JP7142842B2 - 哺乳動物精子の分離方法、人工授精方法及び体外受精方法 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳動物精子の分離方法、人工授精方法及び体外受精方法に関する。

家畜における雌雄産み分け技術は、家畜の効率的な生産に大きく寄与する。たとえば、乳牛の場合、雌を計画的に産み分けさせることで後継乳牛を獲ることができる。一方、牛乳生産のためには常に乳牛を妊娠させておく必要がある。後継乳牛が獲られた後では、子牛価格の高い黒毛和牛の受精卵を乳牛に移植し、黒毛和牛を生誕させると酪農家の経営が大きく改善される。そして、黒毛和牛の子牛価格は、雌雄で大きな価格差があり、雄子牛価格は雌子牛価格よりも高額である。したがって、乳牛において、後継乳牛（雌産子）を生誕させる技術だけでなく、後継乳牛が獲られた後の体外受精や人工授精において、黒毛和牛の受精卵を得て雄子牛を生誕させる技術が求められている。

また、養豚においては、去勢雄は成長が早いため、雌に比べ、出荷体重に到達するまでの肥育日数が短い。このため、肉豚生産において雄産子をより多く生誕させることは、養豚業の経営改善のみならず、餌あたりの豚肉生産量の増加になるので、世界における食料生産を高めることにもつながる。一方で、去勢を行うことに対して、批難もあることから、雌産子を選択的に生誕させたい要望もある。

このように、家畜をはじめとする哺乳動物において、雌雄産み分け技術の要求は高い。これまでの雌雄産み分け技術として、特許文献１～３などの手法が知られている。また、これらのほか、Ｘ染色体とＹ染色体の大きさの差異に着眼した手法が知られている。この手法では、セルソーターを用い、ＤＮＡを染色する蛍光色素を取り込ませた精子を蛍光量に基づいて仕分けることにより、９０％以上の割合でＸ染色体を有する精子を分離する技術が確立されており、乳牛生産に利用されている。

特開２００８－０２２７６０号公報 特開平７－１６３２６９号公報 特開平６－１８１６６６号公報

しかし、セルソーターを用いた手法では、大量の精子処理に時間がかかるという課題を有する。また、精子が蛍光染色されること、更に、精子に特殊波長の光が暴露されることから、分離した精子の運動性が低下してしまい、授精率にも難がある。

本発明は上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的は大量の精子でも短い時間で分離し得るとともに、分離した精子の運動性の低下を抑制し得る哺乳動物精子の分離方法、人工授精方法及び体外受精方法を提供することにある。

本発明の第１の観点に係る哺乳動物精子の分離方法は、
ＴＬＲ７リガンドとしてレシキモドを０．０３～０．３μＭ、又は、イミキモドを０．０３～３０μＭ含有する培地にて精子を培養し、
前記培地の上層に浮遊する精子と下層に沈降する精子とに分離する、
ことを特徴とする。

過重力を負荷して分離することが好ましい。

遠心力により過重力を負荷することが好ましい。

０×ｇより大きく１００×ｇより小さい遠心力を負荷することが好ましい。

前記培地の上層３０％を分取してＹ染色体保有精子に富む精子群を得ることが好ましい。

前記培地の下層３０％を分取してＸ染色体保有精子に富む精子群を得ることが好ましい。

本発明の第２の観点に係る人工授精方法は、
本発明の第１の観点に係る哺乳動物精子の分離方法で分離した非ヒト哺乳動物の精子を用いて非ヒト哺乳動物の人工授精を行う、
ことを特徴とする。

本発明の第３の観点に係る体外受精方法は、
本発明の第１の観点に係る哺乳動物精子の分離方法で分離した非ヒト哺乳動物の精子を用いて非ヒト哺乳動物の体外受精を行う、
ことを特徴とする。

