BRPI0617485A2 - regiço de ligaÇço de antÍgeno isolada de um anticorpo ou fragmento funcional dele, anticorpo il-3 humano ou humanizado, composiÇço farmacÊutica e uso do referido anticorpo - Google Patents

Abstract

<B>REGIçO DE LIGAÇçO DE ANTÍGENO ISOLADA DE UM ANTICORPO OU FRAGMENTO FUNCIONAL DELE, ANTICORPO IL-3 HUMANO OU HUMANIZADO, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA E USO DO REFERIDO ANTICORPO<D>A presente invenção refere-se a moléculas de ligação anti-IL-1 3 humanas, particularmente anticorpos, e a métodos para uso de moléculas de anticorpo anti-IL-13 em diagnóstico ou tratamento de distúrbios relacionados a IL-13, tal como asma, dermatite atópica, rinite alérgica, fibrose, doença inflamatória do intestino e linfoma de Hodgkin.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REGIÃO DELIGAÇÃO DE ANTÍGENO ISOLADA DE UM ANTICORPO OU FRAGMENTOFUNCIONAL DELE, ANTICORPO IL-3 HUMANO OU HUMANIZADO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO REFERIDO ANTICORPO".

Campo de Uso

A presente invenção refere-se a membros de ligação específicos,em particular moléculas de anticorpo anti-IL-13 humano e especialmenteaqueles que neutralizam a atividade de IL-13. A invenção refere-se ainda amétodos para uso de moléculas de anticorpo anti-IL-13 em diagnóstico outratamento de distúrbios relacionados a IL-13, tal como asma, dermatite ató-pica, rinite alérgica, fibrose, doença inflamatória do intestino e Iinfoma deHodgkin.

Antecedentes da Invenção

A interleucina (IL)-13 é uma citocina de 114 aminoácidos comuma massa molecular não-modificada de aproximadamente 12 kDa [McKenzie,A.N. e outros, J. Immunol., 1993.150 (12):p. 5436-44 e Minty, A. e outros, Natu-re, 1993.362 (6417): p.248-50]. A IL-13 está mais intimamente relacionadacom IL-4 com a qual ela compartilha 30% de similaridade de seqüência nonível de aminoácido. O gene de IL-13 humana está localizado no cromos-somo 5q31 adjacente ao gene de IL-14. Esta região de cromossomo 5q con-tém seqüências de gene para outras citocinas derivadas de linfócito Th2 in-cluindo GM-CSF e IL-5, cujos níveis junto com IL-4 foram mostrados se rela-cionar com severidade de doença em asmáticos e modelos de roedores deinflamação alérgica [Nakamura, Y. e outros, Am. J. Respir. Cell MoL Biol.,1996 15(5): p. 680-7, Robinson1 D.S. e outros, N. Engl. J. Med., 1992.326(5): p. 298-304, Walker, C. e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1994,150(4): p. 1038-48, Humbert, M. e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med.,1996, 154(5): p. 1497-504, Corrigan, C.J. e A. B. Kay, Int. Arch. Allergy Appl.Immunol., 1991.94 (1-4): p.270-1, Bentley, A.M. e outros, Am. J. Respir. CellMol. Biol., 1993],

Embora inicialmente identificada como citocina derivada de linfó-cito CD4+ Th2, ela também é produzida por células T CD4+ Th1, células NKde linfócitos T CD8+ e populações de não-célula-T tal como mastócitos, ba-sófilos, eosinófilos, macrófagos, monócitos e células musculares lisas da viaaérea.

A IL-3 é relatada mediar seus efeitos através de um sistema dereceptor que inclui a cadeia α de receptor de IL-4 (IL-4Ra), que pode elamesma se ligar a IL-4 mas não IL-3, e pelo menos duas outras proteínas desuperfície celular, IL-13aRai e IL-13Rcx2 [Murata, T. e outros, Int. J. Hema-tol., 1999.69 (1):p.13-20, Andrews, A.L. e outros, J. Biol. Chem., 2002.277(48):p.46073-8]. IL-13Rai pode se ligar a IL-13 com pouca afinidade, subse-quentemente recrutando IL-4Ra para formar um receptor funcional de altaafinidade que sinaliza [Miloux, B. e outros, FEBS Lett., 1997.401 (2-3): p.163-6, Hilton1 D.J. e outros, Proc. Λ/aí/. Acad. Sci., U.S.A., 1996.93(1), p.497-501], O banco de dados do Genbank lista a seqüência de aminoácido ea seqüência de ácido nucleico de IL-13Rai como NP 001551 e Y10659, res-pectivamente. Estudos em camundongos deficientes em STAT6 (transdutorde sinal e ativador de transcrição 6) revelaram que IL-13, de uma maneirasimilar a IL-4, sinaliza utilizando o curso JAK-STAT6 [Kuperman, D. e outros,J. Exp. Med., 1998. 187 (6): p. 939-48, Nelms, K. e outros, Annu. Rev. Im-munol., 1999. 17: p. 701-38]. IL-13Ra2 compartilha 37% de identidade deseqüência com IL-13Rai no nível de aminoácido e se liga a IL-13 com altaafinidade [Zhang, J.G. e outros, J. Biol. Chem., 1997.272 (14): p. 9474-80,Caput, D. e outros, J. Biol. Chem., 1996.271 (28): p. 16921-6], No entanto,IL-13Rcx2 tem um filamento citoplásmico mais curto que não tem motivos desinalização. Células expressando IL-13Ra2 não são responsivas a IL-13mesmo na presença de IL-4Ra [Kawakami, K. e outros, Blood, 2001.97 (9):p. 2673-9]. É postulado, no entanto, que IL-13Ra2 aja como um receptor deatração regulando o funcionamento de IL-13 mas não IL-14. Isto é apoiadopor estudos em camundongos deficientes em IL-13Ra2 cujo fenótipo estavade acordo com responsividade aumentada a IL-13 [Wood, N. e outros, J.Exp. Med., 2003.197 (6): p. 703-709, Chiaramonte, M.G. e outros, J. Exp.Med., 2003.197 (6): p. 687-701]. O banco de dados do Genbank lista a se-qüência de aminoácido e a seqüência de ácido nucleico de IL-13Ra2 comoΝΡ000631 e Υ08768, respectivamente.

Sumário da Invenção

Uma modalidade da invenção aqui provê um anticorpo humanoou humanizado isolado ou fragmento funcional dele com uma região de Iiga-ção de antígeno que é específica para a proteína-alvo IL-13 e o anticorpo oufragmento funcional dele se liga a IL-13. Em uma modalidade relacionada, aligação a IL-13 é determinada pelo menos pela ligação do receptor de IL-13na superfície celular prevenindo liberação de mediador inflamatório.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê uma região de Ii-gação de antígeno isolada de um anticorpo ou fragmento funcional dele. Emcertas modalidades, a região de ligação de antígeno isolada inclui uma regi-ão H-CDR3 tendo uma seqüência de aminoácido selecionada das SEQ IDNOs: 9-10 e variantes conservativas delas. Conforme aqui descrito, as vari-antes conservativas incluem resíduos de aminoácido em qualquer uma dasseqüências de aminoácido identificadas. Em uma modalidade relacionada, aregião de ligação de antígeno isolada é uma região H-CDR2 tendo a se-qüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 e variantes conservativas dela. Emoutra modalidade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é umaregião de H-CDR1 tendo uma seqüência de aminoácido selecionada de SEQID NOs: 6 e 7 e variantes conservativas delas.

Em outra modalidade, a região de ligação de antígeno isolada éuma região L-CDR3 tendo uma seqüência de aminoácido selecionada deSEQ ID NOs: 20-22 e variantes conservativas delas. Em ainda outra modali-dade relacionada, a região de ligação de antígeno isolada é uma região deL-CDR1 tendo uma seqüência de aminoácido selecionada de SEQ ID NOs:16-18 e variantes conservativas delas. Em ainda outra modalidade relacio-nada, a região de ligação de antígeno isolada é uma região L-CDR2 tendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 e variantes conservativas dela.

Em certas modalidades, a região de ligação de antígeno isoladaé uma cadeia leve variável tendo uma seqüência de aminoácido selecionadade SEQ ID 16-22 e variantes conservativas delas.

Em outra modalidade, a região de ligação de antígeno isolada éuma cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido selecionada deuma a três de SEQ ID 6-10, e uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80,90 ou 95 por cento de identidade de seqüência nas regiões de CDR comregiões de CDR tendo SEQ ID NOs: 6-10. Em uma modalidade relacionada,a região de ligação de antígeno isolada é uma cadeia leve tendo uma se-qüência de aminoácido selecionada de uma a três de SEQ ID NOs: 16-22, euma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identi-dade de seqüência nas regiões de CDR com as regiões de CDR tendo SEQID NOs: 16-22.

Em uma certa modalidade, o anticorpo isolado é uma IgG. Emoutra modalidade, o anticorpo isolado é uma IgGI ou uma lgG4.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um anticorpo hu-mano ou humanizado ou fragmento funcional dele, tendo uma região de li-gação de antígeno que é específica para um epítopo de IL-13, e o anticorpoou fragmento funcional se liga a receptores de superfície de IL-13 em umacélula. Em uma modalidade relacionada, a invenção provê um anticorpo hu-mano ou humanizado ou fragmento funcional dele, tendo uma região de li-gação de antígeno que é específica para um epítopo de IL-13 alvo, e o epí-topo contém um ou mais resíduos de aminoácido de resíduos de aminoácido1-112 de IL-13 alvo. Em uma modalidade relacionada, o epítopo é um epíto-po conformacional.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento funcional éum fragmento de anticorpo Fab ou scFv. Em uma modalidade relacionada, oanticorpo isolado é uma IgG. Em outra modalidade relacionada, o anticorpoisolado é uma IgGI ou uma lgG4.

Em outra modalidade, a invenção provê uma composição farma-cêutica tendo pelo menos um de qualquer um dos anticorpos acima ou frag-mentos funcionais ou variantes conservativas e um veículo ou excipientefarmaceuticamente aceitável para tal.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um animal trans-gênico carregando um gene codificando qualquer um dos anticorpos acimaou fragmentos funcionais deles.Em certas modalidades, a invenção provê um método para tra-tamento de um distúrbio ou condições associadas à presença de uma célulatendo um receptor direcionado para IL-13. O método envolve a administra-ção a um indivíduo com necessidade uma quantidade eficaz de qualqueruma das composições farmacêuticas acima. Em uma modalidade relaciona-da, o distúrbio ou condição a ser tratado é um distúrbio respiratório.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é as-ma brônquica, que é uma doença inflamatória persistente comum do pulmãocaracterizada por hiper-responsividade das vias aéreas superiores (AHR),superprodução de muco, fibrose e níveis de IgE no soro aumentados. Li eoutros, Abstract for pôster submitted at The Americam Thoraic Society An-nual Meeting, 2003, Seattle, relataram efeitos de um anticorpo de IL-13 anti-camundongo neutralizante em um modelo de camundongo crônico de asma.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado éuma Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (COPD). Zheng e outros, J. Clin.Invest., 2000.106 (9): p; 1081-93, demonstraram que superexpressão de IL-13 no pulmão do camundongo causou enfisema, produção de muco elevadae inflamação, refletindo aspectos de COPD humana. Níveis de mRNA de IL-13 foram mostrados ser maiores em amostras de tecido de autópsia de indi-víduos com uma história de COPD quando comparado com amostras depulmão de indivíduo sem nenhuma doença pulmonar relatada (J. Elias, Oraleommunieation at American Thoracic Soeiety Annual Meeting, 2002). Emoutro estudo, níveis aumentados de IL-13 foram demonstrados através deimuno-histoquímica em seções de pulmão periféricas de pacientes COPD[Wardlaw, A.J., Clin. Med., 2001.1 (3): p. 214-8],

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é se-lecionado de outras doenças e condições inflamatórias ou obstrutivas dasvias aéreas superiores tal como dano ao pulmão agudo (ALI), síndrome dodesconforto respiratório agudo/adulto (ARDS), dispnéia, inflamação da viaaérea alérgica, doença da via aérea pequena, carcinoma de pulmão, sín-drome do peito aguda em pacientes com doença de célula falciforme e hiper-tensão pulmonar, bem como exacerbação de hiper-reatividade das vias aé-reas conseqüente a outra terapia de fármaco, em particular outra terapia defármaco inalado.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado ébronquite de qualquer tipo ou gênese incluindo, por exemplo, bronquite agu-da, araquídica, catarral, croupus, crônica ou ftinoide.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado incluipneumoconiose (uma doença dos pulmões, inflamatória, geralmente ocupa-cional, freqüentemente acompanhada por obstrução das vias aéreas superi-ores, seja aguda ou crônica, e ocasionada por inalação repetida de pós), dequalquer tipo ou gênese, incluindo, por exemplo, aluminose, antracose, as-bestose, calicose, ptilose, siderose, silicose, tabacose e bissinose.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é se-lecionado de rinite atópica (febre do feno), dermatite alérgica (eczema) esinusite crônica. Níveis aumentados de IL-13 foram medidos em indivíduoshumanos com rinite atópica (febre do feno), dermatite alérgica (eczema) esinusite crônica. Por exemplo, níveis de IL-13 foram verificados ser mais al-tos em células de biópsias bronquiais, lavagem do septo e bronco-alveolar(BAL) de asmáticos comparado com indivíduos controle [Humbert, M. e ou-tros, J. Allergy Clin. Immunol., 1997.99 (5): p. 657-65, Kotsimbos, T.C., P.Ernest e Q.A. Hamid, Proc. Assoc. Am. Physicians, 1996.108 (5): p. 368-73,Komai-Koma, M. F.Y Liew e P.C. Wilkinson, J. Immunol., 1995.155 (3): p.1110-6, Naseer, T. e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997],

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é se-lecionado de outras condições inflamatórias da pele, por exemplo, psoríaseou lúpus eritematoso.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é do-ença inflamatória do intestino, tal como colite ulcerativa e doença de Crohn.Heller e outros (2002) Immunity, 17(5):629-38, relatam que neutralização deIL-13 através da administração de IL-13Ra2 solúvel melhorou a inflamaçãocolônica em um modelo de murino de colite ulcerativa humana. Correspon-dentemente, expressão de IL-13 foi maior em espécies de biópsia retal depacientes com colite ulcerativa quando comparado com controles.Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é se-lecionado de outras condições fibróticas, tal como esclerose sistêmica, fibro-se pulmonar, fibrose pulmonar idiopática ou pulmão fibroide. Níveis aumen-tados de IL-13 foram medidos no soro de pacientes com esclerose sistêmica[Hasegawa, M. e outros, J. Rheumatol., 1997.24 (2): p. 328-32] e em amos-tras de BAL de pacientes afetados com outras formas de fibrose pulmonar[Hancock, A. e outros, Am. J. Respir. Cell Moi Biol., 1998].

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é fibrosedo fígado. Inibição específica de IL-13 através da administração de IL-13Ra2solúvel ou rompimento do gene de IL-13, mas não ablação de produção deIL-4, preveniu fibrogênese no fígado [Fallon, P.G e outros, J. Immunol.,2000.164 (5): p. 2585-91, Chiaramonte, M.G. e outros, J. Clin. Invest., 1999.104(6): p. 777-85, Chiaramonte, M.G. e outros, Hepatology, 2001.34(2): p. 273-82].

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é do-ença de Hodgkin. A doença de Hodgkin é incomum dentre males pelo que acélula Reed-Sternberg neoplástica, freqüentemente derivada de células B,forma apenas uma pequena proporção da massa clinicamente detectável.Linhagens de célula derivadas de doença de Hodgkin e células Reed-Sternberg primárias freqüentemente expressam IL-13 e seu receptor [Skin-nider, B.F. e outros, Blood, 2001.97(1): p. 250-5]. Como IL-13 promove so-brevivência e proliferação celulares em células B normais, foi proposto queIL-13 poderia agir como um fator de crescimento para células Ree-Sternberg. Skinnider e outros demonstraram que anticorpos de neutralizaçãocontra IL-13 podem inibir o crescimento de linhagens de célula derivadas dedoença de Hodgkin in vitro [Kappu, U. e outros, J. Exp. Med., 1999.189 (12):p. 1939-46]. Essas constatações sugerem que células Reed-Sternberg pode-riam aumentar sua própria sobrevivência por uma alça de citocina autócrinae parácrina de IL-13. De acordo com esta hipótese, níveis aumentados deIL-13 foram detectados no soro de alguns pacientes com doença de Hodkingquando comparado com controles normais [Fiumara, P. F., Cabanillas e A.Younes, Blood, 2001.98 (9): p.2877-8]. Inibidores de IL-13 podem então pre-venir progressão de doença através da inibição da proliferação de célulasReed-Sternberg malignas.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é re-corrência ou metástase de tumor. Inibição de IL-13 foi mostrada aprimorarvacinas antivirais em modelos de animal e pode ser benéfica no tratamentode HIV e outras doenças infecciosas [Ahlers, J.D. e outros, Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 2002]. Muitas células de câncer humanas expressam antígenosespecíficos de tumor imunogênicos. No entanto, embora muitos tumores es-pontaneamente regridam, vários evadem o sistema imune (imunovigilância)ao suprimir imunidade mediada por célula T. Terabe e outros, Nat. Immunol.,2000.1 (6): p. 515-20, demonstraram um papel de IL-13 em imunossupres-são em um modelo de camundongo onde tumores espontaneamente regri-dem após crescimento inicial e então recorrem. Inibição específica de IL-13,com IL-13Ra2 solúvel, protegeu esses camundongos de recorrência de tu-mor. Terabe e outros continuaram a mostrar que IL-13 suprime a diferencia-ção de linfócitos citotóxicos CD8+ específicos de tumor que fazem a media-ção de respostas imunes antitumor.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado éuma infecção viral respiratória, que exacerba condições crônicas de base talcomo asma, bronquite crônica, COPD, otite média e sinusite. A infecção viralrespiratória tratada pode ser associada à infecção bacteriana secundária, talcomo otite média, sinusite ou pneumonia.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado é se-lecionado de outras doenças ou condições, em particular doenças ou condi-ções tendo um componente inflamatório, por exemplo, doenças do osso ejuntas incluindo artrite reumatoide, artrite psoriática e outras doenças tal co-mo aterosclerose, esclerose múltipla e rejeição de aloenxerto aguda ou crô-nica, por exemplo, seguindo transplante de coração, rim, fígado, pulmão oumedula óssea.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado échoque endotóxico, glomerulonefrite, isquemia cerebral e cardíaca, doençade Alzheimer, fibrose cística, ínfecções por vírus e exacerbações associadasà elas, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), esclerose múltipla(MS), gastrite associada com Helicobacter pylori e cânceres, particularmenteo crescimento de câncer ovariano.

