KR102128627B1 - 항-cgrp 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

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패트리샤 다이앤 맥닐
니콜 엠. 잰슨
마리아-크리스티나 루미스
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Abstract

본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 하나의 구현예는 본원에 기재된 항체, 및 그의 결합 단편에 관한 것이고, 이것은 본원에 기재된 VH, VL 및 CDR 폴리펩타이드의 서열, 및 그것을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명은 또한, 하나 이상의 기능적 또는 검출가능 모이어티에 콘주게이트된 항-CGRP 항체 및 그의 결합 단편의 콘주게이트를 고려한다. 본 발명은 또한, 상기 항-CGRP 항체 및 그의 결합 단편을 제조하는 방법을 고려한다. 본 발명의 구현예는 또한, CGRP와 연관된 질환 및 장애의 진단, 평가 및 치료를 위한, 항-CGRP 항체, 및 그의 결합 단편의 용도와 관련된다.

Description

항-CGRP 조성물 및 그의 용도 {ANTI-CGRP COMPOSITIONS AND USE THEREOF}
본원은 미국 가출원 번호 61/488,660 (변리사 문서 번호 67858.730300, 2011년 5월 20일 출원, 명칭 "ANTI-CGRP COMPOSITIONS 및 USE THEREOF")의 이점을 주장하며, 이는 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
본원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열목록을 포함하며 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다. 2012년 5월 18일에 만들어진 상기 ASCII 복사물은　67858o730301.txt로 명명되며 그 크기가 203,815 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 인간 칼시토닌 유전자 관련된 펩타이드 (이하 "CGRP")에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 및 그의 단편 (Fab 단편 포함)에 관한 것이다. 본 발명은 또한, CGRP와 연관된 질환 및 장애를 위한 스크리닝 방법, 및 상기 항체 또는 그의 단편을 투여하여 CGRP와 연관된 질환 및 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 37개 아미노산 길이의 다기능성 신경펩타이드로서 생산된다. 인간에게는 CGRP의 두 가지 형태인 CGRP-알파 및 CGRP-베타 형태가 존재하며 이들은 유사한 활성을 갖는다. CGRP-알파 및 CGRP-베타는 인간에서 3개의 아미노산이 다르며, 상이한 유전자로부터 유래된다. 상기 CGRP 패밀리의 펩타이드들은, 각각 구별되는 수용체 및 생물학적 활성을 가짐에도 불구하고, 아밀린, 아드레노메둘린, 및 칼시토닌을 포함한다(Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001)).
CGRP는 활성화될 때 뇌막 내에서 신경펩타이드를 방출하는, 삼차 신경과 같은 수많은 조직으로부터 방출되어, 혈관확장, 혈관 누출, 및 비만 세포 분해를 특징으로 하는 신경성 염증을 매개한다(Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004)). CGRP의 생물학적 효과는, 수용체-연관 막 단백질(RAMP)과 공동으로, 7개의 막통과 성분으로 구성된 CGRP 수용체(CGRP-R)를 통해 매개된다. CGRP-R은 수용체 성분 단백질(RCP)의 활성을 더 필요로 하며, 이는 G 단백질을 통한 아데닐레이트 사이클라제에 대한 효율적인 결합 및 cAMP 생산에 필수적이다(Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001)).
편두통은 미국 내 성인 인구의 약 10%에 영향을 미치는 신경혈관성 장애이며, 통상 극심한 두통을 수반한다. 편두통 환자의 약 20-30%가 전조증상(aura)을 경험하는데, 이는 상기 두통에 선행하고/하거나 이를 동반하는 국소 신경학적 현상을 포함한다. CGRP는 편두통의 발달에 두드러진 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 다른 신경펩타이드는 제외하고, CGRP의 혈장 농도는 편두통의 두통 단계 중 경정맥 혈액에서 증가한 것으로 확인되었다. 게다가, Arulmozhi 등에 따르면, 편두통 환자에서 하기가 확인되었다: (1) 혈장 CGRP 농도와 편두통 간의 강한 상관관계; (2) CGRP의 주입이 편두통-유사 두통을 일으킴; (3) 기준선 CGRP 수준이 증가되었음; 및 (4) 편두통 발작 동안의 혈장 CGRP 수준의 변화가 두통 강도와 유의하게 상관관계가 있음(Arulmozhi, D.K., 등, Vas. Pharma., 43: 176-187 (2005)).
편두통에 대한 한 가지 효과적인 치료법은, 수마트립탄(sumatriptan) 및 리자트립탄(rizatriptan)을 포함하는 트립타민계 약물의 패밀리인, 트립탄의 투여이다. 이 패밀리의 구성원들은 5-HT1B, 5-HT1D, 및 5-HT1F를 포함하는, 다수의 세로토닌 수용체에 대해 친화도를 갖는다. 이 패밀리 약물의 구성원들은 뇌혈관을 선택적으로 수축시킬 뿐만 아니라, 관상 혈관에 대해 혈관수축 효과를 일으킨다(Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004)). 투여 이후 확립된 심장병 환자에게서 관상 연축(coronary spasm)의 이론적인 위험성이 있으며, 트립탄을 섭취한 후 심장 사건이 드물게 일어날 수 있다. 관상 혈관 질환을 갖는 환자에 대해 사용금지되었음에 주목해야 한다.
유사하게도, 통증은 소정의 진통제 또는 비-스테로이드 항염증 약물(NSAID)의 투여를 통해 다뤄질 수 있다. 그러나, 이들 치료제의 투여는 어떤 부정적인 결과를 희생하면서 일어날 수 있다. NSAID는 신부전, 장 출혈, 및 간 기능부전을 일으킬 가능성이 있다. 진통제는 메스꺼움, 구토, 정신 기능 장애, 및 중독을 일으킬 가능성이 있다. 그러므로, 이러한 부정적인 결과 중 일부를 피하기 위해서는 통증을 위한 대안적인 치료법을 찾는 것이 바람직하다.
CGRP는 편두통, 두통, 및 통증을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 질환 및 장애에서 역할을 하는 것으로 여겨진다.
예를 들어, 보고에 따르면 CGRP는 과민성 방광과 상관관계가 있거나 원인적 역할을 할 수 있다. CGRP가 과민성 방광 질환과 관련될 수 있다는 증거는 CGRP가 요로, DRG 및 척수 내에 존재한다는 사실(Wharton 등, 1986 Neurosci (3):727) 및 또한 C 구심 섬유(C-fiber afferent)가 배뇨에 관여하는 자극을 척수에 전달하는데 매우 중요하다는 사실을 포함한다(Yoshida 등, 2011 J Pharmacol Sci (112):128). 또한, 보톡스의 방광내 투여가 CGRP를 억제하고 아세트산-유도된 방광 통증 모델에서의 상호수축 간격을 유의하게 감소시킨다는 것이 보고되었다(Chuang 등, 2004 J Urol (172):1529; Chuang 등, 2009 J Urol (182):786).
CGRP가 이 질환에서 원인적 역할을 할 수 있다는 증거는, 개시된 항-CGRP Ab가 테레빈유-유도된 과민성 방광 모델에서 방광 수축 횟수를 감소시켰다는 것을 제시하는 데이타를 함유하는 최근 공개된 특허출원이다(Pfizer WO 2011/024113)).
이들 및 다른 장애에서의 CGRP의 인지된 관련성으로 인해, 부작용을 피하면서, CGRP와 연관된 질환 및 장애를 예방하거나 치료하는데 유용한 조성물 및 방법이 본 기술분야에 여전히 요구된다. CGRP와 연관된 질환 또는 장애, 예컨대 편두통, 두통, 과민성 방광, 및 통증을 감소시키거나 억제하는 조성물 또는 방법이 본 기술분야에 여전히 요구된다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 특이적 항체 및 그의 단편, 특히 원하는 에피토프 특이성, 높은 친화도 또는 결합능 및/또는 기능적 특성을 갖는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 또 하나의 구현예는 본원에 기재된 항체에 관한 것이고, 이 항체는 본원에 기재된 VH, VL 및 CDR 폴리펩타이드의 서열, 및 그것을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예는 CGRP에 결합하고/하거나 CGRP를 CGRP 수용체 ("CGRP-R")에 결합시켜셔 매개된 생물학적 활성을 억제하는 키메라 또는 인간화 항체 및 그의 단편 (Fab 단편 포함)에 관한 것이다.
또 하나의 본 발명의 바람직한 구현예에서, 전체 길이 항체 및 그의 Fab 단편은 CAMP의 CGRP-알파-, CGRP-베타-, 및 랫트 CGRP-주도된 생산을 억제하는 것으로 고려된다. 본 발명의 추가로 바람직한 구현예에서, 전체 길이 및 그의 Fab 단편은 투여 다음에 수령체의 혈관확장을 감소시키는 것으로 고려된다.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, CGRP에 결합할 수 있는 키메라 또는 인간화 항체 및 그의 단편 (Fab 단편 포함)은 하기의 감소, 치료 또는 예방하는 방법에서 유용하다: (전조가 있거나 없는) 편두통, 암 또는 종양, 암 또는 종양 성장과 연관된 신생혈관형성, 암 또는 종양 생존과 연관된 신생혈관혈성, 체중 감소, 통증, 반신마비성 편두통, 군발성 두통, 편두통성 신경통, 만성 두통, 긴장성 두통, 일반적인 두통, 열감, 만성 발작성 편두통, 두경부에서 근원적인 구조 문제로 인한 이차성 두통, 두개 신경통, 부비동 두통 (예를 들면 부비강염과 연관된 것), 및 알러지-유도된 두통 또는 편두통. 본 발명의 항체 및 항체 단편은 하기 상태 또는 질환 중 하나 이상의 위험을 치료, 예방, 개선, 조절 또는 감소시키는데 특히 유용성을 갖는다: 과민성 방광 및 방광 감염을 갖는 다른 소변 상태, 통증; 만성 통증; 신경성 염증 및 염증성 통증; 신경병성 통증; 눈 통증; 치통; 수술후 통증, 외상 관련된 통증, 화상 관련된 통증, 당뇨병; 비-인슐린 의존 진성 당뇨병 및 다른 염증성 자가면역 장애, 혈관 장애; 염증; 관절염; 기관지 괴만성, 천식; 충격; 패혈증; 아편제 회수 증후군; 모르핀 내성; 남성 및 여성의 열감; 알러지 피부염; 건선; 뇌염; 뇌 외상; 간질; 신경퇴행성 질환; 소양증, 신경성 피부 적열상태, 피부 장미화 및 홍반을 포함하는 피부 질환; 염증성 장질환, 과민성 장 증후군, 방광염; 월경통, 및 잠재적으로 치료 또는 예방될 수 있는 다른 상태 또는 CGRP 수용체의 길항작용에 의해 개선된 증상. 편두통 및 군발성 두통, 및 다른 통증 관련 상태뿐만 아니라 과민성 방광을 포함하는 두통의 습성 또는 예방 치료가 특히 중요하다.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, CGRP에 결합할 수 있는 키메라 또는 인간화 항체 및 그의 단편 (Fab 단편 포함)는 하기의 감소, 치료 또는 예방하는 방법에 바람직하게는 유용하다: 위-식도 역류, 및 위-식도 역류, 소화불량, 과민성 장 증후군, 염증성 장질환, 크론병, 회장염, 궤양성 대장염, 신장 산통, 월경통, 방광염, 생리 기간, 분만, 폐경기, 전립선염, 또는 췌장염과 연관된 내장 통증.
본 발명의 또 하나의 구현예에서 이들 항체 및 인간화 버전은 토끼 면역 세포 (B 림프구)로부터 유래될 수 있고 인간 생식 계열 서열에 대한 그것의 상동성 (서열 동일성)을 기반으로 선택될 수 있다. 이들 항체는 서열 변형을 최소화하거나 그것이 없을 필요가 있을 수 있고, 그렇게 함으로써 인간화 후 기능적 특성의 체류를 용이하게 한다. 본 발명의 추가 구현예는, 예를 들면 토끼 면역 세포로부터 유래된 VH, VL 및 CDR 폴리펩타이드를 포함하는 항-CGRP 항체 및 그것을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로부터의 단편, 뿐만 아니라 CGRP및/또는 CGRP/CGRP-R 복합체에 결합할 수 있는 신규 항체 및 폴리펩타이드 조성물의 창조에서 이들 항체 단편 및 그것을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 기능적 또는 검출가능 모이어티에 콘주게이트된 항-CGRP 항체 및 그의 결합 단편의 콘주게이트을 고려한다. 본 발명은 또한, 상기 키메라 또는 인간화 항-CGRP 또는 항-CGRP/CGRP-R 복합 항체 및 그의 결합 단편을 제조하는 방법을 고려한다. 일 구현예에서, 결합 단편은, 비제한적으로, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 단편, SMIPs (소분자 면역의약품), 카멜바디, 나노바디, 및 IgNAR을 포함한다.
본 발명의 구현예는 CGRP와 연관된 질환 및 장애 또는 그의 이상 발현의 진단, 평가 및 치료를 위한 항-CGRP 항체 및 그의 결합 단편의 용도에 속한다. 본 발명은 또한, CGRP와 연관된 질환 및 장애 또는 그의 이상 발현의 진단, 평가 및 치료를 위한 항-CGRP 항체의 단편의 용도를 고려한다. 본 발명의 다른 구현예는 재조합 숙주세포, 예를 들면 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 또는 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 항-CGRP 항체 또는 그의 단편의 생산에 관한 것이다.
도 1은 전체길이 항체 Ab1에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 2는 전체길이 항체 Ab2에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 3은 전체길이 항체 Ab3에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 4는 전체길이 항체 Ab4에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 5는 전체길이 항체 Ab5에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 6은 전체길이 항체 Ab6에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 7은 전체길이 항체 Ab7에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 8은 전체길이 항체 Ab8에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 9는 전체길이 항체 Ab9에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 10은 전체길이 항체 Ab10에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 11은 전체길이 항체 Ab11에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 12는 전체길이 항체 Ab12에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 13은 전체길이 항체 Ab13에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 14는 전체길이 항체 Ab14에 대응하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 제공한다.
도 15는 항체 Ab1, Ab2, Ab3, 및 Ab4에 대해 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 CGRP-알파 ELISA 결합 데이타를 제공한다.
도 16은 항체 Ab5, Ab6, Ab7, 및 Ab8에 대해 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 CGRP-알파 ELISA 결합 데이타를 제공한다.
도 17은 항체 Ab9, Ab10, 및 Ab14에 대해 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 CGRP-알파 ELISA 결합 데이타를 제공한다.
도 18은 항체 Ab11, Ab12, 및 Ab13에 대해 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 CGRP-알파 ELISA 결합 데이타를 제공한다.
도 19는 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab1, Ab2, 및 Ab4에 의한 CGRP-알파-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 20은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab3에 의한 CGRP-알파-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 21은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab5 및 Ab6에 의한 CGRP-알파-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 22는 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab7, Ab8, Ab9, 및 Ab10에 의한 CGRP-알파-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 23은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab11, Ab12, 및 Ab13에 의한 CGRP-알파-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 24는 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab14에 의한 CGRP-알파-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 25은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab1, Ab2, 및 Ab3에 의한 CGRP-베타-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 26은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab4, Ab5, 및 Ab6에 의한 CGRP-베타-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 27은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab7 및 Ab8에 의한 CGRP-베타-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 28은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab9, Ab10, 및 Ab14에 의한 CGRP-베타-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 29은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab11, Ab12, 및 Ab13에 의한 CGRP-베타-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 30은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab1, Ab2, Ab4, 및 Ab5에 의한 랫트 CGRP-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 31은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab3 및 Ab6에 의한 랫트 CGRP-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 32는 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab7 및 Ab8에 의한 랫트 CGRP-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 33은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab9에 의한 랫트 CGRP-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 34는 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab10에 의한 랫트 CGRP-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 35는 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab11 및 Ab12에 의한 랫트 CGRP-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 36은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab13에 의한 랫트 CGRP-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 37은 아래의 실시예 1의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab14에 의한 랫트 CGRP-주도된 cAMP 생산의 억제를 실증한다.
도 38은 아래의 실시예 6의 프로토콜에 따라 수득된 항체 Ab1-Ab13에 의한 방사표지된 CGRP의 CGRP-R에의 결합의 억제를 실증한다.
도 39는, 하기 실시예 7의 프로토콜에 따라 수득된, 대조군 항체와 비교하여, 랫트 모델에서 캡사이신 투여 후 항체 Ab3 및 Ab6을 투여함으로써 얻어진 혈관확장의 감소를 보여준다.
도 40은, 하기 실시예 7의 프로토콜에 따라 수득된, 대조군 항체와 비교하여, 랫트 모델에서 캡사이신 투여 후 다양한 농도의 항체 Ab6을 투여함으로써 얻어진 혈관확장의 감소를 보여준다.
도 41A-C는 식염수 주입 동안 방광 용량(bladder capacity)에 대한 Ab3의 유리한 효과를 보여준다. 동물들에게 Ab3 또는 음성 대조군 항체를 투여한 다음, 방광 내로 식염수 주입 동안 관찰하였다. ICI(패널 A)는 증가되었고, MF(패널 B)는 감소되었으며, 이는 증가된 방광 용량을 가리킨다. AM(패널 C)의 차이는 표준 편차에 속하였고 통계학적으로 유의하지 않았다. 별표는 통계학적으로 유의한 개선을 가리킨다(p < 0.05 비모수 스튜던트 t-검정, 음성 대조군 Ab에 대한 비교). 범례: 검정 막대: Ab3 처리(10 mg/kg); 흰색 막대: 음성 대조군 항체(10 mg/kg). 오차 막대는 표준 편차를 가리킨다. 약어: ICI : 상호수축 간격; MF : 배뇨 빈도; AM : 배뇨의 진폭.
도 42는 신경병성 통증 모델에서의 Ab2의 효과를 보여준다. 정(Chung) 수술(L5/L6 척수 신경 결찰)에 의해 기계적 이질통증이 유도되었고, Ab2 처리된 동물(빗금선 막대) 및 대조군 동물(채워진 막대) 사이에 민감도가 비교되었다. 더 높은 수치는 더 낮은 민감도를 가리킨다. 평균 민감도는 13일(Ab2 투여 전)에는 유사하였으나, 14일 및 17일에는 개선되었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 가리킨다.
도 43은 Ab2 및 모르핀의 진통 효과를 보여준다. 모르핀(개방된 정사각형), Ab2(10 mg/kg, 채워진 삼각형), 또는 비히클(음성 대조군, 개방된 원)이 투여된 동물에 대해 꼬리 회수(withdrawal) 시간(Y-축, 초)에 의해 통증 민감도를 평가하였다. 모르핀 내성이 발생된 동물들은 4일째까지 대조군 동물과 유사한 꼬리 회수 시간을 나타내었다. 반면, Ab2-처리된 동물은 실험 과정 내내(7일째까지) 꼬리 회수 시간의 지속적 개선을 나타내었다. Ab2-처리된 동물에서의 개선은 통계학적으로 유의하였다(p < 0.05 일원분산분석(one-way ANOVA) 후 던넷 검정, 비히클에 대한 비교, 별표로 표시됨). 오차 막대는 평균 표준 오차를 가리킨다.
도 44는 Ab2의 용량-의존적 진통 효과를 보여준다. 0일(첫 번째 꼬리 회수 시간 시험 이후)에, 랫트에게 1 mg/kg(채워진 정사각형), 3 mg/kg(채워진 역삼각형), 또는 10 mg/kg(채워진 삼각형) 용량의 항체 Ab2, 또는 비히클(개방된 원) 또는 음성 대조군 항체(개방된 정사각형)를 투여하였다. 아픈 열 자극에 반응한 랫트의 꼬리 회수 시간을 매일 평가하였다(더 높은 시간은 통증에 대한 상대적 무감각을 가리킴). Ab2의 투여에 의해 용량-의존 방식으로 꼬리 회수 시간이 증가하였다. 별표는 꼬리 회수 시간에서의 통계학적으로 유의한 증가를 가리킨다(p < 0.05 일원분산분석(one-way ANOVA) 후 던넷 검정, 비히클에 대한 비교). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 가리킨다.
도 45는 모르핀과 병용된 Ab2의 진통 효과, 및 모르핀 내성이 시작된 후 모르핀을 회수할 때의 진통 효과를 보여준다. 0일(첫 번째 꼬리 회수 시간 시험 이후)에, 랫트에게 10 mg/kg 용량의 항체 Ab2(채워진 정사각형 및 채워진 삼각형) 또는 비히클(개방된 원)을 투여하였다. 그리고 나서, 랫트에게 1일 내지 10일(채워진 정사각형)에 또는 1일 내지 4일(채워진 삼각형)에만 모르핀을 투여하였다. 모르핀-처리 마우스에서 꼬리 회수 시간은 처음에는 크게 증가하였으나, 이후 감소하였고, 이는 모르핀 내성을 가리킨다. 그러나, 4일 이후 모르핀이 회수된 마우스에서, 꼬리 회수 시간은 증가되었고 5일 내지 8일에 높은 상태를 유지하였다. 오차 막대는 평균 표준 오차를 가리킨다.
도 46은 내장 통증 랫트 모델에서의 Ab2의 효과를 보여준다. 비처리(naive) 동물(개방된 막대) 또는 음성 대조군 항체(채워진 막대) 또는 Ab2(빗금선 막대)를 받은 만성 결장 과민을 유발하는 TNBS로 처리된 동물에 대해 결장 팽창 역치(더 높은 값은 더 낮은 민감도를 가리킴)를 측정함으로써 내장 통증을 정량하였다. 과민감성은 Ab2-처리된 동물에 의해 27%까지 완화되었고, 팽창 역치는 Ab2의 투여에 의해 유의하게 개선되었다(p < 0.05 스튜던트 t-검정, TNBS + 음성 대조군에 대한 비교). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 가리킨다.
바람직한 구현예의 상세한 설명
정의
본 발명은 기술된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 및 시약이 달라질 수 있기 때문에 이에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것이며 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이 단수형 및 정관사형은 상기 문맥이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"의 언급은 복수의 상기 세포를 포함하며, "단백질"의 언급은 하나 이상의 단백질 및 본 기술분야의 숙련자에게 널리 알려진 이의 등가물 등의 언급을 포함한다. 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은, 달리 언급하지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP): 본원에서 사용된 바와 같이, CGRP는 American Peptides(Sunnyvale CA) 및 Bachem(Torrance, CA)으로부터 이용가능한 하기 호모사피엔스 CGRP-알파 및 호모사피엔스 CGRP-베타 아미노산 서열뿐만 아니라, 이들 CGRP 아미노산 서열의 임의의 막-결합 형태 외에도, 이 서열의 돌연변이 (뮤디엔), 스플라이스 변이체, 동형체, 오쏘로그, 동족체 및 변이체를 포함한다:
CGRP -알파: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 (서열번호: 281), 여기에서, N-말단의 페닐알라닌은 아미드화되어 있다;
CGRP -베타: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2 (서열번호: 282), 여기에서, N-말단의 페닐알라닌은 아미드화되어 있다.
컴피턴트 효모 종의 접합(mating): 본 발명에서, 이것은 배양으로 성장할 수 있는 임의의 2배체(diploid) 또는 4배체(tetraploid) 효모를 광범위하게 포함하는 것으로 의도된다. 상기 효모 종은 반수체, 2배체, 또는 다른 다배체 형태로 존재할 수 있다. 주어진 배수성의 세포들은, 적절한 조건 하에서, 상기 형태의 규정되지 않은 수의 세대를 위해 증식될 수 있다. 순차적 접합(mating)은 추가 접합(mating) 또는 2배체 균주의 융합을 통해 4배체 균주를 야기할 수 있다. 본 발명은 반수체 효모 뿐만 아니라, 예를 들면, 접합(mating) 또는 스페로플라스트 융합에 의해 생산된 2배체 또는 다른 다배체 효모 세포의 사용을 고려한다.
본 발명의 일 구현예에서, 교배 능력이 있는 효모는 사카로마이세타시애 패밀리의 구성원이며, 이는 아르크시오자이마(Arxiozyma); 아스코보트라이오자이마(Ascobotryozyma); 사이테로마이세스(Citeromyces); 데바리오마이세스(Debaryomyces); 덱케라(Dekkera); 에레모테시움(Eremothecium); 이사첸키아(Issatchenkia); 카자키스타니아(Kazachstania); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces); 코다마에아(Kodamaea); 로데로마이세스(Lodderomyces); 파키솔렌(Pachysolen); 피치아(Pichia); 사카로마이세스(Saccharomyces); 사투르니스포라(Saturnispora); 테트라피시스포라(Tetrapisispora); 톨루라스포라(Torulaspora); 윌리옵시스(Williopsis); 및 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)를 포함한다. 본 발명에서 잠재적으로 유용한 효모의 다른 유형은 야로위아(Yarrowia); 로도스포리디움(Rhodosporidium); 칸디다(Candida): 한세눌라(Hansenula); 필로바시움(Filobasium); 스포리디오볼러스(Sporidiobolus); 불레라(Bullera); 류코스포리디움(Leucosporidium) 및 필로바시델라(Filobasidella) 속을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 교배 능력이 있는 효모는 피치아 속의 구성원이다. 본 발명의 추가로 바람직한 구현예에서, 피치아 속의 교배 능력이 있는 효모는 하기 종 중 하나이다: 피치아 패스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)(피치아 앙구스타(Pichia angusta)). 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 피치아 속의 교배 능력이 있는 효모는 피치아 패스토리스 종이다.
반수체 효모 세포: 그의 정상 게놈(염색체) 보체(complement)의 각 유전자의 단일 카피를 갖는 세포.
다배체 효모 세포: 그의 정상 게놈 (염색체) 보체 중 하나를 초과하는 카피를 갖는 세포.
2배체 효모 세포: 전형적으로 두 개의 반수체 세포의 융합(접합) 과정에 의해 형성된, 그의 정상 게놈 보체의 본질적으로 모든 유전자의 2개의 카피(대립 유전자)를 갖는 세포.
4배체 효모 세포: 전형적으로 두 개의 반수체 세포의 융합(접합) 과정에 의해 형성된, 그의 정상 게놈 보체의 본질적으로 모든 유전자의 4개의 카피(대립 유전자)를 갖는 세포. 4배체는 2, 3, 4 이상의 상이한 발현 카세트를 가질 수 있다. 이러한 4배체는 사카로마이세스 세레비지애에서 동형접합체 헤테로탈릭 a/a 및 알파/알파 2배체의 선택적 접합에 의해 그리고 피치아에서 영양요구성 2배체를 수득하기 위해 반수체의 순차적 접합에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, [met his] 반수체는 [ade his] 반수체와 접합되어 2배체 [his]를 수득할 수 있으며; [met arg] 반수체는 [ade arg] 반수체와 접합되어 2배체 [arg]를 수득할 수 있고; 이후 2배체 [his] x 2배체 [arg]하여 4배체 자가 영양 생물(prototroph)을 수득할 수 있다. 2배체 세포의 이점 및 사용에 대한 언급은 4배체 세포에도 적용될 수 있는 것으로 본 기술분야의 숙련자에게 이해될 것이다.
효모 접합(mating): 2개의 반수체 효모 세포가 자연적으로 융합하여 하나의 2배체 효모 세포를 형성하는 과정.
감수분열(meiosis): 2배체 효모 세포가 감소적 분열을 겪어 4개의 반수체 포자 산물을 형성하는 과정. 이후, 각 포자는 발아되어 영양적으로 성장하는 세포주인 반수체를 형성할 수 있다.