本発明に係る哺乳動物精子の分離方法によれば、多量の精子の分離処理を短い時間で行い得るとともに、分取した精子の運動性の低下を抑制し得る。

図１（Ａ）～（Ｄ）は、各動物種の精子におけるＴＬＲ７の局在を示す写真である。 各動物種におけるＴＬＲ７陽性精子の割合を示すグラフである。 ＴＬＲ７リガンドを添加した培地でマウス精子を培養したときの浮遊精子の割合を示すグラフである。 ＴＬＲ７リガンドを添加した培地でマウス精子を培養したときの浮遊精子のＸ染色体保有精子及びＹ染色体保有精子の割合を示すグラフである。 ＴＬＲ７リガンドを添加した培地でウシ精子を培養したときの浮遊精子の割合を示すグラフである。 ＴＬＲ７リガンドを添加した培地でウシ精子を培養したときの浮遊精子のＸ染色体保有精子及びＹ染色体保有精子の割合を示すグラフである。 ＴＬＲ７リガンドを添加した培地でブタ精子を培養したときの浮遊精子の割合を示すグラフ（図７（Ａ））、浮遊精子のＸ染色体保有精子及びＹ染色体保有精子の割合を示すグラフ（図７（Ｂ））である。 ＴＬＲ７リガンドを添加した培地でマウス精子を培養し、遠心分離した後の培地の上層に存在するＸ染色体保有精子及びＹ染色体保有精子の割合を示すグラフである。 ＴＬＲ７リガンドを添加した培地でマウス精子を培養し、遠心分離した後の培地の上層に存在するＸ染色体保有精子及びＹ染色体保有精子の割合を示すグラフである。

本実施の形態に係る哺乳動物精子の分離方法は、ＴＬＲ７リガンドを含有する培地にて精子を培養する。そして、培地の上層に浮遊する精子と下層に沈降する精子とに分離する。

ＴＬＲ７リガンドを含有する培地で精子を培養すると、Ｙ染色体を持たない精子（以下、Ｘ染色体保有精子）は、精子活性が低下し培地の下層へ沈降する。一方、Ｙ染色体を持つ精子（以下、Ｙ染色体保有精子）は、精子活性の低下が生じにくく、培地の上層に浮遊することになる。

そして、培地の上層に浮遊する精子を分取することで、Ｙ染色体保有精子に富む精子群を得ることができる。分取はスポイト等の分取器具を使用した分取など、培地の上層に浮遊する精子群を分取し得る公知の技術で行えばよい。この分取した精子群の多くはＹ染色体保有精子であるので、このＹ染色体保有精子が卵子と受精することにより、ＸＹ染色体を持つ受精卵となる。したがって、この分取した精子群を用い、哺乳動物の人工授精や体外受精を行うことによって選択的に雄産子を産み分けさせることができる。

また、培地の下層に沈降する精子群を分取することで、Ｘ染色体保有精子に富む精子群を得ることができる。この分取した精子群の多くはＸ染色体保有精子であるため、この精子が卵子と受精することにより、ＸＸ染色体を持つ受精卵となる。したがって、この分取した精子群を用い、哺乳動物の人工授精や体外受精を行うことによって選択的に雌産子を産み分けさせることができる。

ＴＬＲ７リガンドを含有する培地は、基礎培地にＴＬＲ７リガンドを添加することにより調製して用いればよい。基礎培地としては、哺乳動物の精子の培養に通常用い得る培地が使用され得る。基礎培地として、例えば、ＨＴＦ培地（組成：NaCl, KCl, KH₂PO₄, MgSO₄・7H₂O, CaCl₂・2H₂O, NaHCO₃, Glucose, Na-pyruvate, Na-lactate, Gentamicin Sulfate salt, Phenol Red）等の胚培養培地が好適に用いられる。

ＴＬＲ７リガンドとして、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）やイミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、ガーディキモド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）が挙げられる。これらは１種単独で用いられても、２種以上が用いられてもよい。

基礎培地へのＴＬＲ７リガンドの添加量は、用いるＴＬＲ７リガンドの種類や用いる精子の動物種により適宜設定すればよく、例えば、０．０３μＭ～３０μＭであることが好ましい。例えば、マウスの精子について、レシキモドを用いる場合、レシキモドの添加量は０．３μＭ～３μＭであることが好ましい。また、ウシの精子について、レシキモドを用いる場合、０．０３μＭ～０．３μＭであることが好ましく、また、イミキモドを用いる場合、０．０３μＭ～３０μＭであることが好ましい。

