석기로부터 생성된 서열 데이터를 위한 디폴트 포맷이 되었음). 일부 실시양태에서, 참조 서열은 GRCh37과 같은 표준 참조물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 환자의 비-이환 세포로부터의 서열이다. 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 서열 내 각각의 문자 (또는 기호)는 실제로 뉴클레오티드 (예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드) 또는 아미노산 (예를 들어, 히스티딘, 류신, 리신 등)에 대응한다.

다음 단계에서, 도 2a의 하부 영상에 도시된 바와 같이, 변이체가 참조 서열에 부가된다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 변이체는 도면에서 선 사이에 있는 참조물로부터의 서열 "AG"의 결실, 즉 서열 2이다. 그래프 상에서, 이러한 결실은 결실 전 및 후에서 참조 서열을 노드로 절단하고, 노드를 에지와 연결하고, 또한 한 노드에서 "AG"로의 경로 및 그 다음 다른 노드로의 경로를 생성시킴으로써 나타내어진다. 따라서, 노드 사이의 한 경로는 참조 서열을 나타내는 반면, 다른 경로는 결실을 나타낸다.

실제로, 변이체는 1000 게놈스 프로젝트(Genomes Project) 웹사이트에서 찾을 수 있는 것과 같은 변이체 지명 포맷 (VCF) 파일의 등재물을 적용하는 것에 의해 DAG에 지명된다. 각각의 VCF 파일이 특정 참조 게놈에 대해 맞추어져 있기 때문에, 스트링이 어디에 위치되어야 하는지를 확인하는 것은 어렵지 않다. 실제로, 도 3에 디스플레이된 바와 같이, VCF 파일의 각각의 등재물은 참조물과 조합되어 별도의 그래프를 생성시키는 것으로 생각될 수 있다. 도 2의 VCF 등재물이 도 3의 VCF 등재물에 대응하는 것은 아님에 주목한다. 또한, 개체의 비-이환 및 이환 세포의 서열을 비교함으로써 변이체를 DAG 내로의 포함에 대해 확인하는 것이 가능하다.

도 2b로 이동하여, 특정 위치에서의 삽입 "GG"에 대응하는 제2 VCF 등재물이 첨가되어 확장된 DAG, 즉 서열 3 및 서열 4를 포함하는 것이 생성된다. 다음에, 제3 VCF 등재물이 첨가되어 참조 서열에서 초기의 SNP를 설명하는 확장된 DAG, 즉 서열 5-8을 포함하는 것이 생성될 수 있다. 따라서, 3개의 단계로, 핵산 판독물이 정렬될 수 있는 DAG가 생성되었다 (하기에서 논의됨).

실제로, DAG는 각 노드가 스트링, 일련의 모 노드 및 위치에 의해 정의되는 노드의 세트 S로서 컴퓨터 메모리 (하드 디스크, 플래시, 클라우드 메모리 등)에 나타내어진다. 상기 스트링은 노드의 "내용", 즉 서열이며; 모 노드는 그래프 내 다른 노드에 대해 노드의 위치를 정의하고; 노드의 위치는 시스템에서의 일부 정규 배열, 예를 들어 참조 게놈에 대비한 것이다. 참조 서열에 대해 그래프를 엄격하게 정의할 필요는 없지만, 그것은 출력 데이터의 조작을 보다 간단하게 만든다. 물론, S에 대한 추가의 제약은 그것이 루프를 포함할 수 없다는 것이다.

많은 실시양태에서, 노드는 도 2a 및 2b에 도시된 바와 같이 복수의 문자를 포함하지만, 노드는, 예를 들어 도 3에 도시된 바와 같이 단일 염기를 나타내는 단일 문자일 수 있다는 것이 가능하다. 노드가 문자 스트링을 나타내는 경우에, 노드 내 모든 문자는 통상의 스미스-워터맨 기술로 수행되는 바와 같이 문자-대-문자 계산보다는 오히려 단일 비교 단계로 정렬될 수 있다. 그 결과, 컴퓨팅 부담은 최신 기술 방법과 비교하여 매우 감소된다. 감소된 컴퓨팅 부담은 정렬이 보다 신속하게 보다 적은 자원으로 완결되도록 한다. 수백만개의 작은 판독물이 정렬 및 조립될 필요가 있는 차세대 서열분석에서 사용되는 경우에, 이러한 컴퓨팅 부담 감소는 의미있는 정보, 즉 유전자형을 보다 신속하게 이용가능하게 만들면서 정렬의 비용을 감소시킨다는 면에서 유형 이익을 갖는다. 치료가 환자의 유전자형에 맞추어질 경우에, 증가된 속도는 환자가 최신 기술 방법을 사용하는 것보다 더 일찍 치료 일을 시작하게 할 수 있다.

이러한 DAG 방법을 보다 큰 구조로 외삽하면, 주어진 참조 영역에 있어서 유전자 서열 내 알려져 있는 변이를 나타내는 수천개의 VCF 등재물을 혼입시키는 DAG를 구축하는 것이 가능하다. 그럼에도 불구하고, DAG가 보다 커지면서 컴퓨팅이 보다 오래 걸리기 때문에, 많은 적용분야에서 단지 서열의 일부분, 예를 들어 염색체만을 나타낼 수 있는 보다 작은 DAG가 사용된다. 다른 실시양태에서, DAG는 DAG에 의해 포괄되는 집단의 크기를 감소시키는 것, 예를 들어 유방암 내 변이를 나타내는 DAG로부터 삼중 음성 유방암 내 변이를 나타내는 DAG로 가는 것에 의해, 보다 작아질 수 있다. 대안적으로, 전형적으로 DAG의 보다 큰 부분이 샘플 사이에서 일관되도록 하는, 용이하게 확인된 유전자 마커를 기반으로 맞춤제작되는 보다 긴 DAG가 사용될 수 있다. 예를 들어, 아프리카-혈통 여성으로부터의 일련의 핵산 판독물을 정렬하는 것은, 동일한 서열에 걸쳐 인간에서 알려져 있는 모든 변이를 설명하는 DAG와 비교하여 아프리카 혈통 여성으로부터의 VCF 등재물을 사용하여 생성된 DAG에 대하여 보다 신속하게 된다. 본 발명의 DAG는 그것이 새롭게 확인된 돌연변이를 혼입시키는데 시간 경과에 따라 변형될 수 있다는 점에서 동적 구축물이라는 것을 인식하여야 한다. 추가적으로, 정렬 결과가 재귀적으로 DAG에 첨가되는 알고리즘이 또한 가능하다.

스트링-대-DAG 정렬의 경우에, 갭 삽입이 훨씬 더 많은 대가를 치름으로써 전체 서열에서 새로운 갭을 개방하는 것 보다는 서열에 대한 정렬을 선호하도록, 갭 벌점이 조정될 수 있다. 물론, (상기에서 논의된) DAG의 개선으로, 돌연변이가 DAG 내에 설명되어 있기 때문에 갭의 발생은 훨씬 더 감소되어야 한다.

정렬 알고리즘

한 실시양태에서, 방향성 비순환 그래프 (DAG)에 대하여 서열 판독물을 정렬하기 위한 알고리즘이 사용된다. 배경기술에서 표현된 알고리즘과 달리, 상기 정렬 알고리즘은 DAG (예를 들어, 참조 서열 구축물) 상의 위치에 함유되어 있는 각각의 서열에 대해 최대 점수를 확인하는 것에 의해 C_i,j의 최대값을 확인한다. 실제로, 선행 위치에서 "뒤쪽으로" 탐색하는 것에 의해, 복수의 가능한 경로에 걸친 최적 정렬을 확인하는 것이 가능하다.

본 발명의 알고리즘은 상기에서 논의된 판독물 ("스트링"으로도 알려져 있음) 및 방향성 비순환 그래프 (DAG) 상에서 수행된다. 알고리즘을 정의할 목적으로, S를 정렬되는 스트링이라 하고, D를 S가 정렬되는 방향성 비순환 그래프라 한다. 스트링 S의 요소는 1에서 시작하는 지수로 괄호화된다. 따라서, S가 스트링 ATCGAA인 경우에, S[1] = A, S[4] = G 등이다.

DAG의 경우에, 노드 서열의 각각의 문자는 별도의 요소 d로 나타내어질 것이다. d의 선행자는 하기와 같이 정의된다:

(i) d가 그의 노드 서열의 제1 문자가 아닌 경우에, 그의 노드에서 d에 선행하는 문자가 그의 (유일한) 선행자이고;

(ii) d가 그의 노드 서열의 제1 문자인 경우에, d의 노드의 모체인 임의의 노드 서열의 최종 문자가 d의 선행자이다.

모든 선행자의 세트는 다시 P[d]로 나타내어진다.

"최고" 정렬을 찾아내기 위해, 알고리즘은 S의 제1 j 요소와 d에 선행하는 (및 그것을 포함하는) DAG 부분과의 최적 정렬의 점수인 M[j,d] 값을 탐색한다. 이러한 단계는 배경기술 부문의 방정식 1에서 H_i,j를 찾는 것과 유사하다. 구체적으로, M[j,d]를 결정하는 것은 하기에서 정의되는 바와 같이 a, i, e 및 0의 최대값을 찾는 것을 수반한다:

여기서

e = P[d]에서의 p*에 대하여 max{M[j,p*] + 결실_벌점}

i = M[j-1, d] + 삽입_벌점

a = S[j]=d인 경우, P[d]에서의 p*에 대하여 max{M[j-1,p*] + 매치_점수}

S[j]≠d인 경우, P[d]에서의 p*에 대하여 max{M[j-1,p*] + 미스매치_벌점}.

상기 기재된 바와 같이, e는 S의 제1 j 문자와 d를 포함하지 않는 d 이전 DAG 부분과의 최고의 정렬 더하기 추가의 결실_벌점이다. 따라서, d가 노드 서열의 제1 문자가 아닌 경우라면, 하나의 선행자 p만이 존재하고, S의 제1 j 문자와 DAG (p 이전 및 p 포함)와의 정렬 점수는 M[j,p] + 결실_벌점과 같다. d가 그의 노드 서열의 제1 문자인 경우에, 다수의 가능한 선행자가 존재할 수 있고, 결실_벌점은 일정하기 때문에, [M[j,p*] + 결실_벌점]을 최대화하는 것은 S의 제1 j 문자와 최고의 정렬 점수를 갖는 선행자를 선택하는 것과 동일하다.

방정식 6에서, i는 스트링 S의 제1 j-1 문자와 d 이전 및 d 포함 DAG와의 정렬 더하기 삽입_벌점으로써, SW에서의 삽입 인수의 정의와 유사하다 (방정식 1 참조).

추가적으로, a는 S의 제1 j 문자와 d를 포함하지 않는 d 이전 DAG 부분과의 최고의 정렬 더하기 매치_점수 (S의 j번째 문자가 문자 d와 동일한 경우) 또는 미스매치_벌점 (S의 j번째 문자가 문자 d와 동일하지 않은 경우)이다. e에서처럼, 이것은 d가 그의 노드 서열의 제1 문자가 아닌 경우라면, 하나의 선행자, 즉 p만이 존재한다는 것을 의미한다. 그것은 a가 S의 제1 j-1 문자와 DAG (p 이전 및 p 포함)와의 정렬 점수, 즉 M[j-1,p]이며, S의 d 및 j번째 문자가 매치되는지 여부에 따라 미스매치_벌점 또는 매치_점수가 첨가된다는 것을 의미한다. d가 그의 노드 서열의 제1 문자인 경우에, 다수의 가능한 선행자가 존재할 수 있다. 이와 같은 경우, {M[j,p*] + 미스매치_벌점 또는 매치_점수}를 최대화하는 것은 S의 제1 j-1 문자와 최고의 정렬 점수를 갖는 선행자 (즉, M[j-1,p*] 인수 후보 중 최고의 것)를 선택하고, S의 d 및 j번째 문자가 매치되는지 여부에 따라 미스매치_벌점 또는 매치_점수를 첨가하는 것과 동일하다.