Em outra modalidade, o distúrbio ou condição a ser tratado sãoos sintomas causados por infecção viral em um humano que é causada pelorinovírus humano, outros enterovírus, coronavírus, herpes vírus, vírus influ-enza, vírus parainfluenza, vírus sincial respiratório ou um adenovírus.

Tratamento de acordo com a presente invenção pode ser sinto-mático ou profilático.

A eficácia de um agente da invenção na inibição de condiçõesinflamatórias, por exemplo, em doenças das vias aéreas respiratórias, podeser demonstrada em um modelo de animal, por exemplo, modelo de camun-dongo, rato ou coelho, de inflamação das vias aéreas ou outras condiçõesinflamatórias, por exemplo, conforme descrito por Wada e outros, J. Exp.Med. (1994) 180:1135-40; Sekido e outros, Nature (1993) 365:654-57; Mo-delska e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med. (1999) 160:1450-56; e Laffone outros (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med., 160:1443-49.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um método paraidentificação de uma célula tendo um receptor para IL-3. Este método envol-ve contato da célula com qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de anti-corpo acima tendo ainda um marcador detectável. O marcador é radioativo,fluorescente, magnético, paramagnético ou quimioluminescente. O métodopode ainda envolver qualquer um dos acima formando imagem ou separan-do a célula marcada.

Em outra modalidade, qualquer um dos anticorpos ou fragmentosde anticorpo humanos ou humanizados acima são sintéticos.

Em outra modalidade, a invenção provê uma composição farma-cêutica e um agente terapêutico adicional.

O agente terapêutico adicional pode ser selecionado do grupoconsistindo em substâncias de fármaco anti-inflamatório, broncodilatador,anti-histamina ou antitussígeno, particularmente no tratamento de doençasdas vias aéreas obstrutivas ou inflamatórias tal como aquelas mencionadosaqui anteriormente, por exemplo, como potencializadores de atividade tera-pêutica de tais fármacos ou como um meio de redução da dosagem requeri-da ou efeitos colaterais potenciais de tais fármacos. Um agente terapêuticoda invenção pode ser misturado com a outra substância de fármaco em umacomposição farmacêutica fixa ou ele pode ser administrado separadamente,antes, simultaneamente com ou após a outra substância de fármaco. Destemodo a invenção inclui uma combinação de um agente da invenção confor-me aqui anteriormente descrito com uma substância de fármaco anti-inflamatório, broncodilatadora, anti-histamina ou antitussígeno, o dito agenteda invenção e a dita substância de fármaco estando na mesma composiçãofarmacêutica ou uma diferente.

Fármacos anti-inflamatórios adequados incluem esteroides, emparticular glucocorticosteroides tal como budenosida, dipropionato de becla-metasona, propionato de fluticasoina, ciclesonida ou furoato de mometasonaou esteroides descritos nos WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879,WO 02/00679 (especialmente aqueles dos Exemplos 3, 11, 14, 17, 19, 26,34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 e 101), WO 03/35668, WO 03/48181,WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 e WO 04/66920;agonistas de receptor de glucocorticoide não-esteroidais, tais como aquelesdescritos nos DE 10261874, WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280,WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 eWO 04/26248; antagonistas deLTB4 tal como BIIL 284, CP- 195543, DPCI 1870, LTB4 etanolamida, LY293111, LY 255283, CGS025019C, CP- 195543, ONO-4057, SB 209247,SC-53228 e aqueles descritos na US 5451700; tais antagonistas de LTD4incluem montelucaste, pranlucaste, zafírlucaste, accolate, SR2640, Wy-48,252, ICI 198615, MK-571, LY-171883, Ro 24-5913 e L-648051; inibidoresde PDE4 tal como cilomilast (Ariflo® GIaxoSmithKIine), Roflumilast (Byk Gul-den), V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (Schering-Plough), Arofilina (Almirall Prodesfarma), PDI 89659 / PD168787 (Parke-Davis), AWD-12-281 (Asta Medica), CDC-801 (Celgene), SeICID(TM) CC-10004 (Celgene), VM554/UM565 (Vemalis), T-440 (Tanabe), KW-4490(Kyowa Hakko Kogyo) e aqueles descritos nos WO 92/19594, WO 93/19749,WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953,WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457,WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO5 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO 04/019945,WO 04/045607 e WO 04/037805; agonistas de A2a tal como aqueles descri-tos rios EP 1052264, EP 1241176, EP 409595A2, WO 94/17090, WO96/02543, WO 96/02553, WO 98/28319, WO 99/24449, WO 99/24450, WO99/24451, WO 99/38877, WO 99/41267, WO 99/67263, WO 99/67264, WO99/67265, WO 99/67266, WO 00/23457, WO 00/77018, WO 00/78774, WO01/23399, WO 01/27130, WO 01/27131, WO 01/60835, WO 01/94368, WO02/00676, WO 02/22630, WO 02/96462 e WO 03/086408; e antagonistas deA28 tal como aqueles descritos no WO 02/42298.

Fármacos broncodilatadores adequados incluem agentes antico- linérgicos ou antimuscarínicos, em particular brometo de ipatrópio, brometode oxitrópio, sais de tiotrópio e CHF 4226 (Chiesi) e glicopirrolato, mas tam-bém aqueles descritos nas EP 424021, US 3714357, US 5171744, WO01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 e WO 04/05285; eagonistas de adrenoceptor beta-2 tal como albuterol (salbutamol), metapro-terenol, terbutalina, salmeterol fenoterol, procaterol e especialmente formote-rol, carmoterol e seus sais farmaceuticamente aceitáveis e compostos (emforma de sal livre ou solvato) de fórmula I do WO 00/75114, documento queé aqui incorporado a título de referência, de preferência compostos dos seus

Exemplos, especialmente um composto de fórmula

<formula>formula see original document page 12</formula>

isto é, (5-[(R)-2-(5,6-Dietil-indan-2-ilamino)-1-hidróxi-etil]-8-hidróxi-1 H-quinolin-2- ona) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como compostos(na forma livre ou sal ou solvato) de fórmula I do WO 04/16601, e tambémcompostos dos EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035,US 2002/0055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618 WO 04/46083 , WO 04/80964,ΕΡ1460064, WO 04/087142, WO 04/089892, EP 01477167, US 2004/0242622, US 2004/0229904, WO 04/108675, WO 04/108676, WO 05/033121,WO 05/040103 e WO 05/044787.

Fármacos anti-inflamatórios e broncodilatadores duplos adequa-dos incluem agonistas de adrenoceptor beta-2 /antagonistas muscarínicosduplos tal como aqueles descritos nos US 2004/0167167, WO 04/74246 eWO 04/74812.

Substâncias de fármaco anti-histamina adequadas incluem clori-drato de cetirizina, acetaminofeno, fumarato de clemastina, prometazina,loratidina, desloratidina, cloridrato de difenilidramina e fexofenadina, activas-tina, astemizol, azelastina, ebastina, epinastina, mizolastina e tefenadinabem como aquelas reveladas nos JP 2004107299, WO 03/099807 e WO04/026841.

Combinações de agentes terapêuticos da invenção e agentesanticolinérgicos ou antimuscarínicos, esteroides, agonistas de beta-2, inibi-dores de PDE4, agonistas de receptor de dopamina, antagonistas de LTD4ou antagonistas de LTB4 podem ser também usadas. Outras combinaçõesúteis dos agentes da invenção com fármacos anti-inflamatórios são aquelascom outros antagonistas de receptores de quimiocina, por exemplo, CCR-1,CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 e CCR10, CXCR11,CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas de CCR-5tal como antagonistas da Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 e SCH-D, antagonistas Takeda tal como cloreto de N-[[4-[[[6,7-di-hidro-2-(4-metilfenil)-5H-benzociclo-hepten-8-il]carbonil]amino]fenil]-metil]-tetra-hidro-N,N-dimetil-2H-piran-4-amino (TAK-770), antagonistas de CCR-5 descritosna US 6166037 (particularmente reivindicações 18 e 19), WO 0066558 (parti-cularmente reivindicação 8), WO 0066559 (particularmente reivindicação 9),WO 04/018425 e WO 04/026873.

O agente terapêutico adicional pode ser também selecionado dogrupo consistindo em outras moléculas de ligação de citocina, particularmen-te anticorpos de outras citocinas, em particular uma combinação com umanticorpo anti-IL4, tal como descrito no PCT/EP2005/00836, e anticorpo anti-IgE, tal como Xolair®, um anticorpo anti-IL31, um anticorpo anti-IL-31R, umanticorpo anti-TSLP, um anticorpo de receptor anti-TSLP, um anticorpo anti-endoglina, um anticorpo anti-IL1b ou outro anticorpo anti-IL13, tal como des-crito no WO 05/007699.

Em uma certa modalidade, a invenção provê um anticorpo tendouma primeira seqüência de aminoácido que é uma cadeia pesada selecio-nada de um a três de SEQ ID NOs: 6-10 e uma seqüência tendo pelo menos60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de seqüência nas regiões deCDR com as regiões de CDR tendo SEQ ID NOs: 6-10; e uma segunda se-quência de aminoácido que é uma cadeia leve selecionada de uma a três deSEQ ID NOs: 16-22 e uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95por cento de identidade de seqüência nas regiões de CDR com as regiõesde CDR mostradas nas SEQ ID NOs: 16-22.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um imunoconjuga-do feito de um primeiro componente que é um anticorpo ou fragmento dele eum segundo componente tendo uma segunda seqüência de aminoácido. Porexemplo, o imunoconjugado é uma citotoxina, ou o imunoconjugado é umaproteína ou anticorpo de ligação tendo uma especificidade de ligação paraum alvo que é diferente de IL-13.

Em certas modalidades, a invenção provê um anticorpo biespecífico.

Em outra modalidade, a invenção provê um kit tendo um anticor-po ou fragmento de anticorpo dele. Em algumas modalidades, o kit contémainda um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável então. Em ou-tras modalidades relacionadas, o anticorpo no kit está presente em uma do-se unitária. Em ainda outra modalidade relacionada, o kit inclui instruçõespara uso na administração a um indivíduo.Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção refere-se a anticorpos isolados, particular-mente anticorpos humanos, que se ligam especificamente a IL-13 e que ini-bem as propriedades funcionais de IL-13. Em certas modalidades, os anti-corpos da invenção são derivados de seqüências de cadeia pesadas e levesparticulares e/ou compreendem características estruturais particulares talcomo regiões de CDR compreendendo seqüências de aminoácido particula-res. A invenção provê anticorpos isolados, métodos de fabricação de taisanticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo taisanticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunocon-jugados ou moléculas biespecíficas da invenção. A invenção refere-se tam-bém a métodos de uso dos anticorpos para inibir um distúrbio ou condiçãoassociado à presença de IL-13 alvo de receptor celular, por exemplo, no tra-tamento de uma condição inflamatória ou alérgica, particularmente uma do-ença da via aérea inflamatória ou obstrutiva.

A fim de que a presente invenção possa ser mais prontamentecompreendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionaissão mostradas durante a descrição detalhada.

O termo 'interleucina-13' ou 'IL-13' é, exceto onde o contexto ditarde outro modo, faz referência a IL-13 humana. A presente invenção provêanticorpos para IL-13 humana, especialmente anticorpos humanos, que sãoreativos cruzados com IL-13 de primata não-humano, incluindo IL-13 de ma-caco cinomólogo e rhesus. Anticorpos de acordo com algumas modalidadesda presente invenção reconhecem uma variante de IL-13 onde o resíduoarginina na posição de aminoácido 130 é substituído por glutamina. Em ou-tros aspectos e modalidades a presente invenção provê membros de ligaçãoespecíficos contra IL-13 de murino, especificamente IL-13 de camundongo.

O termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, Iin-fócitos, células apresentando antígeno, células fagocíticas, granulócitos emacromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (in-cluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em dano seletivo a,destruição de ou eliminação do corpo humano de patógenos invasores, célu-Ias ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas, ou, em casosde autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanosnormais.

Um "curso de transdução de sinal" refere-se à relação bioquímicaentre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempe-nham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célulapara uma outra porção de uma célula. Conforme aqui usado, a expressão"receptor de superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexosde moléculas capazes de receber um sinal e capazes da transmissão de talsinal através da membrana de plasma de uma célula. Um exemplo de um"receptor de superfície celular" da presente invenção é o receptor de IL-13ao qual a molécula da proteína IL-13 se liga.

O termo "anticorpo" conforme referido aqui inclui anticorpos inte-grais e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, "porção de ligaçãode antígeno") ou suas cadeias simples. Um "anticorpo" de ocorrência naturalé uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H)e duas leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesa-da é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada a-qui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constantede cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cadacadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abrevia-da aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constantede cadeia leve é compreendida de um domínio, Cl- As regiões Vh e Vl po-dem ser mais subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regi-ões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regi-ões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FR). CadaVh e Vl é composta de três CDRs e quatro FRs dispostas do terminal aminoao terminal carbóxi na ordem que segue: FR1, CDR1 , FR2, CDR2, FR3,CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um do-mínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dosanticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatoreshospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, célulasefetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ousimplesmente "porção de antígeno"), conforme aqui usado, refere-se a umou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade em especifi-camente se ligar a um antígeno (por exemplo, IL-13). Foi mostrado que afunção de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por frag-mentos de um anticorpo de comprimento integral. Exemplos de fragmentosde ligação compreendidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno"de um anticorpo incluem um fragmento Fab1 um fragmento monovalenteconsistindo nos domínios Vl, Vh, Cl e CH1; um fragmento F(ab)2, um frag-mento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma pontedissulfeto na região de impedimento; e um fragmento Fd consistindo nosdomínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo nos domínios Vl e Vh deum braço único de um anticorpo; um fragmento dAb (Ward e outros, 1989,Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e uma região de de-terminação de complementaridade isolada (CDR).

Ainda, embora os dois domínios do fragmento Fv1 Vl e VH, sejamcodificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodosrecombinantes, por um Iigante sintético que permite que eles sejam tornadosuma cadeia de proteína única onde as regiões VL e Vh se emparelham paraformarem moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples(scFv); vide, por exemplo, Bird e outros, 1988, Science 242:423-426; e Hus-ton e outros, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci., 85:5879-5883). Tais anticorpos decadeia simples pretendem também ser compreendidos dentro do termo"porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Esses fragmentos de anti-corpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas daqueles ver-sados na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à utilidade da mes-ma maneira que são os anticorpos intactos.

Um "anticorpo isolado", conforme aqui usado, refere-se a um an-ticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificida-des antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se ligaespecificamente a lL-13 é substancialmente livre de anticorpos que se ligamespecificamente a antígenos outros que não IL-13). Um anticorpo isoladoque especificamente se liga a IL-13 pode, no entanto, ter reatividade cruzadacom outros antígenos, tal como moléculas de IL-13 de outras espécies. Alémdisso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro materialcelular e/ou agentes químicos.

O termo "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpomonoclonal" conforme aqui usado refere-se a uma preparação de moléculasde anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpomonoclonal mostra uma especificidade de ligação única e afinidade para umepítopo particular.

O termo "anticorpo humano", conforme aqui usado, pretende in-cluir anticorpos tendo regiões variáveis onde ambas regiões de estrutura eCDR são derivadas de seqüências de origem humana. Ainda, se o anticorpocontiver uma região constante, a região constante é também derivada de taisseqüências humanas, por exemplo, seqüências de linhagem germinativahumana, ou versões mutadas de seqüências de linhagem germinativa hu-mana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de ami-noácido não codificados por seqüências humanas (por exemplo, mutaçõesintroduzidas por metagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", confor-me aqui usado, não pretende incluir anticorpos onde seqüências de CDRderivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, tal comoum camundongo, foram enxertadas em seqüências de estrutura humana.