선별 마커: 선별 마커는, 예를 들어 형질전환 사건을 통해서, 상기 유전자를 받는 세포에게 성장 표현형(신체 성장 특징)을 부여하는 유전자 또는 유전자 단편이다. 선별 마커는 선별 마커 유전자를 받지 않은 세포가 성장할 수 없는 조건 하에서 선별 성장 배지에서 상기 세포가 생존하고 성장하게 한다. 선별 마커 유전자는 일반적으로 항생제 또는 기타 약물, 온도(2개의 온도 민감성("ts") 돌연변이가 교차되거나 ts 돌연변이체가 형질전환될 때)에 세포 내성을 부여하는 유전자와 같은 양성 선별 유전자; 예컨대 생합성 유전자를 갖지 않는 모든 세포가 필요로 하는 특정 영양소가 없는 배지에서 성장하는 능력을 세포에게 부여하는 생합성 유전자, 또는 야생형 유전자를 갖지 않는 세포에 의해 성장 불능을 세포에게 부여하는 돌연변이된 생합성 유전자와 같은 음성 선별 마커 등을 포함하는, 몇 가지 유형에 속한다. 적합한 마커는 ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
발현 벡터: 이들 DNA 벡터는 표적 숙주세포 내에서 외래 단백질을 발현시키기 위한 조작을 용이하게 하는 요소를 함유한다. 간편하게, 형질전환을 위한 DNA의 서열 및 생산의 조작이 박테리아 숙주, 예를 들어 대장균에서 일차적으로 수행되고, 일반적으로 벡터들은 박테리아 복제 기점 및 적절한 박테리아 선별 마커를 포함하는, 상기 조작을 용이하게 하는 서열들을 포함할 것이다. 선별 마커는 선별 배양 배지에서 성장한 형질전환된 숙주세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 선별 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주세포는 배양 배지에서 생존하지 않을 것이다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결핍을 보충하는 단백질, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 매우 중용한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다. 효모의 형질전환을 위한 예시적인 벡터 및 방법이, 예를 들어 문헌[Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기술되어 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 발현 벡터는 형질전환된 효모 균주를 확인하기 위한 영양요구성 또는 약물 선별 마커를 포함하는, 효모 특이적 서열들을 추가로 포함할 것이다. 약물 마커는 효모 숙주세포에서 벡터의 카피수를 증폭시키는데 추가로 사용될 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드 코딩 서열은 효모 세포에서의 폴리펩타이드의 발현을 제공하는 전사 및 번역 조절 서열들에 작동가능하게 연결된다. 이들 벡터 성분은, 비제한적으로, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열. 폴리펩타이드의 분비를 위한 서열들, 예를 들어 신호 서열 등이 또한 포함될 수 있다. 효모 복제 기점은 선택적인데, 발현 벡터가 종종 효모 게놈 내로 통합되기 때문이다. 본 발명의 일 구현예에서, 목적하는 폴리펩타이드는 효모 2배체 세포로부터의 폴리펩타이드의 최적화된 분비를 제공하는 서열들에 작동가능하게 연결되거나 융합된다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계 내로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 신호 서열을 위한 DNA는, 만약 이것이 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되면, 폴리펩타이드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 만약 이것이 서열의 전사에 영향을 미치면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결"되는 것은 연결될 DNA 서열이 인접하는 것을 의미하고, 분비성 리더인 경우, 인접하고 해독틀(reading frame) 안에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 간편한 제한 부위에서의 라이게이션(ligation)에 의해 또는 대안적으로는 당해분야의 숙련자에게 공지된 PCR/재조합 방법(GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California)에 의해 달성된다. 만약 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상적 관례에 따라 사용된다.
프로모터는 구조 유전자(일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)의 시작 코돈의 상류(5')에 위치하는 비번역 서열로서, 이들이 작동가능하게 연결된 특정한 핵산 서열의 전사 및 번역을 제어한다. 이러한 프로모터들은 몇 가지 계열에 속한다: 유도성(inducible), 항시적(constitutive), 및 억제성(repressible) 프로모터(억제인자의 부재시 전사 수준을 증가시킴). 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예를 들면, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도 변화에 반응하여 이들의 제어 하에 있는 DNA로부터 증가된 전사 수준을 개시할 수 있다.
효모 프로모터 단편은 또한 효모 게놈 내의 동일한 부위 내로의 발현 벡터의 상동 재조합 및 통합을 위한 부위로서 작용할 수 있고, 대안적으로 선별 마커가 상동 재조합을 위한 부위로서 사용된다. 피치아 형질전환이 문헌[Cregg 등 (1985) Mol . Cell . Biol . 5:3376-3385]에 기술되어 있다.
피치아 유래의 적합한 프로모터의 예는 AOX1 프로모터(Cregg 등 (1989) Mol. Cell . Biol. 9:1316-1323); ICL1 프로모터(Menendez 등 (2003) Yeast 20(13):1097-108); 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 프로모터(GAP)(Waterham 등 (1997) Gene 186(1):37-44); 및 FLD1 프로모터(Shen 등 (1998) Gene 216(1):93-102)를 포함한다. GAP 프로모터는 강한 항시적 프로모터이고 AOX 및 FLD1 프로모터는 유도성이다.
기타 효모 프로모터는 ADH1, 알코올 탈수소효소 II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk, 및 이들로부터 유래된 키메라 프로모터를 포함한다. 추가로, 비-효모 프로모터, 예컨대 포유동물, 곤충, 식물, 파충류, 양서류, 바이러스, 및 조류 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. 가장 전형적으로 상기 프로모터는 포유동물 프로모터(발현된 유전자에 대해 잠재적으로 내인성임)를 포함하거나 효모 시스템에서의 효율적인 전사를 제공하는 효모 또는 바이러스 프로모터를 포함할 것이다.
목적하는 폴리펩타이드는 직접적으로 뿐만 아니라, 이종 폴리펩타이드, 예를 들어 신호 서열 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드를 갖는 융합 폴리펩타이드로서 재조합으로 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분이거나 벡터 내로 삽입된 폴리펩타이드 코딩 서열의 일부일 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주세포 내에서 이용가능한 표준 경로 중 하나를 통해 인식되고 가공되는 신호 서열이다. 사카로마이세스 세레비지애 알파 인자 프리-프로신호는 피. 패스토리스로부터의 다양한 재조합 단백질의 분비에 효과적인 것으로 입증되었다. 다른 효모 신호 서열들은 알파 접합 인자 신호 서열, 인버타제 신호 서열, 및 다른 분비된 효모 폴리펩타이드들로부터 유래된 신호 서열을 포함한다. 또한, 이들 신호 펩타이드 서열은 2배체 효모 발현 시스템에서 향상된 분비를 제공하기 위해 조작될 수 있다. 목적하는 다른 분비 신호들은 또한 포유동물 신호 서열을 포함하며, 이는 분비될 단백질에 대해 이종이거나, 분비될 단백질에 대한 천연 서열일 수 있다. 신호 서열은 프리-펩타이드 서열을 포함하며, 일부 경우, 프로펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 사슬, 예컨대, K28 프리프로독소 서열, PHA-E, FACE, 인간 MCP-1, 인간 혈청 알부민 신호 서열, 인간 Ig 중쇄, 인간 Ig 경쇄 등에서 발견되는 신호 서열들을 포함하는 이러한 많은 신호 서열들이 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Hashimoto et . al . Protein Eng 11(2) 75 (1998); 및 Kobayashi et . al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998)]을 참조한다.
전사는 벡터 내로 전사 활성자 서열을 삽입함으로써 증가될 수 있다. 이들 활성자는 보통 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용 요소로서, 프로모터 상에 작용하여 그 전사를 증가시킨다. 전사 인핸서는 상대적으로 배향 및 위치 독립적이며, 인트론 내에서 뿐만 아니라 코딩 서열 자체 내에서, 전사 단위의 5' 및 3'에서 발견된다. 인핸서는 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내로 접합될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
원핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 그러한 서열은 원핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비번역된 영역에서, 번역 종결 코돈의 3'으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 mRNA의 비번역된 부분 내의 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 세그먼트를 함유한다.
상기 열거된 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 제조는 표준 라이게이션 기술 또는 PCR/재조합 방법을 이용한다. 분리된 플라스미드 또는 DNA 단편들은 절단되고, 조정되고, 필요한 플라스미드를 생성하기 위한 원하는 형태로 또는 재조합 방법을 통해 다시 라이게이션된다. 제조된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석을 위해, 상기 라이게이션 혼합물들을 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 성공적인 형질전환체를 적절한 경우 항생제 내성(예컨대, 암피실린 또는 제오신)에 의해 선택한다. 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 분석되고/거나 서열을 분석한다.
단편들의 제한효소 처리 및 라이게이션의 대안으로서, att 부위에 기초한 재조합 방법 및 재조합 효소가 벡터 내로 DNA 서열을 삽입하는 데 사용된다. 상기 방법은, 예를 들어 문헌[Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949]에 기술되어 있고, 당해분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 상기 방법은 람다 및 대장균-인코딩된 재조합 단백질의 혼합물에 의해 매개되는 분자간 DNA 재조합을 이용한다. 재조합은 상호작용하는 DNA 분자들 상의 특이적 부착(att) 부위들 사이에서 일어난다. att 부위의 설명을 위해, 문헌[Weisberg, ed.(Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250]을 참조한다. 재조합 후 att 부위가 각각의 모 벡터에 의해 제공된 서열로 구성된 하이브리드 서열이 되도록, 재조합 부위의 측면에 있는 DNA 세그먼트들은 스위치된다. 재조합은 임의의 위상기하학의 DNA들 사이에서 일어날 수 있다.
Att 부위는, 적절한 벡터 내로 목적하는 서열을 라이게이션하고, 특정 프라이머를 사용하여 att B 부위를 함유하는 PCR 생성물을 생성하고, att 부위 등을 함유하는 적절한 벡터 내로 클로닝된 cDNA 라이브러리를 생성함으로써, 목적하는 서열 내로 도입될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴딩(folding)은, 아미노산 잔기들 간의 상호작용이 구조를 안정화시키는 작용을 하는 경우, 폴리펩타이드 및 단백질의 3차원 구조를 지칭한다. 비-공유 상호작용이 구조를 결정하는데 중요하지만, 보통 목적하는 단백질은 2개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 분자내- 및/또는 분자간 공유성 이황화 결합을 가질 것이다. 자연으로 발생하는 단백질 및 폴리펩타이드 또는 그의 유도체 및 변이체의 경우, 적절한 폴딩은 전형적으로 최적의 생물학적 활성을 야기하는 배열이며, 이는 활성, 예컨대 리간드 결합, 효소 활성 등의 분석에 의해 간편하게 관찰될 수 있다.
일부 경우, 예를 들어 원하는 생성물이 합성 기원인 경우, 생물학적 활성에 기초한 분석이 덜 중요할 것이다. 그와 같은 분자의 적절한 폴딩은 물리적 특성, 에너지 고려, 모델링 연구 등에 기초하여 결정될 수 있다.
발현 숙주는 폴딩 및 이황화 결합 형성을 향상시키는 하나 이상의 효소, 즉 폴다아제, 샤페로닌 등을 코딩하는 서열의 도입에 의해 추가로 개질될 수 있다. 그러한 서열은 본 기술분야에 공지된 바와 같은 벡터, 마커 등을 이용하여 효모 숙주세포에서 항시적으로 또는 유도성으로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 원하는 발현 패턴에 충분한 전사 조절 요소를 포함하는 서열들이 표적화된 방법론을 통해 효모 게놈에 안정적으로 통합된다.
예를 들어, 원핵 PDI는 단백질 시스테인 산화 및 이황화 결합 이성질화의 효율적인 촉매일 뿐만 아니라, 샤페론 활성을 나타낸다. PDI의 공동-발현은 다수의 이황화 결합을 갖는 활성 단백질의 생산을 용이하게 할 수 있다. BIP(면역글로불린 중쇄 결합 단백질), 사이클로필린 등의 발현이 또한 관심대상이다. 본 발명의 일 구현예에서, 반수체 모 균주 각각은 별개의 폴딩 효소를 발현하며, 예컨대 하나의 균주가 BIP를 발현하고, 다른 균주가 PDI 또는 이들의 조합을 발현할 수 있다.
용어들 "원하는 단백질" 또는 "원하는 항체"는 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 표적에 특이적인 모 항체, 즉, CGRP 또는 키메라 또는 인간화 항체 또는 본원에 기술된 바와 같이 이들로부터 유래된 이의 결합 부분을 지칭한다. 용어 "항체"는 에피토프에 일치하거나 이를 인식하는 특이적 형상을 갖는 임의의 폴리펩타이드 사슬-함유 분자 구조를 포함하는 것으로 의도되며, 여기에서 하나 이상의 비-공유 결합 상호작용들이 분자 구조 및 에피토프 간의 복합체를 안정화시킨다. 전형적인 항체 분자는 면역글로불린이며, 모든 공급원, 예컨대 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 기타 포유동물, 닭, 기타 조류 등으로부터 유래된 모든 유형의 면역글로불린, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 등이 "항체"로 간주된다. 본 발명에 따른 출발 물질로서 유용한 항체를 생산하기 위한 바람직한 공급원은 토끼이다. 수많은 항체 코딩 서열들이 기술되어 왔으며, 다른 것들은 당해분야에 잘 공지된 방법에 의해 제기될 수 있다. 이의 예는 키메라 항체, 인간 항체 및 다른 비-인간 포유동물 항체, 인간화 항체, 단일 사슬 항체(예컨대 scFv), 카멜바디, 나노바디, IgNAR(상어로부터 유래된 단일-사슬 항체), 작은-모듈 면역의약품(SMIP) 및 Fab, Fab', F(ab')2 등과 같은 항체 단편을 포함한다. 문헌[Streltsov VA, 등, Structure of a shark IgNAR antibody variable domain 및 modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci. 2005 Nov;14(11):2901-9. Epub 2005 Sep 30; Greenberg AS, 등, A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement 및 extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar 9;374(6518):168-73; Nuttall SD, 등, Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, 및 use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 Aug;38(4):313-26; Hamers-Casterman C, 등, Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446-8; Gill DS, 등, Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 Dec; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct 19]을 참조한다.
예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 유전공학에 의해 생산될 수 있다. 다른 방법과 마찬가지로, 이러한 기술에서, 항체-생산 세포는 원하는 항원 또는 면역원에 대해 감작화된다. 항체 생산 세포로부터 분리된 메신저 RNA가 PCR 증폭을 이용하여 cDNA를 만들기 위한 주형으로서 사용된다. 초기 항원 특이성을 보유하는 하나의 중쇄 유전자 및 하나의 경쇄 유전자를 함유하는 각각의 벡터의 라이브러리가 발현 벡터 내로 상기 증폭된 면역글로불린 cDNA의 적절한 부분을 삽입함으로써 생산된다. 조합 라이브러리는 중쇄 유전자 라이브러리를 경쇄 유전자 라이브러리와 조합함으로써 구축된다. 이것은 중쇄 및 경쇄(항체 분자의 Fab 단편 또는 항원 결합 단편과 유사함)를 공동-발현하는 클론의 라이브러리를 생성한다. 이들 유전자를 갖는 벡터들은 숙주세포 내로 공동-형질감염된다. 항체 유전자 합성이 상기 형질감염된 숙주에서 유도될 때, 중쇄 및 경쇄 단백질들이 자가-조립되어 항원 또는 면역원을 이용한 스크리닝에 의해 검출될 수 있는 활성 항체를 생산한다.
목적하는 항체 코딩 서열은 천연 서열에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라 유전 코드의 축퇴성에 의해 상기 개시된 핵산 및 그의 변이체와 서열이 동일하지 않은 핵산에 의해 코딩된 것을 포함한다. 변이체 폴리펩타이드는 아미노산(aa) 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이거나 또는 글리코실화 부위를 변화시키기 위한 것과 같은 비-필수적인 아미노산을 제거하거나 기능에 필요하지 않은 하나 이상의 시스테인 잔기의 치환 또는 결실에 의해 미스폴딩을 최소화하는 치환일 수 있다. 변이체는 단백질의 특정한 영역(예컨대, 기능적 도메인, 촉매성 아미노산 잔기 등)의 향상된 생물학적 활성을 보유하거나 갖도록 설계될 수 있다. 변이체는 또한 본원에 개시된 폴리펩타이드의 단편, 특히 생물학적으로 활성인 단편 및/또는 기능적 도메인에 상응하는 단편을 포함한다. 클로닝된 유전자의 시험관내 돌연변이유발을 위한 기술들은 공지되어 있다. 단백분해 분해에 대한 이들의 내성을 개선하거나, 용해도 특성을 최적화하거나, 이들을 치료제로서 더 적합하게 하기 위해, 통상의 분자생물학적 기술을 이용하여 변형된 폴리펩타이드 역시 본 발명에 포함된다.
키메라 항체는 하나의 종의 항체 생산 세포로부터 수득된 가변 경쇄 및 중쇄 영역 (VL 및 VH)을 또 다른 종으로부터 유래된 불변 경쇄 및 중쇄 영역과 조합함으로써 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로 키메라 항체는 대부분 인간 도메인을 갖는 항체를 생산하기 위해, 설치류 또는 토끼 가변 영역 및 인간 불변 영역을 이용한다. 그와 같은 키메라 항체의 생산은 본 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 표준 방법에 의해 달성될 수 있다(예컨대, 전체가 참고로써 본원에 통합되어 있는 미국 특허 제5,624,659호에 기술된 바와 같음). 본 발명의 키메라 항체의 인간 불변 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 불변 영역으로부터 선택될 수 있음이 추가로 고려된다.
인간화 항체는 한층더 인간-유사 면역글로불린 도메인을 함유하고, 단지 동물-유래 항체의 상보성-결정 영역만을 포함하도록 조작된다. 이것은 모노클로날 항체의 가변 영역의 초-가변 루프의 서열을 주의깊게 조사하고, 이들을 인간 항체 사슬의 구조에 맞춤으로써 달성된다. 외관상 복잡함에도 불구하고, 상기 공정은 실제로는 간단하다. 예를 들어, 본원에 참조로써 통합되어 있는 미국 특허 제6,187,287호를 참조한다.
전체 면역글로불린(또는 이들의 재조합 대응물) 외에도, 에피토프 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 단편(예컨대, Fab', F(ab')2, 또는 다른 단편)이 합성될 수 있다. "단편", 또는 최소 면역글로불린은 재조합 면역글로불린 기술을 이용하여 설계될 수 있다. 예를 들어 본 발명에 사용하기 위한 "Fv" 면역글로불린은 융합된 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역을 합성함으로써 생산될 수 있다. 항체의 조합, 예컨대 2개의 별개의 Fv 특이성을 포함하는 디아바디(diabody) 역시 관심대상이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, SMIP(소분자 면역의약품), 카멜바디, 나노바디, 및 IgNAR가 면역글로불린 단편에 포함된다.
면역글로불린 및 그의 단편은 번역후 개질될 수 있으며, 예컨대 화학적 링커와 같은 효과기 부분, 형광 염료, 효소, 독소, 기질, 생물발광 물질, 방사선활성 물질, 화학발광 부분과 같은 검출가능한 부분, 또는 스트렙타비딘, 아비딘 또는 바이오틴과 같은 특이적 결합 부분 등을 부가하는 것이 본 발명의 방법 및 조성물에 이용될 수 있다. 부가적인 효과기 분자의 예가 아래에 제공되어 있다
만약 유전 코드에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열의 번역이 폴리펩타이드 서열을 생성하는 경우(즉, 폴리뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드 서열을 "코딩"하는 경우), 폴리펩타이드 서열은 폴리펩타이드 서열에 "대응"되며, 만약 두 개의 서열이 동일한 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 경우 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열은 또 다른 폴리뉴클레오타이드 서열에 "대응"된다.
DNA 컨스트럭트의 "이종" 영역 또는 도메인은 더 큰 DNA 분자 내의 인식가능한 DNA의 세그먼트로서, 자연에서 상기 더 큰 분자와 함께 발견되지 않는다. 따라서, 이종 영역이 포유동물 유전자를 코딩하는 경우, 상기 유전자는 생물 공급원의 게놈 내에서 포유동물 게놈 DNA의 측면에 존재하지 않는 DNA가 보통 측면에 존재할 것이다. 이종 영역의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 컨스트럭트(예를 들어, 게놈 코딩 서열이 인트론을 함유하는 cDNA, 또는 천연 유전자와 다른 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 대립유전자 변화 또는 자연적으로 발생하는 돌연변이 사건은 본원에 규정된 DNA의 이종 영역을 야기하지 않는다.
"코딩 서열"은 (유전 코드를 고려하여) 단백질 또는 펩타이드 서열에 대응되거나 이들을 코딩하는 코돈의 인프레임(in-frame) 서열이다. 2개의 코딩 서열들은, 만약 상기 서열 또는 이들의 상보적 서열이 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 경우 서로 대응된다. 적절한 조절 서열과 연합된 코딩 서열은 폴리펩타이드로 전사 및 번역될 수 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열이 보통 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다. "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라아제에 결합하여 하류(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 전형적으로 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 조절 분자(예컨대, 전사 인자)의 결합을 위한 부가적 부위를 함유한다. 코딩 서열은 세포에서 RNA 폴리머라아제가 프로모터 서열에 결합하여 코딩 서열을 mRNA로 전사한 다음, 최종적으로 mRNA가 상기 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역될 때, 상기 프로모터 서열의 "조절 하에" 있거나 상기 프로모터에 "작동가능하게 연결"된다.
벡터는 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 외래 물질을 생물 또는 숙주세포 내로 도입하는데 사용된다. 전형적인 벡터는 재조합 바이러스(폴리뉴클레오타이드용) 및 리포솜(폴리펩타이드용)을 포함한다. "DNA 벡터"는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이며, 여기에 또 다른 폴리뉴클레오타이드 세그먼트가 부착되어 상기 부착된 세그먼트의 복제를 일으킨다. "발현 벡터"는 적절한 숙주세포에 의해 폴리펩타이드 합성을 지시할 조절 서열을 함유하는 DNA 벡터이다. 이것은 보통 프로모터가 RNA 폴리머라아제에 결합하여 mRNA의 전사를 개시할 뿐만 아니라 리보솜 결합 부위 및 개시 신호가 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 번역을 지시한다는 것을 의미한다. 적절한 부위에서 그리고 정확한 해독틀로 발현 벡터 내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 통합한 다음, 벡터에 의해 적절한 숙주세포를 형질전환시키는 것은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 생산을 가능하게 한다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 "증폭"은 특정한 핵산 서열의 다수의 카피의 시험관내 생산이다. 상기 증폭된 서열은 보통 DNA의 형태이다. 이러한 증폭을 수행하기 위한 다양한 기술들이 검토 문헌[Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291-294)]에 기술되어 있다. 폴리머라아제 사슬 반응 또는 PCR은 핵산 증폭의 원조이며, 본원에서 PCR의 사용은 다른 적합한 증폭 기술의 예로서 고려되어야 한다.
현재 척추동물 내 항체의 일반적인 구조는 잘 이해되고 있다(Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). 항체는 대략 23,000 달톤의 분자량의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드("경쇄"), 및 분자량 53,000-70,000의 2개의 동일한 중쇄("중쇄")로 이루어진다. 상기 4개의 사슬은 이황화 결합에 의해 "Y" 배열로 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y" 배열의 입에서 시작하는 중쇄를 묶는다. "Y" 배열의 "가지(branch)" 부분은 Fab 영역으로 지정되며; "Y" 배열의 줄기 부분은 FC 영역으로 지정된다. 아미노산 서열 배향은 "Y" 배열의 위쪽에 있는 N-말단으로부터 각 사슬의 아래에 있는 C-말단으로 진행된다. N-말단은 이를 유발한 항원에 대해 특이성을 갖는 가변 영역을 가지며, 이는 대략 100개 아미노산 길이이고, 경쇄 및 중쇄 사이에 그리고 항체마다 약간의 변화가 존재한다.
가변 영역은 각 사슬 내에서 사슬의 남은 길이를 확장시키고 특정 계열의 항체 내에서 항체의 특이성(그것을 유발하는 항원)이 변하지 않는 불변 영역에 연결된다. 면역글로불린 분자의 계열을 결정하는 5개의 공지된 주요 계열의 불변 영역(γ, μ, α, δ 및 ε(감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론) 중쇄 불변 영역)에 대응하는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE가 존재한다. 상기 불변 영역 또는 계열은 보체의 활성화(Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology 및 Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), 및 다른 세포 반응(Andrews, D. W., 등, Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., 등, Immunology, 48: 187 (1983)))을 포함하는 항체의 이후의 효과기 기능을 결정하는 반면, 가변 영역은 그것이 반응할 항원을 결정한다. 경쇄는 κ(카파) 또는 λ(람다) 중 하나로 분류된다. 각 중쇄 계열은 카파 또는 람다 경쇄 중 하나를 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마에 의해 또는 B 세포에 의해 면역글로불린이 생성될 때, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 공유 디설파이드 결합에 의해 서로 결합된다.
표현 "가변 영역" 또는 "VR"은 항체를 항원에 결합시키는데 직접 관여하는 항체에서의 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍 안에 있는 도메인을 지칭한다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH) 및 뒤이어 수많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL) 및 그 다른 말단에 불변 도메인을 가지며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 도메인과 맞춰 조정되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 맞춰 조정된다.
표현 "상보성 결정 영역", "초가변 영역", 또는 "CDR"은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 발견되는 하나 이상의 초-가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 지칭한다(Kabat, E. A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) 참고). 이들 표현은 카밧 등에 의해 규정된 바와 같은 초가변 영역("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., 등, US Dept. of Health 및 Human Services, 1983) 또는 항체의 3차원 구조 내의 초가변 루프(Chothia 및 Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987))를 포함한다. 각 사슬 내의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 매우 가깝게 유지되며, 다른 사슬 유래의 CDR과 함께, 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR 내에는 항체-항원 상호작용에서 CDR에 의해 사용되는 중요한 접촉 잔기에 대응하는 선택성 결정 영역(SDR)으로서 기술되어 온 엄선된 아미노산이 존재한다(Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
표현 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 내에 있는 하나 이상의 프레임워크 영역을 지칭한다(Kabat, E. A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) 참고). 이들 표현은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 내의 CDR 사이에 삽입된 상기 아미노산 서열 영역을 포함한다.
CGRP에 대한 결합 활성을 갖는 항-CGRP 항체 및 그의 결합 단편
항체 Ab1
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVVVKR (서열번호: 1).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 2).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRASSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (서열번호: 3).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRASSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 4).
본 발명은 추가로, 서열번호: 1의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 2의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 5; 서열번호: 6; 및 서열번호: 7의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 3의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 4의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 8; 서열번호: 9; 및 서열번호: 10의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 1의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 2의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 5; 서열번호: 6; 및 서열번호: 7의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 3의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 4의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 8; 서열번호: 9; 및 서열번호: 10의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 1의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 3의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 1의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 5; 서열번호: 6; 및 서열번호: 7); 및 서열번호: 3의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 8; 서열번호: 9; 및 서열번호: 10).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항-CGRP 항체는 Ab1이고, 이것은 서열번호: 2 및 서열번호: 4을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab1에 대해, Fab 단편은 서열번호: 1의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 3의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 3의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab1의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab1 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주 에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab2
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR (서열번호: 11).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 12).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 13).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 14).
본 발명은 추가로, 서열번호: 11의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 12의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 15; 서열번호: 16; 및 서열번호: 17의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 13의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 14의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 18; 서열번호: 19; 및 서열번호: 20의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기로 이루어진다: 서열번호: 11의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 12의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 15; 서열번호: 16; 및 서열번호: 17의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기로 이루어진다: 서열번호: 13의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 14의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 18; 서열번호: 19; 및 서열번호: 20의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 11의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 13의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 11의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 15; 서열번호: 16; 및 서열번호: 17); 및 서열번호: 13의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 18; 서열번호: 19; 및 서열번호: 20).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간화 항-CGRP 항체는 Ab2이고, 이것은 서열번호: 12 및 서열번호: 14을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab2에 대해, Fab 단편은 서열번호: 11의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 13의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 11 및/또는 서열번호: 13의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab2의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab2 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab3
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR (서열번호: 21).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 22).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 23).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 24).
본 발명은 추가로, 서열번호: 21의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 22의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 25; 서열번호: 26; 및 서열번호: 27의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 28; 서열번호: 29; 및 서열번호: 23의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 24의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 30의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 21 또는 서열번호: 22의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 23 또는 서열번호: 24의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 21의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 22의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 25; 서열번호: 26; 및 서열번호: 27의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 28; 서열번호: 29; 및 서열번호: 23의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 24의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 30의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 21의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 23의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 21의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 25; 서열번호: 26; 및 서열번호: 27); 및 서열번호: 23의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 28; 서열번호: 29; 및 서열번호: 30).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항-CGRP 항체는 Ab3이고, 이것은 서열번호: 22 및 서열번호: 24을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab3에 대해, Fab 단편은 서열번호: 21의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 23의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 21 및/또는 서열번호: 23의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab3의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab3 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab4
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKR (서열번호: 31).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 32).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (서열번호: 33).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 34).
