BRPI0314218B1 - preservação de célula de esperma e sistemas de processamento - Google Patents

Abstract

"sistemas de preservação e processamento de células de esperma". a preservação de células de esperma e outros processamentos de células de esperma são divulgados. a presente invenção está dirigida, em algumas modalidades, à preservação de células de esperma, uma vez que a preservação de células de esperma pode também estar relacionada à inseminação artificial, fertilização in vitro, superovulação, produção de mamífero, amostras de esperma e processamento de células de esperma, de uma maneira geral. a presente invenção está também direcionada, em algumas modalidades, às características de processamento de células de esperma, tais como técnicas de coleta, manipulação, classificação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação. a preservação de células de esperma de acordo com a presente invenção pode estar direcionada à manutenção ou melhoramento da qualidade do esperma e, em algumas modalidades, uma ou mais características das células de esperma, tais como viabilidade, motilidade e funcionalidade. as taxas de fertilização podem também ser mantidas ou melhoradas. uma modalidade pode compreender a obtenção de células de esperma (10). as células de esperma podem ser criopreservadas (20) e descongeladas (30). o processamento (40) pode ser executado nas células de esperma e criopreservação das células de esperma (50).

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Patente de invenção para: “PRESERVAÇÃO DE CÉLULA DE ESPERMA E SISTEMAS DE PROCESSAMENTO”.

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisional de Patente U. S. de número 60/410.884, depositado em 13 de setembro de 2003 e Pedido Não Provisional de Patente U. S. de número 10/340.881, depositado em 09 de janeiro de 2003, cada um dos quais está aqui incorporado por referência.

CAMPO TÉCNICO A presente invenção relaciona-se à preservação de células de esperma, e o processamento de células de esperma, de uma maneira geral. A invenção pode ser aplicável à inseminação artificial, fertilização in vitro, superovulação, produção de mamífero, amostras de esperma e processamento de célula de esperma, incluindo características de coleta, manipulação, classificação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A fertilização de óvulos de mamífero, potencialmente chamados de oócitos, tal como por técnicas dc inseminação artificial e de fertilização in vitro, tem sido conduzida na tentativa de aumentar as taxas de fertilização de animais domésticos. Além disso, a pré-seleção efetiva de sexo tem sido executada em muitas espécies de animais domésticos seguindo-se do desenvolvimento de métodos seguros e confiáveis de classificação, geralmente, ou especificamente separando as células de esperma em populações portadoras de cromossomo X e portadoras de cromossomo Y enriquecidas. A separação de células de esperma portadoras de cromossomo X das células de esperma portadoras de cromossomo Y, assim como técnicas de coleta, manipulação, classificação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação, ou processamento de célula de esperma e sêmen de uma maneira geral, pode ser executada conforme divulgado aqui e conforme divulgado por vários pedidos de patente, por exemplo: PCT/US99/17165; PCT/US01/45 023; PCT/US01/15150; PCT/US98/27909; PCT/US01/45237, PCT/USOl/18879, PCT/US00/30155, PCT/US01/02304, Patente U. S. de número 6.071. 689, Patente de número 6.372. 422, Pedido de Patente U. S. divisional de número 10/081.955, Pedido Provisional de Patente U. S. de número 60/400.486, e Pedido Provisional de Patente U. S. de número 60/400.971, cada um dos quais está aqui incorporado por referência.

Embora os vários dispositivos e métodos de processamento de célula de esperma, geralmente, e a coleta, manipulação, classificação, armazenagem, transporte, uso, fertilização e inseminação de células de esperma tenham sido melhorados em relação a vários anos passados, problemas significantes ainda existem com relação à manutenção da qualidade do esperma, tal como viabilidade, motilidade e funcionalidade, e preservação e estimulação das células de esperma, especialmente com relação a procedimentos de inseminação artificial {in vivo) e de fertilização in vitro (IVF). Uma conseqüência potencial é a redução nas taxas de fertilização. A qualidade do esperma, tal como a viabilidade de esperma separado em populações portadoras de cromossomo X e portadoras de cromossomo Y enriquecidas pode ser comparada diretamente in vitro (por exemplo, em conjunto com procedimentos de IVF) e in vivo (por exemplo, em conjunto com procedimentos de inseminação artificial), é geralmente reduzida durante o processamento tradicional de célula de esperma. De forma mais geral, as técnicas de processamento tradicionais dirigidas à viabilidade, motilidade, funcionalidade, preservação, estimulação, fertilização e inseminação de esperma podem não ter produzido taxas de fertilização ou qualidade de esperma preferidas ou até mesmo adequadas, por exemplo.

Como um exemplo de processamento tradicional de esperma, técnicas de classificação de célula de esperma para a reprodução de mamíferos podem ser limitadas, por exemplo, com relação à qualidade da célula de esperma, tal como viabilidade, motilidade e funcionalidade das células de esperma, e taxas de fertilização assim como potencialmente outras características ou aspectos limitados. Por exemplo, se o aparelho de classificação está a uma distância relativamente longa dos machos, ou se o aparelho de classificação está a uma distância relativamente longa das fêmeas receptoras a serem inseminadas ou dos óvulos a serem fertilizados com o esperma processado, a qualidade das células de esperma, taxas de fertilização, ou outras características ou aspectos podem ser adversamente afetados. Algumas das técnicas incorporadas por referência ou algumas técnicas tradicionais podem scr alcançadas a um certo grau de viabilidade, motilidade ou funcionalidade das células de esperma, e taxas de fertilização desejáveis, enquanto dirigidindo-se, por exemplo, à preservação do esperma durante o transporte ao aparelho de classificação. Entretanto, técnicas adicionais que alcançam qualidade de célula de esperma suficiente, tal como viabilidade, motilidade e funcionalidade, e outros aspectos tal como estimulação, preservação e manutenção de células de esperma, ou taxas de fertilização melhoradas, podem ser desejáveis, especialmente para qualquer uma ou para uma combinação de várias etapas de processamento de esperma. As características de processamento podem incluir, por exemplo, coleta, manipulação, classificação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação, e especialmente a preservação das células de esperma classificadas a partir do aparelho de classificação ao local de fertilização (potencialmente através de amostras individuais coletadas ou “palhetas”), ou em qualquer outro estágio do processamento de esperma.

Como um outro exemplo das limitações do processamento tradicional de esperma, técnicas de processamento tradicionais podem ser limitadas com relação à qualidade da célula de esperma, geralmente, tal como viabilidade, motilidade e funcionalidade das células de esperma, e estimulação da célula de esperma, preservação da célula de esperma, e taxas de fertilização, devido ao tipo e à extensão do processamento envolvida. Técnicas de processamento conhecidas tal como preservação ou classificação, por exemplo, podem degradar a qualidade do esperma, e ainda reduzir as taxas de fertilização. A degradação da qualidade do esperma e das taxas de fertilização pode ter se revelado problemática anteriormente em circunstâncias que têm exigido etapas adicionais de preservação de célula de esperma, tal como em circunstâncias onde o aparelho de classificação está a uma distância relativamente longa dos machos ou quando o aparelho de classificação está a uma distância relativamente longa das fêmeas receptoras que serão inseminadas ou de outra forma fertilizadas com o esperma processado. Entretanto, a degradação potencialmente identificada da qualidade do esperma e das taxas de fertilização pode não ter sido até então direcionada ao contexto da preservação de células de esperma, ou mesmo identificada como relacionada à preservação da célula de esperma, ou processamento das células de esperma de uma maneira geral, uma vez que se pode realmente ter compreendido que as técnicas de preservação tradicionais contribuíram para os efeitos adversos à qualidade do esperma, taxas de fertilização, ou outras características ou resultados relevantes.

