BR122022012930B1 - Anticorpo anti-cgrp ou fragmento de anticorpo anti-cgrp, sequências de ácido nucleico, vetor, célula cultivada ou recombinante, composição farmacêutica e uso do referido anticorpo ou fragmento de anticorpo - Google Patents

Anticorpo anti-cgrp ou fragmento de anticorpo anti-cgrp, sequências de ácido nucleico, vetor, célula cultivada ou recombinante, composição farmacêutica e uso do referido anticorpo ou fragmento de anticorpo Download PDF

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Brian Robert Kovacevich
Leon F. Garcia-Martinez
Katie Olson
Benjamin H. Dutzar
Jens J. Billgren
John A. Latham
Danielle M. Mitchell
Patricia Dianne Mcneill
Nicole M. Janson
Maria-Cristina Loomis
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H. Lundbeck A/S
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Abstract

a presente invenção é dirigida a anticorpos e fragmentos dos mesmos tendo especificidade de ligação para cgrp. outra modalidade desta invenção se refere aos anticorpos descritos aqui e fragmentos de ligação dos mesmos, compreendendo as sequências de polipeptídeos vh, vl e cdr descritas aqui, e os polinucleotídeos que codificam as mesmas. a invenção também contempla conjugados de anticorpos anti-cgrp e fragmentos de ligação dos mesmos conjugados a uma ou mais frações funcionais ou detectáveis. a invenção também contempla métodos para preparar ditos anticorpos anti-cgrp e fragmentos de ligação dos mesmos. as modalidades da invenção também pertencem ao uso de anticorpos anti-cgrp e fragmentos de ligação dos mesmos, para o diagnóstico, a avaliação e o tratamento de doenças e distúrbios associados com cgrp.

Description

Dividido do BR 11 2013 029932 0, depositado em 21/05/2012
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido US 61/488.660 (Arquivo do Procurador N.° 67858.730300) depositado em 20 de maio de 2011, intitulado "ANTI-CGRP COMPOSITIONS AND USE THEREOF" aqui incorporada como referência em sua totalidade.
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida em formato ASCII através de EFS-Web e é aqui incorporada como referência em sua totalidade. Dita cópia de ASCII, criada em 18 de maio de 2012, é chamada 67858o730301.txt e possui 203.815 bytes de tamanho.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[003] Esta invenção refere-se aos anticorpos e fragmentos dos mesmos (incluindo os fragmentos Fab) contendo especificidade de ligação para o Peptídeo Relacionado ao Gene de Calcitonina humano (a seguir designado "CGRP"). A invenção também se refere aos métodos para triar para doenças e distúrbios associados com CGRP, e métodos para prevenir ou tratar doenças e distúrbios associados com CGRP através da administração dos ditos anticorpos ou fragmentos dos mesmos.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[004] O Peptídeo Relacionado ao Gene de Calcitonina (CGRP) é produzido como um neuropeptídeo multifuncional de 37 aminoácidos de comprimento. Duas formas de CGRP, as formas CGRP-alfa e CGRP-beta, existem em seres humanos e têm atividades semelhantes. CGRP-alfa e CGRP-beta se diferem por três aminoácidos nos seres humanos e são derivados de genes diferentes. A família CGRP de peptídeos inclui amilina, adrenomedulina e calcitonina, embora cada um tenha receptores e atividades biológicas distintos. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001).
[005] CGRP é liberado de inúmeros tecidos como os nervos trigêmeos, que quando ativados liberam neuropeptídeos dentro das meninges, mediando inflamação neurogênica que é caracterizada por vasodilatação, vazamento nos vasos e degradação de mastócitos. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Os efeitos biológicos do CGRP são mediados através do receptor de CGRP (CGRP-R), que consiste em um componente de sete transmembranas, em conjunto com a proteína de membrana associada ao receptor (RAMP). CGRP-R ainda necessita da atividade da proteína de componente de receptor (RCP), que é essencial para um acoplamento eficiente para adenilato ciclase através de proteínas G e a produção de cAMP. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001).
[006] Enxaquecas são distúrbios neurovasculares que afetam aproximadamente 10% da população adulta nos Estados Unidos e normalmente são acompanhadas de dores de cabeça intensas. Aproximadamente 20-30% dos portadores de enxaqueca experimentam a aura, compreendendo fenômenos neurológicos focais que precedem e/ou acompanham o evento. Acredita-se que CGRP desempenhe uma função proeminente no desenvolvimento da enxaqueca. Por exemplo, as concentrações plasmáticas de CGRP foram identificadas elevadas no sangue venoso jugular durante a fase de dor de cabeça da enxaqueca, com exclusão de outros neuropeptídeos. Além disso, de acordo com Arulmozhi et al, os seguintes foram identificados nos pacientes com enxaqueca: (1) uma forte correlação entre as concentrações plasmáticas de CGRP e enxaquecas; (2) a infusão de CGRP produziu uma dor de cabeça tipo a da enxaqueca; (3) níveis basais de CGRP foram elevados; e (4) alterações nos níveis plasmáticos de CGRP durante ataques de enxaqueca significativamente se correlacionaram com a intensidade da dor de cabeça. Arulmozhi, D.K., et al., Vas. Pharma., 43: 176-187 (2005).
[007] Um tratamento eficaz para enxaqueca é a administração de triptanos, que são uma família de fármacos baseadas em triptamina, incluindo sumatriptano e rizatriptano. Os membros desta família têm uma afinidade por múltiplos receptores de serotonina, incluindo 5-HT1B, 5-HT1D, e 5-HT1F. Os membros desta família de fármacos seletivamente constringem vasos cerebrais, mas também causam efeitos vasoconstritores nos vasos coronários. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Há um risco teórico de espasmo coronariano em pacientes com doença cardíaca estabelecida após a administração, e eventos cardíacos depois de tomar triptanos podem ocorrer raramente. São contraindicados para pacientes com doença vascular coronária.
[008] Da mesma forma, a dor muitas vezes pode ser resolvida através da administração de certos narcóticos ou fármacos anti-inflamatórias não esteroides (NSAIDs). No entanto, a administração destes tratamentos pode ocorrer à custa de certas consequências negativas. NSAIDs têm o potencial de causar insuficiência renal, sangramento intestinal e disfunção hepática. Os narcóticos têm o potencial de causar náuseas, vômitos, funcionamento mental prejudicado e vício. Portanto, é desejável identificar tratamentos alternativos para a dor a fim de evitar algumas dessas consequências negativas.
[009] Acredita-se que CGRP desempenha uma função em uma infinidade de doenças e distúrbios, incluindo, entre outros, enxaquecas, dores de cabeça e dor.
[0010] Por exemplo, CGRP declaradamente pode se correlacionar a ou até mesmo desempenhar um papel na bexiga super-reativa. Provas que CGRP pode se correlacionar à condição de bexiga super-reativa incluem o fato de que o CGRP está presente no trato urinário, DRG e medula espinhal - (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727) e também que as fibras C aferentes são essenciais para o transporte de impulsos envolvidos na micção da medula espinhal (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112):128). Além disso, foi relatado que a administração intravesical de Botox suprime CGRP e reduz significativamente o intervalo intercontração em ácido acético - modelo de dor da bexiga induzida (Chuang et al., 2004 J Urol (172):1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182):786).
[0011] Uma prova que CGRP pode desempenhar um papel causal nesta condição é um pedido de patente recentemente publicado contendo dados supostamente sugerindo que um Ab anti-CGRP revelado nele reduziu o número de contrações da bexiga em um modelo de bexiga super-reativa induzido por óleo de terebintina -(Pfizer WO 2011/024113)).
[0012] Devido ao envolvimento percebido de CGRP nestes e em outros distúrbios, ainda há uma necessidade na técnica de composições e métodos úteis para prevenir ou tratar doenças e distúrbios associados com CGRP, evitando efeitos colaterais adversos. Ainda há uma necessidade na técnica de composições ou métodos que reduzem ou inibem doenças ou distúrbios associados com CGRP, como enxaquecas, dores de cabeça, bexiga super-reativa e dor.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0013] A presente invenção está direcionada aos anticorpos específicos e fragmentos dos mesmos contendo especificidade de ligação para CGRP, em particular anticorpos contendo especificidade epitópica desejada, alta afinidade ou avidez e/ou propriedades funcionais. Outra modalidade da presente invenção refere-se aos anticorpos descritos aqui, compreendendo as sequências do VH e VL e CDR dos polipeptídeos descritos aqui, e os polinucleotídeos que os codificam. Uma modalidade preferencial da invenção é direcionada aos anticorpos quiméricos ou humanizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) capazes de se ligar ao CGRP e/ou inibir a atividade biológica mediada pela ligação do CGRP ao receptor de CGRP ("CGRP-R").
[0014] Em outra modalidade preferencial da invenção, anticorpos inteiros e fragmentos Fab dos mesmos são contemplados que inibem a produção de cAMP conduzida por CGRP-alfa, CGRP-beta e CGRP de rato. Em outra modalidade preferencial da invenção, os inteiros e os fragmentos Fab dos mesmos são contemplados que reduzem a vasodilatação em um destinatário após a administração.
[0015] Em outra modalidade da invenção, anticorpos quiméricos ou humanizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) capazes de se ligar ao CGRP são úteis em métodos direcionados para reduzir, tratar, ou prevenir enxaquecas (com ou sem aura), câncer ou tumores, angiogênese associada com câncer ou crescimento de tumor, angiogênese associada com câncer ou sobrevida de tumor, enxaquecas, perda de peso, dor, enxaqueca hemiplágica, cefaleia em salvas, neuralgia enxaquecosa, dores de cabeça crônicas, dores de cabeça de tensão, dores de cabeça gerais, rubores quentes, hemicrania paroxisomal crônica, cefaleias secundárias devido a um problema estrutural subjacente na cabeça ou pescoço, neuralgia cranial, cefaleias de sinos (como, por exemplo, associada com sinusite), cefaleias ou enxaquecas induzidas por alergia. Os anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente invenção particularmente têm utilidade no tratamento, prevenção, melhora, controle ou redução do risco de uma ou mais das seguintes condições ou doenças: bexiga super-reativa e outras condições urinárias incluindo infecção na bexiga, dor; dor crônica; inflamação neurogênica e dor inflamatória; dor neuropática; dor ocular; dor de dente; dor pós-cirúrgica, dor relacionada ao trauma, dor relacionada à queimadura, diabetes; diabetes mellitus não dependente de insulina e outros distúrbios autoimunes inflamatórios, distúrbios vasculares; inflamação; artrite; hiper-reatividade brônquica, asma; choque; sepse; síndrome de retirada de opiato; tolerância à morfina; rubores em homens e mulheres; dermatite alérgica; psoríase; encefalite; trauma cerebral; epilepsia; doenças neurodegenerativas; doenças de pele incluindo prurite, vermelhidão cutânea neurogênica, rosácea de pele e eritema; doença intestinal inflamatória, síndrome de intestino irritável, cistite; e dismenorreia e outras condições que potencialmente podem ser tratadas ou prevenidas ou os sintomas melhorados pelo antagonismo dos receptores de CGRP. De particular importância é o tratamento profilático ou agudo de dor de cabeça, incluindo enxaqueca e cefaleia em salvas, e outras condições relacionadas à dor, bem como bexiga super-reativa.
[0016] Em outra modalidade da invenção, anticorpos quiméricos ou humanizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) capazes de se ligar ao CGRP são preferencialmente úteis em métodos direcionados para reduzir, tratar ou prevenir o refluxo gastroesofágico e dor visceral associada ao refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino irritável, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenorreia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prostatite ou pancreatite.
[0017] Em outra modalidade da invenção, esses anticorpos e versões humanizadas podem ser derivados de células imunes do coelho (linfócitos B) e podem ser selecionados com base em sua homologia (identidade de sequência) para sequências de linhagem germinativa humana. Estes anticorpos podem necessitar mínima ou nenhuma modificação da sequência, facilitando assim a retenção das propriedades funcionais após a humanização. Outra modalidade da invenção é direcionada para fragmentos de anticorpos anti-CGRP incluindo polipeptídeos de VH, VL e CDR, por exemplo, derivados de células imunes de coelho e os polinucleotídeos codificando as mesmas, bem como o uso destes fragmentos de anticorpos e os polinucleotídeos codificando os mesmos na criação de novas composições de anticorpos e polipeptídeo capazes de se ligar aos complexos CGRP e/ou CGRP/CGRP-R.
[0018] A invenção também contempla conjugados de anticorpos anti-CGRP e fragmentos de ligação dos mesmos conjugados com uma ou mais frações funcionais ou detectáveis. A invenção também contempla métodos para preparar os ditos anticorpos complexos anti-CGRP ou anti-CGRP/CGRP-R quiméricos ou humanizados e fragmentos de ligação dos mesmos. Em uma modalidade, fragmentos de ligação incluem, entre outros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, SMIPs (imunofarmacêuticos de pequena molécula), camelcorpos, nanocorpos e IgNAR.
[0019] Modalidades da invenção referem-se ao uso de anticorpos anti- CGRP e fragmentos de ligação dos mesmos para o diagnóstico, avaliação e tratamento de doenças e distúrbios associados com CGRP ou expressão anormal dos mesmos. A invenção também contempla o uso de fragmentos de anticorpos anti-CGRP para o diagnóstico, avaliação e tratamento de doenças e distúrbios associados com CGRP ou expressão anormal dos mesmos. Outras modalidades da invenção referem-se à produção de anticorpos anti-CGRP ou fragmentos dos mesmos nas células hospedeiras recombinantes, por exemplo, células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, ou células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras.
BREVE DESCRIÇÃO DOS VÁRIOS PONTOS DE VISTA DOS DESENHOS
[0020] A figura 1 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab1 inteiro.
[0021] A figura 2 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab2 inteiro.
[0022] A figura 3 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab3 inteiro.
[0023] A figura 4 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab4 inteiro.
[0024] A figura 5 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab5 inteiro.
[0025] A figura 6 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab6 inteiro.
[0026] A figura 7 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab7 inteiro.
[0027] A figura 8 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab8 inteiro.
[0028] A figura 9 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab9 inteiro.
[0029] A figura 10 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab10 inteiro.
[0030] A figura 11 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab11 inteiro.
[0031] A figura 12 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab12 inteiro.
[0032] A figura 13 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab13 inteiro.
[0033] A figura 14 fornece sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo correspondentes ao Anticorpo Ab14 inteiro.
[0034] A figura 15 fornece os dados de ligação de ELISA de CGRP-alfa obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra para anticorpos Ab1, Ab2, Ab3 e Ab4.
[0035] A figura 16 fornece os dados de ligação de ELISA de CGRP-alfa obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra para anticorpos Ab5, Ab6, Ab7 e Ab8.
[0036] A figura 17 fornece os dados de ligação de ELISA de CGRP-alfa obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra para anticorpos Ab9, Ab10, e Ab14.
[0037] A figura 18 fornece os dados de ligação de ELISA de CGRP-alfa obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra para anticorpos Ab11, Ab12, e Ab13.
[0038] A figura 19 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-alfa por anticorpos Ab1, Ab2 e Ab4, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0039] A figura 20 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-alfa pelo anticorpo Ab3, obtido seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0040] A figura 21 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-alfa por anticorpos Ab5 e Ab6, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0041] A figura 22 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-alfa por anticorpos Ab7, Ab8, Ab9 e Ab10, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0042] A figura 23 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-alfa por anticorpos Ab11, Ab12 e Ab13, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0043] A figura 24 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-alfa pelo anticorpo Ab14, obtido seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0044] A figura 25 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-beta por anticorpos Ab1, Ab2, e Ab3, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0045] A figura 26 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-beta por anticorpos Ab4, Ab5, e Ab6, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0046] A figura 27 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-beta por anticorpos Ab7 e Ab8, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0047] A figura 28 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-beta por anticorpos Ab9, Ab10, e Ab14, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0048] A figura 29 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP-beta por anticorpos Ab11, Ab12, e Ab13, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0049] A figura 30 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP de rato por anticorpos Ab1, Ab2, Ab4 e Ab5, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0050] A figura 31 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP de rato por anticorpos Ab3 e Ab6, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0051] A figura 32 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP de rato por anticorpos Ab7, e Ab8, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0052] A figura 33 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP de rato pelo anticorpo Ab9, obtido seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0053] A figura 34 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP de rato pelo anticorpo Ab10, obtido seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0054] A figura 35 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP de rato por anticorpos Ab11, e Ab12, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0055] A figura 36 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP de rato pelo anticorpo Ab13, obtido seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0056] A figura 37 demonstra a inibição da produção de cAMP conduzida por CGRP de rato pelo anticorpo Ab14, obtido seguindo o protocolo no Exemplo 1 infra.
[0057] A figura 38 demonstra a inibição da ligação do CGRP radiomarcado para CGRP-R por anticorpos Ab1-Ab13, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 6 infra.
[0058] A figura 39 demonstra uma redução da vasodilatação obtida através da administração de anticorpos Ab3 e Ab6 após a administração de capsaicina em um modelo de rato, em relação a um anticorpo de controle, obtidos seguindo o protocolo no Exemplo 7 infra.
[0059] A figura 40 demonstra uma redução da vasodilatação obtida através da administração do anticorpo Ab6 em diferentes concentrações após a administração de capsaicina em um modelo de rato, em relação a um anticorpo de controle, obtido seguindo o protocolo no Exemplo 7 infra.
[0060] As figuras 41A-C mostra o efeito benéfico de Ab3 na capacidade da bexiga durante a infusão de solução salina. Os animais foram administrados com Ab3 ou um anticorpo de controle negativo e, em seguida, monitorados durante a infusão de solução salina para a bexiga. ICI (painel A) foi aumentado e MF (painel B) foi diminuído, indicando aumento da capacidade da bexiga. Diferenças em AM (painel C) estavam dentro do desvio padrão e estatisticamente significativas. Os asteriscos indicam melhora estatisticamente significativa (p < 0,05 teste t-Student não pareado, em comparação com Ab de controle Negativo). Legenda: barras cheias: tratado com Ab3 (10 mg/kg); barras abertas: anticorpo de controle negativo (10 mg/kg). As barras de erro indicam o desvio padrão. Abreviaturas: ICI : Intervalo de Intercontração; MF: Frequência de Micção; AM: Amplitude de Micção.
[0061] A figura 42 mostra o efeito Ab2 em um modelo de dor neuropática. Alodinia mecânica foi induzida pela cirurgia de Chung (ligadura de nervo espinhal L5/L6) e o grau de sensibilidade foi comparado entre animais tratados com Ab2 (barras picadas) e animais de controle (barras cheias). Valores mais altos indicam menos sensibilidade. A sensibilidade média foi semelhante no dia 13 (antes da administração de Ab2), mas melhorou nos dias 14 e 17. As barras de erro indicam o erro padrão da média.
[0062] A figura 43 mostra o efeito analgésico de Ab2 e morfina. A sensibilidade à dor foi avaliada pelo tempo de retirada de cauda (eixo y, segundos) para animais administrados com morfina (quadrados abertos), Ab2 (10 mg/kg, triângulos cheios), ou veículo (controle negativo, círculos abertos). Os animais desenvolveram tolerância à morfina e apresentaram tempos de retirada de cauda semelhantes aos animais de controle pelo dia 4. Em contraste, os animais tratados com Ab2 apresentaram uma melhoria sustentada no tempo de retirada de cauda ao longo do experimento (ao dia 7). A melhoria nos animais tratados com Ab2 foi estatisticamente significante (p < 0,05 ANOVA uma via seguida pelo teste de Dunnett, comparação com o veículo, indicado porasteriscos). As barras de erro indicam o erro padrão da média.
[0063] A figura 44 mostra o efeito analgésico dose-dependente de Ab2. No dia 0 (logo após o primeiro teste de tempo de retirada de cauda), os ratos foram administrados com anticorpos Ab2 na dose de 1 mg/kg (quadrados cheios), 3 mg/kg (triângulos cheios apontando para baixo) ou 10 mg/kg (triângulos cheios apontando para cima), ou um veículo (círculos abertos) ou anticorpo de controle negativo (quadrados abertos). O tempo de retirada de cauda dos ratos em resposta a um estímulo térmico doloroso foi avaliado diariamente (tempos superiores indicam insensibilidade relativa à dor). O tempo de retirada de cauda foi aumentado de forma dose-dependente pela administração de Ab2. Os asteriscos indicam aumentos estatisticamente significativos no tempo de retirada de cauda (p < 0,05 uma via ANOVA seguido pelo teste de Dunnett, comparação com veículo). As barras de erro indicam o erro padrão da média.
[0064] A figura 45 mostra o efeito analgésico do Ab2 em combinação com morfina, e quando a morfina é retirada após o aparecimento da tolerância à morfina. No dia 0 (logo após o primeiro teste de tempo de retirada cauda), os ratos foram administrados com anticorpo Ab2 com uma dosagem de 10 mg/kg (quadrados cheios e triângulos cheios) ou veículo (círculos abertos). Os ratos foram então administrados com morfina diariamente nos dias 1 a 10 (quadrados cheios) ou somente nos dias 1 a 4 (triângulos cheios). O tempo de retirada de cauda inicialmente foi grandemente aumentado nos camundongos tratados com morfina, mas diminuído nos dias subsequentes, indicando tolerância à morfina. No entanto, nos camundongos em que a morfina foi retirada após o dia 4, o tempo de retirada de cauda aumentou e manteve-se elevado entre os dias 5 e 8. As barras de erro indicam o erro padrão da média.
[0065] A figura 46 mostra o efeito de Ab2 em um modelo de rato de dor visceral. A dor visceral foi quantificada através da medição do limite de distensão colônica (valores mais altos indicam menos sensibilidade) para animais naive (barra aberta) ou animais tratados com TNBS para provocar hipersensibilidade colônica crônica que recebeu um anticorpo de controle negativo (barras cheias) ou Ab2 (barras picadas). A hipersensibilidade foi aliviada por 27% pelos animais tratados com Ab2, e o limite de distensão foi significativamente melhorado pela administração de Ab2 (p < 0,05 teste t-Student, comparação com TNBS + grupo controle Negativo). As barras de erro indicam o erro padrão da média.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS DEFINIÇÕES
[0066] Deve ser entendido que esta invenção não é limitada para a metodologia, protocolos, linhagens celulares, espécies ou gêneros animais e reagentes particulares descritos, como tal, podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas, e não pretende limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. Conforme usado aqui, as formas do singular "um" "uma", e "a" e "o" incluem os plurais referentes, salvo se o contexto claramente ditar de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade dessas células e a referência à "proteína" inclui a referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas conhecidas pelos especialistas na técnica e assim por diante. Todos os termos científicos e técnicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um especialista na técnica a que pertence esta invenção, salvo de indicado claramente de outra forma.
[0067] Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP): Conforme usado aqui, CGRP inclui não apenas as seguintes sequências de aminoácidos de Homo sapiens CGRP-alfa e Homo sapiens CGRP-beta disponíveis a partir de American Peptides (Sunnyvale CA) e Bachem (Torrance, CA): CGRP-alfa: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 281), em que a fenilalanina N-terminal é amidada; CGRP-beta: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 282), em que a fenilalanina N-terminal é amidada; mas também quaisquer formas ligadas à membrana destas sequências de aminoácidos CGRP, bem como mutantes (mutiens), variantes de junção, isoformas, ortólogos, homólogos e variantes desta sequência.
[0068] Espécies de leveduras competentes para reprodução: Na presente invenção, este se destina a incluir amplamente qualquer levedura diploide ou tetraploide que pode ser crescida em cultura. Essa espécie de levedura pode existir em uma forma haploide, diploide, poliploide ou outra. As células de uma determinada ploidia podem, sob condições apropriadas, proliferar para um número indefinido de gerações nessa forma. Células diploides também podem esporular para formar células haploides. A reprodução sequencial pode resultar em cepas tetraploides através de outras reproduções ou fusões de cepas diploides. A presente invenção contempla o uso de leveduras haploides, bem como células diploides ou outras leveduras poliploides produzidas, por exemplo, pela reprodução ou fusão de esferoplasto.
[0069] Em uma modalidade da invenção, a levedura competente para reprodução é um membro da família Saccharomycetaceae, que inclui os gêneros Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; e Zygosaccharomyces. Outros tipos de leveduras potencialmente úteis na invenção incluem Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium e Filobasidella.
[0070] Em uma modalidade preferencial da invenção, a levedura competente para reprodução é um membro do gênero Pichia. Em outra modalidade preferencial da invenção, a levedura competente para reprodução do gênero Pichia é uma das seguintes espécies: Pichia pastoris, Pichia methanolica, e Hansenula polymorpha (Pichia angusta). Em modalidade particularmente preferencial da invenção, a levedura competente para reprodução do gênero Pichia é a espécie de Pichia pastoris.
