BR112019017308A2 - anticorpos anti-il31 para uso veterinário - Google Patents

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Nguyen Lam
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Abstract

a presente invenção refere-se a várias modalidades fornecidas referentes aos anticorpos anti-il31 que se ligam à il31 canina. esses anticorpos podem ser usados em métodos para tratar condições induzidas por il31 em animais de estimação, como cães, felinos e equinos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS ANTI-IL31 PARA USO VETERINÁRIO.
[1] Este pedido reivindica o benefício do pedido internacional PCT/US2017/023788, depositado em 23 de março, 2017, e reivindica o benefício do pedido provisório US n° 62/463.543, depositado em 24 de fevereiro, 2017, aqui incorporados em sua totalidade, a título de referência
CAMPO DA INVENÇÃO [2] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-IL31 isolados, por exemplo, ligados à IL31 de caninos, e métodos de uso do mesmo, por exemplo, no tratamento de condições induzidas por IL31 ou na redução da função de sinalização de IL31 nas células, por exemplo, em animais de estimação, como caninos, felinos e equinos. ANTECEDENTES [3] A interleucina 31 (IL31) é uma citocina produzida principalmente por células Th2 e está envolvida na promoção de doenças de pele, como formas pruriginosas e outras formas de doenças alérgicas (por exemplo, dermatite atópica). A IL31 funciona ligando seu receptor e ativando atividades a jusante, como a ativação de JAK1, e é pensada por causar muitos dos problemas clínicos associados com dermatite e outros distúrbios.
[4] Animais de estimação como os gatos, cães e cavalos, sofrem de muitas doenças de pele semelhante a doenças de pele humana, como a dermatite atópica. No entanto, a sequência de IL31 diverge entre humano, gato, cachorro e cavalo. Existe uma necessidade, portanto, por métodos e compostos que podem ser usados especificamente para ligar a IL31 de animal de estimação para o tratamento de condições induzidas pela IL31 e para a redução de sinalização da IL31.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
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2/79 [5] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado é fornecido que se liga à IL31 canina. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo compreendendo 34-50 aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo compreendendo a sequência de aminoácidos de PSDX1X2KI (SEQ ID NO: 45), em que X é qualquer resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, X1 é um aminoácido hidrofóbico. Em algumas modalidades, X1 é selecionado de A, V, I e L. Em algumas modalidades, X1 é selecionado de V e I. Em algumas modalidades, X2 é um aminoácido hidrofílico. Em algumas modalidades, X1 é selecionado de A, R, K, Q e N. Em algumas modalidades, X1 é selecionado de R e Q. Em algumas modalidades, Xi é V e X2 é R. Em algumas modalidades, X1 é I e X2 é Q. Em algumas modalidades, 0 anticorpo se liga a um epítopo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88.
[6] Em algumas modalidades, 0 anticorpo se liga à IL31 canina com uma constante de dissociação (Kd) menor que 5 x 10-6 M, menor que 1 x 10 6 M, menor que 5 x 10-7 M, menor que 1 x 10-7 M, menor que 5 x 10-8 M, menor que 1 x 10-8 M, menor que 5 x 10-9 M, menor que 1 x 10-9 M, menor que 5 x 10 10 M, menor que 1 x 10 10 M, menor que 5 x 10 11 M, menor que 1 x 10-11 M, menor que 5 x 10-12 M, ou menor que 1 x 10-12 M, medida por interferometria de biocamada.
[7] Em algumas modalidades, 0 anticorpo reduz a função de sinalização da IL31 em uma espécie de animal de estimação, como medido por uma redução na fosforilação de STAT-3. Em algumas modalidades, a espécie de animal de estimação é canina, felina ou equina.
[8] Em algumas modalidades, 0 anticorpo se liga à IL31 felina ou IL31 equina, conforme determinado por análise de imunoblot e/ou
Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 125/216
3/79 de interferometria de biocamada. Em algumas modalidades, o anticorpo compete com o anticorpo monoclonal M14 na ligação à IL31 canina. Em algumas modalidades, o anticorpo compete com anticorpo monoclonal M14 na ligação à IL31 felina. Em algumas modalidades, o anticorpo não se liga à IL31 humana, conforme determinado por análise de imunoblot e/ou de interferometria de biocamada.
[9] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo canino, caninizado, felino, felinizado, equino, equinizado ou quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico compreendendo regiões de arcabouço de cadeia pesada variáveis murinas ou regiões de arcabouço de cadeia leve variáveis murinas.
[10] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que:
[11] a. a cadeia pesada compreende uma sequência de CDR-H1 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; uma sequência de CDRH2 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 62, 89 ou 87; e uma sequência de CDR-H3 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e [12] b. a cadeia leve compreende uma sequência de CDR-L1 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de se
Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 126/216
4/79 quência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 63; uma sequência de CDR-L2 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; e uma sequência de CDR-L3 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[13] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1); (b) uma CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 89, e uma CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
[14] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1); (b) uma CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62 ou 87, e uma CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
[15] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo (a) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8); (b) uma CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e (c) uma CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[16] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo (a) uma CDR-L1 compreendendo a se
Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 127/216
5/79 quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63); (b) uma CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e (c) uma CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[17] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma ou mais de (a) uma sequência de arcabouço da região variável da cadeia pesada 1 (HC FR1) da SEQ ID NO: 4, 70 ou 79, (b) um sequência HCFR2 da SEQ ID NO: 5, 71 ou 80, e (c) uma sequência HC-FR3 da SEQ ID NO: 6, 72, 73 ou 81, (d) uma sequência HC-FR4 da SEQ ID NO: 7, 74 ou 82, (e) uma sequência de arcabouço da região variável da cadeia leve 1 (LC FR1) da SEQ ID NO: 11, 75 ou 83, (f) uma sequência LC FR2 da SEQ ID NO: 12, 76 ou 84, (g) uma sequência LC FR3 da SEQ ID NO: 13, 77 ou 85, ou (h) uma sequência LC-FR4 da SEQ ID NO: 14, 78 ou 86.
[18] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende:
[19] a. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou [20] b. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e
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6/79 uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou [21] c. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii).
[22] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 16; ou SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 15; ou SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 24 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 25; e uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 16 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 15; e uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 32 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 33.
[23] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico compreendendo uma região constante da cadeia pesada ou região constante da cadeia leve derivadas de um animal de estimação.
[24] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma região constante da cadeia pesada canina selecionado de uma região constante de IgG-Α, IgG-B, IgG-C e IgG-D; (b) uma região constante da cadeia pesada felina selecionada de uma região constante de IgG 1, lgG2a e lgG2b; ou (c) uma região constante da cadeia pesada selecionada de uma região constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG5, lgG6 e lgG7.