다시, 배경기술에서 논의된 SW 알고리즘에서와 같이, 보다 적은 갭 등을 사용한 정렬을 촉진하기 위해 벌점, 예를 들어 결실_벌점, 삽입_벌점, 매치_점수 및 미스매치_벌점이 조정될 수 있다.

상기 방정식에 기재된 바와 같이, 알고리즘은 그 요소에 대한 삽입, 결실 및 매치 점수를 계산하는 것뿐만 아니라 DAG 상의 임의의 선행 노드를 (DAG 방향의 반대로) 뒤쪽으로 탐색함으로써 최대 점수를 찾는 것에 의해서도 각각의 판독물에 대한 최대값을 찾는다. 따라서, 알고리즘은 알려져 있는 돌연변이를 함유하는 DAG를 통한 상이한 경로를 이동할 수 있다. 그래프가 방향성이기 때문에, 그래프의 방향에 반대로 움직이는 백트랙은 그래프의 기점 쪽으로 바람직한 변이체 서열을 쫓으며, 최대 정렬 점수로써 높은 확실도 안에서 가장 가능성 있는 정렬을 확인한다. 상기 방정식이 "최대"값으로 나타내어지기는 하였지만, "최대"는 예를 들어 모든 방정식에서 기호를 전환하고 최소값에 대하여 풀이하는 것을 비롯한 임의의 형태의 최적화를 포괄하고자 의도된다.

개시된 알고리즘의 실행을 도 4에 도시하며, 여기서 참조 서열인 서열 10: TTGGATATGGG 및 알려져 있는 삽입 사례인 서열 11: TTGGATCGAATTATGGG (여기서 삽입은 밑줄표시됨)을 나타내는 DAG에 대하여 서열 "ATCGAA"가 정렬된다. 도 4의 A는 DAG와 비교되는 판독물의 그림 표현을 도시하는 반면, 도 4의 B는 비교에 대응하는 실제 행렬을 도시한다. 배경기술에서 논의된 스미스-워터맨 기술과 마찬가지로, 본 발명의 알고리즘은 최고 점수를 확인하고 백트랙을 수행하여 판독물의 적절한 위치를 확인한다. 도 4의 A 및 B는 또한 본 발명이 구축물에 대하여 스트링의 실제 매치를 생성시키는 반면, 알려져 있는 방법 (예를 들어, SW)은 참조물의 잘못된 부분에 대해 스트링을 정렬하거나 또는 충분하게 높은 정렬 점수를 생성시키지 않는다는 이유로 스트링이 정렬에 포함되는 것을 거부하게 될 가능성이 보다 많아진다는 것을 강조하고 있다. 서열 판독물이 DAG에 포함되어 있지 않은 변이체를 포함하는 경우에, 정렬된 서열은 갭, 삽입 등으로 기록될 것이다.

질환 가변성을 수용하는 구축물의 제작

상기 언급된 바와 같이, 참조 서열 구축물은 기존 변이체 파일로부터 제조될 수 있거나 또는 구축물은 특정 샘플링된 서열을 참조 서열과 비교함으로써 신생 제조될 수 있다. 이러한 신생 구축의 예가 도 5에 도시되어 있다. 참조 게놈, 예를 들어 GRCh37로 시작하여, 비-암성 샘플을 서열분석하고 참조물과 비교하여 변이체의 파일을 생성시킨다. 이러한 변이체 파일을 상기 기재된 바와 같이 참조 서열 구축물, 예를 들어 DAG 내로 혼입시킨다. 변이체는 삽입, 결실, 다형성, 구조적 변이체 등을 포함할 수 있다. 이어서, 생성된 구축물을 사용하여 개체로부터의 이환 샘플로부터의 판독물을 정렬할 수 있다. 이러한 정렬 단계는, 질환 상태와 상관 가능성이 있는 "새로운" 돌연변이 (즉, 주요 클론)의 위치에 관한 즉각적 정보를 제공할 것이며, 이는 비-암성 샘플에 이미 존재하는 돌연변이와 즉시 구별된다 (후자는 이미 구축물에 포함되었기 때문). 더욱이, 주요 클론 샘플은 참조물에 대해 직접적으로 정렬되는 것이 아니라 오히려 참조 서열 구축물에 대해 정렬되기 때문에, 주요 클론 샘플의 대부분은 구축물에 대해 완전히 정렬될 것이고, 임의의 비정렬 판독물은 질환의 성질에 관한 즉각적 단서를 제공할 것이다.

상기 예를 다음 수준으로 가져가면, 비-이환 샘플과 주요 클론 샘플 사이의 변이체는 도 5에 도시된 바와 같이 새로운 참조 구축물인 "주요 클론을 갖는 참조물"에 혼입될 수 있다. 이러한 참조 구축물은 도 6에서 보다 상세히 도시된다. 도 6은 참조 서열의 구축, 및 참조물, 비-이환 서열 및 주요 클론의 혼입을 설명하기 위해 3개의 임의적 서열 (서열 12-14)을 사용한다. 서열 12는 우수한 시작점인 것으로 결정된 참조 서열의 일부분을 나타낸다. 그러나, 해당 개체는 참조 서열에 존재하지 않는 15 bp 삽입을 갖는다 (서열 13). 추가적으로, 암을 갖는 것으로 확인된 개체는 종양의 샘플이 서열분석되었다. 서열분석 시에, 종양 샘플은 삽입 내에 다형성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (서열 14). 도 6의 하부에 있는 참조 서열 구축물에 도시된 바와 같이, 이러한 구축물에 모든 3개의 서열을 설명하는 것이 가능하다.

도 6에서의 이러한 구축물은 적어도 2가지 목적에 유용하다. 첫째로, 임의의 추가의 분석 없이, 참조 서열 구축물은 거의 틀림없이 암과 연관이 없는 삽입과 별개로, 다형성과 주요 클론 사이의 관계를 보여준다. 또한, 삽입 내 다형성의 존재는, 전형적으로 동시대 암 서열분석으로 수행되는 바와 같이, 서열 14를 서열 12와 직접적으로 비교한다면 놓칠 가능성이 있다는 것을 주목하여야 한다. 둘째로, 참조 서열 구축물은 새로운 샘플이 비교될 수 있는 새로운 정렬 도구를 제공한다. 예를 들어, 삽입에 대해 부분적으로 정렬되며 다형성을 포함하는 판독물 (도시되지 않음)은 암성일 가능성이 있는 반면, 삽입에 대해 부분적으로 정렬되지만 다형성의 영역에 "GG" 대신에 "AC"를 함유하는 판독물 (도시되지 않음)은 암성이 아닐 가능성이 있다. 추가적으로, 참조 서열 구축물에 대해 정렬되지 않은 다른 돌연변이에 추가로 다형성을 함유한 새로운 판독물은, 암이 추가로 진행할 수 있으며 보다 큰 시험, 예를 들어 전신 MRI가 적절할 수 있다는 것을 시사한다.

도 6에 도시된 참조 서열 구축물은, 예를 들어 도 7에 도시된 바와 같이 확인된 부차 클론에 대응하는 보다 많은 서열의 부가 하에, 반복적으로 개선될 수 있다. 일부 경우에서 부차 클론은 전이성 세포 또는 질환의 다른 진행된 형태를 나타낼 수 있다. 상기 기재된 정렬 알고리즘을 사용하여, 부차 클론에 대응하는 서열 판독물은 돌연변이가 어디에 위치하는지를 보다 명확하게 해주는 "주요 클론을 갖는 참조물"에 대해 정렬될 수 있다. 도 6에서의 주요 클론 돌연변이의 혼입과 마찬가지로, 부차 클론 돌연변이가 또한 참조 서열 구축물에 혼입되어 또 다른 새로운 참조 서열 구축물인 "부차 클론을 갖는 참조물"을 생성시킬 수 있다. 이어서, "주요 클론을 갖는 참조물"과 마찬가지로, "부차 클론을 갖는 참조물"은 개체에서 질환의 진전에 관한 정보를 제공하며 개체 (또는 적절한 경우에, 다른 개체)로부터의 새로운 샘플을 유형 결정하는데 사용될 수 있다.

새로운 샘플을 참조 서열 구축물에 대해 정렬한 다음 후속적으로 새롭게 확인 변이체를 구축물에 첨가하여 새로운 구축물을 생성시키는 과정은 무기한으로 반복될 수 있다. 실제로, 참조 서열 구축물은 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체 상에 저장된 다변량 구축이기 때문에, 새로운 구조의 부가는 사소하다. 게다가, 이들 대단히 복잡한 참조 구축물에 대한 새로운 판독물의 정렬은 컴퓨터상 실행가능하며, 새로운 판독물을 각각의 이전 서열과 개별적으로 비교하는 것보다 훨씬 덜 힘들다. 구축물 상에서 정렬하고 개선하는 과정은 도 8에 도시된 바와 같이 병렬로 또는 도 9에 도시된 바와 같이 직렬로 수행될 수 있다. 방법이 병렬로 완결되든지 직렬로 완결되든지, 생성된 참조 서열 구축물은 동일하여야 한다. 그럼에도 불구하고 새로운 요소가 부가되는 순서에 좌우되면서 질환의 진전에 관한 상이한 정보를 과정으로부터 모을 수 있다.

병렬화 기회

스미스-워터맨-고토 알고리즘의 순차적 버전은 대규모 병렬화에 적합화되고 유의하게 변형되었다. 예를 들어, 연상 대규모 병렬성(Associative Massive Parallelism)을 사용하는 스미스-워터맨 (SWAMP)으로 지칭되는 ASC 모델이 미국 특허 공개 번호 2012/0239706에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. SWAMP (및 다른 병렬 프로세싱 시스템)를 위한 병렬화 부분은 임의의 역대각선에 따르는 값이 서로 독립적이라는 사실에서 유래한다. 따라서, 주어진 역대각선에 따르는 모든 셀은 컴퓨팅 자원을 분포시키도록 병렬로 수행될 수 있다. 상기 재귀적 방정식에서 나타난 데이터 의존성은 달성가능한 병렬화의 수준을 제한하지만, 파면 접근법을 사용함으로써 여전히 이러한 유용한 알고리즘의 속도를 증가시킬 것이다. 선 울트라 스파크(Sun Ultra SPARC)에서 워즈니악(Wozniak)에 의해 실행된 파면 접근법 (Comput Appl in the Biosciences (CABIOS), 13(2):145-150, 1997)은 특수 SIMD-유사 비디오 명령을 사용한다. 워즈니악은 SIMD 레지스터를 사용하여 마이너 대각선에 병렬인 값을 저장함으로써, 동일한 기계 상에서의 전통적인 실행에 비해 2배 속도증가를 기록하였다. 워즈니악의 예에 따르면, 코드를 병렬화하는 유사한 방식은 x86 아키텍처에 대해 설정되는 스트리밍 SIMD 확장 (SSE)을 사용하는 것이다. 인텔(Intel)에 의해 설계된 벡터-유사 연산이 소수개 (통상적으로 4, 8 또는 16개)의 값에서 한번에 단일 연산/명령을 완료한다. 많은 AMD 및 인텔 칩이 다양한 버전의 SSE를 지원하는데, 인텔은 그의 현대 칩셋을 위한 고급 벡터 확장(Advanced Vector Extension) (AVX)을 사용하여 이러한 기술을 계속 개발하여 왔다.