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos mostrando uma especificidade de ligação única que têm regiões variáveisonde ambas regiões de estrutura e CDR são derivadas de seqüências hu-manas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são pro-duzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não-humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgenede cadeia leve humanos fundidos a uma célula imortalizada.

O termo "anticorpo humano recombinante", conforme aqui usado,inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criadosou isolados por meios recombinantes, tal como anticorpos isolados de umanimal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromos-somal para genes de imunoglobulina humanos ou um hibridoma preparado apartir deles, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada paraexpressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, anticorposisolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatorial, recombinan-te, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de qual-quer outro meio que envolva união de todo ou uma porção de um gene deimunoglobulina humano, seqüências a outras seqüências de DNA. Tais anti-corpos humanos recombinantes têm regiões variáveis onde as regiões deestrutura e de CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de li-nhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anti-corpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagênese invitro (ou, quando um animal transgênico para seqüências Ig humanas forusado, mutagênese somática in vivo) e então as seqüências de aminoácidodas regiões Vh e Vl dos anticorpos recombinantes são seqüências que, em-bora derivadas de e relacionadas com seqüências Vh e Vl de linhagem ger-minativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório delinhagem germinativa de anticorpo humano in vivo.

Conforme aqui usado, "isotipo" refere-se à classe de anticorpo(por exemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgG1 ou lgG4) que é codificado pelosgenes de região constante de cadeia pesada.

As expressões "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "umanticorpo específico para um antígeno" são usadas intercomutavelmenteaqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

Conforme aqui usado, um anticorpo que "se liga especificamentea IL-13 humana" pretende se referir a um anticorpo que se liga a IL-13 hu-mana com um Kd de 5 x 10-9 M ou menos. Anticorpo que "se liga com cru-zamento com um antígeno outro que não IL-13 humana" pretende se referira um anticorpo que se liga a este antígeno com 5 x 10-9 M ou menos. Umanticorpo que "não reage com cruzamento com um antígeno particular" pre-tende se referir a um anticorpo que se liga a este antígeno com um K0 de 1,5χ 10"8 M ou mais, ou um Kd de 5"10 χ 10"8 M ou 1 χ 10"7 M ou mais. Em certasmodalidades, tais anticorpos que não reagem com cruzamento com o antí-geno exibem ligação essencialmente não-detectável contra essas proteínasem ensaios de ligação padrão.

Conforme aqui usado, um anticorpo que "iniba a ligação de IL-13ao receptor de IL-13" refere-se a um anticorpo que inibe a ligação de IL-13ao receptor com um K0 de 5 nM ou menos.

Conforme aqui usado, um anticorpo que "inibe a liberação demediador inflamatório" pretende se referir a um anticorpo que inibe liberaçãode eotaxina induzida por IL-13 a partir de fibroblastos de pulmão humanocom uma IC5o de menos do que 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1,0 nM, 0,5 nM oumenos.

O termo "KaSsoc" ou "Ka", conforme aqui usado, pretende se referirà taxa de associação de uma interação de anticorpo-antígeno particular, en-quanto o termo "Kdis" ou "Kd", conforme aqui usado, pretende se referir à ta-xa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. O ter-mo "Kd", conforme aqui usado, pretende se referir à constante de dissocia-ção, que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (isto é, KdZKa) e é expressacomo uma concentração molar (M). Valores de K0 para anticorpos podemser determinados usando métodos bem-estabelecidos na técnica. Um méto-do para determinação do Kd de um anticorpo é através do uso de ressonân-cia de plásmon de superfície, ou usando um sistema biossensor tal como umsistema Biacore®.

Conforme aqui usado, o termo "alta afinidade" para um anticorpoIgG refere-se a um anticorpo tendo um K0 de 10"8 M ou menos, 10"9 M oumenos ou 10"10 M ou menos para um antígeno-alvo.

Conforme aqui usado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animalhumano ou não-humano. O termo "animal não-humano" inclui todos os ver-tebrados, por exemplo, mamíferos e não-mamíferos, tal como primatas não-humanos, ovelha, cachorros, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, rép-teis, etc.Vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhes nassubseções que seguem.

Ensaios-padrão para avaliar a capacidade de ligação de anticor-po com relação a IL-13 de várias espécies são conhecidos na técnica, inclu-indo, por exemplo, ELISAs, western blots e RIAs. Ensaios adequados sãodescritos em detalhes nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo,afinidade de ligação) dos anticorpos pode também ser avaliada através deensaios-padrão conhecidos na técnica, tal como através de análise Biacore.Ensaios para avaliar os efeitos dos anticorpos sobre propriedades funcionaisde IL-13 são descritos em mais detalhes nos Exemplos.

Deste modo, um anticorpo que "inibe" uma ou mais dessas pro-priedades funcionais de IL-13 (por exemplo, atividades bioquímica, imuno-química, celular, fisiológica ou outras, ou similar) conforme determinado deacordo com metodologias conhecidas na técnica e descritas aqui será com-preendido se relacionar com uma diminuição estatisticamente significante naatividade particular com relação àquela vista na ausência do anticorpo (porexemplo, ou quando um anticorpo controle de especificidade irrelevante estápresente). Um anticorpo que inibe atividade de IL-13 realiza tal diminuiçãoestatisticamente significante em pelo menos 10% do parâmetro medido, empelo menos 50%, 80% ou 90%, e em certas modalidades um anticorpo da in-venção pode inibir mais de 95%, 98% ou 99% de atividade funcional de IL-13.

Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos,isolados e estruturalmente caracterizados, conforme descrito nos Exemplos1-5. As seqüências de aminoácido de Vh dos anticorpos são mostradas nasSEQ ID NOs: 6-10, respectivamente. As seqüências de aminoácido de Vldos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 16-22, respectivamente.Outros anticorpos da invenção incluem aminoácidos que foram mutados,ainda tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 de identidade percentual nasregiões de CDR com as regiões de CDR mostradas nas seqüências descri-tas acima.

Uma vez que cada um desses anticorpos pode se ligar a IL-13,as seqüências de Vh e Vl podem ser "misturadas e combinadas" para cria-rem outras moléculas de ligação anti-IL-13 da invenção. Ligação de IL-13 detais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada usando os en-saios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).

Quando cadeias de Vh e Vl são misturadas e combinadas, uma seqüênciade Vh de um par VH/VL particular deve ser substituída com uma seqüência deVh estruturalmente similar. Da mesma maneira, uma seqüência de Vl de umpar Vh/Vl particular deve ser substituída com uma seqüência de Vl estrutu-ralmente similar. As seqüências de Vh e Vl dos anticorpos da presente in-venção são particularmente condescendentes à mistura e combinação, umavez que esses anticorpos usam seqüências de Vh e Vl derivadas das mes-mas seqüências de linhagem germinativa e então exibem similaridade estru-tural.

Em outro aspecto, a invenção provê anticorpos que compreen-dem as CDR1s, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada e cadeia leve dos anti-corpos, ou combinações delas. As seqüências de aminoácido da CDRIs deVh dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 6-7. A seqüência de a -minoácido das CDR2s de Vh dos anticorpos é mostrada na SEQ ID NO: 8.As seqüências de aminoácido das CDR3s de Vh dos anticorpos são mostra-das nas SEQ ID NOs: 9-10. As seqüências de aminoácido das CDRIs de Vldos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 16-18. As seqüências deaminoácido das CDR2s de Vl dos anticorpos são mostradas na SEQ ID NO:19. As seqüências de aminoácido das CDR3s de Vl dos anticorpos são mos-tradas nas SEQ ID NOs: 20-22. As regiões de CDR são delineadas usando osistema Kabat (Kabat, E.A. e outros, 1991, Sequences of Proteins of Immu-nological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and HumanServices, Publicação NIH Ns 91-3242).

Dado que cada um desses anticorpos pode ser ligar a IL-3 e quea especificidade de ligação de antígeno é provida principalmente pelas regiõesCDR1, 2 e 3, as seqüências de CDR1, 2 e 3 de Vh e a seqüências CDR1, 2 e 3de Vl podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDRs de anticorposdiferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo de-va conter uma CDR1, 2 e 3 de Vh e uma CDR1, 2 e 3 de VL) para criar ou-tras moléculas de ligação anti-IL-13 da invenção. Ligação de IL-13 de taisanticorpos "misturados e combinados" pode ser testada usando os ensaiosde ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Quandoseqüências de CDR de Vh são misturadas e combinadas, a seqüência deCDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência de Vh particular deve ser substi-tuída com uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es). Da mesmamaneira, quando seqüências de CDR de VL são misturadas e combinadas, aseqüência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência de VL particulardeve ser substituída com sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es).Será prontamente aparente ao versado de habilidade comum na técnica queseqüências de VH e VL novas podem ser criadas através da substituição deuma ou mais seqüências de região de CDR de VH e/ou VL com seqüênciasestruturalmente similares das seqüências de CDR mostradas aqui para anti-corpos monoclonais da presente invenção.

Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antí-geno dele tem: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreenden-do uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQID NOs: 6-7, uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendouma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, uma região variável de ca-deia pesada CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácido selecio-nada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9-10; uma região variável de ca-deia leve CDR1 compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionadado grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16-18; uma região variável de cadeialeve CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:19; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma se-qüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:20-22; onde o anticorpo se liga especificamente a IL-13.

Em uma certa modalidade, o anticorpo consiste em: uma regiãovariável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 6; uma regiãovariável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma regiãovariável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 9; uma regiãovariável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 16; uma regiãovariável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 19; e uma regiãovariável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 20.

Em outra modalidade, o anticorpo consiste em: uma região variá-vel de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 7; uma região va-riável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma regiãovariável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 10; uma regi-ão variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 17; uma regi-ão variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 19; e umaregião variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 21.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo consiste em: uma regiãovariável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 7; uma regiãovariável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma regiãovariável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 10; uma regi-ão variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 18; uma regi-ão variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 19; e umaregião variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 22.

Conforme aqui usado, um anticorpo humano compreende regiõesvariáveis de cadeia pesada ou leve que são "o produto de" ou "derivadas de"uma seqüência de linhagem germinativa particular se as regiões variáveis doanticorpo forem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina delinhagem germinativa humana. Tais sistemas incluem imunização de umcamundongo transgênico carregando genes de imunoglobulina humanoscom o antígeno de interesse ou avaliação de uma biblioteca de gene de imu-noglobulina humano mostrada no fago com o antígeno de interesse. Um an-ticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência deimunoglobulina de linhagem germinativa humana pode ser identificado destamaneira através de comparação da seqüência de aminoácido do anticorpohumano com as seqüências de aminoácido de imunoglobulinas de linhagemgerminativa humana e seleção da seqüência de imunoglobulina de linhagemgerminativa humana que é mais próxima em seqüência (isto é, % de identi-dade maior) da seqüência do anticorpo humano. Um anticorpo humano queé "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina de li-nhagem germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoáci-do conforme comparado com a seqüência de linhagem germinativa devido,por exemplo, a mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução in-tencional de mutação direcionada ao sítio. No entanto, um anticorpo humanoselecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em seqüência de ami-noácido a uma seqüência de aminoácido codificada por um gene de imuno-globulina de linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoáci-do que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando compa-rado com as seqüências de aminoácido de imunoglobulina de linhagemgerminativa de outras espécies (por exemplo, seqüências de linhagem ger-minativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelomenos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95%, ou até pelo menos 96%,97%, 98% ou 99% idêntico em seqüência de aminoácido à seqüência deaminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinati-va. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüência de linha-gem germinativa humana particular vai mostrar não mais do que diferençasde 10 aminoácidos da seqüência de aminoácido codificada pelo gene deimunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anti-corpo humano pode mostrar não mais do que 5, ou até mesmo não mais doque 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da seqüência de aminoácido codifi-cada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

Anticorpos homólogos

Em ainda outra modalidade, um anticorpo da invenção tem regi-ões variáveis de cadeias pesada e leve tendo seqüências de aminoácidoque são homólogas às seqüências de aminoácido dos anticorpos descritosaqui, e onde os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dosanticorpos anti-IL-13 da invenção.

Por exemplo, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado,ou porção de ligação de antígeno dele, compreendendo uma região variávelde cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, onde: a região vari-ável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido que épelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácido selecionada do gru-po consistindo em SEQ ID NOs: 6-10; a região variável de cadeia leve com-preende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga auma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ IDNOs: 16-22; o anticorpo se liga especificamente a IL-13, e o anticorpo exibepelo menos uma das propriedades funcionais que seguem: o anticorpo inibea ligação da proteína IL-13 ao receptor de IL-13 ou o anticorpo inibe a liga-ção de receptor de IL-13 prevenindo ou melhorando uma condição inflamató-ria ou alérgica, particularmente uma doença das vias aéreas inflamatória ouobstrutiva, ou o anticorpo inibe ligação de receptor IL-13 prevenindo ou me-lhorando asma ou o anticorpo inibe ligação de receptor IL-13 prevenindo oumelhorando COPD.

Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais ou três das propriedades funcionais discutidas acima. O anti-corpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humani-zado ou um anticorpo quimérico.

Em outras modalidades, as seqüências de aminoácido de Vhe/ou VL podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%homólogas às seqüências mostradas acima. Um anticorpo tendo regiões deVH e VL tendo alta (isto é, 80% ou mais) homologia com as regiões de Vh eVL das SEQ ID NOs: 6-10 e 16-22, respectivamente, pode ser obtido atravésde mutagênese (por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio ou mediadapor PCR) de moléculas de ácido nucleico codificando SEQ ID NOs: 6-10e/ou 16-22, seguido por teste do anticorpo alterado codificado para a funçãoretida (isto é, a função mostrada acima) usando os ensaios funcionais des-critos aqui.

Conforme aqui usado, a homologia percentual entre duas se-qüências de aminoácido é equivalente à identidade percentual entre as duasseqüências. A identidade percentual entre as duas seqüências é uma funçãodo número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, %de homologia = N° de posições idênticas/ N° total de posições χ 100), levan-do em consideração o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna,que precisa ser introduzido para alinhamento ótimo das duas seqüências. Acomparação de seqüências e determinação de identidade percentual entreduas seqüências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático,conforme descrito nos exemplos não-limitantes abaixo.

A identidade percentual entre duas seqüências de aminoácidopode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput.Appl. Biosci., 4:11-17, 1998) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma falta de comprimen-to de lacuna ("gap Ienght penalty") de 12 e uma falta de lacuna ("gap penalty")de 4. Ainda, a identidade percentual entre duas seqüências de aminoácido po-de ser determinada usando o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol.,48:444-453,1970) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de softwareGCG (disponível em http://www.gcg.com), usando ou uma matriz Blossom 62ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna ("gap weight") de 16, 14, 12, 10,8, 6 ou 4 e um peso de comprimento ("Ienght weight") de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

Adicional ou alternativamente, as seqüências de proteína dapresente invenção podem ser usadas mais como uma "seqüência de inves-tigação" ("query sequence") para realizar uma pesquisa em bancos de dadospúblicos para, por exemplo, identificar seqüências relacionadas. Tais pes-quisas podem ser realizadas usando o programa XBLAST (versão 2.0) deAltschul e outros, 1990, J. Mol. Biol., 215:403-10. Pesquisas de proteínaBLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, com-primento de palavras = 3 para se obter seqüências de aminoácido homólo-gas às moléculas de anticorpo da invenção. Para se obter alinhamentos comlacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizadoconforme descrito em Altschul e outros, 1997, Nucleic Acid Res. 25(17):3389-3402. Quando utilizando os programas BLAST e Gapped BLAST, osparâmetros de padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST eNBLAST) podem ser usados. Vide http://www.ncbi.nhn.nih.gov.

Anticorpos com modificações conservativas

Em certas modalidades, um anticorpo da invenção tem uma regi-ão variável de cadeia pesada que consiste em seqüências de CDR1, CDR2e CDR3 e uma região variável de cadeia leve consistindo em seqüências deCDR1, CDR2 e CDR3, onde uma ou mais dessas seqüências de CDR têmseqüências de aminoácido especificadas com base nos anticorpos descritosaqui ou suas modificações conservativas, e onde os anticorpos retêm aspropriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-IL-13 da invenção.Deste modo, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado, ou umaporção de ligação de antígeno dele, consistindo em uma região variável decadeia pesada consistindo em seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 e umaregião variável de cadeia leve consistindo em seqüências de CDR1, CDR2 eCDR3, onde: as regiões variáveis de cadeia pesada de CDR1 são seqüên-cias consistindo em seqüências de aminoácido selecionadas do grupo con-sistindo em seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 6-7 e suas modifica-ções conservativas; a região variável de cadeia pesada de CDR2 é uma se-qüência consistindo em uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, esuas modificações conservativas; a região variável de cadeia pesada deCDR3 são seqüências consistindo em seqüências de aminoácido seleciona-das do grupo consistindo em seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 9-10 e suas modificações conservativas; as regiões variáveis de cadeia levede CDR1 são seqüências consistindo em seqüências de aminoácido sele-cionadas do grupo consistindo em seqüências de aminoácido de SEQ IDNOs: 16-18 e suas modificações conservativas; as regiões variáveis de ca-deia leve de CDR2 são uma seqüência consistindo em uma seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 19, e suas seqüências conservativas; as regiõesvariáveis de cadeia leve de CDR3 são seqüências consistindo em sequên-cias de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em seqüências deaminoácido de SEQ ID NOs: 20-22, e suas modificações conservativas; oanticorpo se liga especificamente a IL-13; e o anticorpo inibe ligação de re-ceptor de IL-13 prevenindo liberação de mediador inflamatório.

Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais ou três ou mais das propriedades funcionais listadas discutidasacima. Tais anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, anti-corpos humanizados ou anticorpos quiméricos.Conforme aqui usado, o termo "modificações de seqüência con-servativas" pretende se referir a modificações de aminoácido que não afe-tam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpocontendo a seqüência de aminoácido. Tais modificações conservativas in-cluem substituições, adições e deleções de aminoácido. Modificações po-dem ser introduzidas em um anticorpo da invenção através de técnicas pa-drão conhecidas no campo, tal como mutagênese direcionada a sítio e mu-tagênese mediada por PCR.

Substituições de aminoácido conservativas são umas onde o re-síduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendouma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadei-as laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem ami-noácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidi-na), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico),cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina,glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias lateraisnão-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenila-lanina, metionina), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina,valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, feni-lalanina, triptofano, histidina). Deste modo, um ou mais resíduos de aminoá-cido dentro das regiões de CDR de um anticorpo da invenção podem sersubstituídos com outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeialateral, e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função retida usan-do os ensaios funcionais descritos aqui.

Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que anticorpos anti-IL-13 da in-venção

Em outra modalidade, a invenção provê anticorpos que se ligamao mesmo epítopo que os vários anticorpos anti-IL-13 da invenção providosaqui. Tais anticorpos adicionais podem ser identificados com base em suacapacidade em competir com cruzamento (por exemplo, inibir competitiva-mente a ligação de, de uma maneira estatisticamente significante) com ou-tros anticorpos da invenção em ensaios de ligação de IL-13 padrão. A capa-cidade de um anticorpo de teste em inibir a ligação de anticorpos da presen-te invenção a IL-13 humana demonstra que o anticorpo de teste pode com-petir com este anticorpo para ligação a IL-13 humana; tal anticorpo pode, deacordo com teoria não-limitante, se ligar ao mesmo epítopo ou um relacio-nado (por exemplo, um estruturalmente similar ou espacialmente proximal)em IL-13 humana como o anticorpo com o qual ele compete. Em uma certamodalidade, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em IL-13 humanaque os anticorpos da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano.Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isoladosconforme descrito nos Exemplos.

Anticorpos enqenheirados e modificados

Um anticorpo da invenção pode ser ainda preparado usando umanticorpo tendo uma ou mais seqüências de Vh e/ou Vl mostradas aqui co-mo material de partida para engenheirar um anticorpo modificado, anticorpomodificado que pode ter propriedades alteradas do anticorpo de partida. Umanticorpo pode ser engenheirado através da modificação de um ou mais re-síduos dentro de uma ou ambas regiões variáveis (isto é, Vh e/ou VL), porexemplo, dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentre de uma oumais regiões de estrutura. Adicional ou alternativamente, um anticorpo podeser engenheirado através de modificação de resíduos dentro da(s) regi-ão(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s)do anticorpo.

Um tipo de engenharia de região variável que pode ser realizadaé enxerto de CDR. Anticorpos interagem com antígenos-alvo predominante-mente através de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seisregiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeias leve epesada. Por esta razão, as seqüências de aminoácido dentro das CDRs sãomais diversas entre anticorpos individuais do que seqüência fora das CDRs.Devido ao fato das seqüências de CDRs serem responsáveis pela maior par-te das interações de anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorposrecombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência na-tural específicos através de construção de vetores de expressão que incluemseqüências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específico enxerta-das nas seqüências de estrutura de um anticorpo diferente com proprieda-des diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. e outros, 1998, Nature332:323-327; Jones1 P. e outros, 1986, Nature 321:522-525; Queen1 C. e ou-tros, 1989, Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 86:10029-10033; Patente U.S. Nq5.225.539 para Winter e Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762e 6.180.370 para Queen e outros).

Deste modo, outra modalidade da invenção refere-se a um anti-corpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação de antígeno, compreen-dendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo seqüências deCDR1 tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistin-do em SEQ ID NOs: 6-7; seqüências de CDR2 tendo uma seqüência de a-minoácido da SEQ ID NO: 8; seqüências de CDR3 tendo uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9-10, res-pectivamente; e uma região variável de cadeia leve tendo seqüências deCDR tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindoem SEQ ID NOs: 16-18; seqüências de CDR2 tendo uma seqüência de ami-noácido de SEQ ID NO: 19; e seqüências de CDR3 consistindo em uma se-qüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:20-22, respectivamente. Deste modo, tais anticorpos contêm as seqüênciasde CDR Vh e Vl de anticorpos monoclonais, mas podem conter seqüênciasestruturais diferentes desses anticorpos.

Tais seqüências de estrutura podem ser obtidas de bancos dedados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem seqüênciasde gene de anticorpo de linhagem germinativa. Por exemplo, seqüências deDNA de linhagem germinativa para genes de região variável de cadeias pe-sada e leve humanos podem ser encontradas no banco de dados de se-qüência de linhagem germinativa humana "VBase" (disponível na Internet nowww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat1 E.A. e outros, 1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. De-partment of Health and Human Services, Publicação NIH N- 91-3242; To-mlinson, I. M. e outros, 1992 J. foi. Bioi 227:776-798; e Cox, J. P. L. e ou-tros, 1994 Eur. J lmmunol. 24:827-836; cujos conteúdos são aqui incorpora-dos a título de referência.

Um exemplo de seqüências de estrutura para uso nos anticorposda invenção são aquelas que são estruturalmente similares às seqüênciasde estrutura usadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo,seqüências de consenso e/ou seqüências de estrutura usadas por anticor-pos monoclonais da invenção. As seqüências CDR1, 2 e 3 de Vh, e as se-qüências CDR1, 2 e 3 de VL, podem ser enxertadas nas regiões estruturaisque têm a seqüência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulinade linhagem germinativa da qual a seqüência de estrutura deriva, ou as se-qüências de CDR podem ser enxertadas nas regiões de estrutura que con-têm uma ou mais mutações conforme comparado com as seqüências delinhagem germinativa. Por exemplo, foi constatado que em certos casos ébenéfico mudar resíduos dentro das regiões de estrutura para manter ouaumentar a capacidade de ligação a antigeno do anticorpo (vide, por exem-plo, Patentes U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 paraQueen e outros).

Outro tipo de modificação de região variável é mutar resíduos deaminoácido dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL paraentão melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinida-de) do anticorpo de interesse, conhecida como "maturação de afinidade".Mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese mediada por PCR pode serrealizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre ligação de anti-corpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada emensaios in vitro ou in vivo conforme aqui descrito e provido nos Exemplos.Modificações conservativas (conforme acima discutido) podem ser introduzi-das. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoá-cido. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cin-co resíduos dentro de uma região CDR são alterados.

Deste modo, em outra modalidade, a invenção provê anticorposmonoclonais anti-IL-13 isolados, ou suas porções de ligação de antigeno,consistindo em uma região variável de cadeia pesada tendo: uma regiãoCDR1 de Vh consistindo em uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo tendo SEQ ID NOs: 6-7 ou uma seqüência de aminoácido tendo uma,duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoáci-do conforme comparado com SEQ ID NOs: 6-7; uma região CDR2 de Vhtendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou uma seqüência deaminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleçõesou adições de aminoácido conforme comparado com SEQ ID NO: 8; umaregião CDR de Vh tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do gru-po consistindo nas SEQ ID NOs: 9-10 ou uma seqüência de aminoácido ten-do uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições deaminoácido conforme comparado com as SEQ ID NOs: 9-10; uma regiãoCDR1 de Vl tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NOs: 16-18 ou uma seqüência de aminoácido tendouma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de ami-noácido conforme comparado com SEQ ID NOs: 16-18; uma região CDR2de Vl tendo uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 19 ou uma se-qüência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições,deleções ou adições de aminoácido conforme comparado com SEQ ID NO:19; e uma região CDR3 de Vl tendo uma seqüência de aminoácido selecio-nada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 20-22 ou uma seqüência deaminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ouadições de aminoácido conforme comparado com as SEQ ID NOs: 20-22.

Os anticorpos engenheirados da invenção incluem aqueles ondemodificações foram feitas em resíduos de estrutura dentro de Vh e/ou VL, porexemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais mo-dificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anti-corpo. Por exemplo, uma abordagem é a mutação recuperada ("backmuta-te") um ou mais resíduos de estrutura para a seqüência de linhagem germi-nativa correspondente. Mais especificamente, o anticorpo que sofreu muta-ção somática pode conter resíduos de estrutura que diferem da seqüênciade linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos depodem ser identificados comparando as seqüências de estrutura do anticor-po com as seqüências de linhagem germinativa da qual o anticorpo é deri-vado. Para retornar as seqüências de região de estrutura para sua configu-ração de linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser a muta-ção recuperada ("backmutated") para a seqüência de linhagem germinativaatravés de, por exemplo, mutagênese direcionada a sítio ou mutagênesemediada por PCR. Tais anticorpos recuperados ("backmutated") pretendemtambém ser compreendidos pela invenção.

Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutação de umou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou até mesmo dentro deuma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de célula T para entãoreduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem é tam-bém referida como "desimunização" e é descrita em mais detalhes na Publi-cação de Patente U.S. N2 20030153043 de Carr e outros.

Em adição ou alternativa para modificações feitas dentro das re-giões de estrutura ou CDR, os anticorpos da invenção podem ser engenhei-rados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente alterar umaou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida no soro,fixação de complemento, ligação de receptor Fc e/ou citotoxidez celular de-pendente de antígeno. Ainda, um anticorpo da invenção pode ser quimica-mente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem serligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, nova-mente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cadauma dessas modalidades é descrita em mais detalhes abaixo. A numeraçãode resíduos de na região Fc é aquela do índice EU de Kabat.

Em uma modalidade, a região de clivagem de CH1 é modificadade modo que o número de resíduos de cisteína na região de clivagem é alte-rado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descritamais na Patente U.S. N2 5.677.425 de Bodmer e outros. O número de resí-duos de cisteína na região de clivagem de CH1 é alterado para, por exem-plo, facilitar a montagem das cadeias pesadas e leves ou para aumentar oudiminuir a estabilidade do anticorpo.

Em outra modalidade, a região de clivagem Fc de um anticorpo é34mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especifica-mente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região deinterface do domínio CH2-CH3 do fragmento de clivagem Fc de modo que oanticorpo tem ligação da proteína A Staphylococcyl (SpA) prejudicada comrelação à ligação de SpA do domínio de clivagem Fc nativo. Esta abordagemé descrita em mais detalhes na Patente U.S. N- 6.165.745 de Ward e outros.

Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentarsua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo,uma ou mais das mutações que seguem podem ser introduzidas: T252L,T254S, T256F, conforme descrito na Patente U.S. N- 6.277.375 para Ward.Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode seralterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação dereceptor selvagem tomado de duas alças de um domínio CH2 de uma regiãoFc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.869.046 e6.121.022 de Presta e outros.

Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada substituindopelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido dife-rente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um oumais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácidodiferente de modo que o anticorpo tem uma afinidade alterada para um Ii-gante efetor, mas retém a capacidade de ligação de antígeno do anticorpode origem. O Iigante efetor para o qual afinidade é alterada pode ser, porexemplo, um receptor Fc ou o componente C1 de complemento. Esta abor-dagem é descrita em mais detalhes nas Patentes U.S. Nos. 5.624.821 e5.648.260, ambas para Winter e outros.

Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados deresíduos de aminoácido podem ser substituídos com um resíduo de aminoá-cido diferente de modo que tal anticorpo tem ligação de C1q alterada e/oucitotoxidez dependente de complemento (CDC) reduzida ou abolida. Estaabordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes U.S. Nos. 6.194.551de Idusogie e outros.

Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido sãoalterados para então alterar a capacidade do anticorpo em fixar complemen-to. Esta abordagem é descrita mais na Publicação PCT WO 94/29351 deBodmer e outros.

Em ainda outra modalidade, a região Fc é modificada para au-mentar a capacidade do anticorpo em mediar citotoxidez celular dependentede anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo para um recep-tor Fcy através da modificação de um ou mais aminoácidos. Esta abordagemé descrita mais na Publicação PCT WO 00/42072 de Presta. Além disso, ossítios de ligação em IgGI humano para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn forammapeados e variantes com ligação aperfeiçoada foram descritas (vide Shi-elds, R.L. e outros, 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604).

Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo émodificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, oanticorpo sem glicosilação). Glicosilação pode ser alterada para, por exem-pio, aumentar a afinidade do anticorpo para "antígeno". Tais modificações docarboidrato podem ser realizadas através de, por exemplo, alteração de umou mais sítios de glicosilação dentro da seqüência de anticorpo. Por exem-plo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas que resultamem eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de estrutura de regiãovariável para então eliminar glicosilação neste sítio. Tal aglicosilação podeaumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal abordagem é descritaem mais detalhes nas Patentes U.S. Nss 5.714.350 e 6.350.861 de Co e ou-tros.

Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito o qualtem um tipo alterado de glicosilação tal como anticorpo hipofucosilado tendoquantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estru-turas GIcNac divididas ao meio aumentadas. Tais padrões de glicosilaçãoalterados foram demonstrados aumentar a capacidade de ADCC de anticor-pos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas através de, porexemplo, expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com mecanis-mo de glicosilação alterado. Células com mecanismo de glicosilação altera-do foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeirasonde expressar anticorpos recombinantes da invenção para então produzirum anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, a EP 1.176.195 deHang e outros descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcio-nalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, de modo queanticorpos expressos em tal linhagem celular exibem hipofocusilação. A Pu-blicação PCT W003/035835 de Presta descreve uma linhagem de célulaCHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida em ligar fucose acarboidratos ligados a Asn(297), também resultando em hipofucosilação deanticorpos expressos naquela célula hospedeira (vide também, Shields, R.L.e outros, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). A Publicação PCT WO99/54342 de Umana e outros descreve linhagens celulares engenheiradaspara expressar glicosil transferases de modificação de glicoproteina (por e-xemplo, beta(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase Ill (GnTIII)) de modo queanticorpos expressos nas linhagens de células engenheiradas exibem estru-turas GIcNac divididas ao meio aumentadas que resulta em atividade deADCC aumentada dos anticorpos (vide também Umana e outros, 1999, Nat.Biotech. 17:176-180).

Outra modificação dos presentes anticorpos que é compreendidapela invenção é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado para, por e-xemplo, aumento da meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo.Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento dele, tipicamente éreagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster ou aldeído reativoderivado de PEG, sob condições onde um ou mais grupos PEG ficam liga-dos a um anticorpo ou fragmento de anticorpo. A peguilação pode ser reali-zada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação comuma molécula PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análo-go). Conforme aqui usado, o termo "polietileno glicol" pretende compreenderqualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outrasproteínas, tal como mono (C1-C10)alcóxi ou arilóxi-polietileno glicol ou polie-tileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguiladoé um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilação de proteínas são co-nhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Vi-de, por exemplo, Ep 0 154 316 de Nishimura e outros e EP 0 401 384 deIshikawa e outros.

Métodos de engenharia de anticorpos

Conforme acima discutido, os anticorpos anti-IL-13 tendo se-quências de Vh e Vl mostrados aqui podem ser usados para criar novos an-ticorpos anti-IL-13 através da modificação das seqüências de Vh ou Vl, ouda(s) região(ões) constante(s) ligada(s) a elas. Deste modo, em outro aspec-to da invenção, as características estruturais de um anticorpo anti-IL-13 dainvenção são usadas para criar anticorpos anti-IL-13 estruturalmente rela-cionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorposda invenção, tal como ligação a IL-13 humana e também inibição de uma oumais propriedades funcionais de IL-13 (por exemplo, ligação de receptor,inibição de liberação de mediador).

Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos da pre-sente invenção, ou suas mutações, podem ser combinadas recombinante-mente com regiões de estrutura conhecidas e/ou outras CDRs para criar an-ticorpos anti-IL-3 recombinantemente engenheirados, adicionais, da inven-ção, conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aque-las descritas na seção anterior. O material de partida para o método de en-genharia é um ou mais das seqüências de Vh e/ou Vl providas aqui, ou umaou mais regiões CDR delas. Para criar o anticorpo engenheirado, não é ne-cessário preparar realmente (isto é, expressar uma proteína) um anticorpotendo uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vl providas aqui, ou uma oumais regiões CDR delas. Pelo contrário, a informação contida na(s) sequên-cia(s) é usada como o material de partida para criar uma sequência(s) de"segunda geração" derivada(s) da(s) sequência(s) original(ais) e então a(s)sequência(s) de "segunda geração" é/são preparada(s) e expressa(s) comouma proteína.