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7/79 [25] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende:
[26] a. (i) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 26; (ii) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 27; ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve como em (i) e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada como em (ii); ou [27] b. (i) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 30; (ii) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 31; ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve como em (i) e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada como em (ii); ou [28] c. (i) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 34; (ii) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 35; ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve como em (i) e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada como em (ii).
[29] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; ou SEQ ID NO: 20.
[30] Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado de Fv, scFv, Fab, Fab’, F(ab')2 e Fab'-SH.
[31] Em algumas modalidades, o anticorpo é biespecífico, em que o anticorpo se liga à IL31 e um ou mais antígenos selecionados de IL17, TNFa, CD20, CD19, CD25, IL4, IL13, IL23, IgE, CD11a, IL6R, a4-lntegrina, IL12, ΙΙ_1β ou BlyS.
[32] Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado é fornecido, o qual codifica um anticorpo anti-IL31 descrito aqui acima. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é fornecida, que com
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8/79 preende um ácido nucléico codificando um anticorpo anti-IL31 descrito aqui acima. Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir um anticorpo anti-IL31, que compreende a cultura como uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucléico codificando um anticorpo anti-IL31 descrito aqui acima e isolando o anticorpo.
[33] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-IL31 descrito aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-IL31 descrito aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o veículo farmaceuticamente aceitável compreende a Lhistidina, o cloreto de sódio e o polissorbato 80.
[34] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 6,2. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 6,0, ou de 5,3 a 5,7 ou 5,5.
[35] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem uma concentração de L-histidina de 5 mM a 100 mM, de 10 mM a 50 mM, de 20 mM a 30 mM, de 10 a 30 mM ou 20 mM.
[36] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem uma concentração de cloreto de sódio de 80 a 200 mM, de 100 a 175 mM, de 120 a 150 mM ou 140 mM.
[37] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem uma concentração de polisorbato 80 de 0,005 mg/mL a 0,5 mg/mL, de 0,01 mg/mL a 0,1 mg/mL ou de 0,05 mg/mL.
[38] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável compreende pelo menos um açúcar. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem uma concentração de pelo menos um de açúcar de 0,5% a 20%, de 1% a 10%, de 1% a 5%, ou de 1% a 3%. Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável é composto por sacarose, trealose, D-manitol, maltose e/ou
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9/79 sorbitol.
[39] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável compreende um agente antibacteriano. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende m cresol ou metilparabeno. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende m cresol a 0,2% e/ou metilparabeno a 0,9%.
Usos de anticorpos e composições farmacêuticas [40] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para tratar uma espécie de animal de estimação tendo uma condição induzida por IL31, compreendendo a administração às espécies de animal de estimação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IL31 descrito aqui ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo descrito aqui. Em algumas modalidades, a espécie de animal de estimação é canina, felina ou equina. Em algumas modalidades, a condição induzida por IL31 é uma condição pruriginosa ou alérgica. Em algumas modalidades, a condição induzida por IL31 é selecionada de dermatite atópica, prurido, asma, psoríase, escleroderma e eczema.
[41] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL31 ou a composição farmacêutica é administrado parenteralmente. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL31 ou a composição farmacêutica é administrado por uma via intramuscular, uma via intraperitonial, uma via intracerebrospinal, uma via subcutânea, uma via intra-arterial, uma via intrassinovial, uma via intratecal, ou uma via de inalação.
[42] Em algumas modalidades, o método compreende administrar em combinação com o anticorpo anti-IL31 ou a composição farmacêutica um inibidor de Jak, um inibidor de PI3K, um inibidor de AKT ou um inibidor de MAPK. Em algumas modalidades, o método compreende administrar em combinação com o anticorpo anti-IL31 ou a composição farmacêutica um ou mais anticorpos selecionados de um anti
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10/79 corpo anti-IL17, um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-CD25, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti-IL13, um anticorpo anti-IL23, um anticorpo anti-lgE, um anticorpo anti-CD11a, um anticorpo anti-IL6R, um anticorpo antia4-lntegrina, um anticorpo anti-IL12, um anticorpo anti-IL1 β e um anticorpo anti-BlyS.
[43] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de redução da função de sinalização de IL31 em uma célula, compreendendo expor à célula um anticorpo anti-IL31 a composição farmacêutica descrita aqui em condições permissivas para a ligação do anticorpo à IL31 extracelular, reduzindo, assim, a ligação ao receptor de IL31 e/ou redução da função de sinalização de IL31 pela célula. Em algumas modalidades, a célula é exposta ao anticorpo ou à composição farmacêutica ex vivo. Em algumas modalidades, a célula é exposta ao anticorpo ou à composição farmacêutica in vivo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula canina, uma célula felina ou uma célula equina.
[44] Em algumas modalidades, um método para a detecção de IL31 em uma amostra de uma espécie de animal de estimação é fornecido, compreendendo colocar a amostra em contato com um anticorpo anti-IL31 ou com a composição farmacêutica descrita aqui em condições permissivas para a ligação de anticorpos à IL31, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo e a IL31 na amostra. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra biológica obtida a partir de um canino, felino ou equino.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [45] Figura 1A é um alinhamento de sequências leves variáveis de clones de anticorpo monoclonal de camundongo M14, M18, M19 e M87. Figura 1B é um alinhamento de sequências pesadas variáveis de clones de anticorpo monoclonal de camundongo M14, M18, M19 e
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M87.
[46] Figura 2A e Figura 2B são gráficos da análise de ligação de IL31 canina com diferentes concentrações de anticorpo quimérico M14.
[47] Figura 3A e Figura 3B são gráficos da análise de ligação de IL31 canina com diferentes concentrações de anticorpo M14 caninizado.
[48] Figura 4 é um imunoblot mostrando a sinalização da IL31 canina inibida em diferentes concentrações de anticorpo M14 caninizado.
[49] As Figuras 5A e 5B são imunoblots de supressões de GSTcanina-IL31 sondada com anticorpo M14 e anticorpo anti-GST, respectivamente.
[50] As Figuras 6A e 6B são imunoblots de supressões de GSTcanina-IL31 sondada com anticorpo M14 e anticorpo anti-GST, respectivamente.
[51] As Figuras 7A e 7B são imunoblots de proteínas de IL31 felina e equina fundidas a Fc humana sondada com anticorpo M14 e anticorpo anti-FC, respectivamente.
[52] Figura 8 mostra a análise de imunoblot do mapeamento fino do epítopo e da digitalização de alanina do epítopo de IL31 canino maduro usando anticorpo anti-IL31 canino (painel superior) e anticorpo anti-GST (painel inferior).
[53] Figura 9 mostra a análise de imunoblot do mapeamento fino do epítopo e da digitalização de alanina do epítopo de IL31 canino maduro usando anticorpo anti-IL31 canino (painel superior) e anticorpo anti-GST (painel inferior).
[54] Figura 10 mostra a análise de imunoblot do mapeamento fino do epítopo e da digitalização de alanina do epítopo de IL31 canino maduro usando anticorpo anti-IL31 canino (painel superior) e anticorpo anti-GST (painel inferior).