본 발명은 추가로, 서열번호: 31의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 32의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 35; 서열번호: 36; 및 서열번호: 37의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 33의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 34의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 38; 서열번호: 39; 및 서열번호: 40의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 31 또는 서열번호: 32의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 33 또는 서열번호: 34의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 31의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 32의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 35; 서열번호: 36; 및 서열번호: 37의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 33의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 34의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 38; 서열번호: 39; 및 서열번호: 40의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 31의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 33의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 31의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 35; 서열번호: 36; 및 서열번호: 37); 및 서열번호: 33의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 38; 서열번호: 39; 및 서열번호: 40).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간화 항-CGRP 항체는 Ab4이고, 이것은 서열번호: 32 및 서열번호: 34을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab4에 대해, Fab 단편은 서열번호: 31의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 33의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 31 및/또는 서열번호: 33의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab4의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab4 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab5
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (서열번호: 41).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 42).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 43).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 44).
본 발명은 추가로, 서열번호: 41의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 42의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 45; 서열번호: 46; 및 서열번호: 47의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 43의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 44의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 48; 서열번호: 49; 및 서열번호: 50의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 41 또는 서열번호: 42의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 43 또는 서열번호: 44의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 41의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 42의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 45; 서열번호: 46; 및 서열번호: 47의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 43의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 44의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 48; 서열번호: 49; 및 서열번호: 50의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 41의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 43의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 41의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 45; 서열번호: 46; 및 서열번호: 47); 및 서열번호: 43의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 48; 서열번호: 49; 및 서열번호: 50).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항-CGRP 항체는 Ab5이고, 이것은 서열번호: 42 및 서열번호: 44을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab5에 대해, Fab 단편은 서열번호: 41의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 43의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 41 및/또는 서열번호: 43의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab5의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab5 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab6
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (서열번호: 51).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 52).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 53).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 54).
본 발명은 추가로, 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 52의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 54의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51 또는 서열번호: 52의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53 또는 서열번호: 54의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안저으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 52의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안저으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 54의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57); 및 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간화 항-CGRP 항체는 Ab6이고, 이것은 서열번호: 52 및 서열번호: 54을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab6에 대해, Fab 단편은 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 51 및/또는 서열번호: 53의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab6의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab6 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab7
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEVVVKR (서열번호: 61).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 62).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGVVGINGRTYYASWAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (서열번호: 63).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGVVGINGRTYYASWAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 64).
본 발명은 추가로, 서열번호: 61의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 62의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 65; 서열번호: 66; 및 서열번호: 67의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 63의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 64의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 68; 서열번호: 69; 및 서열번호: 70의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 61 또는 서열번호: 62의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 63 또는 서열번호: 64의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 61의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 62의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 65; 서열번호: 66; 및 서열번호: 67의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 63의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 64의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 68; 서열번호: 69; 및 서열번호: 70의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 61의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 63의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 61의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 65; 서열번호: 66; 및 서열번호: 67); 및 서열번호: 63의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 68; 서열번호: 69; 및 서열번호: 70).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항-CGRP 항체는 Ab7, 서열번호: 62 및 서열번호: 64을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab7에 대해, Fab 단편은 서열번호: 61의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 63의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 61 및/또는 서열번호: 63의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab7의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab7 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab8
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIKR (서열번호: 71).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 72).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGVVGINGRTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 73).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGVVGINGRTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 74).
본 발명은 추가로, 서열번호: 71의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 72의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 75; 서열번호: 76; 및 서열번호: 77의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 73의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 74의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 78; 서열번호: 79; 및 서열번호: 80의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 71 또는 서열번호: 72의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 73 또는 서열번호: 74의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 71의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 72의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 75; 서열번호: 76; 및 서열번호: 77의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 73의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 74의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 78; 서열번호: 79; 및 서열번호: 80의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 71의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 73의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 71의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 75; 서열번호: 76; 및 서열번호: 77); 및 서열번호: 73의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 78; 서열번호: 79; 및 서열번호: 80).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간화 항-CGRP 항체는 Ab8이고, 이것은 서열번호: 72 및 서열번호: 74을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab8에 대해, Fab 단편은 서열번호: 71의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 73의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 71 및/또는 서열번호: 73의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab8의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab8 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab9
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEVVVKR (서열번호: 81).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 82).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYMQWVRQSPGRGLEWIGVIGSDGKTYYATWAKGRFTISKTSSTTVDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTVSS (서열번호: 83).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYMQWVRQSPGRGLEWIGVIGSDGKTYYATWAKGRFTISKTSSTTVDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 84).
본 발명은 추가로, 서열번호: 81의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 82의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 85; 서열번호: 86; 및 서열번호: 87의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 83의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 84의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 88; 서열번호: 89; 및 서열번호: 90의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 81 또는 서열번호: 82의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 83 또는 서열번호: 84의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 81의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 82의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 85; 서열번호: 86; 및 서열번호: 87의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 83의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 84의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 88; 서열번호: 89; 및 서열번호: 90의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 81의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 83의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 81의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 85; 서열번호: 86; 및 서열번호: 87); 및 서열번호: 83의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 88; 서열번호: 89; 및 서열번호: 90).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항-CGRP 항체는 Ab9이고, 이것은 서열번호: 82 및 서열번호: 84을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab9에 대해, Fab 단편은 서열번호: 81의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 83의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 81 및/또는 서열번호: 83의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab9의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab9 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab10
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKR (서열번호: 91).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 92).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 93).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 94).
본 발명은 추가로, 서열번호: 91의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 92의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 95; 서열번호: 96; 및 서열번호: 97의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 93의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 94의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 98; 서열번호: 99; 및 서열번호: 100의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 91 또는 서열번호: 92의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 93 또는 서열번호: 94의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 91의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 92의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 95; 서열번호: 96; 및 서열번호: 97의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 93의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 94의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 98; 서열번호: 99; 및 서열번호: 100의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 91의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 93의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 91의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 95; 서열번호: 96; 및 서열번호: 97); 및 서열번호: 93의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 98; 서열번호: 99; 및 서열번호: 100).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간화 항-CGRP 항체는 Ab10이고, 이것은 서열번호: 92 및 서열번호: 94을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab10에 대해, Fab 단편은 서열번호: 91의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 93의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 91 및/또는 서열번호: 93의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab10의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab10 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab11
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVVVKR (서열번호: 101).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 102).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGVNGKRYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (서열번호: 103).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGVNGKRYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 104).
본 발명은 추가로, 서열번호: 101의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 102의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 105; 서열번호: 106; 및 서열번호: 107의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 103의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 104의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 108; 서열번호: 109; 및 서열번호: 110의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 101 또는 서열번호: 102의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 103 또는 서열번호: 104의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 101의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 102의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 105; 서열번호: 106; 및 서열번호: 107의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 103의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 104의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 108; 서열번호: 109; 및 서열번호: 110의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 101의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 103의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 101의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 105; 서열번호: 106; 및 서열번호: 107); 및 서열번호: 103의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 108; 서열번호: 109; 및 서열번호: 110).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항-CGRP 항체는 Ab11이고, 이것은 서열번호: 102 및 서열번호: 104을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab11에 대해, Fab 단편은 서열번호: 101의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 103의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 101 및/또는 서열번호: 103의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab11의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab11 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab12
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIKR (서열번호: 111).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 112).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGVNGKRYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 113).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGVNGKRYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 114).
본 발명은 추가로, 서열번호: 111의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 112의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 115; 서열번호: 116; 및 서열번호: 117의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 113의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 114의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 118; 서열번호: 119; 및 서열번호: 120의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 111 또는 서열번호: 112의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 113 또는 서열번호: 114의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 111의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 112의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 115; 서열번호: 116; 및 서열번호: 117의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 113의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 114의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 118; 서열번호: 119; 및 서열번호: 120의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 111의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 113의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 111의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 115; 서열번호: 116; 및 서열번호: 117); 및 서열번호: 113의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 118; 서열번호: 119; 및 서열번호: 120).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간화 항-CGRP 항체는 Ab12이고, 이것은 서열번호: 112 및 서열번호: 114을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab12에 대해, Fab 단편은 서열번호: 111의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 113의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 111 및/또는 서열번호: 113의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab12의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab12 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab13
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKLASGVPSRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVVVKR (서열번호: 121).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKLASGVPSRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 122).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다: QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGIIYNGDGSTYYASWVNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVSS (서열번호: 123).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGCIYNGDGSTYYASWVNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 124).
본 발명은 추가로, 서열번호: 121의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 122의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 125; 서열번호: 126; 및 서열번호: 127의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 123의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 124의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 128; 서열번호: 129; 및 서열번호: 130의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 121 또는 서열번호: 122의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 123 또는 서열번호: 124의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 121의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 122의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 125; 서열번호: 126; 및 서열번호: 127의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 123의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 124의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 128; 서열번호: 129; 및 서열번호: 130의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 121의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 123의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 121의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 125; 서열번호: 126; 및 서열번호: 127); 및 서열번호: 123의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 128; 서열번호: 129; 및 서열번호: 130).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항-CGRP 항체는 Ab13이고, 이것은 서열번호: 122 및 서열번호: 124을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab13에 대해, Fab 단편은 서열번호: 121의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 123의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 121 및/또는 서열번호: 123의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab13의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab13 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab14
일 구현예에서, 본 발명은 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKR (서열번호: 131).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 132).
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 133).
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 134).
본 발명은 추가로, 서열번호: 131의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 132의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 135; 서열번호: 136; 및 서열번호: 137의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 133의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 134의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 138; 서열번호: 139; 및 서열번호: 140의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 131 또는 서열번호: 132의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 133 또는 서열번호: 134의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 131의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 132의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 135; 서열번호: 136; 및 서열번호: 137의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 133의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 134의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 대응하는 서열번호: 138; 서열번호: 139; 및 서열번호: 140의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 131의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 133의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 131의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 135; 서열번호: 136; 및 서열번호: 137); 및 서열번호: 133의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 138; 서열번호: 139; 및 서열번호: 140).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 인간화 항-CGRP 항체는 Ab14이고, 이것은 서열번호: 132 및 서열번호: 134을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab14에 대해, Fab 단편은 서열번호: 131의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 133의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 131 및/또는 서열번호: 133의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 Ab14의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab14 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 항체 단편은 하기 비제한 형태 중 하나 이상으로 존재할 수 있다: Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단일 사슬 Fv 항체 형태. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체는 일정한 아래에 제시된 서열을 포함하는 카파 경쇄 서열을 추가로 포함한다:
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 283).
또 하나의 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체는 추가로, 아래에서 제시된 서열을 포함하는 감마-1 일정한 중쇄 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 284).
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 또는 133으로부터 선택된 VH 폴리펩타이드 서열, 또는 그의 변이체를 포함하고; 추가로 서열번호: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 또는 131로부터 선택된 VL 폴리펩타이드 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는, 단리된 항-CGRP 항체를 고려하고, 여기서 상기 VH 또는 VL 폴리펩타이드 중 뼈대 잔기 (FR 잔기)의 하나 이상은 CGRP에 특이적으로 결합하는 항-CGRP 항체를 유발하는 또 하나의 아미노산 잔기로 치환되었다. 본 발명은 이들 항체의 인간화 키메라 형태를 고려한다. 키메라 항체는 하기로부터 유래된 Fc를 포함할 수 있다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 또는 IgG19 불변 영역.
본 발명의 일 구현예에서, 항체 또는 VH 또는 VL 폴리펩타이드는 유래되거나 본원에서 참조된 인간화 과정의 개시 전에 하나 이상의 토끼 B 세포 집단로부터 선택된다.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 및 그의 단편은 CGRP-R에 대한 결합 특이성을 갖지 않는다. 본 발명의 추가 구현예에서, 항-CGRP 항체 및 그의 단편은 CGRP와 CGRP-R과의 회합을 억제한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 및 그의 단편은 CGRP와 CGRP-R 및/또는 부가적 단백질 및/또는 그의 다량체와의 회합을 억제하고/거나, 그의 생물학적 효과에 역작용한다.
본원의 단락 [0127]에서 언급된 바와 같이, 항체 및 그의 단편은 후번역으로 변형되어 효과기 모이어티 예컨대 화학적 링커, 검출가능 모이어티 예컨대 예를 들면 형광 염료, 효소, 기질, 생물발광 물질, 방사선활성 물질, 및 화학발광 모이어티, 또는 기능적 모이어티 예컨대 예를 들면 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 세포독소, 세포독성 약물, 및 방사선활성 물질을 부가할 수 있다.
항체 또는 그의 단편은 또한 화학적으로 변형되어 부가적 이점 예컨대 폴리펩타이드의 증가된 용해도, 안정성 및 순환 시간 (생체내 반감기), 또는 감소된 면역원성 (참고 미국 특허 번호 4,179,337)를 제공할 수 있다. 유도체화에 대한 화학적 모이어티는 수용성 폴리머 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 코폴리머, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올 등으로붙터 선택될 수 있다. 항체 및 그의 단편은 분자 내의 무작위의 위치에서, 또는 분자 내의 예정된 위치에서 변형될 수 있고 1, 2, 3 또는 그 초과의 부착된 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.
폴리머는 임의의 분자량일 수 있고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜에 대해, 바람직한 분자량은 취급 및 제조에 용이하도록 약 1 kDa 내지 약 100 kDa이다 (폴리에틸렌 글리콜의 제제에서, 일부 분자는 언급된 분자량보다 더 큰, 조금 적은 무게인 것을 나타내는 용어 "약"). 다른 크기가 원하는 치료 프로파일 (예를 들면, 원하는 지속된 방출의 지속시간, 효과, 생물학적 활성이 있다면, 취급 용이성, 치료 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 항원성 및 다른 공지된 효과의 정도 또는 부족)에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 하기의 평균 분자량을 가질 수 있다: 약 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, 또는 100,000 kDa. 분지형 폴리에틸렌 글리콜은 예를 들면 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 5,643,575; Morpurgo 등, Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev 등, Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); 및 Caliceti 등, Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), 이들 각각의 개시내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.
당해분야의 숙련가에게 이용가능한 수많은 부착 방법이 있다, 참조 예를 들면, 참조로 본원에 포함되어 있는 EP 0 401 384 (PEG의 G-CSF에의 커플링), 또한 참조 Malik 등, Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (트레실 클로라이드를 사용하는 GM-CSF의 페길화를 보고함). 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 반응성 그룹, 예컨대, 유리 아미노 또는 카복실 그룹을 통해 아미노산 잔기를 통해 공유 결합될 수 있다. 반응성 그룹은, 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 것이다. 유리 아미노 그룹을 갖는 아미노산 잔기는 라이신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있고; 유리 카복실 그룹을 갖는 것은 아스파르트산 잔기 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 설프히드릴 그룹은 폴리에틸렌 글리콜 분자에 부착시키기 위해 반응성 그룹으로서 또한 사용될 수 있다. 아미노 그룹에서의 부착, 예컨대 N-말단 또는 라이신 그룹에서의 부착이 치료 목적을 위해 바람직하다.
상기에서 제안된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 임의의 수많은 아미노산 잔기에의 결합을 통해 단백질에 부착될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 하기에 대한 공유 결합을 통해 폴리펩타이드에 연결될 수 있다: 라이신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 또는 시스테인 잔기. 하나 이상의 반응 화학은 폴리에틸렌 글리콜을 특이적 아미노산 잔기 (예를 들면, 라이신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 또는 시스테인) 또는 하나 초과의 유형의 아미노산 잔기 (예를 들면, 라이신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 이들의 조합)에 부착하기 위해 이용될 수 있다.
대안적으로, 항체 또는 그의 단편은 알부민 (비제한적으로 재조합 인간 혈청 알부민 또는 단편 또는 그의 변이체를 포함 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,876,969, 1999년 3월 2일 발행, EP 특허 0 413 622, 및 미국 특허 번호 5,766,883, 1998년 6월 16일 발행, 이것은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다)) 또는 다른 순환 혈액 단백질 예컨대 트랜스페린 또는 페리딘과의 융합을 통해 증가된 생체내 반감기를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, (단편 또는 그의 변이체를 포함하는) 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 항체는 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있는 성숙한 형태 인간 혈청 알부민 (즉, EP 특허 0 322 094의 도 1 및 2에서 보여진 인간 혈청 알부민의 아미노산 1-585)과 융합된다. 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 본 발명에 의해 포함된다.
검출가능 모이어티에 관해서, 추가로 예시적인 효소는, 비제한적으로, 홀스래디쉬 페록시다아제, 아세틸콜린에스테라제, 알칼리성 인산분해효소, 베타-갈락토시다아제 및 루시퍼라아제를 포함한다. 추가로 예시적인 형광 물질은, 비제한적으로, 로다민, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 엄벨리페론, 디클로로트리아지닐아민, 파이코에리트린 및 단실 클로라이드를 포함한다. 추가로 예시적인 화학발광 모이어티는, 비제한적으로, 루미놀을 포함한다. 추가로 예시적인 생물발광 물질은, 비제한적으로, 루시페린 및 에쿼린을 포함한다. 추가로 예시적인 방사선활성 물질은 비제한적으로 하기를 포함한다: 요오드 125 (125I), 탄소 14 (14C), 황 35 (35S), 트리튬 (3H) 및 인 32 (32P).
기능적 모이어티에 관해서, 예시적인 세포독성 약물은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 메토트렉세이트, 아미노프테린, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진; 알킬화제 예컨대 메클로레타민, 티오에파 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 미토마이신 C, 로무스틴 (CCNU), 1-메틸니트로소우레아, 사이클로토스파마이드, 메클로레타민, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴 및 카보플라틴 (파라플라틴)을 포함하고; 안트라사이클린은 다우노루비신 (예전에 다우노마이신), 독소루비신 (아드리아마이신), 데토루비신, 카르미노마이신, 아이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론 및 비스안트렌을 포함하고; 항생제는 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 블레오마이신, 칼리키아마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC); 및 항유사분열제 예컨대 빈카 알카로이드, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다. 다른 세포독성 약물은 파클리탁셀 (탁솔), 리신, 슈도모나스 외독소, 젬시타빈, 사이토칼라신 B, 그라마이시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 에토포사이드, 테노포사이드, 콜히친, 디하이드록시 안트라신디온, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 프로카르바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 마이토탄 (O,P'-(DDD)), 인터페론, 및 이들 세포독성 약물의 혼합물.
추가로 세포독성 약물은, 비제한적으로, 화학요법제 예컨대 카보플라틴, 시스플라틴, 파클리탁셀, 젬시타빈, 칼리키아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴 및 블레오마이신을 포함한다. 식물 및 박테리아 예컨대 리신, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 독소로부터 유래된 독성 효소는 인간화 또는 키메라 항체, 또는 그의 결합 단편에 콘주게이트되어, 세포-유형-특이적-사멸 시약을 생성할 수 있다 (Youle, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
다른 세포독성 약물은 하기에 의해 기재된 세포독성 리보뉴클레아제를 포함한다: Goldenberg (미국 특허 번호 6,653,104). 본 발명의 구현예는 또한, 방사선면역콘주게이트에 관한 것이고, 여기서 알파 또는 베타 입자를 방출하는 방사선핵종은 복합체-형성제의 사용과 함께 또는 없이 항체, 또는 그의 결합 단편에 안정되게 콘주게이트된다. 그와 같은 방사선핵종은 하기를 포함한다: 베타-에미터 예컨대 인-32 (32P), 스칸듐-47 (47Sc), 구리-67 (67Cu), 갈륨-67 (67Ga), 이트륨-88 (88Y), 이트륨-90 (90Y), 요오드-125 (125I), 요오드-131 (131I), 사마륨-153 (153Sm), 루테튬-177 (177Lu), 레늄-186 (186Re) 또는 레늄-188 (188Re), 및 알파-에미터 예컨대 아스타틴-211 (211At), 납-212 (212Pb), 비스무트-212 (212Bi) 또는 -213 (213Bi) 또는 악티늄-225 (225Ac).
항체 또는 그의 결합 단편을 검출가능 모이어티 등에 콘주게이트하기 위한 방법, 예컨대 하기에 의해 기재된 방법에 당해기술에 공지되어 있다: Hunter 등, Nature 144:945 (1962); David 등, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain 등, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); 및 Nygren, J., Histochem. 및 Cytochem. 30:407 (1982).
본원에 기재된 구현예는 추가로, 본원에서 제시된 항체, 항체 단편, 디아바디, SMIPs, 카멜바디, 나노바디, IgNAR, 폴리펩타이드, 가변 영역 및 CDR와 실질적으로 상동인 변이체 및 동등물을 포함한다. 이들, 예를 들면, 보존적 치환 돌연변이를 함유할 수 있다 (즉, 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환). 예를 들면, 보존적 치환은 동일한 일반적인 부류 내의 또 하나에 의한 아미노산, 예를 들면, 또 하나의 산성 아미노산에 의한 하나의 산성 아미노산, 또 하나의 염기성 아미노산에 의하 하나의 염기성 아미노산, 또는 또 하나의 중성 아미노산에 의한 하나의 중성 아미노산의 치환을 의미한다. 보존적 아미노산 치환에 의해 의도된 것은 당해분야에 공지되어 있다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 본원에 제시된 항체 단편, 가변 영역 및 CDR의 임의의 하나 이상의 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 90% 또는 그 초과 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 고려한다. 더 바람직하게, 본 발명은 본원에 제시된 항체 단편, 가변 영역 및 CDR의 임의의 하나 이상의 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 95% 또는 그 초과 서열 상동성, 더욱 더 바람직하게 적어도 98% 또는 그 초과 서열 상동성, 및 더욱 더 바람직하게 적어도 99% 또는 그 초과 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 고려한다. 핵산과 아미노산 서열 사이의 상동성을 측정하는 방법은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 추가로, 항-CGRP 활성을 추가로 갖는 본원에 제시된 항체 단편, 가변 영역 및 CDR의 상기-인용된 폴리펩타이드 동족체를 고려한다. 항-CGRP 활성의 비제한 예는, 예를 들면, 아래의 단락 [0329]-[0350]에서 제시되어 있다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 추가로, 임의의 상기 서열에 결합하는 항-유전자형 항체의 생성 및 사용을 고려한다. 예시적인 구현예에서, 그와 같은 항-유전자형 항체는 항-CGRP 항체의 효과를 조절, 감소 또는 상쇄시키기 위해 항-CGRP 항체를 수용한 대상체에 투여될 수 있다. 그와 같은 항-유전자형 항체는 항-CGRP 항체의 존재를 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료에 또한 유용할 수 있다. 그와 같은 항-유전자형 항체의 추가로 예시적인 사용은, 예를 들면 대상체의 혈액 또는 다른 체액에서 존재하는 항-CGRP 항체의 수준을 모니터링하기 위해 본 발명의 항-CGRP 항체의 검출을 위한 것이다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 다른 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 치환된 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 항-CGRP 항체를 또한 고려한다. 예를 들면, 비제한적으로, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려하고 본원에 기재된 임의의 다른 CDR 서열에 대한 본원에 기재된 임의의 CDR 서열의 치환으로부터 얻은 항체를 추가로 고려한다.
본 발명의 부가적 예시적인 구현예
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 동일한 중첩 선형 또는 형태적 에피토프(들)에 결합하고/하거나 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, 또는 Ab14로부터 선택된 항-인간 CGRP 항체로서 온전한 인간 CGRP 폴리펩타이드 또는 그의 단편 상에 동일한 중첩 선형 또는 형태적 에피토프(들)에 결합하는하나 이상의 항-인간 CGRP 항체 또는 그의 항체 단편을 고려한다. 바람직한 구현예에서, 항-인간 CGRP 항체 또는 그의 단편는 동일한 중첩 선형 또는 형태적 에피토프(들)에 특이적으로 결합하고/하거나 Ab3, Ab6, Ab13, 또는 Ab14로서 온전한 인간 CGRP 폴리펩타이드 또는 그의 단편 상에 동일한 중첩 선형 또는 형태적 에피토프(들)에 결합하기 위해 경쟁한다.
본 발명의 바람직한 구현예는 CGRP에 대한 결합 특이성을 가지며 CGRP의 CGRP 수용체에의 결합에 의해 매개된 생물학적 활성을 억제하는 키메라 또는 인간화 항체 및 그의 단편 (Fab 단편 포함)에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 또는 인간화 항-CGRP 항체는 Ab3, Ab6, Ab13, 또는 Ab14로부터 선택된다.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP을 통해 매개된 생물학적 활성에 영향을 주고, 그렇게 함으로써 CGRP의 CGRP-R에의 결합을 통해 매개된 생물학적 활성을 피해서 CGRP와 연관된 질환 또는 장애를 감소, 치료 또는 예방하는 방법이 고려된다. 일 구현예에서, CGRP와 연관된 질환 또는 장애는 편두통 또는 또 하나의 장애이고, 여기서 CGRP는 통증, 두통, 통증, 암, 과민성 방광, 또는 체중 감소를 유도한다. CGRP와 연관된 질환 및 장애의 추가의 비제한 목록은 본원에서 제공된다.
본 발명의 또 하나의 바람직한 구현예는 환자의 편두통 및 두통의 치료를 위해 Fab 폴리펩타이드 서열의 용도를 고려한다. Fab 폴리펩타이드 서열을 사용하여 치료될 수 있는 편두통 및 두통의 비제한 유형은 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-인간 CGRP 항체는 원상태 인간 CGRP 폴리펩타이드의 전체 길이에 걸치는 중복 선형 펩타이드 단편을 사용하여 에피토프 맵핑에 의해 확인된 바와 같이, Ab3, Ab6, Ab13, 또는 Ab14에 의해 특이적으로 결합된온전한 CGRP 폴리펩타이드 또는 그의 단편 상에 동일한 중첩 선형 또는 형태적 에피토프에 특이적으로 결합된 항체이다.
본 발명은 또한, 동일한 CGRP 에피토프에 결합하고/하거나 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, 또는 Ab14로부터 선택된 항-CGRP 항체를 비제한적으로 포함하는 본원에 개시된 항체 또는 항체단편으로서 CGRP에 결합하기 위한 항-CGRP 항체와 결합하는 항-CGRP 항체에 관한 것이다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 또한, 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 또는 133으로부터 선택된 VH 폴리펩타이드 서열에 함유된 CDR의 하나 이상, 또는 그의 변이체, 및/또는 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 또는 131로부터 선택된 VL 폴리펩타이드 서열, 또는 그의 변이체에 함유된 CDR의 하나 이상을 포함하는, 단리된 항-CGRP 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 2개의 이전 단락에서 논의된 항-인간 CGRP 항체는 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, 또는 Ab14로부터 선택된 항-인간 CGRP 항체에서 함유된 것과 동일한 각각의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에서 적어도 2 개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기에서 논의된 항-인간 CGRP 항체는 Ab3 또는 Ab6에 함유된 것과 동일한 각각의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역에서 적어도 2 개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기에서 논의된 항-인간 CGRP 항체의 CDR 모두는 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, 또는 Ab14로부터 선택된 항-인간 CGRP 항체에 함유된 CDR과 동일하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기에서 논의된 항-인간 CGRP 항체의 CDR 모두는 Ab3 또는 Ab6로부터 선택된 항-인간 CGRP 항체에 함유된 CDR과 동일하다.
본 발명은 추가로, 하기를 고려한다: 상기에서 논의된 하나 이상의 항-인간 CGRP 항체는 무글리코실화되고; 변형되어 효과기 기능, 반감기, 단백질분해, 및/또는 글리코실화를 바꾼 Fc 영역을 함유하고; 인간, 인간화, 단일 사슬 또는 키메라이고; 토끼 (모) 항-인간 CGRP 항체로부터 유래된 인간화 항체를 고려한다.
본 발명은 추가로, 하나 이상의 항-인간 CGRP 항체를 고려하고, 여기서 상기 항체의 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역 각각에서 틀 영역 (FR)은 비변형되거나 모 토끼 항체의 상응하는 FR 잔기를 갖는 가변 경쇄 또는 중쇄 영역에서 하나 이상의 인간 FR 잔기의 치환에 의해 변형된 인간 FR이고, 여기서 상기 인간 FR은 라이브러리에 함유된 다른 인간 생식계열 항체 서열에 대해 상응하는 토끼 가변 중쇄 또는 경쇄 영역에 대한 고수준의 상동성을 기반으로 한 인간 생식계열 항체 서열의 라이브러리부터 선택된 인간 가변 중쇄 및 경쇄 항체 서열로부터 유래되었다.