Deste modo, em outra modalidade, a invenção provê um métodopara preparação de um anticorpo anti-IL-13 consistindo em: uma seqüênciade anticorpo de região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência deCDR1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6-7, uma sequên-cia de CDR de SEQ ID NO: 8 e/ou uma seqüência de CDR3 selecionada dogrupo consistindo em SEQ ID NOs: 9-10; e uma seqüência de anticorpo deregião variável de cadeia leve tendo uma seqüência de CDR1 selecionadado grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16-18, uma seqüência de CDR2 deSEQ ID NO: 19 e/ou uma seqüência de CDR3 selecionada do grupo consis-tindo em SEQ ID NOs: 20-22; alteração de pelo menos um resíduo de aml·noácido dentro da seqüência de anticorpo de região variável de cadeia pe-sada e/ou seqüência de anticorpo de região variável de cadeia leve para cri-ar pelo menos uma seqüência de anticorpo alterada; e expressão da se-quência de anticorpo alterada como uma proteína.

Técnicas de biologia molecular padrão podem ser usadas parapreparar e expressar a seqüência de anticorpo alterada. O anticorpo codifi-cado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) é um que retém uma, al-gumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-IL-13 descri-tos aqui, cujas propriedades funcionais incluem, mas não estão limitadas a,especificamente ligação a IL-13 humana; e o anticorpo exibe pelo menosuma das propriedades funcionais que seguem: o anticorpo inibe ligação deproteína IL-13 ao receptor de IL-13, ou o anticorpo inibe ligação do receptorde IL-13 prevenindo ou melhorando uma condição inflamatória, fibrótica oualérgica, particularmente uma doença das vias aéreas inflamatória ou obstru-tiva, ou o anticorpo inibe a ligação do receptor de IL-13 deste modo preve-nindo ou melhorando a asma.

O anticorpo alterado pode exibir uma ou mais, duas ou mais outrês ou mais das propriedades funcionais descritas acima.

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem seravaliadas usando ensaios-padrão disponíveis na técnica e/ou descritos aqui,tal como aqueles mostrados nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).

Em certas modalidades dos métodos de engenharia de anticor-pos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatória ou seletiva-mente ao longo de toda ou parte de uma seqüência de codificação de anti-corpo anti-IL-13 e os anticorpos anti-IL-13 modificados resultantes podemser avaliados quanto à atividade de ligação e/ou outras propriedades funcio-nais conforme aqui descrito. Métodos mutacionais foram descritos na técni-ca. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 de Short descreve méto-dos para criação e avaliação de mutações de anticorpo usando mutagênesepor saturação, montagem de ligação sintética ou uma combinação delas.

Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazar e outros des-creve métodos de uso de métodos de avaliação computacional para otimizarpropriedades físico-químicas de anticorpos.Moléculas de ácido nucleico codificando anticorpos da invenção

Outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucle-ico que codificam os anticorpos da invenção. Os ácidos nucleicos podemestar presentes em células inteiras, em um Iisato de célula ou podem serácidos nucleicos em uma forma parcialmente purificada ou substancialmentepura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro"quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminan-tes, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, através detécnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, associação de CsCI,cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outros bem-conhecidos na técnica. Vide F. Ausubel e outros, Ed. 1987 Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova York.

Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e podeou não conter seqüências intrônicas. Em uma modalidade, o ácido nucleicoé uma molécula de cDNA. O ácido nucleico pode estar presente em um ve-tor tal como um vetor de exposição ("display") de fago ou em um vetor deplasmídeo recombinante.

Ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando técnicasde biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (porexemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos car-regando genes de imunoglobulina humanos conforme descrito mais abaixo),cDNAs codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo produzido pelohibridoma podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão outécnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma bi-blioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de expo-sição de fago), ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser recuperadode vários clones de fago que são membros da biblioteca.

Uma vez fragmentos de DNA codificando segmentos de VH e VLsendo obtidos, esses segmentos de DNA podem ser manipulados mais atra-vés de técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converteros genes de região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimen-to integral, para genes de fragmento Fab ou para um gene de scFv. Nessasmanipulações, um fragmento de DNA codificando VL ou VH é operativamenteligado a outra molécula de DNA, ou a um fragmento codificando outra prote-ína, tal como uma região constante de anticorpo ou um Iigante flexível. Otermo "operativamente ligado", conforme usado neste contexto, pretendesignificar que os dois fragmentos de DNA são unidos de uma maneira fun-cional, por exemplo, de modo que as seqüências de aminoácido codificadaspor dois fragmentos de DNA permaneçam em estrutura, ou de modo que aproteína seja expressa sob controle de um promotor desejado.

O DNA isolado codificando a região VH pode ser convertido emum gene de cadeia pesada de comprimento integral ligando o DNA codifi-cando VH a uma outra molécula de DNA codificando regiões constantes decadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As seqüências de genes de região cons-tante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (vide, por exem-plo, Kabat, Ε. A., e outros, 1991 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services,Publicação NIH N- 91-3242) e fragmentos de DNA compreendendo essasregiões podem ser obtidos através de amplificação de PCR padrão. A regiãoconstante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGI, IgG2,lgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Para um gene de cadeia pesada de frag-mento Fab, o DNA codificando VH pode ser operativamente ligado a outramolécula de DNA codificando apenas a região constante CH1 de cadeia pe-sada.

O DNA isolado codificando a região VL pode ser convertido emum gene de cadeia leve de comprimento integral (bem como em um gene decadeia leve de Fab) ligando operativamente o DNA codificando Vl a outramolécula de DNA codificando a região constante de cadeia leve, CL. As se-qüências de genes de região constante de cadeia leve humanos são conhe-cidas na técnica (vide, por exemplo, E..A. e outros, 1991 Sequences of Pro-teins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Healthand Human Services, Publicação NIH N° 91-3242) e fragmentos de DNAcompreendendo essas regiões podem ser obtidos através de amplificaçãopor PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma regiãoconstante capa ou lambda.

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA codificandoVh e Vl são operativamente ligados a outro fragmento codificando um Iiganteflexível, por exemplo, codificando a seqüência de aminoácido (Gly4-Ser)3, demodo que as seqüências de Vh e Vl podem ser expressas como uma proteí-na de cadeia simples contígua, com as regiões Vl e Vh unidas por um Iigan-te flexível (vide, por exemplo, Bird e outros, 1988 Science 242:423-426; Hus-ton e outros, 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty eoutros, 1990 Nature 348:552-554).Produção de anticorpos monoclonais da invenção

Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos através deuma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonalconvencional, por exemplo, através da técnica de hibridização celular somá-tica padrão de Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495. Muitas técnicas paraprodução de anticorpo monoclonal podem ser empregadas, por exemplo,transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

Um sistema animal para preparação de hibridomas é o sistemade murino. Produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem-estabelecido. Protocolos e técnicas de imunização para isolamento de es-plenócitos imunizados para fusão são bem-conhecidos na técnica. Parceirosde fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos defusão são também conhecidos.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invençãopodem ser preparados com base na seqüência de um anticorpo monoclonalde murino preparado conforme acima descrito. DNA codificando as imuno-globulinas de cadeias pesada e leve pode ser obtido do hibridoma de murinode interesse e ser engenheirado para conter seqüências de imunoglobulinade não-murino (por exemplo, humanas) usando técnicas de biologia molecularpadrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis demurino podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando métodos co-nhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. N- 4.816.567 para Ca-billy e outros). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR de mu-rino podem ser inseridas em uma estrutura humana usando métodos conhe-cidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. N2 5.225.539 para Wintere Patentes U.S. N2s 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Que-en e outros.

Em uma certa modalidade, os anticorpos da invenção são anti-corpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dire-cionados contra IL-13 podem ser gerados usando camundongos transgêni-cos ou transcromossômicos carregando partes do sistema imune humano aoinvés do sistema de camundongo. Esses camundongos transgênicos etranscromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundon-gos HuMab e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente refe-ridos aqui como "camundongo Ig humano".

O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém miniloci de genede imunoglobulina humano que codificam seqüências de imunoglobulina decadeias pesada (μ e γ) e leve κ humanas não-rearranjadas, junto com muta-ções direcionadas que inativam os Ioci de cadeias μ e κ endógenas (vide,por exemplo, Lonberg e outros, 1994, Nature 368(6474):856-859). Destemodo, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de camun-dongo, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeias pesada e le-ve humanos introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática paragerar monoclonal IgGK humano de alta afinidade (Lonberg, N. e outros, 1994supra; revisto em Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmaco-Iogy 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D., 1995 lntern. Rev. lmmunolA2>\65-93, e Harding, F. e Lonberg, N., 1995 Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 764:536-546).A preparação e uso de camundongos HuMAb, e as modificações genômicascarregadas por tais camundongos, são descritos mais em Taylor1 L. e outros,1992 NucIeicAcids Research 20:6287-6295; Chen, J. e outros, 1993 Interna-tional Immunology 5: 647-656; Tuaillon e outros, 1993 Proc. Nati Acad. Sei.USA 94:3720-3724; Choi e outros, 1993 Nature GeneticsAA 17-123; Chen,J. e outros, 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon e outros, 1994 J. Immunol.152:2912-2920; Taylor1 L. e outros, 1994 International Immunology 579-591; eFishwild1 D. e outros, 1996 Nature Bioteehnology 14: 845-851, cujos conteú-dos são aqui especificamente incorporados a título de referência em sua to-talidade. Vide ainda Patentes U.S. Nas 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. Na 5,545,807 para Sura-ni e outros; Publicações PCT Nss WO 92103918, WO 93/12227, WO94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 eWO 99/45962, todas para Lonberge Kay; e Publicação PCT Na WO 01/14424 para Korman e outros.

Em outra modalidade, anticorpos humanos da invenção podemser criados usando um camundongo que carrega seqüências de imunoglo-bulina humana em transgenes e transcromossomos tal como um camundon-go que carrega um transgene de cadeia pesada humano e um transcromos-somo de cadeia leve humano. Tais camundongos, referidos aqui como "ca-mundongo KM", são descritos em detalhes na Publicação PCT N2 WO02/43478 para Ishida e outros.

Ainda, sistemas animais transgênicos alternativos expressandogenes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técnica e podem serusados para criar anticorpos anti-IL-13 da invenção. Por exemplo, um siste-ma transgênico alternativo referido como o Xenocamundongo (Abgenix, Inc.)pode ser usado; tais camundongos são descritos, por exemplo, nas PatentesU.S. Nas 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 para Ku-cherlapati e outros.

Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativosexpressando genes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técni-ca e podem ser usados para criar anticorpos anti-IL-13 da invenção. Por e-xemplo, camundongos carregando ambos um transcromossomo de cadeiapesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano, referidoscomo "camundongos TC", podem ser usados; tais camundongos são descritosem Tomizuka e outros, 2000, Proc. Nati Acad. Sei. USA 97:722-727. Ainda,vacas carregando transcromossomos de cadeias pesada e leve humanosforam descritas na técnica (Kuroiwa e outros, 2002 Nature Biotechnology20:889-894) e podem ser usadas para criar anticorpos anti-IL-13 da invenção.

Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser tambémpreparados usando métodos de exposição de fago para avaliação de bibliote-cas de genes de imunoglobulina humanos. Tais métodos de exposição de fagopara isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Vide,por exemplo, Patentes U.S. N2s 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 to paraLadner e outros; Patentes U.S. N2s 5.427.908 e 5.580.717 para Dower e ou-tros; Patentes U.S. N2s 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty e outros; Pa-tentes U.S. N2s 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e6.593.081 para Griffiths e outros

Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser tam-bém preparados usando camundongos SCID onde células imunes humanasforam reconstituídas de modo que uma resposta de anticorpo humano podeser gerada quando da imunização. Tais camundongos são descritos nas, porexemplo, Patentes U.S. N2s 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson e outros.Geração de anticorpos monoclonais humanos contra IL-13

IL-13 humana recombinante (hr) purificada conjugada a Epítoposauxiliares T Pan DR (PADRE) é usada como o antígeno. Anticorpos mono-clonais completamente humanos para IL-13 são preparados usando as Ii-nhagens HCo7 de camundongos transgênicos HuMab que expressam genesde anticorpo humano. Nesta linhagem de camundongo, o gene de cadeialeve capa de camundongo endógeno pode ser homoziguamente rompidoconforme descrito em Chen e outros, 1993, EMBO J., 12:811-820 e o genede cadeia pesada de camundongo endógeno pode ser homoziguamenterompido conforme descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01109187.Esta linhagem de camundongo carrega um transgene de cadeia leve capahumano, KCo5, conforme descrito em Fishwild e outros, 1996, Nature Biote-chnology 14:845-851 e o transgene de cadeia pesada humano HCo7 con-forme descrito nas Patentes U.S. Nss 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807.

Para gerar anticorpos monoclonais integralmente humanos paraIL-13 da invenção, camundongos HuMab são imunizados com uma mistura deIL-13 recombinante purificada derivada de conjugado de HEKEBNA/PADRE(42 ug/camundongo) e Quil A (15 ug/camundongo, Accurate Chemical). Es-quemas de imunização gerais para camundongos HuMab são descritos emLonberg, N. e outros, 1994 Nature 368(6474):856-859; Fishwild, D. e outros,1996 Nature Biotechnology 14:845-851 e Publicação PCT WO 98/24884.Camundongos transgênicos são imunizados ou intravenosamente (IV) ousubcutaneamente (SC) entre os dias 1-71. Os camundongos são reforçadosintravenosamente com antígeno (sem adjuvante) dois dias antes do sacrifí-cio e remoção do baço. RNA foi isolado dos baços usando o NucleospinRNA II isolation kit (BD Bioscience/Clontech). O RNA foi usado para geraruma biblioteca de dispaly de fago de domínios variáveis de cadeias HeLaleatoriamente ordenados em um vetor de exposição de fago conforme des-crito na Patente U.S. 6.794.132. A biblioteca de exposição de fago foi sub-metida a cinco rodadas de seleção usando hrlL-13 biotinilada em um proto-colo de ligação de equilíbrio de fase de solução conforme descrito na paten-te. As primeiras quatro rodadas de seleção empregaram hrlL-13 a 10'8 Meaúltima rodada da seleção empregou hrlL-13 a 10"9 Μ. A razão de sinal pararuído final determinada através de contagem de pfu's recuperados na pre-sença de antígeno divididos pelos pfu's recuperados na ausência de antíge-no foi 37 para esta biblioteca, indicando que mais de 90% do fago selecio-nado estavam expressando anticorpos que se ligavam a hrlL-13. A bibliotecade exposição de fago foi então subclonada em um vetor de plasmídeo para aexpressão de Fab solúvel conforme descrito na Patente U.S. 6.794.132.Geração de transfectomas produzindo anticorpos monoclonais

Os anticorpos da invenção podem ser também produzidos em umtransfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinaçãode técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene comoé bem-conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science229:1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou seus fragmentosde anticorpo, DNAs codificando cadeias leves e pesadas parciais ou decomprimento completo podem ser obtidos através de técnicas de biologiamolecular padrão (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de DNAusando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAspodem ser inseridos nos vetores de expressão de modo que os genes sãooperativamente ligados a seqüências de controle transcripcional e traducio-nal. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" pretende significar queum gene de anticorpo é ligado em um vetor de modo que seqüências decontrole transcripcional e traducional dentro do vetor servem sua função pre-tendida de regulagem da transcrição e tradução do gene de anticorpo. Ovetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são escolhi-dos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada.O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpopodem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos ge-nes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo sãoinseridos no vetor de expressão através de métodos padrão (por exemplo,ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anti-corpo e vetor, ou ligação de extremidade cega se quaisquer sítios de restri-ção estiverem presentes). As regiões variáveis de cadeias leve e pesada dosanticorpos descritos aqui podem ser usadas para criar genes de anticorpo decomprimento completo de qualquer isotipo de anticorpo através da inserçãodeles em vetores de expressão já codificando regiões constantes de cadeiaspesada e constante de cadeia leve do isotipo desejado de modo que o seg-mento de Vh é operativamente ligado ao(s) segmento(s) de CH dentro dovetor e o segmento de Vl é operativamente ligado ao segmento de CL dentrodo vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinantepode codificar um peptídeo de sinal que facilita secreção da cadeia de anti-corpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode serclonado no vetor de modo que o peptídeo de sinal é ligado em estrutura aotérmino amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode serum peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo(isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína não-imunoglobulina).

Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de ex-pressão recombinantes da invenção carregam seqüências reguladoras quecontrolam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célulahospedeira. O termo "seqüência reguladora" pretende incluir promotores,aumentadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo,sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genesde cadeia de anticorpo. Tais seqüências reguladoras são descritas, por e-xemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego1 CA 1990). Será compreendido por aquelesversados na técnica que o projeto do vetor de expressão, incluindo a seleçãode seqüências reguladoras, pode depender de fatores tal como a escolha dacélula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão de proteína de-sejado, etc. Seqüências reguladoras para expressão de célula hospedeira demamífero incluem elementos virais que direcionam níveis altos de expressãode proteína em células de mamífero, tal como promotores e/ou aumentado-res derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus(por exemplo, o adenovírus de promotor tardio principal (AdMLP)) e polioma.Alternativamente, seqüências reguladoras não-virais podem ser usadas, talcomo o promotor de ubiquitina ou promotor de P-globina. Ainda, elementosreguladores compostos de seqüências de fontes diferentes, tal como o sis-tema promotor SRa, que contém seqüências do promotor inicial de SV40 e arepetição terminal longa de vírus da leucemia de célula T humana tipo 1 (Ta-kebe, Y. e outros, 1988 Mol. CeH Biol. 8:466-472).

Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e seqüências regu-ladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carre-gar seqüências adicionais, tal como seqüências que regulam replicação dovetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genesmarcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita seleção decélulas hospedeiras onde o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, PatentesU.S. Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas de Axel e outros). Por e-xemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência afármacos, tal como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hos-pedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis in-cluem o gene de di-hidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hos-pedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (paraseleção de G418).

Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de ex-pressão codificando as cadeias pesada e leve é/são transfectados em umacélula hospedeira através de técnicas padrão. As várias formas do termo"transfecção" pretendem compreender uma ampla variedade de técnicasgeralmente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hos-pedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitaçãode cálcio-fosfato, transfecção com DEAE-dextrano e similar. É teoricamentepossível expressar os anticorpos da invenção ou em células procarióticas oueucarióticas. Expressão de anticorpos em células eucarióticas, em particularcélulas hospedeirass de mamífero, é discutida porque tais células eucarióti-cas, e em particular células de mamífero, são mais prováveis do que as célu-las procarióticas de se reunirem e secretar um anticorpo apropriadamenterevestido (folded) e imunologicamente ativo. Expressão procariótica de ge-nes de anticorpo foi descrita ser ineficaz para produção de altos rendimentosde anticorpo ativo (Boss, M.A. e Wood, C.R., 1985 Immunology Today 6:13-13).

Células hospedeiras de mamífero para expressão dos anticorposrecombinantes da invenção incluem de Ovário de Hamster Chinês (célulasCHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas por Urlaub eChasin, 1980 Proc.Nati Acad. Sei. USA 77:4216-4220 usadas com um marcador selecionávelde DH FR, por exemplo, conforme descrito em RJ. Kaufman e P.A. Sharp,1982 Mol. Biol. 159:601-621, células de mieloma de NSO, células COS ecélulas SP2. Quando vetores de expressão recombinantes codificando ge-nes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, osanticorpos são produzidos através de cultura das células hospedeiras porum período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nascélulas hospedeiras ou secreção do anticorpo no meio de cultura onde ascélulas hospedeiras são cultivadas. Anticorpos podem ser recuperados domeio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão.Imunoconiuqados

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpoanti-IL-13, ou um fragmento dele, conjugado a uma porção terapêutica, talcomo uma citocina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou umaradiotoxina. Tais conjugados são referidos aqui como "imunoconjugados".Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como"imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agenteque seja prejudicial para células (por exemplo, mate). Exemplos incluem tá-xon, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina,etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, t. colchicina, doxorrubicina,daunorrubicina, di-hidróxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, acti-nomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína,lidocaína, propanolol e puromicina e análogos ou homólogos deles. Agentesterapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo,metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoruracil decar-bazina), agentes ablativos (por exemplo, mecloretamina, tioepa cloraxnbucil,meifalan, carmustina (BSNU) e Iomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfan,dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina(II) (DDP) cisplatina, antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antes dau-nomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antesactinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem ser con-jugadas a um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, calicheamici-nas, maitansinas e auristatinas e seus derivados. Um exemplo de conjugadode anticorpo de calicheamicina está comercialmente disponível (MylotargTM:Wyeth-Ayerst).

Citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção u-sando tecnologia de ligante disponível da técnica. Exemplos de tipos de li-gante que foram usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo inclu-em, mas não estão limitados a, Iigantes contendo hidrazonas, tioéteres, és-teres, dissulfetos e peptídeo. Um Iigante pode ser escolhido que seja, porexemplo, suscetível à clivagem por pH baixo dentro do compartimento Iisos-somai ou suscetível à clivagem por proteases, tal como proteases de prefe-rência expressas em tecido de tumor tal como catepsinas (por exemplo, ca-tepsinas B, C1 D).

Para discussão adicional de tipos de citotoxinas, Iigantes e méto-dos para conjugação de agentes terapêuticos a anticorpos vide também Sai-to, G. e outros, 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199- 215; Trail, P.A. e outros,2003 Câncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G., 2003 CâncerCell 3:207-212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Câncer 2:750-763; Pastan, I. eKreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. eSpringer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Os anticorpos da presente invenção também podem ser conjuga-dos a um isótopo radioativo para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos, tam-bém referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioati-vos que podem ser conjugados a anticorpos para uso diagnostica ou tera-peuticamente incluem, mas não estão limitados a, iodo131, índio111, ítrio90 elutécio177. Métodos para preparação de radioimunoconjugados são estabele-cidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão comercialmentedisponíveis, incluindo Zevalin® (DEC Pharmaceuticals) e Bexxar® (CorixaPharmaceuticals) e métodos similares podem ser usados para preparar ra-dioimunoconjugados usando os anticorpos da invenção.

Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados paramodificar uma dada resposta biológica, e a porção de fármaco não deve serconsiderada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Porexemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídio possu-indo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por e-xemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo dela, tal comoabrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria; uma prote-ína tal como fator de necrose de tumor ou interferon-γ; ou modificadores deresposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"),interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colôniade granulócito macrófago ("GM-CSF"), fator de estimulação de colônia degranulócito ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

Técnicas para conjugação de tal porção terapêutica a anticorpossão bem-conhecidas, vide, por exemplo, Amon e outros, "Monoclonal Anti-bodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em MonoclonalAntibodies And Câncer Therapy, Reisfeld e outros (eds.), pp. 243-56 (AlanR. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros, "Antibodies For Drug Delivery", emControlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson e outros (eds.), pp. 623-53(Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn CancerTherapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological AndClinicai Applications, Pinchera e outros (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis,Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detec-tion And Therapy, Baldwin e outros (eds.), pp. 303-16 (Academic Press1985) e Thorpe e outros, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Anti-body-Toxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Moléculas biespecíficas

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a moléculasbiespecíficas compreendendo um anticorpo anti-IL-13, ou um fragmento de-le, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porções de ligação de antíge-no dele, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por e-xemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou Iigantepara um receptor) para gerar uma molécula específica que se liga a pelomenos dois sítios de ligação diferentes de moléculas-alvo. O anticorpo dainvenção pode na realidade ser derivatizado ou ligado a mais de uma outramolécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam amais de dois sítios de ligação e/ou moléculas-alvo diferentes; tais moléculasmultiespecíficas pretendem ser também compreendidas pelo termo "molécu-la biespecífica" conforme aqui usado. Para criar uma molécula biespecíficada invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (porexemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação,tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético deligação, de modo que uma molécula biespecífica resulte.

Deste modo, a presente invenção inclui moléculas biespecíficascompreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para IL-13 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo.Por exemplo, o segundo epítopo-alvo é um receptor Fc, por exemplo, FcyRI(CD64) humano ou um receptor Fca humano (CD89). Deste modo, a inven-ção inclui moléculas biespecíficas capazes de ligação a ambas moléculasefetoras expressando FcyR, FcaR ou FcsR (por exemplo, monócitos, macró-fagos ou células polimorfonucleares (PMNs) e a células-alvo expressandoIL-13. Essas moléculas biespecíficas são direcionadas a células expressan-do IL-13 para célula efetora e disparam atividades de célula efetora mediadapor receptor Fe, tais como fagocitose de uma célula expressando IL-13, cito-toxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), liberação decitocina ou geração de ânion superóxido.

Adicionalmente, para a invenção na qual a molécula biespecíficaé multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidadede ligação, em adição a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especi-ficidade de ligação anti-IL-13. Por exemplo, a terceira especificidade de liga-ção poderia ser uma porção de fator de antiaumento (EF), por exemplo, umamolécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida em atividadecitotóxica e então aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porçãode fator antiaumento" poderia ser um anticorpo, fragmento de anticorpo fun-cional ou um Iigante que se liga a uma dada molécula, por exemplo, um an-tígeno ou um receptor, e então resulta em um aumento do efeito dos deter-minantes de ligação para o receptor Fc ou o antígeno de célula alvo.

A "porção de fator antiaumento" pode se ligar a um receptor Fcou um antígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção de fator antiau-mento poderia se ligar a uma entidade que é diferente da entidade à qual asprimeira e segunda especificidades se ligam. Por exemplo, a porção de fatorantiaumento pode se ligar a uma célula T citotóxica (por exemplo, através deCD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD44, ICAM-1 ou outra célula imune que re-sulte em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo).

Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invençãocompreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticor-po, ou um fragmento de anticorpo dele, incluindo, por exemplo, um Fab,Fab', F(ab')2, Fv ou Fv de cadeia simples. O anticorpo pode ser também umdímero de cadeia leve ou cadeia pesada ou qualquer fragmento mínimo deletal como um Fv ou um construto de cadeia simples conforme descrito emLadner e outros Patente U.S. N- 4.946.778, cujo conteúdo é aqui expressa-mente incorporado a título de referência.

Em uma modalidade, a especificidade de ligação para um recep-tor Fcy é provida por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueadapor imunoglobulina G humana (IgG). Conforme aqui usado, o termo "recep-tor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia γ localizadosno cromossomo 1. Esses genes codificam um total de doze isoformas dereceptor de transmembrana ou solúvel que são agrupadas em três classesde receptor Fy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) e FcyRIII (CD 16). Em outramodalidade, o receptor Fcy é um FcyRI humano de alta afinidade. O FcyRIhumano é uma molécula de 72 kDa, que mostra alta afinidade para IgG mo-nomérica (108 - 109 M 1).

A produção e a caracterização de certos anticorpos monoclonaisanti-Fcy são descritas por Fanger e outros na Publicação PCT WO 88/00052e na Patente U.S. N- 4.954.617, cujos ensinamentos são aqui incorporadosa título de referência em sua totalidade. Esses anticorpos se ligam a um epí-topo de FeyRI1 FcyRII or FeyRIII em um local que é distinto do sítio de ligaçãoFcy do receptor e, então, sua ligação não é bloqueada substancialmente pe-los níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis na pre-sente invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O hibri-doma produzindo mAb32 está disponível da American Type Culture Collecti-on, N- de Acesso ATCC HB9469. Em outras modalidades, o anticorpo doreceptor anti-Fcy é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 22(Η22). A produção e a caracterização do anticorpo H22 são descritas emGraziano1 R.F. e outros, 1995 J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 e PublicaçãoPCT WO 94/10332. A linhagem celular produzindo o anticorpo 1122 foi de-positada na American Type Culture Collection sob a projetoação HA022CL1e tem o número de acesso CRL 11177.

Em ainda outras modalidades, a especificidade de ligação paraum receptor Fc é provida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgAhumano, por exemplo, um receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89), cuja ligação nãofoi bloqueada por imunoglobulina humana A (IgA). O termo "receptor de IgA"pretende incluir o produto de gene de um gene (FcaRI) localizado no cro-mossomo 19. Este gene é conhecido codificar várias isoformas de trans-membrana alternativamente unidas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é consti-tutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos eneutrofílicos, mas não em populações de célula não-efetora. FcaRI tem afi-nidade de meio (5 χ 107 M"1) para ambas IgAI e lgA2, que é aumentadaquando da exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton,H.C. e outros, 1996 Criticai Reviews in Immunology 116:423-440). Quatroanticorpos monoclonais específicos para FcaRI, identificados como A3, A59,A62 e A77, que se ligam a FcaRI fora do domínio do Iigante de IgA1 foramdescritos (Monteiro, R.C. e outros, 1992 J. Immunol. 148:1764).

FcaRI and FcyRI são receptores de acionamento para uso emmoléculas biespecíficas da invenção porque eles são expressos principal-mente em células efetoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs1 macró-fagos e células dendríticas; expressos em níveis altos (por exemplo, 5.000-100.000 por célula); mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo,ADCC, fagocitose); fazem a mediação de apresentação de antígeno aumen-tada de antígenos, incluindo autoantígenos, direcionados a eles.

Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculasbiespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais de murino, quiméricose humanizados.

As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser pre-paradas através de conjugação das especificidades de ligação constituintes,por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-IL-13, usandométodos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade deligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e entãoconjugada uma à outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas oupeptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou ligação com cru-zamento pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentesde ligação com cruzamento incluem proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)(DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propi-onato (SPDP) e 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfossuc-cinimidila (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky e outros, 1984 J. Exp.Med. 160:1686; Liu, MA e outros, 1985 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648).Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus1 1985, Behring Inst.Mitt. N2 78, 118-132; Brennan e outros, 1985 Science 229:81-83) e Glennie eoutros, 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação são SA-TA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles po-dem ser conjugados através de ligação sulfidrila das regiões de clivagemC-terminais das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular, aregião de clivagem é modificada para conter um número ímpar de resíduosde sulfidrila, por exemplo, um, antes da conjugação.

Alternativamente, ambas especificidades de ligação podem sercodificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hos-pedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica foruma mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou Iigante χ proteína de fusão deFab. Uma molécula biespecífica da invenção compreende um anticorpo de ca-deia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica decadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas bies-pecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia sim-pies. Métodos para preparação de moléculas biespecíficas são descritos, porexemplo, na Patente U.S. Número 5.260.203; Patente U.S. Número 5.455.030;Patente U.S. Número 4.881.175; Patente U.S. Número 5.132.405; PatenteU.S. Número 5.091.513; Patente U.S. Número 5.476.786; Patente U.S. Nú-mero 5.013.653; Patente U.S. Número 5.258.498 e Patente U.S. Número5.482.858.

Ligação das moléculas específicas a seus alvos específicos podeser confirmada através de, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado àenzima (ELISA), radioimunoensaio (REA), análise FACS, bioensaio (por e-xemplo, inibição de crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um dessesensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpode interesse particular através do emprego de um reagente marcado (porexemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exem-plo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectados usando, por e-xemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado à enzima que reco-nhece e especificamente se liga aos complexos anticorpo-FcR. Alternativa-mente, os complexos podem ser detectados usando qualquer um de umavariedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radio-ativamente marcado 4 e usado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, porexemplo, Weintraub; B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março,1986, que é aqui incorporado a título de referência). O isótopo radioativo po-de ser detectado por tais meios tal como o uso de um contador γ ou um con-tador de cintilação ou através de autorradiografia.

Composições farmacêuticas

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição,por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combina-ção de anticorpos monoclonais, ou suas porção(ões) de ligação de antígeno,da presente invenção, formulada junto com um veículo farmaceuticamenteaceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (porexemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou molé-culas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêuti-ca da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imu-noconjugados ou biespecíficos) que se ligam a epítopos diferentes no antí-geno-alvo ou que têm atividades complementares.As composições farmacêuticas da invenção podem ser tambémadministradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outrosagentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpoanti-IL-13 da presente invenção combinado com pelo menos outro agenteanti-inflamatório. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usadosem terapia de combinação são descritos em mais detalhes abaixo na seçãosobre uso dos anticorpos da invenção.

Conforme aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" in-clui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos,agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo deabsorção e similar que sejam fisiologicamente compatíveis. O veículo deveser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea,parenteral, espinhal ou epidermal (por exemplo, através de injeção ou infu-são). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticor-po, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido em ummaterial para proteger o composto da ação de ácidos e outras condiçõesnaturais que possam inativar o composto.

Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um oumais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitá-vel" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do compos-to de origem e não causa quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (vide,por exemplo, Berge, S.M., e outros, 1977 J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplosde tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Saisde adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não-tóxicos, tal como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodrídico,fosfórico e similar, bem como de ácidos orgânicos não-tóxicos tais como áci-dos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenil-substituídos, ácidos hidróxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e simi-lar. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similar, bem como deaminas orgânicas não-tóxicas, tais como ΝΝ'-dibenziletilenodiamina, N-metil-glucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína esimilar.

Uma composição farmacêutica da invenção pode também incluirum antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantesfarmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água, taiscomo ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissul-feto de sódio, sulfeto de sódio e similar; antioxidantes solúveis em óleo, taiscomo palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno bu-tilado (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa-tocoferol e similar; e agentes de que-lação de metal, tal como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (ED-TA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similar.

Exemplos de veículos aquosos e não-aquosos adequados quepodem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção inclu-em água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicole similar), e suas misturas adequadas, óleos vegetais tais como óleo de oli-va, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Fluidez apropri-ada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de materiais de revesti-mento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícularequerido no caso de dispersões e através do uso de tensoativos.