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12/79 [55] Figura 11 mostra a análise de imunoblot do mapeamento fino do epítopo e da digitalização de alanina do epítopo de IL31 canino maduro usando anticorpo anti-IL31 canino (painel superior) e anticorpo anti-GST (painel inferior).
[56] Figura 12 mostra a análise de imunoblot do mapeamento fino do epítopo e da digitalização de alanina do epítopo de IL31 canino maduro usando anticorpo anti-IL31 canino (painel superior) e anticorpo anti-GST (painel inferior).
[57] Figura 13 é uma reatividade cruzada do imunoblot do anti- corpo anti-IL31 canino M14 para IL31 da morsa.
DESCRIÇÃO DE CERTAS SEQUÊNCIAS [58] A Tabela 1 fornece uma lista de certas sequências mencio- nadas aqui.
Tabela 1: Descrição de certas sequências
SEQ ID NO: SEQUÊNCIA DESCRIÇÃO
1 GRSIT5GYW Sequência de aminoácidos CDR-H1 da cadeia pesada variável de clones de anticorpos de camundongo M14, M18 e M19
2 YISY3GITDYMPSLK3 Sequência de aminoácidos CDR-H2 da cadeia pesada variável de clones de anticorpos de camundongo M14 e M19
62 YI3YSGITYYNP3LKS Sequência de aminoácidos CDR-H2 da cadeia pesada variável do clone de anticorpo de camundongo Ml 8
89 YI SYSGITDY Sequência de aminoácidos alternativa CDR-H2 da cadeia pesada variável de clones de anticorpos de camundongo M14 e M19
87 YI5YSGITYY Sequência de aminoácidos alternativa CDR-H2 da cadeia pesada variável do clone de anticorpo de camundongo Ml 8
3 AA.YGNYGYANDY Sequência de aminoácidos CDR-H3 da cadeia pesada variável de clones de anticorpos de camundongo M14, M18 e M19
4 EVQLQESGí;SLVKE;SQTT,SLTCS\T' Sequência de aminoácidos HC-FR1 de arcabouço da cadeia pesada da região variável do clone de anticorpo de camundongo M14
5 NWIRKFPGNKLEYMG Sequência de aminoácidos HC-FR2 de cadeia pesada da região variável de clone de anticorpo de camundongo M14
6 RISITP.DTSKNQYYLQLNSVTTERTATYYC Sequência de aminoácidos HC-FR3 de arcabouço da cadeia pesada da região variável do clone de anticorpo de camundongo M14
7 WGQGT3VTVS3 Sequência de aminoácidos HC-FR4 de arcabouço da cadeia pesada da região variável do clone de anticorpo de camundongo M14
8 RASESVDTYGNSFMH Sequência de aminoácidos CDR-L1 da cadeia leve variável de clones de anticorpos de camundongo M14 e M19
63 RASESVDTYGNSFIH Sequência de aminoácidos CDR-L1 da cadeia leve variável do clone de anticorpo de camundongo Ml 8
9 RASNLES Sequência de aminoácidos CDR-L2 da cadeia leve variável de clones de anticorpos de camundongo M14, M18 e M19
10 QQSYEDPWT Sequência de aminoácidos CDR-L3 da cadeia leve variável de clones de anticorpos de camundongo M14, M18 e M19
11 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC Sequência de aminoácidos LC-FR1 de arcabouço da cadeia leve da região variável do clone de anticorpo de camundongo M14
12 WYQQKSGQSPKLLIY Sequência de aminoácidos LC-FR2 de arcabouço da cadeia leve da região variável do clone de anticorpo de camundongo M14
13 GIPARFGG S G S RT D FT LT ID PVEAD DVAT YYC Sequência de aminoácidos LC-FR3 de arcabouço da cadeia leve da região variável do clone de anticorpo de camundongo M14
14 FGGGTKLEIK Sequência de aminoácidos LC-FR4 de arcabouço da cadeia leve da região variável do clone de anticorpo de camundongo M14
15 EVQLVE S G P S LVKP GGSLR- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYM- GYISYSGITDYNPSLKSRITISRDTSKNQYYLQLNSVT- TEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTLVTVSS Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável caninizada do clone de anticorpo de camundongo M14
16 DIVMTQSPASLSVSLGQRATISCRASESVDTYGNS- FMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGSG- TDFTLTIDPVQADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIK Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável caninizada do clone de anticorpo de camundongo M14
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70 EVQLVESGPSLVKPGGSLRLTCSVT HC-FR1 M14 caninizada
71 NWIRKFPGNKLEYMG HC-FR2 M14 caninizada
72 RITISRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYC HC-FR3 M14 caninizada
73 NPSLKSRITISRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYC HC-FR3 M14 caninizada alternativa
74 WGQGTLVTVSS HC-FR4 M14 caninizada
75 DIVMTQSPASLSVSLGQRATISC LC-FR1 M14 caninizada
76 WYQQKPGQSPKLLIY LC-FR2 M14 caninizada
77 GIPARFGG S G S GT D FT LT ID P VQAD DVAT YYC LC-FR3 M14 caninizada
78 FGGGTKLEIK LC-FR4 M14 caninizada
17 EVQLVE S G P S LVKP GGSLRLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGITDYNPSLKSRITISRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLHSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNWHPASNTKVDKPVFNECRCTDTPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCWLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDI- DVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK Sequência da cadeia pesada caninizada do clone de anticorpo de camundongo M14 e IgG-A canina
18 EVQLVE S G P S LVKP GGSLR- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYM- GYISYSGITDYNPSLKSRITISRDTSKNQYYLQLNSVT- TEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTLVTVSSASTTAP- SVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNS- GSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSET- FTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPA- PEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWDLD- PEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNG- TYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIER- TISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIK- DFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED- GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYT- QESLSHSPGK Sequência da cadeia pesada caninizada de clone de anticorpo de camundongo M14 e IgG-B canina
19 EVQLVE S G P S LVKP GGSLR- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYM- GYISYSGITDYNPSLKSRITISRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSQSGSTVALACLVSGYIPEPVTVSWNSVSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPATNTKVDKPVAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVWDLD- PENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNG- T YRWS VL PIGHQDWL SGKQ FKCKVNNKAL P S PI EE IIS KT PGQAHQ PNVYVL P P SRDEMSKNTVT LT CLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK Sequência da cadeia pesada caninizada de clone de anticorpo de camundongo M14 e IgG-C canina