Pode ter sido tradicionalmente compreendido que as etapas de processamento adicionais no processamento das células de esperma ou sêmen possuindo uma concentração de células de esperma degradarão a qualidade do esperma e reduzirão as taxas de fertilização a tal ponto que etapas de processamento adicionais, de uma maneira geral, seriam evitadas. Especificamente, pode-se também ter tradicionalmente compreendido que as etapas de processamento tais como, preservação, especificamente criopreservaçâo e classificação podem ser muito prejudiciais às células de esperma, especialmente em seqüências de processamento que incorporam tanto criopreservaçâo quanto classificação. Além disso, pode até ter sido sugerido e ensinado em métodos tradicionais que a preservação de esperma, tal como a criopreservaçâo, fornecida após etapas de processamento prévias de modo a preservar o esperma para procedimentos posteriores, tal como para técnicas in vivo ou in vitro, não poderia ser executada sem comprometer as células de esperma e a própria técnica a tal grau que os resultados dos procedimentos posteriores seriam afetados de forma detrimental. Conseqüentemente, tais preocupações têm sido até mesmo demonstradas em procedimentos de processamento de célula de esperma tradicionais, ensinando além das etapas de processamento subseqüentes, tal como classificação e criopreservaçâo, ou etapas de processamento que incorporam etapas de criopreservaçâo múltiplas. DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção pode se dirigir à variedade de problemas previamente identificados e potencialmente não abordados associados à qualidade de célula de esperma reduzida, tais como viabilidade, motilidade e funcionalidade, e estimulação, preservação, e outras características ou aspectos das células de esperma. As células de esperma que podem ter sido ou serão processadas por uma ou mais etapas de coleta, manipulação, classificação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação e reduções potenciais das taxas de fertilização são também consideradas. A invenção presente pode também estar direcionada à variedade de problemas associados com qualidade da célula de esperma das células de esperma que foram separadas em populações portadoras de cromossomo X e portadoras de cromossomo Y enriquecidas, potencialmente as células de esperma classificadas através de técnicas tal como classificação de fluxo, e à redução potencial nas taxas de fertilização. De uma maneira mais geral, a presente invenção pode se dirigir tradicionalmente às baixas taxas de fertilização de inseminação artificial in vivo e fertilização in vitro, e às questões de qualidade de célula de esperma, tais como viabilidade, motilidade e funcionalidade de célula de esperma. A presente invenção também está dirigida às questões tais como estimulação, preservação e taxas de fertilização, assim como às características de fertilidade melhoradas ou mantidas, tal como a taxa de desenvolvimento de blastocisto, capacidade de desenvolvimento in vivo, taxa de gravidez e divisão celular, alcançando resultados que podem ter sido inesperados àqueles habilitados na técnica. Adicionalmente, a presente invenção direciona-se aos números de esperma processados potencialmente necessários para se obter as taxas de gravidez desejadas, e também em consideração das taxas de gravidez obtidas relativas ao esperma preservado classificado e não classificado.

Naturalmente, propósitos e objetivos adicionais significantes da invenção estão divulgados na descrição a seguir da invenção.

Conseqüentemente, para alcançar os vários propósitos e objetivos da invenção, a presente invenção em algumas modalidades pode compreender um método de processamento de uma amostra de esperma, as etapas compreendendo a obtenção de células de esperma, criopreservação das células de esperma, descongelamento das células de esperma, processamento das células de esperma, e criopreservação das mesmas. Métodos correspondentes de produção de mamíferos e amostras de mamíferos e esperma são também divulgados.

Além disso, modalidades da invenção podem compreender um método de processamento de célula de esperma, e as etapas fornecidas à medida que se obtém as células de esperma, criopreserva-se as células de esperma, descongela-se as células de esperma, processa-se as células de esperma, e criopreserva-se as mesmas. Uma modalidade adicional da invenção pode compreender um método de produção de um mamífero, compreendendo as etapas de obtenção de células de esperma, criopreservação de células de esperma, descongelamento de células de esperma, classificação de células de esperma, criopreservação de células de esperma, descongelamento de células de esperma, fertilização de pelo menos um óvulo e produção de um mamífero a partir deste pelo menos um óvulo fertilizado.

Além disto, para alcançar os vários propósitos e objetivos da invenção, a presente invenção pode estar direcionada às modalidades que atendem à necessidade por procedimentos para inseminação artificial (in vivo) e fertilização in vitro, e em algumas modalidades direcionada aos procedimentos de superovulação. Adicionalmente, as modalidades podem estar também direcionadas à produção de mamíferos ou embriões de mamíferos, e podem ainda estar direcionadas à criação de amostras de espermas tais como palhetas, pelotas, doses de inseminação, ou outras amostras de esperma preparadas, e o processamento de sêmen.

Modalidades adicionais da invenção são divulgadas por toda a descrição da invenção e nas reivindicações seguintes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Cada Figura contida em cada uma das aplicações expostas na Exibição A deve ser aqui considerada incorporada por referência como parte desta descrição da presente invenção. A Figura 1 é um fluxograma de uma modalidade da presente invenção. A Figura 2 é um fluxograma de uma segunda modalidade da presente invenção. A Figura 3 é um fluxograma de uma outra modalidade da presente invenção. A Figura 4 é um fluxograma de uma modalidade da presente invenção. A Figura 5 é um fluxograma de uma modalidade da presente invenção, potencialmente fornecida em combinação com a modalidade da Figura 1, em algumas modalidades.

MODOS PARA EXECUTAR A INVENÇÃO A presente invenção divulga técnicas de processamento e preservação de sêmen e célula de esperma e a preservação, estimulação, fertilização e inseminação dirigidas a uma ou mais características da célula de esperma ou qualidade do esperma, tal como a viabilidade, motilidade e funcionalidade da célula de esperma, e a estimulação, preservação e taxas de fertilização. As modalidades da presente invenção também divulgam características de fertilidade melhoradas ou mantidas, tal como a taxa de desenvolvimento de blastocisto, capacidade de desenvolvimento in vivo, taxa de gravidez ou divisão celular. As características da célula de esperma ou qualidade do esperma podem ser abordadas dentro do contexto de várias técnicas de processamento, tais como coleta, manipulação, armazenagem transporte, uso, fertilização ou inseminação. A qualidade da célula de esperma pode ser qualquer um ou uma combinação dos vários atributos das células de esperma previamente mencionados ou ainda mencionados aqui, tais como, por exemplo, viabilidade, motilidade e funcionalidade, e pode mesmo ser considerada como uma ou uma combinação de características de fertilidade das células de esperma. A característica da célula de esperma pode se referir a qualquer um ou a uma combinação de vários atributos biológicos, químicos, físicos, psicológicos ou funcionais de uma ou mais células de esperma, tais como cromossomos portando os atributos da célula, ou em algumas modalidades pode se referir à qualidade da célula de esperma conforme previamente descrito.

As características de fertilidade podem ser melhoradas ou mantidas, e podem compreender a taxa de desenvolvimento de blastocisto, capacidade de desenvolvimento in vivo, taxa de gravidez ou divisão celular. Técnicas de processamento de sêmen ou célula de esperma podem se referir a qualquer uma ou a uma combinação de técnicas de preservação, estimulação, inseminação, fertilização, classificação, seleção, separação ou descongelamento, e podem ser especificamente direcionados a qualquer uma ou a uma combinação de técnicas de coleta, manipulação, seleção, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação.

As amostras de esperma podem se referir a um volume que contém as células de esperma, compreendendo potencialmente sêmen, fluido veicular ou outros materiais, e pode compreender uma ou uma pluralidade de pelotas, palhetas, doses de inseminação ou outras amostras de esperma preparadas.