Essas composições podem também conter adjuvantes tais comoconservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dis-persantes. Prevenção de presença de micro-organismos pode ser assegura-da tanto através de procedimentos de esterilização, supra, e através da in-clusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, para-beno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e similar. Deve ser também desejávelincluir isotônicos, tais como acuçares, cloreto de sódio e similares nas com-posições. Ainda, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável podeser realizada através da inclusão de agentes que retardam absorção tal co-mo monoestearato de alumínio e gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dis-persões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporâneade soluções ou dispersão injetável estéril. O uso de tais meios e agentespara substância farmaceuticamente ativa é conhecido na técnica. Exceto namedida em que quaisquer meios ou agente convencional forem incompatí-veis com o composto ativo, seu uso nas composições farmacêuticas da in-venção é contemplado. Compostos ativos suplementares podem ser tam-bém incorporados às composições.

As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis eestáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composiçãopode ser formulada como uma solução, microemulsão, Iipossoma ou outraestrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. O veículopode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água,etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquidoe similar) e suas misturas adequadas. A fluidez apropriada pode ser manti-da, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, atra-vés da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersãoe através do uso de tensoativos. Em muitos casos, uma pessoa pode incluiragentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol,sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das com-posições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agenteque retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através daincorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solventeapropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima,conforme requerido, seguido por esterilização por microfiltragem. Em geral,dispersões são preparadas através da incorporação do composto ativo emum veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros in-gredientes requeridos daqueles acima enumerados. No caso de pós estéreispara preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparaçãosão secagem a vácuo e secagem com pulverização (liofilização) que dão umpó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de umasolução estéril-filtrada deles.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada comum material veículo para produzir uma forma de dosagem única vai variardependendo do indivíduo sendo tratado e do modo particular de administra-ção. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um ma-terial veículo para produzir uma forma de dosagem única vai geralmente seraquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em ge-ral, de cem por cento, esta quantidade vai variar de a partir de cerca de 0,01por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de a par-tir de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento ou de a partir de cercade 1 por cento a cerca de 30 por cento de ingrediente ativo em combinaçãocom um veículo farmaceuticamente aceitável.

Os regimes de dosagem são ajustados para prover a respostadesejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, umbolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser adminis-tradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou au-mentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É es-pecialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de uni-dade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosa-gem. Forma de unidade de dosagem conforme aqui usado refere-se a uni-dades fisicamente separadas adequadas como dosagens unitárias para osindivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade prede-terminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêuticodesejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especifi-cação para as formas de unidade de dosagem da invenção é ditada por ediretamente dependente das características únicas do composto ativo e doefeito terapêutico particular a ser obtido, e das limitações inerentes à técnicade composição tal como um composto ativo para o tratamento de sensibili-dade em indivíduos.

Para administração do anticorpo, as faixas de dosagem de a par-tir de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais geralmente 0,01 a 5 mg/kg dopeso do corpo do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3mg/kg de peso do corpo, 1 mg/kg de peso do corpo, 3 mg/kg de peso docorpo, 5 mg/kg de peso do corpo ou 10 mg/kg de peso do corpo ou dentroda faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar implica adminis-tração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a ca-da três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, umavez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosa-gem para um anticorpo anti-IL13 da invenção podem incluir 1 mg/kg de pesodo corpo ou 3 mg/kg de peso do corpo através de administração intravenosaou subcutânea, com o anticorpo sendo dado usando um dos programas dedosagem que seguem: por exemplo, a cada quatro semanas para seis do-sagens, então a cada três meses; a cada três semanas; 3 mg/kg de peso docorpo uma vez seguido por 1 mg/kg de peso do corpo a cada três semanas.

Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais comespecificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente,caso onde a dosagem de cada anticorpo administrado se encaixa dentro dasfaixas indicadas. Anticorpo é geralmente administrado em ocasiões múlti-plas. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanal-mente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Intervalos podemser também irregulares conforme indicado através da medição dos níveis nosangue de anticorpo para o antígeno-alvo no paciente. Em alguns métodos,a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plas-ma de cerca de 1-1000 µg/ml e em alguns métodos cerca de 25-300 pg/ml.

Alternativamente, anticorpo pode ser administrado como umaformulação de liberação sustentada, caso onde administração menos fre-qüente é requerida. A dosagem e a freqüência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram ameia-vida mais longa, seguido por anticorpos humanizados, anticorpos qui-méricos e anticorpos não-humanos. A dosagem e a freqüência de adminis-tração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêu-tico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é admi-nistrada em intervalos relativamente não freqüentes durante um período detempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o restode suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente altaem intervalos relativamente curtos é algumas vezes requerida até progres-são da doença ser reduzida ou terminada ou até o paciente mostrar melhoraparcial ou completa dos sintomas de doença. Em seguida, o paciente podeser administrado com um regime profilático.

Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composi-ções farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a seobter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a res-posta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de admi-nistração particular, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem se-lecionado vai depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos inclu-indo a atividade das composições particulares da presente invenção empre-gadas, ou do éster, sal ou amida delas, a via de administração, o tempo deadministração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado,a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usadosem combinação com as composições particulares empregadas, a idade, se-xo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendotratado, e fatores similares bem-conhecidos na técnica médica.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-IL-3 da invenção pode resultar em uma diminuição na severidade dos sintomasda doença, um aumento na freqüência e duração dos períodos livres de sin-toma de doença ou uma prevenção de prejuízo ou incapacidade devido àafecção da doença.

Uma composição da presente invenção pode ser administradaatravés de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de umavariedade de métodos conhecidos na técnica. Como será compreendido pe-lo versado na técnica, a via e/ou modo de administração vai variar depen-dendo dos resultados desejados. As vias de administração para anticorposda invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal,subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de administração, por exem-plo, através de injeção ou infusão. A expressão "administração parenteral"conforme aqui usado significa modos de administração outros que não ad-ministração enteral e tópica, geralmente através de injeção, e inclui, semlimitação, injeção e infusão intravenosas, intramusculares, intra-arteriais,intratecais, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradermais, intra-peritoneais, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intra-articulares,subcapsulares, subaraquinoides, intraespinhais, epidurais e intrasternais.

Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administra-do através de uma via não-parenteral, tal como uma via de administraçãotópica, epidermal ou mucosal, por exemplo, intranasalmente, oralmente, va-ginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos quevão proteger o composto contra liberação rápida, tal como uma formulaçãode liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdermais e sis-temas de aplicação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocom-patíveis, podem ser usados, tal como acetato de etileno vinila, polianidridos,ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos méto-dos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmenteconhecidos daqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dek-ker, Inc., New York, 1978.

Composições terapêuticas podem ser administradas com disposi-tivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade,uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com umdispositivo de injeção hipodérmico sem agulha, tal como os dispositivosmostrados na Patente U.S. N2 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413;4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem-conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. Ne 4.487.603,que mostra uma bomba de microinfusão implantável para distribuição damedicação em uma taxa controlada; Patente U.S. N2 4.486.194, que mostraum dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através dapele; Patente U.S. N2 4.447.233, que mostra uma bomba de infusão paramedicação para aplicação de medicação em uma taxa de infusão precisa;Patente U.S. N2 4.447.224, que mostra um aparelho de infusão implantávelde fluxo variável para aplicação de fármaco contínua; Patente U.S. N24.439.196, que mostra um sistema de aplicação de fármaco osmótico tendocompartimentos multicâmara; e Patente U.S. N2 4.475.196, que mostra umsistema de aplicação de fármaco osmótico. Essas patentes são aqui incorpo-radas a título de referência. Muitos outros tais implantes, sistemas de aplica-ção e módulos são conhecidos daqueles versados na técnica.

Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos dainvenção podem ser formulados para assegurar distribuição apropriada invivo. Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostosaltamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos dainvenção cruzem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por e-xemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de Iipossomas vide,por exemplo, Patentes U.S. 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os Iiposso-mas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamentetransportadas para células ou órgãos específicos, então aumentam a aplica-ção de fármaco direcionada (vide, por exemplo, V.V. Ranade, 1989, J. Cline.Pharmacol. 29:685). Porções-alvo exemplares incluem folato ou biotina (vi-de, por exemplo, Patente U.S. 5.416.016 para Low e outros); manosídeos(Umezawa e outros, 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);anticorpos (P.G. Bloeman e outros, 1995 FEBS Lett., 357:140; M. Owais eoutros, 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína Atensoativo (Briscoe e outros, 1995 Am. J. Physiol.1233: 134); p1 20 (Schreiere outros, 1994 J. Biol. Chem. 269:9090); vide também K. Keinanen; M.L.Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immuno-methods 4:273.

Usos e métodos da invenção

Os anticorpos (e imunoconjugados e moléculas biespecíficas) dapresente invenção têm utilidades de diagnóstico e terapêutica in vitro e invivo. Por exemplo, essas moléculas podem ser administradas a células emcultura, por exemplo, in vitro ou in vivo, ou em um indivíduo, por exemplo, invitro, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. Otermo "indivíduo" conforme aqui usado pretende incluir animais humanos enão-humanos. Animais não-humanos incluem todos os vertebrados, por e-xemplo, mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanos, ove-lha, cachorro, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis. Os méto-dos são particularmente adequados para tratamento de pacientes humanostendo um distúrbio associado com expressão de IL-13 aberrante. Quandoanticorpos para IL-13 são administrados junto com outro agente, os dois po-dem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente.

Em uma modalidade, os anticorpos (e imunoconjugados e molé-cuias biespecíficas) da invenção podem ser usados para detectar níveis deIL-13, ou níveis de células que contêm IL-13. Isto pode ser conseguido, porexemplo, através de contato de uma amostra (tal como uma amostra in vitro)e uma amostra de controle com o anticorpo anti-IL-13 sob condições quepermitam a formação de um complexo entre o anticorpo e IL-13. Quaisquercomplexos formados entre o anticorpo e IL-13 são detectados e comparadosna amostra e controle. Por exemplo, métodos de detecção padrão, bem-conhecidos na técnica, tal como ELISA e ensaios de citometria de fluxo, po-dem ser realizados usando as composições da invenção.

Deste modo, em um aspecto, a invenção provê ainda métodospara detecção da presença de IL-13 (por exemplo, antígeno IL-13 humano)em uma amostra, ou medição da quantidade de IL-13, compreendendo con-tato da amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo da invenção,ou uma porção de ligação de antígeno dele, que se liga especificamente aIL-13, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o an-ticorpo ou porção dele e IL-13. A formação de um complexo é então detec-tada, onde a diferença em formação de complexo entre a amostra compara-do com a amostra de controle é indicativa da presença de IL-13 na amostra.

Também dentro do escopo da invenção estão estojos consistindonas composições (por exemplo, anticorpos, anticorpos humanos, imunocon-jugados e moléculas biespecíficas) da invenção e instruções para uso. O kitpode conter ainda pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anti-corpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo tendo uma ativi-dade complementar que se liga a um epítopo no antígeno-alvo distinto doprimeiro anticorpo). Estojos tipicamente incluem um marcador indicando ouso pretendido dos conteúdos do kit. O termo marcador inclui qualquer ma-terial escrito ou gravado fornecido no ou com o kit, ou que de outro modoacompanhe o kit.A invenção tendo sido descrita integralmente é ilustrada mais pe-los exemplos e reivindicações que seguem, que são ilustrativos e não pre-tendem ser mais limitantes. Aqueles versados na técnica vão reconhecer ouserão capazes de determinar usando não mais do que experimentação derotina vários equivalentes para os procedimentos específicos descritos aqui.Tais equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção e reivindica-ções. Os conteúdos de todas as referências, incluindo patentes emitidas epedidos de patente publicados, citados ao longo deste pedido são aqui in-corporados a título de referência.

ExemplosExemplo 1: Geração de anticorpos específicos de IL-13 humanos de biblio-tecas de baço imunizadas

O RNA de baços foi usado para gerar uma biblioteca de exposi-ção de fago ("phage display") de domínios variáveis de cadeias HeL aleato-riamente ordenados em um vetor de exposição de fago de Fab conformedescrito na Patente U.S. 6.794.132. A biblioteca de exposição de fago foisubmetida a cinco rodadas de seleção usando hrlL-13 biotinilado em um pro-tocolo de ligação de equilíbrio de fase de solução conforme descrito na pa-tente. As primeiras quatro rodadas de seleção empregaram hrlL-13 a IO 8Me a última rodada de seleção empregou hrlL-13 a 10"9 Μ. A razão de sinalpara ruído final determinada através de contagem de pfu's recuperados napresença de antígeno dividido pelos pfu's recuperados na ausência de antí-geno foi 37 para esta biblioteca, indicando que mais de 90% dos fagos sele-cionados estavam expressando anticorpos que se ligam à hrlL-13. A biblio-teca de exposição de fago foi então subclonada em um vetor de plasmídeopara a expressão de Fab solúvel conforme descrito na Patente U.S.6.794.132. A biblioteca subclonada compreende vetores de plasmídeo em E.coli, cada plasmídeo codificando um fragmento Fab monoclonal. A bibliotecade suclone foi posta em placa e colônias representando clones individuaisforam coletadas para inocular placas de 96 poços. Após crescimento da noi-te para o dia, as culturas de placa foram usadas para arquivar bancos decélula congelada para os clones em placas de 96 poços e também para se-mear placas de 96 poços réplicas que foram induzidas para expressar anti-corpos monoclonais. No dia seguinte, essas culturas de placa de 96 poçosforam submetidas à extração com detergente e purificação para recuperarquantidades em micrograma de anticorpos. Os anticorpos purificados foramtratados para remover endotoxina e filtrados estéreis terminalmente. EnsaiosELISA foram conduzidos usando rhlL-13 biotinilada revestida em placas deavidina para identificar quais poços continham positivos funcionais. Ensaiossanduíche se direcionando à região constante dos anticorpos foram usadospara determinar as concentrações de anticorpo em poços diferentes. As pla-cas de 96 poços contendo os anticorpos e os dados de ensaio foram avalia-dos quanto à atividade biológica. Os clones de interesse nos bancos de célu-la congelada de 96 poços foram então sequenciados para identificar aquelesexpressando anticorpos únicos. Subseqüentemente, os bancos de célulacongelada desses clones únicos foram usados para semear culturas de fras-co de agitação de pequena escala e cultivadas da noite para o dia. Frascosde grande escala foram semeados usando as culturas da noite para o dia eentão induzidos para expressar anticorpos. No dia seguinte, as culturas defrasco foram mecanicamente homogeneizadas e purificadas para dar quan-tidades em miligrama de anticorpos. Os Fabs purificados foram processadospara remoção de endotoxina e submetidos à filtragem estéril terminal. A ati-vidade funcional desses anticorpos foi demonstrada através de ELISA usan-do rhIL-13 biotinilada revestida em placas de avidina. As concentrações deanticorpo foram determinadas através de medição de absorbância a 280 nm.Os Fabs purificados foram avaliados quanto à ligação e atividade in vitro emum ensaio baseado em célula.

Exemplo 2: Análise quantitativa de afinidades de ligação: determinação decandidatos Fab IL-13 anti-humanos

Medições de ressonância de plásmon de superfície quantificandoa interação de Fabs anti-IL13 com várias hrlL-13 foram realizadas usando obiossensor óptico, BIAcore 2000. Ligação específica de IL-13 a um respecti-vo Fab IL-13 imobilizado em um chip BIAcore pode ser medida seguindoacúmulo do Iigante no receptor. As taxas de associação microscópica (kon) edissociação (koff) podem ser obtidas diretamente das taxas de acúmulo demassa no chip e são expressas em unidades de resposta (RUs). Fab anti-IL-13 é imobilizado na superfície do chip através de um anticorpo Lk anti-humano secundário (Jackson Immunochemicals). Este anticorpo de capturafoi covalentemente ligado usando o 'Amine coupling kit' (BIAcore, Ng Cat.BR-1000-50) conforme recomendado nos protocolos do fabricante. 250 μΙ deconcentrações variáveis de hrlL-13 foram injetados em uma taxa de fluxo de20 μΙ/min e o traço cinético foi registrado. A superfície do chip foi regeneradapor duas etapas de lavagem ácida usando HCI a 100 mM e injetando 10 μΙcom uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min. Este tratamento leva à dissociação docomplexo Fab IL-13 devido á desnaturação ácida reversível. Nenhuma perdasignificante de atividade de ligação foi observada quando o anticorpo foi rein-jetado para uma rodada subsequente. Os traços de cinética foram avaliadoscom o software BIAcore aplicando o modelo de associação Langmuir 1:1.

Os dados de afinidade sumarizados sobre IL-13 humana sãomostrados na Tabela 1 aqui.