また、培養時間についても特に制限されず、Ｘ染色体保有精子の活性が低下して培地の下層に沈降し、上層に浮遊するＹ染色体保有精子を分離するために十分な時間であればよい。例えば、３０分間～３時間であることが好ましく、１～２時間であることがより好ましい。

また、過重力を負荷して分離を行うことが好ましい。精子は本来的に流れに逆らって泳ごうとする性質を備えている。したがって、過重力が負荷されていると、精子は負荷された過重力の方向に逆らって泳ごうとする。上述したように、ＴＬＲ７リガンドを含有する培地では、Ｘ染色体保有精子の活性が低くなり、この状況で過重力が負荷されると、Ｘ染色体保有精子は過重力に抗えず、過重力が負荷されている方向へ、即ち、培地の下層へ沈降しやすくなる。一方で、Ｙ染色体保有精子は、ＴＬＲ７リガンドの影響を受け難いことから、過重力が負荷されても、負荷されている過重力の方向に逆らって泳ぐことができる。即ち、Ｙ染色体保有精子は培地の上層に浮遊することができる。このようなことから、過重力を負荷して分離を行うことによって、Ｙ染色体保有精子とＸ染色体保有精子との分離精度を高めることができる。

過重力を負荷する手法として、遠心力を負荷する遠心分離法が好ましい。負荷する遠心力は、０×ｇより大きく１００×ｇより小さいことが好ましく、５０×ｇであることがより好ましい。負荷する遠心力（過重力）が大きすぎると、Ｙ染色体保有精子であっても、過重力に逆らえなくなり、培地の下層に沈降してしまうためである。一方、遠心力（過重力）が小さすぎると、一部のＹ染色体保有精子は培地の下層にも泳いで行ってしまい、分離効果が低くなるためである。

なお、過重力を負荷する時間は、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子とを分離可能な時間であればよく、負荷する過重力にもよるが、例えば３０分程度である。

また、培地の上層、好ましくは上層の３０％に浮遊しているＹ染色体保有精子に富む精子群を分取して、人工授精、体外受精に用いることが好ましい。また、培地の下層、好ましくは下層の３０％に沈降しているＸ染色体保有精子に富む精子群を分取して、人工授精、体外受精に用いることが好ましい。培地の中層には、Ｙ染色体保有精子、Ｘ染色体保有精子の混在が生じ易いためである。なお、分取した精子群は、基礎培地等で洗浄してから用いることが好ましい。

本実施の形態に係る哺乳動物精子の分離方法では、上述のように、ＴＬＲ７リガンドを含有する培地で精子を培養するものゆえ、短い時間で多量の精子を処理することが可能である。

また、本実施の形態に係る哺乳動物精子の分離方法では、精子を蛍光染色することもなく、精子に特殊波長の光を暴露することもない。このため、分離した精子の活性の低下を抑制することができ、授精率の低下も抑制できる。

なお、分離したＹ染色体保有精子に富む精子群、Ｘ染色体保有精子に富む精子群を用いて人工授精、体外受精を行う場合、分離した精子を用いて、人工授精、体外受精の通常の手法で行えばよい。Ｙ染色体保有精子に富む精子群を用いて人工授精、又は、体外受精を行うことで、選択的に雄産子を生誕させることができる。一方、Ｘ染色体保有精子に富む精子群を用いて人工授精、又は、体外受精を行うことで、選択的に雌産子を生誕させることができる。

（マウス精子のトランスクリプトーム解析）
マウス精子のトランスクリプトーム解析を行った。マウス精子中のＲＮＡ断片を抽出し、その全ＲＮＡをシークエンサーにより解析した。その結果、Ｘ染色体由来の１４６７遺伝子が発現しており、その中の２６種は受容体をコードするＲＮＡであった。その２６種のＲＮＡを表１に示す。

この中のＴＬＲ７は、特異的リガンドがＸ染色体にコードされるＴＬＲ８以外には直接結合しないこと、及び、刺激によりＣａ^２＋を放出することが知られている。そして、Ｃａ^２＋は精子の運動性に大きな影響を与えることが知られている。ＴＬＲ７はＴＬＲ８が存在しなければ存在しない遺伝子であり、ＴＬＲ７がＸ染色体、Ｙ染色体の存在に関与しているものと考えられ、以下の検証を行った。