본 발명의 일 구현예에서, 항-인간 CGRP 항체 또는 단편은 생체내에서 인간 세포를 발현시키는 CGRP 및/또는 순환 가용성 CGRP 분자에 특이적으로 결합하고, 상기 분자는 CGRP를 발현시키는 세포와 연관된 질환이 있는 환자에서 인간 세포 상에서 또는 그 그 세포에 의해 발현된 CGRP를 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 질환은 하기로부터 선택된다: (전조가 있거나 없는) 편두통, 체중 감소, 암 또는 종양, 암 또는 종양 성장과 연관된 신생혈관형성, 암 또는 종양 생존과 연관된 신생혈관혈성, 반신마비성 편두통, 군발성 두통, 편두통성 신경통, 만성 두통, 긴장성 두통, 일반적인 두통, 열감, 만성 발작성 편두통, 두경부에서 근원적인 구조 문제로 인한 이차성 두통, 두개 신경통, 부비동 두통 (예를 들면 부비강염과 연관된 것), 알러지-유도된 두통 또는 편두통, 통증, 염증성 통증, 수술후 절개 통증, 복합 부위 통증 증후군, 암 통증, 일차 또는 전이성 골 암 통증, 골절 통증, 만성 통증, 골다공증 골절 통증, 화상 유래 통증, 골다공증, 통풍 관절 통증, 복통, 겸상 적혈구 위기와 연관된 통증, 및 다른 침해성 통증, 뿐만 아니라 간세포 암종, 유방암, 간경변증, 신경성 통증, 신경병성 통증, 침해성 통증, 삼차 신경통, 대상포진후 신경통, 환지통, 섬유근육통, 생리 통증, 난소통, 반사성 교감신경 위축증, 신경성 통증, 골관절염 또는 류마티스성 관절염 통증, 등 아래 통증, 당뇨병성 신경병증, 엉덩뼈신경통, 또는 통증 또는 하기와 연관된 내장 통증: 위-식도 역류, 소화불량, 과민성 장 증후군, 과민성 결장, 강직성 결장, 점액 대장염, 염증성 장질환, 크론병, 회장염, 궤양성 대장염, 신장 산통, 월경통, 방광염, 생리 기간, 노동, 폐경기, 전립선염, 췌장염, 신장 산통, 월경통, 침입형 방광염 (IC)을 포함하는 방광염, 장폐색증과 연관된 수술, 게실염, 복막염, 심막염, 간염, 충수염, 대장염, 담낭염, 자궁내막증, 만성 및/또는 급성 췌장염, 심근경색증, 신장 통증, 늑막 통증, 전립선염, 골반 통증, 장기와 연관된 외상 만성 침해성 통증, 만성 신경병성 통증, 만성 염증성 통증, 섬유근육통, 돌파 통증 및 지속적 통증.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 질환은 하기 중 하나 이상으로부터 바람직하게 선택된 악성종양 또는 세포로부터 생긴 암 통증이다: 선상 조직의 선암종, 장기의 배아 조직의 모세포종, 상피 조직의 암종, 혈구로부터의 조직의 백혈병, 림프성 조직의 림프종, 골수의 골수종, 결합 또는 지지 조직의 육종, 부신암, AIDS-관련된 림프종, 빈혈, 방광암, 골 암, 뇌암, 유방암, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 화학요법, 결장암, 혈구감소, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두부암, 경부암, 간담도 암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 호지킨 질환, 림프종, 비- 호지킨, 신경계 종양, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 요도 암, 골 암, 결합 조직의 육종 암, 골 조직의 암, 혈액-형성 세포의 암, 골수의 암, 다발성 골수종, 백혈병, 일차 또는 2차 골 암, 골로 전이된 종양, 신경 및 중공 내장에 침투하는 종양, 신경 구조 근처의 종양. 추가로 바람직하게 암 통증은 내장 통증, 바람직하게 췌장암으로부터 생기고/거나 복부에서 전이하는 내장 통증을 포함한다. 추가로 바람직하게 암 통증은 체성 통증, 바람직하게 골 암, 골에서의 전이, 수술후 통증, 결합 조직의 육종 암, 골 조직의 암, 혈액-형성 세포의 골수의 암, 다발성 골수종, 백혈병, 일차 또는 2차 골 암 중 하나 이상으로 인한 체성 통증을 포함한다.
본 발명은 추가로, 검출가능 표지 또는 치료제에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되는 항-인간 CGRP 항체 또는 단편을 고려한다.
본 발명은 또한, 효모 또는 인간 바람직한 코돈을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진 것을 포함하는, 상기에서 제시된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편의 발현으로 생긴 하나 이상의 핵산 서열을 고려한다. 본 발명은 또한, 상기 핵산 서열(들)을 포함하는(플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는) 벡터를 고려한다. 본 발명은 또한, 포유동물, 효모, 박테리아, 및 곤충 세포를 포함하는, 상기에서 제시된 항체의 적어도 하나를 발현시키는 숙주세포 또는 재조합 숙주세포를 고려한다. 바람직한 구현예에서, 숙주세포는 효모 세포이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 효모 세포는 2배체 효모 세포이다. 더 바람직한 구현예에서, 효모 세포는 피치아 효모이다.
본 발명은 또한, CGRP 발현 세포와 연관된 질환 또는 상태가 있는 환자에게 치료적 유효량의 적어도 하나의 본원에 기재된 항-인간 CGRP 항체 또는 단편을 투요하는 것을 포함하는 치료 방법을 고려한다. 본 발명은 또한, 치료 방법이 본원에 개시된 2 이상의 항-CGRP 항체 또는 그의 단편의 투여를 수반할 수 있다는 것을 고려한다. 하나 초과의 항체가 환자에 투여되면, 다중 항체는 동시에 투여될 수 있거나, 투여에 시차를 둘 수 있다. 치료될 질환은 본원의 상기에서 및 다른 곳에서 제시된 비제한 목록에서 제공된다. 바람직한 구현예에서, 질환은 편두통, 두통, 체중 감소, 통증, 암 통증 또는 신경병성 통증으로부터 선택된다. 또 하나의 구현예에서 치료는 추가로, 화학요법, 방사선요법, 시토카인 투여 또는 유전자 요법으로부터 선택된 또 하나의 치료제 또는 레지멘의 투여를 포함한다.
본 발명의 비-제한적인 구현예에서, 또 하나의 치료제 또는 레지멘은 탁솔 (파클리탁셀) 또는 그의 유도체, 백금 화합물 예컨대 카보플라틴 또는 시스플라틴, 안트로사이클린 예컨대 독소루비신, 알킬화제 예컨대 사이클로포스파마이드, 항대사물질 예컨대 5-플루오로우라실, 또는 에토포사이드를 포함한다.
본 발명은 추가로, CGRP를 발현시키는 세포의 존재를 생체내에서 이미지화하는 방법을 고려하고, 이 방법은 진단적 유효량의 적어도 하나의 항-인간 CGRP 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 투여는 추가로 CGRP 발현 질환 부위에서 항체의 검출을 용이하게 하는 방사선핵종 또는 형광단의 투여를 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 생체내 이미징 방법의 결과는 방사선요법, 화학요법 또는 이들의 조합을 포함하는 치료 레지멘을 포함하는 적절한 치료 레지멘의 디자인을 용이하게 하기 위해 사용된다.
CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 항-CGRP 항체, 및 그의 단편의 항-CGRP 활성은 CGRP에 대한 결합 강도 또는 친화도에 의해 또한 기재될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 항-CGRP 항체, 및 그의 단편은 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 또는 10-13 M 이하의 해리 상수 (KD)와 함께 CGRP에 결합한다. 바람직하게, 항-CGRP 항체 및 그의 단편은 10-11 M, 5×10-12 M, 또는 10-12 M 이하의 해리 상수와 함께 CGRP에 결합한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 항-CGRP 항체, 및 그의 단편은 선형 또는 형태 CGRP 에피토프에 결합한다.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 항-CGRP 항체, 및 그의 단편의 항-CGRP 항체는 10-4 S-1, 5×10-5 S-1, 10-5 S-1, 5×10-6 S-1, 10-6 S-1, 5×10-7 S-1, 또는 10-7 S-1 이하의 해리속도상수와 함께 CGRP에 결합한다.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 항-CGRP 항체, 및 그의 단편의 항-CGRP 활성은 CGRP와 연관된 질환 및 장애의 증상을 예방, 개선 또는 감소시키거나, 대안적으로 그것을 치료하여 항-CGRP 활성을 나타낸다. CGRP와 연관된 질환 및 장애의 비제한 예는 본원에 제시되어 있다.
항-CGRP 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
항체 Ab1
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 141).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 2의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 142).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 3의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGCCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 143).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 4의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 144).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 1의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 2의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열번호: 145; 서열번호: 146; 및 서열번호: 147의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 3의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 4의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 148; 서열번호: 149; 및 서열번호: 150의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 1의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 141; 서열번호: 2의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 142; 서열번호: 3의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 143; 서열번호: 4의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 144; 서열번호: 1의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 2의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 145; 서열번호: 146; 및 서열번호: 147)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 3의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 4의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 148; 서열번호: 149; 및 서열번호: 150)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab1에 대해, 전체 길이 Ab1 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 2의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 142 및 서열번호: 4의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 144.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab1의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab1 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab1 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab2
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 11의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 151).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 12의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 152).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 13의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 153).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 14의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 154).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 11의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 12의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 155; 서열번호: 156; 및 서열번호: 157의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 13의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 14의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 158; 서열번호: 159; 및 서열번호: 160의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 11의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 151; 서열번호: 12의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 152; 서열번호: 13의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 153; 서열번호: 14의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 154; 서열번호: 11의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 12의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 155; 서열번호: 156; 및 서열번호: 157)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 13의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 14의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 158; 서열번호: 159; 및 서열번호: 160)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab2에 대해, 전체 길이 Ab2 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 12의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 152 및 서열번호: 14의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 154.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab2의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab2 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab2 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab3
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 21의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 161).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 22의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 162).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 23의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 163).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 24의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 164).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 21의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 22의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 165; 서열번호: 166; 및 서열번호: 167의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 23의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 24의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 168; 서열번호: 169; 및 서열번호: 170의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 21의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 161; 서열번호: 22의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 162; 서열번호: 23의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 163; 서열번호: 24의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 164; 서열번호: 21의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 22의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 165; 서열번호: 166; 및 서열번호: 167)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 23의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 24의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 168; 서열번호: 169; 및 서열번호: 170)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab3에 대해, 전체 길이 Ab3 항체을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 22의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 162 및 서열번호: 24의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 164.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab3의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab3 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab3 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab4
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 31의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCGTCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTAACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 171).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 32의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCGTCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTAACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 172).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 33의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGTTCCGTCTCTGGCATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 173).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 34의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 174).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 31의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 32의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 175; 서열번호: 176; 및 서열번호: 177의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 33의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 34의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 178; 서열번호: 179; 및 서열번호: 180의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 31의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 171; 서열번호: 32의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 172; 서열번호: 33의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 173; 서열번호: 34의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 174; 서열번호: 31의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 32의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 175; 서열번호: 176; 및 서열번호: 177)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 33의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 34의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 178; 서열번호: 179; 및 서열번호: 180)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab4에 대해, 전체 길이 Ab4 항체을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 32의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 172 및 서열번호: 34의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 174.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab4의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab4 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab4 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab5
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 41의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 181).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 42의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 182).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 43의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 183).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 44의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 184).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 41의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 42의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 185; 서열번호: 186; 및 서열번호: 187의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 43의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 44의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 188; 서열번호: 189; 및 서열번호: 190의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 41의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 181; 서열번호: 42의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 182; 서열번호: 43의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 183; 서열번호: 44의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 184; 서열번호: 41의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 42의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 185; 서열번호: 186; 및 서열번호: 187)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 43의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 44의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 188; 서열번호: 189; 및 서열번호: 190)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab5에 대해, 전체 길이 Ab5 항체을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 42의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 182 및 서열번호: 44의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 184.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab5의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab5 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab5 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab6
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 51의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 191).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 52의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 192).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 53의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 193).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 54의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 194).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 52의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 195; 서열번호: 196; 및 서열번호: 197의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 54의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 198; 서열번호: 199; 및 서열번호: 200의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 191; 서열번호: 52의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 192; 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 193; 서열번호: 54의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 194; 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 52의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 195; 서열번호: 196; 및 서열번호: 197)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 54의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 198; 서열번호: 199; 및 서열번호: 200)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab6에 대해, 전체 길이 Ab6 항체을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 52의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 192 및 서열번호: 54의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 194.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab6의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab6 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab6 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab7
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 61의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGATTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGACTGTAGTACTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 201).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 62의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGATTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGACTGTAGTACTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 202).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 63의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACATCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCGTTGGTATTAATGGTCGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 203).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 64의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 204).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 61의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 62의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 205; 서열번호: 206; 및 서열번호: 207의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 63의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 64의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 208; 서열번호: 209; 및 서열번호: 210의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 61의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 201; 서열번호: 62의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 202; 서열번호: 63의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 203; 서열번호: 64의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 204; 서열번호: 61의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 62의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 205; 서열번호: 206; 및 서열번호: 207)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 63의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 64의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 208; 서열번호: 209; 및 서열번호: 210)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab7에 대해, 전체 길이 Ab7 항체을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 62의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 202 및 서열번호: 64의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 204.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab7의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab7 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab7 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab8
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 71의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTACAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTACTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 211).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 72의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTACAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTACTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 212).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 73의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGCAATGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCGTTGGTATCAATGGTCGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 213).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 74의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 214).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 71의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 72의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 215; 서열번호: 216; 및 서열번호: 217의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 73의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 74의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 218; 서열번호: 219; 및 서열번호: 220의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 71의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 211; 서열번호: 72의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 212; 서열번호: 73의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 213; 서열번호: 74의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 214; 서열번호: 71의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 72의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 215; 서열번호: 216; 및 서열번호: 217)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 73의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 74의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 218; 서열번호: 219; 및 서열번호: 220)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab8에 대해, 전체 길이 Ab8 항체을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 72의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 212 및 서열번호: 74의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 214.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab8의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab8 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab8 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab9
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 81의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTATAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGATTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 221).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 82의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTATAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGATTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 222).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 83의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAGTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGGAGGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAGAATGGCCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTACCAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 223).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 84의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 224).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 81의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 82의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 225; 서열번호: 226; 및 서열번호: 227의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 83의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 84의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 228; 서열번호: 229; 및 서열번호: 230의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 81의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 221; 서열번호: 82의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 222; 서열번호: 83의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 223; 서열번호: 84의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 224; 서열번호: 81의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 82의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 225; 서열번호: 226; 및 서열번호: 227)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 83의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 84의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 228; 서열번호: 229; 및 서열번호: 230)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab9에 대해, 전체 길이 Ab9 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 82의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 222 및 서열번호: 84의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 224.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab9의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab9 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab9 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab10
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 91의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 231).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 92의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 232).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 93의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGTACCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 233).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 94의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 234).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 91의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 92의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 235; 서열번호: 236; 및 서열번호: 237의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 93의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 94의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 238; 서열번호: 239; 및 서열번호:240의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 91의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 231; 서열번호: 92의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 232; 서열번호: 93의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 233; 서열번호: 94의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 234; 서열번호: 91의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 92의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 235; 서열번호: 236; 및 서열번호: 237)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 93의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 94의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 238; 서열번호: 239; 및 서열번호: 240)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab10에 대해, 전체 길이 Ab10 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 92의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 232 및 서열번호: 94의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 234.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab10의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab10 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab10 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab11
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 101의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTCCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTATTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 241).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 102의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAGGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTCCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTATTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 242).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 103의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGAGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAACTACTATATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 243).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 104의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 244).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 101의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 102의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 245; 서열번호: 246; 및 서열번호: 247의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 103의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 104의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 248; 서열번호: 249; 및 서열번호: 250의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 101의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 241; 서열번호: 102의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 242; 서열번호: 103의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 243; 서열번호: 104의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 244; 서열번호: 101의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 102의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 245; 서열번호: 246; 및 서열번호: 247)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 103의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 104의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 248; 서열번호: 249; 및 서열번호: 250)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab11에 대해, 전체 길이 Ab11 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 102의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 242 및 서열번호: 104의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 244.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab11의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab11 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab11 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab12
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 111의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTACTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 251).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 112의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTACTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 252).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 113의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAACTACTACATGCAATGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 253).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 114의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 254).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 111의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 112의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 255; 서열번호: 256; 및 서열번호: 257의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 113의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 114의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 258; 서열번호: 259; 및 서열번호: 260의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 111의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 251; 서열번호: 112의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 252; 서열번호: 113의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 253; 서열번호: 114의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 254; 서열번호: 111의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 112의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 255; 서열번호: 256; 및 서열번호: 257)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 113의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 114의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 258; 서열번호: 259; 및 서열번호: 260)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab12에 대해, 전체 길이 Ab12 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 112의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 252 및 서열번호: 114의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 254.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab12의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab12 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab12 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab13
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 121의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCATCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCCTGTGGGAGACACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTCTTTATAATAACAACGCCTTGGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCGCCTGATCTATGATGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCTACAGAAGTGATAGTGTTGATGGTGTTGCTTTCGCCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 261).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 122의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCATCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCCTGTGGGAGACACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTCTTTATAATAACAACGCCTTGGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCGCCTGATCTATGATGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCTACAGAAGTGATAGTGTTGATGGTGTTGCTTTCGCCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 262).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 123의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCAATGCAATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTACAATGGTGATGGCAGCACATACTACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAACTGAATAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACGTATTATTGTGCGAGAGATCTTGACTTGTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 263).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 124의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 264).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 121의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 122의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 265; 서열번호: 266; 및 서열번호: 267의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 123의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 124의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 268; 서열번호: 269; 및 서열번호: 270의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 121의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 261; 서열번호: 122의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 262; 서열번호: 123의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 263; 서열번호: 124의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 264; 서열번호: 121의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 122의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 265; 서열번호: 266; 및 서열번호: 267)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 123의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 124의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 268; 서열번호: 269; 및 서열번호: 270)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab13에 대해, 전체 길이 Ab13 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 122의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 262 및 서열번호: 124의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 264.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab13의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab13 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab13 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab14
본 발명은 추가로, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 131의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 271).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 132의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 272).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 133의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTTCTGTACCAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 273).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 134의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 274).
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 131의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 132의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 275; 서열번호: 276; 및 서열번호: 277의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 133의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 134의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 서열번호: 278; 서열번호: 279; 및 서열번호: 280의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 131의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 271; 서열번호: 132의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 272; 서열번호: 133의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 273; 서열번호: 134의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 274; 서열번호: 131의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 132의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 275; 서열번호: 276; 및 서열번호: 277)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 133의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 134의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 278; 서열번호: 279; 및 서열번호: 280)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 CGRP에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab14에 대해, 전체 길이 Ab14 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 132의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 272 및 서열번호: 134의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 274.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab14의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-CGRP 항체 예컨대 Ab14 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 또는 미생물 시스템 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab14 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 또는 133으로부터 선택된 항-CGRP VH 항체 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 적어도 하나의 뼈대 잔기 (FR 잔기)는 토끼 항-CGRP 항체 VH 폴리펩타이드 또는 보존적 아미노산 치환에서 상응하는 위치에 존재하는 아미노산으로 치환되었다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 또는 131의 항-CGRP VL 항체 아미노산 서열을 인코딩하거나, 그의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 적어도 하나의 뼈대 잔기 (FR 잔기)는 토끼 항-CGRP 항체 VL 폴리펩타이드 또는 보존적 아미노산 치환 에서 상응하는 위치에 존재하는 아미노산으로 치환되었다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기에 함유된 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 이종기원 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다: 서열번호:1 및 서열번호:3; 서열번호:11 및 서열번호:13; 서열번호:21 및 서열번호:23; 서열번호:31 및 서열번호:33; 서열번호:41 및 서열번호:43; 서열번호:51 및 서열번호:53, 서열번호:61 및 서열번호:63; 서열번호:71 및 서열번호:73; 서열번호:81 및 서열번호:83; 서열번호:91 및 서열번호:93; 서열번호:101 및 서열번호:103; 서열번호:111 및 서열번호:113; 서열번호:121 및 서열번호:123; 또는 서열번호:131 및 서열번호:133.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-CGRP 항체로부터 유래된 CDR 폴리펩타이드의 적어도 하나를 함유하는 폴리펩타이드를 발현시키는, 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 상기 발현된 폴리펩타이드 단독은 CGRP에 특이적으로 결합하거나 항-CGRP 항체로부터 유래된 CDR 폴리펩타이드의 적어도 하나를 함유하는 폴리펩타이드를 발현시키는 또 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열과 공동으로 발현될 때 CGRP에 특이적으로 결합하고, 상기 CDR의 적어도 하나는 서열번호: 1, 3, 11, 13, 21, 23, 31, 33, 41, 43, 51, 53, 61, 63, 71, 73, 81, 83, 91, 93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131, 또는 서열번호:133의 VL 또는 VH 폴리펩타이드에서 함유된 것으로부터 선택된다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주세포 및 벡터가 또한 고려된다.
본 발명은 추가로, 본원에서 제시된 바와 같이 가변 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 뿐만 아니라 개별적인 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 포함하는 벡터, 뿐만 아니라 상기 벡터 서열을 포함하는 숙주세포를 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 숙주세포는 효모 세포이다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 효모 숙주세포는 피치아속에 속한다.
B-세포 스크리닝 및 단리
일 구현예에서, 본 발명은 원하는 CGRP 항원, 또는 그와 같은 항체에 대응하는 핵산 서열에 대해 특이적인, CGRP에 대항하는 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 적어도 하나의 CGRP 항원-특이적 세포를 단리하기 위해 사용될 수 있는 항원-특이적 B 세포의 클론 모집단의 제조 및 단리를 고려한다. 항원-특이적 B 세포의 상기 클론 모집단을 제조 및 단리하는 방법은, 예를 들면 하기에서 교시된다: 미국 특허 공보 번호 US 2007/0269868 (Carvalho-Jensen 등), 그것의 개시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다. 항원-특이적 B 세포의 상기 클론 모집단을 제조 및 단리하는 방법은 또한 본원의 실시예에서 교시된다. 크기 또는 밀도에 의한 세포 집단을 "풍부하게 하는" 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 5,627,052. 이들 단계는 항원-특이성에 의해 세포 집단을 풍부하게 하는 것 외에 사용될 수 있다.
항체를 인간화하는 방법
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 항체 중쇄 및 경쇄를 인간화하는 방법을 고려한다. 항-CGRP 항체에 적용될 수 있는 항체 중쇄 및 경쇄를 인간화하는 방법은 예를 들면 하기에서 교시된다: 미국 특허 출원 공보 번호 US 2009/0022659 (Olson 등), 및 미국 특허 번호 7,935,340 (Garcia-Martinez 등), 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
항체 및 그의 단편을 생산하는 방법
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-CGRP 항체 및 그의 단편을 생산하는 방법을 고려한다. 교배 반응능 효모의 다배체, 바람직하게 2배체 또는 4배체 균주로부터 분비된 항-CGRP 항체 및 그의 단편을 생산하는 방법은 예를 들면 하기에서 교시된다: 미국 특허 출원 공보 번호 US 2009/0022659 (Olson 등), 및 미국 특허 번호 7,935,340 (Garcia-Martinez 등), 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
항체를 생산하는 다른 방법은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생산하는 방법은 이제 당해분야에 잘 공지되어 있다 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly 등); Morrison 등, P.N.A.S. USA, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. 등, Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. 등, Nature, 312:643-46 (1984), 이들 각각의 개시내용은 이것은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다).
마찬가지로, 인간화 항체를 생산하는 다른 방법은 당해분야에 잘 공지되어 있다 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,530,101, 5,585,089, 5,693,762, 및 6,180,370 (Queen 등); 미국 특허 번호 5,225,539 및 6,548,640 (Winter); 미국 특허 번호 6,054,297, 6,407,213 및 6,639,055 (Carter 등); 미국 특허 번호 6,632,927 (Adair); Jones, P.T. 등, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., 등, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, 등, Science, 239:1534-36 (1988), 이들 각각의 개시내용은 이것은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다).
CGRP 결합 특이성을 갖는 본 발명의 항체 폴리펩타이드는 당해분야의 숙련가에게 공지된 종래의 기술을 사용하여, 오페론 및 항체 중쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터를 제작하여 또한 생산될 수 있다, 여기서 항체 특이성에 대해 요구된 CDR을 인코딩하는 DNA 서열은 비-인간 세포 공급원, 바람직하게 토끼 B-세포 공급원으로부터 유래되고, 한편 항체 사슬의 잔류부를 인코딩하는 DNA 서열은 인간 세포 공급원으로부터 유래된다.
제 2 발현 벡터는 당해분야의 숙련가에게 잘 공지된 동일한 종래의 수단을 사용하여 생산되고, 상기 발현 벡터는 오페론 및 항체 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 함유하고, 여기서 상기 항체 특이성에 대해 요구된 CDR을 인코딩하는 DNA 서열은 비-인간 세포 공급원, 바람직하게 토끼 B-세포 공급원으로부터 유래되고, 한편 항체 사슬의 잔여부를 인코딩하는 DNA 서열은 인간 세포 공급원으로부터 유래된다.
발현 벡터는 당해분야의 숙련가에게 공지된 종래의 기술에 의해 숙주세포로 전달감염되어 전달감염된 숙주세포를 생산하고, 상기 전달감염된 숙주세포는 상기 항체 폴리펩타이드를 생산하기 위해 당해분야의 숙련가에게 공지된 종래의 기술에 의해 배양된다.
숙주세포는 상기에 기재된 2 개의 발현 벡터로 공-전달감염될 수 있고, 제 1 발현 벡터는 오페론 및 경쇄-유래 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 함유하고 제 2 벡터는 오페론 및 중쇄-유래 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 함유한다. 2 개의 벡터는 상이한 선택가능한 마커를 함유하지만, 바람직하게 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 실질적으로 동등한 발현을 달성한다. 대안적으로, 단일 벡터가 사용될 수 있고, 상기 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두를 인코딩하는 DNA를 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA, 게놈 DNA, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
항체 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용될 숙주세포는 박테리아 세포 예컨대 이. 콜리, 또는 진핵세포 예컨대 피. 패스토리스일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 이를 위한 명확한 유형의 포유동물 세포, 예컨대 골수 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, NSO 세포주, 또는 HEK293 세포주가 사용될 수 있다.
벡터가 제작될 수 있는 일반적인 방법, 숙주세포를 생산하기 위해 요구된 전달감염 방법 및 상기 숙주세포 모두로부터 항체 폴리펩타이드를 생산하기 위해 요구된 배양 방법은 종래의 기술을 포함한다. 바람직하게 항체를 생산하기 위해 사용된 세포주가 포유동물 세포주이지만, 임의의 다른 적당한 세포주, 예컨대 박테리아 세포주 예컨대 이. 콜리-유래 균주, 또는 효모 세포주가 대안적으로 사용될 수 있다.
마찬가지로, 일단 생산된 항체 폴리펩타이드는 당해 기술의 표준 절차, 예컨대 예를 들면 교차유동 여과, 암모늄 설페이트 침전, 친화도 칼럼 크로마토그래피 등에 따라 정제될 수 있다.
본원에 기재된 항체 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 폴리펩타이드와 동일한 치료 적용에 유용한 펩타이드 또는 비-펩타이드 모방체의 디자민 및 합성에 또한 사용될 수 있다. 참고, 예를 들면, Saragobi 등, Science, 253:792-795 (1991), 그의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
선별 검정
본 발명은 또한, CGRP 연관된 질환 또는 장애의 증상을 나타내는 환자에서 CGRP와 연관된 질환 및 장애의 확인하는데 도움이 되도록 디자인된 선별 검정을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항-CGRP 항체, 또는 CGRP 그의 결합 단편은 CGRP와 연관된 질환 또는 장애의 증상을 나타내는 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 CGRP의 존재를 검출하기 위해 사용된다. CGRP의 존재, 또는 그의 높은 수준은, 비교할만한 생물학적 샘플에서 CGRP의 전-질환 수준과 비교할 때, CGRP와 연관된 질환 또는 장애를 진단하는데 유익할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 구현예는 본원에서 확인된 CGRP 연관된 질환 또는 장애의 증상을 나타내는 환자에서 CGRP와 연관된 질환 또는 장애의 진단에 도움이 되도록 진단 또는 선별 검정을 제공하고, 이 검정은 후번역으로 변형된 항-CGRP 항체 또는 그의 결합 단편을 사용하여 상기 환자로부터 생물학적 샘플에서 CGRP 발현의 수준을 검정하는 것을 포함한다. 항-CGRP 항체 또는 그의 결합 단편은 후번역으로 번형되어 검출가능 모이어티 예컨대 개시내용에서 이전에 제시된 것을 포함할 수 있다.