다른 실행에서, 로그네스(Rognes)와 시베르그(Seeberg) (Bioinformatics (Oxford, England), 16(8):699-706, 2000)는 SSE의 선행자, MMX SIMD 명령과 함께 인텔 펜티엄 프로세서를 그의 실행에 사용한다. 파얼라인(ParAlign)을 위한 로그네스와 시베르그의 작업으로부터 개발된 접근법 (Bioinformatics, 16(8):699-706, 2000)은 파면 접근법을 사용하지 않는다 (Rognes, Nuc Acids Res, 29(7):1647-52, 2001; Saebo et al., Nuc Acids Res, 33(suppl 2):W535-W539, 2005). 대신에, 그들은 질의 서열에 대해 병렬로 SIMD 레지스터를 정렬함으로써, 사전-컴퓨팅 질의-특이적 점수 행렬을 사용하여 8개의 값을 한번에 컴퓨팅한다. 이러한 방법의 추가의 상세한 설명은 본원에 참조로 포함되는 U.S. 7,917,302에서 찾아볼 수 있다. 로그네스와 시베르그가 SIMD 레지스터를 레이아웃하는 방식에서, 노스 네이버 의존성은 SSE 병렬 "벡터" 계산으로부터 획득되는 잠재적 속도증가의 3분의 1까지를 제거할 수 있었다. 이것을 극복하기 위해, 그들은 SWAT-유사 최적화를 혼입시킨다. 큰 아핀 갭 벌점에서는, 노스 네이버가 대부분의 경우 0이 될 것이다. 이것이 사실인 경우, 프로그램은 파라(Farrar)에 의해 "느린 F 평가"로 지칭되는 (Bioinformatics, 23(2):156-161, 2007) 노스 네이버의 값을 컴퓨팅하는 것을 생략할 수 있다. 로그네스와 시베르그는 방정식 1의 계산 횟수를, 그것이 특정 역치 미만인 경우 생략하는 것에 의해 감소시킴으로써, 그의 알고리즘의 속도를 증가시킬 수 있다. 문헌 [Rognes and Seeberg, Bioinformatics, 16(8):699-706, 2000]에서는 MMX/SSE 명령 및 SWAT-유사 확장을 통해 8-원 벡터를 사용함으로써, 6배 속도증가를 기록하였다.

파라에 의해 수행된 SSE 작업 (Bioinformatics, 23(2):156-161, 2007)에서는 질의 레지스터에 병렬로 SIMD 레지스터를 라인업하는데 스트리핑 또는 스트라이딩 패턴의 액세스가 사용된다. 그렇게 하는 것은 어떠한 중첩 의존성도 피한다. 다시 SWAT-유사 최적화를 혼입시키는 것 (Farrar, Bioinformatics 23(2):156-161, 2007)은 워즈니악 (CABIOS 13(2):145-150, 1997) 및 로그네스와 시베르그 (Bioinformatics (Oxford, England), 16(8):699-706, 2000) SIMD 실행에 비해 2-8배 속도증가를 달성한다. 블록 치환 행렬, 및 노던 (F) 조건문이 해당 내부 루프 밖으로 이동되는 효율적이고 독창적인 내부 루프는 중요한 최적화이다. 프로세싱을 위한 16개 8-비트 요소의 스트라이딩 메모리 패턴 액세스는 메모리 액세스 시간 역시 개선함으로써, 전체 속도증가에 기여한다.

파라 (Sequence Analysis, 2008)는 그의 작업을 소니(Sony), 도시바(Toshiba) 및 IBM에 의해 제작된 셀 프로세서로 확장하였다. 이러한 셀 프로세서는 하나의 주 코어와 8개의 부 코어를 가진다. 셀 브로드밴드 엔진(Cell Broadband Engine)은 모두 파라의 스트리핑 접근법을 사용하는 스잘코우스키(Szalkowski) 등 (BMC Res Notes 1(107), 2008)의 SWPS3 및 위라완(Wirawan) 등 (BMC Bioinformatics 9 (377) 2008)의 CBESW를 비롯한 여러 추가의 스미스-워터맨 실행의 개발 플랫폼이었다. 루드니키(Rudnicki) 등 (Fund Inform. 96, 181-194, 2009)은 PS3을 사용하여 다수의 데이터베이스 서열에 걸친 병렬화를 사용하는 방법을 개발하였다.

로그네스 (BMC Bioinformatics 12 (221), 2011)는 또한 다수의 데이터베이스 서열을 병렬로 프로세싱하는 SWIPE로 지칭되는 다중-연결 접근법을 개발하였다. 초점은 "일반 CPU"에서 SIMD 접근법을 사용하는 것이었다. 조립 병렬화 스플릿을 사용하는 이러한 조사에서, 병렬로 다수의 데이터베이스 서열을 사용하는 작업은 류(Liu) 등 (BMC Res Notes 2(73), 2009) 및 리고우스키(Ligowski)와 루드니키(Rudnicki) (Eight Annual International Workshop on High Performance Computational Biology, Rome, 2009)의 CUDASW에 기재되어 있는 그래픽 프로세서 장치 (GPU)-기반 툴과 유사하다. 류 등 (BMC Res Notes 3(93), 2010) 및 리고우스키 등 (GPU Computing Gems, Emerald Edition, Morgan Kaufmann, 155-157, 2011)에 의한 CUDASW++2.0을 사용하는 GPU 작업의 다른 실행도 존재하였다.

다른 변형에서는, 소규모 벡터 병렬화 (8, 16 또는 32-원 병렬화)가 병렬로 다수의 서열을 정렬하는 GPU 실행을 통해 접근가능한 계산을 하는데 사용될 수 있다. 이론적인 최고 계산 속도증가는 최적인 m배이다. 96 프로세싱 요소를 사용한 클리어스피드(ClearSpeed) 실행의 96배 속도증가가 이론적 속도증가를 확증해준다.

병렬 컴퓨팅 모델

스미스-워터맨 서열 정렬을 개발하고 확장하는데 사용된 주 병렬 모델은 연상 컴퓨팅(ASsociative Computing) (ASC) (Potter et al., Computer, 27(11):19-25, 1994)이다. 스미스-워터맨 알고리즘의 효율적인 병렬 버전이 본원에 기재된다. 본 부문에서는 이러한 모델 및 하나의 다른 모델이 상세히 기재된다.

일부 관련 용어가 본원에 정의된다. 컴퓨터 아키텍처의 플린 분류법(Flynn's Taxonomy)으로부터의 두 가지 관심 용어는 MIMD 및 SIMD로, 두 가지 상이한 병렬 컴퓨팅 모델이다. 다중-명령 다중-데이터 (MIMD) 모델로 분류되는 컴퓨터 클러스터는 극히 대규모인 정렬에서의 메모리 한계를 극복하는 개념-증명으로 사용된다. 부문 8은 MIMD 모델의 용법을 기재한다. ASC로 알려져 있는 확장된 데이터-병렬 단일-명령 다중-데이터 (SIMD) 모델이 또한 기재된다.

다중 명령 다중 데이터 (MIMD)

다중-데이터 다중-명령 모델 또는 MIMD 모델은 현재 이용가능한 대부분의 병렬 시스템을 기재하고 있으며, 현재 인기 있는 컴퓨터 클러스터를 포함하고 있다. MIMD 프로세서는 완전-독립형 중앙 프로세싱 장치 (CPU)를 가지고 있으며, 각각 그 자체의 로컬 메모리를 포함한다 (Quinn, Parallel Computing: Theory and Practice, 2nd ed., New York: McGraw-Hill, 1994). SIMD 모델과 달리, 각각의 MIMD 프로세서는 비동기로 그 자체의 프로그램을 저장 및 실행한다. MIMD 프로세서는 통신을 가능하게 하는 네트워크를 통해 연결되지만, 사용되는 네트워크는 기계 (클러스터 노드) 사이의 이더넷(Ethernet), 미리넷(Myrinet) 및 인피니밴드(InfiniBand) 연결에 걸쳐 광범위하게 달라질 수 있다. 통신은 단일 장치의 외부로 나가는 SIMD에 비해 훨씬 더 느슨한 통신 구조를 사용하는 경향이 있다. 데이터는 개별 프로세서에 의해 실행되는 그의 개별 프로그램의 제어 하에 비동기로 네트워크를 따라 이동된다. 전형적으로, 통신은 메시지-전달을 지원하는 여러 상이한 병렬 언어 중 하나에 의해 처리된다. 이것을 위한 매우 통상적인 라이브러리는 메시지 전달 인터페이스 (MPI)로 알려져 있다. "SIMD-유사" 방식의 통신이 가능하지만, 데이터 이동은 비동기가 될 것이다. MIMD에 의한 병렬 컴퓨팅은 통상적으로 프로세서에 의해 실행되는 다양한 태스크가 고도로 독립적이지 않은 한 (즉 소위 "당황스럽게도 병렬" 또는 "즐겁게도 병렬" 문제), 광범위한 통신 및 빈번한 동기화를 필요로 한다. 부문 8에서 제시되는 작업은 인피니밴드를 통해 연결되는 AMD 오페론 클러스터를 사용한다.

SIMD와 달리, 메시지-전달에 요구되는 최악-사례 시간은 예측하기가 어렵거나 불가능하다. 전형적으로, MIMD 소프트웨어에 있어서의 메시지-전달 실행 시간은 평균 사례 추정치를 사용하여 결정되는데, 종종 그것은 SIMD에서 전형적인 최악 사례 이론 평가에 의하기보다는 시험에 의해 결정된다. MIMD 소프트웨어에 있어서의 최악 사례가 종종 매우 좋지 않고 드물게 일어나기 때문에, 평균 사례 추정치가 훨씬 더 유용하다. 결과적으로, 특정한 문제에 대한 MIMD에 요구되는 통신 시간은 SIMD에 있어서의 것에 비해 상당히 더 높을 수 있으며, 통상적으로 그러하다. 이것는 필요한 프로세서간 통신의 수를 최소화하고 프로세서 통신 사이의 시간량을 최대화하려는 MIMD 프로그래밍 (특히 메시지-전달이 사용되는 경우)에서의 중요한 목표로 이어진다. 이것은 그래픽 프로세서 또는 GPU를 사용하는 것과 같은 단일 카드 가속 수준에서도 그러하다.

데이터-병렬 프로그래밍은 MIMD 프로그래밍에 중요한 기술이기도 하지만, 본원에서는 모든 태스크가 상이한 데이터에서 동일한 연산을 수행하며, 다양한 임계점에서만 동기화된다. MIMD 시스템을 위한 대부분의 알고리즘은 단일-프로그램 다중-데이터 (SPMD) 프로그래밍 패러다임으로 기록된다. 각각의 프로세서는 동일한 프로그램의 그 자체 사본을 가지고 있어서, 그의 로컬 데이터 상에서 그 프로세서 또는 코어에 특이적인 코드 부문을 실행한다. SPMD 패러다임의 인기는 그것이 상이한 프로세서에 걸쳐 동시에 실행되게 될 다수의 상이한 프로그램을 기록하기가 상당히 어려우면서도, 여전히 단일 문제를 해결하는데 있어서 협력가능하는 사실에서 유래한다. 메모리-집약적이되 컴퓨팅-집약적이 아닌 문제에 사용되는 또 다른 접근법은 부문 8에 제시되어 있는 작업을 사용하여 점보멤(JumboMem)에 의해 수행되는 바와 같이, 가상 메모리 서버를 생성시키는 것이다. 이것은 그의 기본적인 실행에 MPI를 사용한다.