20 EVQLVE S G P S LVKP GGSLRLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGITDYNPSLKSRITISRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSTVTVPSSRWPSETFTCNWHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCWLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYS- KLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK Sequência da cadeia pesada caninizada de clone de anticorpo de camundongo M14 e IgG-D canina
21 DIVMTQSPASLSVSLGQRATISCRASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGSGTDFTLTIDPVQADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD Sequência da cadeia leve caninizada do clone de anticorpo de camundongo M14 e região constante da cadeia leve canina
22 MLSHTGPSRFALFLLCSMETLLSSHMAPTHQLPPSDVRKIILELQPLSRGLLEDYQKKETGVPESNRTLLLCLTSDSQPPRLNSSAILPYFRAIRPLSDKNIIDKIIEQLDKLKFQHEPETEISVPADTFECKSFILTILQQFSACLES- VFKSLNSGPQ Sequência de aminoácidos da IL31 canina
23 PSDVRKIILELQPLSRG Epítopo da IL31 canina
24 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDTYGNS- FMHWYQQKSGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGS- RTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGT- KLEIK Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável do clone de anticorpo de camundongo M14
25 EVQ L Q E S G P S LVK P S Q T L 5 - LT C S VT GD SITS GYWNWIRKFPGNKLE YPi- GYISYSGITDYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVT- TEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTSVi'VSS Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável do clone de anticorpo de camundongo M14
26 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDTYGNS- Cadeia leve variável quimérica do clone de anticorpo de camundongo M14 e
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FMHWYQQKSGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGSRTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYS- LSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD região constante da cadeia leve canina
27 EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGITDYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTSVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDED- GSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK Cadeia pesada variável quimérica do clone de anticorpo de camundongo M14 e IgG-B canina
28 MLSHAGPARFALFLLCCMETLLPSHMAPAHRLQPSDVRKIILELRPMSKGLLQDYLKKEIGLPESNHSSLPCLSSDSQLPHINGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKFQREPEAKVSMPADNFERKNFILAVLQQFSACLEHVLQSLNSGPQ Sequência de aminoácidos da IL31 felina NCBIref: XP_011286140.1 [felis catus]
29 MVSHIGSTRFALFLLCCLGTLMFSHTGPIYQLQPKEIQAIIVELQNLSKKLLDDYLNKEKGVQKFDSDLPSCFTSDSQAPGNINSSAILPYFKAISPSLNNDKSLYIIEQLDKLNFQNAPETEVSMPTDNFERKRFILTILRWFSNCLE- LAMKTLTTAEQALPPLDPSTPHAGAVALTHHQQDRTALDRAVF? FVWAAP RGGEVGDGGH Sequência de aminoácidos da IL31 equina
30 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDTYGNSFMHWYQQKSGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGSRTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRSDAQPSVFLFQPSLDELHTGSASIVCILNDFYPKEVNVKWKVDGWQNKGIQESTTEQNSKDSTYSLSSTLTMSSTEYQSHEKFSCEVTHKSLASTLVKSFNRSECQRE Cadeia leve variável quimérica do clone de anticorpo de camundongo M14 e região constante da cadeia leve felina
31 EVQLQESGPSLVKPSQTLS- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYM- GYISYSGITDYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTSVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGTTSGATVALACLVLGYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQASGLYSLSSMVTVPSSRWLSDTFTCNVAHPPSNTKVDKTVRKTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLWDLGPDD SDVQITWFVDNTQVYTAKT S P REEQ FN ST YRWSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK Cadeia pesada variável quimérica do clone de anticorpo de camundongo M14 e região constante da cadeia pesada felina
32 EIQMTQSPSSLSASPGDRVTISCRASESVDTYGNS- FMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSG- TDFTLTISSLEPEDAATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIK Sequência da cadeia leve variável felinizada do clone de anticorpo de camundongo M14
33 DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCSVTGDSITSGYWNWVR- QAPGKGLQWVAYISYSGITDYADSVKGRFTISRD- NAKNTLYLQLNNLKAEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTLVTVSS Sequência da cadeia pesada variável felinizada do clone de anticorpo de camundongo M14
79 DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCSVT HC-FR1 M14 felinizada
80 NWVRQAPGKGLQWVA HC-FR2M14 felinizada
81 ADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLNNLKAEDTATYYCA HC-FR3 M14 felinizada
82 WGQGTLVTVSS HC-FR4M14 felinizada
83 EIQMTQSPSSLSASPGDRVTISC LC-FR1 M14 felinizada
84 WYQQKPGQSPKLLIY LC-FR2M14 felinizada
85 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAATYYC LC-FR3 M14 felinizada
86 FGGGTKLEIK LC-FR4M14 felinizada
34 EIQMTQSPSSLSASPGDRVTISCRASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRSDAQPSVFLFQPSLDELHTGSASIVCILNDFYPKEVNVKWKVDGWQNKGIQESTTEQNSKDSTYSLSSTLTMSSTEYQSHEKFSCEVTHKSLAS- TLVKSFNRSECQRE Sequência da cadeia leve felinizada do clone de anticorpo de camundongo M14
35 DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCSVTGDSITSGYWNWVRQAPGKGLQWVAYISYSGITDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLNNLKAEDTATYYCARYGNYGYAM- DYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGTTSGATVAIACLVLGYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQASGLYSLSSMVTVPSSRWLSDTFTCNVAHPPSNTKVDKTVRKTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLWDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRWSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPE- Sequência da cadeia pesada felinizada do clone de anticorpo de camundongo M14
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PENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRS- HWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK
36 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSL- GQRATISCRASESVDTYGNS- FMHWYQQKSGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGS- RTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGT- KLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNN- FYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSK- DSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPI- VKSFNRNEC Sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo de camundongo M14
37 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPAS- LAVSPGQRATISCRASESVDTYGNSFIHWYQQK- PGQSPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTIN- PVETDDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRADAAP- TVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKID- GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYE- RHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC Sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo de camundongo Ml 8