（各種哺乳類の精子におけるＴＬＲ７の発現局在の観察）
マウス、ウシ、ブタ、ヤギのそれぞれの精子について、免疫染色してＴＬＲ７の発現局在を観察した。図１（Ａ）にマウス、図２（Ｂ）にウシ、図３（Ｃ）にブタ、図４（Ｄ）にヤギの精子の写真を示す。

図１（Ａ）～（Ｄ）を見ると、いずれの動物種においてもＴＬＲ７が発現しているとともに、ＴＬＲ７の発現はいずれも精子尾部に局在していた。

また、ＴＬＲ７が発現した陽性精子の割合を算出した。その結果を図２に示す。図２を見ると、ＴＬＲ７が発現した陽性精子の割合は、いずれの動物種においても５０％前後である。この結果から、Ｘ染色体保有精子のみＴＬＲ７が発現していると考えられる。

（ＴＬＲ７リガンドが精子に及ぼす影響の検証）
各種哺乳動物の精子について、ＴＬＲ７リガンドを添加した培地にて培養し、ＴＬＲ７リガンドが精子に及ぼす影響について検証した。

（マウス精子における検証）
胚培養培地（ＨＴＦ）にアルブミン及びＴＬＲ７リガンドを添加した培地を用い、マウス精子を１時間、３７℃、５％二酸化炭素条件下で培養した。ＴＬＲ７リガンドとして、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ Ｒ－８４８（以下、Ｒ－８４８）を用いた。Ｒ－８４８の添加量は、０μＭ、０．００３μＭ、０．０３μＭ、０．３μＭ、１．５μＭ、３μＭとしてそれぞれ行った。

培地の上層に浮遊している精子の割合を図３に示す。図３を見ると、上層に浮遊する精子の割合はＲ－８４８の濃度依存的に減少し、０．３μＭ添加区では無添加区に比べて半減した。

この上層に浮遊する精子を回収してＤＮＡを抽出し、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により、Ｘ染色体保有精子（以下、Ｘ精子）とＹ染色体保有精子（以下、Ｙ精子）の割合を算出した。

その結果を図４に示す。図４を見ると、０．３μＭ添加区、３μＭ添加区において、Ｙ精子の割合が高く、０．３μＭ添加区では８０％以上がＹ精子であった。

無添加区及び０．３μＭ添加区の浮遊精子を洗浄した後、体外受精に供試した。体外受精胚について、ＸＸ染色体、ＸＹ染色体を保有している割合を算出した。その結果を表２に示す。

表２を見ると、無添加区の浮遊精子を用いた場合ではＸＸ染色体とＸＹ染色体の割合はほぼ同じであるが、０．３μＭ添加区の浮遊精子を用いた場合では約９０％の受精卵がＸＹ両染色体を有していた。また、０．３μＭ添加区の浮遊精子を用いて体外受精を行った胚盤胞期胚を移植したところ、１２匹の産子中、１０匹の雄産子が得られた。

（ウシ精子における検証）
大分県農林水産研究指導センターから提供されたウシ凍結精液を用いた。凍結精子を融解し、アルブミン無添加ＨＴＦ培地で洗浄した。このウシ精子を、ＨＴＦにアルブミン及びＴＬＲ７リガンドを添加した培地にて、１時間、３７℃、５％二酸化炭素条件下で培養した。ＴＬＲ７リガンドとして、Ｒ－８４８、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ Ｒ－８３７（以下、Ｒ－８３７と記す）を用いた。Ｒ－８４８の添加量は、０μＭ、０．００３μＭ、０．０３μＭ、０．３μＭ、３μＭとしてそれぞれ行った。また、Ｒ－８３７の添加量は、０．００３μＭ、０．０３μＭ、０．３μＭ、３μＭ、３０μＭ、３００μＭとしてそれぞれ行った。

ウシ精子の培養における浮遊精子の割合を図５に示す。図５を見ると、ＴＬＲ７リガンドを添加して培養した場合、無添加区に比べて、いずれも上層の浮遊精子の割合が減少している。

つづいて、上層の浮遊精子を回収し、ＤＮＡを抽出してｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により、Ｘ精子とＹ精子の割合を算出した。