As células de esperma podem ser mantidas ou melhoradas de acordo com a presente invenção, e em algumas modalidades fornecidas como preservação de célula de esperma, ou mais amplamente, processamento de célula de esperma, tal como através de etapas de processamento como na classificação da célula de esperma ou preservação da célula de esperma, e pode ser incorporada de acordo com técnicas de fertilização e inseminação. As modalidades podem compreender algumas características componentes de preservação das células de esperma ou outras técnicas de processamento conforme pode ser divulgado nas patentes e pedidos de patente mencionados previamente, cada referência expressamente incorporada por referência até onde esteja consistente com a presente invenção, e conforme também descrito abaixo.

As células de esperma podem também ser mantidas ou melhoradas em algumas modalidades através de técnicas de preservação e estimulação como também descrito abaixo, e também em combinação adicional com técnicas de processamento, estimulação, preservação, fertilização e inseminação nos pedidos de patente e patentes previamente mencionados.

Conseqüentemente, a presente invenção pode ser incorporada como métodos de processamento de célula de esperma. Referindo-se à Figura 1, as etapas de processamento de célula de esperma de algumas modalidades estão mostradas no fluxograma. As células de esperma são obtidas (10) e são criopreservadas (20). As células de esperma são então descongeladas (14) e uma etapa subseqüente de criopreservação (16) é executada. Cada uma destas características está também descrita abaixo. Uma modalidade de processamento de célula de esperma da invenção consistente com as características apresentadas na Figura 1 é mostrada na Figura 2. A modalidade fornece as etapas 20, 22, 24 e 26 consistente com a modalidade da Figura 1, e também cria pelo menos uma amostra de esperma. A amostra de esperma pode compreender qualquer amostra de esperma conforme previamente descrito e compatível com a descrição adicional a seguir. A invenção pode ser também incorporada como métodos para produção de um mamífero, consistente com as modalidades da Figura 1, como pode ser mais facilmente identificado nas etapas 30, 32, 34 e 36 da Figura 3. As células de esperma da característica (36) fertilizam pelo menos um óvulo (28) e um mamífero é produzido (40) a partir de pelo menos um óvulo. Cada uma destas características está também descrita abaixo. A Figura 4 mostra as modalidades de processamento de célula de esperma de acordo com a presente invenção. Conforme mostrado, e em elaboração adicional nas características previamente descritas, as células de esperma podem ser obtidas (50) a partir de uma fonte de mamífero, ou diretamente ou cm várias combinações de etapas, tal como através de uma instalação de armazenagem. As células de esperma podem ser criopreservadas (52). A criopreservação pode ser fornecida como também descrito em algumas modalidades da invenção abaixo. De forma subseqüente, as células de esperma podem ser descongeladas (54). Processamento adicional (56) pode então ser executado nas células de esperma antes de uma outra etapa de criopreservação das células de esperma (58). O processamento de célula de esperma, de maneira geral, e os processos previamente descritos podem ser executados independentes das técnicas de inseminação e fertilização, ou como parte de e em combinação com tais técnicas. Cada um dos processos acima pode também ser executado com relação às técnicas de superovulação. Conseqüentemente, algumas modalidades da invenção são métodos de produção de um mamífero, conforme mostrado na Figura 5. Após processamento prévio, ou em algumas modalidades uma vez prosseguindo com as características (50) até (58), pelo menos um óvulo pode ser fertilizado (62). Em uma modalidade, as células de esperma podem ser descongeladas (60) e a fertilização (62) de pelo menos um óvulo com as células de esperma pode ser conduzido. Um mamífero pode então ser produzido (64) a partir do óvulo fertilizado pelas células de esperma processadas. Etapas de processamento adicionais, tal como a classificação das células de esperma é fornecida em algumas modalidades, e é preferivelmente executada após o primeiro descongelamento (54).

Além disso, as modalidades da invenção, tais como àquelas previamente descritas, suportam técnicas in vivo e in vitro. Conseqüentemente, uma fêmea das espécies de mamífero a partir das quais o esperma foi obtido pode ser inseminada com as células de esperma, tal como as células de esperma previamente processadas, ou células de esperma classificadas e criopreservadas, cada uma previamente descrita. As técnicas de inseminação podem compreender inseminar pelo menos uma fêmea com as células de esperma, a provisão das quais pode ser descongelada ou potencialmente como células de esperma criopreservadas em uma condição não descongelada, potencialmente em uma configuração de pelota ou outra configuração de amostra de esperma conforme previamente descrito. As amostras de esperma descongeladas podem ser preferidas se, por exemplo, a qualidade de célula de esperma deve ser mantida ou melhorada como parte do processamento da célula de esperma ou produção de mamífero. Entretanto, células criopreservadas não descongeladas poderíam ser usadas para inseminação e preferidas se, por exemplo, um descongelamento das células de esperma dentro da fêmea for aceitável, e se uma redução de etapas é desejado fora do útero, tal como para reduzir o processamento das células de esperma. Além disso, as técnicas de inseminação artificial e de fertilização in vitro, geralmente, de acordo com a presente invenção, podem ser executadas com células criopreservadas não descongeladas, independente de ou em combinação com outras características de processamento tal como descongelamento, etapas subseqüentes de criopreservação, classificação, ou outras características agora divulgadas. Etapas de processamento, tal como a classificação das células de esperma, podem ser também executadas. A inseminação pode ser executada com pelo menos uma amostra de esperma, tal como àquela previamente descrita. Pelo menos um óvulo da fêmea pode ser fertilizado e um mamífero produzido a partir deste pelo menos um óvulo fertilizado. De acordo com os procedimentos in vitro, a fertilização in vitro de pelo menos um óvulo pode ser executada. O pelo menos um óvulo fertilizado pode ser transferido a uma fêmea receptora, e um embrião de mamífero pode ser produzido, ou em algumas modalidades, um mamífero pode ser produzido, a partir de pelo menos um óvulo fertilizado. Técnicas de superovulação são também abrangidas pela presente invenção. Uma fêmea da espécie do mamífero pode ser superovulada. Em algumas modalidades, a fêmea superovulada pode ser inseminada com células de esperma e o pelo menos um óvulo fertilizado. Em outras modalidades, pelo menos um óvulo da fêmea superovulada pode ser obtido e o pelo menos um óvulo é fertilizado in vitro. O pelo menos um óvulo fertilizado pode ser transferido a uma fêmea receptora ou pela técnica de inseminação artificial ou pela técnica de fertilização in vitro.

Conforme previamente mencionado, os métodos de processamento de célula de esperma podem compreender a criação de pelo menos uma amostra de esperma das células de esperma. Conseqüentemente, as modalidades da invenção podem compreender métodos de processamento de célula de esperma consistentes com as modalidades previamente descritas, tais como àquelas mostradas na Figura 2, que caracterizam a criação de pelo menos uma amostra de esperma de células de esperma. Em algumas modalidades, a pelo menos uma amostra de esperma criada pode ser o alvo de uma etapa de criopreservação subseqüente, de forma que pelo menos uma amostra de esperma seja criopreservada.