단일 명령 다중 데이터 (SIMD)

SIMD 모델은 PE로 지칭되는 다수의 간단한 산술 프로세싱 요소로 이루어진다. 각 PE는 패치하여 저장할 수 있는 그 자체의 로컬 메모리를 가지나, 프로그램을 컴파일 또는 실행하는 능력은 가지고 있지 않다. 본원에 사용된 용어 "병렬 메모리"는 집합적으로 컴퓨팅 시스템 중 로컬 메모리를 지칭한다. 예를 들어, 병렬 메모리는 SIMD 컴퓨터 시스템 중 로컬 메모리의 집합 (예를 들어, PE의 로컬 메모리), MIMD 컴퓨터 시스템 중 프로세서의 로컬 메모리 집합 (예를 들어, 중앙 프로세싱 장치의 로컬 메모리) 등일 수 있다. 프로그램의 컴파일링 및 실행은 제어 장치 (또는 프론트 엔드)로 지칭되는 프로세서에 의해 처리된다 (Quinn, Parallel Computing: Theory and Practice, 2nd ed., New York: McGraw-Hill, 1994). 제어 장치는 통상적으로 버스에 의해 모든 PE에 연결된다.

모든 활성인 PE는 제어 장치로부터 수신된 프로그램 명령을 락스텝으로 동기 실행한다. "어떠한 시간 단위에서도, 단일 연산은 각각 상이한 데이터를 조작하는 다중 프로세싱 장치 상에서 동일한 실행 상태에 있다" (Quinn, Parallel Computing: Theory and Practice, 2nd ed., New York: McGraw-Hill, 1994, page 79). 동일한 명령이 모든 활성인 PE에 의해 병렬로 동시에 실행되기는 하지만, 일부 PE는 임의의 특정한 명령을 생략하도록 허용될 수 있다 (Baker, SIMD and MASC: Course notes from CS 6/73301: Parallel and Distributed Computing-power point slides, (2004)2004). 이것은 통상적으로 일부 PE가 이프(if) 명령을 실행하며 나머지 PE가 다른 부분을 실행하는 "이프-엘스(if-else)" 분지 구조를 사용하여 수행된다. 이러한 모델은 영상 프로세싱 및 행렬 연산과 같이 기껏해야 소수의 동시에 일어날 수 있는 이프-엘스 분지 구조를 갖는 특성상 "데이터-병렬"인 문제에 이상적이다.

데이터는 제어 장치에 의해 모든 활성인 PE로 브로드캐스트될 수 있고, 제어 장치는 또한 제어 장치와 PE 사이의 연결 (통상적으로 버스)을 사용하여 특정한 PE로부터 데이터 값을 획득할 수 있다. 추가적으로, PE 세트는 PE 사이의 병렬 데이터 이동을 제공하는 선형 어레이, 2-D 메시 또는 하이퍼큐브와 같은 상호연결 네트워크에 의해 연결된다. 데이터는 락스텝으로 데이터 이동을 비롯한 명령을 실행하는 PE에 의해 동기 병렬 방식으로 상기 네트워크를 통해 이동된다. PE로 명령을 브로드캐스트하는 것은 제어 장치이다. 특히, SIMD 네트워크는 오늘날 대부분의 병렬 컴퓨터에 의해 사용되는 메시지-전달 패러다임을 사용하지 않는다. 이의 중요한 이점은 SIMD 네트워크 통신이 극히 효율적이고, 통신에 요구되는 최대 시간이 그 특정한 통신을 제어하는 알고리즘의 최악-사례 시간에 의해 결정될 수 있다는 것이다.

이러한 부문의 나머지는 확장된 SIMD ASC 모델을 기재하는데 할애된다. ASC는 이러한 논의를 위한 알고리즘 설계 및 개발의 중심에 있다.

연상 컴퓨팅 모델

연상 컴퓨팅 (ASC) 모델은 굳이어 에어로스페이스(Goodyear Aerospace)에서 닥터 케네스 배처(Kenneth Batcher)에 의해 설계된 STARAN 연상 SIMD 컴퓨터, 및 그의 집중 네이비(Navy)-이용 계승자인 ASPRO를 기반으로 하는 확장된 SIMD이다.

켄트 주립 대학교 컴퓨터 과학부에서 개발된 ASC는 연상 컴퓨팅을 위한 알고리즘 모델이다 (Potter et al., Computer, 27(11):19-25, 1994) (Potter, Associative Computing: A Programming Paradigm for Massively Parallel Computers, Plenum Publishing, 1992). ASC 모델은 굳이어 에어로스페이스에 의해 구축된 연상 프로세서인 STARAN 및 MPP 상에서의 작업으로부터 성장하였다. 그것이 현재는 하드웨어에서 지원되지 않고 있지만, 이러한 모델을 위한 컴퓨터를 효율적으로 모의하고 또한 설계하기 위한 연구 노력이 현재 이루어지고 있다.

확장된 SIMD 모델처럼, ASC는 동기 데이터-병렬 프로그래밍을 사용함으로써, 다중-태스킹 및 비동기 점-대-점 통신 루팅 둘 다를 피한다. 다중-태스킹은 불필요한데, 어떠한 시간에도 단지 하나의 태스크만이 실행되며, 이러한 태스크의 다수 예는 모든 활성인 프로세싱 요소 (PE)에서 락스텝으로 실행되기 때문이다. SIMD 프로그래머와 마찬가지로 ASC는 MPI 및 다른 MIMD 클러스터 패러다임에서 명시적으로 처리되어야 하는 문제인 부하 균형화, 동기화 및 동적 태스크 스케줄링에 수반된 문제를 피한다.

도 10은 ASC 컴퓨터의 개념 모델을 도시한다. 명령 스트림 (IS)으로도 알려져 있는 단일 제어 장치, 및 각각 그 자체의 로컬 메모리를 갖는 다수의 프로세싱 요소 (PE)가 존재한다. 제어 장치 및 PE 어레이는 브로드캐스트/리덕션 네트워크를 통해 연결되고, PE는 PE 데이터 상호연결 네트워크를 통해 함께 연결된다.

도 10에서 보이는 바와 같이, PE는 그 자체의 로컬 메모리에 위치되어 있는 데이터에 대한 액세스를 갖는다. 데이터는 제자리에서 유지되며, 응답하는 (활성인) PE는 그의 로컬 데이터를 병렬로 프로세싱한다. 연상이라는 용어의 언급은 메모리 주소 이외의 콘텐트에 의해 데이터를 위치시키기 위한 탐색의 용도에 관한 것이다. ASC 모델은 연상 메모리를 사용하지 않는데, 대신 일반 사이클이 탐색-프로세싱-추출인 연상 프로세서이다. 모델의 개관은 문헌 [Potter et al., Computer, 27(11):19-25, 1994]에서 이용가능하다.

알고리즘의 표 특성은 그 자체를 ASC 데이터 구조의 자연적인 표 구조로 인하여 ASC를 사용하는 컴퓨팅에 적합하게 한다. 노스 및 노스웨스트 네이버의 데이터의 락스텝 이동을 위한 PE 상호연결 네트워크에 걸친 고도로 효율적인 통신, 및 병렬 컴퓨팅에 걸친 탐색 및 최대값에 있어서의 빠르고 일정한 시간 연상 함수는 SWAMP에 의해 잘 이용되고 있다.

연상 연산은 ASC 모델에 의해 요구되는 추가의 하드웨어로 인해 일정한 시간 내에 실행된다 (Jin et al., 15th International Parallel and Distributed Processing Symposium (IPDPS'01) Workshops, San Francisco, p. 193, 2001). 이들 연산은 어떠한 SIMD-유사 기계에 의해서도 효율적으로 (그러나 덜 신속하게) 수행될 수 있으며, 여러 SIMD 하드웨어 플랫폼 상에서 효율적으로 실행되도록 성공적으로 적합화되어 있다 (Yuan et al., Parallel and Distributed Computing Systems (PDCS), Cambridge, M A, 2009; Trahan et al., J. of Parallel and Distributed Computing (JPDC), 2009). 따라서, SWAMP 및 다른 ASC 알고리즘은 벡터 기계를 비롯한 SIMD와 밀접하게 관련되어 있는 다른 시스템 상에서 효율적으로 실행될 수 있는 바, 이것이 상기 모델이 패러다임으로 사용되는 이유이다.

제어 장치는 프로그램 명령을 패치하여 디코딩하고, 제어 신호를 PE로 브로드캐스트한다. PE는 제어 장치의 지시 하에 그 자체의 로컬 데이터를 사용하여 이들 명령을 실행한다. 모든 PE는 암묵적으로 명령 사이를 동기화하면서 락스텝 방식으로 명령을 실행한다. ASC는 연상 탐색, 최대/최소 탐색 및 응답자 선택/검출의 여러 관련 고속 포괄 연산을 가진다. 이들은 하기 부문에서 기재된다.

연상 함수

SWAMP 알고리즘과 관련된 함수는 하기에 논의한다. 연상 탐색

ASC 알고리즘에서의 기본 연산은 연상 탐색이다. 연상 탐색은 로컬 데이터가 주어진 탐색 키와 매치되는 PE를 동시에 위치시킨다. 매칭 데이터를 갖는 PE는 응답자로 지칭되고, 비-매칭 데이터를 갖는 것은 비-응답자로 지칭된다. 탐색을 수행한 후에, 알고리즘은 이어서 비-응답자를 불능화하는 것에 의해 응답자에만 영향을 주도록 추가의 프로세싱을 제한할 수 있다 (또는 그 반대도 마찬가지임). 추가의 탐색을 수행하는 것은 응답자의 세트를 추가로 정밀화할 수 있다. 연상 탐색은 대각선 내 병렬 작용 내에서 어느 PE가 활성인지를 선택함에 있어서 SWAMP+에 의해 집중적으로 이용된다.

최대/최소 탐색

각 PE가 표준 비교 연산자 (동일, 미만 등)를 사용하여 탐색 키에 대하여 그의 로컬 데이터를 비교하는 단순 탐색 이외에도, 연상 컴퓨터는 또한 응답자 세트를 결정하기 위해 전체 PE 어레이로부터의 데이터가 함께 조합되는 포괄 탐색을 수행할 수도 있다. 가장 통상적인 유형의 포괄 탐색은 응답자가, 데이터가 전체 PE 어레이에 걸쳐 최대값 또는 최소값의 PE인 최대/최소 탐색이다. 최대값은 지금까지 계산된 최고값을 추적하기 위해 그것이 프로세싱하는 모든 대각선에서 SWAMP+에 의해 사용된다. 최대 탐색의 사용은 논리 병렬 작용에서 1회, 정렬마다 m+n회로 빈번하게 이루어진다.