생물학적 샘플의 CGRP 수준은 본원에 제시된 변형된 항-CGRP 항체 또는 그의 결합 단편을 사용하고 CGRP의 표준 수준 (예를 들면, 정상 생물학적 샘플의 수준)에 대한 생물학적 샘플의 CGRP의 수준을 비교하여 측정된다. 숙련된 임상의는, 일부 가변성이 정상 생물학적 샘플들 사이에 존재할 수 있다는 것을 이해하고, 결과를 평가할 때 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항-CGRP 항체는 CGRP 발현 수준을 암성 발달의 특정한 단계와 관련짓기 위해 사용될 수 있다. 당해분야의 숙련가는 암성 발달의 임상적으로 규정된 단계에 대응하는 CGRP 발현의 범위를 확인하기 위해 수많은 대상체에서 CGRP를 측정할 수 있다. 이들 범위는, 당업자가 암이 있는 것으로 진단된 대상체에서 CGRP의 측정하고 각 대상체의 수준과 상기 암의 단계에 대응하는 범위와 상관관계가 있다는 것을 허용할 것이다. 당해분야의 숙련가는, 상이한 간격으로 환자의 CGRP를 모니터링하여 암의 진행이 측정될 수 있는 것으로 이해한다.
상기-인용된 검정은, CGRP 연관된 질환 또는 장애를 갖는 것으로 믿어지는 환자의 생물학적 샘플에서 수득된 CGRP의 수준이 상기 환자의 CGRP 수준이 예를 들면, 치료 계획으로 변했는지를 확인하기 위해 동일한 환자로부터 이전의 생물학적 샘플에서 CGRP의 수준과 비교될 때, 질환 또는 장애를 모니터링하는에 유용할 수 있다.
본 발명은 또한, CGRP를 발현시키는 세포의 존재를 생체내에서 이미지화하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 진단적 유효량의 진단 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 상기 생체내 이미징은 예를 들면 CGRP 발현 종양 또는 전이의 검출 또는 이미징에 유용하고, 효과적인 암 치료 프로토콜의 디자인에 대한 계획 레지멘의 일부로서 유용할 수 있다. 치료 프로토콜은, 예를 들면, 방사선, 화학요법, 시토카인 요법, 유전자 요법, 및 항체 요법 중 하나 이상, 뿐만 아니라 항-CGRP 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 항-CGRP 항체의 CGRP에의 결합을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 특히, 키트는 본 발명의 항-CGRP 항체 또는 면역반응성 그의 단편과 특이적으로 반응하는 CGRP의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 키트는 기질에 결합되는 항체, 항원과 반응하는 2차 항체 및 항원에 의한 제 2차 항체의 반응을 검출하기 위한 시약을 또한 포함할 수 있다. 그와 같은 키트는 ELISA 키트일 수 있고 예를 들면 본원에 기재된 바와 같이, 기질, 적절할 때일차 및 2차 항체, 및 임의의 다른 필요한 시약 예컨대 검출가능 모이어티, 효소 기질, 및 발색 시약을 포함할 수 있다. 진단 키트는 또한 면역블랏 키트의 형태일 수 있다. 진단 키트는 또한 화학발광 키트의 형태일 수 있다 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). 진단 키트는 또한 란탄계 원소계 검출 키트 일 수 있다 (PerkinElmer, San Jose, CA).
숙련된 임상의는, 생물학적 샘플이, 비제한적으로, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 점액, 늑막 유체, 활막 유체 및 척수액을 포함하는 것으로 이해한다.
CGRP의 증상을 개선 또는 감소시키거나, 그것과 연관될 질환 및 장애를 치료 또는 예방하는 방법
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 그의 단편은 CGRP와 연관된 질환 및 장애의 증상을 개선 또는 감소시키거나, 그것을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 그의 단편, 뿐만 아니라 조합은, 이하에 더 상세히 기재된 바와 같이, 약제학적 조성물 형태로 CGRP와 연관된 질환 및 장애의 치료가 필요한 환자에게 치료적 효과적인 양이 또한 투여될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 그의 단편은 하기의 증상을 개선 또는 감소시키거나, 그것을 치료 또는 예방하는데 유용하다: (전조가 있거나 없는) 편두통, 체중 감소, 암 또는 종양, 암 또는 종양 성장과 연관된 신생혈관형성, 암 또는 종양 생존과 연관된 신생혈관혈성, 통증, 반신마비성 편두통, 군발성 두통, 편두통성 신경통, 만성 두통, 긴장성 두통, 일반적인 두통, 열감, 만성 발작성 편두통, 두경부에서 근원적인 구조 문제로 인한 이차성 두통, 두개 신경통, 부비동 두통 (예를 들면 부비강염과 연관된 것), 및 알러지-유도된 두통 또는 편두통.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 그의 단편 및/또는 제 2 제제는, 하기의 질환 및 장애의 비제한 목록의 증상을 개선 또는 감소시키거나, 그것을 치료 또는 예방하는데 유용하다: 통증, 염증성 통증, 수술후 절개 통증, 복합 부위 통증 증후군, 암 통증, 일차 또는 전이성 골 암 통증, 골절 통증, 만성 통증, 골다공증 골절 통증, 화상 유래 통증, 골다공증, 통풍 관절 통증, 복통, 겸상 적혈구 위기와 연관된 통증, 및 다른 침해성 통증, 뿐만 아니라 간세포 암종, 유방암, 간경변증, 신경성 통증, 신경병성 통증, 침해성 통증, 삼차 신경통, 대상포진후 신경통, 환지통, 섬유근육통, 생리 통증, 난소통, 반사성 교감신경 위축증, 신경성 통증, 골관절염 또는 류마티스성 관절염 통증, 등 아래 통증, 당뇨병성 신경병증, 엉덩뼈신경통, 또는 통증 또는 하기와 연관된 내장 통증: 위-식도 역류, 소화불량, 과민성 장 증후군, 과민성 결장, 강직성 결장, 점액 대장염, 염증성 장질환, 크론병, 회장염, 궤양성 대장염, 신장 산통, 월경통, 방광염, 생리 기간, 노동, 폐경기, 전립선염, 췌장염, 신장 산통, 월경통, 침입형 방광염 (IC)을 포함하는 방광염, 장폐색증과 연관될 수술, 게실염, 복막염, 심막염, 간염, 충수염, 대장염, 담낭염, 자궁내막증, 만성 및/또는 급성 췌장염, 심근경색증, 신장 통증, 늑막 통증, 전립선염, 골반 통증, 장기와 연관된 외상 만성 침해성 통증, 만성 신경병성 통증, 만성 염증성 통증, 섬유근육통, 돌파 통증 및 지속적 통증, 및 하기 중 하나 이상으로 바람직하게 선택된 악성종양 또는 암으로부터 생긴 암 통증: 선상 조직의 선암종, 장기의 배아 조직의 모세포종, 상피 조직의 암종, 혈구로부터의 조직의 백혈병, 림프성 조직의 림프종, 골수의 골수종, 결합 또는 지지 조직의 육종, 부신암, AIDS-관련된 림프종, 빈혈, 방광암, 골 암, 뇌암, 유방암, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 화학요법, 결장암, 혈구감소, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두부암, 경부암, 간담도 암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 호지킨 질환, 림프종, 비- 호지킨, 신경계 종양, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 요도 암, 골 암, 결합 조직의 육종 암, 골 조직의 암, 혈액-형성 세포의 암, 골수의 암, 다발성 골수종, 백혈병, 일차 또는 2차 골 암, 골로 전이된 종양, 신경 및 중공 내장에 침투하는 종양, 신경 구조 근처의 종양. 추가로 바람직하게 암 통증은 내장 통증, 바람직하게 췌장암으로부터 생기고/거나 복부에서 전이된 내장 통증을 포함한다. 추가로 바람직하게 암 통증은 체성 통증, 바람직하게 골 암, 골에서의 전이, 수술후 통증, 결합 조직의 육종 암, 골 조직의 암, 혈액-형성 세포의 골수의 암, 다발성 골수종, 백혈병, 일차 또는 2차 골 암 중 하나 이상으로 인한 체성 통증을 포함한다.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 그의 단편 및/또는 제 2 제제는, 하기의 질환 및 장애의 비제한 목록의 증상을 개선 또는 감소시키거나, 그것을 치료 또는 예방하는데 유용하다: 암 또는 종양, 암 또는 종양 성장과 연관된 신생혈관형성, 암 또는 종양 생존과 연관된 신생혈관혈성.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 그의 단편 및/또는 제 2 제제는, 하기의 질환 및 장애의 비제한 목록의 증상을 개선 또는 감소시키거나, 그것을 치료 또는 예방하는데 유용하다: 신경성, 신경병성 또는 침해성 통증. 신경병성 통증은, 비제한적으로, 삼차 신경통, 대상포진후 신경통, 환지통, 섬유근육통, 생리 통증, 난소통, 반사성 교감신경 위축증 및 신경성 통증을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 골관절염 또는 류마티스성 관절염 통증, 등 아래 통증, 당뇨병성 신경병증, 엉덩뼈신경통, 및 다른 신경병성 통증.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 그의 단편 및/또는 제 2 제제는 하기의 질환 및 장애의 비제한 목록의 증상을 개선 또는 감소시키거나, 그것을 치료 또는 예방하는데 유용하다: 과민성 방광 및 다른 소변 상태, 위-식도 역류 및 위-식도 역류와 연관된 내장 통증, 소화불량, 과민성 장 증후군, 염증성 장질환, 크론병, 회장염, 궤양성 대장염, 신장 산통, 월경통, 방광염, 생리 기간, 노동, 폐경기, 전립선염, 소양증, 또는 췌장염. 또한, 대상체 CGRP 항체 및 항체 단편은 단독으로 또는 다른 활성제, 예를 들면, 오피오이드 및 비-오피오이드 진통제 예컨대 NSAID와 함께 사용되어 진통을 유도하거나 또 하나의 진통제의 효능을 강력하게 하거나 특정 진통제 예컨대 모르핀 또는 관련된 오피오이드 진통제에 대한 내성을 예방 또는 개선할 수 있다. 모르핀-유도된 진통의 발달을 차단/역전시키는 역할의 증거는 하기인 사실이다: CGRP8-37 및 CGRP 수용체 길항제 (BIBN4096BS)는 전하는 바에 따르면 모르핀 내성의 발달을 예방/역전시킨다 (Powell 등, 2000 J Brit J Pharmacol (131):875; Menard 등, 1996 J Neurosci (16):2342; Wang 등, 2009 FASEB J (23):2576; Wang 등, 2010 통증 (151):194)
대상체 항체는 잠재적으로 임의의 오피오이드 진통제 또는 NSAID 또는 다른 진통제, 잠재적으로 또 하나의 항체와 조합되어 통증 관리를 증가 또는 향상시키거나, 진통제 예컨대 오피오이드 진통제 화합물에 대한 내성을 역전 또는 억제할 수 있다. 이것으로 그와 같은 진통제 화합물이 더 긴 지속시간 동안 또는 감소된 복용량으로 투여되는 것을 허용할 수 있고 그렇게 함으로써 잠재적으로 그것과 연관된 불리한 부작용을 개선한다.
용어 "오피오이드 진통제"는, 본원에서, 약물, 모르핀 유사 작용을 갖는 천연 또는 합성의 모든 약물을 의미한다. 합성 및 반합성 오피오이드 진통제는 하기 화합물의 5 개의 화학적 클래스의 유도체이다: 펜안트렌; 페닐헵틸아민; 페닐피페리딘; 모르피난; 및 벤조모르판, 이들 모두는 그 용어의 범위 내에 있다. 예시적인 오피오이드 진통제는 하기를 포함한다: 코데인, 디하이드로코데인, 디아세틸모르핀, 하이드로코돈, 하이드로모르폰, 레보르파놀, 옥시모르폰, 알펜타닐, 부프레노르핀, 부토르파놀, 펜타닐, 수펜타닐, 메페리딘, 메타돈, 날부핀, 프로폭시펜 및 펜타조신 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염.
용어 "NSAID"는, 비-스테로이드 항염증 화합물을 의미한다. NSAID는 사이클로옥시게나제를 억제하는 그의 능력에 의해서 분류될 수 있다. 사이클로옥시게나제 1 및 사이클로옥시게나제 2는 사이클로옥시게나제의 2개의 주요 동형체이고 대부분의 표준 NSAID는 2 개의 동형체의 혼합된 억제제이다. 대부분의 표준 NSAID는 하기의 5 개의 구조 카테고리 내에 있다: (1) 프로피온산 유도체, 예컨대 이부프로펜, 나프록센, 나프로신, 디클로페낙, 및 케토프로펜; (2) 아세트산 유도체, 예컨대 톨메틴 및 슬린닥; (3) 페남산 유도체, 예컨대 메페남산 및 메클로페남산; (4) 바이페닐카복실산 유도체, 예컨대 디플루니살 및 플루페니살; 및 (5) 옥시캄, 예컨대 피록심, 수독시캄, 및 이속시캄. 사이클로옥시게나제 2를 선택적으로 억제하는 NSAID의 또 하나의 부류가 기재되었다. Cox-2 억제제는 예를 들면 하기에서 기재되었다: 미국 특허 번호 5,616,601; 5,604,260; 5,593,994; 5,550,142; 5,536,752; 5,521,213; 5,475,995; 5,639,780; 5,604,253; 5,552,422; 5,510,368; 5,436,265; 5,409,944; 및 5,130,311, 이들 모도는 참고로 본원에 포함되어 있다. 어떤 예시적인 COX-2 억제제는 하기를 포함한다: 셀레콕십 (SC-58635), DUP-697, 플로수라이드 (CGP-28238), 멜록시캄, 6-메톡시-2 나프틸아세트산 (6-MNA), 로페콕십, MK-966, 나부메톤 (6-MNA의 전구약물), 니메설라이드, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; 또는 이들의 조합.
일부 구현예에서, 아스피린 및/또는 아세트아미노펜은 대상체 CGRP 항체 또는 단편과 함께 취해질 수 있다. 아스피린은 비-스테로이드 항염증 화합물의 또 하나의 유형이다.
본 발명의 CGRP 항체의 투여에 의해 치료 및/또는 예방될 수 있는 예시적인, 비제한 질환 및 장애는 신경성, 신경병성, 염증성, 열 또는 침해성 통증과 연관된 임의의 상태로부터 생긴 통증을 포함한다. 바람직하게 장애는 통증 부위에서 증가된 CGRP와 연관될 것이다. 신경병성 통증의 어떤 구현예에서, 언급된 삼차 신경통, 대상포진후 신경통, 환지통, 섬유근육통, 반사성 교감신경 위축증 및 신경성 통증 상태가 바람직하게 치료된다. 다른 구현예에서, 암 통증, 특히, 골 암 통증, 골관절염 또는 류마티스성 관절염 통증, 등 아래 통증, 수술후 절개 통증, 골절 통증, 골다공증 골절 통증, 골다공증, 통풍 관절 통증, 당뇨병성 신경병증, 엉덩뼈신경통, 겸상 적혈구 위기와 연관된 통증, 편두통, 및 다른 신경병성 및/또는 침해성 통증이 바람직하게 치료된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 항체 단편의 사용을 통해 CGRP 활성 또는 CGRP 상향조절와 연관된 임의의 질환 또는 장애 (상기 언급된 예시적인 질환, 장애 및 상태의 임의의 것 포함)를 치료, 예방 및/또는 개선하는 방법을 포함한다. 본 발명의 치료 방법은 단독으로 또는 또 하나의 활성제와 공동으로 본원에서 개시된 항-CGRP 항체를 포함하는 임의의 제형을 투여하는 것을 포함한다.
약제학적 제형이 투여되는 대상체는, 예를 들면, 그와 같은 치료, 예방 및/또는 완화가 필요하거나, CGRP-매개된 활성의 억제 또는 감쇠로부터 이점이 있는 임의의 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 예를 들면, 대상체는 상기 언급된 질환 또는 장애의 임의의 것으로 진단되거나 그것에 의해 괴로울 위험이 있는 것으로 보이는 개인일 수 있다. 본 발명은 추가로, CGRP 활성과 연관된 임의의 질환 또는 장애 (상기 언급된 예시적인 질환, 장애 및 상태의 임의의 것 포함)의 치료, 예방 및/또는 완화용 약제의 제조에서의 본원에 개시된 임의의 약제학적 제형의 용도를 포함한다.
투여
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 CGRP 그의 결합 단편, 뿐만 아니라 상기 항체 또는 항체 단편의 조합은 약 0.1 내지 100.0 mg/수령 대상체의 체중 kg의 농도로 대상체에게 투여된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 CGRP 그의 결합 단편, 뿐만 아니라 상기 항체 또는 항체 단편의 조합은 약 0.4 mg/수령 대상체의 체중 kg의 농도로 대상체에게 투여된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 CGRP 그의 결합 단편, 뿐만 아니라 상기 항체 또는 항체 단편의 조합 매 26 주 이하 1회, 예컨대 매 16 주 이하 1회, 매 8 주 이하 1회, 매 4 주 이하 1회, 매 2 주 이하 1회, 매주 이하 1회, 또는 1일 이하 1회의 빈도로 수령 대상체에 투여된다.
Fab 단편은 매 2 주 이하, 매주 이하, 1일 1회 이하, 여러 번/1 일, 및/또는 매 몇 시간 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 환자는 원하는 결과를 얻는데 효과적인 1 내지 6 회/1 일의 분할 용량으로, 또는 지속된 방출 형태로 주어진 0.1 mg/kg 내지 40 mg/kg/1일의 Fab 단편을 수용한다.
주어진 환자에게 투여된 항체 또는 Fab의 농도는 단락 [0552] 및 [0553]에서 상기에 제시된 예시적인 투여 농도 초과 또는 미만일 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
당해분야의 숙련가는, 예를 들면 본원의 개시내용 및 하기의 교시에 의해 안내된 일상적인 실험과정을 통해 효과적인 복용량 및 투여 빈도를 측정할 수 있다: Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C., & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 및 Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 CGRP 그의 결합 단편, 뿐만 아니라 상기 항체 또는 항체 단편의 조합은 약제학적 제형으로 대상체에게 투여된다.
"약제학적 조성물"은 포유동물에의 투여에 적당한 화학적 또는 생물학적 조성물을 의미한다. 그와 같은 조성물은 하기를 비제한적으로 포함하는 수많은 경로 중 하나 이상을 통해 투여용으로 구체적으로 제형될 수 있다: 구강, 표피, 경막외, 흡입, 동맥내, 심장내, 뇌심실내, 진피내, 근육내, 비강내, 안구내, 복강내, 척수내, 척추강내, 정맥내, 경구, 비경구, 관장 또는 좌약을 통한 직장, 피하, 피하, 설하, 경피, 및 점막통과. 또한, 투여는 주사, 분말, 액체, 겔, 물약, 또는 다른 투여 수단에 의해 일어날 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 기재된 항-CGRP 항체, 또는 CGRP 그의 결합 단편, 뿐만 아니라 상기 항체 또는 항체 단편의 조합은 하나 이상의 활성제와 함께 임의의 투여될 수 있다. 그와 같은 활성제는 진통제, 항-히스타민, 해열제, 항염증, 항생제, 항바이러스, 및 항-시토카인 제제를 포함한다. 활성제는 하기를 포함한다: 작용제, 길항제, 및 TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-α, IFN-γ, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, 간세포 성장 인자 (HGF), 헵시딘, 임의의 상기에 대항하는 항체 반응성, 및 임의의 그것의 수용체에 대항하는 항체 반응성의 조절물질. 활성제는 또한 비제한적으로 하기를 포함한다: 2-아릴프로피온산, 아세클로페낙, 아세메타신, 아세틸살리실산 (아스피린), 알클로페낙, 알미노프로펜, 암모시프린, 암파이론, 아릴알칸산, 아자프로파존, 베노릴레이트/베노릴레이트, 베녹사프로펜, 브롬페낙, 카프로펜, 셀레콕십, 콜린 마그네슘 살리실레이트, 클로페존, COX-2 억제제, 덱시부프로펜, 덱스케토프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 드록시캄, 에텐자마이드, 에토돌락, 에토리콕십, 파이슬라민, 페남산, 펜부펜, 페노프로펜, 플루페남산, 플루녹사프로펜, 플루르바이프로펜, 이부프로펜, 이부프록삼, 인도메타신, 인도프로펜, 케부존, 케토프로펜, 케토록락, 로르녹시캄, 록소프로펜, 루미라콕십, 마그네슘 살리실레이트, 메클로페남산, 메페남산, 멜록시캄, 메타미졸, 메틸 살리실레이트, 모페부타존, 나부메톤, 나프록센, N-아릴안트라닐산, 신경 성장 인자 (NGF), 옥사메타신, 옥사프로진, 옥시캄, 옥시펜부타존, 파레콕십, 페나존, 페닐부타존, 페닐부타존, 피록시캄, 파이르프로펜, 프로펜스, 프로글루메타신, 피라졸리딘 유도체, 로페콕십, 살리실 살리실레이트, 살리실아마이드, 살리실레이트, 서브스턴스 P, 설핀파이라존, 설린닥, 수프로펜, 데녹시캄, 티아프로펜산, 톨페남산, 톨메틴, 및 발데콕십.
항-히스타민제는 히스타민의 작용 또는 세포 (예를 들면, 비만 세포)로부터의 그것의 방출에 반대하는 임의의 화합물일 수 있다. 항히스타민제는 비제한적으로 하기를 포함한다: 아크리바스틴, 아스테미졸, 아자타딘, 아젤라스틴, 베타타스틴, 브롬페니라민, 부클리진, 세티리진, 세티리진 유사체, 클로르페니라민, 클레마스틴, CS 560, 사이프로헵타딘, 데슬로라타딘, 덱스클로르페니라민, 에바스틴, 에피나스틴, 펙소페나딘, HSR 609, 하이드록시진, 레보카바스틴, 로라티딘, 메트스모폴라민, 미졸라스틴, 노라스테미졸, 페닌다민, 프로메타진, 파이릴아민, 테르페나딘, 및 트라닐라스트.
항생제는 비제한적으로 하기를 포함한다: 아미카신, 아미노글리코사이드, 암목실린, 암피실린, 안사마이신, 아르스페나민, 아지트로마이신, 아즐로실린, 아즈트레오남, 바시트라신, 카바세펨, 케바페넴, 카르베니실린, 세파클로르, 세파드록실, 세팔렉신, 세팔로틴, 세팔로틴, 세파만돌, 세파졸린, 세프디니르, 세프디토렌, 세페핌, 세픽심, 세포페라존, 세포탁심, 세폭시틴, 세프포독이심, 세프프로질, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심, 세프토바이프롤, 세프트리악손, 세푸록심, 세팔로스포린, 클로르암페니콜, 실라스타틴, 시프로플록사신, 클라리트로마이신, 클린다마이신, 클록사실린, 콜리스틴, 코-트리목사졸, 탈포프리스틴, 데메클로사이클린, 디클록사실린, 디리트로마이신, 도리페넴, 데옥시사이클린, 에녹사신, 에르타페넴, 에리트로마이신, 에탐부톨, 플루클록사실린, 포스포마이신, 푸라졸리돈, 후시딘산, 가티플록사신, 젤다나마이신, 겐타마이신, 글리코펩타이드, 허비마이신, 이미페넴, 이소니아지드, 카나마이신, 레보플록사신, 린코마이신, 리네졸라이드, 로메플록사신, 로라카르베프, 매르롤라이드, 마페나이드, 메로페넴, 메티실린, 메트로니다졸, 메즐로실린, 미노사이클린, 모노박탐, 목시플록사신, 무피로신, 나프실린, 네오마이신, 네틸마이신, 니트로푸란토인, 노르플록사신, 오플록사신, 옥사실린, 옥시테트라사이클린, 파로모마이신, 페니실린, 페니실린, 피페라실린, 플라텐시마이신, 폴리믹신 B, 폴리펩타이드, 프론토실, 피라진아마이드, 퀴놀론, 퀴누프리스틴, 리팜피신, 리팜핀, 록시트로마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 설파세트아마이드, 설파메티졸, 설파닐리마이드, 설파살라진, 설피속사졸, 설폰아마이드, 테이코플라닌, 텔리트로마이신, 테트라사이클린, 테트라사이클린, 티카실린, 티니다졸, 토브라마이신, 트리메토프림, 트리메토프림-설파메톡사졸, 트롤레안도마이신, 트로바플록사신, 및 반코마이신.
활성제는 또한 하기를 포함한다: 알도스테론, 베클로메타손, 베타메타손, 코르티코스테로이드, 코르티솔, 코르티손 아세테이트, 데옥시코르티코스테론 아세테이트, 덱사메타존, 플루드로코르티손 아세테이트, 글루코코르티코이드, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 스테로이드, 및 트리암시놀론. 이들 활성제의 임의의 적당한 조합이 또한 고려된다.
"약제학적 부형제" 또는 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 담체, 보통 액체이고, 여기서 활성 치료제가 제형된다. 본 발명의 일 구현예에서, 활성 치료제는 본원에 기재된 인간화 항체, 또는 하나 이상의 그의 단편이다. 부형제는 화학적 및/또는 생물학적 안정성, 및 방출 특성을 제공할 수는 있지만 일반적으로 제형에 대한 임의의 약리적 활성을 제공하지 않는다. 예시적인 제형은 예를 들면 참고로 포함되는 있는 하기에서 발견될 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, 제 19판, Grennaro, A., Ed., 1995.
본원에 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장 및 생리적으로 상용성인 흡수 지연제를 포함한다. 일 구현예에서, 담체는 비경구 투여에 적당하다. 대안적으로, 담체은 정맥내, 복강내, 근육내, 또는 설하 투여에 적당할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 주사가능 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산물 및 멸균 분말을 포함한다. 약제학적으로 활성 물질을 위한 그와 같은 매체 및 제제의 사용은 당해분야에 공지되어 있다. 임의의 종래의 매체 또는 제제가 활성 화합물과는 불양립성인 것은 제외하는 한, 본 발명의 약제학적 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 보충 활성 화합물은 또한 조성물에 포함될 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 보관의 상태 하에서 멸균 및 안정해야 한다. 본 발명은, 약제학적 조성물이 동결건조된 형태로 존재하는 것을 고려한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적당한 다른 질서 있는 구조로서 제형될 수 있다. 담체는 용매 또는 분산매일 수 있고, 이것은, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 적당한 그의 혼합물을 함유한다. 본 발명은 추가로, 약제학적 조성물에서 안정제의 포함을 고려한다. 적절한 유체성은, 예를 들면, 분산물의 경우에 요구된 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
많은 경우에, 조성물에서 등장제, 예를 들면, 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 장기적인 흡수는 흡수를 지연하는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴를 조성물에서 포함하여 일어날 수 있다. 게다가, 알칼린 폴리펩타이드는 지연 방출 제형에서, 예를 들면 느린 방출 폴리머를 포함하는 조성물에서 제형될 수 있다. 활성 화합물은 이식물 및 마이크로캡슐에 넣어진 전달 시스템을 포함하는 빠른 방출, 예컨대 조절된 방출 제형에 대항하여 화합물을 보호할 담제와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있고, 그 예는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 아교질, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락트산, 폴리글리콜 코폴리머 (PLG)이다. 그와 같은 제형의 많은 제조 방법은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
각각의 인용된 구현예에 대해, 화합물은 다양한 복용 형태로 투여될 수 있다. 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 생물학적으로-허용가능한 복용 형태, 및 이들의 조합이 고려된다. 그와 같은 복용 형태의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 재구성가능 분말, 엘릭시르, 액체, 용액, 서스펜션, 에멀젼, 분말, 과립, 입자, 마이크로입자, 분산성 과립, 카셰, 흡입기, 에어로졸 흡입기, 패치, 입자 흡입기, 이식물, 데포(depot) 이식물, 주사제 (피하, 근육내, 정맥내, 및 진피내를 포함), 주입, 및 이들의 조합.
예시된 본 발명의 다양한 구현예의 상기 설명은 총 망라하거나 개시된 정확한 형태로 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 특정 구현예 및 예들은 본원에 예시적인 목적으로 기술되어 있음에도 불구하고, 관련 분야의 숙련자들에게 인식될 본 발명의 범위 내에서 다양한 동등한 변형이 가능하다. 본원에 제공된 본 발명의 교시는 상기 기술된 실시예 이외의 다른 목적에 적용될 수 있다.