Pode ter sido previamente imaginado que, consistente com as técnicas de processamento convencionais, tais células de esperma processadas, e as amostras de esperma criadas, não seriam de qualidade de esperma suficiente ou de outra forma não seriam capazes de fertilização. Algumas modalidades preferidas da presente invenção, entretanto, também estipula que a amostra de esperma seja de fertilizar pelo menos um óvulo de um mamífero fêmea, como pode ser notado nas várias modalidades descritas abaixo, e também a inseminação de tal fêmea com a pelo menos uma amostra de esperma, e em algumas modalidades, a fertilização de pelo menos um óvulo de um mamífero fêmea com a pelo menos uma amostra de esperma. A característica das amostras de esperma capazes de fertilização estende-se em algumas modalidades à capacidade de fertilização de uma espécie de um mamífero fêmea superovulada, e à inseminação de tal fêmea superovulada com pelo menos uma amostra de esperma. A característica das amostras de esperma capazes de fertilização também se estende em algumas modalidades à capacidade de fertilização in vitro de pelo menos um óvulo, e a fertilização in vitro de pelo menos um óvulo com a pelo menos uma amostra de esperma. Modalidades adicionais atendem à necessidade de criação de pelo menos uma amostra de esperma capaz de inseminar pelo menos um mamífero fêmea, e a inseminação de tal pelo menos uma fêmea com a dita pelo menos uma amostra de esperma. A fertilização de uma pluralidade de óvulos, e mesmo a produção de um embrião de mamífero, um embrião que possa ser transferido a uma fêmea receptora, e mais geralmente a produção de mamífero, tal como uma prole de mamífero, são fornecidas consistentes com a capacidade de fertilização da amostra de esperma e as características adicionais descritas acima. As modalidades da invenção direcionadas à capacidade da amostra de esperma podem também compreender a produção de pelo menos um animal de um sexo pré-selecionado a partir das ditas células de esperma processadas criopreservadas. Novamente, as amostras de esperma podem conseqüentemente ser criadas e podem ser configuradas como uma palheta, uma pelota, uma dose de inseminação, ou uma amostra de esperma preparada.

Cada uma das modalidades previamente descritas, e aquelas também descritas abaixo, podem ser consideradas divergências do processamento de célula de esperma tradicional, a produção de mamíferos, a produção de embrião de mamífero e a criação de amostras de esperma. Tem-se tradicionalmente percebido que tal processamento das células de esperma não pode assegurar de forma suficiente a qualidade do esperma ou fornecer taxas adequadas de inseminação, fertilização ou gravidez. Entretanto, e como foi ensinado nas várias referências aqui citadas e incorporadas por referência, as células de esperma podem realmente ser processadas para alcançar, por exemplo, a classificação das células de esperma, potencialmente para diferenciar as células de esperma como células portadoras de cromossomo X ou células portadoras de cromossomo Y, em alguns exemplos para atender à necessidade de pré-seleção do sexo do mamífero ou embrião de mamífero. A presente invenção também atende à necessidade tal processamento, e em algumas modalidades preferidas, características adicionais de preservação até então pensadas como não sendo viáveis comercialmente, ou mesmo possíveis, e até agora fornecendo uma solução para aquelas questões previamente identificadas, mas não abordadas. O sêmen, e particularmente as células de esperma, pode ser obtido e de outra forma até então processado a partir de mamíferos de acordo com a presente invenção, tais como eqüídeos, bovídeos, felídeos, ovídeos, canídeos, búfalo, bois, alce, suíno, ou outras espécies de mamífero. Também, algumas modalidades podem prover a obtenção e processamento de sêmen ou células de esperma a partir de espécies de mamífero apreciadas, espécies de mamíferos ameaçadas, indivíduos raros de uma espécie de mamífero, e até mesmo espécimes ou indivíduos zoológicos. O mamífero resultante ou embrião de mamífero pode ser produzido de acordo com as técnicas conforme previamente descrito e como também descrito abaixo. As amostras de esperma podem ser criadas, em algumas modalidades, conforme previamente descrito.

As amostras de esperma são criopreservadas, tal como por congelamento, usando-se várias técnicas de preservação, tal como o congelamento em um criodiluente tamponado com Hepes. As células de esperma podem ser fornecidas como pelotas ou palhetas e podem ser descongeladas usando-se várias técnicas de descongelamento, por exemplo, com espermatozóide de carneiro. Outras amostras de esperma podem ser fornecidas por todo o processamento de células de esperma, e podem ou não ser criopreservadas quando criadas como uma amostra de esperma ou quando fornecidas para inseminar ou fertilizar um óvulo.

Um ou mais aditivos, de forma única ou em combinação, podem ser introduzidos no sêmen, células de esperma ou amostra de esperma. Em uma modalidade, um criodiluente pode ser introduzido na amostra de esperma para preservar as células de esperma. A introdução do aditivo ou aditivos, tal como um criodiluente, na amostra de esperma, e em algumas modalidades como uma etapa de criopreservação, potencialmente chamada de congelamento pode manter ou melhorar as células de esperma, e pode também manter ou melhorar a qualidade do esperma, a qualidade da célula de esperma, tal como a viabilidade, motilidade e funcionalidade da célula de esperma, e pode manter ou melhorar as taxas de estimulação e fertilização, e potencialmente uma ou mais características da célula de esperma. Em outras modalidades da presente invenção, um aditivo ou aditivos, tal como o criodiluente, sozinho ou em combinação, pode ser removido a partir da amostra de esperma. A remoção do criodiluente ou outros aditivos da amostra de esperma, e em algumas modalidades com as etapas de criopreservação, pode manter ou melhorar as células de esperma, e pode também manter ou melhorar a qualidade do esperma, tal como através da manutenção ou melhoramento da viabilidade, motilidade e funcionalidade da célula de esperma, e das taxas de fertilização, e potencialmente uma ou mais características da célula de esperma.

As células de esperma podem também ser mantidas ou melhoradas em algumas modalidades da presente invenção como parte das técnicas divulgadas, e a qualidade do esperma pode também ser mantida ou melhorada, tal como através da manutenção ou melhoramento da viabilidade, motilidade e funcionalidade da célula de esperma, e potencialmente uma ou mais características da célula de esperma. Além disso, as taxas de fertilização podem ser pelo menos mantidas, e mesmo melhoradas, de acordo com as características da presente invenção e como também descrito abaixo. As características de fertilização podem também ser mantidas ou melhoradas, e em algumas modalidades as taxas de desenvolvimento de blastocistos podem ser melhoradas, a fertilização monospérmica pode ser pelo menos mantida e até melhorada, e as taxas de clivagem pelo menos mantidas ou até mesmo melhoradas. Em algumas modalidades da invenção, a amostra de esperma pode ser preservada, conforme previamente descrito, tal como através da criopreservação, tal como o congelamento ou outras técnicas de preservação tais como àquelas divulgadas nos pedidos de patente previamente mencionados e patentes incorporadas por referência. A qualidade do esperma é mantida nas modalidades conforme também descrito abaixo. A manutenção da qualidade do esperma, entretanto, deve ser interpretada como abrangendo características de melhoramento associadas com as células de esperma. Por exemplo, a presente invenção pode fornecer motilidade melhorada, viabilidade melhorada, e funcionalidade melhorada das células de esperma, e em algumas modalidades das células de esperma de uma amostra de esperma.

Consequentemente, o criodiluente ou outros aditivos, de forma singular ou em combinação, pode ser introduzido na amostra de esperma para preservar ou estimular o esperma. Em uma modalidade preferida, a introdução do criodiluente ou outros aditivos na amostra de esperma contribui para a preservação do esperma através da criopreservação, congelamento da amostra de esperma, e então a manutenção ou melhoramento das células de esperma, e também a manutenção ou melhoramento da qualidade do esperma, tal como pelo menos se mantendo ou mesmo melhorando-se a viabilidade, motilidade e funcionalidade da célula de esperma, e potencialmente uma ou mais características da célula de esperma. Conforme previamente mencionado, o criodiluente ou outros aditivos podem ser introduzidos na amostra de esperma antes da preservação da amostra ou como a preservação da amostra. A amostra pode ser então processada tal como através de técnicas de coleta, manipulação, classificação, armazenagem, transporte, uso, fertilização, ou inseminação conforme divulgado nos pedidos de patente previamente mencionados e patentes.