응답자 선택/검출

연상 탐색은 다수의 응답자로 이어질 수 있으며, 연상 알고리즘은 하기 3개의 상이한 모드 중 1개로 그 응답자를 프로세싱할 수 있다: 병렬, 순차적 또는 단일 선택. 병렬 응답자 프로세싱은 각각의 응답자에서 동일한 연산 세트를 동시에 수행한다. 순차적 응답자 프로세싱은 각각의 응답자를 개별적으로 선택함으로써, 각각의 응답자에 대해 상이한 연산 세트를 가능하게 한다. 단일 응답자 선택 (또한 하나뽑기(pickOne)로 알려져 있음)은 프로세싱을 적용받기 위한 하나의 임의적으로 선택되는 응답자를 선택한다. 다수의 응답자에 추가로, 연상 탐색이 응답자로 이어지지 않는 것 또한 가능하다. 이러한 경우를 처리하기 위해, ASC 모델은 탐색에 대한 임의의 응답자가 있었는지를 검출하고, 그 경우 (임의응답자(anyResponder)로 알려져 있음) 별도의 작용 세트를 수행할 수 있다. SWAMP에서는, 정렬될 문자를 함유하는 다수의 응답자가 선택되어, 상기에 언급된 연상 탐색에 기초하여 병렬로 프로세싱된다. 단일 응답자 선택은 최대/최소 탐색을 사용하였을 때 정확히 동일한 최대값을 갖는 다수의 값이 존재하는 경우에 및 그 때에 이루어진다.

PE 상호연결 네트워크

대부분의 연상 프로세서는 어레이 내에서의 병렬 데이터 이동을 가능하게 하는 일부 유형의 PE 상호연결 네트워크를 포함한다. ASC 모델 자체는 어떠한 특정한 상호연결 네트워크도 특정하지 않는데, 사실 많은 유용한 연상 알고리즘은 그것을 필요로 하지 않는다. 전형적으로, 연상 프로세서는 1D 선형 어레이 또는 2D 메시와 같은 간단한 네트워크를 실행한다. 이들 네트워크는 실행하기가 간단하며, 데이터가 동기 방식으로 신속하게 전달되는 것을 가능하게 한다. 예를 들어 1D 선형 어레이이면, SWAMP 알고리즘에서의 PE 사이의 명시적인 통신에 충분하다.

병렬 컴퓨팅 시스템

일반화된 병렬 프로세싱 아키텍처가 도 11에 도시된다. 각각의 구성요소가 직접 연결을 갖는 것으로 도시되어 있기는 하지만, 다양한 요소가 지리적으로는 이격되어 있되 네트워크, 예를 들어 인터넷을 통해 연결되어 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 혼성 구성이 가능하기는 하지만, 병렬 컴퓨터에서의 주 메모리는 전형적으로 단일 어드레스 공간의 모든 프로세싱 요소 사이에 공유되어 있거나, 또는 분포되어 있다, 즉 각각의 프로세싱 요소가 그 자체의 로컬 어드레스 공간을 갖는다. (분포 메모리는 메모리가 논리적으로 분포되어 있다는 사실을 지칭하지만, 종종 그것이 물리적으로 분포되어 있다는 것을 암시하기도 한다.) 분포 공유된 메모리 및 메모리 가상화는 프로세싱 요소가 그 자체의 로컬 메모리 및 비-로컬 프로세서 상의 메모리에 대한 액세스를 갖는 두 가지 접근법을 조합한다. 로컬 메모리에 대한 액세스는 전형적으로 비-로컬 메모리에 대한 액세스보다 더 빠르다.

주 메모리의 각각의 요소가 동일한 대기시간 및 밴드폭으로 액세스될 수 있는 컴퓨터 아키텍처는 균일 메모리 액세스(Uniform Memory Access) (UMA) 시스템으로 알려져 있다. 전형적으로, 공유 메모리 시스템에 의해서만 달성될 수 있는 것이며, 여기서 메모리는 물리적으로 분포되어 있지 않다. 이러한 특성을 갖지 않는 시스템은 비-균일 메모리 액세스(Non-Uniform Memory Access) (NUMA) 아키텍처로 알려져 있다. 분포 메모리 시스템은 비-균일 메모리 액세스를 갖는다.

프로세서-프로세서 및 프로세서-메모리 통신은 별형, 고리형, 트리, 하이퍼큐브, 팻 하이퍼큐브 (노드에 1개 초과의 프로세서를 갖는 하이퍼큐브) 또는 n-차원 메시를 비롯한 무수한 위상의 공유된 (다포트화 또는 다중화) 메모리, 크로스바 스위치, 공유된 버스 또는 상호연결 네트워크를 비롯한 여러 방식으로 하드웨어에서 실행될 수 있다.

상호연결된 네트워크를 기반으로 하는 병렬 컴퓨터는 직접 연결되어 있지 않은 노드 사이의 메시지 전달을 가능하게 하는 루팅을 혼입시켜야 한다. 프로세서 사이의 통신에 사용되는 매체는 대형 다중프로세서 기계에서 계층형일 가능성이 있다. 이러한 자원은 전용 용도로의 구입을 위해 상업적으로 입수가능하거나, 또는 이들 자원은 "클라우드", 예를 들어 아마존 클라우드 컴퓨팅(Amazon Cloud Computing)을 통해 액세스될 수 있다.

컴퓨터는 일반적으로 버스를 통해 메모리에 커플링되는 프로세서를 포함한다. 메모리는 RAM 또는 ROM을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 시스템이 본원에 기재된 함수를 수행하도록 실행가능한 명령을 저장하는 적어도 하나의 유형 비-일시적 매체를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명의 방법의 수행에 필요한 것으로 또는 가장 적합한 것으로 인식하고 있는 바와 같이, 본 발명의 시스템은 버스를 통해 서로 통신하는 하나 이상의 프로세서 (예를 들어, 중앙 프로세싱 장치 (CPU), 그래픽 프로세싱 장치 (GPU) 등), 컴퓨터-판독가능 저장 장치 (예를 들어, 주 메모리, 정적 메모리 등), 또는 이들의 조합을 포함한다.

프로세서는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 프로세서, 예컨대 인텔 (캘리포니아주 산타 클라라)에 의해 제온(XEON) E7이라는 상표명으로 판매되고 있는 프로세서, 또는 AMD (캘리포니아주 서니베일)에 의해 옵테론(OPTERON) 6200이라는 상표명으로 판매되고 있는 프로세서일 수 있다.

메모리는 컴퓨터-판독가능 저장 장치를 지칭할 수 있으며, 하나 이상의 명령 (예를 들어, 본원에서 발견되는 임의의 방법론 또는 함수를 구현하는 소프트웨어), 데이터 (예를 들어, 임의의 유형 물리적 대상, 예컨대 환자의 염색체에서 발견되는 유전자 서열을 구현하는 것), 또는 이들 둘 다의 세트가 저장되는 임의의 기계-판독가능 매체를 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서는 상기 컴퓨터-판독가능 저장 장치가 단일 매체일 수도 있지만, 용어 "컴퓨터-판독가능 저장 장치"는 하나 이상의 명령 또는 데이터 세트를 저장하는 단일 매체 또는 다중 매체 (예를 들어, 중앙화되거나 분포된 데이터베이스, 및/또는 연관 캐시 및 서버)를 포함하는 것으로 여겨져야 한다. 따라서, 용어 "컴퓨터-판독가능 저장 장치"는 비제한적으로 고체-상태 메모리 (예를 들어, 가입자 확인 모듈 (SIM) 카드, 보안 디지털 카드 (SD 카드), 마이크로 SD 카드, 또는 고체-상태 드라이브 (SSD)), 광학 및 자기 매체, 및 임의의 다른 유형 저장 매체를 포함하는 것으로 여겨질 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터-판독가능 저장 장치는 유형 비-일시적 매체를 포함한다. 이러한 비-일시적 매체는, 예를 들어 일시적인 파장 및 신호는 배제한다. "비-일시적 메모리"는 신호 자체와 같은 컴퓨터 판독가능 전파 매체는 배제하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따른 입력/출력 장치는 비디오 디스플레이 장치 (예를 들어, 액정 디스플레이 (LCD) 또는 음극선관 (CRT) 모니터), 문자숫자 입력 장치 (예를 들어, 키보드), 커서 제어 장치 (예를 들어, 마우스 또는 트랙패드), 디스크 드라이브 장치, 신호 생성 장치 (예를 들어, 스피커), 터치스크린, 가속도계, 마이크로폰, 휴대용 무선 주파수 안테나, 및 예를 들어 네트워크 인터페이스 카드 (NIC), 와이-파이 카드 또는 휴대용 모뎀일 수 있는 네트워크 인터페이스 장치를 포함할 수 있다.

샘플 획득 및 제조

본 발명은 생물학적 샘플로부터 회수된 핵산에 대응하는 서열 (예를 들어, 핵산 서열, 아미노산 서열)을 생성시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생성된 정보는 대상체로부터 수득된 핵산 물질에 존재하는 돌연변이를 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플, 즉 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)이 대상체로부터 수득되며, 상기 핵산은 프로세싱되고 (용해, 증폭 및/또는 정제됨), 상기 핵산은 하기 기재된 방법을 사용하여 서열분석된다. 많은 실시양태에서, 서열분석의 결과는 선형 핵산 서열이 아니라, 대상체에 대해 서열로 재-조립되어야 하는 수천 또는 수백만개의 개별적인 짧은 핵산 판독물의 집합이다. 일단 판독물이 정렬되어 서열을 생성시키고 나면, 정렬된 서열은, 예를 들어 질환을 나타낼 수 있는 돌연변이를 확인하기 위해 참조 서열과 비교될 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상체는 참조 서열 구축물, 즉 상기 기재된 바와 같은 방향성 비순환 그래프 ("DAG")에 대한 판독물의 정렬에 기초하여 특정한 돌연변이를 갖는 것으로 확인될 수 있다.

상기 목적들 중 임의의 목적을 위해, 방법은 생물학적 샘플에 적용될 수 있다. 상기 생물학적 샘플은, 예를 들어 혈액, 전혈, 혈장, 눈물, 유두 흡인물, 혈청, 대변, 소변, 타액, 순환 세포, 조직, 생검 샘플, 모낭, 또는 환자의 생물학적 물질을 함유하는 다른 샘플을 포함할 수 있다. 이러한 샘플을 기반으로 한 시험을 수행함에 있어서의 한 가지 문제는 대부분의 경우에 관심 돌연변이를 함유하는 미량의 DNA 또는 RNA만이 샘플 중에 존재할 수 있다는 것이다. 이것은 돌연변이 핵산이 매우 소량으로 존재하는 비-침습성 샘플, 예컨대 협측 스왑 또는 혈액 샘플에서 특히 그러하다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편이 자연적으로 짧을 수 있는데, 즉 샘플 중 관련 핵산의 무작위 전단이 짧은 단편을 생성시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 핵산은 프로세싱의 용이성을 위해, 또는 서열분석 기술이 1000개 미만의 염기, 예를 들어 500개 미만의 염기, 예를 들어 200개 미만의 염기, 예를 들어 100개 미만의 염기, 예를 들어 50개 미만의 염기의 서열 판독물만을 서열분석할 수 있기 때문에, 고의로 단편화된다. 본원에 기재된 방법이 가변적인 길이의 서열을 정렬하는데 사용될 수 있기는 하지만, 일부 실시양태에서, 복수의 핵산 판독물 대부분은 상기 서열분석 방법을 따를 것이며, 1000개 미만의 염기, 예를 들어 500개 미만의 염기, 예를 들어 200개 미만의 염기, 예를 들어 100개 미만의 염기, 예를 들어 50개 미만의 염기를 포함할 것이다.

핵산은 관련 기술분야에 알려져 있는 방법에 의해 수득될 수 있다. 일반적으로, 핵산은 다양한 기술, 예컨대 그의 내용이 전문으로 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 280-281, (1982)]에 기재된 것에 의해 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있다.