[0071] Célula de Levedura Haploide: Uma célula contendo uma única cópia de cada gene de seu complemento genômico normal (cromossômico).
[0072] Célula de Levedura Poliploide: Uma célula contendo mais de uma cópia do seu complemento genômico normal (cromossômico).
[0073] Célula de Levedura Diploide: Uma célula contendo duas cópias (alelos) de essencialmente cada gene de seu complemento genômico normal, normalmente formada pelo processo de fusão (reprodução) de duas células haploides.
[0074] Célula de Levedura Tetraploide: Uma célula contendo quatro cópias (alelos) de essencialmente cada gene de seu complemento genômico normal, normalmente formada pelo processo de fusão (reprodução) de duas células haploides. Tetraploides podem possuir dois, três, quatro ou mais cassetes de expressão diferentes. Esses tetraploides podem ser obtidos em S. cerevisiae pela reprodução seletiva de diploides a/a e alfa/alfa heterotálicos homozigotos e em Pichia pela reprodução sequencial de haploides para obter diploides auxotróficos. Por exemplo, um haploide [met his] pode ser reproduzido com haploide [ade his] para obter diploide [his]; e um haploide [met arg] pode ser reproduzido com haploide [ade arg] para obter diploide [arg]; Então o diploide [his] x diploide [arg] para obter um tetraploide prototrófico. Deve ser compreendido pelos especialistas na técnica que referências aos benefícios e usos de células diploides podem igualmente se aplicar às células tetraploides.
[0075] Reprodução de Levedura: O processo pelo qual duas células de levedura haploides se fundem naturalmente para formar uma célula de levedura diploide.
[0076] Meiose: O processo pelo qual uma célula de levedura diploide sofre divisão redutora para formar quatro produtos de esporos haploides. Cada esporo pode então germinar e formar uma linhagem celular de crescimento vegetativo haploide.
[0077] Marcador Selecionável: Um marcador selecionável é um gene ou fragmento de gene que confere um fenótipo de crescimento (característica de crescimento físico) em uma célula que recebe esse gene, como, por exemplo, através de um evento de transformação. O marcador selecionável permite que a célula sobreviva e cresça em um meio de crescimento seletivo nas condições em que as células que não recebem esse gene marcador selecionável não podem crescer. Genes marcadores selecionáveis geralmente caem em vários tipos, incluindo genes marcadores selecionáveis positivos como um gene que confere uma resistência da célula a um antibiótico ou outra fármaco, temperatura quando dois mutantes sensíveis à temperatura ("ts") são cruzados ou um mutante ts é transformado; genes marcadores selecionáveis negativos como um gene biossintético que confere a uma célula, a capacidade de crescer em um meio sem um nutriente específico necessário por todas as células que não possuem esse gene biossintético, ou um gene biossintético mutado que confere a uma célula a incapacidade de crescer por células que não têm o gene de tipo selvagem; e semelhantes. Marcadores apropriados incluem, entre outros: ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; e semelhantes.
[0078] Vetor de Expressão: Esses vetores de DNA contêm elementos que facilitam a manipulação para a expressão de uma proteína estrangeira dentro da célula hospedeira alvo. Convenientemente, a manipulação de sequências e produção de DNA para a transformação são realizadas primeiramente em um hospedeiro bacteriano, por exemplo, E. coli, e vetores gerais incluirão as sequências para facilitar essas manipulações, incluindo uma origem de replicação bacteriana e marcador de seleção bacteriana apropriado. Marcadores de seleção codificam proteínas necessárias para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas crescidas em meio de cultura seletivo. Células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene de seleção não vão sobreviver no meio de cultura. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir do meio complexo. Vetores e métodos exemplares para a transformação de levedura são descritos, por exemplo, em Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[0079] Vetores de expressão para uso nos métodos da invenção ainda irão incluir sequências específicas de levedura, incluindo um marcador selecionável auxotrófico ou de fármaco para identificar cepas de leveduras transformadas. Um marcador de fármaco ainda pode ser usado para amplificar o número de cópia do vetor em uma célula hospedeira de levedura.
[0080] O polipeptídeo que codifica a sequência de interesse está operacionalmente ligado às sequências reguladoras transcricionais e traducionais que fornecem expressão do polipeptídeo em células de levedura. Esses componentes do vetor podem incluir, entre outros, uma ou mais das seguintes opções: um elemento potencializador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. Sequências para a secreção do polipeptídeo também podem ser incluídas, por exemplo, uma sequência de sinal e semelhantes. Uma origem de replicação de levedura é opcional, uma vez que os vetores de expressão são frequentemente integrados no genoma da levedura. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo de interesse está operacionalmente ligado, ou fundido, às sequências que fornecem secreção otimizada do polipeptídeo de células diploides de levedura.
[0081] Ácidos nucleicos são "operacionalmente ligados" quando são colocados em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma sequencia de sinal está operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se esse é expresso como uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou potencializador está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se essa afeta a transcrição da sequência. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa que a sequência de DNA sendo ligada é contígua e, no caso de um líder secretor, contíguo e no quadro de leitura. No entanto, os potencializadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada pela ligação em sítios de restrição convenientes ou, alternativamente, através de um método de PCR/recombinação familiar para os especialistas na técnica (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Se esses sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados em conformidade com a prática convencional.
[0082] Os promotores são sequências não traduzidas localizadas a montante (5') do códon de início de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 bp) que controla a transcrição e tradução de sequências de ácidos nucleicos particulares aos quais estão operacionalmente ligados. Esses promotores enquadram-se em várias classes: promotores induzíveis, constitutivos e repressíveis (que aumentam os níveis de transcrição em resposta à ausência de um repressor). Promotores induzíveis podem iniciar o aumento dos níveis de transcrição de DNA sob seus controles em resposta a algumas alterações nas condições de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou a mudança de temperatura.
[0083] O fragmento de promotor de levedura também pode servir como o sítio para recombinação homóloga e integração do vetor de expressão no mesmo sítio no genoma da levedura; alternativamente, um marcador selecionável é usado como sítio para recombinação homóloga. A Transformação de Pichia é descrita em Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.
[0084] Exemplos de promotores apropriados de Pichia incluem o AOX1 e promotor (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); promotor ICL1 (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13):1097-108); promotor gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); e promotor FLD1 (Shen et al. (1998) Gene 216(1):93-102). O promotor GAP é um promotor constitutivo forte o e os promotores AOX e FLD1 são induzíveis.
[0085] Outros promotores de levedura incluem ADH1, álcool desidrogenase II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk e promotores quiméricos derivados desses. Além disso, promotores não levedura podem ser usados na invenção como promotores de mamífero, inseto, planta, réptil, anfíbio, vírus e de ave. Mais normalmente o promotor compreenderá um promotor de mamífero (potencialmente endógeno para os genes expressos) ou compreenderá um promotor de levedura ou viral que fornece transcrição eficiente em sistemas de levedura.
[0086] Os polipeptídeos de interesse podem ser produzidos de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, por exemplo, uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo contendo um local de clivagem específico no N-terminal da proteína ou polipeptídeo maduro. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte da sequência codificadora do polipeptídeo que é inserida no vetor. A sequência de sinal heteróloga selecionada preferencialmente é aquela que é reconhecida e processada através de uma das vias padrão disponíveis dentro da célula do hospedeiro. O sinal de pré-pro do fator de S. cerevisiae alfa provou ser eficaz na secreção de uma variedade de proteínas recombinantes de P. pastoris. Outras sequências de sinal de levedura incluem a sequência de sinal de fator de reprodução alfa, a sequência de sinal de invertase, e sequências de sinal derivadas de outros polipeptídeos de levedura secretados. Além disso, essas sequências de peptídeo sinal podem ser projetadas para fornecer secreção potencializada em sistemas de expressão de levedura diploide. Outros sinais de secreção de interesse também incluem sequências de sinal de mamífero, que podem ser heterólogas à proteína sendo secretada, ou pode ser uma sequência nativa para a proteína sendo secretada. Sequências de sinal incluem sequências pré-peptídicas, e, em alguns casos, podem incluir sequências de pró-peptídeo. Muitas dessas sequências de sinal são conhecidas na técnica, por exemplo, incluindo as sequências de sinal encontradas nas cadeias de imunoglobulina, sequência preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, sequências de sinal de albumina de soro humano, cadeia pesada de Ig humana, cadeia leve de Ig humana e semelhantes. Por exemplo, ver Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); e Kobayashi et. al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).
[0087] A transcrição pode ser aumentada inserindo uma sequência de ativador transcricional no vetor. Estes ativadores são elementos de ação cis de DNA, geralmente de cerca de 10 a 300 bp, que atuam sobre um promotor para aumentar a sua transcrição. Potencializadores transcricionais são relativamente independentes de orientação e posição, sendo encontrado 5' e 3' para a unidade de transcrição, dentro de um íntron, bem como dentro da própria sequência codificadora. O potencializador pode ser recombinado para o vetor de expressão em uma posição 5' ou 3' para a sequência codificadora, mas é preferencialmente localizado em um sítio 5' do promotor.
[0088] Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucariontes também podem conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Essas sequências são comumente disponíveis em 3' para o códon de terminação de tradução, em regiões não traduzidas de DNAs ou cDNAs virais ou eucarióticos. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNA.
[0089] A construção de vetores apropriados contendo um ou mais dos componentes listados acima emprega técnicas de ligação padrão ou métodos de PCR/recombinação. Plasmídeos isolados ou fragmentos de DNA são clivados, adaptados e religados na forma desejada para gerar os plasmídeos necessários ou através de métodos de recombinação. Para a análise confirmar as sequências corretas nos plasmídeos construídos, as misturas de ligação são usadas para transformar as células hospedeiras e transformantes bem sucedidos selecionados por resistência aos antibióticos (por exemplo, ampicilina ou Zeocin), se apropriado. Os plasmídeos dos transformantes são preparados, analisados por digestão com endonuclease de restrição e/ou sequenciados.
[0090] Como alternativa à restrição e ligação dos fragmentos, métodos recombinantes baseados em sítios att e enzimas recombinantes podem ser usados para inserir sequências de DNA em um vetor. Esses métodos são descritos, por exemplo, por Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949; e são conhecidos pelos especialistas na técnica. Esses métodos utilizam recombinação de DNA intermolecular que é mediada por uma mistura de proteínas de recombinação codificadas por lambda e E. coli. A recombinação ocorre entre sítios de ligação específicos (att) sobre as moléculas de DNA de interação. Para uma descrição dos sítios att, ver Weisberg e Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed.(Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250. Os segmentos de DNA flanqueando os sítios de recombinação são trocados, de forma que após a recombinação os sítios att são sequências híbridas compostas por sequências doadas por cada vetor parental. A recombinação pode ocorrer entre DNAs de qualquer topologia.
[0091] Sítios att podem ser introduzidos em uma sequência de interesse através da ligação da sequência de interesse em um vetor apropriado; gerando um produto PCR contendo sítios att B através do uso de iniciadores específicos; geração de uma biblioteca de cDNA clonada em um vetor apropriado contendo sítios att; e semelhantes.
[0092] Enovelamento, conforme usado aqui, refere-se à estrutura tridimensional de polipeptídeos e proteínas, onde interações entre resíduos de aminoácidos agem para estabilizar a estrutura. Enquanto interações não covalentes são importantes para determinar a estrutura, geralmente as proteínas de interesse terão ligações dissulfeto covalentes intramolecular e intermolecular formadas por dois resíduos de cisteína. Para proteínas e polipeptídeos de ocorrência natural ou derivados e variantes dos mesmos, o enovelamento apropriado é normalmente o arranjo que resulta na atividade biológica ideal e convenientemente pode ser monitorado por ensaios para a atividade, por exemplo, ligação de ligantes, atividade enzimática, etc.
[0093] Em alguns casos, por exemplo, onde o produto desejado é de origem sintética, ensaios com base na atividade biológica serão menos significativos. O enovelamento apropriado dessas moléculas pode ser determinado com base nas propriedades físicas, considerações energéticas, estudos de modelagem e semelhantes.
[0094] O vetor de expressão pode ser ainda modificado pela introdução de sequências que codificam uma ou mais enzimas que melhoram o enovelamento e formação de ligação dissulfeto, ou seja, foldases, chaperoninas, etc. Essas sequências podem ser expressas de forma constitutiva ou induzível na célula hospedeira de levedura, usando vetores, marcadores, etc., conforme conhecido na técnica. Preferencialmente, as sequências, incluindo elementos reguladores transcricionais suficientes para o padrão desejado de expressão, são integradas de forma estável no genoma da levedura através de uma metodologia específica.
[0095] Por exemplo, o PDI eucariótico não é apenas um catalisador eficiente da oxidação da proteína cisteína e isomerização da ligação dissulfeto, mas também apresenta atividade de chaperona. A coexpressão de PDI pode facilitar a produção de proteínas ativas contendo várias ligações dissulfeto. Também é de interesse a expressão do BIP (proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina); ciclofilina; e semelhantes. Em uma modalidade da invenção, cada uma das cepas parentais haploides expressa uma enzima de enovelamento diferente, por exemplo, uma cepa pode expressar BIP e a outra cepa pode expressar PDI ou combinações dos mesmos.
[0096] Os termos "proteína desejada" ou "anticorpo desejado" são usados de modo intercambiável e se referem geralmente a um anticorpo parental específico para um alvo, ou seja, CGRP ou um anticorpo quimérico ou humanizado ou uma parte de ligação dos mesmos derivados desses conforme descrito aqui. O termo "anticorpo" destina-se a incluir qualquer estrutura molecular contendo cadeia de polipeptídeo com uma forma específica que se encaixa e reconhece um epitopo, onde uma ou mais interações de ligação não covalentes estabilizam o complexo entre a estrutura molecular e o epitopo. A molécula do anticorpo arquetípica é a imunoglobulina e todos os tipos de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc, de todas as fontes, por exemplo, de humano, roedor, coelho, vaca, ovelha, porco, cachorro, outros mamíferos, galinhas, outras aves, etc., são considerados como "anticorpos". Uma fonte preferencial para a produção de anticorpos úteis como matéria-prima de acordo com a invenção são os coelhos. Várias sequências codificadoras de anticorpo são descritas; e outras podem ser levantadas por métodos bem conhecidos na técnica. Exemplos dos mesmos incluem anticorpos quiméricos, anticorpos humanos e outros anticorpos de mamíferos não humanos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única (como scFvs), camelbodies, nanobodies, IgNAR (anticorpos de cadeia única derivados de tubarões), imunofarmacêuticos de pequena molécula (SMIPs) e fragmentos de anticorpos como Fabs, Fab', F(ab')2 e semelhantes. Ver Streltsov VA, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci. 2005 Nov;14(11):2901-9. Epub 2005 Sep 30; Greenberg AS, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar 9;374(6518):168- 73; Nuttall SD, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 Aug;38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446-8; Gill DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 Dec; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct 19.
[0097] Por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem ser produzidos por engenharia genética. Nesta técnica, como acontece com outros métodos, as células produtoras de anticorpos são sensibilizadas para o antígeno ou imunógeno desejado. O RNA mensageiro isolado de células produtoras de anticorpos é usado como um modelo para preparar o cDNA usando amplificação por PCR. Uma biblioteca de vetores, cada um contendo um gene de cadeia pesada e um gene de cadeia leve mantendo a especificidade do antígeno inicial, é produzida pela inserção de seções apropriadas do cDNA de imunoglobulina amplificadas nos vetores de expressão. Uma biblioteca combinatória é construída através da combinação da biblioteca de gene de cadeia pesada com a biblioteca de gene de cadeia leve. Isso resulta em uma biblioteca de clones que coexpressa uma cadeia leve e pesada (assemelhando- se ao fragmento Fab ou fragmento de ligação ao antígeno de uma molécula de anticorpo). Os vetores que transportam estes genes são cotransfectados em uma célula hospedeira. Quando a síntese do gene do anticorpo é induzida no hospedeiro transfectado, as proteínas de cadeia pesada e leve se automontam para produzir anticorpos ativos que podem ser detectados pela triagem com o antígeno ou imunógeno.
[0098] Sequências codificadoras de anticorpo de interesse incluem aquelas codificadas por sequências nativas, bem como os ácidos nucleicos que, em virtude da degeneração do código genético, não são idênticos em sequência aos ácidos nucleicos revelados e variantes dos mesmos. Polipeptídeos variantes podem incluir substituições de aminoácidos (aa), adições ou deleções. As substituições de aminoácidos podem ser substituições de aminoácidos conservadas ou substituições para eliminar aminoácidos não essenciais, como para alterar um sítio de glicosilação, ou para minimizar o erro no enovelamento pela substituição ou deleção de um ou mais resíduos de cisteína que não são necessários para função. Variantes podem ser projetadas para reter ou possuir atividade biológica potencializada de uma região particular da proteína (por exemplo, um domínio funcional, resíduos de aminoácidos catalíticos, etc). Variantes também incluem fragmentos dos polipeptídeos revelados aqui, fragmentos particularmente biologicamente ativos e/ou fragmentos correspondentes aos domínios funcionais. Técnicas para mutagênese in vitro de genes clonados são conhecidas. Também estão incluídos na presente invenção os polipeptídeos que foram modificados usando técnicas de biológicas moleculares comuns a fim de melhorar sua resistência à degradação proteolítica ou para otimizar as propriedades de solubilidade ou torná-los mais apropriados como um agente terapêutico.
[0099] Anticorpos quiméricos podem ser preparados por meios recombinantes, combinando as regiões de cadeia leve e pesada (VL e VH) obtidas de células que produzem anticorpo de uma espécie com as regiões de cadeia leve e pesada constante de outra. Anticorpos quiméricos típicos utilizam regiões variáveis de roedor ou coelho e região constante humana, a fim de produzir um anticorpo com domínios predominantemente humanos. A produção desses anticorpos quiméricos é bem conhecida na técnica e pode ser alcançada por meios padrão (conforme descrito, por exemplo, na Patente US 5.624.659, incorporada aqui como referência em sua totalidade). Ainda é contemplado que as regiões constantes humanas de anticorpos quiméricos da invenção podem ser selecionadas das regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
[00100] Anticorpos humanizados são projetados para conter ainda mais domínios de imunoglobulina do tipo humano, e incorpora apenas as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo derivado de animal. Isso é realizado examinando cuidadosamente a sequência das alças hipervariáveis das regiões variáveis do anticorpo monoclonal, e a adaptando para a estrutura das cadeias de anticorpo humano. Embora aparentemente complexo, o processo é simples na prática. Ver, por exemplo, Patente US 6.187.287, totalmente incorporado aqui como referência.
[00101] Além de imunoglobulinas inteiras (ou suas homólogas recombinantes), fragmentos de imunoglobulina compreendendo o sítio de ligação ao epitopo (por exemplo, Fab', F(ab')2, ou outros fragmentos) podem ser sintetizados. "Fragmento", ou imunoglobulinas mínimas podem ser projetados utilizando técnicas de imunoglobulina recombinantes. Por exemplo, imunoglobulinas "Fv" para uso na presente invenção podem ser produzidas sintetizando uma região de cadeia leve variável e uma região de cadeia pesada variável. Combinações de anticorpos são também de interesse, por exemplo, diabodies, que compreendem duas especificidades Fv distintas. Em outra modalidade da invenção, SMIPs (imunofarmacêuticos de pequena molécula), camelbodies, nanobodies e IgNAR são inclusos por fragmentos de imunoglobulinas.
[00102] Imunoglobulinas e fragmentos das mesmas podem ser modificados de forma pós-traducional, por exemplo, para adicionar frações efetoras como ligantes químicos, frações detectáveis, como corantes fluorescentes, enzimas, toxinas, substratos, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, frações quimioluminescente e semelhantes ou frações de ligação específicas, como estreptavidina, avidina, ou biotina e semelhantes podem ser utilizadas nos métodos e composições da presente invenção. Exemplos de moléculas efetoras adicionais são fornecidos infra.
[00103] Uma sequência polinucleotídica "corresponde" a uma sequência de polipeptídeo se a tradução da sequência polinucleotídica em conformidade com o código genético produzir a sequência polipeptídica (ou seja, a sequência de polipeptídeo "codifica" a sequência do polipeptídeo), uma sequência de polinucleotídeo "corresponde" a outra sequência de polipeptídeo se duas sequências codificam a mesma sequência de polipeptídeo.
[00104] Uma região ou domínio "heterólogo" de uma construção de DNA é um segmento identificável de DNA dentro de uma molécula de DNA maior que não é encontrado em associação com a molécula maior na natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene de mamífero, o gene geralmente será flanqueado por DNA que não flanqueia o DNA genômico dos mamíferos no genoma do organismo de origem. Outro exemplo de uma região heteróloga é uma construção onde a própria sequência codificadora não é encontrada na natureza (por exemplo, um cDNA onde a sequência codificadora genômica contém íntrons, ou sequências sintéticas contendo códons diferentes do gene nativo). A variação alélica ou eventos mutacionais de ocorrência natural não dão origem a uma região heteróloga do DNA conforme definido aqui.
[00105] Uma "sequência codificadora" é uma sequência in-frame de códons que (tendo em conta o código genético) corresponde a ou codifica uma proteína sequência de peptídeo. Duas sequências codificadoras se correspondem se as sequências ou suas sequências complementares codificam as mesmas sequências de aminoácidos. Uma sequência codificadora em associação com sequências reguladoras apropriadas pode ser transcrita e traduzida em um polipeptídeo. Uma sequência de sinal de poliadenilação e de terminação de transcrição geralmente será localizada 3' à sequência codificadora. Uma "sequência promotora" é uma região reguladora de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase em uma célula e iniciar a transcrição de uma sequência codificadora a jusante (direção 3'). Sequências promotoras normalmente contêm sítios adicionais para ligação de moléculas reguladoras (por exemplo, fatores de transcrição) que afetam a transcrição da sequência codificadora. A sequência codificadora está "sob controle" da sequência promotora ou "operacionalmente ligada" ao promotor quando a RNA polimerase se liga à sequência promotora em uma célula e transcreve a sequência codificadora em mRNA, que por sua vez traduziu na proteína codificada pela sequência codificadora.
[00106] Vetores são usados para introduzir uma substância estranha, como DNA, RNA ou proteína, em uma célula do organismo ou hospedeiro. Vetores típicos incluem vírus recombinantes (para polinucleotídeos) e lipossomas (para polipeptídeos). Um "vetor de DNA" pode ser um replicon, como plasmídeo, fago ou cosmídeo em que outro segmento de polinucleotídeo pode ser ligado de modo a realizar a replicação do segmento ligado. Um "vetor de expressão" é um vetor de DNA que contém sequências reguladoras que irão direcionar a síntese de polipeptídeos por uma célula hospedeira apropriada. Isso geralmente significa um promotor para se ligar à RNA polimerase e iniciar a transcrição do mRNA, bem como sítios de ligação do ribossomo e sinais de iniciação para direcionar a tradução do mRNA em um polipeptídeo. A incorporação de uma sequência de polinucleotídeo em um vetor de expressão no sítio apropriado e no quadro de leitura correto, seguida pela transformação de uma célula hospedeira apropriada pelo vetor, permite a produção de um polipeptídeo codificado pela dita sequência de polinucleotídeo.
[00107] "Amplificação" de sequências de polinucleotídeos é a produção in vitro de várias cópias de uma sequência de ácidos nucleico particular. A sequência amplificada é geralmente sob a forma de DNA. Uma variedade de técnicas para a realização dessa amplificação é descrita em um artigo de revisão por Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291-294). Reação em cadeia da polimerase, ou PCR é um protótipo de amplificação de ácido nucleico, e o uso de PCR aqui deve ser considerado exemplar de outras técnicas de amplificação apropriadas.
[00108] A estrutura geral de anticorpos em vertebrados agora é bem entendida (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Os anticorpos consistem em duas cadeias de polipeptídeo leves idênticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 daltons (a "cadeia leve") e duas cadeias pesadas idênticas de peso molecular 53.000-70.000 (a "cadeia pesada"). As quatro cadeias são unidas por pontes dissulfeto em uma configuração de "Y", em que as cadeias leves suportam as cadeias pesadas que começam na boca da configuração "Y". A parte de "braço" da configuração "Y" é designada região Fab; a parte do tronco da configuração "Y" é designada a região FC. A orientação da sequência de aminoácido segue da extremidade N-terminal na parte superior da configuração "Y" à extremidade C-terminal na parte inferior de cada cadeia. A extremidade N-terminal possui a região variável contendo especificidade para o antígeno que a suscitou, e possui aproximadamente 100 aminoácidos de comprimento, possuindo pequenas variações entre cadeia leve e pesada e de anticorpo para anticorpo.