Em uma modalidade, o criodiluente ou outros aditivos, sozinhos ou em combinação, podem ser introduzidos em uma amostra de esperma previamente coletada e a amostra criopreservada, tal como através de congelamento, seguido por um descongelamento da amostra e subseqüente processamento, incluindo as técnicas de coleta, manipulação, classificação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou de processamento de inseminação. Uma tal etapa de processamento pode ser fornecida como classificação, e em algumas modalidades como a separação das células de esperma portadoras de cromossomo X das células de esperma portadoras de cromossomo Y, potencialmente em uma amostra ou amostras de população de alta pureza. Vários benefícios podem ser alcançados através de tal técnica de processamento de esperma, incluindo a manutenção da qualidade do esperma. Por exemplo, vários métodos de classificação conforme descritos nos pedidos de patente e patentes previamente citados alcançam uma separação das células de esperma portadoras do cromossomo X das células de esperma portadoras do cromossomo Y enquanto minimizam os danos às células de esperma viável. Também, esperma não viável, contaminação, ou criodiluente ou outros aditivos, por exemplo, podem ser eliminados através de tais técnicas de separação. Adicionalmente, outros aspectos da qualidade do esperma podem ser mantidos ou melhorados, particularmente viabilidade, motilidade e funcionalidade da célula de esperma. A amostra de esperma pode também ser estimulada durante o processamento para manter ou melhorar a qualidade do esperma conforme previamente descrito. Um método de processamento de esperma conhecido na técnica está descrito na Patente U. S. de número 5.135.759, aqui incorporada por referência nesta descrição, divulgando uma técnica de classificação por citometria de fluxo. O processamento das células de esperma pode ser executado classificando-se as células de esperma conforme previamente descrito, ou em algumas modalidades, de acordo com os processos a seguir. A classificação pode compreender, em algumas modalidades, como uma seleção de células de esperma baseada em pelo menos uma característica desejada, potencialmente as características de qualidade da célula de esperma, tais como viabilidade, motilidade, funcionalidade, estimulação e preservação, ou uma ou uma combinação de várias características de célula de esperma, tais como os atributos biológicos, químicos, físicos, psicológicos ou funcionais de uma ou mais células de esperma, tais como cromossomos portadores dos atributos da célula. As células de esperma podem ser tingidas, preferivelmente com Hoechst 33342 ou corante ou pigmento semelhante, ou em combinação com tais corantes ou pigmentos, e as células de esperma diferenciadas com base na coloração e seleção. As células podem então ser separadas com base na diferenciação e são então coletadas. As células de esperma podem ser então processadas de acordo com as várias técnicas daquelas referências aqui citadas e expressamente incorporadas por referência, e em algumas modalidades preferidas, processadas de modo a compreender a manutenção da qualidade de esperma.

Modalidade Exemplar 1 Em uma modalidade de uma técnica de preservação e processamento, 200pL de espermatozóide descongelado foram colocados em um gradiente de separação de 2 mL (90%:45%) de Puresperin™, uma preparação humana, e um diluente baseado em Tris. As preparações de gradiente foram então centrifugadas a 1000 g por 15 minutos. A pelota pós-Puresperm™ foi removida, lentamente diluída a 1: 4 com diluente baseado em Tris aquecida e centrifugada a 650 g por 3 minutos. O sobrenadante foi removido e o esperma tingido, incubado e classificado como previamente descrito. O diluente baseado em Tris foi usado como o meio corante e Androhep® (Minitub, Germany) adicionado de 20% de gema de ovo foi usado como o meio de coleta. O exemplo acima é uma das várias modalidades da técnica inventiva, fornecendo a preservação de esperma, tal como através da criopreservação ou congelamento, descongelamento do esperma, identificação do esperma, tal como através da coloração, e classificação do esperma, tal como em populações portadoras do cromossomo X e cromossomo Y.

Embora o exemplo prévio forneça uma técnica de preservação de esperma e técnica de processamento de coleta, preservação, descongelamento e separação de esperma, outras técnicas são abrangidas por e explicitamente divulgadas na presente invenção. Por exemplo, uma ou uma combinação de várias técnicas de coleta, manipulação, separação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação pode ser executada como parte desta presente técnica inventiva. Em uma modalidade, o esperma pode ser coletado, seguido pela separação das células de esperma portadoras de cromossomo X das células de esperma portadoras de cromossomo Y. Uma etapa de preservação anterior à separação da célula de esperma pode não ser necessária, por exemplo, durante as circunstâncias na qual o aparelho de classificação está facilmente disponível após a coleta do esperma. A amostra ou amostras de esperma classificadas podem então ser preservadas como uma etapa adicional e conforme previamente descrito, potencialmente para também manipular, separar, armazenar, transportar, usar, fertilizar ou inseminar. A amostra de esperma classificada pode também ser estimulada durante o processamento para manter ou melhorar a qualidade do esperma conforme previamente descrito. O exemplo a seguir descreve um exemplo de uma técnica de processamento.

Modalidade Exemplar 2 As amostras de esperma foram centrifugadas a 700 g por 6 minutos à temperatura ambiente (24°C). O sobrenadante foi removido e o esperma classificado pode ser usado “novo” para AI ou em um sistema de IVF, ou a pelota remanescente foi diluída a 1:4 com o criodiluente baseado em Ilepes, de forma potencial o mesmo diluente usado para uma criopreservação original do esperma, e o congelamento usando várias técnicas, tal como àquelas previamente descritas e conforme descrito abaixo. O esperma congelado novamente e classificado foi descongelado usando-se métodos tal como um tudo de vidro agitado em um banho a 37°C, e então pode ser usado em um AI ou sistema de IVF.

Modalidade Exemplar 3 O uso de espermatozóide classificado a partir de pelotas congeladas-descongeladas no mamífero ovino relacionado a sistemas de fertilização in vitro. O esperma congelado-classificado e congelado-classificado-congelado usando em um sistema de IVF de ovino foi lentamente diluído com 0,5 mL de meio de IVF, e em algumas modalidades, usando-se o protocolo de IVF de ovino, e centrifugado em um tubo Falcon com uma tampa apertada a 300 g por 6 minutos. O sobrenadante foi removido e o esperma remanescente foi rapidamente colocado na cavidade de IVF a uma concentração de um milhão de esperma móvel/mL. Preferivelmente, um alto padrão de preparação de meio (isto é, uso de óvulos com menos de 24 horas de vida, ultracentrifugação dos diluentes da gema do ovo e filtração meticulosa) e manipulação das amostras (isto é, temperatura constante) são exigidos.

Outras técnicas de preservação, processamento, fertilização e inseminação não necessitam incluir uma etapa de separação. Por exemplo, o esperma pode ser coletado, seguido por uma etapa de preservação e manipulação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação subseqüentes.

Além disso, uma ou mais etapas de preservação podem ser conduzidas como parte das técnicas de preservação, processamento, fertilização e inseminação, ou combinações destas, tal preservação em algumas modalidades compreendendo a criopreservação, tal como através do congelamento da amostra de esperma, e etapas subseqüentes de descongelamento, que ocorrem antes, concomitantes com, ou após uma ou mais outras técnicas de processamento.