먼저 샘플의 추출물을 제조한 다음, 충분하게 순수한 핵산 제제를 수득하기 위해 추가의 단계--즉 차등 침전, 칼럼 크로마토그래피, 유기 용매를 사용한 추출 등--을 수행할 필요가 있을 수 있다. 추출물은 관련 기술분야의 표준 기술을 사용하여, 예를 들어 세포의 화학적 또는 기계적 용해에 의해 제조될 수 있다. 이어서, 임의의 오염성이며 잠재적으로 방해성인 단백질을 변성시키기 위해, 추출물은 예를 들어 여과 및/또는 원심분리에 의하거나, 및/또는 카오트로픽 염, 예컨대 구아니디늄 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여, 또는 유기 용매, 예컨대 페놀 및/또는 HCCl₃을 사용하여 추가로 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 대상체 샘플, 예를 들어 혈액 샘플로부터 수집된 RNA, 예를 들어 mRNA를 포함할 수 있다. 일반적인 RNA 추출 방법에 대해서는 관련 기술분야에 널리 알려져 있으며, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)]을 비롯한 표준 분자 생물학 교재에 개시되어 있다. 파라핀 포매된 조직으로부터의 RNA 추출 방법은, 예를 들어 문헌 [Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), 및 De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995)]에 개시되어 있다. 이들 참고문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 특히, RNA 단리는 상업적 제조업체, 예컨대 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 정제 키트, 완충제 세트 및 프로테아제를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 배양물 내 세포로부터의 총 RNA는 퀴아젠 알엔이지(RNeasy) 미니-칼럼을 사용하여 단리할 수 있다. 다른 상업적으로 입수가능한 RNA 단리 키트는 마스터퓨어(MASTERPURE) 완전 DNA 및 RNA 정제 키트 (에피센터(EPICENTRE), 위스콘신주 매디슨) 및 파라핀 차단 RNA 단리 키트 (암비온, 인크.(Ambion, Inc.))를 포함한다. 조직 샘플로부터의 총 RNA는 RNA Stat-60 (텔-테스트(Tel-Test))을 사용하여 단리할 수 있다. 종양으로부터 제조된 RNA는, 예를 들어 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리에 의해 단리할 수 있다.

분석용 서열분석

서열분석은 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의할 수 있다. DNA 서열분석 기술은 표지된 종결인자 또는 프라이머 및 평판 또는 모세관에서의 겔 분리를 사용한 전형적 디데옥시 서열분석 반응 (생어(Sanger) 방법), 가역적으로 종결되는 표지된 뉴클레오티드를 사용한 합성에 의한 서열분석, 파이로시퀀싱, 454 서열분석, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화, 표지된 클론의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화 후 라이게이션을 사용한 합성에 의한 서열분석, 중합 단계 동안의 표지된 뉴클레오티드 혼입의 실시간 모니터링, 폴로니 서열분석, 및 SOLiD 서열분석을 포함한다. 분리된 분자의 서열분석은 폴리머라제 또는 리가제를 사용한 순차적 또는 단일 연장 반응, 뿐만 아니라 프로브의 라이브러리와의 단일 또는 순차적 차등 혼성화에 의해 보다 최근에 입증되었다. 서열분석 전에는, 샘플 중 핵산의 일부 또는 전부를 증폭시키는 것이 추가적으로 유익할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 관련 기술분야에 알려져 있는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여 증폭된다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 한 예는 DNA 또는 RNA를 증폭시키는데 이용될 수 있는 폴리머라제-기반의 합성에-의한-서열인 일루미나(Illumina) 서열분석 (예를 들어, MiSeq™ 플랫폼)이다. DNA에 대한 일루미나 서열분석은 폴드-백 PCR 및 앵커 프라이머를 사용하여 고체 표면 상에서의 DNA 증폭을 기반으로 한다. 게놈 DNA를 단편화하고, 어댑터를 단편의 5' 및 3' 말단에 부가한다. 유동 셀 채널의 표면에 부착되는 DNA 단편을 연장시키고 브릿지 증폭시킨다. 단편은 이중 가닥이 되고, 이중 가닥 분자를 변성시킨다. 고체상 증폭의 다중 사이클 후 변성은 유동 셀의 각각의 채널에서 동일한 주형의 대략 1,000 카피의 단일-가닥 DNA 분자의 수백만개 클러스터를 생성시킬 수 있다. 프라이머, DNA 폴리머라제 및 4개의 형광단-표지된 가역적으로 종결되는 뉴클레오티드를 사용하여 순차적 서열분석을 수행한다. 뉴클레오티드 혼입 후에, 레이저를 사용하여 형광단을 여기시키고, 영상을 포획하고, 제1 염기의 정체를 기록한다. 각각의 혼입된 염기로부터의 3' 종결인자 및 형광단을 제거하고, 혼입, 검출 및 확인 단계를 반복한다. 일루미나 서열분석을 사용하여 RNA를 검출할 때에는, 샘플의 RNA 발현을 결정하기 위해 RNA 단편을 단리 및 증폭시키는 것 이외에는 동일한 방법이 적용된다. 서열분석기를 사용하여 서열을 조사한 후, 그들은 생물학적 서열 및 품질 점수를 저장하기 위한 텍스트-기반 포맷인 FASTQ 파일과 같은 데이터 파일로 출력될 수 있다 (상기 논의 참조).

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 DNA 서열분석 기술의 또 다른 예는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)에 의해 제공되는 이온 토렌트(Ion Torrent)™ 서열분석이다. 각각의 내용이 전문으로 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2009/0026082, 2009/0127589, 2010/0035252, 2010/0137143, 2010/0188073, 2010/0197507, 2010/0282617, 2010/0300559, 2010/0300895, 2010/0301398, 및 2010/0304982를 참조한다. 이온 토렌트™ 서열분석에서, DNA를 대략 300-800개 염기 쌍의 단편으로 전단하며, 단편은 평활 말단이다. 이어서 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단편의 말단에 라이게이션시킨다. 어댑터는 단편의 증폭 및 서열분석을 위한 프라이머로서 작용한다. 단편은 표면에 부착될 수 있고, 단편을 개별적으로 해상할 수 있는 해상도로 부착된다. 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가는 양성자 (H⁺)를 방출하며, 이의 신호가 서열분석 기기에서 검출되고 기록된다. 신호 강도는 혼입된 뉴클레오티드의 수에 비례한다. 이온 토렌트 데이터는 또한 FASTQ 파일로 출력될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 DNA 및 RNA 서열분석 기술의 또 다른 예는 454™ 서열분석 (로슈(Roche)) (Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380)이다. 454™ 서열분석은 파이로시퀀싱을 또한 이용하는 합성에-의한-서열분석 기술이다. DNA의 454™ 서열분석은 2개의 단계를 수반한다. 제1 단계에서, DNA를 대략 300-800개 염기 쌍의 단편으로 전단하며, 단편은 평활 말단이다. 이어서 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단편의 말단에 라이게이션시킨다. 어댑터는 단편의 증폭 및 서열분석을 위한 프라이머로서 작용한다. 단편을, 예를 들어 5'-비오틴 태그를 함유하는 어댑터 B를 사용하여, DNA 포획 비드, 예를 들어 스트렙타비딘-코팅 비드에 부착시킬 수 있다. 비드에 부착된 단편을 유수 에멀젼의 액적 내에서 PCR 증폭시킨다. 그 결과 각 비드 상에 클론 증폭된 DNA 단편의 다중 카피를 얻는다. 제2 단계에서, 비드를 웰 (피코리터 크기)에 포획한다. 파이로시퀀싱을 각각의 DNA 단편에 대해 병렬로 수행한다. 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가는 서열분석 기기에서 CCD 카메라에 의해 기록되는 광 신호를 생성시킨다. 신호 강도는 혼입된 뉴클레오티드의 수에 비례한다. 파이로시퀀싱은 뉴클레오티드 부가 시에 방출되는 피로포스페이트 (PPi)를 사용한다. PPi는 아데노신 5' 포스포술페이트의 존재 하에서 ATP 술푸릴라제에 의해 ATP로 전환된다. 루시페라제는 ATP를 사용하여 루시페린을 옥시루시페린으로 전환시키고, 이러한 반응은 광을 생성시키며, 이를 검출하고 분석한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현을 측정하는데 파이로시퀀싱이 사용된다. RNA의 파이로시퀀싱은 유사하게 DNA의 파이로시퀀싱에 적용되며, 미시적 비드에 부분적 rRNA 유전자 서열분석을 부착 적용한 다음 부착물을 개별 웰 내에 배치시키는 것에 의해 수행된다. 이어서, 부착된 부분적 rRNA 서열은 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위해 증폭된다. 문헌 [Sharon Marsh, Pyrosequencing® Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 373, 15-23 (2007)].

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 DNA 및 RNA 검출 기술의 또 다른 예는 SOLiD™ 기술 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))이다. SOLiD™ 기술 시스템은 DNA 및 RNA 둘 다의 대규모로 병렬인 차세대 서열분석을 실행하는데 이용될 수 있는 라이게이션 기반 서열분석 기술이다. DNA SOLiD™ 서열분석에서, 게놈 DNA를 단편으로 전단하고, 어댑터를 단편의 5' 및 3' 말단에 부착시켜 단편 라이브러리를 생성시킨다. 대안적으로, 어댑터를 단편의 5' 및 3' 말단에 라이게이션하고, 단편을 원형화시키고, 원형화된 단편을 소화시켜 내부 어댑터를 생성시키고, 어댑터를 생성된 단편의 5' 및 3' 말단에 부착시켜 짝-쌍형성 라이브러리를 생성시킴으로써 내부 어댑터를 도입할 수 있다. 다음으로, 비드, 프라이머, 주형 및 PCR 성분을 함유하는 마이크로반응기에서 클론 비드 집단을 제조한다. PCR 후에, 주형을 변성시키고 비드를 풍부화시켜 연장된 주형을 갖는 비드를 분리한다. 선택된 비드 상의 주형을 3' 변형에 적용시켜 유리 슬라이드에 대해 결합되도록 한다. 특이적 형광단에 의해 확인되는 중심 결정 염기 (또는 염기 쌍)를 갖는 부분적 무작위 올리고뉴클레오티드의 순차적 혼성화 및 라이게이션에 의해 서열을 결정할 수 있다. 색을 기록한 후에, 라이게이션된 올리고뉴클레오티드를 절단 및 제거한 다음 과정을 반복한다.