浮遊精子のＸ精子、Ｙ精子の割合を図６に示す。図６を見ると、Ｒ－８４８添加区においては、０．０３μＭ～３μＭ添加区でＹ精子の割合が高く、０．０３μＭ～０．３μＭ添加区で９０％以上がＹ精子であった。また、Ｒ－８３７添加区においては、０．０３μＭ～３０μＭ添加区でＹ精子の割合が高く、７０％以上がＹ精子であった。

上記のＲ－８４８の０．０３μＭ添加区におけるＹ精子に富む上層の精子を用い、ウシの体外受精を行った。その結果、受精率は７１．７％、胚盤胞期胚への発生率は６４．３％であり、これらは通常の体外受精と同等であり、受精率は良好であった。

そして胚盤胞期胚をｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で雌雄判別を行った。その結果、８７．８％が雄胚であった。したがって、ウシでも雄産子を選択的に得られることがわかる。

（ブタ精子における検証）
モデナ液にシステイン、グリシン及びＴＬＲ７リガンドを添加した培地を用い、豚の精子を２時間、３７℃、５％二酸化炭素、５％酸素条件下で２時間培養した。ＴＬＲ７リガンドとして、Ｒ－８４８を用いた。Ｒ－８４８の添加量は、０μＭ、０．３μＭとしてそれぞれ行った。

ブタ精子の培養における浮遊精子の割合を図７（Ａ）に示す。図７（Ａ）を見ると、ＴＬＲ７リガンドを添加して培養した場合、無添加区に比べて、上層の浮遊精子の割合が半減している。

上層の浮遊精子を回収し、ＤＮＡを抽出してｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により、Ｘ精子とＹ精子の割合を算出した。

浮遊精子のＸ精子、Ｙ精子の割合を図７（Ｂ）に示す。図７（Ｂ）を見ると、ＴＬＲ７リガンド添加区においては、９０％以上がＹ精子であった。この浮遊精子をヒロスワインＢ液で懸濁し、人工授精に用いた結果、７匹の産子中、６匹の雄産子が得られた。

以上の検証結果から、Ｙ染色体を有する精子を分離することができ、これを用いた人工授精や体外受精により、家畜等の哺乳動物に雄産子を産み分けさせることがわかった。

（過重力を負荷した分離の検証）
マウス精子について、過重力を負荷して分離を行い、その影響を検証した。

胚培養培地（ＨＴＦ）にアルブミン及びＴＬＲ７リガンドを添加した培地（５００μＬ）を用い、マウス精子を１時間、３７℃、５％二酸化炭素条件下で培養した。ＴＬＲ７リガンドとして、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ Ｒ－８４８（以下、Ｒ－８４８）を用いた。Ｒ－８４８の添加量は、０．３μＭである。

３０分後、遠心分離装置（製品名：卓上マイクロ冷却遠心機３５２０、久保田商事株式会社）を用い、３７℃で、３０分間遠心分離を行った。遠心分離は、５０×ｇ、１００×ｇ、５００×ｇの遠心力でそれぞれ行った。また、比較のため、遠心分離を行わない系（０×ｇ）についても行った。

遠心分離後、それぞれの培地の上層１５０μＬ（上層３０％）を分取して、上記と同様の手法によって、それぞれの培地中のＸ精子、Ｙ精子の割合を算出した。その結果を図８に示す。

また、それぞれの培地の下層１５０μＬ（下層３０％）を分取して、上記と同様の手法によって、それぞれの培地中のＸ精子、Ｙ精子の割合を算出した。その結果を図９に示す。

図８を見ると、培地の上層の精子群において、０×ｇ、５０×ｇにて、Ｙ精子の割合は８０％を越えており、５０×ｇでは約９０％に達している。一方、１００×ｇ以上では６０％程度であった。

また、図９を見ると、培地の下層の精子群においては、０×ｇ、５０×ｇにて、Ｘ精子の割合は６０％を越えており、５０×ｇでは９０％近くまで達している。一方、１００×ｇ以上ではＸ精子の割合は５０％を下回っている。