Modalidade Exemplar 4 A aplicação de classificação de esperma para geração de animais domésticos e selvagens pode ser limitada quando o aparelho de classificação está a uma longa distância do(s) macho(s), conforme previamente descrito, mas seria facilitada pela classificação de esperma criopreservado e descongelado, tal como esperma congelado-descongelado (Lu KH e outros, Theriogenology 1999:52: 1393-1405) e criopreservação ou re-congelamento do mesmo. A classificação de alta pureza com qualidade mantida de esperma de carneiro congelado-descongelado pode ser alcançada após o processamento para remover o criodiluente. O objetivo deste estudo era avaliar a capacidade funcional do esperma congelado-descongelado após a classificação e uma segunda etapa de criopreservação/descongelamento. Sêmen congelado de 2 carneiros (n = 2 ejaculações por carneiro) foi usado completamente. Tratamentos de esperma pós-descongelamento compreendiam (i) não-classificados (Controle); (ii) classificado (Congelado-Classificado) e (iii) classificado e então re-congelado (Congelado-Classificado-Congelado). Espermas X e Y foram separados usando-se um classificador de alta velocidade (SX MoFlo®, Cytomation, CO, USA) após a incubação com Hoechst 33342 e corante alimentício para eliminar espermas não viáveis. A re-análise revelou altos níveis de pureza para amostras enriquecidas com X e Y para todos os tratamentos (87,0 ± 4,5%). Para IVF, 472 oócitos de IVM foram inseminados com 1 x 106 espermas móveis/mL. Após 3 horas em meio SOF, os oócitos foram transferidos ao meio de divagem de IVF Sydney (Cook®, QLD, Austrália) por 4 dias seguido por meio de blastocisto de IVF Sydney (Cook®) por um período adicional de 3 dias de cultura em 02 5%: C02 5%: N2 90%. Os oócitos foram analisados para divagem em 24 e 48 horas pós-inseminação (p.i.) Em 52 horas p.i., oócitos não clivados foram tingidos com orceína para avaliação da maturação e fertilização. Os dados de 3 réplicas foram analisados por ANOVA, teste qui quadrado e Teste Exato de Fisher. Na inseminação, o percentual de esperma móvel (± SEM) era maior (P < 0,001) para o Congelado-Classificado (85,8 ± 2,4%) e o Congelado-Classificado-Congelado (66,7 ± 7,7%) que ο Controle (36,7 ± 2,1%). A taxa de maturação era de 95,6% (451/472). A clivagem dos oócitos em um grupo de controle partenogenético (sem esperma) era baixo (2/56; 3,6%). A fertilização polispérmica era baixa (9/451; 2,0%) e não diferia entre os tratamentos.

Tabela 1 Fertilização & desenvolvimento de embrião inicial de oócitos após a incubação com esperma de carneiro não classificado congelado-descongelado (Controle), congelado-descongelado & classificado (Congelado-Classificado) & congelado-descongelado, classificado e então congelado-descongelado (Congelado-Classificado-Congelado). Os valores entre parênteses são percentuais. dFertilização monospérmica. Dentro da coluna, valores com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05).

As taxas de fertilização e clivagem eram altas de forma consistente através dos tratamentos. A taxa de desenvolvimento do blastocisto era maior para os oócitos fertilizados com esperma Congelado-Classificado-Congelado que com esperma de Controle. Estes resultados demonstram que o esperma de carneiro congelado-descongelado pode ser classificado por sexo para uso imediato ou para uso futuro em um sistema de IVF após nova criopreservação. O exemplo acima é uma das várias modalidades da técnica inventiva, fornecendo a preservação do esperma, tal como através da criopreservação, tal como congelamento, descongelamento do esperma, classificação do esperma, tal como em populações portadoras de cromossomo X e Y, preservando a amostra classificada, tal como através da criopreservação ou congelamento, e ainda incluindo o descongelamento da amostra de esperma para uso, tal como para fertilização ou inseminação.

Deve-se consideras as taxas de fertilizada com relação aos procedimentos de preservação e processamento, tal como a separação para classificação por sexo e criopreservação de amostras de esperma, como o próximo Exemplo descreve, e em combinação com a criopreservação, descongelamento, processamento e subseqüente criopreservação, conforme divulgado nesta descrição.

Modalidade Exemplar 5 Cordeiros foram produzidos após a inseminação artificial (AI) com números baixos (2-4 x 106) de esperma classificado por sexo criopreservado. Menos ovelhas estavam prenhas após AI com esperma congelado-descongelado classificado como X ou Y (25%, 15% respectivamente) que com uma dose comercial de esperma congelado-descongelado não classificado (54%). O objetivo do presente estudo era determinar os números mínimos de esperma congelado-descongelado classificado exigido para se obter taxas de gravidez similares àquelas obtidas com esperma não classificado.

Uma amostra de esperma de ejaculações únicas de 2 carneiros foi tingida, incubada, analisada e classificada usando-se um classificador de célula de esperma de alta velocidade (MoFlo®, Cytomation, Fort Collins, CO, USA) conforme previamente descrito. Os espermas foram processados a 15.000-18.000/serc sem classificação por sexo em tubos de centrífuga de 10 mL pré-saturados com BSA 1% em fluido de revestimento contendo 0,2 mL de meio tamponado com Tris e 20% de gema de ovo (v/v). Para cada amostra, 1,3 x 106 espermas foram classificados por sexo e analisados para determinação da pureza. Amostras classificadas e não classificadas (controle) foram diluídas com um diluente tamponado com “zwitteríons” contento 13,5% de gema de ovo e 6% de glicerol e congeladas como pelotas de 250 pL contento 5 x 106 espermas. O tempo de cio foi controlado em 144 ovelhas Merino por esponjas de progestagen (FGA, Vetrepharm A/Asia, Sydney) inseridas de forma intravaginal por 12 dias e uma injeção de 400 I.U de PMSG (Pregnecol,Vetrepharm A/Asia) na remoção da esponja (SR). Trinta e seis horas após a remoção da esponja, 134 ovelhas foram injetadas com 40 pg de GnRH (Fertagyl®, Intervet) para controlar o tempo de ovulação. Cento e onze ovelhas foram inseminadas no útero por laparoscopia de 57 a 60 horas após SR com 5, 10, 20, ou 40 x 106 espermas congelados- descongelados classificados ou não classificados. Treze ovelhas que não receberam GnRH foram inseminadas com uma dose comercial de esperma congelado-descongelado não classificado. Treze ovelhas que não receberam GnRH foram inseminadas com uma dose comercial de esperma congelado-descongelado não classificado de 57 a 58 horas após SR. A gravidez foi diagnosticada por ultra-som no 53° dia. Os dados foram analisador por qui quadrado. A motilidade do esperma após o descongelamento era de 37,8 ± 1,78% (classificado) e de 42,9 ± 0,93% (não classificado). Sete das treze (53,8%) ovelhas que não receberam GnRH estavam prenhas. Das ovelhas tratadas com GnRH, a proporção de gravidez foi afetada pelo número de espermas inseminados (p < 0,05) mas não pelo carneiro ou tipo de esperma (p > 0,05). Para as ovelhas inseminadas com esperma congelado-descongelado classificado ou não classificado (controle), a taxa de gravidez foi maior para inseminações de 10 e 40 x 106 espermas que para 5 e 20 x 106 espermas (Tabela 1). Os resultados sugerem que um mínimo de 40 x 105 de esperma congelado-descongelado classificados inseminado próximo ao período de ovulação é requisitado para se obter taxas de gravidez aceitáveis comercialmente.

Tabela 1 A gravidez após a inseminação intrauterina de ovelhas com esperma de controle congelado-descongelado e de carneiro classificado. abDentro das colunas diferentes sobrescritos diferem (p < 0,05). aEsta pesquisa foi apoiada por XY, Inc; CO, USA; The Australian Research Council, Vetrephann A/Asia.