38 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSL- GQ RATIS C RAS E SVDT YGN S FMHWYQQ K- PGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTIN- PVEADDIATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRADAAP- TVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKID- GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYE- RHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC Sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo de camundongo Ml 9
39 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDA- ATYYCQHIRELTRS FGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPP SSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC Sequência de aminoácidos da cadeia leve do clone de anticorpo de camundongo M87
64 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPAS- LAVSPGQRATISCRASESVDTYGNSFIHWYQQK- PGQSPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTIN- PVETDDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIK Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável do clone de anticorpo de camundongo Ml 8
65 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSL- GQ RAT IS C RAS E S VDT YGN S FMHWYQQ K- PGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTIN- PVEADDIATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIK Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável do clone de anticorpo de camundongo M19
66 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSL- GQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPR- LLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDA- ATYYCQHIRELTRS FGGGTKLEIK Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável do clone de anticorpo de camundongo M87
40 MAVLGLLLCLVTFPSCVLSEVQLQESGPSLVKPSQTLS- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYM- GYISYSGITDYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVT- TEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTSVTVSSAK- TTPPSVYPLAPGS Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e de dobradiça do clone de anticorpo de camundongo M14
41 MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLQESGPSLVKPSQTLS- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYM- GYISYSGITDYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVT- TEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTSVTVSSAK- TTPPSVYPLAPGS Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e de dobradiça do clone de anticorpo de camundongo Ml 8
42 MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLQESGPSLVKPSQTLS- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNELEYM- GYISYSGITYYNPSLKSRFSITRDTSKNQYYLQLNSVT- TEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTSVTVSSAK- Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e de dobradiça do clone de anticorpo de camundongo Ml9
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TTPPSVYPLAPGS
43 MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVKLVESGGGLVQPGGSLR- LSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIRN- KANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAE- DSATYYCARDYYGSCFDYWGQGTTLTVSSAK- TTPPSVYPLAPGS Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e de dobradiça do clone de anticorpo de camundongo M87
67 MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLQESGPSLVKPSQTLS- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYM- GYISYSGITDYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVT- TEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTSVTVSS Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável do clone de anticorpo de camundongo Ml8
68 MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLQESGPSLVKPSQTLS- LTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNELEYM- GYISYSGITYYNPSLKSRFSITRDTSKNQYYLQLNSVT- TEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTSVTVSS Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável do clone de anticorpo de camundongo M19
69 MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVKLVESGGGLVQPGGSLR- LSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIRN- KANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAE- DSATYYCARDYYGSCFDYWGQGTTLTVSS Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável do clone de anticorpo de camundongo M87
44 SSHMAPTHQLPPSDVRKIILELQPLSRGLLEDYQK- KETGVPESNRTLLLCLTSDSQPPRLNSSAILPYFRAIR- PLSDKNIIDKIIEQLDKLKFQHEPETEISVPADT- FECKSFILTILQQFSACLESVFKSLNSGPQ Sequência de aminoácidos da IL31 canina madura
45 PSDXiX2KI, onde Xi e X2 são quaisquer aminoácidos; ou onde Xi é um aminoácido hidrofóbico, ou onde Xi é selecionado de A, V, I e L, ou onde Xi é selecionado de V e I; e onde X2 é um aminoácido hidrofílico, ou onde X2 é selecionado de A, R, K, Q e N; ou onde X2 é selecionado de R e Q. Epítopo da IL31
88 PSDVRKI Epítopo da IL31 canina alternativo
46 MASHSGPSTSVLFLFCCLGGWLASHTLPVRLLRPS- DDVQKIVEELQSLSKMLLKDVEEEKGVLVSQNYTLPCLSPDAQPPNNIHSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQFSECMDLALKSLTSGAQQATT Sequência de aminoácidos percursores da IL31 humana NCBI ref: NP 001014358.1
47 MLSHAGPARFALFLLCFMGTSLTSQTAPIHQLHPSDVRKIILELQPLSKGLLEDYLKKEMGVPESNHFLLPCLTSDSQPPRINSSAILPYFRAIRPLSDKNTINKIIEQLDKLKFQHEPETEVSVPADTFESKSFI- LAILQQFSACLDHVFKSLNPGPQQVMQGHLIEPIPSGTADV Sequência de aminoácidos da IL31 de morsa prevista NCBI ref: XP 004395998.1 [odobenus rosmarus divergens]
48 ML SHAGPARFAL FLLC FMGT SLT SQTAPIHQLHPSDVRKIILELQPLSKGLLEDYLKKEMGVPESNHFLLPCLTSDSQPPRINSSAILPYFRAIRPLSDKNTINKIIEQLDKLKFQHEPETEVSVPADTFESKSFILAILQQFSACLDHVFKSLNPGPQQVMQGHLIEPIPSGTADVGS GSHHHHHH Mors a_IL31 _Hi s 6
49 MASHSGPATSVLFLLCCLGGWLTSHTLPVHFLQPSDI- QKIVEELQSLSKMLLKDVKEDKGVLVSQNYTLPCLTP- DAQPPNIIHSPAIRAYLKTIRELDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQFSECMDLALKSLTSGAQQATT Sequência de aminoácidos da IL31 de babuíno-anúbis prevista NCBI ref: XP 003907358.1 [papio anubis]
50 MASHSGPATSVLFLLCCLGGWLTSHTLPVHFLQPSDI- QKIVEELQSLSKMLLKDVKEDKGVLVSQNYTLPCLTP- DAQPPNIIHSPAIRAYLKTIRELDNKSVIDEIIEHLD- KLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQ FS ECMDLALKSLTS GAQQATT GSGSHHHHHH babuíno-anúbis_IL31 _Seu6
51 MLSRAVPAGFALFLLCYMETLLTSHTAPTHRLPPSDVRKIILELQPLSKGLLEDYLKKETGLPESNHSLVPCLTSDSEAPHINSSAILPYFRAIRPLSDKNVIDKIIEQLDKLKFQHEPETEVSVPADTFEGKSFILTILQQFSACLER- VFKSLNPGAQ Sequência de aminoácidos da IL31 de urso polar prevista NCBI ref: XP 008687166.1 [ursus maritimus]
52 MLSHAGPARFALFLLCFMETSLTSQTVPIHQLQPSDVR- KIILELQPLSKGLLEDYLKKEMGVPESNHFLLPCLTS- DSQPPRINSSAILPYFRAIRPLSDKNIINKIIEQLDKLKFQHEPETEVSVPADTFESKSFILTILQQFSACLGHVLKSLNPGPQQVMQGHLAKPIPSGTADMYETLRHHH Sequência de aminoácidos da IL31 de foca-de-weddell prevista NCBI ref: XP 006746595.1 [leptonychotes weddellii]