[00109] A região variável é ligada em cada cadeia para uma região constante que estende o comprimento restante da cadeia e que dentro de uma determinada classe de anticorpo não varia com a especificidade do anticorpo (ou seja, o antígeno que o suscita). Existem cinco classes principais conhecidas das regiões constantes que determinam a classe da molécula de imunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE correspondendo às regiões constantes de cadeia pesada Y, μ, α, δ e ε (gamma mu, alfa, delta e epsilon)). A classe ou região constante determina a função efetora subsequente do anticorpo, incluindo a ativação do complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), e outras respostas celulares (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983); enquanto a região variável determina o antígeno com o qual o mesmo irá reagir. As cadeias leves são classificadas como K (kappa) ou À (lambda). Cada classe de cadeia pesada pode ser preparada com uma cadeia leve kappa ou lambda. As cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas umas às outras, e as partes de "cauda" das duas cadeias pesadas são ligadas entre si por ligações de dissulfeto covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas ou por células B.
[00110] A expressão "região variável" ou o "VR" refere-se aos domínios dentro de cada par de cadeias leves e pesadas em um anticorpo que estão envolvidos diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) em uma extremidade e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada.
[00111] As expressões "região determinante de complementaridade," "região hipervariável", ou "CDR" referem-se a uma ou mais das regiões hipervariáveis ou determinantes de complementariedade (CDRs) encontradas nas regiões variáveis de cadeias leves ou pesadas de um anticorpo (Ver Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Essas expressões incluem as regiões hipervariáveis conforme definido por Kabat et al. . ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983) ou as alças hipervariáveis em estruturas tridimensionais de anticorpos (Chothia e Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). Os CDRs em cada cadeia são mantidos juntos em estreita proximidade pelas regiões estruturais, e com os CDRs da outra cadeia, contribuindo para a formação do sítio de ligação ao antígeno. Dentro dos CDRs existem aminoácidos selecionados que foram descritos como as regiões determinantes de seletividade que representam os resíduos de contato crítico usados pelo CDR na interação anticorpo-antígeno (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
[00112] As expressões "região estrutural" ou "FR" referem-se a uma ou mais das regiões estruturais dentro das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de um anticorpo (Ver Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Essas expressões incluem aquelas regiões de sequência de aminoácido interpostas entre os CDRs dentro das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de um anticorpo.
Anticorpos Anti-CGRP e Fragmentos de Ligação dos Mesmos Contendo Atividade de Ligação para CGRP Anticorpo Ab1
[00113] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGV SSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 1).
[00114] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGV SSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2).
[00115] A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNTYYAS WAKGRFTISRASSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3).
[00116] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNTYYAS WAKGRFTISRASSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
[00117] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; e SEQ ID NO: 7 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; e SEQ ID NO: 10 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00118] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
[00119] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; e SEQ ID NO: 7 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2.
[00120] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; e SEQ ID NO: 10 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4.
[00121] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; e SEQ ID NO: 7) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; e SEQ ID NO: 10) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3.
[00122] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico é Ab1, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00123] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab1, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 3 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00124] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab1. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab1 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab2
[00125] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:11).
[00126] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 12).
[00127] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTY YASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13).
[00128] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTY YASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).
[00129] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; e SEQ ID NO: 17 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; e SEQ ID NO: 20 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00130] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.
[00131] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; e SEQ ID NO: 17 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12.
[00132] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; e SEQ ID NO: 20 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14.
[00133] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; e SEQ ID NO: 17) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; e SEQ ID NO: 20) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13.
[00134] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado é Ab2, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00135] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab2, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 11 e/ou SEQ ID NO: 13 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00136] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab2. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab2 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab3
[00137] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 21).
[00138] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 22).
[00139] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTY YASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23).
[00140] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTY YASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24).
[00141] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; e SEQ ID NO: 27 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; e SEQ ID NO: 30 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00142] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24.
[00143] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; e SEQ ID NO: 27 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22.
[00144] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; e SEQ ID NO: 30 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24.
[00145] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; e SEQ ID NO: 27) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; e SEQ ID NO: 30) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23.
[00146] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico é Ab3, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00147] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab3, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 21 e/ou SEQ ID NO: 23 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00148] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab3. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab3 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab4
[00149] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGV PSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 31).
[00150] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGV PSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 32).
[00151] A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYAS WAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33).
[00152] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYAS WAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34).
[00153] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; e SEQ ID NO: 37 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; e SEQ ID NO: 40 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00154] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34.
[00155] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; e SEQ ID NO: 37 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32.
[00156] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; e SEQ ID NO: 40 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34.
[00157] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; e SEQ ID NO: 37) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; e SEQ ID NO: 40) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33.
[00158] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado é Ab4, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00159] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab4, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 31 e/ou SEQ ID NO: 33 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00160] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab4. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab4 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab5
[00161] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 41).
[00162] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 42).
[00163] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATY YASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 43).
[00164] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATY YASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44).
[00165] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; e SEQ ID NO: 47 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; e SEQ ID NO: 50 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00166] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.
[00167] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; e SEQ ID NO: 47 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42.
[00168] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; e SEQ ID NO: 50 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44.
[00169] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; e SEQ ID NO: 47) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; e SEQ ID NO: 50) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43.
[00170] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico é Ab5, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00171] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab5, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 41 e/ou SEQ ID NO: 43 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00172] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab5. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab5 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab6
[00173] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 51).
[00174] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 52).
[00175] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATY YASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53).
[00176] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATY YASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54).
[00177] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 57 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; e SEQ ID NO: 60 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00178] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 54.
[00179] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 57 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52.
[00180] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; e SEQ ID NO: 60 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54.
[00181] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 57) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; e SEQ ID NO: 60) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53.
[00182] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado é Ab6, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 54, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00183] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab6, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 51 e/ou SEQ ID NO: 53 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00184] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab6. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab6 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab7
[00185] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVS SRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 61).
[00186] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVS SRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 62).
[00187] A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGVVGINGRTYY ASWAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 63).
[00188] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGVVGINGRTYY ASWAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64).
[00189] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; e SEQ ID NO: 67 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; e SEQ ID NO: 70 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00190] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 61 ou SEQ ID NO: 62. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 63 ou SEQ ID NO: 64.
[00191] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; e SEQ ID NO: 67 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62.
[00192] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; e SEQ ID NO: 70 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64.
[00193] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; e SEQ ID NO: 67) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; e SEQ ID NO: 70) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63.
[00194] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico é Ab7, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00195] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab7, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 61 e/ou SEQ ID NO: 63 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00196] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab7. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab7 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab8
[00197] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 71).
[00198] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 72).
[00199] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGVVGINGRT YYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 73).
[00200] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGVVGINGRT YYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74).
[00201] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; e SEQ ID NO: 77 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; e SEQ ID NO: 80 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00202] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 71 ou SEQ ID NO: 72. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 73 ou SEQ ID NO: 74.
[00203] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; e SEQ ID NO: 77 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72.
[00204] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; e SEQ ID NO: 80 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74.
[00205] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; e SEQ ID NO: 77) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; e SEQ ID NO: 80) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73.
[00206] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado é Ab8, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 74, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00207] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab8, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 71 e/ou SEQ ID NO: 73 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00208] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab8. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab8 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab9
[00209] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGV SSRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 81).
[00210] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGV SSRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 82).
[00211] A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYMQWVRQSPGRGLEWIGVIGSDGKTYYAT WAKGRFTISKTSSTTVDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 83).
[00212] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYMQWVRQSPGRGLEWIGVIGSDGKTYYAT WAKGRFTISKTSSTTVDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 84).
[00213] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; e SEQ ID NO: 87 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; e SEQ ID NO: 90 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00214] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 82. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 84.
[00215] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; e SEQ ID NO: 87 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82.
[00216] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; e SEQ ID NO: 90 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84.
[00217] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; e SEQ ID NO: 87) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; e SEQ ID NO: 90) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83.
[00218] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico é Ab9, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 82 e SEQ ID NO: 84, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00219] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab9, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 81 e/ou SEQ ID NO: 83 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00220] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab9. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab9 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab10
[00221] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 91).
[00222] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 92).
[00223] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTY YATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93).
[00224] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTY YATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 94).
[00225] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; e SEQ ID NO: 97 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 91 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; e SEQ ID NO: 100 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00226] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 93 ou SEQ ID NO: 94.
[00227] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; e SEQ ID NO: 97 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 91 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92.
[00228] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; e SEQ ID NO: 100 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94.
[00229] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 91; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; e SEQ ID NO: 97) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 91; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; e SEQ ID NO: 100) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93.
[00230] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado é Ab10, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 92 e SEQ ID NO: 94, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00231] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab10, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 91 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 91 e/ou SEQ ID NO: 93 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00232] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab10. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab10 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab11
[00233] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVS SRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 101).
[00234] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVS SRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 102).
[00235] A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGVNGKRYYA SWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 103).
[00236] A invenção também inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação ao CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGVNGKRYYA SWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 104).
[00237] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; e SEQ ID NO: 107 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 101 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; e SEQ ID NO: 110 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00238] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 102. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 103 ou SEQ ID NO: 104.
[00239] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; e SEQ ID NO: 107 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 101 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102.
[00240] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; e SEQ ID NO: 110 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104.
[00241] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 101; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; e SEQ ID NO: 107) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 101; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; e SEQ ID NO: 110) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103.
[00242] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico é Ab11, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 104, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00243] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab11, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 101 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 101 e/ou SEQ ID NO: 103 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00244] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab11. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab11 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab12
[00245] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 111).
[00246] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência definida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 112).
[00247] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGVNGKR YYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 113).
[00248] A invenção também inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência definida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGVNGKR YYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 114).
[00249] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; e SEQ ID NO: 117 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 111 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; e SEQ ID NO: 120 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de um ou mais dos CDRs, as sequências de cadeias variáveis pesadas e variáveis leves, e as sequências de cadeias pesadas e leves definidas acima, incluindo todas.
[00250] A invenção também contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 112. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 114.
[00251] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; e SEQ ID NO: 117 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 111 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112.
[00252] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; e SEQ ID NO: 120 que correspondem às regiões determinantes de complementariedade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114.
[00253] A invenção também contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpos: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 111; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113; as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; e SEQ ID NO: 117) da região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 111; e as regiões determinantes de complementariedade (SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; e SEQ ID NO: 120) da região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113.
[00254] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado é Ab12, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 112 e SEQ ID NO: 114, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas definidas aqui.
[00255] Em outra modalidade da invenção particularmente preferencial, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Em relação ao anticorpo Ab12, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 111 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113. Essa modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 111 e/ou SEQ ID NO: 113 no dito Fab enquanto mantém a especificidade de ligação para CGRP.
[00256] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab12. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab12 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos através da expressão em células de mamíferos, como células CHO, NSO ou HEK 293, de fungos, insetos ou sistemas microbianos como células de levedura (por exemplo levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab13
[00257] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKLASGV PSRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 121).
[00258] A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKLASGV PSRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVVVKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 122).
[00259] A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGIIYNGDGSTYY ASWVNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 123).
[00260] A invenção ainda inclui anticorpos quiméricos contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGCIYNGDGSTY YASWVNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 124).
[00261] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; e SEQ ID NO: 127 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 121 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; e SEQ ID NO: 130 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas as mesmas.
[00262] A invenção ainda contempla os fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 121 ou SEQ ID NO: 122. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 123 ou SEQ ID NO: 124.
[00263] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; e SEQ ID NO: 127 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 121 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122.
[00264] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; e SEQ ID NO: 130 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124.
[00265] A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpo: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 121; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; e SEQ ID NO: 127) de uma região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 121; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; e SEQ ID NO: 130) de uma região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123.
[00266] Em uma modalidade preferencialmente particular da invenção, o anticorpo anti-CGRP quimérico é Ab13, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 124, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui
[00267] Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab13, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 121 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 121 e/ou SEQ ID NO: 123 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.
[00268] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab13. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab13 ou Fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de levedura. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
Antibody Ab14
[00269] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 131).
[00270] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia leve compreendendo a sequência estabelecida abaixo: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 132).
[00271] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTY YATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 133).
[00272] A invenção ainda inclui anticorpos humanizados contendo especificidade de ligação para CGRP e possuindo uma sequência de cadeia pesada compreendendo a sequência estabelecida abaixo: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTY YATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 134).
[00273] A invenção ainda contempla anticorpos compreendendo uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; e SEQ ID NO: 137 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 131 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132, e/ou uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; e SEQ ID NO: 140 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134, ou combinações destas sequências de polipeptídeo. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos compreendem, ou alternativamente consistem em, combinações de uma ou mais das CDRs, as sequências de cadeia pesada variável e leve variável, e as sequências de cadeia pesada e leve estabelecidas acima, incluindo todas das mesmas.
[00274] A invenção ainda contempla fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 131 ou SEQ ID NO: 132. Em outra modalidade da invenção, fragmentos de anticorpo da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 134.
[00275] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; e SEQ ID NO: 137 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 131 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132.
[00276] Em outra modalidade da invenção, fragmentos do anticorpo contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polipeptídeo de SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; e SEQ ID NO: 140 que corresponde às regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134.
[00277] A invenção ainda contempla fragmentos de anticorpos que incluem um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, fragmentos dos anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos dos seguintes fragmentos de anticorpo: a região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 131; a região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133; as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; e SEQ ID NO: 137) de uma região de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 131; e as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; e SEQ ID NO: 140) de uma região de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133.
[00278] Em uma modalidade preferencialmente particular da invenção, o anticorpo anti-CGRP humanizado é Ab14, compreendendo, ou alternativamente consistindo em, SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 134, e contendo pelo menos uma das atividades biológicas estabelecidas aqui
[00279] Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção, fragmentos de anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem em, fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab14, o fragmento Fab inclui a sequência de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 131 e a sequência de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133. Esta modalidade da invenção ainda contempla adições, deleções e variantes de SEQ ID NO: 131 e/ou SEQ ID NO: 133 em dito Fab enquanto retendo a especificidade de ligação para CGRP.
[00280] Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab14. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab14 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outras, Pichia pastoris.
[00281] Em outra modalidade, fragmentos de anticorpos podem estar presentes em uma ou mais das seguintes formas não limitantes: Formas de Fab, Fab', F(ab')2, Fv e Fv de cadeia simples de anticorpo. Em uma modalidade preferencial, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui ainda compreendem a sequência de cadeia leve constante capa compreendendo a sequência estabelecida abaixo: VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 283).
[00282] Em outra modalidade preferencial, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui compreendem a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada constante gama 1 compreendendo a sequência estabelecida abaixo: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 284).
[00283] Em outra modalidade, a invenção contempla um anticorpo anti- CGRP isolado compreendendo uma sequência de polipeptídeo VH selecionada de: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ou 133, ou uma variante da mesma; e ainda compreendendo uma sequência de polipeptídeo VL selecionada de: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ou 131, ou uma variante da mesma, em que um ou mais dos resíduos estruturais (resíduos FRs) em dito polipeptídeo VH ou VL foi substituído com outro resíduo de aminoácido resultando em um anticorpo anti-CGRP que especificamente liga CGRP. A invenção contempla formas humanizadas e quiméricas destes anticorpos. Os anticorpos quiméricos podem incluir um Fc derivado de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 ou IgG19 regiões constantes.
[00284] Em uma modalidade da invenção, os anticorpos ou polipeptídeos VH ou VL se originam ou são selecionados de uma ou mais populações de célula B de coelho antes do início do processo de humanização referenciado aqui.
[00285] Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos não têm especificidade de ligação para CGRP-R. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos inibem a associação de CGRP com CGRP-R. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos inibem a associação de CGRP com CGRP-R e/ou proteínas adicionais e/ou multímeros dos mesmos, e/ou antagoniza os efeitos biológicos dos mesmos.
[00286] Como declarado no parágrafo [0127] aqui, anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser modificados pós-tradução para adicionar frações efetoras como ligantes químicos, frações detectáveis como, por exemplo, corantes fluorescentes, enzimas, substratos, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, e frações quimioluminescentes, ou frações funcionais como, por exemplo, estreptavidina, avidina, biotina, uma citotoxina, um agente citotóxico, e materiais radioativos.
[00287] Anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ainda ser quimicamente modificados para fornecer vantagens adicionais como solubilidade aumentada, estabilidade e tempo de circulação (meia-vida in vivo) do polipeptídeo, ou imunogenicidade reduzida (Ver patente US 4.179.337). As frações químicas para derivatização podem ser selecionadas de polímeros solúveis em água como polietileno glicol, copolímeros etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, polivinil álcool e semelhantes. Os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser modificados em posições aleatórias dentro da molécula, ou em posições predeterminadas dentro da molécula e podem incluir uma, duas, três ou mais frações químicas ligadas.
[00288] O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. Para polietileno glicol, o peso molecular preferencial é entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indica que nas preparações de polietileno glicol, algumas moléculas irão pesar mais, algumas menos e o peso molecular declarado) para facilitar o manuseio e fabricação. Outros tamanhos podem ser usados, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração de liberação sustentada, os efeitos, se qualquer um na atividade biológica, a facilidade no manuseio, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos de polietileno glicol à uma proteína terapêutica ou análogo). Por exemplo, o polietileno pode ter um peso molecular médio de cerca de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, ou 100.000 kDa. polietileno glicois ramificados são descritos, por exemplo, na patente US 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); and Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), as revelações das quais são incorporadas aqui por referência.
[00289] Há um número de métodos de ligação disponíveis aos especialistas na técnica, ver, por exemplo, EP 0 401 384, aqui incorporado por referência (acoplamento de PEG a G-CSF), Ver ainda Malik et al., Exp. Hematol. 20:10281035 (1992) (relato de peguilação de GM-CSF usando cloreto de tresila). Por exemplo, polietileno glicol pode ser covalentemente ligado por resíduos de aminoácido através de um grupo reativo, como, um amino livre ou grupo carboxila. Grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula ativada de polietileno glicol pode estar ligada. Os resíduos de aminoácidos contendo um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisina e os resíduos de aminoácido N-terminal; aqueles contendo um grupo carboxila livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido C- terminal. Os grupos sulfidrila podem ainda ser usados como um grupo reativo para ligar as moléculas de polietileno glicol. Preferenciais para fins terapêuticos na ligação em grupo amino, como ligação no grupo N-terminal ou lisina.
[00290] Como sugerido acima, polietileno glicol pode ser ligado às proteínas através de ligação a qualquer um de um número de resíduos de aminoácidos. Por exemplo, polietileno glicol pode ser ligado aos polipeptídeos através de ligação covalente aos resíduos de lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ou cisteína. Um ou mais produtos químicos de reação podem ser empregados para ligar polietileno glicol aos resíduos de aminoácido específicos (por exemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ou cisteína) ou a mais do que um tipo de resíduo de aminoácido (por exemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína e combinações dos mesmos).
[00291] Alternativamente, anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ter meias vidas in vivo aumentadas via fusão com albumina (incluindo entre outras albumina sérica humana recombinante ou fragmentos ou variantes dos mesmos (ver, por exemplo, patente US 5.876.969, emitida em 2 de março de 1999, patente EP 0 413 622, e patente US 5.766.883, emitida em 16 de junho de 1998, aqui incorporada por referência em sua totalidade)) ou outras proteínas sanguíneas circulantes como transferrina ou ferritina. Em uma modalidade preferencial, polipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ou variantes dos mesmos) são fundidos com a forma madura de albumina sérica humana (ou seja, aminoácidos 1-585 de albumina sérica humana como mostrado nas figuras 1 e 2 de patente EP 0 322 094) que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Polinucleotídeos que codificam proteínas de fusão da invenção estão ainda incluídos pela invenção.
[00292] Com relação às frações detectáveis, outras enzimas exemplares incluem, entre outras, peroxidase de rábano silvestre, acetilcolinesterase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase e luciferase. Outros materiais fluorescentes exemplares incluem, entre outros, rodamina, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, umbelliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina e danisl cloreto. Outras frações quimioluminescentes exemplares incluem, entre outras, luminol. Outros materiais bioluminescentes exemplares incluem, entre outros, luciferina e aequorin. Outros materiais radioativos exemplares incluem, entre outros, Iodo 125 (125I), Carbono 14 (14C), Enxofre 35 (35S), Trítio (3H) e fósforo 32 (32P).
[00293] Com relação às frações funcionais, agentes citotóxicos exemplares incluem, entre outros, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina; agentes alquilantes como mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclotosfamida, mecloretamina, bussulfan, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina e carboplatina (paraplatina); antraciclinas incluem daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), detorrubicina, carminomicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona e bisantreno; antibióticos incluem dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, caliceamicina, mitramicina, e antramicina (AMC); e agentes antimitóticos como os alcaloides da vinca, vincristina e vinblastina. Outros agentes citotóxicos incluem paclitaxel (taxol), ricina, pseudomonas exotoxina, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, etoposídeo, tenoposídeo, colchicina, dihidroxi anthracina diona, 1-dehidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiureia, asparaginase, corticosteroides, mitotano (O,P'- (DDD)), interferons, e misturas destes agentes citotóxicos.
[00294] Outros agentes citotóxicos incluem, entre outros, agentes quimioterápicos como carboplatina, cisplatina, paclitaxel, gemcitabina, calicheamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracila, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina e bleomicina. Enzimas toxicas de plantas e bactérias como ricina, toxina diftérica e toxina de Pseudomonas podem ser conjugadas aos anticorpos humanizados ou quiméricos, ou fragmentos de ligação aos mesmos, para gerar reagentes de morte específica por tipo de célula (Youle, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
[00295] Outros agentes citotóxicos incluem ribonucleases como descrito por Goldenberg na patente US 6.653.104. Modalidades da invenção ainda referem-se aos radioimunoconjugados onde um radionuclídeos que emite partículas alfa ou beta é estavelmente acoplado ao anticorpo, ou fragmentos de ligação ao mesmo, com ou sem o uso de um agente de formação de complexo. Ditos radionuclídeos incluem emissores beta Fósforo-32 (32P), Escádio-47 (47Sc), Cobre-67 (67Cu), Gálio-67 (67Ga), Ítrio-88 (88Y), Ítrio-90 (90Y), Iodo-125 (125I), Iodo- 131 153 177 186 131 ( I), Samário-153 ( Sm), Lutécio-177 ( Lu), Rênio-186 ( Re) ou Rênio- 188 211 212 188 ( Re), e emissores alfa como Astatina-211 ( At), Chumbo-212 ( Pb), 212 213 225 Bismuto-212 ( Bi) ou -213 ( Bi) ou Actínio-225 ( Ac).
[00296] Métodos são conhecidos na técnica para a conjugação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao mesmo em uma fração detectável e semelhantes, como por exemplo, aqueles métodos descritos por Hunter et al, Nature 144:945 (1962); David et al, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); e Nygren, J., Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).
[00297] Modalidades descritas aqui ainda incluem variantes e equivalentes que são substancialmente homólogas aos anticorpos, fragmentos de anticorpos, diabodies, SMIPs, camelbodies, nanobodies, IgNAR, polipeptídeos, regiões variáveis e CDRs estabelecidos aqui. Estas podem conter, por exemplo, mutações de substituição conservadoras (ou seja, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos semelhantes). Por exemplo, substituição conservada refere-se à substituição de um aminoácido com outro dentro da mesma classe geral, por exemplo, um aminoácido ácido com outro aminoácido ácido, um aminoácido básico com outro aminoácido básico, ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. O que é pretendido por uma substituição de aminoácido conservada é bem conhecido na técnica.
[00298] Em outra modalidade, a invenção contempla sequências de polipeptídeo contendo pelo menos 90% ou mais homologia de sequência a qualquer uma ou mais das sequências de polipeptídeo de fragmentos de anticorpo, regiões variáveis e CDRs estabelecidas aqui. Mais preferencialmente, a invenção contempla sequências de polipeptídeo contendo pelo menos 95% ou mais de homologia de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou mais homologia de sequência, e ainda mais preferencialmente pelo menos 99% ou mais homologia de sequência a qualquer uma ou mais das sequências de polipeptídeo de fragmentos de anticorpo, regiões variáveis e CDRs estabelecidas aqui. Métodos para determinar homologia entre ácido nucleico e sequências de aminoácido são bem conhecidas aos especialistas na técnica.
[00299] Em outra modalidade, a invenção ainda contempla os homólogos de peptídeo acima mencionados dos fragmentos de anticorpo, regiões variáveis e CDRs estabelecidas aqui ainda contendo atividade anti-CGRP. Exemplos não limitantes de atividade anti-CGRP são estabelecidos aqui, por exemplo, nos parágrafos [0329]-[0350] infra.