Modalidade Exemplar 6 A capacidade de escolher e re-congelar esperma congelado-descongelado irá aumentar de forma significativa a aplicação potencial de tecnologia de processamento de esperma tal como a tecnologia de sexagem de esperma para aplicações tais como gerenciamento de espécies. O esperma de carneiro congelado-descongelado, classificado, re-congelado e então descongelado, de acordo com algumas modalidades da invenção, parece completamente funcional in vitro com a produção de blastocisto mais que aquele esperma congelado-descongelado, não classificado (Hollingshead FK e colaboradores, 2003; Theriogenology 59 209). Algumas modalidades podem ser especialmente úteis para avaliar a capacidade in vitro de embriões produzidos in vitro derivados de esperma congelado-descongelado após a classificação e uma segunda etapa de criopreservação. O sêmen congelado de 2 carneiros (n = 3 ejaculações por carneiro) foi usado por toda uma técnica da presente invenção. Tratamentos de esperma pós-descongelamcnto compreendiam (i) não-classificado (Controle); (ii) classificado (Congelado-Classificado) e (iii) classificado e então re-congelado (Congelado-Classificado-Congelado). Espermas X e Y foram separados usando-se um classificador de alta velocidade (SX MoFlo®, Cytomation, CO, USA) após a incubação com Hoechst 33342 e corante alimentício para eliminar espermas não viáveis. A re-análise em algumas modalidades revelou altos níveis (meio ± SEM) de pureza para amostras enriquecidas com X e Y para todos os tratamentos (89 ± 1,2%). No 6o dia pós-inseminação em uma técnica executada da invenção, 2 embriões (estágio de blastocisto ou mais) foram transferidos por recipiente. Os dados foram analisados por qui quadrado e Teste Exato de Fisher. A sobrevivência do embrião in vivo para esta modalidade pode ser similar através dos tratamentos de esperma (28/64, 43,8% do total), e 20 de 23 (87,0%) cordeiros classificados por sexo eram do sexo previsto (Tabela 2). Estes resultados das modalidades da invenção podem demonstrar alta capacidade de desenvolvimento in vivo de embriões classificados por sexo produzidos in vitro derivados de esperma de carneiro congelado-descongelado após a classificação e uma segunda etapa de criopreservação/descongelamento, e aumentar a aplicação potencial da tecnologia de processamento de esperma tal como a tecnologia de sexagem.

Tabela 2 A sobrevivência in vivo de embriões produzidos in vitro derivados de esperma de carneiro não classificado congelado-descongelado (Controle), congelado-descongelado & classificado (Congelado-Classificado) & congelado-descongelado, classificado e então congelado-descongelado (Congelado-Classificado-Congelado). "Diagnóstico por ensaio de progesterona do sangue.0 Diagnosticado por ultra-sonografia. A invenção pode também incluir uma amostra de esperma, conforme previamente definido, tal como uma palheta, e em algumas modalidades palhetas utilizadas em IVF, produzida de acordo com qualquer uma das modalidades da invenção, tal como qualquer uma das técnicas de processamento, produção de mamífero, produção de embrião de mamífero, estimulação, preservação, fertilização e inseminação, e ser de qualidade de esperma mantida ou melhorada, tal como uma palheta de viabilidade, motilidade e funcionalidade desejadas, ou outras características, ou combinações de características, tal como as características aqui divulgadas, resultando potencialmente em níveis desejáveis de taxas de fertilização, e em algumas modalidades, particularmente para mamíferos eqüinos. A amostra de esperma tal como pelo menos uma ou uma pluralidade de palhetas pode ser particularmente adequada para produção individual de embriões. A invenção pode também incluir um mamífero produzido de acordo com qualquer uma das modalidades da invenção acima descritas, ou pode incluir um mamífero de sexo predeterminado de acordo com as várias modalidades da invenção que fornecem amostras para inseminação de célula de esperma possuindo uma população enriquecida de células de esperma portadoras de cromossomo X ou uma população enriquecida células de esperma portadoras de cromossomo Y, ou um mamífero produzido de acordo com qualquer modalidade da invenção em que uma amostra para inseminação de célula de esperma contendo um baixo número de células de esperma comparada ao número típico usado para inseminar aquela espécie de mamífero particular é usada, ou prole de alce produzida de acordo com a invenção conforme descrita acima. A invenção também inclui várias técnicas de processamento, preservação, estimulação, fertilização, inseminação, e de produção de mamífero ou embrião de mamífero conforme aqui divulgado e como pode compreender características combinadas divulgadas nos pedidos de patente e referências previamente mencionadas. Conseqüentemente, as várias características de processamento de sêmen e de célula de esperma fornecidas como sistemas de preservação, estimulação, fertilização, inseminação, e modalidades de produção de mamífero ou embrião de mamífero, estão direcionadas à qualidade do esperma tal como uma ou mais características de célula de esperma, tal como viabilidade, motilidade, funcionalidade, ou taxas de fertilização consistentes com as divulgações dos pedidos de patente e referências previamente mencionadas. Também, as características da célula de esperma podem estar abordadas dentro do contexto de várias técnicas de coleta, manipulação, separação, armazenagem, transporte, uso, fertilização ou inseminação, e naquelas ou em outras modalidades, dentro do contexto de análise, teste ou determinação de atributos biológicos, químicos, físicos, fisiológicos ou funcionais de células de esperma. Portanto, os sistemas de presente invenção podem fornecer técnicas de processamento, estimulação, preservação, fertilização e inseminação, por exemplo, incorporando técnicas de classificação por fluxo, técnicas de separação de alta pureza, técnicas de fertilização de inseminação de baixa dosagem, procedimentos de inseminação heterospérmica, tais como para avaliar a viabilidade, motilidade, função ou fertilidade comparativas processadas em vários ambientes de pressão dentro de um classificador como apenas alguns exemplos. A divulgação incorporada por referência, tal como os vários exemplos fornecidos de separação de células de esperma portadoras de cromossomo X das células de esperma portadoras de cromossomo Y, e outras técnicas divulgadas de coleta, manipulação, separação, armazenagem, transporte, uso, fertilização e inseminação não são pretendidas para limitar a presente invenção a qualquer modalidade particular, se aparelho, método ou outra forma. As descrições incorporadas por referência e os vários exemplos não devem ser interpretados para limitar a presente invenção a apenas técnicas para classificação de esperma ou apenas técnicas para preservação de esperma. Esta divulgação, entretanto, pode ser compreendida para incorporar as várias técnicas no contexto das várias modalidades da presente invenção. Também, a presente invenção deve ser interpretada para incorporar tais técnicas de processamento, preservação, estimulação, fertilização e inseminação de esperma consistentes com as características divulgadas.

Como pode ser facilmente compreendido a partir do supracitado, os conceitos básicos da presente invenção podem ser incorporados em uma variedade de formas. Eles envolvem a preservação de células de esperma, processamento de células de esperma, amostras de esperma, sistemas de produção de mamífero ou embrião de mamífero incluindo tanto técnicas quanto dispositivos para executar o processamento de célula de esperma. Neste pedido, várias técnicas de processamento de célula de esperma são divulgadas como parte dos resultados apresentados a serem alcançados pelos vários dispositivos descritos e como etapas que são inerentes à utilização. São simplesmente o resultado natural da utilização de dispositivos como objetivado e descrito. Além disso, embora alguns dispositivos sejam divulgados, deve-se compreender que estes não apenas executam certos métodos, mas também podem ser variados de muitas maneiras. De forma importante, assim como todo o precedente, todas estas observações devem ser compreendidas como abrangidas por esta divulgação.

Também, cada um dos vários elementos da invenção e reivindicações pode também ser alcançado de várias maneiras. Esta divulgação deve ser compreendida para abranger cada variação, seja uma variação de uma modalidade de qualquer modalidade de aparelho, uma modalidade de método ou processo, ou mesmo meramente uma variação de qualquer elemento destas. Particularmente, deve-se compreender que uma vez que a divulgação relaciona-se aos elementos da invenção, as palavras para cada elemento podem ser expressas por termos de aparelho ou termos de métodos equivalentes, mesmo se apenas a função ou resultado for o mesmo. Tais termos equivalentes, mais amplos ou mesmo mais genéricos devem ser considerados como abrangidos na descrição de cada elemento ou ação. Tais termos podem ser substituídos onde desejado tomar explícita a cobertura ampla de forma implícita à qual esta invenção está intitulada.