53 MLSHAGPARFALFLLCCMETLLPSHMAPTHRLQPSDVRKIILELRPMSKGLLQDYLKKEMGLPESNHSSLPCLSSDSQLPHINGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKFQREPEAEVSMPADNFERKNFILAVLQQFSACLEHVLQSLNSGPQ Sequência de aminoácidos da IL31 de tigre-siberiano prevista NCBI ref: XP 007079636.1 [panthera tigris altaica]
54 MLSHAGPARFALFLLCCMETLLPSHMAPTHRLQPSDVRKIILELRPMSKGLLQDYLKKEMGLPESNHSSLPCLSSDSQLPHINGSAILPYFRAIRPLSDKNTIDKIIEQLDKLKFQREPEAEVSMPADNFERKNFILAVLQQFSACLEHVLQSLNSGSQ Sequência de aminoácidos da IL31 de guepardo prevista NCBI ref: XP 014919275.1 [acinonyx jubatus]
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55 MASHSGPATSVLFLLCCLGGWLTSHTLPVHFLQPSDI- QKIVEELQSLSKMLLKDVKEDKGVLVSQNYTLPCLTP- DAQPPNIIHSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQFSECMDLALKSLTSGAQQATT Sequência de aminoácidos da IL31 de macaco fascicularis prevista GenBank ref: EHH66805.1 [macaca fascicularis]
56 GPATSVLFLLCCLGGWLTSHTLPVHFLQPSDIQKIVE- ELQSLSKMLLKDVKEDKGVLVSQNYTLPCLTP- DAQPPNIIHSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLD- KLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQFSECMDLALKSLTSGAQQATT Sequência de aminoácidos da IL31 de macaco rhesus prevista GenBank ref: EHH21279.1 [macaca mulata]
57 MASHSGPATSVLFLLCCLGGWLTSHTLPVHFLQPSDI- QKIVKELQSLSKMLLKDVKEDKGVLVSQNYTLPCLTP- DAQPPNIIHSPAIRAYLKTIRQLDNRSVIDEIIEHLD- KLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQFSECMDLALKSLTSGAQQATT Sequência de aminoácidos da IL31 de drill prevista NCBIref: XP_011819882.1 [mandrillus leucophaeus]
58 MASHSGPATSVLFLLCCLGGWLTSHTLPVHFLQPSDI- QKIVEELQSLSKMLLKDVKEDKGVLVSQNYKLPCLTP- DAQPPNIIHSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQFSECMDLALKSLTSGAQQATT Sequência de aminoácidos da IL31 de macaco-verde prevista NCBIref: XP 008003211.1 [chlorocebus sabaeus]
59 MASHSGPATSVLFLLCCLGGWLTSHTLPVHFLQPSDI- QKIVEELQSLSKMLLKDVKEDKGVLVSQNYTLPCLTP- DAQPPNIIHSPAIRAYLKTIRQLDNRSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQFSECMDLALKSLTSGAQQATT Sequência de aminoácidos da IL31 de macaco cercocebus atys NCBIref: XP_011926625.1 [cercocebus atys]
60 MASHSGPTTSVLFLLCCLGGWLTSHTLPVHFLRPSDI- QKIVEELQSLSKMLLKDVEEDKGVLVSQNYTLPCLTP- DAQPPNIIHSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLD- KLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTIS- QQFSECMDLALKSLTSGAQQATT Sequência de aminoácidos da IL31 de macaco-dourado prevista NCBI ref: XP 010366647.1 [rhinopithecus roxellana]
61 MIFHTGTTKPTLVLLCCIGTWLATCSLSFGAPISKEDLRTTIDLLKQESQDLYNNYSIKQASGMSADESIQLPCFSLDREALTNISVIIAHLEKVKVLS ENTVDT SWVIRWLT- NISCFNPLNLNISV- PGNTDESYDCKVFVLTVLKQFSNCMAELQAKDNTTC Sequência de aminoácidos percursores da IL31 murino NCBI ref: NP 083870 [mus musculus]
DESCRIÇÃO DE CERTAS MODALIDADES [59] São fornecidos anticorpos que ligam IL31 canina, IL31 felina ou IL31 equina. Também são fornecidas cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos que são capazes de formar anticorpos que se ligam à IL31. Além disso, são fornecidos anticorpos, cadeias pesadas e cadeias leves compreendendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) específicas. São fornecidos polinucleotídeos de codificação de anticorpos à IL31 canina. Métodos de produção ou purificação de anticorpos para IL31 canina também são fornecidos. São fornecidos métodos de tratamento utilizando anticorpos para IL31 canina. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos de tratamento de condições induzidas por IL31 em de espécies de animal de estimação. Métodos de detecção de IL31 em uma amostra de uma espécie de animal de estimação são fornecidos.
[60] Para conveniência do leitor, são fornecidas as seguintes definições de termos usados aqui.
[61] Como usado aqui, os termos numéricos como Kd são cal-
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18/79 culados com base em medições científicas e, portanto, estão sujeitos a erros de medição adequados. Em alguns casos, um termo numérico pode incluir valores numéricos que são arredondados para o valor significativo mais próximo.
[62] Como usado aqui, um/uma, o/a” significa ao menos um ou um ou mais salvo indicação ao contrário. Como usado aqui, o termo ou significa e/ou, salvo indicação ao contrário. No contexto de uma reivindicação dependente múltipla, o uso de ou quando referindo-se de volta a outras reivindicações refere-se a essas reivindicações na alternativa apenas.
Anticorpos anti-IL31 [63] Novos anticorpos dirigidos contra a IL31 são fornecidos, por exemplo, anticorpos que se ligam à IL31 canina, IL31 felina, e/ou IL31 equina. Anticorpos anti-IL31 fornecidos aqui incluem, mas não estão limitados a, anticorpos monoclonais, anticorpos de camundongo, anticorpos quiméricos, anticorpos caninizados, anticorpos felinizados e anticorpos equinizados. Em algumas modalidades, um anticorpo antiIL31 é um anticorpo monoclonal de camundongo isolado como M14, M18, M19e M87.
[64] Anticorpos monoclonais M14, M18, M19 e M87 foram isolados da seguinte forma. Brevemente, camundongos foram imunizados com IL31 canina e clones de anticorpo monoclonal de camundongo foram obtidos através de tecnologia de hibridoma padrão. Ensaio imunoabsorvente de ligação enzimática (ELISA) foi utilizado para a triagem de clones de hibridoma produzindo anticorpos de ligação da IL31. Baseado em afinidade de ligação e um ensaio funcional baseado em célula descrito aqui, os clones de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais M14, M18, M19 e M87 foram selecionados para uma investigação mais aprofundada. A cadeia pesada variável (VH) e cadeia leve variável (VL) de cada um dos quatro clones foram sequenciadas e
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19/79 analisadas pelo alinhamento de sequência (Figura 1).
[65] Também são fornecidas aqui sequências de aminoácidos de anticorpo monoclonal M14. Por exemplo, são fornecidas CDRs de cadeia pesada variável (SEQ ID NOs: 1-3; SEQ ID NO: 89 é uma definição alternativa para CDR-H2), CDRs de cadeia leve variável (SEQ ID NOs: 8-10), sequências de arcabouço da cadeia pesada da região variável (SEQ ID NOs: 4-7), e sequências de arcabouço da cadeia leve da região variável (SEQ ID NOs: 11-14) para o anticorpo monoclonal M14. As sequências de aminoácidos da cadeia leve variável, cadeia leve, cadeia pesada variável e cadeia pesada variável e de dobradiça do anticorpo monoclonal M14 são fornecidas (SEQ ID NOs: 24, 36, 25 e 40, respectivamente).