[00300] Em outra modalidade, a invenção ainda contempla a geração e uso de anticorpos anti-idiotípicos que se ligam a qualquer uma das sequências acima. Em uma modalidade exemplar, dito um anticorpo anti-idiotípico poderia ser administrado a um sujeito que recebeu um anticorpo anti-CGRP para modular, reduzir ou neutralizar o efeito de anticorpo anti-CGRP. Ditos anticorpos anti- idiotípicos poderiam ainda ser úteis para o tratamento de doença autoimune caracterizada pela presença de anticorpos anti-CGRP. Outro uso exemplar de ditos anticorpos anti-idiotípicos é para a detecção de anticorpos anti-CGRP da presente invenção, por exemplo, monitorar os níveis de anticorpos anti-CGRP presentes no sangue de um sujeito ou outros fluidos corporais.
[00301] A presente invenção ainda contempla anticorpos anti-CGRP compreendendo qualquer uma das sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo descritas aqui substituídas por qualquer uma das outras sequências de polinucleotídeo descritas aqui. Por exemplo, sem limitação, a presente invenção contempla anticorpos compreendendo a combinação de qualquer uma das sequências variáveis de cadeia leve e variáveis de cadeia pesada descritas aqui, e ainda contempla anticorpos resultando da substituição de qualquer uma das sequências CDR descrias aqui para qualquer uma das outras sequências CDR descritas aqui.
Modalidades exemplares adicionais da invenção
[00302] Em outra modalidade, a invenção contempla um ou mais anticorpos anti-CGRP humano ou fragmento de anticorpos dos mesmos que especificamente se liga aos mesmos epitopos lineares de sobreposição ou conformacionais e/ou competem para ligação aos mesmos epitopos lineares de sobreposição ou conformacionais em um polipeptídeo CGRP humano intacto ou fragmento do mesmo como um anticorpo anti-CGRP humano selecionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ou Ab14. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo anti-CGRP humano ou fragmento do mesmo especificamente se liga aos mesmos epitopos lineares de sobreposição ou conformacionais e/ou competem para ligação aos mesmos epitopos lineares de sobreposição ou conformacionais em um polipeptídeo CGRP humano intacto ou um fragmento do mesmo as Ab3, Ab6, Ab13, ou Ab14.
[00303] Uma modalidade preferencial da invenção é direcionada aos anticorpos quiméricos ou humanizados e fragmentos dos mesmos (incluindo fragmentos Fab) contendo especificidade de ligação para CGRP e inibir atividades biológicas mediadas pela ligação de CGRP ao receptor CGRP. Em uma modalidade preferencialmente particular da invenção, os anticorpos quiméricos ou humanizados anti-CGRP são selecionados de Ab3, Ab6, Ab13, ou Ab14.
[00304] Em outra modalidade da invenção é contemplado um método para reduzir, tratar ou prevenir doenças ou distúrbios associados com CGRP afetando aquelas atividades biológicas mediadas por CGRP, assim, evitando as atividades biológicas através da ligação de CGRP a CGRP-R. Em uma modalidade, a doença ou distúrbio associado com CGRP é enxaqueca ou outro distúrbio em que CGRP induz dor, cefaleia, dor, câncer, bexiga super-reativa, ou perda de peso. Outra listagem não limitante de doenças e distúrbios associada com CGRP é fornecida aqui.
[00305] Outra modalidade preferencial da invenção contempla o uso de sequências Fab de polipeptídeo para o tratamento de enxaquecas e cefaleias em um paciente. Tipos não limitantes de enxaquecas e cefaleias que podem ser tratados usando sequências Fab de polipeptídeo são fornecidos aqui em outro ponto.
[00306] Em outra modalidade da invenção, o anticorpo anti-CGRP humano é um anticorpo que especificamente se liga aos mesmos epitopos lineares de sobreposição ou conformacionais ou um polipeptídeo CGRP intacto ou fragmento do mesmo que são especificamente ligados por Ab3, Ab6, Ab13, ou Ab14 como verificado por mapeamento epitópico usando fragmentos de peptídeo linear de sobreposição que mediu o comprimento completo do polipeptídeo CGRP humano nativo.
[00307] A invenção é ainda direcionada a um anticorpo anti-CGRP que se liga com o mesmo epitopo CGRP e/ou compete com um anticorpo anti-CGRP para ligação ao CGRP como um anticorpo ou fragmento de anticorpo revelado aqui, incluindo entre outros um anticorpo anti-CGRP selecionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ou Ab14.
[00308] Em outra modalidade, a invenção é ainda direcionada a um anticorpo anti-CGRP isolado ou fragmento de anticorpo compreendendo uma ou mais das CDRs contidas nas sequências VH de polipeptídeo selecionadas de: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ou 133, ou uma variante da mesma, e/ou uma ou mais das CDRs contidas nas sequências VL de polipeptídeo selecionadas de: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ou 131, ou uma variante da mesma.
[00309] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-CGRP humano discutido nos dois parágrafos anteriores compreende pelo menos 2 regiões determinantes de complementariedade (CDRs) em cada uma das regiões variáveis leves e variáveis pesadas que são idênticas às contidas em um anticorpo anti-CGRP humano selecionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ou Ab14.
[00310] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo anti-CGRP humano discutido acima compreende pelo menos 2 regiões determinantes de complementariedade (CDRs) em cada uma das regiões variáveis leves e variáveis pesadas que são idênticas às contidas em Ab3 ou Ab6. Em outra modalidade, todas as CDRs do anticorpo anti-CGRP humano discutidas acima são idênticas às CDRs contidas em um anticorpo anti-CGRP humano selecionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ou Ab14. Em uma modalidade preferencial da invenção, todas as CDRs do anticorpo anti-CGRP humano discutidas acima são idênticas às CDRs contidas em um anticorpo anti- CGRP humano selecionado de Ab3 ou Ab6.
[00311] A invenção ainda contempla que um ou mais dos anticorpos anti- CGRP humanos discutidos acima são aglicosilado; que contêm uma região Fc que foi modificada para alterar a função efetora, meia-vida, proteólise, e/ou glicosilação; são humanos, humanizados, de cadeia simples ou quimérica; e são um anticorpo humanizado derivado de um anticorpo de coelho (parental) anti- CGRP humano.
[00312] A invenção ainda contempla um ou mais anticorpos anti-CGRP humanos em que as regiões estruturais (FRs) na região leve variável e a região pesada variável de dito anticorpo respectivamente são FRs humanas que são não modificadas ou que foram modificadas pela substituição de um ou mais dos resíduos FR humanos na região de cadeia variável leve ou pesada com os correspondentes resíduos FR do anticorpo parental de coelho, e em que ditas FRs foram derivadas de sequências de anticorpo de cadeia variável pesada e leve que foram selecionadas de uma biblioteca de sequências de anticorpo de linhagem germinativa humana baseada em seus altos níveis de homologia às correspondentes regiões de cadeia variável pesada ou leve de coelho em relação às outras sequências de anticorpo de linhagem germinativa contidas na biblioteca.
[00313] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-CGRP humano ou fragmento especificamente se liga para CGRP expressando células humanas e/ou às moléculas CGRP solúveis circulantes in vivo, incluindo CGRP expresso em ou por células humanas em um paciente com uma doença associada com células que expressam CGRP.
[00314] Em outra modalidade, a doença é selecionada de enxaquecas (com ou sem aura), perda de peso, câncer ou tumores, angiôgenese associada com câncer ou crescimento de tumor, angiôgenese associada com câncer ou sobrevida de tumor, enxaquecas hemiplágicas, cefaleia em salvas, neuralgia enxaquecosa, dores de cabeça crônicas, dores de cabeça de tensão, dores de cabeça gerais, rubores quentes, hemicrania paroxisomal crônica, cefaleias secundárias devido a um problema estrutural subjacente na cabeça ou pescoço, neuralgia cranial, cefaleias de sinos (como, por exemplo, associada com sinusite), cefaleias ou enxaquecas induzidas por alergia, dor, dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, síndrome de dor regional complexa, dor de câncer, dor de câncer ósseo primário ou metastático, dor de fratura, dor crônica, dor de fratura osteoporótica, dor resultante de queimadura, osteoporose, dor articular de gota, abdominal dor, dor associada com crise de célula falciforme, e outras dores nociceptivas, bem como carcinoma hepatocelular, câncer de mama, cirrose hepática, dor neurogênica, dor neuropática, dor nocicéptica, neuralgia trigeminal, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, fibromialgia, dor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatética de reflexo, dor neurogênica, osteoartrite ou dor de artrite reumatoide, dor lombar inferior, neuropatia diabética, ciática, ou dor ou dor visceral associada com: refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome de intestino irritável, cólon irritável, cólon espástico, colite mucosa, doença intestinal inflamatória, Doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenorreia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prostatite, pancreatite, cólica renal, dismenorreia, cistite, incluindo cistite intersticial (IC), cirurgia associada com o íleo, diverticulite, peritonite, pericardite, hepatite, apendicite, colite, colecistite, endometriose, pancreatite crônica e/ou aguda, infarto do miocárdio, dor renal, dor pleural, prostatite, dor pélvica, trauma em um órgão, dor nociceptiva crônica, dor neuropática crônica, dor inflamatória crônica, fibromialgia, dor avançada e dor persistente.
[00315] Em outra modalidade da invenção, a doença é dor de câncer que surge de malignidade ou de câncer preferencialmente selecionado de um ou mais de: adenocarcinoma em tecido glandular, blastoma em tecido embrionário dos órgãos, carcinoma no tecido epitelial, leucemia em tecidos que formam células sanguíneas, linfoma em tecido linfático, mieloma em medula óssea, sarcoma em tecido conectivo ou de suporte, câncer adrenal, linfoma relacionado a AIDS, anemia, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, tumores carcinoides, câncer cervical, quimioterapia, câncer de cólon, citopenia, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer hepatobiliar, câncer renal, leucemia, câncer hepático, câncer pulmonar, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma, não Hodgkin, tumores do sistema nervoso, câncer oral, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer retal, câncer de pele, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer uretral, câncer ósseo, sarcomas câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue, câncer de medula óssea, mieloma múltiplo, leucemias, câncer ósseo primário ou secundário, tumores que metastizam ao osso, tumores que infiltram o nervo e vísceras ocas, tumores pertos de estruturais neurais. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor visceral, preferencialmente dor visceral que surge de câncer pancreático e/ou metástases no abdômen. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor somática, preferencialmente dor somática devido à um ou mais de câncer ósseo, metástase no osso, dor pós-cirúrgica, sarcomas de câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue da medula óssea, mieloma múltiplo, leucemias, câncer ósseo primário ou secundário.
[00316] A invenção ainda contempla anticorpos anti-CGRP humano ou fragmentos direta ou indiretamente à um marcador detectável ou agente terapêutico.
[00317] A invenção ainda contempla uma ou mais sequências de ácido nucleico que resultam na expressão de um anticorpo anti-CGRP humano ou fragmento de anticorpo como estabelecido acima, incluindo aquelas compreendendo, ou alternativamente consistindo em, códons preferenciais de leveduras ou humanos. A invenção ainda contempla vetores (incluindo plasmídeos ou vetores virais recombinantes) compreendendo ditas sequências de ácido nucleico. A invenção ainda contempla células hospedeiras ou células hospedeiras recombinantes que expressam pelo menos um dos anticorpos estabelecidos acima, incluindo células de mamíferos, leveduras, bactérias e insetos. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Em outra modalidade preferencial, a célula de levedura é uma célula de levedura diploidal. Em uma modalidade mais preferencial, a célula de levedura é uma levedura Pichia.
[00318] A invenção ainda contempla um método de tratamento compreendendo administrar a um paciente com uma doença ou condição associada com células que expressam CGRP uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um anticorpo anti-CGRP humano ou fragmento descrito aqui. A invenção ainda contempla que o método de tratamento pode envolver a administração de dois ou mais anticorpos anti-CGRP ou fragmentos dos mesmos e revelados aqui. Se mais do que um anticorpo é administrado ao paciente, os vários anticorpos podem ser administrados simultaneamente ou concomitantemente, ou podem ser escalonados em suas administrações. As doenças que podem ser tratadas são apresentadas na lista não limitante estabelecida acima e em outro ponto aqui. Em uma modalidade preferencial, a doença é selecionada de enxaqueca, cefaleia, perda de peso, dor, dor de câncer ou dor neuropática. Em outra modalidade o tratamento ainda inclui a administração de outro agente terapêutico ou regime selecionado de quimioterapia, radioterapia, administração de citocina ou terapia gênica.
[00319] Em uma modalidade não limitante da invenção, outro agente terapêutico ou regime incluem Taxol (paclitaxel) ou seus derivados, compostos de platina como carboplatina ou cisplatina, antrociclinas como doxorrubicina, agentes alquilantes como ciclofosfamida, antimetabólitos como 5-fluoruracil, ou etoposídeo.
[00320] A invenção ainda contempla um método de gerar imagem in vivo que detecta a presença de células que expressam CGRP compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um anticorpo anti-CGRP humano. Em uma modalidade, dita administração ainda inclui a administração de um radionuclídeos ou fluróforo que facilita a detecção do anticorpo em sítios de doença que expressam CGRP. Em outra modalidade, os resultados de dito método de imagem in vivo são usados para facilitar o desenho de um regime terapêutico apropriado, incluindo regimes terapêuticos incluindo radioterapia, quimioterapia ou uma combinação dos mesmos.
[00321] A atividade anti-CGRP dos anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos contendo especificidade de ligação para CGRP, pode ainda ser descrita por sue força de ligação ou sua afinidade para CGRP. Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos contendo especificidade de ligação para CGRP, se ligam a CGRP com uma constante de dissociação (KD) de menos do que ou igual a 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, ou 10-13 M. Preferencialmente, os anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos se ligam a CGRP com uma constante de dissociação de menos do que ou igual a 10-11 M, 5x10-12 M, ou 10-12 M. Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti- CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos contendo especificidade de ligação para CGRP, se ligam a um epitopo CGRP linear ou conformacional.
[00322] Em outra modalidade da invenção, a atividade anti-CGRP dos anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos contendo especificidade de ligação para CGRP, se ligam a CGRP com uma taxa de desassociação de menos do que ou igual a 10-4 S-1, 5x10-5 S-1, 10-5 S-1, 5x10-6 S-1, 10-6 S-1, 5x10-7 S-1, ou 10-7 S-1.
[00323] Em outra modalidade da invenção, a atividade de anti-CGRP dos anticorpos anti-CGRP da presente invenção, e fragmentos dos mesmos contendo especificidade de ligação para CGRP, apresentam atividade anti-CGRP prevenindo, melhorando ou reduzindo os sintomas de, ou alternativamente tratando, doenças e distúrbios associadas com CGRP. Exemplos não limitantes de doenças e distúrbios associadas com CGRP são estabelecidas aqui.
Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpo de anti-CGRP Anticorpo Ab1
[00324] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 1: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGG GGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGC GACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTA GTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 141).
[00325] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 2: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGG GGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGC GACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTA GTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTG GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGC CTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 142).
[00326] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 3: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTC ACCTGCACAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGCCAGG CTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGATAACACATACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGCCTCGTCGACCACGGTGG ATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAG GGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 143).
[00327] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTC ACCTGCACAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGCCAGG CTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGATAACACATACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGCCTCGTCGACCACGGTGG ATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAG GGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAA TCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGA (SEQ ID NO: 144).
[00328] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; e SEQ ID NO: 147 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2.
[00329] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; e SEQ ID NO: 150 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4.
[00330] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 141 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 142 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 143 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 144 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; e SEQ ID NO: 147) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; e SEQ ID NO: 150) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4.
[00331] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab1, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab1 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 142 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 2; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 144 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 4.
[00332] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para a expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab1 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab1 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de polinucleotídeos Ab1 em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab2
[00333] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 11: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAG TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 151).
[00334] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 12: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAG TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGC TGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGA AACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 152).
[00335] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 13: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGATAACAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 153).
[00336] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGATAACAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 154).
[00337] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; e SEQ ID NO: 157 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12.
[00338] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; e SEQ ID NO: 160 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14.
[00339] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 151 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 11; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 152 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 153 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 154 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; e SEQ ID NO: 157) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; e SEQ ID NO: 160) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14.
[00340] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab2, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab2 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 152 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 12; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 154 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14.
[00341] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou in sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab2 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab2 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab2 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab3
[00342] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 21: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAG TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 161).
[00343] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 22: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAG TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGC TGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGA AACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 162).
[00344] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 23: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGATAACAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 163).
[00345] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGATAACAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 164).
[00346] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; e SEQ ID NO: 167 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 21 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22.
[00347] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; e SEQ ID NO: 170 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24.
[00348] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 161 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 21; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 162 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 163 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 164 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; e SEQ ID NO: 167) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 21 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; e SEQ ID NO: 170) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24.
[00349] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab3, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab3 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 162 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 22; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 164 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 24.
[00350] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab3 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab3 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab3 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab4
[00351] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 31: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCGTCTG GGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCA GCGGCGTGCAGTGTAACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAC TAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 171).
[00352] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 32: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCGTCTG GGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCA GCGGCGTGCAGTGTAACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAC TAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACT GCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTAC GAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 172).
[00353] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 33: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTC ACCTGTTCCGTCTCTGGCATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGG ATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAG GGGACATCTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 173).
[00354] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTC ACCTGTTCCGTCTCTGGCATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGG ATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAG GGGACATCTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAA TCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGA (SEQ ID NO: 174).
[00355] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; e SEQ ID NO: 177 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 31 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32.
[00356] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; e SEQ ID NO: 180 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 33 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34.
[00357] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 171 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 31; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 172 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 173 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 33; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 174 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; e SEQ ID NO: 177) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 31 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; e SEQ ID NO: 180) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 33 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34.
[00358] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab4, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab4 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 172 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 32; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 174 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34.
[00359] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab4 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab4 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab4 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab5
[00360] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 41: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGG GGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTA ATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 181).
[00361] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 42: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGG GGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTA ATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC TCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 182).
[00362] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 43: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 183).
[00363] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 184).
[00364] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; e SEQ ID NO: 187 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 41 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42.
[00365] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; e SEQ ID NO: 190 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 43 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44.
[00366] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 181 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 41; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 182 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 183 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 43; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 184 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; e SEQ ID NO: 187) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 41 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; e SEQ ID NO: 190) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 43 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44.
[00367] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab5, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab5 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 182 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 42; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 184 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 44.
[00368] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab5 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab5 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab5 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab6
[00369] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 51: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGG GGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTA ATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 191).
[00370] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 52: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGG GGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTA ATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC TCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 192).
[00371] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 53: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 193).
[00372] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 194).
[00373] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; e SEQ ID NO: 197 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 51 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52.
[00374] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; e SEQ ID NO: 200 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 53 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54.
[00375] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 191 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 51; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 192 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 193 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 53; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 194 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; e SEQ ID NO: 197) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 51 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; e SEQ ID NO: 200) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 53 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54.
[00376] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab6, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab6 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 192 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 52; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 194 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 54.
[00377] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab6 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab6 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab6 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab7
[00378] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 61: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGG GGTCTCATCGCGATTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGC GACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGACTGTAGTA CTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 201).
[00379] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 62: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGG GGTCTCATCGCGATTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGC GACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGACTGTAGTA CTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC TCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 202).
[00380] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 63: CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACATCCCTGAC ACTCACCTGCACCGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGCAATGGGTCCGC CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCGTTGGTATTAATGGTCGCAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCAC GGTGGATCTGAAAATGACCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGC CAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 203).
[00381] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64: CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACATCCCTGAC ACTCACCTGCACCGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGCAATGGGTCCGC CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCGTTGGTATTAATGGTCGCAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCAC GGTGGATCTGAAAATGACCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGC CAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCT ACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGC CCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACA CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGG TCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 204).
[00382] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; e SEQ ID NO: 207 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 61 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62.
[00383] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; e SEQ ID NO: 210 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 63 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64.
[00384] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 201 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 61; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 202 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 203 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 63; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 204 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; e SEQ ID NO: 207) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 61 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; e SEQ ID NO: 210) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 63 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64.
[00385] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab7, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab7 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 202 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 62; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 204 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 64.
[00386] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab7 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab7 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab7 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab8
[00387] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 71: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTACAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTAC TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 211).
[00388] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 72: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTACAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTAC TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGC TGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGA AACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 212).
[00389] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 73: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCGTTGGTATCAATGGTCGCAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 213).
[00390] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCGTTGGTATCAATGGTCGCAC ATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT GCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 214).
[00391] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; e SEQ ID NO: 217 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 71 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72.
[00392] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; e SEQ ID NO: 220 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 73 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74.
[00393] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 211 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 71; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 212 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 213 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 73; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 214 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; e SEQ ID NO: 217) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 71 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; e SEQ ID NO: 220) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 73 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74.
[00394] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab8, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab8 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 212 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 72; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 214 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 74.
[00395] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab8 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab8 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab8 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab9
[00396] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 81: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTATAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACGTCCACTCTGGCATCTGG GGTCTCATCGCGATTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGC GACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTC GTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 221).
[00397] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 82: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTATAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACGTCCACTCTGGCATCTGG GGTCTCATCGCGATTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGC GACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTC GTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTG GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGC CTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 222).
[00398] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 83: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTC ACCTGCACAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAGTGGGTCCGCCAGT CTCCAGGGAGGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATAC TACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTG GATCTGAGAATGGCCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTACCAGA GGGGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 223).
[00399] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTC ACCTGCACAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAGTGGGTCCGCCAGT CTCCAGGGAGGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATAC TACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTG GATCTGAGAATGGCCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTACCAGA GGGGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGG ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC TGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACA GCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAATGA (SEQ ID NO: 224).
[00400] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; e SEQ ID NO: 227 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 81 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82.
[00401] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; e SEQ ID NO: 230 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 83 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84.
[00402] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 221 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 81; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 222 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 223 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 83; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 224 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; e SEQ ID NO: 227) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 81 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; e SEQ ID NO: 230) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 83 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84.
[00403] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab9, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab9 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 222 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 82; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 224 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 84.
[00404] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab9 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab9 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab9 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab10
[00405] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 91: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCG TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 231).
[00406] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 92: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCG TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGC TGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGA AACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 232).
[00407] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGAC ATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT ACCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 233).
[00408] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGAC ATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT ACCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 234).
[00409] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; e SEQ ID NO: 237 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 91 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92.
[00410] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; e SEQ ID NO:240 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 93 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94.
[00411] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 231 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 91; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 232 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 233 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 93; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 234 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; e SEQ ID NO: 237) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 91 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; e SEQ ID NO: 240) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 93 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94.
[00412] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab10, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab10 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 232 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 92; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 234 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94.
[00413] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab10 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab10 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab10 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab11
[00414] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 101: CAGGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTCCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTATTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGG GGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGC GACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTA ATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 241).
[00415] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 102: CAGGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTCCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACC ATCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTATTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGG GGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGC GACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTA ATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC TCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 242).
[00416] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 103: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGAGGATCCCTGACACTC ACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAACTACTATATGCAATGGGTCCGCCAGG CTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATAC TACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTG GATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGA GGCGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 243).
[00417] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGAGGATCC CTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAACTACTATATGCAATGGG TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTGTGAATGGT AAGAGATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCG ACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTC TGTGCCAGAGGCGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGT GGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTC AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGT TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCT CCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCA CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCC AGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT CTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 244).
[00418] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; e SEQ ID NO: 247 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 101 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102.
[00419] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; e SEQ ID NO: 250 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104.
[00420] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 241 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 101; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 242 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 243 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 244 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; e SEQ ID NO: 247) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 101 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; e SEQ ID NO: 250) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104.
[00421] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab11, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab11 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 242 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 102; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 244 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 104.
[00422] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab11 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab11 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab11 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab12
[00423] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 111: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTACTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTAA TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 251).
[00424] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 112: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTACTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTAA TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGC TGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGA AACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 252).
[00425] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 113: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAACTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGA GATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGA CCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTG TGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 253).
[00426] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAACTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGA GATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGA CCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTG TGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 254).
[00427] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; e SEQ ID NO: 257 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 111 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112.
[00428] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; e SEQ ID NO: 260 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 113 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114.
[00429] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 251 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 111; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 252 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 253 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 113; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 254 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; e SEQ ID NO: 257) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 111 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; e SEQ ID NO: 260) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 113 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114.
[00430] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab12, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab12 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 252 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 112; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 254 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114.