상기 상세한 설명에 비추어 본 발명에 이러한 그리고 다른 변화가 이뤄질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항에서, 사용된 용어들은 본 발명을 명세서 및 청구항에 개시된 특정 구현예로 한정하고자 하는 것으로 이해되어서는 안된다. 따라서, 본 발명은 상기 개시에 한정되지 않으나, 그 대신 본 발명의 범위는 하기 청구항에 의해 전적으로 결정될 것이다.
본 발명은 하기 설명 및 실시예에 상세히 기술된 것 이외의 방식으로 실행될 수 있다. 상기 교시에 비추어 본 발명의 수많은 변형 및 변화가 가능하며, 따라서 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
항원-특이적 B 세포의 클론 집단을 얻기 위한 방법에 관한 소정의 교시들이 2006년 5월 19일에 출원된 미국 가출원 제60/801,412호에 개시되어 있으며,,이들의 개시내용은 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있다.
토끼-유래 모노클로날 항체의 인간화 및 항원 결합 친화도를 유지하기 위한 바람직한 서열 변형에 관한 소정의 교시들이 2008년 5월 21일에 출원된 "신규 토끼 항체 인간화 방법 및 인간화 토끼 항체"라는 명칭의, 국제 공개 제WO/2008/144757호에 대응되는 국제 출원 제PCT/US2008/064421호에 개시되어 있으며, 이들의 개시내용은 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있다.
교배 능력이 있는 효모를 이용하여 항체 또는 이의 단편을 생산하는 것 및 대응되는 방법들에 관한 소정의 교시들이 2006년 5월 8일에 출원된 미국 특허 출원 제11/429,053호(미국 특허 출원 공개 제US2006/0270045호)에 개시되어 있으며, 이들의 개시내용이 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있다.
소정의 CGRP 항체 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드가 이 특허 출원에 첨부된 서열 목록에 개시되어 있고, 상기 서열 목록의 개시내용은 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있다.
발명의 배경, 상세한 설명, 및 실시예에 인용된 각 문헌의 전체 내용(특허, 특허 출원, 신문 기사, 초록, 매뉴얼, 책자, 또는 다른 개시내용)은 이들 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있다.
하기 실시예들은 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 제공하기 위해 제시되며, 이는 발명으로서 간주되는 것의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 사용된 수치(예컨대, 양, 온도, 농도 등)에 대한 정확도를 보장하기 위한 노력이 있었으나, 약간의 실험 오차 및 편차는 허용되어야 한다. 달리 지적되지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 부근이다.
실시예
실시예 1: CGRP 에 결합하는 항체의 제조
본원에 개시된 항체 선별 프로토콜에 의해, 광범위한 패널의 항체들을 생성할 수 있다.
면역화 전략
토끼를 인간 CGRPα(American Peptides, Sunnyvale CA 및 Bachem, Torrance CA)로 면역화시켰다. 면역화는 완전 프로이드 보조액(CFA)(시그마) 중의 100 μg의 KLH와 혼합된 100 μg의 항원의 1차 피하(sc) 및 뒤이어 각각 불완전 프로이드 보조액(IFA)(시그마) 중의 50 μg과 혼합된 50 μg 항원을 함유하는 2주 간격의 2회 부스트로 이루어졌다. 동물로부터 55일째에 채혈하고, SK-N-MC에서 CGRP 주도의 cAMP의 억제에 의해 혈청 역가를 결정하였다.
항체 선별 역가 평가
인간 CGRPα에 결합하는 항체를 동정하고 특성을 규명하기 위해, 항체-함유 용액을 ELISA에 의해 시험하였다. 요약하면, 뉴트라비딘 코팅된 플레이트(Thermo Scientific)를 ELISA 완충액(PBS pH 7.4 중의 0.5% 생선 피부 젤라틴)에 희석된 N-말단 바이오티닐화된 인간 CGRPα(50 μL/웰, 1 μg/mL)로 실온에서 약 1시간 동안 또는 대안적으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그리고 나서, 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 ELISA 완충액으로 추가로 차단하고 세척 완충액(PBS, 0.05% 트윈 20)을 이용하여 세척하였다. 시험된 혈청 샘플을 ELISA 완충액을 이용하여 연속 희석하였다. 희석된 혈청 샘플 50 μL을 웰 위로 이전시키고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하였다. 현상을 위해, 항-토끼 특이적 Fc-HARP(ELISA 완충액 중의 1:5000 희석)를 웰에 첨가하고 실온에서 45분간 인큐베이션하였다. 세정액을 이용한 3x 세척 단계 후, TMB 기질을 이용하여 실온에서 2분간 플레이트를 현상하고, 0.5M HCl을 이용하여 반응을 켄칭하였다. 웰 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
기능적 활성에 의한 혈청 샘플의 역가 결정( CGRP 주도의 cAMP 수준의 억제)
기능적 활성을 갖는 항체를 동정하고 특성을 규명하기 위해, cAMP 수준의 CGRP 주도 증가의 억제 분석을 전기화학발광(functional activity)을 이용하여 수행하였다. 요약하면, 시험될 항체 제제를 96 웰 둥근바닥 폴리스티렌 플레이트(Costar)에서 MSD 분석 완충액(Hepes, MgCl2, pH 7.3, 1 mg/mL blocker A, Meso Scale Discovery) 중에서 연속 희석하였다. 이 플레이트에, MSD 검정 완충액에서 희석된 인간 CGRPα를 첨가하고(최종 농도 10 ng/mL), 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 분석-키트 제조업체에 의해 제안된 적절한 대조군을 사용하였다. 인간 신경상피종 세포(SK-N-MC, ATCC)를 EDTA 용액(PBS 중의 5 mM)을 이용하여 떼어내고 성장 배지(MEM, 10% FBS, 항생제)를 이용하여 원심분리에 의해 세척하였다. 세포 수를 분석 완충액 mL 당 200만 개의 세포로 조정하고, 세포를 cAMP 분석 플레이트에 로딩하기 바로 전에 IBMX(3-이소부틸-1메틸잔틴, 시그마)를 0.2 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 항체 인간 CGRPα 용액을 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 함유하는 20 μL의 용액을 cAMP 분석 플레이트로 이동시켰다. 시험된 모든 샘플을 적절한 대조군과 함께 2반복으로 진행시켰다. 10 μL의 세포를 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 교반하면서 30분간 배양하였다. 세포가 CGRP 용액과 함께 배양되는 동안, 세포용해 버퍼(MSD) 중의 TAG 표지된 cAMP(MSD)의 1:200 용액을 만들어 정지 용액을 제조하였다. 세포-CGRP 배양을 정지시키기 위해, 20 μL의 정지 용액을 세포에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 교반하면서 1시간 동안 배양하였다. 판독 완충액(MSD)을 물로 4배 희석하고, 100 μL를 플레이트 상의 모든 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 플레이트를 Sector imager 2400(MSD)를 이용하여 판독하고 데이타 피트(fit) 및 IC50 결정을 위해 프리즘 소프트웨어를 사용하였다.
조직 수확
허용가능한 역가가 확립되면, 토끼(들)를 희생시켰다. 비장, 림프절, 및 전혈을 수확하고 하기와 같이 처리하였다:
조직을 분리하고 20 cc 주사기의 플런저를 이용하여 70 μm의 멸균 와이어 메쉬 (Fisher)를 통해 압력을 가함으로써 비장 및 림프절을 단일 세포 현탁액으로 가공하였다. 세포를 PBS 중에서 수집하였다. 세포를 원심분리에 의해 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 트립판 블루에 의해 세포 밀도를 결정하였다. 세포를 10분간 1500 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 FBS 중의 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO, 시그마)의 적절한 부피에 재현탁시키고, 1 ml/바이알로 분배하였다. 바이알을 서냉 챔버에서 -70℃에서 24시간 동안 보관하고 액체 질소에 보관하였다.
전혈을 FBS가 없는 상기 기술된 동일한 중량부의 저글루코오스 배지와 혼합하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. 35 ml의 전혈 혼합물을 45 ml 코니컬 튜브(Corning) 내로 8 ml의 Lympholyte Rabbit(Cedarlane) 위로 조심스럽게 올리고 실온에서 2500 rpm으로 30분간 정지없이 원심분리하였다. 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫(VWR)을 이용하여 PBMC 층을 조심스럽게 제거하고, 모아, 깨끗한 50 ml 바이알 안에 넣었다. 세포를 실온에서 1500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상기 기재된 변형 배지로 2회 세척하고, 트립판 블루 염색에 의해 세포 밀도를 결정하였다. 마지막 세척 후, 세포를 적절한 부피의 10% DMSO/FBS 배지에 재현탁시키고 상기에 기재된 바와 같이 냉동시켰다.
B 세포 선별, 농축( enrichment ) 및 배양 조건
B 세포 배양을 시작하는 날에, PBMC, 비장세포, 또는 림프절 바이알을 사용하기 위해 해동시켰다. 바이알을 LN2 탱크로부터 빼내 해동될 때까지 37℃ 수조에 두었다. 바이알의 내용물을 15 ml 코니컬 원심분리 튜브(Corning)로 옮기고, 상기 기재된 변형된 RPMI 10 ml을 튜브에 서서히 적가하였다. 세포를 2K RPM에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세포를 10 ml의 새로운 배지에 재현탁시켰다. 세포 밀도 및 생존력을 트립판 블루에 의해 결정하였다.
a) Ab1 및 Ab13 에 대해 하기 프로토콜을 사용하였다
세포를 하기와 같이 바이오티닐화된 인간 CGRPα와 미리 혼합하였다. 세포를 다시 세척하고 1E07 세포/80 μL 배지에 재현탁시켰다. 바이오티닐화된 인간 CGRPα를 5 ug/mL의 최종 농도로 세포 현탁액에 첨가하고 4℃에서 30분간 배양하였다. PBF[Ca/Mg 없는 PBS (Hyclone), 2 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 0.5% 소혈청 알부민(BSA) (시그마-바이오틴 없음)]를 이용한 2회 10 mL 세척을 수행하여 결합하지 않은 바이오티닐화된 인간 CGRPα를 제거하였다. 2회 세척 후, 세포를 1E07 세포/80 μl PBF로 재현탁시키고, 1E07 세포 당 20 μl의 MACS® 스트렙타비딘 비드(Miltenyi Biotech, Auburn CA)를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포 및 비드를 4℃에서 15분간 배양하고 1E07 세포 당 2 ml의 PBF로 1회 세척하였다.
b) Ab4 , Ab7 , Ab9 및 Ab11 에 대해 하기 프로토콜을 사용하였다:
바이오티닐화된 인간 CGRPα를 하기와 같이 스트렙타비딘 비드 상에 미리 로딩하였다. 75 μL의 스트렙타비딘 비드(Milteny Biotec, Auburn CA)를 N-말단에 바이오티닐화된 huCGRPα(최종 농도 10 ug/ml 최종 농도) 및 300 μl PBF와 혼합하였다. 이 혼합물을 4℃에서 30분간 배양하고 MACS® 분리 칼럼(Miltenyi Biotec, 결합하지 않은 물질을 제거하기 위해 1 ml 세척과 함께)을 이용하여 결합하지 않은 바이오티닐화된 인간 CGRPα를 제거하였다. 그리고 나서, 물질을 빼내, 이를 사용하여 1E7 세포 당 100 ul 중의 상기로부터 세포를 재현탁시킨 다음, 혼합물을 4℃에서 30분간 배양하고 10 ml의 PBF로 1회 세척하였다.
두 가지 a) 및 b) 프로토콜의 경우 하기를 적용하였다: 세척 후, 세포를 500μl의 PBF에 재현탁시키고 따로 두었다. MACS® MS 칼럼(Miltenyi Biotec, Auburn CA)을 자석 스탠드(Milteni) 상에서 500 ml의 PBF로 미리 세척하였다. 세포 현탁액을 프리-필터를 통해 상기 칼럼에 적용하고, 결합하지 않은 분획을 수집하였다. 칼럼을 2.5 ml의 PBF 완충액으로 세척하였다. 칼럼을 자석 스탠드로부터 제거하고 깨끗한 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브 위에 두었다. 1 ml의 PBF 완충액을 칼럼 위쪽에 첨가하고, 양성 선별된 세포를 수집하였다. 양성 세포 분획의 수율 및 생존율을 트립판 블루 염색에 의해 결정하였다. 양성 선별로 평균 1%의 출발 세포 농도를 얻었다.
배양을 위한 시딩 수준에 대한 정보를 제공하기 위해 파일럿 세포 스크린을 확립하였다. 플레이트에 10, 25, 50, 100, 또는 200 농축 B 세포/웰을 시딩하였다. 또한, 각 웰은 250 μl/웰의 최종 부피로 고글루코오스 변형 RPMI 배지 내에 50K 세포/웰의 조사된(irradiated) EL-4.B5 세포(5,000 Rads) 및 적절한 수준의 활성화된 토끼 T 세포 상청액(미국 출원 공개 제20070269868호)(제제에 따라 1 내지 5% 범위)을 함유하였다. 배양물을 4% CO2에서 37℃에서 5 내지 7일간 배양하였다.
항원-인식에 의한 B-세포 배양 스크리닝( ELISA )
항-인간 CGRPα 항체를 생산하는 웰을 확인하기 위해, 항원-인식에 의해 혈청 샘플의 역가를 결정하기 위해 기술된 동일한 프로토콜(ELISA)을 하기와 같이 변형하여 사용하였다. 요약하면, 뉴트라비딘 코팅된 플레이트를 두 가지 N- 및 C- 말단으로 바이오티닐화된 인간 CGRPα(50 μL/웰, 각각 1 μg/mL)의 혼합물로 코팅하였다. B-세포 상청액 샘플(50 μL)을 미리 희석하지 않고 시험하였다.
CGRP 주도의 cAMP 생산을 이용한 B-세포 상청액에서의 기능적 활성의 확인
B-세포 상청액에 함유된 기능적 활성을 결정하기 위해, 혈청 샘플의 기능적 역가를 결정하기 위해 기술된 것과 유사한 과정을 하기와 같이 변형하여 사용하였다. 요약하면, 희석된 폴리클로날 혈청 샘플 대신에 B-세포 상청액(20μL)을 사용하였다.
항원-특이적 B-세포의 분리
목적하는 웰을 함유하는 플레이트를 -70℃로부터 빼내고 웰 당 200 μL의 배지(10% RPMI 전체, 55 μM BME)로 5회 세척하여 각 웰로부터 세포를 회수하였다. 상기 회수된 세포를 원심분리에 의해 펠렛팅하고 상청액을 조심스레 제거하였다. 펠렛화된 세포를 100 μl의 배지에 재현탁시켰다. 항체 발현 세포를 확인하기 위해, 스트렙타비딘 코팅된 자석 비드(M280 dynabeads, Invitrogen)를 두 가지 N- 및 C- 말단으로 바이오티닐화된 인간 CGRPα의 조합으로 코팅하였다. 각각의 바이오티닐화된 인간 CGRPα 롯트를 연속 희석에 의해 최적화하였다. 그리고 나서, 대략 4x107 코팅된 비드를 함유하는 100 μl를 재현탁된 세포와 혼합하였다. 이 혼합물에, 배지 중에 1:100으로 희석된 15 μl의 염소 항-토끼 H&L IgG-FITC(Jackson Immunoresearch)를 첨가하였다.
20 μl의 세포/비드/항-토끼 H&L 현탁액을 제거하고 5 μl 소적을 슬라이드 당 총 35 내지 40개의 소적으로 Sigmacote(시그마)로 미리 처리된 1-웰 유리 슬라이드 상에 분배하였다. 파라핀 오일의 불투과성 방벽(JT Baker)을 사용하여 소적을 침지하고, 슬라이드를 어두운 곳에서 4% CO2 배양기에서 37℃에서 90분간 배양하였다.
항체를 생산하는 특이적 B 세포는 항체 분비에 의해 생산되는 주위의 형광 고리, 비드-결합된 바이오티닐화된 항원의 인식, 및 이후 형광-IgG 검출 시약에 의한 검출에 의해 확인될 수 있다. 목적하는 세포가 확인되면, 이를 마이크로매니퓰레이트(micromanipulator, Eppendorf)를 통해 회수하였다. 항체를 합성하고 내보내는 단일 세포를 마이크로원심분리 튜브 내로 옮기고, 드라이 아이스를 이용하여 동결한 후, -70℃에서 보관하였다.
항원-특이적 B 세포로부터의 항체 서열의 증폭 및 서열 결정
조합된 RT-PCR 기반의 방법을 이용하여 분리된 단일 B-세포로부터 항체 서열을 회수하였다. 제한 효소를 함유하는 프라이머를 설계하여 표적 면역글로불린 유전자, 예컨대 토끼 면역글로불린 서열의 보존 및 불변 영역(중쇄 및 경쇄)에서 어닐링하고, 2-단계 네스티드(nested) PCR 회수를 사용하여 상기 항체 서열을 증폭하였다. 각 웰로부터의 앰플리콘에 대해 회수 및 크기 온전성을 분석하였다. 그리고 나서, 얻어진 단편을 AluI으로 절단하여 서열 클론형성능을 분석하였다. 동일한 서열들은 이들의 전기영동 분석에서 공통된 단편화 패턴을 나타내었다. 그리고 나서, 원래의 중쇄 및 경쇄 앰플리콘 단편을 PCR 프라이머 내에 함유된 제한 효소 부위를 이용하여 절단하고 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 DNA 단편을 함유하는 벡터를 증폭하고 정제하였다. 발현에 앞서, 상기 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄의 서열을 확인하였다.
원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 모노클로날 항체의 재조합 생산
특이적 B-세포로부터 회수된 항체의 항원 특이성 및 기능적 특성을 결정하기 위해, 쌍으로 된 원하는 중쇄 및 경쇄 서열의 발현을 유도하는 벡터를 HEK-293 세포 내로 형질감염시켰다.
ELISA 에 의한 재조합 항체의 항원-인식
재조합 발현된 항체의 인간-CGRPα에 결합하는 능력을 규명하기 위해, 항체-함유 용액을 ELISA에 의해 시험하였다. 모든 배양은 실온에서 수행하였다. 요약하면, Immulon IV 플레이트(Thermo Scientific)를 CGRPα 함유 용액(PBS 중의 1 ut/mL)으로 2 시간 동안 코팅하였다. 그리고 나서, CGRPα-코팅된 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.05% 트윈-20)으로 3회 세척하였다. 그리고 나서, 상기 플레이트를 블로킹 용액(PBS, 0.5% 생선 피부 젤라틴, 0.05% Tween-20)을 이용하여 대략 1시간 동안 블로킹하였다. 그리고 나서, 상기 블로킹 용액을 제거한 다음, 플레이트를 일련의 희석된 시험 항체와 대략 1시간 동안 배양하였다. 이러한 배양 말기에, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 2차 항체 함유 용액(퍼옥시다아제 콘주게이트된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적 (Jackson Immunoresearch))으로 대략 45분간 추가 배양하고, 3회 세척하였다. 상기 시점에 기질액(TMB 퍼옥시다아제 기질, BioFx)을 첨가하고 어두운 곳에서 3 내지 5분간 배양하였다. HCl 함유 용액(0.5 M)을 첨가하여 반응을 중지시키고 플레이트를 플레이트-판독기에서 450 nm에서 판독하였다.
결과: 도 15-18은 항-CGRP 항체 Ab1-Ab14가 CGRPα에 결합하고 이를 인식함을 입증한다.
랫트에 대한 CGRP 주도의 세포내 cAMP 수준의 조절 및 교차 반응성의 조절에 의한 재조합 항체의 기능적 특성규명
cAMP 분석의 CGRPα 매개된 증가된 세포 수준을 억제하는 재조합 발현된 항체의 능력을 규명하기 위해, 전자화학발광 분석-키트(Meso Scale Discovery, MSD)를 사용하였다. 요약하면, 시험 항체 제제를 96 웰 둥근바닥 폴리스티렌 플레이트(Costar)에서 MSD 분석 완충액(Hepes, MgCl2, pH 7.3, 1 mg/mL blocker A, Meso Scale Discovery) 중에서 연속희석하였다. 이 플레이트에, MSD 분석 완충액에서 희석된 인간 CGRPα(최종 농도 25 ng/mL)를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 분석-키트 제조업체에 의해 제안된 바와 같은 적절한 대조군을 사용하였다. 인간 신경상피종 세포(SK-N-MC, ATCC)를 EDTA 용액(5 mM)을 이용하여 떼어내고 원심분리에 의해 성장 배지(MEM, 10% FBS, 항생제)를 이용하여 세척하였다. 세포 수를 분석 완충액 중에 200만 개의 세포/mL로 조정하고, cAMP 분석 플레이트에 세포를 로딩하기 바로 전에 IBMX(3-이소부틸-1메틸잔틴, 50 mM 시그마)를 0.2 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 항체 인간 CGRPα 용액을 1시간 동안 배양한 후, 세포를 함유하는 20 μl의 용액을 cAMP 분석 플레이트로 옮겼다. 시험된 모든 샘플을 적절한 대조군과 함께 2 반복하여 시행하였다. 10 μl의 세포를 웰에 첨가하고, 플레이트를 교반하면서 30분간 배양하였다. 세포가 CGRP 용액과 함께 배양되는 동안, 세포용해 완충액(MSD) 중의 TAG 표지된 cAMP(MSD)의 1:200 용액을 만들어 정지 용액을 준비하였다. 세포-CGRP 배양을 정지시키기 위해, 20 μl의 정지 용액을 세포에 첨가하고, 플레이트를 교반하면서 1시간 동안 배양하였다. 판독 완충액(MSD)을 물로 4회 희석하고 100 μl를 플레이트 상의 모든 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 플레이트를 Sector imager 2400(MSD)을 이용하여 판독하고, 데이타 맞춤(fit) 및 IC50 결정을 위해 프리즘 소프트웨어를 사용하였다.
인간 CGRPβ를 길항하는 재조합 항체의 능력을 시험하기 위해, CGRP 작용제(CGRPβ 10ng/mL 최종 농도)의 치환을 이용하여 유사한 분석을 수행하였다. 랫트 CGRP-매개된 cAMP 생성을 인식하고 억제하는 재조합 항체를 랫트 CGRP(최종 농도 5 ng/mL) 및 랫트 L6 세포주(ATCC)를 이용하여 평가하였다.
결과: 도 19-37은 항-CGRP 항체 Ab1-Ab14가 CGRPα, CGRPβ, 및 cAMP의 랫트 CGRP 매개된 증가된 세포 수준을 억제함을 입증한다.
실시예 2: Fab 단편의 효소적 생산
제조업체의 지침에 따라 고정화된 파파인(Thermo/Pierce)을 이용하여 파파인 절단을 수행하였다. 요약하면, 정제된 항체를 서서히 교반하면서 37℃에서 고정화된 파파인과 함께 시스테인/HCl-함유 완충액 중에서 배양하였다. 분취량을 취하고 SDS-PAGE를 이용하여 중쇄의 절단을 분석함으로써 절단을 관찰하였다. 반응을 정지시키기 위해, 고정화된 파파인을 회전시켜 제거하고 50 mM 트리스 pH 7.5을 이용하여 세척 및 여과하였다. 절단되지 않은 전장 항체 및 Fc 단편을 MabSelectSure (GE) 칼럼을 이용하여 제거하였다.
실시예 3: 효모 세포 발현
중쇄 및 경쇄용 피치아 패스토리스 발현 벡터의 제조.
인간화 경쇄 및 중쇄 단편을 상업적으로 합성하고 pGAP 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. pGAP 발현 벡터는 면역글로불린 사슬의 발현을 유도하는 GAP 프로모터 및 내보내기(export) 위한 인간 혈청 알부민(HSA) 리더 서열을 사용한다. 또한, 이 벡터는 박테리아 복제 기점, 및 피치아 패스토리스에서 항생제 G418에 대해 내성을 부여하는 1 카피의 카나마이신 내성 유전자와 같은 통상의 요소를 함유한다. G418은 게놈 내로 통합된 원하는 발현 벡터를 함유하는 균주를 선별하기 위한 수단을 제공한다.
피치아 패스토리스의 반수체 met1 및 lys3 숙주 균주 내로의 발현 벡터의 형질전환
반수체 피치아 패스토리스 균주의 형질전환 및 피치아 패스토리스 성 주기(sexual cycle)의 조작을 위해 사용된 모든 방법들은 피치아 프로토콜(Methods in Molecular Biology Higgings, DR, 및 Cregg, JM, Eds. 1998. Humana Press, Totowa, NJ)에 기술된 대로 수행하였다. 형질전환에 앞서, 각 벡터를 GAP 프로모터 서열 내에서 선형화하여 피치아 패스토리스 게놈의 GAP 프로모터 유전좌위 안으로 벡터의 통합을 유도하였다. 반수체 균주를 전기천공을 이용하여 형질감염시키고, 성공적인 형질전환체를 YPDS(효모 추출물, 소비털을 갖는 펩톤 덱스트로오스) G418 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 중쇄 및 경쇄 유전자의 카피수를 서던 블롯 분석에 의해 반수체 균주에 대해 결정하였다. 그리고 나서, 반수체 균주를 교배하고 이들을 아미노산 마커(즉, Lys 및 Met)의 부재시 성장하는 능력으로 선별하였다. 그리고 나서, 얻어진 2배체 클론을 최종적으로 서던 블롯하여 중쇄 및 경쇄 유전자의 카피수를 확인하였다. 발현을 관찰하는 바이오레이어 간섭법(biolayer interferometry) 단백질-A 바이오센서(Octet, ForteBio)를 이용하여 목적하는 항체를 발현하는 클론을 선택하였다.
실시예 4: 피치아 패스토리스에서 Ab3 , Ab6 및 Ab14 의 발현
전장 항체의 발현을 위해 3가지 피치아 균주를 제조하였다. 모든 전장 항체를 발현하는 균주의 경우, 반수체 균주를 만든 다음 교배시켰다. 하나의 반수체 군주는 전장 경쇄 서열을 발현하였고 또 다른 반수체 균주는 전장 중쇄 서열을 발현하였다. 각각의 2배체 균주를 연구 세포 은행(research cell bank)를 생성하는데 사용하였고 생물반응기에서의 발현을 위해 사용하였다.
먼저, 하기 영양소(%w/v)로 구성된 배지를 사용한 연구 세포 은행을 이용하여 접종물을 확장시켰다: 효모 추출물 3%, 무수 덱스트로오스 4%, YNB 1.34%, 바이오틴 0.004% 및 100 mM 인산칼륨. 발효조를 위한 접종물을 생성하기 위해, 상기 세포 은행을 30℃ 및 300 rpm에서 진탕 배양기에서 대략 24시간 동안 확장시켰다. 그리고 나서, 1 L 멸균 성장 배지를 함유하는 Labfors 2.5L 작업 부피 용기에 10% 접종물을 첨가하였다. 상기 성장 배지는 하기 영양소로 구성되었다: 황산칼륨 18.2 g/L, 제1인산암모늄 36.4 g/L, 제2인산칼륨 12.8 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3.72 g/L, 구연산나트륨 2수화물 10 g/L, 글리세롤 40 g/L, 효모 추출물 30 g/L, PTM1 미량 금속 4.35 mL/L, 및 거품억제제 204 1.67 mL/L. PTM1 미량 금속 용액은 하기 성분으로 구성되었다: 황산 제2구리 5수화물 6 g/L, 요오드화나트륨 0.08 g/L, 황산망간 수화물 3 g/L, 나트륨 몰리브데이트 2수화물 0.2 g/L, 붕산 0.02 g/L, 염화코발트 0.5 g/L, 염화아연 20 g/L, 황산 제1철 7수화물 65 g/L, 바이오틴 0.2 g/L, 및 황산 5 mL/L.
생물반응기 공정 제어 매개변수를 하기와 같이 설정하였다: 진탕 1000 rpm, 기류 분당 1.35 표준 리터, 온도 28℃ 및 pH를 수산화암모늄을 이용하여 6으로 제어하였다. 산소 보충을 제공하지 않았다.
용존 산소 급증으로 표시되는 바와 같이 초기 글리세롤이 소비될 때까지 발효 배양물을 대략 12 내지 16시간 동안 성장시켰다. 용존 산소 급증 후 대략 3시간 동안 배양물을 고갈시켰다. 이 고갈 기간 후, 에탄올의 볼러스 부가물(bolus addition)을 반응기에 첨가하여 1% 에탄올(w/v)에 도달하게 하였다. 발효 배양물을 15 내지 30분 동안 평형화하였다. 에탄올 볼러스 30분 후에 공급물 부가를 개시하고 이를 40분간 1 ml/분의 일정한 속도로 설정한 다음, 에탄올 센서에 의해 공급물 펌프를 제어하여 에탄올 감지 프로브(Raven Biotech)를 이용하여 나머지 작동을 위해 에탄올의 농도를 1%로 유지시켰다. 상기 공급물은 하기 성분으로 구성되었다: 효모 추출물 50 g/L, 덱스트로오스 500 g/L, 마그네슘 설페이트 헵타히드레이트 3 g/L, 및 PTM1 미량의 금속 12 mL/L. 전장 Ab6 및 Ab14의 발효를 위해, 구여산나트륨 2수화물(0.5 g/L)을 또한 상기 공급물에 첨가하였다. 총 발효 시간은 대략 90시간이었다.