[66] Além disso, as sequências de aminoácidos das CDRs, sequências de arcabouço, cadeia leve variável, cadeia pesada variável de anticorpos monoclonais M18, M19 e M87 são fornecidas (Ver, por exemplo, Figura 1). São fornecidas CDRs de cadeia pesada variável (SEQ ID NOs: 1-3; SEQ ID NO: 89 é uma definição alternativa para CDR-H2), CDRs de cadeia leve variável (SEQ ID NOs: 8-10), cadeia leve variável (SEQ ID NO: 65), cadeia leve (SEQ ID NO: 38), cadeia pesada variável e de dobradiça (SEQ ID NO: 42) e cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 68) para o anticorpo monoclonal M19. São fornecidas CDRs de cadeia pesada variável (SEQ ID NOs: 1,62 e 3; SEQ ID NO: 87 é uma definição alternativa para CDR-H2), CDRs de cadeia leve variável (SEQ ID NOs: 63, 9 e 10), cadeia leve variável (SEQ ID NO: 64), cadeia leve (SEQ ID NO: 37), cadeia pesada variável e de dobradiça (SEQ ID NO: 41) e cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 67) para o anticorpo monoclonal M18. São fornecidas cadeia leve variável (SEQ ID NO: 66), cadeia leve (SEQ ID NO: 39), cadeia pesada variável e de dobradiça (SEQ ID NO: 43) e cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 69) para o anticorpo monoclonal M87.
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20/79 [67] Também são fornecidos aqui anticorpos quiméricos, caninizados, felinizados e equinizados derivados de anticorpo monoclonal M14, M18, M19 e M87. Em algumas modalidades, são fornecidas sequências de aminoácidos do anticorpo monoclonal M14 caninizado, como as SEQ ID NOs: 15-21 e 70-78. Em algumas modalidades, são fornecidas sequências de aminoácidos de anticorpos felinizados derivados do anticorpo monoclonal M14, como as SEQ ID NOs: 32-35 e 79-86. Em algumas modalidades, são fornecidas sequências de aminoácidos de anticorpos quiméricos do anticorpo monoclonal M14, como as SEQ ID NOs: 26, 27, 30 e 31.
[68] O termo anticorpo aqui é usado em sentido amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não limitado a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecifico (como engajadores de células T biespecíficos) e anticorpos triespecíficos), e fragmentos de anticorpos (como Fab, F(ab')2, ScFv, minicorpo, diacorpo, triacorpo e tetracorpo) desde que eles apresentam a atividade de ligação ao antigeno desejada. Espécies canina, felina e equina têm diferentes variedades (classes) de anticorpos que são compartilhados por muitos mamíferos.
[69] O termo anticorpo inclui, mas não está limitado a, fragmentos que são capazes de se ligar a um antigênio, como Fv, Fv de cadeia única (scFv), Fab, Fab’, di-scFv, sdAb (anticorpo de domínio único) e (Fab’)2 (incluindo um F(ab')2 quimicamente ligado). Digestão de papaína dos anticorpos produz dois fragmentos de ligação a antigeno idênticos, chamados de fragmentos Fab, cada um com sítio de ligação ao antigeno único, e um fragmento Fc residual, cujo nome reflete sua capacidade de se cristalizar prontamente. Tratamento de pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação do antigeno e ainda é capaz de ligação cruzada do antigeno. O termo anticorpo também inclui, mas não está limitado a, anticorpos quiméricos,
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21/79 anticorpos humanizados, e anticorpos de várias espécies, como camundongo, humano, macaco cynomolgus, caninos, felinos, equinos, etc. Além disso, para todas as construções de anticorpo fornecidas aqui, variantes tendo as sequências de outros organismos também são contempladas. Sendo assim, se uma versão murina de um anticorpo é revelada, um profissional versado na técnica compreenderá como transformar o anticorpo baseado na sequência murina em uma sequência de gato, cão, cavalo, etc. Fragmentos de anticorpos também incluem orientação de scFvs de cadeia única, di-scFv tandem, diabodies, tri-sdcFv tandem, minicorpos, fragmentos de anticorpos, etc. Fragmentos de anticorpos também incluem nanocorpos (sdAb, um anticorpo tendo um único domínio monomérico, como um par de domínios variáveis de cadeias pesadas, sem uma cadeia leve). Um fragmento de anticorpo pode ser referido como sendo uma espécie específica em algumas modalidades (por exemplo, scFv de camundongo ou um scFv canino). Isto denota as sequências de pelo menos parte das regiões não CDR, em vez de a fonte da construção. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem um marcador ou são conjugados a uma segunda porção.
[70] Os termos marcador e marcador detectável significa uma porção acoplada a um anticorpo ou seu analito para gerar uma reação (por exemplo, ligação) entre os membros do par de ligação específico detectável. O membro marcado do par de ligação específico é referido como rotulado de forma detectável. Assim, o termo proteína rotulada de forma detectável refere-se a uma proteína com um marcador incorporado que fornece a identificação da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o marcador é um marcador detectável que pode produzir um sinal que é detectável por meios visuais ou instrumentais, por exemplo, como a incorporação de um aminoácido radiomarcado ou fixação a um polipeptideo de porções de biotinila que po
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22/79 dem ser detectados por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática, que pode ser detectada por métodos colorimétricos ou ópticos). Exemplos de marcadores de polipeptídeos incluem, mas não estão limitados a, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 1111n, 1251, 1311, 177Lu, 166Ho ou 153Sm), cromogênios, marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimiluminescentes, grupos biotinila, epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par com zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo), e agentes magnéticos, como quelatos de gadolínio. Exemplos representativos de marcadores comumente empregados para os imunoensaios incluem porções que produzem luz, por exemplo, compostos de acridínio, e porções que produzem fluorescência, por exemplo, fluoresceína. Neste contexto, a porção em si não pode ser marcada de forma detectável, mas pode tornar-se detectável após reação com uma outra porção.
[71] O termo anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpo policlonal que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre o antígeno. Assim, uma
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23/79 amostra de anticorpos monoclonais pode se ligar ao mesmo epítopo do antígeno. O modificador monoclonal” indica o caráter do anticorpo direcionado como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção de anticorpos por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos pelo método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante, como descrito na patente US No. 4.816.567. Os anticorpos monoclonais podem também ser isolados a partir de bibliotecas de fago gerado utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554, por exemplo.
[72] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal é um anticorpo de camundongo isolado selecionado dentre os clones M14, M18, M19e M87.
[73] Sequência de aminoácidos significa uma sequência de resíduos de aminoácidos em um peptídeo ou uma proteína. Os termos polipeptídeo e proteínas são usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a um comprimento mínimo. Tais polímeros de resíduos de aminoácidos podem conter resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais e incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, trímeros e multímeros de resíduos de aminoácidos. Tanto as proteínas de comprimento total como os seus fragmentos são abrangidos pela definição. Os termos também incluem modificações pósexpressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação, fosforilação e similares. Além disso, para efeitos da presente revelação, um polipeptídeo se refere a uma proteína que inclui modificações, como deleções, adições e substituições (geralmente conservadoras em natureza), para a sequência nativa, desde que a proteína
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24/79 mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser deliberadas, como através da mutagênese sítio- dirigida, ou pode ser acidental, como por meio de mutações de hospedeiros que produzem proteínas ou erros devido à amplificação da PCR.