[00431] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab12 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab12 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab12 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab13
[00432] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 121: GCCATCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCCTGTGGGAGACACAGTCA CCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTCTTTATAATAACAACGCCTTGGCCTGGTTTCA GCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCGCCTGATCTATGATGCATCCAAACTGGCATC TGGGGTCCCATCGCGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACACAGTTCACTCTCACCAT CAGTGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCTACAGAAGTGA TAGTGTTGATGGTGTTGCTTTCGCCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 261).
[00433] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 122: GCCATCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCCTGTGGGAGACACAGTCA CCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTCTTTATAATAACAACGCCTTGGCCTGGTTTCA GCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCGCCTGATCTATGATGCATCCAAACTGGCATC TGGGGTCCCATCGCGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACACAGTTCACTCTCACCAT CAGTGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCTACAGAAGTGA TAGTGTTGATGGTGTTGCTTTCGCCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACT GCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTAC GAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 262).
[00434] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 123: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACT CACCTGCACAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCAATGCAATGTGGTGGGTCCGCCA GGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTACAATGGTGATGGCAGCA CATACTACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCAC GGTGACTCTGCAACTGAATAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACGTATTATTGTGC GAGAGATCTTGACTTGTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 263).
[00435] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACT CACCTGCACAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCAATGCAATGTGGTGGGTCCGCCA GGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTACAATGGTGATGGCAGCA CATACTACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCAC GGTGACTCTGCAACTGAATAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACGTATTATTGTGC GAGAGATCTTGACTTGTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 264).
[00436] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; e SEQ ID NO: 267 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 121 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122.
[00437] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; e SEQ ID NO: 270 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 123 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124.
[00438] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 261 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 121; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 262 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 263 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 123; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 264 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; e SEQ ID NO: 267) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 121 ou a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; e SEQ ID NO: 270) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 123 ou a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124.
[00439] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab13, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab13 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 262 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 122; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 264 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124.
[00440] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab13 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab13 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab13 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
Anticorpo Ab14
[00441] A invenção é ainda direcionada aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve variável de SEQ ID NO: 131: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCG TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 271).
[00442] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 132: CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGG GTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCG TGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGC TGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGA AACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 272).
[00443] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 133: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGAC ATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT ACCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 273).
[00444] Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, as seguintes sequências de polinucleotídeo que codificam a sequência de polipeptídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134: GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGAC ATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC CACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGT ACCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 274).
[00445] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; e SEQ ID NO: 277 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 131 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132.
[00446] Em outra modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; e SEQ ID NO: 280 que corresponde aos polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs, ou regiões hipervariáveis) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 133 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134.
[00447] A invenção ainda contempla sequências de polinucleotídeo incluindo uma ou mais das sequências de polinucleotídeo que codificam fragmentos de anticorpos descritos aqui. Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpos contendo especificidade de ligação para CGRP compreendem, ou alternativamente consistem em, um, dois, três ou mais, incluindo todos os seguintes polinucleotídeos que codificam fragmentos de anticorpo: o polinucleotídeo SEQ ID NO: 271 que codifica a sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 131; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 272 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 273 que codifica a sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 133; o polinucleotídeo SEQ ID NO: 274 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134; polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; e SEQ ID NO: 277) da sequência variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 131 ou uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132; e polinucleotídeos que codificam as regiões determinantes de complementaridade (SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; e SEQ ID NO: 280) da sequência variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 133 ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134.
[00448] Em uma modalidade preferencial da invenção, polinucleotídeos da invenção compreendem, ou alternativamente consistem em, polinucleotídeos que codificam fragmentos Fab (fragmento de ligação ao antígeno) contendo especificidade de ligação para CGRP. Com relação ao anticorpo Ab14, os polinucleotídeos que codificam o anticorpo Ab14 completo compreendem, ou alternativamente consistem em, o polinucleotídeo SEQ ID NO: 272 que codifica a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 132; e o polinucleotídeo SEQ ID NO: 274 que codifica a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 134.
[00449] Outra modalidade da invenção contempla estes polinucleotídeos incorporados em um vetor de expressão para expressão em células de mamíferos como CHO, NSO, HEK-293, ou em sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras como a levedura Pichia. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris. Em uma modalidade da invenção descrita aqui (infra), fragmentos Fab podem ser produzidos por digestão enzimática (por exemplo, papaína) de Ab14 após a expressão de polinucleotídeos completos em um hospedeiro apropriado. Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP como Ab14 ou fragmentos Fab dos mesmos podem ser produzidos via expressão de Ab14 polinucleotídeos em células de mamíferos como células CHO, NSO ou HEK 293, sistemas de fungos, insetos ou microbianos como células de leveduras (por exemplo, levedura diploide como Pichia diploide) e outras cepas de leveduras. Espécies de Pichia apropriadas incluem, entre outros, Pichia pastoris.
[00450] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma sequência VH de aminoácido de anticorpo anti-CGRP selecionada de SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ou 133, ou que codificam uma variante da mesma em que pelo menos um resíduo estrutural (resíduo FR) foi substituído com um aminoácido presente na posição correspondente em um polipeptídeo VH de anticorpo de coelho anti-CGRP ou uma substituição de aminoácido conservada.
[00451] Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido VL de anticorpo anti-CGRP de 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ou 131, ou que codificam uma variante da mesma em que pelo menos um resíduo estrutural (resíduo FR) foi substituído com um aminoácido presente na posição correspondente em um polipeptídeo de VL de anticorpo de coelho anti-CGRP ou uma substituição conservada de aminoácido.
[00452] Ainda em outra modalidade, a invenção é direcionada a um ou mais polinucleotídeos heterólogos compreendendo uma sequência que codifica os polipeptídeos contidos na SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61 e SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:71 e SEQ ID NO:73; SEQ ID NO:81 e SEQ ID NO:83; SEQ ID NO:91 e SEQ ID NO:93; SEQ ID NO:101 e SEQ ID NO:103; SEQ ID NO:111 e SEQ ID NO:113; SEQ ID NO:121 e SEQ ID NO:123; ou SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:133.
[00453] Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um polinucleotídeo isolado que expressa um polipeptídeo contendo pelo menos uma CDR de polipeptídeo derivada de um anticorpo anti-CGRP em que dito polipeptídeo expresso isolado especificamente se liga CGRP ou especificamente liga CGRP quando expresso em associação com outra sequência de polinucleotídeo que expressa um polipeptídeo contendo pelo menos uma CDR de polipeptídeo derivada de um anticorpo anti-CGRP em que dita pelo menos uma CDR é selecionada das contidas nos polipeptídeos VL ou VH da SEQ ID NO: 1, 3, 11, 13, 21, 23, 31, 33, 41, 43, 51, 53, 61, 63, 71, 73, 81, 83, 91, 93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131, ou SEQ ID NO:133.
[00454] Células hospedeiras e vetores compreendendo ditos polinucleotídeos são ainda contempladas.
[00455] A invenção ainda contempla vetores compreendendo as sequências de polinucleotídeo que codificam as sequências de polipeptídeo de cadeia variável pesada e leve, bem como as regiões determinantes de complementaridade individuais (CDRs, ou regiões hipervariáveis), como estabelecidas aqui, bem como células hospedeiras compreendendo ditas sequências de vetor. Em uma modalidade da invenção, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Em outra modalidade da invenção, a célula hospedeira de levedura pertence ao gênero Pichia.
Triagem e isolamento de célula B
[00456] Em uma modalidade, a presente invenção contempla a preparação e isolamento de uma população de células B específicas de antígeno que podem ser usadas pra isolar pelo menos uma célula específica para o antígeno CGRP, que pode ser usado para produzir um anticorpo contra CGRP, que é específico a um antígeno CGRP desejado, ou uma sequência de ácido nucleico correspondente a dito um anticorpo. Métodos para preparar e isolar dita população clonal de células B específicas para antígeno são ensinados, por exemplo, em publicação de patente U.S. no. US 2007/0269868 para Carvalho- Jensen et al., a revelação da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Métodos para preparar e isolar dita população clonal de células B específicas para antígeno são ainda ensinados aqui nos exemplos. Métodos para "enriquecer" uma população celular por tamanho ou densidade são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, patente U.S. 5.627.052. Estas etapas podem ser usadas em adição ao enriquecimento da população celular por especificidade de antígeno.
Métodos para humanizar anticorpos
[00457] Em outra modalidade, a presente invenção contempla métodos para humanizar cadeias pesadas e leves de anticorpo. Métodos para produzir cadeias pesada e leve de anticorpo que podem ser aplicados aos anticorpos anti- CGRP são ensinados, por exemplo, na publicação do pedido de patente US 2009/0022659 para Olson et al., e na patente US 7.935.340 para Garcia-Martinez et al., as revelações das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
Métodos para produzir anticorpos e fragmentos dos mesmos
[00458] Em outra modalidade, a presente invenção contempla métodos para produzir anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos. Métodos para produzir anticorpos anti-CGRP e fragmentos dos mesmos secretados de cepas poliploidai, preferencialmente diploides ou tetraploides de leveduras competentes para reprodução são ensinadas, por exemplo, na publicação de pedido de patente US 2009/0022659 para Olson et al., e na patente US 7.935.340 para Garcia-Martinez et al., as revelações das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
[00459] Outros métodos para produzir anticorpos são bem conhecidos aos especialistas na técnica. Por exemplo, métodos para produzir anticorpos quiméricos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patente US 4.816.567 para Cabilly et al.; Morrison et al., P.N.A.S. USA, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-46 (1984), as revelados das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades).
[00460] Da mesma forma, outros métodos para produzir anticorpos humanizados são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, patentes US 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762, e 6.180.370 para Queen et al; patentes US. 5.225.539 e 6.548.640 para Winter; patentes US 6.054.297, 6.407.213 e 6.639.055 para Carter et al; patente US 6.632.927 para Adair; Jones, P.T. et al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al, Science, 239:1534-36 (1988), as revelações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades).
[00461] Polipeptídeos de anticorpos da invenção contendo especificidade de ligação a CGRP podem ainda ser produzidos por construção, usando técnicas convencionais bem conhecidas aos especialistas na técnica, um vetor de expressão contendo um operon e uma sequência de DNA que codifica uma cadeia pesada de anticorpo em que a sequência de DNA que codifica as CDRs requeridas para especificidade de anticorpo é direcionada a partir de uma célula não humana, preferencialmente uma fonte de célula B de coelho, enquanto a sequência de DNA que codifica as demais partes da cadeia de anticorpo é direcionada a partir de uma fonte de célula humana.
[00462] Um segundo vetor de expressão é produzido usando os mesmos meios convencionais bem conhecidos aos especialistas na técnica, dito vetor de expressão contendo um operon e uma sequência de DNA que codifica uma cadeia leve de anticorpo em que a sequência de DNA que codifica as CDRs requerida para especificidade de anticorpo é direcionada a partir de uma fonte de célula não humana, preferencialmente uma fonte de célula B de coelho, enquanto a sequência de DNA que codifica as demais partes da cadeia do anticorpo é direcionada a partir de uma fonte de célula humana.
[00463] Os vetores de expressão são transfectados em uma célula hospedeira por técnicas convencionais bem conhecidas aos especialistas na técnica para produzir uma célula hospedeira transfectadas, dita célula hospedeira transfectadas cultivada por técnicas convencionais bem conhecidas aos especialistas na técnica para produzir ditos polipeptídeos de anticorpo.
[00464] A célula hospedeira pode ser co-transfectada com os dois vetores de expressão descritos acima, o primeiro vetor de expressão contendo DNA que codifica um operon um polipeptídeo derivado de cadeia leve e o segundo vetor contendo DNA que codifica um operon e um polipeptídeo derivado de cadeia pesada. Os dois vetores contêm diferentes marcadores selecionáveis, mas preferencialmente atingem substancialmente expressam igual dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, o vetor incluindo DNA que codifica ambos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender cDNA, DNA genômico, ou ambos.
[00465] As células hospedeiras usadas para expressar os polipeptídeos de anticorpos podem ser uma célula bacteriana como E. coli, ou uma célula procariótica como P. pastoris. Em uma modalidade da invenção, uma célula de mamífero de um tipo bem definido para esta finalidade, como uma célula de mieloma, uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO), uma linhagem celular NSO, ou uma linhagem celular HEK293 podem ser usadas.
[00466] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, os métodos de transfecção requeridos para produzir a célula hospedeira e métodos de cultivo requeridos para produzir os polipeptídeos de anticorpos de ditas células hospedeiras todas incluem técnicas convencionais. Embora preferencialmente a linhagem celular usada para produzir o anticorpo é uma linhagem celular de mamífero, qualquer outra linhagem celular, como uma linhagem de célula bacteriana como uma cepa bacteriana derivada de E. coli, ou uma linhagem de célula de levedura, podem alternativamente ser usadas.
[00467] De modo semelhante, uma vez produzidos os polipeptídeos de anticorpos podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrões na técnica, como por exemplo, filtração de fluxo cruzado, precipitação por sulfato de amônio, cromatografia de coluna de afinidade, e semelhantes.
[00468] Os polipeptídeos de anticorpos descritos aqui podem ainda ser usados para o desenho e síntese de miméticos de peptídeo ou não peptídeo que poderiam ser úteis para as mesmas aplicações terapêuticas como os polipeptídeos de anticorpos da invenção. Ver, por exemplo, Saragobi et al, Science, 253:792-795 (1991), os conteúdos dos quais é aqui incorporado por referência em suas totalidades.
Ensaios de triagem
[00469] A invenção ainda inclui ensaios de triagem desenhados para assistir na identificação das doenças e distúrbios associadas com CGRP em pacientes que apresentam os sintomas de uma doença ou distúrbio associado a CGRP.
[00470] Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP da invenção, ou fragmentos CGRP de ligação ao mesmo, são usados para detectar a presença de CGRP em uma amostra biológica obtida de um paciente que apresenta sintomas de uma doença ou distúrbio associada com CGRP. A presença de CGRP, ou níveis elevados dos mesmos quando comparado aos níveis de pré-doença de CGRP em uma amostra biológica comparável, pode ser benéfica no diagnóstico uma doença ou distúrbio associada com CGRP.
[00471] Outra modalidade da invenção fornece um ensaio de diagnóstico ou triagem para assistir no diagnóstico de doenças ou distúrbios associados com CGRP em pacientes que apresentam sintomas de uma doença ou distúrbio associado com CGRP identificados aqui, compreendendo avaliar o nível de expressão de CGRP em uma amostra biológica de dito paciente usando um anticorpo anti-CGRP modificado após a tradução ou fragmento de ligação ao mesmo. O anticorpo anti-CGRP ou fragmento de ligação ao mesmo pode ser modificado após a tradução para incluir uma porção detectável como estabelecido anteriormente na revelação.
[00472] O nível de CGRP na amostra biológica é determinado usando um anticorpo anti-CGRP modificado ou fragmento de ligação ao mesmo como estabelecido aqui, e comparar o nível de CGRP na amostra biológica contra um nível de CGRP (por exemplo, o nível nas amostras biológicas normais). O médico especialista poderia entender que alguma variabilidade pode existir entre as amostras biológicas normais e poderia levar em consideração quando avalia os resultados. Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP da invenção podem ser usados para se correlacionar aos níveis de expressão de CGRP com um estágio particular de desenvolvimento de câncer. Um especialista na técnica poderia ser capaz de medir CGRP em vários sujeitos para estabelecer faixas de expressão de CGRP que correspondem aos estágios clinicamente definidos de desenvolvimento de câncer. Estas faixas irão permitir ao especialista medir CGRP em um sujeito diagnosticado com um câncer e se correlaciona aos níveis em cada sujeito com uma faixa que corresponde a um estágio de dito câncer. Um especialista na técnica poderia entender que medir CGRP no paciente em intervalos diferentes, a progressão do câncer pode ser determinada.
[00473] O ensaio mencionado acima pode ainda ser útil no monitoramento de uma doença ou distúrbio, onde o nível de CGRP obtido em uma amostra biológica de um paciente que se acredita ter uma doença ou distúrbio associado com CGRP é comparado com o nível de CGRP nas amostras biológicas anteriores do mesmo paciente, para definir se o nível de CGRP em ditos pacientes mudou com, por exemplo, um regime de tratamento.
[00474] A invenção é ainda direcionada para um método de gerar imagem in vivo que detecta a presença de células que expressam CGRP compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição diagnóstica. Dito imageamento in vivo é útil para a detecção ou imageamento de tumores ou metástases que expressam CGRP, por exemplo, e podem ser úteis como parte de um regime de planejamento para o desenho de um protocolo de tratamento efetivo do câncer. O protocolo de tratamento pode incluir, por exemplo, um ou mais de radiação, quimioterapia, terapia de citocina, terapia gênica, e terapia de anticorpo, bem como um anticorpo anti-CGRP ou fragmento do mesmo.
[00475] A presente invenção ainda fornece um kit para detectar a ligação de um anticorpo anti-CGRP da invenção a CGRP. Em particular, o kit pode ser usado para detectar a presença de um reativo especificamente a CGRP com um anticorpo anti-CGRP da invenção ou um fragmento imunorreativo do mesmo. O kit pode ainda incluir um anticorpo ligado a um substrato, um anticorpo secundário reativo com o antígeno e um reagente para detectar uma reação do anticorpo secundário com o antígeno. Dito kit pode ser um kit ELISA e pode compreender o substrato, anticorpos primários e secundários quando apropriados, e qualquer outro reagente apropriado como frações detectáveis, enzimas substratos, e reagentes de cor, por exemplo, como descrito aqui. O kit diagnóstico pode ainda estar na forma de um kit immunoblot. O kit diagnóstico pode ainda estar na forma de um kit quimioluminescente (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). O kit diagnóstico pode ainda ser um kit de detecção baseado em lantanídeo (PerkinElmer, San Jose, CA).
[00476] Um clínico especialista poderia entender que uma amostra biológica inclui, entre outras, soro, plasma, urina, saliva, mucosa, fluido pleural, fluido sinovial e fluido espinhal.
Métodos para melhorar ou reduzir os sintomas de ou tratar ou prevenir, doenças e distúrbios associados com CGRP
[00477] Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos, são úteis para melhorar ou reduzir os sintomas de, ou tratar, ou prevenir, doenças e distúrbios associados com CGRP. Anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos, bem como combinações, podem ainda ser administrados em uma quantidade terapeuticamente efetiva aos pacientes em necessidade de tratamento de doenças e distúrbios associados com CGRP na forma de uma composição farmacêutica como descrito em maiores detalhes abaixo.
[00478] Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos, são úteis para melhorar ou reduzir os sintomas de, ou tratar ou prevenir enxaquecas (com ou sem aura), perda de peso, câncer ou tumores, angiôgenese associada com câncer ou crescimento de tumor, angiôgenese associada com câncer ou sobrevida de tumor, dor, enxaquecas hemiplágicas, cefaleia em salvas, neuralgia enxaquecosa, dores de cabeça crônicas, dores de cabeça de tensão, dores de cabeça gerais, rubores quentes, hemicrania paroxisomal crônica, cefaleias secundárias devido a um problema estrutural subjacente na cabeça ou pescoço, neuralgia cranial, cefaleias de sinos (como, por exemplo, associada com sinusite), e cefaleias ou enxaquecas induzidas por alergia.
[00479] Em uma modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos e/ou com um segundo agente, são úteis para melhorar ou reduzir os sintomas de, ou tratar, ou prevenir, a seguinte listagem de doenças e distúrbios: dor, dor inflamatória, dor de incisão pós-operatória, síndrome de dor regional complexa, dor de câncer, dor de câncer ósseo primário ou metastático, dor de fratura, dor crônica, dor de fratura osteoporótica, dor resultante de queimadura, osteoporose, dor articular de gota, abdominal dor, dor associada com crise de célula falciforme, e outras dores nociceptivas, bem como carcinoma hepatocelular, câncer de mama, cirrose hepática, dor neurogênica, dor neuropática, dor nocicéptica, neuralgia trigeminal, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, fibromialgia, dor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatética de reflexo, dor neurogênica, osteoartrite ou dor de artrite reumatoide, dor lombar inferior, neuropatia diabética, ciática, ou dor ou dor visceral associada com: refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome de intestino irritável, cólon irritável, cólon espástico, colite mucosa, doença intestinal inflamatória, Doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenorreia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prostatite, pancreatite, cólica renal, dismenorreia, cistite, incluindo cistite intersticial (IC), cirurgia associada com o íleo, diverticulite, peritonite, pericardite, hepatite, apendicite, colite, colecistite, endometriose, pancreatite crônica e/ou aguda, infarto do miocárdio, dor renal, dor pleural, prostatite, dor pélvica, trauma em um órgão, dor nociceptiva crônica, dor neuropática crônica, dor inflamatória crônica, fibromialgia, dor avançada e dor persistente, e dor de câncer que surge de malignidade ou de câncer preferencialmente selecionado de um ou mais de: adenocarcinoma em tecido glandular, blastoma em tecido embrionário dos órgãos, carcinoma no tecido epitelial, leucemia em tecidos que formam células sanguíneas, linfoma em tecido linfático, mieloma em medula óssea, sarcoma em tecido conectivo ou de suporte, câncer adrenal, linfoma relacionado a AIDS, anemia, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, tumores carcinoides, câncer cervical, quimioterapia, câncer de cólon, citopenia, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer hepatobiliar, câncer renal, leucemia, câncer hepático, câncer pulmonar, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma, não Hodgkin, tumores do sistema nervoso, câncer oral, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer retal, câncer de pele, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer uretral, câncer ósseo, sarcomas câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue, câncer de medula óssea, mieloma múltiplo, leucemias, câncer ósseo primário ou secundário, tumores que metastizam ao osso, tumores que infiltram o nervo e vísceras ocas, tumores pertos de estruturais neurais. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor visceral, preferencialmente dor visceral que surge de câncer pancreático e/ou metástases no abdômen. Ainda preferencialmente a dor de câncer compreende dor somática, preferencialmente dor somática devido a um ou mais de câncer ósseo, metástase no osso, dor pós-cirúrgica, sarcomas câncer do tecido conectivo, câncer do tecido ósseo, câncer de células formadoras do sangue da medula óssea, mieloma múltiplo, leucemias, câncer ósseo primário ou secundário.
[00480] Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos e/ou com um segundo agente, são úteis para melhorar ou reduzis os sintomas de, ou tratar ou prevenir, a seguinte listagem não limitante de doenças e distúrbios: câncer ou tumores, angiôgenese associada com câncer ou crescimento de tumor, angiôgenese associada com câncer ou sobrevida de tumor.
[00481] Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos e/ou com um segundo agente, são úteis para melhorar ou reduzis os sintomas de, ou tratar ou prevenir, a seguinte listagem não limitante de doenças e distúrbios: dor neurogênica, neuropática ou nocicéptica. Dor neuropática pode incluir, entre outras, neuralgia trigeminal, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, fibromialgia, dor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatética de reflexo and dor neurogênica. Em outras modalidades preferenciais, osteoartrite ou dor de artrite reumatoide, dor lombar inferior, neuropatia diabética, ciática, e outras dores neuropáticas.
[00482] Em outra modalidade da invenção, anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou fragmentos dos mesmos e/ou com um segundo agente, são úteis para melhorar ou reduzis os sintomas de, ou tratar ou prevenir, a seguinte listagem não limitante de doenças e distúrbios: bexiga superreativa e outras condições urinárias, refluxo gastroesofágico e dor visceral associada com refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome de intestino irritável, doença intestinal inflamatória, Doença de Crohn, ileíte, colite ulcerativa, cólica renal, dismenorreia, cistite, período menstrual, parto, menopausa, prostatite, prurite, ou pancreatite. Ainda, os CGRP anticorpos e fragmentos de anticorpos objetos podem ser usados isolados ou em conjunto com outros agentes ativos, por exemplo, analgésicos opioides e não opioides como NSAIDs para induzir analgesia ou para potencializar a eficácia de outros analgésicos ou para prevenir ou aliviar a tolerância a um analgésico especifico como morfina ou analgésicos opioides relacionados. A evidência para o papel de CGRP no bloqueio/reversão do desenvolvimento de analgesia induzida por morfina: é o fato que antagonistas de receptor de CGRP8-37 e CGRP (BIBN4096BS) reportadamente previnem/revertem o desenvolvimento de tolerância à morfina -(Powell et al., 2000 J Brit J Pharmacol (131):875; Menard et al., 1996 J Neurosci (16):2342; Wang et al., 2009 FASEB J (23):2576; Wang et al., 2010 Pain (151):194)
[00483] Os anticorpos objetos potencialmente podem ser combinados com qualquer analgésico opioide ou NSAID ou outros analgésicos, potencialmente outro anticorpo para aumentar ou melhorar o gerenciamento da dor ou pra reverter ou suprimir a tolerância a um analgésico como um composto analgésico opioide. Isto pode permitir que ditos compostos analgésicos sejam administrados por uma duração maior ou em dosagens reduzidas, assim, potencializando o alívio de efeitos colaterais associados com este.