실시예 5: 항체를 인간화하는 방법
항체를 인간화하는 방법이 발행된 미국 특허 제7935340호에 앞서 공개되었고, 상기 개시내용은 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있다. 일부 경우, 부가적인 토끼 프레임워크 잔기들이 활성을 유지하는데 필요한지 여부를 결정할 필요가 있다. 일부 경우, 인간화 항체는 친화도 또는 활성의 손실을 최소화하기 위해 여전히 일부 중요한 토끼 프레임워크 잔기가 유지될 필요가 있다. 이들 경우에, 원하는 활성을 갖기 위해, 인간 생식계열 서열로부터의 단일 또는 다중 프레임워크 아미노산을 다시 원래의 토끼 아미노산으로 변화시키는 것이 필요하다. 이들 변화는 토끼 잔기가 친화도 및 활성을 보존하는데 필요한지 여부를 확인하기 위해 실험적으로 결정된다. 이는 현재 가변 중쇄 및 경쇄 인간화 아미노산 서열의 말단이다.
실시예 6: 세포 수용체에 대한 CGRP 결합의 억제
CGRP 세포 수용체에 대한 CGRP 결합을 억제하는 재조합으로 발현된 항체의 능력을 규명하기 위해, 종래 기술된 바와 같이 방사성리간드-결합 분석을 수행하였다[Elshourbagy et al, Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al, Peptides, 16:421 (1995)]. 재조합 인간 CGRP 수용체, 칼시토닌 수용체-유사 수용체 및 RAMP1(Chemiscreen, Millipore)의 막 제제를 사용하였다. 항체 희석물을 125I 방사선표지된 인간 CGRPα(0.03 nM)와 실온에서 30분간 전배양하였다. 0.1 μM 인간 CGRPα의 존재하에 비-특이적 결합을 추정하였다. 막을 여과하고, 세척하였다. 그리고 나서, 필터를 계수하여 특이적으로 결합된 125I 방사선표지된 인간 CGRPα를 결정하였다.
결과: 도 38은 항-CGRP 항체 Ab1-Ab13이 그의 세포 수용체에 대한 CGRP 결합을 억제함을 입증한다.
실시예 7: 랫트에서 항- CGRP 항체에 의한 신경성 혈관확장의 억제
CGRP는 강력한 혈관확장제이다(Nature 313: 54-56 (1985) 및 Br J. Clin. Pharmacol. 26(6):691-5. (1988)). 비-침습적으로 CGRP 수용체 길항제 활성을 측정하는 약동학적 분석을 이용하여 항-CGRP 항체의 특성을 규명하였다. 상기 모델은 캡사이신 용액의 국소 적용 후 레이저 도플러 이미징을 이용하여 측정된 진피 혈류 변화에 의존한다. 캡사이신은 일시적인 수용체 잠재적 바닐로이드(vanilloid) 타입 1 수용체(TRPV-1)를 활성화시켜, CGRP 및 물질 P(substance P)를 포함하는 혈관활성 매개체의 국소적 방출을 통해 신경성 염증 및 혈관확장을 야기한다(Br. J. Pharmacol. 110: 772-776 (1993)).
혈관확장 분석 전날에, 동물에게 IP(복강내)를 통해 시험 제제 또는 대조군을 투여하였다. 투여 후, 동물의 등쪽의 아래 영역에서 대략 2x6cm의 면적으로 면도하고 털을 뽑았다. 그리고 나서 동물을 밤새 그들의 우리(cage)로 되돌려 보냈다. 시험 당일, 투여 약 24시간 후에, 동물을 이소플루란 가스로 마취하고 온도 제어 전기 이불 위에 두고 이소플루란의 연속적 전달을 위한 노즈 콘(nose cone)을 장착하였다. 혈관확장의 관찰을 위해 레이저 도플러 영상기를 사용하였다. 633 nm 헬륨-네온 레이저에 의해 생성된 간섭성 적색 빛의 빔을 상기 면도된 직사각형 영역(2x6cm)에 겨냥하고, 중간 해상도 모드에서 스캔하였다. 먼저 기준선 도플러 스캔을 얻고 2개의 유사한 저 유동(low flux) 면적을 확인함으로써 O-링 배치의 위치를 미리 결정하였다. 2개의 고무 O-링(직경 ~1 cm)을 선택된 영역에 두고 기준선 스캔을 수행하였다. 스캔 완료 후 곧바로, 5 μL의 에탄올:아세톤 용액(1:1) 중의 1 mg의 캡사이신을 두 개의 O-고리 각각의 안에 적용하였다. 캡사이신 적용 후 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5, 25, 27.5 및 30분에 도플러 스캔을 반복하였다. 각각의 2개의 O-링 각각의 안에서의 기준선 평균 유동으로부터의 백분율 변화를 캡사이신으로 인한 혈관확장의 결과로서 도시하였다.
세포 수용체에 대한 CGRP 결합을 억제하는 재조합으로 발현된 항체의 능력을 시험하기 위해, 종래 기술된 대로 방사성리간드-결합 분석을 수행하였다.
결과: 도 39 및 40은 항-CGRP 항체 Ab3 및 Ab6이 캡사이신 투여 후 이 모델에서 혈관확장을 감소시켰음을 입증한다.
실시예 8: 과민성 방광에 대한 CGRP 항체 투여의 효과
방광 자제(bladder continence) 및 과민성 방광에 대한 항-CGRP 항체 투여의 잠재적 효능을 평가하는 시험을 수행하였다. 방광 자제는 요도 폐쇄 및 배뇨근 활동 사이의 균형상태이며, 과민성 방광은 요절박(urgency), 요실금(urinary incontinence), 빈뇨(frequency) 및 아뇨증(nocturia)을 특징으로 하는 질환이다. 문헌에서 보고된 일부 입증되지 않은 증거는 CGRP가 방광 자제와 관련되며 과민성 방광 질환과 상관관계가 있거나 아마도 과민성 방광 질환에서 원인적 역할을 할 수 있음을 제시한다. 따라서, 본 발명의 항-CGRP 항체가, 특히 이들의 CGRP에 대한 높은 친화도를 고려해 볼 때, 이러한 이따금의 쇠약해지는 상태를 잠재적으로 예방하거나 완화할 것이라 희망했었다(CGRP가 과민성 방광에서 역할을 할 수 있다는 증거는 CGRP가 요로, DRG 및 척수에 존재한다는 사실을 포함한다(Wharton 등, 1986 Neurosci (3):727). 또한, C 구심성 신경섬유는 배뇨와 관련된 자극을 척수로 전달하는데 중요하며(Yoshida 등, 2011 J Pharmacol Sci (112):128), 이들 섬유는 CGRP에 의해 영향받는다. 또한, 보톡스의 방광내 투여가 CGRP를 억제하고 아세트산 유도된 방광 통증 모델에서 상호수축 간격을 유의하게 감소시킨다고 보고되었다(Chuang 등, 2004 J Urol (172):1529; Chuang 등, 2009 J Urol (182):786)). 더욱이, 최근에는 항-CGRP 항체의 투여가 알려진 대로 테레빈-오일-유도된 과민성 방광 모델에서 방광 수축 횟수를 감소시킨다고 보고되었다(화이자 PCT 출원 제WO 2011/024113호).
물질 및 방법
동물:
여성 스프래그-다우리 랫트(247-299 g; Charles River Laboratories, Saint Germain sur l'Arbresle, France)를 실험실 조건에 적응시키기 위해 적어도 실험 5일 전에 실험실로 이동시켰다. 이들을 우리(폴리프로필렌 타입 E 우리 크기: 1032 cm2) 당 3마리씩 사육하고 음식(Teklad 2016 global rodents, Harlan, 03800 Gannat, France)을 제공하고 물을 임의로 섭취하게 하였다. 설치류 우리를 위한 톱밥(Souralit 2912 plus, Souralit, 17080 Girona, Spain) 침구를 매주 2회씩 교체하였다. 12/12시간으로 교대되는 밤낮 주기(명 위상(light phase) 오전 7시:오후 7시)와 함께 동물 방 온도(20±2℃)를 유지시키고, 상대 습도를 40-70%로 유지시켰다.
실험실 장비
방광 카테터를 T-튜브를 통해 스트레인 게이지(strain gauge) MX 860 Novatrans III Gold(Medex Medical SARL, Nantes-Carquefou, France) 및 주사기 펌프(70-2208 Model II plus, Harvard Apparatus, Les Ullis, France 및 Razel R-99E, Fisher Bioblock, Illkirch, France)에 연결하였다. PC 상에서 작동하는 파워랩 인터페이스(PowerLab interface; ADInstruments Pty Ltd, Castle-Hill, Australia) 및 차트(Chart®) 소프트웨어를 이용하여 방광내 압력을 지속적으로 기록하였다. 데이타를 마이크로소프트 Excel® 소프트웨어로 분석하였다.
시험 물질
시험 항-CGRP 항체(Ab3)
음성 대조군 항체 (항-digi독소 항체).
화학 시약
생리적 식염수(NaCl 0.9%)(배치 번호 11043411, CAS 번호 7647-14-5)를 센트라베트(Centravet; Lapalisse, France)을 통해 B-Braun으로부터 구입하였다.
마취 물질
우레탄(배치 번호 BCBC9294, CAS 번호 51-79-6) 및 소디움 펜토바르비탈(배치 번호 150A1, CAS 번호 76-74-4)를 각각 시그마-알드리치(St Quentin Fallavier, France) 및 Centravet(Lapalisse, France)으로부터 제공받았다.
실험군
10마리 랫트의 2개의 실험군을 실험에 사용하였다. 각 군에게 10 mk/kg의 대조군 또는 항-CGRP 항체 중 하나를 투여하였다:
연구 설계
실험 절차
암컷 랫트에게 꼬리 정맥 주사를 이용하여 실험 18시간 전에 10 mg/kg의 용량으로 시험 항체 또는 음성 대조군 항체를 정맥내로 투여하였다. 15시간 후, 랫트를 우레탄(1.2 g/kg, 피하(s.c.))으로 마취시켰다. 우레탄 피하 투여 3시간 후, 폴리에틸렌 카테터(각각 0.58 및 0.96 mm의 내부 및 외부 직)를 돔(dome)을 통해 방광내로 삽입하고 쌈지 봉합(purse-string suture)으로 고정시켰다. 체온을 실험 내내 37±2℃(TCAT-2LV controller, Physitemp, ADInstruments Pty Ltd., Casttle Hill, Australia)로 유지시켰다.
방광내압측정 실험
수술 후 마취된 암컷 랫트에서 방광내압측정 조사를 수행하였다. 실온의 생리적 식염수를 적어도 30분 동안 일정한 유속(2 mL/h)으로 방광 내로 지속적으로 주입하였다.
방광내압측정 실험의 말기에, 소디움 펜토바르비탈(54.7 mg/mL)(CAS 번호76-74-4)의 치사 주사(1 mL)에 의해 동물을 희생시킨 다음, 자궁경부 탈구를 수행하였다.
방광내압측정 매개변수
측정된 방광내압측정 매개변수는 다음과 같다:
배뇨(AM)의 진폭, 즉 배뇨의 역치 압력 및 최대 압력 사이의 압력(mmHg),
상호수축 간격(ICI), 즉 2개의 차후의 배뇨 사이의 시간(초),
배뇨 빈도(MF), 즉 배뇨 수축의 수/15 분(피크/15 분).
배제 기준
실험 동안 2마리의 랫트를 배제시켰다: 한 마리는 식염수 방광내 주입 동안 방광 과다반응을 겪어 배제하였고, 다른 한 마리는 방광내압측정 프로파일의 변형을 유도하는 실험 동안 마취 심도가 바뀌어 배제하였다.
결과의 분석
각각의 랫트에 대하여, 식염수 주입 동안 마지막 4번 또는 5번 배뇨의 평균으로써 AM 및 ICI 값을 계산하였다. MF 값은 식염수 주입 동안 15분의 두 간격 동안 수득된 배뇨의 평균으로써 계산하였다.
결과가 평균 값 ± 평균 표준 오차(± sem)로 제시되어 있다. 수치 및 통계 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism®; 버전 4; Version 4; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 이용하여 수행하였다.
항-CGRP 항체군 대 대조 항체군에서의 값(식염수 주입)을 비모수 스튜던트 t-검정을 이용하여 통계적으로 비교하였다.
p<0.05가 통계학적으로 유의한 것으로 받아들여졌다.
결과:
도 41에 나타난 바와 같이, ICI는 항-CGRP Ab-처리군에서 유의하게 더 컸고, MF는 유의하게 더 낮았다(도 41A 및 B 각각; p<0.05, 비모수 스튜던트 t-검정). AM의 경우 그룹들 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 41C, p>0.05, 비모수 스튜던트 t-검정).
이들 결과는 항-CGRP 항체가 과민성 방광을 예방하거나 완화시켜 소변 continency 및 관련된 소변 질환의 치료를 개선하는데 유용할 수 있음을 제시한다.
실시예 9: 랫트에서의 신경병성 통증의 완화
말초 신경의 손상은 기원이 신경병성인 만성 연관 통증을 종종 야기한다. 이러한 통증 증후군은 정상적으로는 유해하지 않은 외부 자극(예컨대, 기계적 및/또는 열적 자극)에 대한 민감도로 이루어진다. 결과적으로, 신경병성 통증은 전통적 진통제 접근법에 대해 난치여서, 이를 치료하기 어렵다. 실험적으로, 신경병성 통증은 말초 신경에 대한 수술 외상을 통해 동물에서 모델화될 수 있다. 정(Chung) 모델은 L5 및 L6의 척수 신경의 결찰에 의해 신경병성 통증이 유도되는 한 가지 상기 시스템이다.
본 실시예에서는, 수컷 스프래그 다우리 랫트에 척수 신경 결찰을 수행하였다. 가능한 항-이질통증 활성을 평가하기 위해, 기계적 이질통증의 본 프레이(von Frey) 시험을 이용하여 랫트에 대해 13일에(이질통증 확인) 그리고 Ab2의 각각의 투여 이후에 다시 통증 민감도를 시험하였다.
방법
도착시 체중이 200-225g인 수컷 스프래그 다우리 랫트(Harlan Laboratories)를 꺼내어 우리 안에 넣었다. 각 동물에 대해 털, 사지 및 구멍의 평가를 포함한 시각에 의한 건강 검사를 수행하였다. 또한, 각 동물에 대해 자세 또는 움직임에 있어서 어떤 비정상 징후를 조사하였다. 모든 동물은 좋은 건강 상태로 확인되어 연구되었다.
도착 다음날 수집된 체중을 무작위 추출하는 것을 제외하고, 랫트를 실험 과정의 개시 전 최소 2일간 적응시켰다. 동물을 투명한 폴리카보네이트의 종래 우리 또는 인증된 방사선이 조사된 접촉 침구를 갖는 투명한 폴리카보네이트 미세격리기(microisolator) 우리에서 개별적으로 사육하였다. 음식 및 물은 임의로 제공하였다. 환경 조건들은 30% 내지 70%의 상대 습도를 갖는 18 내지 26℃(64 내지 79℉)의 온도를 유지하도록 설정하였다. 12:12시간 명:암 주기를 유지하였다.
랫트에 대해 적응 -4일 또는 -1일에 본 프레이(von Frey) 필라멘트를 이용하여 기준선 역치를 시험하였다.
0일에, 동물에 척수 신경 결찰 절차를 수행하였다. 모든 수술은 무균 조건 하에서 수행하였다. 수술에 앞서, 랫트를 마취시켰다. 등 부위를 면도하여 무균 수술을 준비하였다. 랫트를 복와위(ventral recumbence)로 두고 L4-S2 영역의 정중선의 바로 왼쪽을 절개하였다. 좌측 척추인접 근육을 가시 돌기(spinous process)(L4-S2)로부터 분리하였다. L6-S1 후관절을 집고 L4 & L5 척수 신경에 접근하기 위한 공간을 제공하기 위해 횡돌기(transverse process)를 부드럽게 잘라내었다. 좌측 L5 및 L6 척수 신경을 분리하고 6.0 견봉합사로 결찰시켰다. 그리고 나서, 상기 절개를 적절한 봉합사 물질 및 피부 상처 클립으로 닫았다. 수술 후, 동물에게 피하 주사를 통해 유산 링거액(3.0-5.0 mL)을 투여하였다.
그룹 1 및 2의 모든 동물들에게 -4 또는 -1, 13, 14, 및 17일에 본 프레이 시험을 수행하였다. 13일째의 측정은 예비투여(pre-dose)로 여겨졌다. 기계적 이질통증을 위한 본 프레이 시험은 진통제 화합물의 항-침해수용성(anti-nociceptive) 특성을 평가한다. 이 시험에서, 동물들이 평가될 통증 역치에 충분히 차분하도록 동물들을 일차로 시험 챔버에 길들였다. 치료군을 알지 못하는 기술자가 직경이 증가하는 일련의 단계별 나일론 필라멘트(본 프레이 필라멘트)를 이용하여 랫트의 왼쪽 뒷발에 가벼운 압력을 가하였다. 필라멘트는 동물들이 굽힐 때까지 발의 배쪽 표면(ventral surface)에 대해 수직으로 가해졌다. 고통스럽다고 여겨질 때, 랫트는 발을 빼 반응한다. 심리물리학적 척도의 시험을 이용하여 각 랫트에 대해 후퇴에 대한 정확한 힘을 제공하는, 차플란 업-다운(Chaplan up-down) 방법(Chaplan 등, J Neurosci Methods, 53:55-63, 1994)을 이용하여 역치 이질통증을 결정하였다.
13일에 동물들을 본 프레이 점수에 기초하여 두 치료군으로 할당하였다. 6g을 초과하는 본 프레이 점수를 갖는 동물들은 연구에서 제외하였다. 평균 값 및 표준 편차가 동질성의 추정을 만족시켰음을 보증하기 위해 각 군에 대한 평균 본 프레이 점수를 검토하였다. 그룹 1(Ab2) 및 그룹 2(음성 대조군 항체)의 경우 13일째(수술 후 13일)에 IP 주사에 의해 복용량을 1회 투여하였다(각 군 내에 11마리의 동물; Ab2 및 음성 대조군 항체는 10 mg/kg으로 투여됨). 그룹 1에는 거동 시험 전 17일에 Ab2의 부가적인 IV 볼러스(마취되지 않음)를 투여하였다.
그룹 1에 대해 17일에 혈장용 혈액 샘플을 채취하고 Ab2 역가를 분석하였다.
예상된 수술 부위 관찰 및 정(Chung) 수술과 연관된 발 끌기 외에, 어떠한 비정상인 관찰도 보고되지 않았다. 처리는 전체 동물 건강에 악영향을 미치지 않았거나 이 연령의 동물에서 예측되는 정상적인 체중 증가를 방해하지도 않았다.
결과
0일째 수술에 앞서 기준선 시험을 겪은 모든 동물들은 정상 민감도를 가리키는 154의 본 프레이 점수(도시되지 않음)를 가지고 있었다. 13일(항체 투여 전)에, 연구에서 배제된 2마리의 동물을 제외하고, 모든 동물들은 6 g보다 낮은 본 프레이 점수를 가지고 있었고, 이는 외부의 기계적 자극에 대한 민감도가 생성되었음을 가리킨다. 13일에 평균 본 프레이 점수는 3 g 미만이었다(도 42, 좌측 그룹의 막대). 시험 후 13일째에, 동물에게 Ab2 또는 음성 대조군 항체(10 mg/kg)를 투여하였다. 14일 및 17일에, 본 프레이 점수를 다시 시험하였고, 이는 대조군보다 Ab2-처리된 동물에서 더 높았다(도 42, 각각 중간 그룹의 막대 및 우측 그룹의 막대).
이들 결과는 항-CGRP 항체, 예컨대 Ab2 처리가 신경병성 통증을 예방하거나 완화하는데 도움을 줄 수 있음을 가리킨다.
실시예 10: 진통에 대한 항- CGRP 항체 투여의 효과를 평가하는 일차 실험(꼬리 튕기기 모델)
진통 또는 통증에 대한 항-CGRP 항체 투여의 잠재적 효능을 평가하기 위해 3가지 상이한 실험(실시예 10-12)을 수행하였다. 이들 모든 실험에서 설치류 꼬리 튕기기(꼬리 회수로도 지칭됨) 반응 모델이 사용되었는데, 복사열에 대한 설치류 꼬리 튕기기 반응이 잠재적으로 유용한 진통제를 발견하는데 통상적으로 사용된 모델이기 때문이다. 이 분석은 중추작용성 모르핀-유사 진통제(활성) 및 비-오피오이드 또는 말초성 항염증제(불활성)를 구별하는데 특히 유용하다. 이 동물 모델 및 본원에 사용된 방법 및 물질들이 하기에 기술되어 있다.
물질 및 방법
동물: 150 ± 20 g 체중의 수컷 스프래그 다우리 유래의 수컷 랫트.
시험 CGRP 항체: Ab2
비히클 : 15 mM 히스티딘 250 mM 소르비톨, pH 5.5
진통제 화합물: 모르핀
꼬리 튕기기 반응 절차: 체중 150±20 g의 10마리의 스프래그 다우리 유래의 수컷 랫트의 그룹에서 통증 역치로서, 집중된 복사열에 의해 유도된 꼬리 튕기기 반응을 유발하는데 필요한 시간(초)을 측정하였다. 꼬리 튕기기 반응에 대한 기준선 시험을 0일에 수행하였다. 3-5 초의 꼬리 튕기기 반응을 갖는 랫트를 연구에 포함시켰고 기준선 꼬리 튕기기 반응에 기초하여 균형잡힌 치료군으로 할당하였다. 15초 컷(cut)을 사용하여 조직 손상을 피하였다.
모르핀 내성의 발달
10마리의 수컷 스프래그 다우리 랫트의 세 그룹 각각에게 아침 및 저녁에 식염수 비히클(2 ml/kg)을 i.p. 투여를 통해 매일 2회 투여하였다. 세 그룹 중 한 그룹에게는 7일 연속 매일 2회 5 mg/kg 용량으로 진통제(모르핀)를 복강내로 더 투여하였다. 세 그룹 중 두 번째 그룹에게는 0일에 단일 볼러스로서 10 mg/kg의 용량으로 본 발명에 따른 항-CGRP 항체(Ab2)를 복강내로 투여하였다. 그리고 나서, 상이한 그룹 내의 랫트들에 대해 아침 투여 후 30분에 매일 1회 꼬리 튕기기 반응을 시험하였다.
비히클 대조군 및 시험-화합물 처리군 간의 비교를 위해, 원-웨이 ANOVA를 적용한 다음 던넷 t-검정을 적용한다. P<0.05가 유의한 것으로 간주된다.
이들 실험 결과가 도 43에 나타나 있다. 상기 결과는 시험 CGRP 항체가 10 mg/kg으로 투여될 때 열 통증 자극에 대한 현저히 오래 지속되는 진통 효과를 유발하였음을 보여준다. 시험된 모든 랫트로부터 심장 천자를 통해 최종 혈액 샘플을 채취하고 추후 Ab2 역가를 분석하였다.
실시예 11: 진통에 대한 항- CGRP 항체의 효과를 평가하는 2차 꼬리 튕기기 실험)(항체 용량 적정)
본 발명에 따른 항-CGRP 항체(Ab2)를 이용하여 진통에 대한 상이한 항-CGRP 항체 용량의 효과를 평가하기 위해, 두 번째 세트의 꼬리 튕기기 실험을 수행하였다. 이들 실험에 사용된 랫트들은 앞선 실험에서와 마찬가지의 동일한 타입이며, 꼬리 튕기기 프로토콜도 실질적으로 동일하다. 이 실험에서, 용량이 진통에 효과가 있는지 여부를 평가하기 위해, 상이한 항-CGRP 항체 용량을 투여한 상이한 그룹의 동물에서 진통을 비교하였다. 두 번째 세트의 실험에서, 다섯 그룹의 시험 동물들을 하기와 같이 비교하였다. 첫 번째 대조군 그룹의 동물에게는 비히클 단독(15 mM 히스티딘 250 mM 소르비톨, pH 5.5)을 각각 투여하였고, 세 그룹의 동물에게는 비히클 중의 동일한 항-CGRP 항체를 상이한 용량으로(Ab2, 0일에 각각 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 용량으로 투여됨) 투여하였으며, 5번째 그룹의 동물에게는 또한 0일에 10 mg/kg의 음성 대조군 항체(항-디기톡신 항체)를 투여하였다.
꼬리 튕기기 프로토콜은 상기 기술된 것과 실질적으로 동일하였다. 비히클 대조군, 음성 대조군 항체 및 시험-CGRP 항체 처리군 간의 비교를 위해, 원-웨이 ANOVA에 이어 던넷 t-검정을 이용하여 결과를 다시 평가하였다. P<0.05가 유의한 것으로 간주된다.
이들 실험 결과가 도 44에 나타나 있다. 상기로부터 더 높은 항체 용량의 시험 화합물(본 발명의 Ab2 항-CGRP 항체)이 낮은 용량보다 더 우수한 진통 효과를 유발하였음이 확인될 수 있다. 예상된 바와 같이, 음성 대조군 항체는 대조군과 비교하여 진통에 대해 인지가능한 효과를 유발하지 못하였다.
실시예 12: 진통에 대한 항- CGRP 항체/모르핀 공동-투여의 효과를 평가하는 3차 꼬리 튕기기 실험
진통에 대한 항-CGRP 항체/모르핀 병용-투여의 효과를 평가하기 위해, 세 번째 세트의 꼬리 튕기기 실험을 또한 수행하였다. 이들 실험에서, 첫 번째 그룹의 동물들에게는 동일한 비히클 단독을 5 ml/kg의 용량으로 투여하였다. 두 번째 그룹의 동물에게는 1-10일에 5 mg/kg의 용량으로 매일 2회 모르핀을 투여하였고, 여기에서 상기 동물들에게는 0일째에 10 mg/kg의 용량으로 항-CGRP 항체 Ab2를 투여하였다. 세 번째 그룹의 동물에게는 1-4일만에 다시 매일 2회 5 mg/kg의 용량 농도로 모르핀을 투여하고, 0일에 Ab2 항체를 10 mg/kg의 용량으로 추가 투여하였다. 모든 투여는 복강내였다.
0-10일로부터 매일 이들 그룹의 동물 각각에 꼬리 튕기기 실험을 수행하였다. 비히클 대조군, 음성 대조군 항체 및 시험 항-CGRP 항체 처리군 간의 비교를 위해 원-웨이 ANOVA에 이어 던넷 t-검정을 이용하여 이들 꼬리 튕기기 실험의 결과를 다시 평가하였다. P<0.05가 유의한 것으로 간주된다.
이들 비교 결과가 도 45에 요약되어 있다. 실험 내내 일일 용량의 모르핀을 받은 Ab2-처리된 동물들은 모르핀 내성을 나타내었고, 5일 후 꼬리 튕기기 시간이 비히클-처리된 대조군 동물의 수준 정도로 감소하였다. 반면, 4일까지 모르핀만을 받은 Ab2-처리된 동물에서는, 꼬리 튕기기 시간이 5일째에 개선되었고 8일까지 개선된 상태를 유지하였다. 상기 결과는 항-CGRP 항체의 투여가 모르핀 내성의 개시 이후에도 진통 효과를 나타내며, 이는 모르핀의 회수시 더 확연할 수 있음을 제시한다.
실시예 13: 랫트에서의 내장 통증의 완화
과민성 장 증후군(IBS)으로부터 고통받는 환자는 결장 풍선 팽창에 대해 더 낮은 내장 감각 역치를 보여준다(Ritchie, Gut, 1973, 14:125-32). 정상적인 활성화 패턴과 함께, 뇌-장 축의 통증 민감도가 높아진다는 것이 IBS에서 제시되었다. 근위 결장 내로의 트리니트로벤젠설폰산(TNBS)의 주사가 만성 결장 과민증을 유발하였음이 종래에 밝혀졌으며, 이는 결장 팽창에 대한 반응으로 감소된 통증 역치에 의해 의식있는 랫트에서 측정된다(Diop 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002, 302:1013-22). 이러한 만성 과민증은 염증이 생기지 않은 말단 결장에서 발견되었고 21일간 지속되었다. 이는 IBS의 일부 특성과 유사하며, 따라서 이는 이 장애의 병리생리학적 측면을 실험적으로 분석하는 모델로서 사용될 수 있다. 이러한 분석은 TNBS-유도된 결장 과민증에 대한 화합물의 잠재적 항과민증 효과를 결정하는데 사용된다.