다른 실시양태에서, 유전자 발현을 측정하기 위해 SOLiD^TM의 유전자 발현 연속 분석 (SAGE)을 사용한다. 유전자 발현 연속 분석 (SAGE)은 각각의 전사체에 대한 개별 혼성화 프로브를 제공할 필요없이 다수의 유전자 전사체의 동시 및 정량적 분석을 허용하는 방법이다. 먼저, 전사체를 고유하게 확인하기에 충분한 정보를 함유하는 짧은 서열 태그 (약 10-14 bp)를 생성시키되, 단 태그는 각각의 전사체 내의 고유한 위치로부터 수득한다. 이어서, 많은 전사체를 함께 연결하여 긴 연속 분자를 형성하고, 이를 서열분석하여, 다수의 태그의 정체를 동시에 밝힐 수 있다. 개별 태그의 존재비를 결정하고, 각각의 태그에 대응하는 유전자를 확인함으로써 임의의 전사체 집단의 발현 패턴을 정량적으로 평가할 수 있다. 보다 상세한 설명은, 예를 들어 각각의 내용이 전문으로 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Velculescu et al., Science 270:484 487 (1995); 및 Velculescu et al., Cell 88:243 51 (1997)]을 참조한다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 또 다른 서열분석 기술은, 예를 들어 헬리코스 진정 단일 분자 서열분석(Helicos True Single Molecule Sequencing) (tSMS) (Harris T. D. et al. (2008) Science 320:106-109)을 포함한다. tSMS 기술에서, DNA 샘플을 대략 100 내지 200개 뉴클레오티드의 가닥으로 절단하고, 폴리A 서열을 각각의 DNA 가닥의 3' 말단에 부가한다. 각각의 가닥을 형광 표지된 아데노신 뉴클레오티드의 부가에 의해 표지한다. 이어서 DNA 가닥을 유동 셀 표면에 고정화되는 수백만개의 올리고-T 포획 부위를 함유하는 유동 셀에 혼성화시킨다. 주형은 밀도가 약 1억개 주형/cm²일 수 있다. 이어서 유동 셀을 기기, 예를 들어 헬리스콥(HeliScope)™ 서열분석기 내로 로딩하고, 레이저로 유동 셀의 표면을 비추어 각각의 주형의 위치를 밝혀낸다. CCD 카메라는 유동 셀 표면 상의 주형의 위치를 맵핑할 수 있다. 이어서 주형 형광 표지를 절단하고 세척 제거한다. DNA 폴리머라제 및 형광 표지된 뉴클레오티드를 도입함으로써 서열분석 반응을 시작한다. 올리고-T 핵산은 프라이머로서 작용한다. 폴리머라제는 주형 지정 방식으로 프라이머에 표지된 뉴클레오티드를 혼입시킨다. 폴리머라제 및 미혼입 뉴클레오티드를 제거한다. 형광 표지된 뉴클레오티드의 지정 혼입을 갖는 주형을 유동 셀 표면의 영상화에 의해 검출한다. 영상화 후에, 절단 단계로 형광 표지를 제거하고, 목적하는 판독물 길이가 달성될 때까지 다른 형광 표지된 뉴클레오티드로 상기 과정을 반복한다. 각각의 뉴클레오티드 부가 단계에서 서열 정보를 수집한다. tSMS의 추가의 설명은, 예를 들어 라피두스(Lapidus) 등의 미국 특허 번호 7,169,560, 라피두스 등의 미국 특허 출원 번호 2009/0191565, 퀘이크(Quake) 등의 미국 특허 번호 6,818,395, 해리스(Harris)의 미국 특허 번호 7,282,337, 퀘이크 등의 미국 특허 출원 번호 2002/0164629, 및 문헌 [Braslavsky, et al., PNAS (USA), 100: 3960-3964 (2003)]에 제시되고, 이들 참고문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 또 다른 예는 DNA 및 RNA 둘 다를 서열분석하는 퍼시픽 바이오사이언시스(Pacific Biosciences)의 단일 분자 실시간 (SMRT) 기술을 포함한다. SMRT에서, 4개의 DNA 염기 각각을 4개의 상이한 형광 염료 중 1개에 부착시킨다. 이들 염료는 인-연결된다. 단일 DNA 폴리머라제를 제로-모드 도파관 (ZMW)의 바닥에서 주형 단일 가닥 DNA의 단일 분자로 고정화시킨다. ZMW는 ZMW의 외부에서 (마이크로초 단위로) 급속히 확산되는 형광 뉴클레오티드의 배경에 대하여 DNA 폴리머라제에 의한 단일 뉴클레오티드 혼입의 관찰을 가능하게 하는 구속 구조이다. 뉴클레오티드를 성장 가닥으로 혼입시키는데는 수 밀리초가 소요된다. 이러한 시간 동안에, 형광 표지는 여기되어 형광 신호를 생성시키고, 형광 태그는 절단 제거된다. 염료의 대응하는 형광의 검출은 어느 염기가 혼입되었는지를 나타낸다. 과정을 반복한다. RNA를 서열분석하기 위해, DNA 폴리머라제가 ZMW에서 역전사효소로 대체되고, 그에 따라 과정이 이어진다.

제공된 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 또 다른 예는 나노포어 서열분석이다 (Soni G V and Meller, AClin Chem 53: 1996-2001) (2007). 나노기공은 직경이 1 나노미터 정도인 작은 구멍이다. 전도성 유체에서의 나노기공의 침지 및 그에 걸친 전위의 적용은 나노기공을 통한 이온의 전도성에 기인하여 경미한 전류를 일으킨다. 흐르는 전류의 양은 나노기공의 크기에 감수성이다. DNA 분자가 나노기공을 통과할 때, DNA 분자 상의 각각의 뉴클레오티드는 상이한 정도로 나노기공을 폐쇄한다. 따라서, DNA 분자가 나노기공을 통과할 때 나노기공을 통과하는 전류의 변화는 DNA 서열의 판독치를 나타낸다.

제공된 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 또 다른 예는 서열 DNA에 화학물질-감수성 전계 효과 트랜지스터 (chemFET) 어레이를 사용하는 것을 수반한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20090026082에 기재된 바와 같음). 기술의 한 예에서, DNA 분자를 반응 챔버 내에 넣을 수 있고, 주형 분자를 폴리머라제에 결합된 서열분석 프라이머에 혼성화시킬 수 있다. 서열분석 프라이머의 3' 말단에서 새로운 핵산 가닥 내에 1개 이상의 트리포스페이트가 혼입되는 것을 chemFET에 의해 전류의 변화로 검출할 수 있다. 어레이는 다중 chemFET 센서를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 단일 핵산을 비드에 부착시킬 수 있고, 핵산을 비드 상에서 증폭시킬 수 있고, 개별 비드를 각각의 챔버가 chemFET 센서를 갖는 chemFET 어레이 상의 개별 반응 챔버로 전달할 수 있고, 핵산을 서열분석할 수 있다.

제공된 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 서열분석 기술의 또 다른 예는 전자 현미경을 사용하는 것을 수반한다 (Moudrianakis E. N. and Beer M. Proc Natl Acad Sci USA. 1965 March; 53:564-71). 기술의 한 예에서, 개별 DNA 분자를 전자 현미경을 사용하여 구별가능한 금속성 표지를 사용하여 표지한다. 이어서 이들 분자를 평평한 표면 상에 펼쳐놓고, 전자 현미경을 사용하여 영상화함으로써 서열을 측정한다.

추가의 검출 방법은 후속 형광 또는 비-형광 검출, 질량 분광측정 방법을 사용하는 바코드 질량 검출, 방출된 라디오파의 검출, 정렬된 바코드로부터의 산란광의 검출, 정량적 PCR 또는 디지털 PCR 방법을 사용하는 형광 검출을 위해 마이크로어레이에 결합하는 것을 이용할 수 있다. 비교 핵산 혼성화 어레이는 환자 샘플 DNA 내에서의 카피수 변이를 검출하기 위한 기술이다. 샘플 DNA 및 참조 DNA는, 예를 들어 구별되는 형광단을 사용하여 상이하게 표지된 다음, 수많은 프로브에 혼성화된다. 이어서, 샘플 및 참조물의 형광 강도가 측정된 다음에, 형광 강도 비가 카피수 변이를 계산하는데 사용된다. 비교 게놈 혼성화 어레이의 방법은 문헌 [Shinawi M, Cheung SW The array CGH and its clinical applications, Drug Discovery Today 13 (17-18): 760-70]에 보다 상세히 논의되어 있다. 마이크로어레이 검출이 바로 FASTQ 파일을 생성시키지는 않을 수 있지만, 마이크로어레이 서열분석기에 의해 생성된 데이터를 FASTQ 또는 유사한 포맷으로 전환시키는 프로그램이 이용가능하다.

DNA 분자, RNA 분자 및 카피수를 검출하는 또 다른 방법은 형광 계내 혼성화 (FISH)이다. 계내 혼성화 프로토콜 (Ian Darby ed., 2000). FISH는 특정 염색체 재배열, 예컨대 DNA 서열 중 돌연변이 및 카피수 변이를 검출하는 분자 세포유전학 기술이다. DNA 분자는 화학적으로 변성된 후, 2개 가닥으로 분리된다. 이어서, 단일 가닥 프로브가 변성된 DNA 가닥과 함께 인큐베이션된다. 신호 가닥 프로브는 표적 서열 부분에 따라 선택되며, 상보적 서열 부분에 대해 고친화도를 갖는다. 프로브는 반복 서열 프로브, 전염색체 프로브 및 유전자좌-특이적 프로브를 포함할 수 있다. 인큐베이션하는 동안, 조합된 프로브 및 DNA 가닥이 혼성화된다. 이어서, 임의의 변이를 평가하기 위해 현미경 하에서 결과가 가시화 및 정량화된다.

또 다른 실시양태에서, 유전자 발현을 측정하기 위해 매스어레이(MassARRAY)™-기반 유전자 발현 프로파일링 방법을 사용한다. 시쿼놈, 인크.(Sequenom, Inc.) (캘리포니아주 샌디에고)에서 개발한 매스어레이™-기반 유전자 발현 프로파일링 방법에서, RNA의 단리 및 역전사 후에 수득된 cDNA를, 단일 염기를 제외한 모든 위치에서 표적화된 cDNA 영역과 매치되고 내부 표준물로서 작용하는 합성 DNA 분자 (경쟁자)와 섞는다. cDNA/경쟁자 혼합물을 PCR 증폭시키고, PCR-후 쉬림프 알칼리성 포스파타제 (SAP) 효소 처리에 적용하여, 나머지 뉴클레오티드의 탈인산화를 일으킨다. 알칼리성 포스파타제의 불활성화 후에, 경쟁자 및 cDNA로부터의 PCR 생성물을 프라이머 연장에 적용하여, 경쟁자- 및 cDNA-유래 PCR 생성물에 대한 구별되는 질량 신호를 생성시킨다. 정제 후에, 이들 생성물을 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광측정법 (MALDI-TOF MS) 분석을 사용하는 분석에 필요한 성분을 예비-로딩한 칩 어레이 상에 분배한다. 이어서, 생성된 질량 스펙트럼 내의 피크 면적의 비를 분석함으로써 반응물 내에 존재하는 cDNA를 정량화한다. 추가의 상세한 설명은, 예를 들어 문헌 [Ding and Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059 3064 (2003)]을 참조한다.