[00484] O termo "analgésico opioide" aqui refere-se a todas as fármacos, naturais ou sintéticas, ações tipo morfina. Os analgésicos opioides sintéticos e semissintéticos são derivados de cinco classes químicas de compostos: fenantrenos; fenilheptilaminas; fenilpiperidinas; morfinas; e benzomorfans, todas as quais estão dentro do escopo do termo. Analgésicos opioides exemplares incluem codeína, dihidrocodeína, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanil, buprenorfina, butorfanol, fentanil, sufentanil, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno e pentazocina ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00485] O termo "NSAID" refere-se a um composto anti-inflamatório não esteroidal. NSAIDs são categorizados em virtude de suas capacidades de inibir ciclooxigenase. Ciclooxigenase 1 e ciclooxigenase 2 são as duas principais isoformas de ciclooxigenase e NSAIDs mais padrões são inibidores mistos das duas isoformas. NSAIDs mais padrões estão dentro de uma das seguintes cinco categorias estruturais: (1) derivados de ácido propiônico, como ibuprofeno, naproxeno, naprosin, diclofenaco, e cetoprofeno; (2) derivados de ácido acético como tolmetina e slindac; (3) derivados de ácido fenâmico, como ácido fenâmico e ácido meclofenâmico; (4) derivados de ácido bifenilcarboxílico, como diflunisal e flufenisal; e (5) oxicams, como piroxim, sudoxicam, e isoxicam. Outra classe de NSAID foi bem descrita que seletivamente inibe a ciclooxigenase 2. Inibidores de Cox-2 foram descritos, por exemplo, nas patentes US 5.616.601; 5.604.260; 5.593.994; 5.550.142; 5.536.752; 5.521.213; 5.475.995; 5.639.780; 5.604.253; 5.552.422; 5.510.368; 5.436.265; 5.409.944; e 5.130.311, todas as quais são aqui incorporadas por referência. Certos inibidores exemplares de COX-2 incluem celecoxib (SC-58635), DUP-697, flosulide (CGP-28238), meloxicam, ácido 6- metoxi-2 naftilacético (6-MNA), rofecoxib, MK-966, nabumetona (profármaco para 6-MNA), nimesulida, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; ou combinações dos mesmos.
[00486] Em algumas modalidades, aspirina e/ou acetaminofeno podem ser tomados em conjunto com anticorpo CGRP ou fragmento objetos. Aspirina é outro tipo de composto anti-inflamatório não esteroidal.
[00487] Doenças e distúrbios exemplares não limitantes que podem ser tratadas e/ou prevenidas pela administração de anticorpos CGRP da presente invenção incluem, dor resultante de qualquer condição associada com dor neurogênica, neuropática, inflamatória, térmica ou nocicéptica. Preferencialmente o distúrbio será associado com CGRP aumentada no local da dor. Em certas modalidades de dor neuropática, referenciada neuralgia trigeminal, neuralgia pós-herpética, dor de membro fantasma, fibromialgia, distrofia simpatética de reflexo e dor neurogênica são condições preferencialmente tratadas. Em outras modalidades, dor de câncer, particularmente, dor de câncer ósseo, osteoartrite ou dor de artrite reumatoide, dor lombar inferior, dor de incisão pós-operatória, dor de fratura, dor de fratura osteoporótica, osteoporose, dor articular de gota, neuropatia diabética, ciática, dores associadas com crises de falciforme, enxaqueca, e outras dores neuropáticas e/ou dor nocicéptica são preferencialmente tratadas. Assim, a presente invenção inclui métodos para tratar, prevenir, e/ou melhorar qualquer doença ou distúrbio associada com atividade de CGRP ou regulação para cima de CGRP (incluindo qualquer uma das doenças, distúrbios e condições exemplares acima mencionados) através do uso de anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção. Os métodos terapêuticos da presente invenção compreendem administrar a um sujeito qualquer formulação compreendendo um anticorpo anti-CGRP como revelado aqui isolado ou em associação com outro agente de atividade.
[00488] O sujeito em que a formulação farmacêutica é administrada pode ser, por exemplo, qualquer humano ou animal não humano que está em necessidade de dito tratamento, prevenção e/ou melhora, ou poderia, de outra forma se beneficiar da inibição ou atenuação de atividade mediada por CGRP. Por exemplo, o sujeito pode ser um indivíduo que é diagnosticado com, ou que é considerado em risco de ser afligido por qualquer uma das doenças ou distúrbios acima mencionados. A presente invenção ainda inclui o uso de qualquer formulação farmacêutica revelada aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção e/ou alívio de qualquer doença ou distúrbio associado com atividade de CGRP (incluindo qualquer um de doenças, distúrbios e condições exemplares acima mencionados).
Administração
[00489] Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou CGRP fragmentos de ligação ao mesmo, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmento de anticorpos, são administrados a um sujeito em uma concentração de entre cerca de 0,1 e 100,0 mg/kg de peso corporal do sujeito receptor. Em uma modalidade preferencial da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou CGRP fragmentos de ligação ao mesmo, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmento de anticorpos, são administrados a um sujeito em uma concentração de cerca de 0,4 mg/kg de peso corporal do sujeito receptor. Em uma modalidade preferencial da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou CGRP fragmentos de ligação ao mesmo, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmento de anticorpos, são administrados a um sujeito receptor com uma frequência de uma vez a cada vinte e seis semanas ou menos, como uma vez a cada dezesseis semanas ou menos, uma vez a cada oito semanas ou menos, uma vez a cada quatro semanas ou menos, uma vez a cada duas semanas ou menos, uma vez a cada semana ou menos, ou uma vez ao dia ou menos.
[00490] Os fragmentos Fab podem ser administrados a cada duas semanas ou menos, a cada semana ou menos, uma vez ao dia ou menos, várias vezes ao dia, e/ou em a cada algumas horas. Em uma modalidade da invenção, um paciente que recebe fragmentos Fab de 0,1 mg/kg a 40 mg/kg por dia administrado em doses divididas de 1 a 6 vezes ao dia, ou em uma forma de liberação sustentada, efetiva para obter os resultados desejados.
[00491] Deve ser entendido que a concentração do anticorpo ou Fab administrado a um determinado paciente pode ser maior ou menor do que as concentrações de administração exemplares estabelecidas acima nos parágrafos [0552] e [0553].
[00492] Um especialista na técnica poderia ser capaz de determinar uma dosagem efetiva e frequência de administração através de experimentação de rotina, por exemplo, guiado pela revelação aqui e os ensinamentos em Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C., & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; and Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.
[00493] Em outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou CGRP fragmentos de ligação ao mesmo, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmento de anticorpos, são administrados a um sujeito em uma formulação farmacêutica.
[00494] Uma "composição farmacêutica" refere-se a uma composição química ou biológica apropriada para administração a um mamífero. Ditas composições podem ser especificamente formuladas para administração via um ou mais de um número de vias, incluindo entre outras bucal, epicutânea, epidural, inalação, intraarterial, intracardial, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinhal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, retal via um enema ou supositório, subcutânea, subdérmica, sublingual, transdérmica, e transmucosal. Além disso, a administração pode ocorrer por meio de injeção, pó, líquido, gel, gotas ou outros meios de administração.
[00495] Em uma modalidade da invenção, os anticorpos anti-CGRP descritos aqui, ou CGRP fragmentos de ligação ao mesmo, bem como combinações de ditos anticorpos ou fragmento de anticorpos, podem ser opcionalmente administrados em combinação com um ou mais agentes ativos. Ditos agentes ativos incluem agentes analgésicos, anti-histamina, antipiréticos, anti-inflamatórios, antibiótico, antiviral, e anti-citocina. Agentes ativos incluem agonistas, antagonistas, e moduladores de TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL- 13, IL-18, IFN-α, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, fator de crescimento de hepatócito (HGF), Hepcidina, incluindo anticorpos reativos contra qualquer um dos seguintes, e anticorpos reativos contra qualquer um de seus receptores. Agentes ativos ainda incluem entre outros ácidos 2- Arilpropionicos, Aceclofenac, Acemetacina, ácido Acetilsalicílico (Aspirina), Alclofenac, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, ácidos Arilalcanoicos, Azapropazona, Benorilato/Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenac, Carprofeno, Celecoxib, salicilato de magnésio de colina, Clofezona, inibidores de COX-2, Dexibuprofenoo, Dexcetoprofeno, Diclofenaco, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenamicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, ácido Flufenâmico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Cebuzona, Cetoprofeno, Cetorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de magnésio, Ácido meclofenâmico, ácido Mefenâmico, Meloxicam, Metamizole, Metil salicilato, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, ácidos N-Arilantranílicos, fator de crescimento de nervo (NGF), Oxametacina, Oxaprozina, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Rofecoxib, salicilato Salicil, Salicilamida, Salicilatos, substância P, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprofenoico, ácido Tolffenâmico, Tolmetina, e Valdecoxib.
[00496] Um anti-histamínico pode ser qualquer composto que opõe a ação de histamina ou sua liberação das células (por exemplo, mastócitos). Anti- histamínicos incluem entre outros acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizina, levocabastina, loratidina, metscopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometazina, pirilamina, terfenadina, e tranilast.
[00497] Antibióticos incluem entre outros Amicacina, Aminoglicosideos, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotin, Cefalotin, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitin, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas, Cloramfenicol, Cilastatin, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistin, Co-trimoxazol, Dalfopristin, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, ácido fusídico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopeptidaos, Herbimicina, Imipenem, Isoniazid, Canamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linazolid, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrolidaos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactams, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipeptídeos, Prontosil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametazol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimatoprima, Trimatoprima-Sulfametoxazol, Trolandomicina, Trovafloxacina, e Vancomicina.
[00498] Agentes ativos ainda incluem Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, Cortisona acetato, Deoxicorticosterona acetato, Dexametasona, Fludrocortisona acetato, Glicocorticoides, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides, e Triamcinolona. Qualquer combinação apropriada destes agentes ativos é ainda contemplada.
[00499] Um "excipiente farmacêutico" ou um "excipiente farmaceuticamente aceitável" é um carreador, geralmente um líquido, em que um agente terapêutico ativo é formulado. Em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico ativo é um anticorpo humanizado descrito aqui, ou um ou mais fragmentos dos mesmos. O excipiente geralmente não fornece qualquer atividade farmacológica à formulação, embora isto possa forencer estabilidade química e/ou biológica, e características de liberação. Formulações exemplares podem ser encontradas, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Grennaro, A., Ed., 1995 que é incorporado por referência.
[00500] Como usado aqui "carreador farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente" incluem qualquer um e todos os solventes, meio de dispersa, revestimentos e agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção que são fisiologicamente compatíveis. Em uma modalidade, o carreador é apropriado para administração parenteral. Alternativamente, o carreador pode ser apropriado para administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, ou sublingual. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de ditos meios e agentes para substâncias ativas farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Compostos ativos complementares podem ainda ser incorporados nas composições.
[00501] Composições farmacêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis em condições de fabricação e armazenamento. A invenção contempla que a composição farmacêutica está presente na forma liofilizada. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada apropriada para uma concentração alta da fármaco. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido), e misturas apropriadas dos mesmos. A invenção ainda contempla a inclusão de um estabilizador na composição farmacêutica. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes.
[00502] Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoois como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada por inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina. Além disso, o polipeptídeo alcalino pode ser formulado em uma formulação de liberação no tempo, por exemplo, em uma composição que inclui um polímero de liberação lenta. Os compostos ativos podem ser preparados com carreadores que irão proteger o composto contra liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsuladas. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, como etileno vinil acetato, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico, copolímeros poliglicólicos (PLG). Muitos métodos para a preparação de ditas formulações são conhecidos aos especialistas na técnica.
[00503] Para cada uma das modalidades mencionadas, os compostos podem ser administrados por uma variedade de formas de dosagem. Qualquer forma de dosagem biologicamente aceitável conhecida aos especialistas na técnica, e combinações dos mesmos, são contempladas. Exemplos de ditas formas de dosagens incluem, entre outras, pós reconstituíveis, elixires, líquidos, soluções, suspensões, emulsões, pós, grânulos, partículas, micropartículas, grânulos dispersíveis, cachês, inalantes, inaladores de aerossóis, adesivos, inalantes em partículas, implantes, implantes em depósitos (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, e intradérmica), infusões e combinações dos mesmos.
[00504] A descrição acima de várias modalidades ilustradas da invenção não pretende ser exaustiva ou limitar a invenção à forma precisa revelada. Enquanto modalidades específicas de, e exemplos para, a invenção são descritos aqui para fins ilustrativos, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da invenção, como os especialistas na técnica reconhecerão. Os ensinamentos fornecidos aqui da invenção podem ser aplicados a outras finalidades, além dos exemplos descritos acima.
[00505] Estas e outras alterações podem ser realizadas em uma invenção à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretadas para limitar a invenção às modalidades reveladas específicas e as reivindicações. Assim, a invenção não é limitada pela revelação, mas, por outro lado, o escopo da invenção deve ser determinada totalmente pelas seguintes reivindicações.
[00506] A invenção pode ser praticada nas formas além daquelas particularmente descritas na descrição acima e exemplos. Várias modificações e variações da invenção são possíveis na luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo e das reivindicações anexadas.
[00507] Certos ensinamentos relacionados aos métodos para obter uma população clonal de células B específicas para antígeno foram revelados no pedido de patente provisório US 60/801.412, depositado dia 19 de maio de 2006, a revelação das quais é aqui incorporados por referência em sua totalidade.
[00508] Certos ensinamentos relacionados a humanização de anticorpos monoclonais derivados de coelho e modificações sequenciais preferenciais para manter a afinidade de ligação ao antígeno foram revelados no pedido internacional PCT/US2008/064421, correspondendo à publicação internacional WO/2008/144757, intitulado "Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies", depositado em 21 de maio de 2008, a revelação das quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[00509] Certas técnicas relacionadas para produzir anticorpos ou fragmentos dos mesmos usando levedura de reprodução competente e métodos correspondentes foram revelados no pedido de patente US 11/429.053, depositado em 8 de maio de 2006, (publicação de pedido de patente US2006/0270045), a revelação das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00510] Certos polinucleotídeos and polipeptídeos de anticorpos CGRP são revelados na listagem de sequência que acompanha este depósito de pedido de patente, e a revelação de dita listagem de sequência é aqui incorporada por referencia em sua totalidade.
[00511] A revelação completa de cada documento citado (incluindo patentes, pedido de patentes, artigos científicos, resumos, manuais, livros ou outras revelações) no Fundamento da invenção, descrição detalhada, e exemplos é aqui incorporada por referência em suas totalidades.
[00512] Os seguintes exemplos são colocados para fornecer aos especialistas na técnica com uma revelação e descrição completas de como preparar o uso de invenção objeto e não pretendem limitar o escopo do que está relacionado com a invenção. Esforços foram realizados para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser contabilizados. Salvo se indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio do peso, a temperatura é em graus centigrados, e a pressão é ou está próxima a da atmosférica.
EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação de Anticorpos que ligam CGRP
[00513] Ao usar o protocolo de seleção de anticorpo descrito aqui, pode-se gerar um painel extensivo de anticorpos.
Estratégia de imunização
[00514] Os coelhos foram imunizados com CGRP0 humano (American Peptides, Sunnyvale CA and Bachem, Torrance CA). A imunização consistiu de uma primeira injeção subcutânea (sc) de 100 μg de antígeno misturado com 100 μg de KLH em adjuvante completo de Freund (CFA) (Sigma) seguido por dois impulsos, duas semanas separadas cada uma contendo 50 μg antígeno misturado com 50 μg em adjuvante incompleto de Freund (IFA) (Sigma). Os animais foram sangrados no dia 55, e os títulos de soro foram determinados por ELISA (reconhecimento de antígeno) e por inibição de aumento de cAMP direcionada a CGRP em SK-N-MC.
Avaliação de título de seleção de anticorpo
[00515] Para identificar e caracterizar anticorpos que se ligam ao CGRP0 humano, soluções contendo anticorpo foram testadas por ELISA. Resumidamente, placas revestidas por neutravidina (Thermo Scientific), foram revestidas com N-term biotiniladoCGRPα humano(50μL por poço, 1 μ g/mL) diluídas em tampão ELISA (0,5% gelatina de pele de peixe em PBS pH 7,4,) por aproximadamente 1 hora em temperatura ambiente ou alternativamente durante a noite a 4°C. As placas foram então bloqueadas com tampão ELISA por uma hora em temperatura ambiente e lavadas usando tampão de lavagem (PBS, 0,05% tween 20). Amostras de soro testadas foram serialmente diluídas usando tampão ELISA. Cinquenta microlitros de amostras de soro diluídas foram transferidos em poços e incubados por uma hora em temperatura ambiente por uma hora. Após esta incubação, a placa foi lavada com tampão de lavagem. Para o desenvolvimento um anti- Fc-HARP específico de coelho (1:5000 diluição em tampão ELISA) foi adicionado aos poços por 45 min em RT. Após uma etapa de lavagem 3x com solução de lavagem, a placa foi desenvolvida usando TMB substrato por dois minutos em temperatura ambiente e a reação foi extinta usando 0,5M HCl. A absorbância do poço foi lida a 450 nm.
Determinação do título de amostras de soro por atividade funcional (inibição de níveis de cAMP direcionadas por CGRP)
[00516] Para identificar e caracterizar anticorpos com atividade funcional, um ensaio de inibição de aumento direcionado por CGRP de níveis de cAMP foi realizado usando eletroquimioluminescência (Meso Scale Discovery, MSD). Resumidamente, preparações de anticorpo a serem testadas foram serialmente diluídas em tampão de ensaio MSD (Hepes, MgCl2, pH 7,3, 1mg/mL bloqueador A, Meso Scale Discovery) em uma placa de poliestireno de fundo redondo de 96 poços (Costar). A esta placa, o CGRP0 humano foi adicionado (10ng/mL concentração final) diluído em tampão de ensaio MSD e incubado por uma hora a 37°C. Os controles apropriados foram usados como sugerido pelo fabricante de kit do ensaio. Células de neuroepitelioma humanas (SK-N-MC, ATCC) foram detectadas usando uma solução EDTA (5mM em PBS) e lavadas usando meio de crescimento (MEM, 10% FBS, antibióticos) por centrifugação. O número de célula foi ajustado para 2 milhões de células por mL em tampão de ensaio, e IBMX (3-Isobutil-1Metilxantina, Sigma) foi adicionado a uma concentração final de 0,2mM imediatamente antes de carregar as células na placa de ensaio de cAMP. Após a solução de anticorpo CGRP α foi incubada por uma hora 20 microlitros de solução contendo as células foram transferidas a uma placa de ensaio cAMP. Todas as amostras testadas correram em duplicadas com os controles apropriados. Dez microlitros de células foram adicionadas aos poços e a placa foi incubada por 30 minutes com agitação em temperatura ambiente. Enquanto as células estavam sendo incubadas com a solução de CGRP, a solução de parada foi preparada em uma solução de 1:200 de cAMP marcado por TAG (MSD) em tampão de lise (MSD). Para interromper a incubação de células-CGRP, 20 microlitros de solução de parada e as células e a placa foram incubadas por uma hora com agitação em temperatura ambiente. O tampão de leitura (MSD) foi diluído quatro vezes com água e 100 microlitros foram adicionados aos poços na placa. A placa foi então lida usando um Sector Imager 2400 (MSD) e o software Prism foi usado para ajustar os dados e determinação de IC50.
Coleta de tecido
[00517] Uma vez que os títulos aceitáveis foram estabelecidos, os coelhos foram sacrificados. Baço, linfonodos e sangue total foram coletados e processados como a seguir:
[00518] Baço e linfonodos foram processados em uma suspensão celular única dissociando o tecido e empurrando através de fio estéril malha 70 μm (Fisher) com um êmbolo de uma seringa de 20 cc. As células foram coletadas em PBS. As células foram lavadas duas vezes por centrifugação. Após a última lavagem, a densidade celular foi determinar por azul de tripano. As células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos; o sobrenadante foi descartado. As células foram resusspensas no volume apropriado de 10% dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma) em FBS (Hyclone) e dispensados a 1 ml/frasco. Os fracos foram armazenados a -70°C em uma câmara de congelamento lento por 24 horas e armazenados em nitrogênio líquido.
[00519] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por mistura de sangue total com partes iguais no meio baixo em glicose descrito acima sem FBS. 35 ml de mistura de sangue total foi cuidadosamente separado em camada de 8 ml de linfócito de coelho (Cedarlane) em um tubo cônico 45 ml (Corning) e centrifugado 30 minutos a 2500 rpm em temperatura ambiente sem quebras. Após centrifugação, as camadas PBMC foram cuidadosamente removidas em uma pipeta Pasteur de vidro (VWR), combinadas e colocadas em um frasco limpo de 50 ml. As células foram lavadas duas vezes com o meio modificado descrito acima por centrifugação a 1500 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente, e a densidade celular foi determinada por coloração com azul de tripano. Após a última lavagem as células foram novamente suspensas em um volume apropriado de meio 10% DMSO/FBS e congelado como descrito acima.
Seleção de célula B, enriquecimento e condições de cultura
[00520] No dia de ajuste de cultura de célula B, frascos de PBMC, esplenócito, ou linfonodos foram descongelados para uso. Os frascos foram removidos de tanque LN2 e colocados em um banho de água de 37°C até descongelado. Os conteúdos dos fracos foram transferidos em um tubo de centrífuga cônico de 15 ml (Corning) e 10 ml de RPMI modificado descrito acima foi lentamente adicionado ao tubo. As células foram centrifugadas por 5 minutos a 2K RPM; o sobrenadante foi descartado. As células foram novamente suspensas em 10 ml de meio fresco. A densidade e viabilidade de células foi determinado por azul tripano.
a) O seguinte protocolo foi usado para Ab1 e Ab13
[00521] As células foram pré-misturadas com o CGRP α humano biotinilado como a seguir. As células foram novamente lavadas e novamente suspensas em meio 1E07 células/80 μL. CGRP α humana biotinilado foi adicionado à suspensão celular na concentração final de 5 ug/mL e incubado por 30 minutos a 4°C. CGRP α biotinilado não ligado foi removido realizando duas lavagens 10 ml usando PBF [PBS sem Ca /Mg (Hyclone), 2 mM ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), 0,5% albumina sérica humana (BSA) (Sigma isento de biotina)]. Após a segunda lavagem, as células foram novamente suspensas a 1E07 células/80 μl PBF e 20 μl de esferas de MACS® estreptavidina (Miltenyi Biotech, Auburn CA) por 10E7 células foram adicionados à suspensão celular. As células e esferas foram incubadas a 4°C por 15 minutos e lavadas uma vez com 2 ml de PBF por 10E7 células.
b) O seguinte protocolo foi usado para Ab4, Ab7, Ab9 e Ab11:
[00522] O CGRP α humano biotinilado foi pré-carregado nas esferas de estreptavidina como a seguir. Setenta e cinco microlitros de esferas de estreptavidina (Milteny Biotec, Auburn CA) foram misturados com huCGRPα biotinilado N-terminalmente (10ug/ml concentração final) e 300 μ l PBF. Esta mistura foi incubada a 4°C por 30 min e CGRP α humano biotinilado não ligado foi removida usando uma coluna de separação MACS® (Miltenyi Biotec, com uma rinsagem de 1ml para remover o material não ligado). Então o material foi extraído, então usado para ressuspender as células acima em 100ul per 1E7 células, a mistura foi então incubada a 4°C por 30min e lavada uma vez com 10 ml de PBF.
[00523] Para ambos os protocolos a) e b) o seguinte é aplicado: Após lavagem, as células foram novamente suspensas em 500μl de PBF e colocadas de lado. Uma coluna MACS® MS (Miltenyi Biotec, Auburn CA) foi pré-rinsada com 500 ml de PBF em uma fita magnética (Milteni). A suspensão celular foi aplicada à coluna por um pré-filtro, e a porção não ligada foi coletada. A coluna foi lavada com 2,5 ml de tampão PBF. A coluna foi removida da fita magnética e colocada em um tubo eppendorf claro, estéril de 1,5 ml. 1 ml de tampão PBF foi adicionado ao topo da coluna e as células selecionadas positivas foram coletadas. O rendimento e a viabilidade de porção de célula positiva foram determinados por coloração de azul tripano. A seleção positiva gerou uma média de 1% da concentração inicial de célula.