Como um único exemplo, deve ser compreendido que todas as ações podem ser expressas como um meio para executar aquela ação ou como um elemento que causa aquela ação. De forma similar, cada elemento físico divulgado deve ser compreendido como abrangendo uma divulgação da ação que aquele elemento físico facilita. Relacionada a este último aspecto, como um único exemplo, a divulgação de um “elemento de criopreservação” ou “dispositivo de criopreservação” ou semelhante, deve ser compreendida como abrangendo a divulgação do ato de “criopreservação” — se explicitamente discutido ou não - e, contrariamente, eram efetivamente a divulgação do ato de “criopreservação”, tal divulgação deve ser compreendida como abrangendo a divulgação de um “agente de criopreservação” e mesmo um “meio para criopreservação”. Tais mudanças e termos alternativos devem ser compreendidos para estarem explicitamente incluídos na descrição.

Quaisquer atos de lei, estatutos, regulamentações ou regras mencionadas neste pedido de patente; ou patentes, publicações ou outras referências mencionadas neste pedido de patente estão aqui incorporadas por referência. Além disso, como para cada termo usado deve ser compreendido que a menos que sua utilização neste pedido seja inconsistente com tal interpretação, definições de dicionários comuns devem ser compreendidas como incorporadas para cada termo e todas as definições, termos alternativos, e sinônimos tais como os contidos em Random House Webster's Unabridged Dictionary, 2a edição, estão aqui incorporados por referência. Finalmente, todas as referências listadas na declaração de informação depositada com o pedido estão aqui em anexo e aqui incorporadas por referência, entretanto, como para cada um dos anteriores, ao ponto em que tal informação ou declarações incorporadas por referência devem ser consideradas inconsistentes com o patenteamento desta(s) invenção(ões), tais declarações não devem ser expressamente consideradas como feitas pelo(s) peticionário(s).

Assim, o(s) peticionário(s) deve(m) ser compreendido(s) como reivindicando pelo menos: i) cada um dos métodos de processamento de célula de esperma, métodos de produção de mamífero, amostras de esperma, mamíferos e embriões de mamífero conforme aqui divulgados e descritos, ii) sistemas relacionados, dispositivos e aparelhos múltiplos divulgados e descritos, iii) variações similares, equivalentes e mesmo implícitas de cada um destes sistemas e métodos, iv) aqueles desenhos alternativos que executam cada uma das funções apresentadas como estão divulgados e descritos, v) aqueles desenhos alternativos e métodos que executam cada uma das funções apresentadas conforme estão implícitas para executar o que está divulgado e descrito, vi) cada característica, componente e etapa apresentados como invenções separadas e independentes, vii) as aplicações melhoradas pelos vários sistemas ou componentes divulgados, viii) os produtos resultantes produzidos por tais sistemas ou componentes, e ix) métodos c aparelhos substancialmentc conforme descrito aqui anteriormente e com referência a qualquer um dos exemplos que acompanham, x) as várias combinações e permutações de cada um dos elementos divulgados, e xi) cada reivindicação ou conceito potencialmente dependente como uma dependência em cada uma das reivindicações e conceitos independentes apresentados. O Peticionário pode ter apresentado reivindicações com um conjunto de dependências iniciais. Deve-se compreender que existe apoio ao grau exigido sob as leis de matéria nova - incluindo, mas não limitado ao Artigo 123 (2) da Convenção de Patentes Européia e a Lei de Patentes 35 USC 132 dos Estados Unidos ou outras leis - para permitir a adição de qualquer uma das várias dependências ou outros elementos apresentados sob uma reivindicação ou conceito independente como dependências ou elementos sob qualquer outra reivindicação ou conceito independente.

Também, se ou quando usado, o uso da expressão transicional “compreendendo” é usado para manter as reivindicações “de sentido amplo”, de acordo com a interpretação da reivindicação tradicional. Assim, a menos que o contexto exija de outra forma, deve ser compreendido que o termo “compreender” ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo”, são objetivados para envolver a inclusão de um elemento ou etapa ou grupo de elementos ou de etapas declarados, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou etapa ou grupo de elementos ou de etapas. Tais termos devem ser interpretados na sua forma mais expansiva de modo a proporcionar ao peticionário a cobertura mais ampla legalmente permitida.

REIVINDICAÇÕES

Claims (19)

1. Um método de processamento de célula de esperma. caracterizado por compreender as etapas de: obtenção de células de esperma; crioprcscrvaçâo das ditas células de esperma; descongelamento das ditas células de esperma; processamento das ditas células de esperma; e criopreservação das ditas células de esperma.

2. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação I, caracterizado por a dita etapa de processamento compreender classificar as ditas células de esperma.

3. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 2. caracterizado por a dita etapa de classificação compreender selecionar as ditas células dc esperma com base em pelo menos uma característica de célula de esperma desejada.

4. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 3, caracterizado por a dita etapa de seleção compreender tingir as ditas células de esperma com base em pelo menos urna característica de célula de esperma desejada.

5. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 4, caracterizado por a dita etapa de seleção também compreender diferenciar as ditas células de esperma com base em pelo menos uma característica de célula de esperma desejada.

6. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 5, caracterizado por a dita etapa de diferenciação compreender diferenciar as ditas células de esperma como uma célula de esperma portadora de cromossomo X ou uma célula de esperma portadora de cromossomo Y.

7. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 5, caracterizado por a dita etapa de seleção também compreender separar as ditas células de esperma que possuem a dita pelo menos uma característica de célula de esperma desejada.

8. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito nas reivindicações 5 ou 7, caracterizado por compreender a etapa de coleta das ditas células de esperma.

9. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 2, caracterizado por a dita etapa de classificação compreender classificar por citometria de fluxo.

10. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 1, caracterizado por compreender a etapa de criação de uma amostra de esperma a partir das ditas células de esperma processadas.

11. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 10, caracterizado por a dita segunda etapa de criopreservação compreender criopreservar a dita amostra de esperma.

12. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 10, caracterizado por a dita etapa de criação de uma amostra de esperma compreender criar uma pluralidade de amostras de esperma e onde a dita segunda etapa de criopreservação compreende criopreservar a dita pluralidade de amostras.

13. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 1, caracterizado por compreender a etapa de criação de uma amostra de esperma a partir das ditas células de esperma criopreservadas processadas.

14. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 1, caracterizado por compreender a etapa de descongelamento das ditas células de esperma criopreservadas processadas.

15. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 14, caracterizado por compreender a etapa de criação de uma amostra de esperma a partir das ditas células de esperma descongeladas criopreservadas processadas.

16. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 14, caracterizado por a dita etapa de criação de uma amostra de esperma compreender criar uma pluralidade de amostras de esperma.

17. Um método de processamento de células de esperma conforme descrito na reivindicação 15, caracterizado por a dita etapa de criação de uma amostra de esperma compreender criar uma pluralidade de amostras de esperma.

18. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 1, caracterizado por a dita etapa de obtenção compreender obter sêmen possuindo uma concentração de células de esperma, onde a dita etapa de criopreservação compreende criopreservar o dito sêmen, e onde a dita etapa de descongelamento compreende descongelar o dito sêmen criopreservado.

19. Um método de processamento de célula de esperma conforme descrito na reivindicação 1, caracterizado por a dita etapa de obtenção compreender obter células de esperma a partir de espécimes zoológicos.