몇 가지 연구들은 CGRP가 내장 통증의 원임임을 보여주었다(Friese 등, Regul Pept 1997;70:1-7; Gschossmann 등, Neurogastroenterol Motil 2001;13:229-36; Julia 및 Bueno, Am J Physiol 1997;272:G141-6; Plourde 등, Am J Physiol 1997;273:G191-6). CGRP는 위장 기원의 캡사이신 민감성 구심성 섬유의 가장 풍부한 펩타이드로서, 전체 펩타이드 면역반응성의 최대 80%를 차지한다(Clague 등, Neurosci Lett 1985;56:63-8; Sternini 등, Gastroenterology 1987;93:852-62). 또한, CGRP 주사는 TNBS 모델에서의 결장 과민증을 유도하고(Delafoy 등, 2006, Gut 55:940-5), 이는 CGRP 길항제 펩타이드(CGRP 8-37)에 의해 뒤바뀐다.
본 실시예는 랫트에서 내장 통증(TNBS-유도된 만성 결장 과민증)의 모델에서 항-CGRP 항체의 시험을 기술한다.
방법
수술 당일 체중이 390 내지 450 g의 수컷 스프래그-다우리 랫트를 이 연구에 포함시켰다. 이들을 12시간-명/암 주기를 갖는, 온도(19.5℃-24.5℃) 및 상대 습도(45%-65%)가 조절되는 방에서 사육하였다. 동물을 우리당 2 또는 3마리씩 사육하였고 시험 전 적응 기간(적어도 5 일)이 준수되었다. 각각의 랫트는 꼬리 표시에 의해 식별되었다. 상기 연구는 I.A.S.P의 연구 및 윤리 사안 위원회의 가이드라인(1983) 및 유럽 가이드라인 2010/63/UE에 따라 수행되었다.
거동 시험 7일 전 트리니트로벤젠설폰산(TNBS, 50 mg/kg)을 수술적으로 투여하여 결장 민감증을 유도하였다. 단식한(24시간) 동물을 수술하였다. 요약하면, 마취(아세프로마진 5 mg/kg / 케타민 30 mg/kg) 하에, TNBS(50 mg/kg, 1 ml/kg)를 결장의 근위 부분(맹장으로부터 1 cm)에 주사하였다. 수술 후, 동물을 조절된 환경 내의 우리로 돌려보내고, 7일 후 시험일 때까지 임의로 섭취하게 하였다. "비처리(naive)" 동물(수술하지 않은 랫트)를 동일한 사육 조건에 두었다.
결장 역치를 결정하기 24시간 전에 동물에게 정맥내로 항-CGRP 항체 Ab2 또는 음성 대조군 항체(모두 10 mg/kg)를 투여하였다. 세 그룹의 랫트를 이 연구에 포함시켰다:
그룹 1: "비처리" 그룹은 D-7에 수술 또는 TNBS 처리를 겪지 않은 동물들로 구성되었고, 시험(즉, D0에 결장 팽창 역치의 측정) 24시간 전(즉 D-1) 대조군 항체로 처리하였다(n=7).
그룹 2: "TNBS" 그룹은 D-7에 수술을 경험하지 않은 동물들로 구성되었고, 대조군 항체로 처리하였다(시험(즉, D0에 결장 팽창 역치의 측정) 24시간 전) (n=8).
그룹 3: "처리된" 그룹은 D-7에 수술을 경험한 동물들로 구성되었고, 시험일(즉, D0에 결장 팽창 역치의 측정) 24시간 전(즉 D-1) Ab2로 처리하였다 (n=8).
TNBS 주사 7일(D7) 후, 결장에 도입된 풍선의 팽창으로 인해 결장 팽창 동안 거동 반응을 유도하는데 필요한 결장내 압력을 측정함으로써 결장 민감도를 평가하였다. 상기 시험은 맹검 실험자에 의해 수행되었다. 이 반응은 동물 몸의 뒷 부분의 상승 및 심각한 수축(Al Chaer 등, Gastroenterology 2000, 119:1276-1285)에 대응하고 통증 마커(Bourdu 등, Gastroenterology. 2005:128, 1996-2008)로 사용된 명확히 가시적인 복부 수축을 특징으로 한다. 풍선(5 cm)을 단식한(24h) 간호 동물의 항문으로부터 10 cm에 최소한의 침습적 방법으로 직장내로 삽입하고, 카테터를 꼬리의 아래에 테이프로 붙였다. 그리고 나서, 랫트를 플렉시글라스(plexiglass) 상자 가운데에 두고 카테터를 전자 바로스탯(barostat) 장치에 연결하였다. 삽입된 풍선과 함께 30분 적응 기간 후, 통증 거동이 입증될 때까지 5 내지 75 mmHg(컷오프)까지 30초마다 5 mm Hg 단계로 결장 압력을 서서히 증가시켰다. 풍선 삽입 후, 30분, 50분, 70분 및 90분에 4가지를 결정하였다.
각 시험으로부터 얻은 데이타를 이용하여, TNBS의 결장내 투여에 의해 유도된 결장 과민증에 대한 활성의 백분율을 하기와 같이 계산하였다.
(활성 백분율)처리된 = (팽창 역치 처리된 - 팽창 역치TNBS) ÷ (팽창 역치Naive - 팽창 역치T N BS) × 100
팽창 역치 처리된 는 "처리된" 그룹에 대한 값의 산술적 평균이고; 팽창 역치TNBS는 "TNBS" 그룹에 대한 값의 산술적 평균이며; 팽창 역치Naive는 "비처리(Naive)" 그룹에 대한 값의 산술적 평균이다.
결과
내장 통증을 완화시키는 항-CGRP 항체의 능력을, TNBS의 투여에 의해 만성 결장 과민증이 유도된 랫트 모델에서 시험하였다. 결장 팽창 역치, 즉, 동물이 거동 반응(근육 수축)을 나타내기 전에 견딜 수 있는 복부 압력의 양을 측정함으로써 내장 통증을 정량화하였다. 더 높은 결장 팽창 역치 값은 더 낮은 민감도를 가리킨다. 예상대로, TNBS 처리는 비처리 동물과 비교하여 크게 감소된 결장 팽창 역치를 야기하였다(도 46, 중간 막대(TNBS 처리됨) 및 좌측 막대(비처리)를 비교). Ab2 투여는 대조군 동물과 비교하여 결장 팽창 역치를 개선하였다(도 46, 우측 막대(Ab2 처리됨) 및 중간 막대(대조군)를 비교). Ab2 투여로부터의 개선은 통계학적으로 유의하였다(p < 0.05 스튜던트 t-검정, TNBS + 음성 대조군 그룹에 대한 비교). Ab2의 항과민증 활성은 27%(TNBS-유도된 과민증의 완화 정도를 가리킴)로 계산되었다.
이들 결과는 항-CGRP 항체가 내장 통증을 예방하거나 완화하는데 유용할 수 있음을 제시한다.
SEQUENCE LISTING <110> KOVACEVICH, BRIAN ROBERT GARCIA-MARTINEZ, LEON F. OLSON, KATIE DUTZAR, BENJAMIN H. BILLGREN, JENS J. LATHAM, JOHN A. MITCHELL, DANIELLE M. MCNEILL, PATRICIA DIANNE JANSON, NICOLE M. LOOMIS, MARIA-CRISTINA <120> ANTI-CGRP COMPOSITIONS AND USE THEREOF <130> 67858.730302 <150> 61/488,660 <151> 2011-05-20 <160> 284 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Ser 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ser 85 90 95 Ser Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 Arg <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val 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Oryctolagus cuniculus <400> 29 Val Ile Gly Ile Asn Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 30 <211> 3 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 30 Gly Asp Ile 1 <210> 31 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Ser 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Thr 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asn Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Thr 85 90 95 Asn Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 Arg <210> 32 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Ser 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Arg 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ser 85 90 95 Arg Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 Arg <210> 82 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Ser 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Arg 50 55 60 Gly Ser 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Synthetic polypeptide <400> 92 Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Asn Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ser 85 90 95 Arg Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 111 Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Tyr Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ser 85 90 95 Asn Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 112 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 112 Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Tyr Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 122 Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Ala Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Arg Ser Asp 85 90 95 Ser Val Asp Gly Val Ala Phe Ala Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 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cgacctggag 240 tgtgccgatg ctgccactta ctactgtcta ggcagttatg attgtagtag tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 143 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 143 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggactcga cctcagtagc tactacatgc aatgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggagtcatt ggtattaatg ataacacata ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaga gcctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatg 240 accagtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagggga catctggggc 300 ccaggcaccc tcgtcaccgt ctcgagc 327 <210> 144 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 144 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggactcga cctcagtagc tactacatgc aatgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggagtcatt ggtattaatg ataacacata ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaga gcctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatg 240 accagtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagggga catctggggc 300 ccaggcaccc tcgtcaccgt ctcgagcgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg 360 gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 420 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 480 accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 540 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 600 accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 660 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc 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ctaggcagtt atgattgtag tagtggtgat tgttttgtt 39 <210> 148 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 148 agctactaca tgcaa 15 <210> 149 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 149 gtcattggta ttaatgataa cacatactac gcgagctggg cgaaaggc 48 <210> 150 <211> 9 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 150 ggggacatc 9 <210> 151 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 151 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagag tgtttatgat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtcta ggcagttatg attgtagtag tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgt 339 <210> 152 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 152 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagag tgtttatgat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtcta ggcagttatg attgtagtag tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 153 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 153 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggact cgacctcagt agctactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatca atgataacac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 154 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 154 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggact cgacctcagt agctactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatca atgataacac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600 agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660 ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac gccagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 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gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtcta ggcagttatg attgtagtag tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgt 339 <210> 162 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 162 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagag tgtttatgat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtcta ggcagttatg attgtagtag tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 163 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 163 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggact cgacctcagt agctactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatca atgataacac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 164 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 164 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggact cgacctcagt agctactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatca atgataacac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 171 caagtgctga cccagactcc atcccccgtg tctgcagctg tgggaagcac agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagag tgtttatcat aacacctacc tggcctggta tcagcagaaa 120 ccagggcagc ctcccaaaca actgatctat gatgcatcca ctctggcgtc tggggtccca 180 tcgcggttca gcggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag 240 tgtaacgatg ctgccgctta ctactgtctg ggcagttatg attgtactaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgt 339 <210> 172 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 172 caagtgctga cccagactcc atcccccgtg tctgcagctg tgggaagcac agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagag tgtttatcat aacacctacc tggcctggta tcagcagaaa 120 ccagggcagc ctcccaaaca actgatctat gatgcatcca ctctggcgtc tggggtccca 180 tcgcggttca gcggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag 240 tgtaacgatg ctgccgctta ctactgtctg ggcagttatg attgtactaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 173 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 173 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgttccgtct ctggcatcga cctcagtggc tactacatga actgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggagtcatt ggtattaatg gtgccacata ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatg 240 accagtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagggga catctggggc 300 ccgggcaccc tcgtcaccgt ctcgagc 327 <210> 174 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 174 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgttccgtct ctggcatcga cctcagtggc tactacatga actgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggagtcatt ggtattaatg gtgccacata ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatg 240 accagtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagggga catctggggc 300 ccgggcaccc tcgtcaccgt ctcgagcgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg 360 gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 420 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 480 accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 540 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 600 accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 660 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 720 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 780 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca 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120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat gatgcatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtactaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 183 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 183 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacctcagt ggctactaca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatta atggtgccac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 184 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 184 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacctcagt ggctactaca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatta atggtgccac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 193 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacctcagt ggctactaca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatta atggtgccac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 194 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 194 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacctcagt ggctactaca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatta atggtgccac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca 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cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 aaatga 1326 <210> 195 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 195 caggccagtc agagtgttta tcataacacc tacctggcc 39 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 196 gatgcatcca ctctggcatc t 21 <210> 197 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 197 ctgggcagtt atgattgtac taatggtgat tgttttgtt 39 <210> 198 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 198 ggctactaca tgaac 15 <210> 199 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 199 gtcattggta ttaatggtgc cacatactac gcgagctggg cgaaaggc 48 <210> 200 <211> 9 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 200 ggggacatc 9 <210> 201 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 201 caagtgctga cccagactgc atcccccgtg tctgcagctg tgggaagcac agtcaccatc 60 aattgccagg 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tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtagtac tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 213 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 213 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacctcagt aaccactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc gttggtatca atggtcgcac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 214 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 214 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacctcagt aaccactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc gttggtatca atggtcgcac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600 agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660 ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac gccagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 aaatga 1326 <210> 215 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 215 caggccagtc agagtgttta caattacaac taccttgcc 39 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 216 tctacatcca ctctggcatc t 21 <210> 217 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 217 ctgggcagtt atgattgtag tactggtgat tgttttgtt 39 <210> 218 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 218 aaccactaca tgcaa 15 <210> 219 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 219 gtcgttggta tcaatggtcg cacatactac gcgagctggg cgaaaggc 48 <210> 220 <211> 9 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 220 ggggacatc 9 <210> 221 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 221 caagtgctga cccagactcc atcccccgtg tctgcagctg tgggaagcac agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagaa tgtttataat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggcagc ctcccaagca actgatctat tctacgtcca ctctggcatc tggggtctca 180 tcgcgattca gaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgacgtgcag 240 tgtgacgatg ctgccactta ctactgtcta ggcagttatg attgtagtcg tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgt 339 <210> 222 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 222 caagtgctga cccagactcc atcccccgtg tctgcagctg tgggaagcac agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagaa tgtttataat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggcagc ctcccaagca actgatctat tctacgtcca ctctggcatc tggggtctca 180 tcgcgattca gaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgacgtgcag 240 tgtgacgatg ctgccactta ctactgtcta ggcagttatg attgtagtcg tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 223 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 223 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggaatcgg cctcagtagc tactacatgc agtgggtccg ccagtctcca 120 gggagggggc tggaatggat cggagtcatt ggtagtgatg gtaagacata ctacgcgacc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaag acctcgtcga ccacggtgga tctgagaatg 240 gccagtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgta ccagagggga catctggggc 300 ccggggaccc tcgtcaccgt ctcgagc 327 <210> 224 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 224 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggaatcgg cctcagtagc tactacatgc agtgggtccg ccagtctcca 120 gggagggggc tggaatggat cggagtcatt ggtagtgatg gtaagacata ctacgcgacc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaag acctcgtcga ccacggtgga tctgagaatg 240 gccagtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgta ccagagggga catctggggc 300 ccggggaccc tcgtcaccgt ctcgagcgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg 360 gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 420 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 480 accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 540 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 600 accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 660 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 720 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 780 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 840 acaaagccgc gggaggagca gtacgccagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 900 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 960 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1020 tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1080 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1140 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1200 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1260 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1320 <210> 225 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 225 caggccagtc agaatgttta taataacaac tacctagcc 39 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 226 tctacgtcca ctctggcatc t 21 <210> 227 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 227 ctaggcagtt atgattgtag tcgtggtgat tgttttgtt 39 <210> 228 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 228 agctactaca tgcag 15 <210> 229 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 229 gtcattggta gtgatggtaa gacatactac gcgacctggg cgaaaggc 48 <210> 230 <211> 9 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 230 ggggacatc 9 <210> 231 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 231 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagaa tgtttacaat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtagtcg tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgt 339 <210> 232 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 232 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagaa tgtttacaat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtagtcg tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 233 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 233 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cggcctcagt agctactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtagtg atggtaagac atactacgcg 180 acctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtaccag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 234 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 234 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cggcctcagt agctactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtagtg atggtaagac atactacgcg 180 acctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtaccag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600 agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660 ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac gccagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 aaatga 1326 <210> 235 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 235 caggccagtc agaatgttta caataacaac tacctagcc 39 <210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 236 tctacatcca ctctggcatc t 21 <210> 237 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 237 ctgggcagtt atgattgtag tcgtggtgat tgttttgtt 39 <210> 238 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 238 agctactaca tgcaa 15 <210> 239 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 239 gtcattggta gtgatggtaa gacatactac gcgacctggg cgaaaggc 48 <210> 240 <211> 9 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 240 ggggacatc 9 <210> 241 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 241 caggtgctga cccagactgc atcccccgtg tctccagctg tgggaagcac agtcaccatc 60 aattgccggg ccagtcagag tgtttattat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggcagc ctcccaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtctca 180 tcgcggttca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgacgtgcag 240 tgtgacgatg ctgccactta ctactgtcta ggcagttatg attgtagtaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgt 339 <210> 242 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 242 caggtgctga cccagactgc atcccccgtg tctccagctg tgggaagcac agtcaccatc 60 aattgccggg ccagtcagag tgtttattat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggcagc ctcccaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtctca 180 tcgcggttca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgacgtgcag 240 tgtgacgatg ctgccactta ctactgtcta ggcagttatg attgtagtaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 243 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 243 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg gaggatccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggaatcga cgtcactaac tactatatgc aatgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggagtcatt ggtgtgaatg gtaagagata ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatg 240 accagtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagaggcga catctggggc 300 ccggggaccc tcgtcaccgt ctcgagc 327 <210> 244 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 244 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg gaggatccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggaatcga cgtcactaac tactatatgc aatgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggagtcatt ggtgtgaatg gtaagagata ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatg 240 accagtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagaggcga catctggggc 300 ccggggaccc tcgtcaccgt ctcgagcgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg 360 gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 420 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 480 accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 540 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 600 accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 660 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 720 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 780 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 840 acaaagccgc gggaggagca gtacgccagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 900 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 960 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1020 tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1080 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1140 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1200 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1260 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1320 <210> 245 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 245 cgggccagtc agagtgttta ttataacaac tacctagcc 39 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 246 tctacatcca ctctggcatc t 21 <210> 247 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 247 ctaggcagtt atgattgtag taatggtgat tgttttgtt 39 <210> 248 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 248 aactactata tgcaa 15 <210> 249 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 249 gtcattggtg tgaatggtaa gagatactac gcgagctggg cgaaaggc 48 <210> 250 <211> 9 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 250 ggcgacatc 9 <210> 251 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 251 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccggg ccagtcagag tgtttactat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtagtaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgt 339 <210> 252 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 252 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccggg ccagtcagag tgtttactat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtagtaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 253 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 253 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacgtcact aactactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtgtga atggtaagag atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgccag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 254 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 254 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacgtcact aactactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtgtga atggtaagag atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgccag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600 agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660 ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac gccagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 aaatga 1326 <210> 255 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 255 cgggccagtc agagtgttta ctataacaac tacctagcc 39 <210> 256 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 256 tctacatcca ctctggcatc t 21 <210> 257 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 257 ctgggcagtt atgattgtag taatggtgat tgttttgtt 39 <210> 258 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 258 aactactaca tgcaa 15 <210> 259 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 259 gtcattggtg tgaatggtaa gagatactac gcgagctggg cgaaaggc 48 <210> 260 <211> 9 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 260 ggggacatc 9 <210> 261 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 261 gccatcgtga tgacccagac tccatcttcc aagtctgtcc ctgtgggaga cacagtcacc 60 atcaattgcc aggccagtga gagtctttat aataacaacg ccttggcctg gtttcagcag 120 aaaccagggc agcctcccaa gcgcctgatc tatgatgcat ccaaactggc atctggggtc 180 ccatcgcggt tcagtggcgg tgggtctggg acacagttca ctctcaccat cagtggcgtg 240 cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ggaggctaca gaagtgatag tgttgatggt 300 gttgctttcg ccggagggac cgaggtggtg gtcaaacgt 339 <210> 262 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 262 gccatcgtga tgacccagac tccatcttcc aagtctgtcc ctgtgggaga cacagtcacc 60 atcaattgcc aggccagtga gagtctttat aataacaacg ccttggcctg gtttcagcag 120 aaaccagggc agcctcccaa gcgcctgatc tatgatgcat ccaaactggc atctggggtc 180 ccatcgcggt tcagtggcgg tgggtctggg acacagttca ctctcaccat cagtggcgtg 240 cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ggaggctaca gaagtgatag tgttgatggt 300 gttgctttcg ccggagggac cgaggtggtg gtcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 263 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 263 cagtcggtgg aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 60 tgcacagcct ctggattcga cttcagtagc aatgcaatgt ggtgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggagtggat cggatgcatt tacaatggtg atggcagcac atactacgcg 180 agctgggtga atggccgatt ctccatctcc aaaacctcgt cgaccacggt gactctgcaa 240 ctgaatagtc tgacagtcgc ggacacggcc acgtattatt gtgcgagaga tcttgacttg 300 tggggcccgg gcaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 264 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 264 cagtcggtgg aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 60 tgcacagcct ctggattcga cttcagtagc aatgcaatgt ggtgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggagtggat cggatgcatt tacaatggtg atggcagcac atactacgcg 180 agctgggtga atggccgatt ctccatctcc aaaacctcgt cgaccacggt gactctgcaa 240 ctgaatagtc tgacagtcgc ggacacggcc acgtattatt gtgcgagaga tcttgacttg 300 tggggcccgg gcaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600 agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660 ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac gccagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 aaatga 1326 <210> 265 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 265 caggccagtg agagtcttta taataacaac gccttggcc 39 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 266 gatgcatcca aactggcatc t 21 <210> 267 <211> 36 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 267 ggaggctaca gaagtgatag tgttgatggt gttgct 36 <210> 268 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 268 agcaatgcaa tgtgg 15 <210> 269 <211> 51 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 269 tgcatttaca atggtgatgg cagcacatac tacgcgagct gggtgaatgg c 51 <210> 270 <211> 12 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 270 gatcttgact tg 12 <210> 271 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 271 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagaa tgtttacaat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtagtcg tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgt 339 <210> 272 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 272 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagaa tgtttacaat aacaactacc tagcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat tctacatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtagtcg tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 273 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 273 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cggcctcagt agctactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtagtg atggtaagac atactacgcg 180 acctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtaccag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 333 <210> 274 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 274 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cggcctcagt agctactaca tgcaatgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtagtg atggtaagac atactacgcg 180 acctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtaccag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600 agcaacacca aggtggacgc gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660 ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac gccagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 aaatga 1326 <210> 275 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 275 caggccagtc agaatgttta caataacaac tacctagcc 39 <210> 276 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 276 tctacatcca ctctggcatc t 21 <210> 277 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 277 ctgggcagtt atgattgtag tcgtggtgat tgttttgtt 39 <210> 278 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 278 agctactaca tgcaa 15 <210> 279 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 279 gtcattggta gtgatggtaa gacatactac gcgacctggg cgaaaggc 48 <210> 280 <211> 9 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 280 ggggacatc 9 <210> 281 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-term amidated <400> 281 Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Lys Ala Phe 35 <210> 282 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-term amidated <400> 282 Ala Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ser Arg Ser Gly Gly Met Val Lys Ser Asn Phe Val Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Lys Ala Phe 35 <210> 283 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 283 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 20 25 30 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 65 70 75 80 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 284 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 284 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (211)

  1. 서열번호:55; 서열번호:56; 및 서열번호:57의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)을 포함하는 가변 경쇄 및 서열번호:58; 서열번호:59; 및 서열번호:60의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호:53에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호:51에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호:53에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩타이드 및 서열번호:51에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호:43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호:41에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호:41에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 폴리펩타이드 및 서열번호:43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  8. 제1항에 있어서, 서열번호:54에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩타이드 및 서열번호:52에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  9. 제1항에 있어서, 서열번호:44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩타이드 및 서열번호:42에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 단리된 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편.
    (i) 무글리코실화되거나;
    (ii) 글리코실화되지만, 만노스 잔기만을 함유하거나;
    (iii) N-글리코실화되지 않거나;
    (iv) 변형되어 효과기 기능, 반감기, 단백질분해, 또는 글리코실화를 바꾼 Fc 영역을 함유하거나;
    (v) 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 항체 또는 1가 항체이거나;
    (vi) Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 또는 1가 항체로부터 선택되는 항체 단편이거나;
    (vii) 검출가능 표지 또는 치료제에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되거나;
    (viii) 10-4 S-1, 5x10-5 S-1, 10-5 S-1, 5x10-6 S-1, 10-6 S-1, 5x10-7 S-1, 또는 10-7 S-1이하의 해리속도상수 (Koff)로 CGRP에 결합하거나;
    (ix) CGRP와 CGRP-R 및/또는 그의 다량체, CGRP-CGRP-R 복합체 중 하나 이상의 부가적 단백질과의 회합을 억제하고/거나 그의 생물학적 효과에 역작용하거나;
    (x) 검출가능 모이어티 또는 기능적 모이어티인 효과기 모이어티를 추가로 포함하거나; 또는
    (xi) IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래되는 인간 Fc를 포함하는 것.
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  14. 전조가 있거나 없는 편두통, 체중 감소, 암, 신생혈관혈성, 만성 편두통, 빈번한 간헐적 편두통, 생리 편두통, 반신마비성 편두통, 군발성 두통, 편두통성 신경통, 만성 두통, 긴장성 두통, 일반적인 두통, 열감, 만성 발작성 편두통, 이차성 두통, 두개 신경통, 부비동 두통, 알러지-유도된 두통 또는 편두통, 통증, 염증성 통증, 수술후 절개 통증, 복합 부위 통증 증후군, 암 통증, 일차 또는 전이성 골 암 통증, 골절 통증, 골다공증 골절 통증, 화상 유래 통증, 골다공증, 통풍 관절 통증, 겸상 적혈구 위기와 연관된 통증, 간경변증, 신경성 통증, 신경병성 통증, 침해성 통증, 삼차 신경통, 대상포진후 신경통, 환지통, 섬유근육통, 난소통, 반사성 교감신경 위축증, 골관절염, 류마티스성 관절염 통증, 등 아래 통증, 당뇨병성 신경병증, 엉덩뼈신경통, 위-식도 역류, 소화불량, 과민성 장 증후군, 염증성 장질환, 크론병, 회장염, 궤양성 대장염, 신장 산통, 월경통, 방광염, 생리 기간, 분만, 폐경기, 전립선염, 또는 췌장염과 연관된 내장 통증으로부터 선택되는 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한, 또는 질환이 과민성 방광; 요실금; 통증; 만성 통증; 신경성 염증, 염증성 통증; 신경병성 통증; 눈 통증; 치통; 수술후 통증, 외상 관련된 통증, 당뇨병; 비-인슐린 의존 진성 당뇨병, 혈관 장애; 염증; 관절염; 기관지 과민성, 천식; 충격; 패혈증; 아편제 회수 증후군; 모르핀 내성; 열감; 알러지 피부염; 건선; 뇌염; 뇌 외상; 간질; 신경퇴행성 질환; 소양증, 신경성 피부 적열상태, 피부 장미화, 홍반; 염증성 장질환, 과민성 장 증후군, 방광염; 및 월경통으로부터 선택되는 것인, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 CGRP 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 질환이 두통 또는 편두통인 것인 약제학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 진통제, 항히스타민제, 항염증제, 항생제, 화학치료제, 면역억제제, 시토카인, 항증식성, 항구토제 또는 세포독소로부터 선택되는 다른 치료제와 조합하여 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  17. (i) 프로모터 및 신호 서열에 작동가능하게 연결된 항체를 인코딩하는 하나 이상의 이종기원 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적어도 하나의 발현 벡터를 반수체 효모 세포에 도입하는 단계;
    (ii) 접합 또는 스페로플라스트 융합으로 다배체 효모를 제 1 및/또는 제 2 반수체 효모 세포로부터 생산하는 단계;
    (iii) 상기 항체를 안정되게 발현시키는 다배체 효모 세포를 선정하는 단계; 및
    (iv) 배양 배지에 상기 항체를 안정되게 발현시키는 상기 다배체 효모 세포로부터 안정한 다배체 효모 배양물을 생산하는 단계
    를 포함하는,
    항체를 안정되게 발현시키고 배양 배지에 적어도 10-25 mg/리터의 상기 항체를 분비하는 다배체 효모 배양물에서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 이종기원 폴리뉴클레오타이드는 서열번호:51 및 서열번호:53에 함유된 폴리펩타이드를 코딩하는 서열; 또는 서열번호:52 및 서열번호:54에 함유된 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
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