[00524] Uma triagem de célula piloto foi estabelecida para fornecer informações em níveis de semeadura para a cultura. As placas foram semeadas a 10, 25, 50, 100, ou 200 B células enriquecidas/poço. Além disso, cada poço continha 50K células/poço de células EL-4.B5 irradiadas (5.000 Rads) e um nível apropriado de sobrenadante de célula T ativada de coelho (ver publicação de pedido de patente US 20070269868) (variando de 1-5% dependendo da preparação) em meio RPMI modificado por alto em um volume final de 250 μl/poço. As culturas foram incubadas por 5 a 7 dias a 37°C em 4% CO2.
Triagem de cultura de célula B por reconhecimento de antígeno (ELISA)
[00525] Para identificar poços que produzem anticorpos anti-CGRP00 humanos, o mesmo protocolo como descrito para a determinação de titulo de amostras séricas por reconhecimento de antígeno (ELISA) foi usado com as seguintes alterações. Resumidamente, placas revestidas por neutravidina foram revestidas com uma mistura de CGRP α humano biotinilado N- e C- terminalmente (50 μL por poço, 1 μg/mL cada). As amostras de sobrenadante de célula B (50 μL) foram testadas sem diluição anterior.
Identificação de atividade funcional em sobrenadantes de célula B usando produção de cAMP direcionada por CGRP
[00526] Para determinar a atividade funcional contida em sobrenadantes de célula B, um procedimento semelhante ao descrito para a determinação do título funcional de amostras séricas foi usada com as seguintes modificações. Resumidamente, sobrenadante de célula B (20 μL) foram usados no lugar de amostras séricas policlonais diluídas.
Isolamento de células B específicas de antígeno
[00527] As placas contendo poços de interesse foram removidas de -70 °C, e as células de cada poço foram recuperadas usando cinco lavagens de 200 microlitros de meio (10% RPMI completo, 55 μM BME) por poço. As células recuperadas foram peletizadas por centrifugação e o sobrenadante foi cuidadosamente removido. As células peletizadas foram novamente suspensas em 100 μl de meio. Para identificar as células que expressam anticorpo, esferas magnéticas revestidas por estreptavidina (M280 dynabeads, Invitrogen) foram revestidas com uma combinação de CGRP0 humano biotinilado N- e C- terminal. Lotes de CGRP α humano biotinilados individuais foram otimizados por diluição serial. Cem microlitros contendo aproximadamente 4x10E7 de esferas revestidas foram então misturadas com as células ressuspensas. À esta mistura 15 microlitros de IgG de cabra anti-H&L de coelho-FITC (Jackson Immunoresearch) diluído 1:100 em meio foram adicionados.
[00528] Vinte microlitros de suspensão célula/esferas/anti- H&L de coelho foram removidos e gotículas de 5 microlitros foram dispensadas em uma lâmina de vidro de um poço anteriormente tratada com Sigmacote (Sigma) totalizando 35 a 40 gotículas por lâmina. Uma barreira impermeável de óleo de parafina (JT Baker) foi usada para submergir as gotículas e a lâmina foi incubada por 90 minutos a 37°C em uma incubadora de 4% CO2 no escuro.
[00529] Células B específicas que produzem anticorpo podem ser identificadas pelo anel fluorescente ao redor produzido por secreção de anticorpo, reconhecimento de antígeno biotinilado associado à esfera, e detecção subsequente pelo reagente de detecção de IgG fluorescente. Uma vez uma célula de interesse foi identificada esta foi recuperada através de um micromanipulador (Eppendorf). A célula única sintetizando e exportando o anticorpo foi transferida em um tubo de microcentrífuga, congelada usando gelo seco e armazenada a -70°C.
Amplificação e determinação de sequência de sequências de anticorpo de células B específicas para o antígeno
[00530] As sequências de anticorpo foram recuperadas usando um método baseado em RT-PCR combinado de uma única célula B isolada. Iniciadores contendo enzimas de restrição foram desenhados para anelar em regiões conservadas e constantes do gene de imunoglobulina alvo (pesada e leve), como sequências de imunoglobulina de coelho, e uma recuperação de PCR ninho de duas etapas foi usado para amplificar a sequência de anticorpo. Amplicons de cada poço foram analisados para recuperação e integridade de tamanho. Os fragmentos resultantes são então digeridos com AluI para mapear a clonalidade de sequência. Sequências idênticas apresentaram um padrão de fragmentação comum em suas análises eletroforéticas. Os fragmentos originais amplicon de cadeia pesada e leve foram então digeridos usando os sítios de enzimas de restrição contidos dentro dos iniciadores de PCR e clonados em um vetor de expressão. O vetor contendo fragmentos de DNA subclonados foram amplificados e purificados. A sequência de cadeias pesadas e leves subclonadas foram verificadas antes da expressão.
Produção recombinante de anticorpo monoclonal de propriedades de especificidade ao antígeno e/ou funcionais desejadas
[00531] Para determinar a especificidade de antígeno e propriedades funcionais de anticorpos específicos de células B recuperados, os vetores que direcionam a expressão das sequências de cadeia pesada e leve pareados desejadas foram transfectados em células HEK-293.
Reconhecimento de antígeno de anticorpos recombinantes por ELISA
[00532] Para caracterizar os anticorpos expressos recombinantes para suas capacidades e se ligar ao CGRP0 humano000 soluções contendo anticorpos foram testados por ELISA. Todas as incubações foram realizadas em temperatura ambiente. Resumidamente, placas Immulon IV (Thermo Scientific) foram revestidas com uma solução contendo CGRP α (1ut/mL em PBS) por 2 horas. Placas revestidas com CGRPEEforam então lavadas em tampão de lavagem (PBS, 0,05% Tween-20). As placas foram então bloqueadas usando uma solução de bloqueio (PBS, 0,5% gelatina de pele de peixe, 0,05% Tween-20) por aproximadamente uma hora. A solução de bloqueio foi então removida e as placas foram então incubadas com uma série de diluição do anticorpo sendo testados por aproximadamente uma hora. Ao fim desta incubação, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem e ainda incubada com uma solução contendo anticorpo secundário (Peroxidase conjugada affinipure fragmento anti-IgG humano F(ab’)2 de cabra, específico de fragmento Fc (Jackson Immunoresearch) por aproximadamente 45 minutos e lavado três vezes. Neste ponto uma solução de substrato (substrato TMB peroxidase, BioFx) e incubada por 3 a 5 minutos no escuro. A reação foi interrompida por adição de uma solução contendo HCl (0,5M) e a placa foi lida a 450 nm em um leitor de placa.
[00533] Resultados: Figuras 15-18 demonstram que anticorpos anti-CGRP Ab1-Ab14 se ligam e reconhecem CGRPα.
Caracterização funcional de anticorpos recombinantes por modulação de níveis de cAMP intracelulares direcionados por CGRP e reatividade cruzada aos ratos
[00534] Para caracterizar anticorpo expresso recombinante para suas capacidades de inibir níveis celulares aumentados de ensaio de cAMP mediados por CGRP α, um kit de ensaio eletroquimioluminescência (Meso Scale Discovery, MSD) foi usado. Resumidamente, preparações de anticorpo a serem testadas foram serialmente diluídas em tampão de ensaio MSD (Hepes, MgCl2, pH 7,3, 1mg/mL bloqueador A, Meso Scale Discovery) em uma placa de poliestireno de fundo redondo de 96 poços (Costar). A esta placa, o CGRPα humano foi adicionado (25ng/mL concentração final) diluído em tampão de ensaio MSD e incubado por uma hora a 37°C. Os controles apropriados foram usados como sugerido pelo fabricante de kit do ensaio. Células de neuroepitelioma humanas (SK-N-MC, ATCC) foram detectadas usando uma solução EDTA (5mM em PBS) e lavadas usando meio de crescimento (MEM, 10% FBS, antibióticos) por centrifugação. O número de célula foi ajustado para 2 milhões de células por mL em tampão de ensaio, e IBMX (3-Isobutil-1Metilxantina, 50mM Sigma) foi adicionado a uma concentração final de 0,2mM imediatamente antes de carregar as células na placa de ensaio de cAMP. A solução de anticorpo CGRPα foi incubada por uma hora após o qual 20 microlitros de solução contendo as células foram transferidas a uma placa de ensaio cAMP. Todas as amostras testadas correram em duplicadas com os controles apropriados. Dez microlitros de células foram adicionados aos poços e a placa foi incubada por 30 minutos com agitação. Enquanto as células estavam sendo incubadas com a solução de CGRP, a solução de parada foi preparada em uma solução de 1:200 de cAMP marcado por TAG (MSD) em tampão de lise (MSD). Para interromper a incubação de células-CGRP, 20 microlitros de solução de parada e as células e a placa foram incubadas por uma hora com agitação. O tampão de leitura (MSD) foi diluído quatro vezes com água e 100 microlitros foram adicionados aos poços na placa. A placa foi então lida usando um Sector Imager 2400 (MSD) e o software Prism foi usado para ajustar os dados e determinação de IC50.
[00535] Para testar a capacidade de anticorpos recombinantes em antagonizar CGRPβ humano um ensaio semelhante foi realizado com a substituição de agonista de CGRP (CGRPβ 10ng/mL concentração final). A avaliação dos anticorpos recombinantes em reconhecer e inibir geração de cAMP mediada por CGRP foi conduzida usando CGRP de rato (5ng/mL concentração final) e a linhagem celular L6 de rato (ATCC).
[00536] Resultados: Figuras 19-37 demonstram que os anticorpos anti- CGRP Ab1-Ab14 inibem CGRPαEECGRPβ, e níveis celulares aumentados de cAMP mediados por CGRP.
Exemplo 2: Produção enzimática de fragmentos Fab
[00537] Digestões por papaína foram conduzidos usando papaína imobilizada (Thermo/Pierce) como por instruções do fabricante. Resumidamente, anticorpos purificados foram incubados em um tampão contendo cisteína/HCl com papaína imobilizada a 37°C com balanço suave. A digestão foi monitorada tomando uma alíquota e analisando usando SDS-PAGE para clivagem da cadeia pesada. Para interromper a reação, a papaína imobilizada foi girada e lavada usando 50 mM Tris pH 7,5 e filtrada. Anticorpo completo não digerido e fragmentos Fc foram removidos usando uma coluna MabSelectSure (GE).
Exemplo 3 Expressão em célula de levedura Construção de vetores de expressão de Pichia pastoris para cadeia pesada e leve.
[00538] Os fragmentos de cadeia leve e pesadas foram comercialmente sintetizados e subclonados em um vetor de expressão pGAP. O vetor de expressão pGAP usa o promotor GAP para direcionar a expressão da cadeia de imunoglobulina e a sequência líder de albumina sérica humana (HSA) para exportar. Além disso, este vetor contém elementos comuns como uma origem bacteriana de replicação, e uma cópia de gene de resistência a canamicina que confere resistência ao antibiótico G418 em P. pastoris. G418 fornece um meio de seleção para cepas que contém o vetor de expressão desejado integrado nos seus genomas.
Transformação de vetores de expressão em cepas hospedeiras haploides meti e lys3 de Pichia pastoris
[00539] Todos os métodos usados para transformação de cepas haploides P. pastoris e manipulação de ciclo sexual de P. pastoris realizada como descrito em protocolos de Pichia (Methods in Molecular Biology Higgings, DR, and Cregg, JM, Eds. 1998. Humana Press, Totowa, NJ). Antes da transformação cada vetor foi linearizado dentro das sequências promotoras GAP para direcionar a integração do vetor no local do promotor GAP do genoma de P. pastoris. Cepas haploides foram transfectadas usando eletroporação e transformantes bem sucedidas foram selecionadas em YPDS (extrato de levedura, peptona dextrose com sorbitol) em placas ágar G418. Números de cópia de genes de cadeia pesada e leve foram determinadas para cepas haploides por análise Southern blot. Cepas haploides foram então reproduzidas e selecionadas por suas capacidades de crescer na ausência dos marcadores de aminoácidos (ou seja, Lys e Met). Clones diploides resultantes foram então submetidos a uma Southern blot final para conformar números de cópia de genes de cadeia pesada e leve. Um clone que expressa o anticorpo de interesse foi selecionado usando biocamada interferometria Proteía-A biosensores para monitorar a expressão (Octet, ForteBio).
Exemplo 4 Expressão de Ab3, Ab6 e Ab14 em Pichia pastoris
[00540] Três cepas de Pichia para expressão de anticorpo completo foram feitas. Para todas as cepas que expressam anticorpo, as cepas haploides foram criadas e subsequentemente cruzadas. Uma cepa haploide expressou a sequência de cadeia leve completa e outra cepa haploide expressou a sequência de cadeia pesada completa. Cada cepa diploide foi usada para gerar um banco de célula de pesquisa e usadas para expressão em um biorreator.
[00541] Primeiro, um inóculo foi expandido usando o banco de célula de pesquisa usando o meio compreendido dos seguintes nutrientes (% p/v): extrato de levedura 3%, dextrose anidra 4%, YNB 1,34%, Biotina 0,004% e 100 mM fosfato de potássio. Para gerar o inóculo para os fermentadores, o banco de célula foi expandido por aproximadamente 24 horas em uma incubadora por agitação a 30°C e 300 rpm. Um inóculo de 10% foi então adicionado aos vasos de trabalho de Labfors 2,5L de volume contendo 1 L de meio de crescimento estéril. O meio de crescimento foi compreendido dos seguintes nutrientes: sulfato de potássio 18,2 g/L, fosfato de amônio monobásico 36,4 g/L, fosfato de potássio dibásico 12,8 g/L, sulfato de magnésio heptahidratado 3,72 g/L, citrato de sódio diidratado 10 g/L, glicerol 40 g/L, extrato de levedura 30 g/L, PTM1 metais traços 4,35 mL/L, e antiespuma 204 1,67 mL/L. A solução de metal traço PTM1 foi compreendida dos seguintes componentes: sulfato cúprico pentahidratado 6 g/L, iodeto de sódio 0,08 g/L, sulfato de manganês hidratado 3 g/L, molibdato de sódio diihdratado 0,2 g/L, ácido bórico 0,02 g/L, cloreto de cobalto 0,5 g/L, cloreto de zinco 20 g/L, sulfato ferroso heptahidratado 65 g/L, biotina 0,2 g/L, e ácido sulfúrico 5 mL/L.
[00542] Os parâmetros de controle de processo do biorreator foram ajustados como a seguir: Agitação 1000 rpm, fluxo de ar 1,35 litro padrão por minuto, temperatura 28°C e pH foi controlado em seis usando hidróxido de amônio. Nenhuma suplementação de oxigênio foi fornecida.
[00543] As culturas de fermentação cresceram por aproximadamente 12 a 16 horas até o glicerol inicial ser consumido como denotado por uma inoculação ao pico de oxigênio dissolvido. As culturas foram colhidas por aproximadamente três horas após a inoculação de oxigênio dissolvido. Após este período de privação, uma adição de etanol em bolus foi inserida no reator para atingir 1% etanol (p/v). As culturas de fermentação foram deixadas equilibrar por 15 a 30 minutos. Adição de alimentação foi iniciada 30 minutos após etanol em bolus e ajustado em uma taxa constante de 1 mL/min por 40 minutos, então a bomba de alimentação foi controlada por um detector de etanol mantendo a concentração de etanol a 1% para o restante da corrida usando uma sonda de detecção (Raven Biotech). A alimentação foi compreendida dos seguintes componentes: extrato de levedura 50 g/L, dextrose 500 g/L, sulfato de magnésio heptahidratado 3 g/L, e PTM1 metais traços 12 mL/L. Para a fermentação do Ab6 e Ab14 completo, citrato de sódio dihidratado (0,5g/L) foi ainda adicionado ao alimentador. O tempo de fermentação total foi aproximadamente 90 horas.
Exemplo 5 Métodos para humanizar anticorpos
[00544] Métodos para humanizar anticorpos foram descritos anteriormente na patente US 7935340, a revelação da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em alguns casos, uma determinação de se resíduos estruturais adicionais são requeridos para manter a atividade é necessária. Em alguns casos os anticorpos humanizados ainda requerem alguns resíduos estruturais de coelho críticos a serem retidos para minimizar a perda de afinidade ou atividade. Nestes casos, é necessário alterar aminoácidos estruturais simples ou múltiplos das sequencias humanas de linhagem germinativa de volta aos aminoácidos de coelho originais para ter a atividade desejada. Estas alterações são determinadas experimentalmente para identificar quais resíduos de coelho são necessários para preservar afinidade e atividade. Isto é agora o fim da sequência de aminoácido humanizado de cadeia pesada e leve variáveis.
Exemplo 6 Inibição de ligação CGRP ao seu receptor celular
[00545] Para caracterizar anticorpos recombinantemente expressos para suas capacidades em inibir a ligação de CGRP ao seu receptor celular, um ensaio de ligação ao radio-ligante foi realizado como anteriormente descrito [Elshourbagy et al, Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al, Peptides, 16:421 (1995)]. As preparações de membrana de receptores CGRP recombinantes humanos, receptor tipo receptor de calcitonina e RAMP1 (Chemiscreen, Millipore) foram usados. Diluições de anticorpo foram pré- incubados com CGRP α humano 125I radiomarcado humano (0,03nM) por 30 minutos em temperatura ambiente. Nenhuma ligação não específica foi estimada na presença de 0,1 μM CGRPα humano. Membranas foram filtradas e lavadas. Os filtros foram então contados para determinar CGRP α humano 125I radiomarcado especificamente ligado.
[00546] Resultados: A Figura 38 demonstra que anticorpos anti-CGRP Ab1- Ab13 inibem a ligação de CGRP ao seu receptor celular.
Exemplo 7 Inibição de vasodilatação neurogênica por Anticorpos anti- CGRP em ratos
[00547] CGRP é um potente vasodilatador (Nature 313: 54-56 (1985) e Br J. Clin. Pharmacol. 26(6):691-5. (1988)). Um ensaio farmacodinâmico para medir atividade antagonista de receptor de CGRP não invasivamente foi usada para caracterizar anticorpos anti-CGRP. O modelo dependia de alterações em fluxo sanguíneo dérmico medido usando um gerador de imagem Doppler laser seguido por aplicação de uma solução de capsaicina. Capsaicina ativa o potencial receptor transitório receptor vaniloide tipo 1 (TRPV-1), produzindo inflamação neurogênica e vasodilatação através da liberação local de mediadores vasoativos incluindo CGRP e substância P (Br. J. Pharmacol. 110: 772-776 (1993)).
[00548] No dia antes do ensaio de vasodilatação, os animais foram dosados com o agente teste ou controle via IP (intraperitoneal). Após a dosagem, os animais foram raspados e depilados na região posterior inferior de seus lados dorsais, em uma área de aproximadamente 2x6cm. Os animais foram então retornados ás suas gaiolas durante a noite. No dia do teste, aproximadamente 24 horas após a dosagem, os animais foram anestesiados com gás isoflurano e colocado em um bloco de aquecimento de temperatura controlada e ajustado com um cone do nariz para liberação contínua de isoflurano. Um gerador de imagem Doppler laser foi usado para a observação de vasodilatação. Um feixe de luz vermelha coerente gerado por um laser de hélio-néon 633 nm foi direcionado para a área raspada, um retângulo (2x6 cm), e escaneado em um modo de resolução médio. Um scan Doppler basal foi obtido primeiro e o local de colocação do O-ring predeterminado ou identificação de duas áreas de fluxo baixo semelhantes. Dois O-rings de borracha (~1cm em diâmetro) foram colocados nas regiões selecionados e um scan basal foi realizado. Imediatamente após a conclusão do scan, 1mg de capsaicina em 5 μL de uma solução de etanol:acetona (1:1) foi aplicado dentro de cada um dos O-rings, os scans Doppler foram repetidos a 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5 e 30 minutos após a aplicação da capsaicina. O percentual de alteração do fluxo médio basal dentro de cada um dos dois O-rings foi plotado como os resultados de vasodilatação devido à capsaicina.
[00549] Para testar os anticorpos recombinantemente expressos para suas capacidades de inibir a ligação de CGRP ao seu receptor celular, um ensaio de ligação ao radioligante foi realizado como anteriormente descrito.
[00550] Resultados: Figuras 39 e 40 demonstram que anticorpos anti-CGRP Ab3 e Ab6 reduziram a vasodilatação neste modelo após administração de capsaicina.
Exemplo 8 Efeito de administração de anticorpo CGRP em bexiga superreativa
[00551] Os experimentos foram conduzidos para avaliar a eficácia potencial de administração de um anticorpo anti-CGRP em continência de bexiga e bexiga superreativa. A continência de bexiga é um equilíbrio entre fechamento uretral e atividade de músculo detrusor, e bexiga superreativa é uma condição caracterizada por urgência, incontinência urinária, frequência e noctúria. Alguma evidência anedótica na literatura sugere que CGRP pode estar envolvida em continência da bexiga e pode estar relacionada a e talvez desempenhw um papel causal na patologia de doença bexiga superreativa. Assim, esperava-se que os anticorpos inventivos anti-CGRP, especialmente dadas suas altas afinidades a CGRP, pudessem potencialmente ajudar a prevenir ou aliviar esta condição as vezes debilitante. (A evidência que CGRP pode desempenhar um papel na bexiga superreativa inclui o fato de que CGRP está presente no trato urinário, DRG e medula espinhal (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727) Ainda, aferentes de fibra C são críticos para conduzir impulsos na micção para a medula espinhal (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112):128) e estas fibras são afetadas por CGRP. Ainda, foi reportado que a administração intravesical de Botox suprime CGRP e significativamente reduz o intervalo de intercontração no modelo de dor na bexiga induzida por ácido acético (Chuang et al., 2004 J Urol (172):1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182):786)). Além disso, foi recentemente reportado que a administração de um anticorpo anti-CGRP supostamente reduz o número de contrações da bexiga em modelo bexiga superreativa induzida por óleo de turpentina (Pfizer pedido de patente PCT WO 2011/024113).
Materiais e Métodos Animais:
[00552] Ratos fêmeas Sprague-Dawley (247 - 299 g) (Charles River Partoatories, Saint Germain sur l’Arbresle, França) foram liberados ao laboratório pelo menos 5 dias antes dos experimentos para serem aclimatados às condições laboratoriais. Foram alojados 3 por gaiola (gaiolas tipo E de polipropileno tamanho: 1032 cm2) e alimentados (Teklad 2016 global rodents, Harlan, 03800 Gannat, França) e água ad libitum. Forração de serragem (Souralit 2912 plus, Souralit, 17080 Girona, Espanha) para as gaiolas de roedores foi alterada duas vezes por semana. A temperatura da sala do animal (20 ± 2 °C) foi mantida com um ciclo de 12/12 horas alternando claro-escuro (fase de luz 7 da manhã: 7 da noite) e umidade relativa mantida a 40-70%.
Equipamento de laboratório
[00553] Cateteres na bexiga foram conectados através de um tubo T para um medidor de tensão MX 860 Novatrans III Gold (Medex Medical SARL, Nantes- Carquefou, França) e uma bomba seringa (70-2208 Model II plus, Harvard Apparatus, Les Ullis, França e Razel R-99E, Fisher Bioblock, Illkirch, França). Pressão intravesical foi registrada continuamente usando um PowerLab interface (ADInstruments Pty Ltd, Castle-Hill, Australia) e software Chart® correndo em um PC. Os dados foram analisados com software Microsoft Excel ®.
Substâncias testes
[00554] Anticorpo Anti-CGRP teste (Ab3)
[00555] Anticorpo de controle negativo (anticorpo anti-digitoxina).
Reagentes químicos
[00556] Salina fisiológica (NaCl 0,9%) (lote n° 11043411, CAS n° 7647-14- 5) foi adquirida de B-Braun via Centravet (Lapalisse, França).
Substâncias anestésicas
[00557] Uretano (lote n° BCBC9294, CAS n° 51-79-6) e pentobarbital sódico (lote n° 150A1, CAS n°76- 74-4) foram fornecidos por Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, França) e Centravet (Lapalisse, França), respectivamente.
Grupos experimentais
[00558] Dois grupos experimentais de 10 ratos foram usados nos experimentos. Cada grupo foi administrado com 10 mg/kg de controle ou anticorpo anti-CGRP:
Desenho do estudo Procedimento experimental
[00559] Ratos fêmeas foram administradas com anticorpo teste ou anticorpo controle negativo por via intravenosa em uma dose de 10 mg/kg, 18 horas antes dos experimentos usando uma injeção na veia caudal. Quinze (15) horas depois, os ratos foram anestesiados com uretano (1,2 g/kg, subcutânea (s.c.). Três (3) horas depois a administração s.c. de uretano, um cateter de polietileno (0,58 e 0,96 mm de diâmetros interno e externo, respectivamente) foi inserido na bexiga através de cúpula e presa com fio de sutura. A temperatura corporal foi mantida a 37± 2°C (TCAT-2LV controller, Physitemp, ADInstruments Pty Ltd., Casttle Hill, Australia) através do experimento.