これらの結果から、０×ｇより大きく１００×ｇより小さい遠心力を負荷して分離すること、より好ましくは５０×ｇの遠心力を負荷して分離することで、Ｙ精子に富む精子群とＸ精子に富む精子群とを効果的に分離できることがわかった。

（体外受精）
上記の５０×ｇの遠心力を負荷して分離した上層の精子群（上層区）、下層の精子群（下層区）を体外受精に供試し、胚盤胞期胚を形成させた。そして、胚盤胞期胚のＸＸ染色体、ＸＹ染色体の割合を求めた。また、ＴＬＲ７リガンドを添加せずに、且つ、遠心分離を行わずに、上記と同じ培地にて、３７℃で６０分間培養した精子群（無添加区）を用い、同様に体外受精に供試して胚盤胞期胚を形成させ、ＸＸ染色体、ＸＹ染色体の割合を求めた。

その結果を表３に示す。なお、表３中、２－ｃｅｌｌの「個」は２４時間で卵割が確認された数、「％」は「（２－ｃｅｌｌの個数／卵子の個数）×１００」である。また、胚盤胞期胚の「個」は胚盤胞期胚が形成された個数、「％」は「（胚盤胞期胚の個数／２－ｃｅｌｌの個数）×１００」である。

２－ｃｅｌｌ、及び、胚盤胞期胚が発生する割合に関し、無添加区、上層区、下層区のいずれも同程度であり、有意差はない。すなわち、ＴＬＲ７リガンドを添加した培地で培養した精子について、遠心分離を行っても、精子の受精機能に何ら影響がないことがわかる。

そして、無添加区の胚盤胞期胚のＸＸ染色体、ＸＹ染色の割合は５０％程度であり、この胚盤胞期胚を体外受精等に供した場合、雄産子、雌産子がほぼ同じ割合で生まれることがわかる。

一方、上層区では、Ｙ染色体を保有している胚盤胞期胚の割合が９０％であり、この胚盤胞期胚を体外受精等に供した場合、９０％の割合で雄産子が生まれることがわかる。また、下層区では、Ｘ染色体のみを保有している胚盤胞期胚が８１％であり、この胚盤胞期胚を体外受精等に供した場合、８１％の割合で雌産子が生まれることがわかる。

以上のように、過荷重を負荷して精子を分離することにより、Ｘ染色体保有精子に富む精子群とＹ染色体保有精子に富む精子群とに精度よく分離することができ、これらの精子群を人工授精、体外受精に用いることで雄産子、雌産子を産み分けさせることが可能である。

本発明に係る哺乳動物精子の分離方法では、Ｙ染色体保有精子とＸ染色体保有精子とに分離することができるため、人工授精や体外受精において、雄産子、雌産子の産み分けが可能であり、家畜産業等に利用可能である。

Claims (8)

1. ＴＬＲ７リガンドとしてレシキモドを０．０３～０．３μＭ、又は、イミキモドを０．０３～３０μＭ含有する培地にて精子を培養し、
   前記培地の上層に浮遊する精子と下層に沈降する精子とに分離する、
   ことを特徴とする哺乳動物精子の分離方法。
2. 過重力を負荷して分離する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物精子の分離方法。
3. 遠心力により過重力を負荷する、
   ことを特徴とする請求項２に記載の哺乳動物精子の分離方法。
4. ０×ｇより大きく１００×ｇより小さい遠心力を負荷する、
   ことを特徴とする請求項３に記載の哺乳動物精子の分離方法。
5. 前記培地の上層３０％を分取してＹ染色体保有精子に富む精子群を得る、
   ことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか一項に記載の哺乳動物精子の分離方法。
6. 前記培地の下層３０％を分取してＸ染色体保有精子に富む精子群を得る、
   ことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか一項に記載の哺乳動物精子の分離方法。
7. 請求項１乃至６のいずれか一項に記載の哺乳動物精子の分離方法で分離した非ヒト哺乳動物の精子を用いて非ヒト哺乳動物の人工授精を行う、
   ことを特徴とする人工授精方法。
8. 請求項１乃至６のいずれか一項に記載の哺乳動物精子の分離方法で分離した非ヒト哺乳動物の精子を用いて非ヒト哺乳動物の体外受精を行う、
   ことを特徴とする体外受精方法。

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