추가의 PCR-기반 기술은, 예를 들어 차등 디스플레이 (Liang and Pardee, Science 257:967 971 (1992)); 증폭된 단편 길이 다형성 (iAFLP) (Kawamoto et al., Genome Res. 12:1305 1312 (1999)); 비드어레이(BeadArray)™ 기술 (일루미나, 캘리포니아주 샌디에고; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), June 2002; Ferguson et al., Analytical Chemistry 72:5618 (2000)); 유전자 발현에 대한 신속한 검정에서 상업적으로 입수가능한 루미넥스100(Luminex100) LabMAP 시스템 및 다색-코딩 마이크로구체 (루미넥스 코포레이션(Luminex Corp.), 텍사스주 오스틴)를 사용하는, 유전자 발현의 검출을 위한 비즈 어레이 (BADGE) (Yang et al., Genome Res. 11:1888 1898 (2001)); 및 고 포괄적 발현 프로파일링 (HiCEP) 분석 (Fukumura et al., Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003))을 포함한다. 상기 문헌 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

특정 실시양태에서, 나일론 멤브레인 어레이, 마이크로칩 어레이 및 유리 슬라이드 어레이, 예를 들어 아피메트릭스(Affymetrix) (캘리포니아주 산타 클라라)로부터 상업적으로 입수가능한 것을 비롯한 마이크로어레이 기술을 사용하여 유전자 발현의 변이가 또한 확인 또는 확증될 수 있다. 일반적으로, RNA 샘플이 단리되고, 역전사를 통해 표지된 cDNA로 전환된다. 이어서, 표지된 cDNA는 관심 세포 또는 조직으로부터의 특정 DNA 프로브를 갖는 나일론 멤브레인, 마이크로칩 또는 유리 슬라이드 상에 혼성화된다. 이어서, 혼성화된 cDNA가 검출 및 정량화되고, 생성된 유전자 발현 데이터는 분석용 대조군과 비교될 수 있다. 표지, 혼성화 및 검출 방법은 마이크로어레이 지지체가 나일론 멤브레인인지, 마이크로칩인지 또는 유리 슬라이드인지에 따라 달라진다. 나일론 멤브레인 어레이는 전형적으로 P-dNTP 표지된 프로브와 혼성화된다. 유리 슬라이드 어레이는 전형적으로 2개의 구별되는 형광 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 표지하는 것을 수반한다. 마이크로어레이를 제조하고 유전자 산물 발현 (예를 들어, RNA 또는 단백질)을 결정하는 방법은 이트만(Yeatman) 등의 미국 특허 출원 번호 2006/0195269에 제시되며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내에서 본원에 개시된 1종 이상의 바이오마커의 존재 및/또는 양을 결정하기 위해 질량 분광측정법 (MS) 분석을 단독으로 또는 다른 방법 (예를 들어, 면역검정 또는 RNA 측정 검정)과 조합하여 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, MS 분석은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI) 비행 시간 (TOF) MS 분석, 예컨대 예를 들어 직접-점 MALDI-TOF 또는 액체 크로마토그래피 MALDI-TOF 질량 분광측정법 분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, MS 분석은 전기분무 이온화 (ESI) MS, 예컨대 예를 들어 액체 크로마토그래피 (LC) ESI-MS를 포함한다. 질량 분석은 상업적으로 입수가능한 분광계를 사용하여 달성할 수 있다. 생물학적 샘플 내에서 바이오마커 펩티드의 존재 및 양을 검출하기 위해 MALDI-TOF MS 및 ESI-MS를 비롯한 MS 분석을 이용하는 방법은 관련 기술분야에 알려져 있다. 추가의 지침에 대해서는, 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,925,389; 6,989,100; 및 6,890,763을 참조한다.

본 발명의 방법, 서열 구축물 및 시스템에서 사용하기 위한 단백질 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 수많은 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 및 아미노산 서열 판독물은 질량 분광측정법 또는 에드만(Edman) 분해를 사용하여 단백질 또는 단백질의 일부분을 분석하는 것에 의해 생성될 수 있다. 질량 분광측정법은, 예를 들어 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI) 비행 시간 (TOF) MS 분석, 예컨대 예를 들어 직접-점 MALDI-TOF 또는 액체 크로마토그래피 MALDI-TOF 질량 분광측정법 분석, 전기분무 이온화 (ESI) MS, 예컨대 예를 들어 액체 크로마토그래피 (LC) ESI-MS, 또는 다른 기술, 예컨대 MS-MS를 포함할 수 있다. 에드만 분해 분석은 모델 49X 프로사이스(Procise) 단백질/펩티드 서열분석기 (어플라이드 바이오시스템즈/라이프 테크놀로지스)와 같은 상업용 기기를 사용하여 수행될 수 있다. 서열분석된 아미노산 서열, 즉 폴리펩티드, 즉 단백질은 적어도 10개 아미노산의 길이, 예를 들어 적어도 20개 아미노산의 길이, 예를 들어 적어도 50개 아미노산의 길이일 수 있다.

참조로 포함

본 개시내용 전반에 걸쳐 특허, 특허 출원, 특허 공개, 학술지, 서적, 논문, 웹 콘텐츠와 같은 다른 문헌을 참조 및 인용하였다. 모든 이러한 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

등가물

본원에 제시되고 기재된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형 및 그의 다수의 추가의 실시양태는, 본원에 인용된 과학 및 특허 문헌에 대한 참조를 비롯한 본 문헌의 전체 내용으로부터 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 본원의 대상은 그의 다양한 실시양태 및 그의 등가물에서 본 발명의 실시에 적합화될 수 있는 중요한 정보, 예시 및 지침을 함유하고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Seven Bridges Genomics Inc. Kural, Deniz <120> METHODS AND SYSTEMS FOR IDENTIFYING DISEASE-INDUCED MUTATIONS <130> SBG-008/01WO 31079/32 <150> US 61/892670 <151> 2013-10-18 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 catagtacct aggtcttgga gctagtc 27 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 2 catagtacct aggtcttggc tagtc 25 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 3 catagtacct aggggtcttg gctagtc 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 4 catagtacct aggggtcttg gagctagtc 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 5 cataggacct aggtcttggc tagtc 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 6 cataggacct aggtcttgga gctagtc 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 7 cataggacct aggggtcttg gctagtc 27 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 8 cataggacct aggggtcttg gagctagtc 29 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 9 ggatcgaaat gg 12 <210> 10 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 10 ttggatatgg g 11 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 11 ttggatcgaa ttatggg 17 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 12 cccagaacgt tgcatcgtag acgagtttca gcatt 35 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 13 cccagaacgt tgctatgcaa caagggacat cgtagacgag tttcagcatt 50 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 14 cccagaacgt tgctatgcag gaagggacat cgtagacgag tttcagcatt 50 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 15 agctacgtac actacc 16 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 16 agctatcgta ctagc 15

Claims

유기체로부터의 비-이환 샘플에서의 핵산에 대응하는 제1 핵산 서열을 수득하는 단계;
제1 서열과 선택된 비-이환 참조 서열 사이의 차이를 확인하는 단계;
제1 서열과 선택된 참조 서열 사이의 차이를 제1 서열과 참조 서열 사이에 차이가 존재하는 제1 참조 서열 구축물 내 위치에 2개 이상의 대안적 경로로서 나타내는 제1 참조 서열 구축물을 제조하는 단계;
유기체로부터의 이환 샘플에 대응하는 제2 서열로부터의 1개 이상의 판독물을 제1 참조 서열 구축물에 대해 정렬하는 단계; 및
제2 서열과 제1 참조 서열 구축물 사이의 차이를 질환으로 인한 돌연변이로서 확인하는 단계
를 포함하는, 질환-유도된 유전자 돌연변이를 확인하는 방법.
제1항에 있어서, 제1 서열, 제2 서열 및 참조 서열 사이의 차이를 제1 서열과 참조 서열 사이에 차이가 존재하거나 제2 서열과 제1 서열 사이에 차이가 존재하는 제2 참조 서열 구축물 내 위치에 2개 이상의 대안적 경로로서 나타내는 제2 참조 서열 구축물을 제조하는 단계;
유기체로부터의 진행성 질환 샘플에 대응하는 제3 서열로부터의 1개 이상의 판독물을 제2 참조 서열 구축물에 대해 정렬하는 단계; 및
제3 서열과 제2 참조 서열 구축물 사이의 차이를 진행성 질환으로 인한 돌연변이로서 확인하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 제2 서열이 질환으로 인한 주요 유전자 클론을 나타내는 것인 방법.
제2항에 있어서, 제3 서열이 질환으로 인한 부차 유전자 클론을 나타내는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 암인 방법.
제5항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 피부암, 전립선암, 갑상선암, 췌장암, 방광암 또는 난소암으로부터 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 암이 백혈병 또는 림프종인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 자가면역 질환인 방법.
제1항에 있어서, 참조 서열 구축물이 방향성 비순환 그래프인 방법.
제1항에 있어서, 서열 판독물이 적어도 약 50 bp 길이인 방법.
제10항에 있어서, 서열 판독물이 적어도 약 100 bp 길이인 방법.
제1항에 있어서, 제2 서열과 제1 참조 서열 사이의 차이가 삽입, 결실, 다형성 또는 구조적 변이체를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 참조 서열 구축물이 적어도 약 1,000,000 bp 길이인 방법.
제1항에 있어서, 참조 서열 구축물이 염색체를 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 참조 서열 구축물이 게놈을 나타내는 것인 방법.
유기체로부터의 비-이환 샘플에 대응하는 제1 서열 및 유기체로부터의 이환 샘플에 대응하는 제2 서열을 수득하는 단계;
제1 서열과 제2 서열 사이의 차이를 확인하는 단계;
제1 서열과 제2 서열 사이의 차이를 제1 서열과 제2 서열 사이에 차이가 존재하는 참조 서열 구축물 내 위치에 2개 이상의 대안적 경로로서 나타내는 참조 서열 구축물을 제조하는 단계;
유기체로부터의 서열 판독물을 참조 서열 구축물에 대해 정렬하는 단계; 및
서열 판독물과 참조 서열 구축물 사이의 차이를 진행성 병기의 질환으로 인한 돌연변이로서 확인하는 단계
를 포함하는, 유기체에서 진행성 병기의 질환으로 인한 돌연변이를 확인하는 방법.
제16항에 있어서, 진행성 병기의 질환을 갖는 것으로 유기체를 진단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 질환이 암인 방법.
제18항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 피부암, 전립선암, 갑상선암, 췌장암, 방광암 또는 난소암으로부터 선택되는 것인 방법.
제18항에 있어서, 암이 백혈병 또는 림프종인 방법.
제18항에 있어서, 진행성 병기의 질환이 전이성 암인 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 질환이 자가면역 질환인 방법.
제16항에 있어서, 참조 서열 구축물이 방향성 비순환 그래프인 방법.
대상체의 비-이환 세포의 유전자 서열 및 대상체의 이환 세포의 유전자 서열을 나타내는 방향성 비순환 그래프를 생성시키는 단계;
대상체로부터의 유전자 샘플에 대응하는 제1 서열 판독물을 방향성 비순환 그래프에 대해 정렬하는 단계; 및
제1 서열 판독물과 방향성 비순환 그래프 사이의 차이를 결정하며, 여기서 차이는 질환의 진행을 나타내는 것인 단계
를 포함하는, 대상체에서 알려져 있는 유전 질환의 진행을 평가하는 방법.
제24항에 있어서, 제1 서열 판독물과 원래 방향성 비순환 그래프 사이의 차이를 혼입시키도록 방향성 비순환 그래프를 변형하는 단계;
대상체로부터의 유전자 샘플에 대응하는 제2 서열 판독물을 변형된 방향성 비순환 그래프에 대해 정렬하는 단계; 및
제2 서열 판독물과 변형된 방향성 비순환 그래프 사이의 차이를 결정하며, 여기서 차이는 질환의 추가의 진행을 나타내는 것인 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 질환이 암인 방법.
제26항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 피부암, 전립선암, 갑상선암, 췌장암, 방광암 또는 난소암으로부터 선택되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 암이 백혈병 또는 림프종인 방법.
제26항에 있어서, 질환의 진행이 전이성 암과 상관된 것인 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 질환이 자가면역 질환인 방법.
대상체의 비-암성 세포의 유전자 서열과 대상체의 비-전이성 암성 세포의 유전자 서열 사이의 변이를 나타내는 방향성 비순환 그래프를 생성시키는 단계;
대상체의 전이성 세포로부터의 유전자 샘플에 대응하는 복수의 서열 판독물을 방향성 비순환 그래프에 대해 정렬하는 단계; 및
서열 판독물과 방향성 비순환 그래프 사이의 차이를 결정하여, 전이성 클론에 대한 유전자 마커를 결정하는 단계
를 포함하는, 전이성 암에 대한 유전자 마커를 결정하는 방법.