Experimento cistométrico
[00560] As investigações cistométricas foram realizadas em ratos fêmeas anestesiadas após a cirurgia. A salina fisiológica em temperatura ambiente foi continuamente infundida na bexiga em uma taxa de fluxo constante (2 mL/h) por um período de pelo menos 30 min.
[00561] Ao fim dos experimentos cistométricos, os animais foram sacrificados por uma injeção letal (1 mL) de pentobarbital sódico (54,7 mg/mL) (CAS n°76-74-4) seguido por deslocamento cervical.
Parâmetros cistométricos
[00562] Os parâmetros cistométricos medidos foram:
[00563] Amplitude de micção (AM), ou seja pressão entre pressão limiar e pressão máxima de micção (mmHg),
[00564] Intervalo intercontração (ICI), ou seja, tempo entre duas micções subsequentes (sec),
[00565] Frequência de micção (MF), ou seja, número de contrações de micção /15 min (picos/15 min).
Critérios de exclusão
[00566] Dois ratos foram excluídos durante os experimentos: Um foi excluído conforme apresentou-se com hiper-reatividade de bexiga durante a infusão intravesical de salina, e o outro devido à anestesia alterada durante o experimento induzindo modificações ao perfil cistométrico.
Análise de resultados
[00567] Para cada rato, os valores para AM e ICI foram calculados como a média das últimas quatro ou cinco micções durante a infusão de salina. Os valores para MF foram calculados como a média de micções obtidas por dois intervalos de 15 minutos durante infusão de salina.
[00568] Os resultados são apresentados como valores médios ± desvio padrão da média (± sem). As Figuras e análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism® (versão 4; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).
[00569] Comparações estatísticas de valores (infusão salina) no grupo de anticorpo anti-CGRP versus o grupo de controle de anticorpo foram realizados usando teste t de Student não pareado.
[00570] Um p<0,05 foi aceito para significância estatística.
Resultados:
[00571] Conforme mostrado na FIG. 41, ICI foi significativamente maior e MF foi significativamente menor nos grupos tratados com Ab anti-CGRP (FIGS. 41A e B respectivamente; p<0,05, teste t de Student não pareado). Nenhuma diferença significativa foi observada entre grupos AM (FIG. 41C, p>0,05, teste t de Student não pareado).
[00572] Estes resultados sugerem que anticorpos anti-CGRP podem ser úteis na prevenção ou alívio de bexiga superreativa, melhorando a continência urinária e tratamento de condições urinárias relacionadas.
Exemplo 9 Alívio de dor neuropática em ratos
[00573] Dano aos nervos periféricos geralmente levam à dor crônica que é neuropática na origem. A síndrome de dor consistem em sensibilidade ao estímulo externo (por exemplo, mecânico e/ou térmico) que não são normalmente nocivos. Consequentemente, dor neuropática é refratária às abordagens analgésicas tradicionais, tornando difícil de tratar. Experimentalmente, dor neuropática pode ser modelada em animais via trauma cirúrgico aos nervos periféricos. O modelo Chung é um dito sistema onde dor neuropática é induzida por ligação dos nervos espinhais de L5 e L6.
[00574] Neste exemplo, uma ligação de nervo espinhal foi realizado em ratos machos Sprague Dawley. Foram testados para sensibilidade de dor no dia 13 (confirmação por alodinia) e então novamente após cada administração de Ab2 usando o teste de von Frey de alodinia mecânica para avaliar possível atividade anti-alodínica.
Métodos
[00575] Ratos machos Sprague Dawley (Harlan Partoatories) pesando 200- 225g na chegada, foram recebidos e colocados em gaiolas. Uma inspeção de saúde visual foi realizada em cada animal para incluir a avaliação de pele, extremidades e orifícios. Cada animal foi ainda avaliado para qualquer sinal anormal na postura ou movimento. Todos os animais demonstraram estar em boa saúde e foram colocados no estudo.
[00576] Os ratos foram aclimatados por um mínimo de dois dias antes do começo dos procedimentos experimentais, com a exceção de randomização de pesos corporais que foram coletados no dia após a chegada. Os animais foram alojados individualmente em gaiolas convencionais de policarbonato claras ou gaiolas de policarbonato microisoladoras com forragem de contato irradiada certificada. Alimento e água foram fornecidos ad libitum. Os controles ambientais foram ajustados para manter as temperaturas de 18o a 26OC (64o a 79OF) com uma umidade relativa de 30% a 70%. Um ciclo de 12:12 horas de claro:escuro foi mantido.
[00577] Os ratos foram testados para limiar basal usando os filamentos von Frey nos Dias -4 ou -1 de aclimatação.
[00578] O dia 0, os animais passaram por um procedimento de ligação de nervo espinhal. Todas as cirurgias foram realizadas em condições assépticas. Antes das cirurgias, os ratos foram anestesiados. A região traseira foi raspadas e preparada para cirurgia asséptica. Os ratos foram colocados em decúbito ventral e uma incisão foi realizada imediatamente a esquerda da linha média da região L4 - S2. Os músculos paraespinhais esquerdos foram separados dos processos espinhosos (L4 - S2). A articulação de faceta L6-S1 foi beliscada e o processo transverso suavemente desbastado para fornecer espaço para avaliar o nervo espinhal L4 & L5. Os nervos espinhais L5 e L6 foram isolados e ligados com suturas de seda 6,0. A incisão foi então fechada com material de sutura apropriado e clips de ferida de pele. Após a operação, solução de Ringer lactato (3,0 - 5,0 mL) foi administrada via injeção subcutânea aos animais.
[00579] Todos os animais nos grupos 1 e 2 receberam um teste von Frey nos dias -4 ou -1, 13, 14, e 17. A medição no dia 13 foi tomada na pré-dose. O teste de von Frey para alodinia mecânica mede propriedades anti-nociceptivas de compostos analgésicos. Neste teste os animais foram primeiro habituados para testar a câmara de modo que estavam calmos suficiente para seus limiares de dor serem avaliados. Um técnico cego aos grupos de tratamento aplicou pressão leve na pata esquerda traseira do rato usando uma série de filamentos de náilon graduados (filamentos von Frey) de diâmetros crescentes. Os filamentos foram pressionados perpendicularmente contra a superfície ventral da pata até dobrarem. Quando considerados dolorosos, o rato responde retirando sua pata. Limiar de alodinia foi determinado usando o método Chaplan up-down (Chaplan et al., J Neurosci Methods, 53:55-63, 1994), que fornece a força precisa para retirada de cada rato usando uma escala psicofísica de teste.
[00580] Os animais foram alocados em dois grupos de tratamento no Dia 13, baseado nos escores de von Frey. Cada animal que tinha um escore von Frey maior do que 6g foi excluído do estudo. Os escores médios de von Frey para cada grupo foram revisados para garantir que os valores médios e desvio padrão satisfaziam a hipótese de homogeneidade. As doses foram administradas por injeção IP uma vez no dia 13 (13 dias após a cirurgia) para o Grupo 1 (Ab2) e Grupo 2 (anticorpo controle negativo) (11 animais em cada grupo; Ab2 e anticorpo controle negativo foram administrados com 10 mg/kg). Grupo 1 recebeu uma injeção de bolus IV adicional (não anestesiados) de Ab2 no dia 17 antes de teste de comportamento.
[00581] Amostras de sangue para plasma foram tomadas no dia 17 para o Grupo 1 e analisadas para título de Ab2.
[00582] Fora das observações do local cirúrgico esperado e patas arrastando associadas com a cirurgia Chung, nenhuma observação anormal foi documentada. O tratamento pareceu não ter efeito adverso em morte de animal em geral nem rompeu o ganho de peso normal esperado nos ratos desta idade.
Resultados
[00583] Todos os animais que passaram por teste basal antes da cirurgia no dia 0 tiveram um escore de von Frey de 15 (não mostrado) indicando sensibilidade normal. No dia 13 (antes da administração do anticorpo), todos os animais tiveram escores von Frey inferiores a 6g, indicando que a sensibilidade aos estímulos mecânicos externos tinha desenvolvido, exceto para dois animais que foram removidos do estudo. Escores médios de von Frey no dia 13 foram menos do que 3 g (FIG. 42, grupo da esquerda de barras). Após o teste no dia 13, os animais foram administrados com Ab2 ou um anticorpo controle negativo (10 mg/kg). Nos dias 14 e 17, escores von Frey foram novamente testados e foram maiores nos animais tratados com Ab2 do que os controles (FIG. 42, grupo do meio das barras e grupo da direita das barras, respectivamente).
[00584] Estes resultados indicam que o tratamento com um anticorpo anti- CGRP como Ab2 pode ajudar a prevenir ou aliviar a dor neuropática.
Exemplo 10 Primeiro experimento avaliando efeito de administração de anticorpo anti-CGRP em analgesia (modelo de Retirada da Cauda)
[00585] Três diferentes experimentos (Exemplos 10-12) foram conduzidos para avaliar a eficácia potencial de uma administração de anticorpo anti-CGRP em analgesia ou dor. Em todos os experimentos um modelo de resposta de retirada da cauda do roedor (ainda referenciado como retirada da cauda) foi usado como a resposta de retirada da cauda ao calor radiante é um modelo comumente usado para detectar potencialmente agentes analgésicos potencialmente úteis. Este ensaio é particularmente usado para discriminar entre analgésicos tipo morfina que atuam centralmente (ativo) e agentes anti- inflamatórios não opioide que atuam perifericamente (inativo). Este modelo animal e métodos e materiais usados neste são descritos abaixo.
Materiais e métodos
[00586] Animais: Ratos machos Sprague Dawley derivados de peso 150 ± 20 g.
[00587] Anticorpo CGRP teste: Ab2
[00588] Veículo: 15 mM Histidina 250 mM Sorbitol, pH 5,5
[00589] Composto analgésico: Morfina
[00590] Procedimentos de resposta de Retirada da cauda: O tempo (segundos) requerido para induzir resposta de retirada da cauda induzida por calor radiante focado foi medido como o limiar de dor em grupos de 10 ratos machos Sprague Dawley pesando 150 ± 20 g. Teste basal para a resposta de retirada da cauda foi realizada no dia 0. Os ratos que têm uma resposta de retirada da cauda de 3-5 segundos foram incluídos no estudo e designados aos grupos de tratamento baseados em resposta de retirada da cauda basal. Um corte de 15 segundos foi usado para evitar dano de tecido.
Desenvolvimento de tolerância à morfina
[00591] Cada um dos 3 grupos de 10 ratos machos Male Sprague foram dosados 2 x diariamente via administração i.p. com veículo salina (2 ml/kg) de manhã e de noite. Um dos 3 grupos foi além disso administrado com analgésico i.p. (morfina) em uma dosagem de 5 mg/kg 2 x diariamente por 7 dias consecutivos. Um segundo dos 3 grupos de ratos foi administrado i.p. com um anticorpo anti-CGRP de acordo com a invenção (Ab2) em uma dosagem de 10 mg/kg como um bolus único no dia 0. Os ratos nos diferentes grupos foram então cada um testado para resposta de retirada da cauda uma vez por dia 30 min após a dose da manhã.
[00592] Uma ANOVA uma via seguido por teste t Dunnett é aplicado para comparação entre controle veículo e grupos tratados com composto. P<0,05 é considerado significativo.
[00593] Os resultados destes experimentos são mostrados na Figura 43. Os resultados destes indicam que o anticorpo CGRP teste quando administrado em 10 mg/kg suscitou efeito analgésico de longa duração significativa a um estímulo de dor térmico. Amostras de sangue terminal foram tomadas de todos os ratos testados através de punção cardíaca e depois foi analisada para título Ab2.
Exemplo 11: segundo experimento de Retirada da cauda avaliando o efeito de anticorpo anti-CGRP em Analgesia (titulação de dose de anticorpo)
[00594] Um segundo conjunto de experimentos de retirada da cauda foi conduzido para avaliar os efeitos de diferentes dosagens de anticorpo anti-CGRP em analgesia usando anticorpo anti-CGRP de acordo com a invenção (Ab2). Os ratos usados nestes experimentos são o mesmo tipo como no experimento anterior e no protocolo de retirada da cauda substancialmente o mesmo. Neste experimento analgesia foi comparada em diferentes grupos de animais administrados com dosagens de diferentes anti-CGRP para avaliar se a dosagem tem um efeito na analgesia. No segundo grupo de experimentos, cinco grupos de animais testes foram comparados como a seguir. Um primeiro grupo de controle de animais foi cada um administrado com veículo isolado (15 mM Histidina 250 mM Sorbitol, pH 5,5), 3 grupos de animais foram cada um administrado em diferentes dosagens do mesmo anticorpo anti-CGRP contido no veículo (Ab2, respectivamente administrado em dosagens de 1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg no dia 0), e um quinto grupo de animais foi administrado 10 mg/kg de um anticorpo controle negativo (anticorpo anti-digitoxina) ainda no dia 0.
[00595] Os protocolos de retirada da cauda foram de outra forma efetuados como descrito acima. Os resultados foram novamente avaliados usando ANOVA de uma via seguindo o teste t de Dunnett para comparação entre o controle veículo, anticorpo controle negativo e grupos tratados por anticorpo CGRP de teste. P<0,05 é considerado significativo.
[00596] Os resultados destes experimentos são mostrados na Figura 44. Pode ser observado a partir deste que quanto maior as dosagens de anticorpo do composto teste (anticorpo Ab2 anti-CGRP inventivo) suscitaram melhores efeitos analgésicos do que as dosagens menores. Como antecipado o anticorpo controle negativo não induziu um efeito perceptível em analgesia em relação aos grupos de controle.
Exemplo12: terceiro experimento de retirada da cauda avaliando o efeito de co-administração de anticorpo anti-CGRP/Morfina em analgesia
[00597] Um terceiro conjunto de experimentos de retirada da cauda foi ainda conduzido para avaliar a administração de anticorpo anti-CGRP /morfina em analgesia. Nestes experimentos um primeiro grupo de animais foi administrado com o mesmo veículo isolado em uma dosagem de 5 ml/kg. Um segundo grupo de animais foi administrado com morfina nos dias 1-10 em uma dosagem de 5 mg/kg, administrado duas vezes ao dia, em que ditos animais foram no dia 0 ainda administrados com o anticorpo anti-CGRP Ab2 em uma dosagem de 10 mg/kg. Um terceiro grupo de animais foi administrado com morfina somente nos dias 1-4 novamente em uma concentração de dosagem de 5 mg/kg, administrado duas vezes ao dia, e foram ainda administrados com o anticorpo Ab2 no dia 0, em uma dosagem de 10 mg/kg. Todas as administrações foram i.p.
[00598] Os experimentos de retirada da cauda foram realizados em cada um destes grupos de animais diariamente do dia 0-10. Os resultados destes experimentos de retirada da cauda foram novamente usando ANOVA de uma via de acordo com o teste t de Dunnett para comparação entre o controle veículo, anticorpo controle negativo e o grupo tratado com anticorpo teste anti-CGRP. P<0,05 é considerado significativo.
[00599] Os resultados destes experimentos são sumarizados na Figura 45. Os animais tratados com Ab2 que receberam uma dose diária de morfina ao longo do experimento apresentaram tolerância à morfina, e após o dia 5 o tempo de retirada da cauda caiu em quase ao nível dos animais de controle tratados com veículo. Em contraste, em animais tratados com Ab2 receberam morfina somente até o dia 4, o tempo de retirada da cauda melhorou no dia 5 e permaneceu melhorado até o dia 8. Os resultados sugerem que a administração de um anticorpo anti-CGRP pode ter efeitos analgésicos mesmo após o início de tolerância à morfina, que pode ser pronunciado na retirada da morfina.
Exemplo13 Alívio de dor visceral em ratos
[00600] Os pacientes que sofrem de síndrome de intestino irritável (IBS) demonstram um limiar sensorial visceral inferior à distensão do balão colorretal (Ritchie, Gut, 1973, 14:125-32). Foi sugerido que IBS que há uma sensibilidade à dor intensificada do eixo cérebro-intestino, com um padrão normal de ativação. Foi anteriormente demonstrado que a injeção de ácido sulfônico trinitrobenzeno (TNBS) no cólon proximal provocou hipersensibilidade colônica, medida em ratos conscientes por um limiar de dor reduzido em resposta a uma distensão colônica (Diop et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002, 302:1013-22). Esta hipersensibilidade crônica demonstrada no cólon não inflamado distal e persistiu por 21 dias. Este imitou certas características de IBS e assim pode ser usado como um modelo para explorar experimentalmente os aspectos patofisiológicos deste distúrbio. Este ensaio é usado para determinar os efeitos potenciais de anti-hipersensibilidade de composto para hipersensibilidade colônica induzida por TNBS.
[00601] Vários estudos envolveram CGRP na dor visceral (Friese et al., Regul Pept 1997;70:1-7; Gschossmann et al., Neurogastroenterol Motil 2001;13:229-36; Julia e Bueno, Am J Physiol 1997;272:G141-6; Plourde et al., Am J Physiol 1997;273:G191-6). CGRP é o peptídeo mais abundante de fibras aferentes sensíveis a capsaicina de origem gastrointestinal, contando por até 80% da imunorreatividade de peptídeo geral (Clague et al., Neurosci Lett 1985;56:63-8; Sternini et al., Gastroenterology 1987;93:852-62). Além disso, a injeção de CGRP induz hipersensibilidade colônica em um modelo de TNBS (Delafoy et al., 2006, Gut 55:940-5), que é revertido por um peptídeo antagonista CGRP (CGRP 8-37).
[00602] Este exemplo descreve o teste de um anticorpo anti-CGRP em um modelo de dor visceral (hipersensibilidade crônica induzida por TNBS) em ratos.
Métodos
[00603] Ratos machos Sprague-Dawley, pesando 390 a 450 g ao dia de cirurgia foram incluídos neste estudo. Foram alojados na temperatura (19,5°C - 24,5°C) e umidade relativa (45 % - 65 %) em sala controlada com um ciclo de 12 h de claro/escuro. Os animais foram alojados 2 ou 3 por gaiola em um período de aclimatação (pelo menos 5 dias) foi observado antes do teste. Cada rato foi identificado por marcações na cauda. O estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do Committee for Research and Ethical Issue of the I.A.S.P. (1983) e as European guidelines 2010/63/UE.
[00604] A sensibilidade colônica foi induzida por administração cirúrgica de ácidos sulfônicos trinitrobenzeno (TNBS, 50 mg/kg) 7 dias antes do teste de comportamento. Os animais em jejum (24 horas) passaram por cirurgia. Resumidamente, sob anestesia (Acepromazina 5 mg/kg / cetamina 30 mg/kg), injeção de TNBS (50 mg/kg, 1 ml/kg) foi realizada na parte proximal do cólon (1 cm do ceco). Após a cirurgia, animais retornaram para suas gaiolas em um ambiente regulado, e alimentados ad libitum até o dia do teste, 7 dias depois. Animais "naive" (ratos sem cirurgia) foram colocados nas mesmas condições de alojamento.
[00605] Os animais foram administrados com o anticorpo anti-CGRP Ab2 ou um anticorpo controle negativo (ambos a 10 mg/kg) por via intravenosa 24 horas antes da determinação de limiar do cólon. Três grupos de ratos foram incluídos neste estudo:
[00606] Grupo 1: um grupo "naive" composto de animais que não passaram por cirurgia ou tratamento de TNBS no D-7 e foram tratados com o anticorpo controle 24 hrs antes (ou seja D-1) para testar (ou seja, medições do limitar de distensão colônica no D0) (n=7).
[00607] Grupo 2: um grupo "TNBS" composto de animais que passaram por cirurgia no D-7 e foram tratados com anticorpo de controle (24 hrs antes (ou seja D-1) para testar (ou seja, medições de limiar de distensão colônica no D0) (n=8).
[00608] Grupo 3: Um grupo "tratado" composto de animais que passaram por cirurgia no D-7 e foram tratados com Ab2 24 hrs antes (ou seja D-1) para testar o dia (ou seja, medições do limiar de distensão colônica no D0) (n=8).
[00609] Sete dias (D7) após a injeção de TNBS, a sensibilidade colônica foi avaliada por medição de pressão intra-colônica requerida para induzir uma resposta comportamento durante a distensão colônica devido à inflamação de um balão introduzido no cólon. Os testes foram conduzidos por um experimentador cego. Esta resposta é caracterizada por uma elevação da parte traseira do corpo do animal e uma contração abdominal claramente visível em correspondendo às contrações graves (Al Chaer et al., Gastroenterology 2000, 119:1276-1285) e usada como um marcador de dor (Bourdu et al., Gastroenterology. 2005:128, 1996-2008). O balão (5 cm) foi inserido intraretal de um modo minimamente invasivo para 10 cm do ânus de animais em jejum (24h) em vigília e o cateter foi gravado na base da cauda. Os ratos foram então colocados no meio da caixa plexiglass e o cateter foi conectado a um aparelho barostático eletrônico. Após um período de aclimatação de 30 min com o balão inserido, a pressão colônica foi gradualmente aumentada por etapas de 5 mmHg a cada 30 segundos de 5 a 75 mmHg (cut off) até o comportamento de dor ser evidenciado. Quatro determinações foram realizadas, 30 min, 50 min, 70 min e 90 min após a inserção do balão.
[00610] Usando os dados de cada teste, o percentual de atividade em hipersensibilidade colônica induzida por administração intracolônica de TNBS foi calculado como a seguir Limitar de distensão tratado é a média aritmética dos valores para o grupo "tratado"; limitar de ditensão TNBS é a média aritmética dos valores para o grupo "TNBS"; e Limiar de distensão Naive é a média aritmética dos valores para o grupo "naive".
Resultados
[00611] A capacidade de um anticorpo anti-CGRP em aliviar a dor visceral foi testada em um modelo de rato em que a hipersensibilidade colônica crônica foi induzida por administração de TNBS. Dor visceral foi quantificada por medição de limiar de distensão colônica, ou seja, a quantidade de pressão abdominal que os animais poderiam tolerar antes de apresentar uma resposta comportamental (contração muscular). Valores maiores de limiar de distensão colônica indicam menos sensibilidade. Como esperado, tratamento com TNBS resultou em limiar de distensão colônica bastante reduzida comparado aos animais naive (FIG. 46, compara barra do meio (tratado com TNBS) e barra da esquerda (naive)). Administração Ab2 melhorou o limiar de distensão colônica comparada aos animais controle (FIG. 46, comparar barra da direita (tratada com Ab2) e barra do meio (controle)). A melhora a partir de administração de Ab2 foi estatisticamente significativa (p < 0,05 teste t de Student, em comparação ao grupo de TNBS + negativo de controle). A atividade anti-hipersensibilidade de Ab2 foi computado sendo 27% (indicativo do grau de alívio de hipersensibilidade induzida por TNBS).
[00612] Estes resultados sugerem que os anticorpos anti-CGRP podem ser úteis na prevenção ou alívio da dor visceral.

Claims (5)

1. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CGRP humano, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma condição ou doença associada a CGRP, em que a condição ou doença é enxaqueca ou cefaleia em salvas, em que os polipeptídeos das regiões determinantes de complementaridade 1, 2 e 3 de cadeia leve (CDR1, CDR2 e CDR3) do referido anticorpo ou fragmento de anticorpo, respectivamente, têm as sequências da SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 57 e os polipeptídeos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada do referido anticorpo ou fragmento de anticorpo, respectivamente, têm as sequências da SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; e SEQ ID NO: 60.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: i. o referido fragmento é selecionado a partir de um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2 ou um fragmento de anticorpo monovalente, opcionalmente em que o referido fragmento é um fragmento Fab; e/ou ii. uma região variável de cadeia leve tem a sequência da SEQ ID NO: 51 e uma região variável de cadeia pesada tem a sequência da SEQ ID NO: 53.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo tem: i. uma cadeia leve tendo a sequência da SEQ ID NO: 52 e uma cadeia pesada tendo a sequência da SEQ ID NO: 54; e/ou ii. uma cadeia leve tendo a sequência: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLA SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC, e uma cadeia pesada tendo a sequência: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGIN GATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (i) a cadeia leve do referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável que compreende os polipeptídeos das regiões determinantes de complementaridade 1, 2 e 3 (CDR1, CDR2 e CDR3), respectivamente, tendo as sequências da SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 57 e uma região constante que compreende um polipeptídeo da região constante da cadeia leve de IgG1 humana ou um fragmento da mesma; e (ii) a cadeia pesada do referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável que compreende os polipeptídeos das CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, tendo as sequências da SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; e SEQ ID NO: 60 e uma região constante que compreende um polipeptídeo da região constante da cadeia pesada de IgG1 humana ou um fragmento da mesma.
5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende ainda um veículo aceitável e é opcionalmente liofilizada e compreende pelo menos um estabilizador.
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