Tabela 1

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Exemplo 3: Conversão para o formato IgG

Os modelos de sequenciamento de DNA de anticorpo foram puri-ficados de culturas de 3 ml usando minipreps QIAprep (Qiagen Inc.). Os mol-des foram sequenciados usando um Applied Biosystems 3100 Avant GeneticAnalyzer de acordo com as especificações do fabricante. As regiões variá-veis de cadeia pesada e capa de clones selecionados foram separadamenteamplificadas dos moldes de sequenciamento através de PCR, purificadasatravés de eletroforese de gel de agarose e excisadas e purificadas do gel.Plasmídeos codificando as Vh e Vl foram clonados em cassetes de expres-são para cadeias leve capa e pesadas IgGi humanas. A linhagem de célulade origem Sp2/0 foi transfectada com dois vetores, um para os vetores decadeia pesada e um para leve. As células transfectadas foram selecionadase amplificadas usando G418 e metotrexato respectivamente resultando naemergência de grupos de célula amplificada, resistente, produzindo os anti-corpos com títulos variando de 5 mg/L a 30 mg/L. Clonagem por diluição foientão empregada, resultando no isolamento de 127 clones viáveis de placasde 96 poços. Linhagens de célula emergentes foram então testadas quantoà produtividade em um formato de agitador descontínuo alimentado. Testede estabilidade para confirmar a integração estável dos construtos de ex-pressão e expressão robusta de produto foi também realizado durante umperíodo de 90 minutos. Northern blots exibiram RNAs de comprimento inte-gral, simples, com intensidades de faixa iguais, indicando níveis de expres-são similares para ambas cadeia pesada e cadeia leve.

Exemplo 4: Caracterização in vitro de anticorpos integrais anti-IL-13 em umensaio baseado em célula

IL-13 é um indutor potente de liberação de eotaxina a partir defibroblastos de pulmão humanos. A capacidade dos anticorpos de neutralizara bioatividade de IL-13 foi avaliada em um ensaio de liberação de eotaxinainduzida por IL-13 usando fibroblastos de pulmão humanos. Resumidamen-te, células (2 χ 104 células por poço em um volume de 100 μΙ) foram postasem placa em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 96 poços. Ascélulas foram estimuladas com uma concentração de IL-13 conferindo 80%da liberação de eotaxina máxima, que foi predeterminada para cada batela-da de células usando uma curva padrão de 0-100 ng/ml de IL-13. Concen-trações variáveis dos anticorpos foram coaplicadas às células. As célulasforam deixadas incubar por 24 horas a 37°C, CO2 a 5% e os meios de cultu-ra foram coletados e armazenados a 20°C até requeridos. Os níveis de eo-taxina dentro dos meios foram medidos através de ELISA específico (R&Dsystems) onde a sensibilidade de ensaio estava entre 15-1000 pg/ml.

Os Fabs anti-IL-13 foram então analisados com relação a EC5Oconforme acima descrito e mostrado na Tabela 2.Tabela 2

<table>table see original document page 71</column></row><table>

Exemplo 5: Análise de seqüência dos anticorpos anti-IL-13As seqüências de nucleotídeo das regiões variáveis de cadeiaspesada e leve (VH e VL) de todos os anticorpos foram determinadas. Se-quências de aminoácido das regiões de determinação de complementarida-de (CDRs) são listadas nas Tabelas 3 e 4 aqui. As CDRs de acordo com adefinição de Kabat (E. Kabat e outros, 1991, Sequences of Proteins of Im-munological Interest, 5a edição, Public Health Service, National Institute ofHealth, Bethesda, MD) são listadas nas Tabelas 3a e 4a.

Tabela 3

<table>table see original document page 71</column></row><table>

Tabela 3A

<table>table see original document page 71</column></row><table>Tabela 4

<table>table see original document page 72</column></row><table>

Tabela 4A

<table>table see original document page 72</column></row><table>

As seqüências dos anticorpos das tabelas anteriores, incluindoregiões de estrutura, são mostradas abaixo. As regiões constantes de cadeiasleve e pesada do anticorpo IgGI integral são também mostradas abaixo, incor-porando, como um exemplo, as regiões variáveis do anticorpo 01951/G12(em negrito).Seqüência do Anticorpo 01471/G6

(i) Região variável de HC

A seqüência de aminoácido variável de HC para 01471/G6 émostrada na SEQ ID NO: 23 e é codificada pela seqüência de nucleotídeomostrada na SEQ ID NO: 24

EVQL VESGGGVVQPGRSLRLgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 60

SCAASG FTFSN YGMHWVRQAtcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggct 120

PGKGLEW V A I IW Y' DGSNKYYccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatactat 180

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLYgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat 240

LQMNSltRAE D T A V Y Y C V K G Sctgcaaatgaacagtctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgtgaaaggatct 300

GDI PFDYWGQGTLVT {SEQ ID NO : 23)ggggatattccctttgactactggggccagggaaccctggtcacc 345 (SEQ ID NO :24>

(ii) Região variável de LC

A seqüência de aminoácido variável de LC para 01471/G6 é mos-trada na SEQ ID NO: 25 e é codificada pela seqüência de nucleotídeo mos-trada na SEQ ID NO: 26

E IVLTQS PATLSS SPGERATgaaattgtgttgacgeagtctccagccaccctgtcttcgtctccaggggaaagagccacc 60

LSCRASQSVSSYLAWYQQKP

ctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacct 120

G QAPRLL I Y DASNRATGI PAggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagcc 180

RFSGSGSGTDFTLTISSLEPaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct 240

ED FAVYYCHQRSHWPPIFTFgaagattttgcagtctattactgtcatcagcgtagccactggcctcccatattcactttc 300

GPGT (SEQ ID NO: 25)ggccctgggacc 312 (SEQ ID NO: 26)

(i) Região variável de HC

A seqüência de aminoácido variável de HC para 03161/H2 émostrada na SEQ ID NO: 27 e é codificada pela seqüência de nucleotídeomostrada na SEQ ID NO: 28EVQLV E SGGGVVQPGRSLRLgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 60

sc aasgftfsnygmhwvrqa

tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggct 120

pgkglewvaiimydgsnkyyccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatactat 180

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat 240

lqmnslraedtavyycvkgs

ctgcaaatgaacagtctgagagccgaggacácggctgtgtattactgtgtgaaaggatct 300

GDIPFDYWGQGTLVT (SEQ ID NO : 27)ggggatattccctttgactactggggccagggaaccctggtcacc 345> (SEQ ID NO : 26)

(ii) Região variável de LC

A seqüência de aminoácido variável de LC para 03161/H2 é mos-trada na SEQ ID NO: 29 e é codificada pela seqüência de nucleotídeo mos-5 trada na SEQ ID NO: 30

EIVLTQS PATLSSSPGERATgaaattgtgttgacgcagtccccagccaccctgtcttcgtctccaggggaaagagccacc 60

lscrasqsvssylawyqqkpctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacct 120

gqa prlli ydasnratgt paggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcaccccagcc 180

RFSGSGSGTDFTLTISSLBPaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct 240

edfavyy c hqr s hwppiftfgaagattttgcagtctattactgtcatcagcgtagccactggcctcccatattcactttc 300

GPGT (SEQ ID NO ;23)ggccctgggacc 312 (SEQ ID NO t30)

Seqüência de anticorpo 01951/G12(i) Região variável de HC

A seqüência de aminoácido variável de HC para 01951/G12 émostrada na SEQ ID NO: 31 e é codificada pela seqüência de nucleotídeo10 mostrada na SEQ ID NO: 32

evqlvesggg vvqpgrslrlgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 60

scaasgftfssygmhwvrq atcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggct 120

PGKG LEWVAI IWYDGSNKYYccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatactat 180

adsvkgrftisrdnskntlygcggactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaaqaacacgctgtat 240LQM NSLRAEDTAVYYCARLWctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggc:tatgg 300

FGDLDAFDIWG QGTMVT (SEQ ID NO :31)ttcggggacttagatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcacc 351 (SEQ IDNO :32)

(i) Região variável de LC

A seqüência de aminoácido variável de LC para 01951/G12 émostrada na SEQ ID NO: 33 e é codificada pela seqüência de nucleotídeomostrada na SEQ ID NO: 34

EIVLTQS PATLSLSPGERAIgaaattgtgttgacgcagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccatc 60

LSC R AGQSV S S YLVWY Q QKPctctcctgcagggccggtcagagtgttagcagttacttagtctggtaccaacagaaacct 120

GQAPRLLIYDASNRATGI PAggccaggctcccaggctGCtcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagcc 180

RFSGSGSGTDFTLTISSLEPaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct 240

EDFAVYYCQQRSSWPPVYTfgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgcagcagctggcctccggtgtacactttt 300

GQGT (SEQ ID NO :33)ggccaggggacc 312 (SEQ IO NO :34)

5 Seqüência de anticorpo 01771/E10(i) Região variável de HC

A seqüência de aminoácido variável de HC para 01771/E10 émostrada na SEQ ID NO: 35 e é codificada pela seqüência de nucleotídeomostrada na SEQ ID NO: 36

qvqlvqsgggvvqpgrslrlcaggtgcagctggtgcagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc 60

SCA A SGF T P SSY GM H WVRQAtcctgtgcggcgtctgg«ttcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggct 120

PGKGLEWVAI IWYDGSNKYYccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatactat 180

ADSVKGRFTISRD N SKNTLYgcggactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctatat 240

LQMNSLRAEDTAVYYCARLWctacaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggctatgg 300

FGDLDAFDIWGQGTMVT (SEQ ID NO :35)ttcggggacttagatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcacc 351 (SEQ ID NO :36)

(i) Região variável de LCA seqüência de aminoácido variável de LC para 01771/E10 émostrada na SEQ ID NO: 37 e é codificada pela seqüência de nucleotídeomostrada na SEQ ID NO: 38

EIVLTQ SPATLSLSPGERATgaaattgtgttgacgcagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc 60

LSCR A SQSVSS Y L A WYQQ K Pctctcctgcagggecagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacct 120

GQ A PRLL I YDASN RATGI PAggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagcc 180

RF S G S G S GT DFT LT I S S L E Paggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcct 240

EDFA V YYCHQ R SS M PPIF TFgaagattttgcggtttattactgtcatcagcgtagcagctggcccccgatattcactttc 300

GPGT (SEQ ID NO :3?)ggccctgggacc 312 (SEQ ID NO :38)

Seqüência de Cadeia Leve de IgGI de Anticorpo Integral Incorporando aRegião Variável de Anticorpo 01951/G12 (Em negrito)

A seqüência de aminoácido de LC é mostrada na SEQ ID NO: 39e é codificada pela seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 40.MSVL TQV LAL LLLW LTG1 ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGCGTTG CTGCTGCTGT GGCTTACAGG TRC EIVL TQS PAT LSLS51 TACGCGTTGT GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT FGE RAI LSCR AGQ SVS101 CTCCAGGGGA AAGAGCCATC CTCTCCTGCA GGGCCGGTCA GAGTGTTAGC SYLV WYQ QKF GQAP RLL151 AGTTACTTAG TCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT IYD ASNR ATG IPA RFSG201 CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG SGS GTD FTLT ISS LEP251 GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT EDFA VYY CQQ RSSH PPV301 GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGCAGCAGCT GGCCTCCGGT YTF GQGT KLE IKR TVAA351 GTACACTTTT GGCCAGGGGA CCAAGCTTGA AATCAAACGA ACTGTGGCTG PSV F I F PPSD EQL KSG401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA TASV VCL LNN FYPR EAK451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA VQW KVDN ALQ SGN SQES501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA VTE QDS KDST YSL SST551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC LTLS KAD YEK HKVY ACE601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA VTH QGLS SPV TKS FNRG651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG

E C * {SEQ ID NO:39)701 GAGAGTGTTA G (SEQ ID NO:40)

Seqüência de Cadeia Pesada de IgGI de Anticorpo Integral Incorporando aRegião Variável de Anticorpo 01951/G12 (Em negrito)

A seqüência de aminoácido de HC é mostrada na SEQ ID NO: 41e é codificada pela seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 42.MAWV WTL PFL MAAA QSV1 ATGGCTTGGG TGTGGACCTT GCCATTCCTG ATGGCAGCTG CCCAAAGTGT

QAE VQLV ESG GGV VQPG51 CCAGGCAGAA GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG

RSL RLS CAAS GFT FSS101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC

YGMH WVR QAP GKGL EWV151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT

AII WYDG SMK YYA DSVK201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATACTATGCG GACTCCGTGA

GRF TIS RDHS KNT LYL251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG

QHNS LRA EDT AVYY CAR301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG

LWF GDLD AFD IWG QGTM351 GCTATGGTTC GGGGACTTAG ATGCTTTTGA TATCTGGGGC CAAGGGACAA

VTV SSA STKG PSV FPL401 TGGTCACCGT CTCCTCAGCC TCCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG

APSS KST SGG TAAL GCL451 GCACCCTCCT CCAAGAGCAC CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT

VKD Y F P E P V T VSW N SGA501 GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG

LTS GVH TFPA VLQ SSG551 CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA

LYSL SSV VTV PSSS LGT601 CTCTACTCCC TCAGCAGCGT CGTGACCGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC

QTY ICNV NHK PSN TKVD651 CCAGACCTAC ATCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG

KR V EPK SCDK THT CPP701 ACAAGAGAGT TGAGCCCAAA TCTTGTGACA AAACTCACAC ATGCCCACCG

CPAP ELL GGP SVFL FPP751 TGCCCAGCAC CTGAACTCCT GGGGGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC

KPK DTLM ISR TPE VTCV801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG

VVD VSH EDPE VKF NWY851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTACVDGV EVH NAK TKPR EEQ901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA

YNS TYRV VSV LTV LHQD951 GTACAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG

WLN GKE YKCK VSN KAL1001 ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC

PAPI EKT ISK AKGQ PRE1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA

PQV YTLP PSR EEM TKNQ1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC

VSL TCL VKGF YPS DIA1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC

VEWE SNG QPE NNYK TTP1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC

PVL DSDG SFF LYS KLTV1251 TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTATAGC AAGCTCACCG

D KS RWQ QGNV FSC SV M1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG

HEAL HNH YTQ KSLS LSP1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCCCC

G K * (SEQ ID NO:41)1401 GGGTAAATGA (SEQ ID NO:42)

Claims (15)

1. Região de ligação de antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional dele, caracterizada pelo fato de que compreende umaregião HC-CDR3 mostrada em uma seqüência de aminoácido selecionadada SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10, e suas variantes conservativas.

2. Região de ligação de antígeno isolada de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as regiões H-CDRI , H-CDR2e H-CDR3 e L-CDRI , L-CDR2 e L-CDR3 mostradas em uma seqüência deaminoácido juntas são selecionadas de (i)-(iii): (i) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 9, e SEQ IDNO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20;(ii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, e SEQ IDNO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21; e(iii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, andSEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22; e suas variantes conserva-tivas.

3. Região de ligação de antígeno isolada, caracterizada pelofato de que compreende uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou-95 por cento em peso de identidade de seqüência nas regiões CDR com asregiões CDR como definidas na reivindicação 1 ou 2.

4. Anticorpo IL-13 humano ou humanizado, caracterizado pelofato de que compreende uma região de ligação de antígeno isolada, comodefinida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que compreende pelo menos um sítio de ligação de antígenocompreendendo um domínio de HC tendo uma seqüência de aminoácidoselecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 23, 27, 31 e 35 ou uma se-qüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade deseqüência da mesma.

6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracteri-zado pelo fato de que compreende pelo menos um sítio de ligação de antí-geno compreendendo um domínio de LC tendo a seqüência de aminoácidoselecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 25, 29, 33 e 37 ou uma se-qüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade deseqüência da mesma.

7. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende pelomenos um sítio de ligação de antígeno compreendendo um primeiro domínio HCselecionado de uma seqüência de aminoácido, como definido na reivindicação 5, e um segundo domínio de LC selecionado de uma seqüência de aminoá-cido, como definido na reivindicação 6, ou uma seqüência tendo pelo menos- 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de seqüência da mesma.

8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de HCde acordo com a SEQ ID NO: 23 e uma região variável de LC de acordo coma SEQ ID NO: 25 ou uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95por cento de identidade de seqüência da mesma.

9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende região variável de HC deacordo com SEQ ID NO: 27 e uma região variável de LC de acordo com aSEQ ID NO: 29 ou uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95por cento de identidade de seqüência da mesma.

10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende região variável de HC deacordo com a SEQ ID NO: 31 e uma região variável de LC de acordo comSEQ ID NO: 33 ou uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95por cento de identidade de seqüência mesma.

11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de HCde acordo com a SEQ ID NO: 35 e uma região variável de LC de acordo comSEQ ID NO: 37 ou uma seqüência tendo pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95por cento de identidade de seqüência da mesma.

12. Anticorpo de acordo com uma das reivindicações 4 a 11,caracterizado pelo fato de que é uma IgGI ou uma lgG4.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um anticorpo ou um fragmento funcional dele, como definidoem qualquer uma das reivindicações 4 a 12, e um veículo ou excipiente far-maceuticamente aceitável para tal.

14. Uso de um anticorpo ou fragmento funcional dele, comodefinido em qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado pelo fatode ser para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar umdistúrbio ou condição associado com a presença de IL-13 direcionada a re-ceptor celular.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelofato de que o distúrbio ou condição é asma.