[74] IL31, como usado aqui, refere-se a qualquer IL31 nativa que resulta da expressão e do processamento de IL31 em uma célula. O termo inclui IL31 de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos e macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos) e animais de estimação (por exemplo, cães, gatos e equinos), salvo indicação em contrário. O termo também inclui variantes de ocorrência natural da IL31, por exemplo, variantes de splice ou variantes alélicas.
[75] Em algumas modalidades, uma IL31 canina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, uma IL31 felina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, uma IL31 equina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, uma IL31 humana compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, uma IL31 de morsa compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47. Em algumas modalidades, uma IL31 murina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61. Em outras modalidades, a IL31 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 60.
[76] O termo domínio de ligação da IL31 de um anticorpo significa o domínio de ligação formado por uma cadeia leve e uma cadeia pesada de um anticorpo anti-IL31, que liga a IL31.
[77] Em algumas modalidades, o domínio de ligação da IL31 li
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25/79 ga a IL31 canina com maior afinidade do que liga a IL31 humana. Em algumas modalidades, o domínio de ligação da IL31 liga a IL31 de outros animais de estimação, como a IL31 felina ou IL31 equina. Em algumas modalidades, o domínio de ligação IL31 não liga a IL31 humana.
[78] Como usado aqui, o termo epítopo refere-se a um local em uma molécula-alvo (por exemplo, um antígeno, como uma proteína, um ácido nucleico, um carboidrato ou um lipídio) para a qual uma molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína estrutural contendo regiões de ligação ao anticorpo) se liga. Epítopos frequentemente incluem um agrupamento de superfície quimicamente ativa de moléculas como cadeias laterais de aminoácidos, polipeptídeos ou açúcar e têm características estruturais tridimensionais específicas bem como características de carga específicas. Epítopos podem ser formados tanto por resíduos contíguos ou não contíguos justapostos (por exemplo, aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, porção lipídica) da molécula alvo. Epítopos formados a partir de resíduos contíguos (por exemplo, porções de aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, lipídios) normalmente são mantidos em exposição a solventes de desnaturação enquanto epítopos formados por dobramento terciário normalmente são perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo pode incluir, mas não está limitado a, pelo menos 3 ou pelo menos 5 ou 8-10 resíduos (por exemplo, aminoácidos e nucleotídeos). Em alguns exemplos um epítopo é inferior a 20 resíduos (por exemplo, aminoácidos e nucleotídeos) de comprimento, menos de 15 resíduos ou menos de 12 resíduos. Dois anticorpos podem ligar o mesmo epítopo dentro de um antígeno caso apresentem ligação competitiva para o antígeno. Em algumas modalidades, um epítopo pode ser identificado por uma certa distância mínima para um resíduo CDR sobre a molécula de ligação ao antígeno.
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Em algumas modalidades, um epítopo pode ser identificado pela distância acima, e mais limitado aos resíduos envolvidos em uma ligação (por exemplo, uma ligação de hidrogênio) entre um resíduo de anticorpos e um resíduo de antígeno. Um epítopo pode ser identificado por várias varreduras, bem como, por exemplo, uma varredura de alanina ou arginina pode indicar um ou mais resíduos que a molécula de ligação ao antígeno pode interagir. A menos que explicitamente indicado, um conjunto de resíduos como um epítopo não exclui outros resíduos de ser parte do epítopo para um determinado anticorpo. Em vez disso, a presença de tal conjunto designa uma série mínima (ou conjunto de espécies) de epítopos. Assim, em algumas modalidades, um conjunto de resíduos identificados como um epítopo designa um epítopo mínimo de relevância para o antígeno, em vez de uma lista exclusiva de resíduos para um epítopo sobre um antígeno.
[79] Em algumas modalidades, o epítopo compreende a sequência de aminoácidos PSDX1X2KI (SEQ ID NO: 45), em que X é qualquer resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, X1 é um aminoácido hidrofóbico. Em algumas modalidades, X1 é selecionado de A, V, I e L. Em algumas modalidades, X1 é selecionado de V e I. Em algumas modalidades, X2 é um aminoácido hidrofílico. Em algumas modalidades, X1 é selecionado de A, R, K, Q e N. Em algumas modalidades, X1 é selecionado de R e Q. Em algumas modalidades, Xi é V e X2 é R. Em algumas modalidades, X1 é I e X2 é Q. Em algumas modalidades, 0 epítopo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88. Em algumas modalidades, 0 epítopo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, 0 epítopo está entre 34-50 aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, 0 epítopo compreende 34-50 aminoácidos da SEQ ID NO: 22.
[80] O termo CDR significa uma região determinante de com
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27/79 plementaridade definida por, pelo menos, uma forma de identificação para um profissional versado na técnica. Em algumas modalidades, as CDRs podem ser definidas de acordo com qualquer um dos sistemas de numeração de Chothia, sistema de numeração de Kabat, uma combinação de Kabat e Chothia, a definição de AbM, a definição de contato, ou uma combinação de definições de Kabat, Chothia, AbM ou contato. As várias CDRs dentro de um anticorpo podem ser designadas por seu respectivo número e tipo de cadeia, incluindo, sem limitação, como CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. O termo CDR é usado aqui para abranger também uma região hipervariável ou HVR, incluindo alças hipervariáveis.
[81] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma cadeia pesada compreendendo (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1); (b) uma CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 87, e (c) uma CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma cadeia leve compreendendo (a) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 63); (b) uma CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e (c) uma CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[82] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma cadeia pesada compreendendo (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1); (b) uma CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 89, e uma CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; e uma cadeia leve compreendendo (a) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
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NO: 8 ou 63; (b) uma CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e (c) uma CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[83] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma cadeia pesada compreendendo (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1); (b) uma CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62 ou 87, e uma CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; e uma cadeia leve compreendendo (a) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 63; (b) uma CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e (c) uma CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[84] O termo região variável conforme usado aqui refere-se a uma região compreendendo pelo menos três CDRs. Em algumas modalidades, a variável região inclui as três CDRs e, pelo menos, uma região de arcabouço (FR). Os termos região variável da cadeia pesada ou cadeia pesada variável são usados de forma intercambiável para se referir a uma região compreendendo ao menos três CDRs da cadeia pesada. Os termos região variável da cadeia leve ou cadeia leve variável são usados de forma intercambiável para se referir a uma região compreendendo ao pelo menos três CDRs da cadeia leve. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável ou cadeia leve variável compreende pelo menos uma região de arcabouço. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende, pelo menos, uma região de arcabouço da cadeia pesada selecionada de HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 e HC-FR4. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende, pelo menos, uma região de arcabouço de cadeia leve selecionada de LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 e LC-FR4. As regiões de arcabouço podem ser justapostas entre as CDRs da cadeia leve ou entre as
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CDRs da cadeia pesada. Por exemplo, um anticorpo pode incluir uma cadeia pesada variável com a seguinte estrutura: (HC-FR1)-(CDR-H1)(HC-FR2)-(CDR-H2)-(HC-FR3)-(CDR-H3)-(HC-FR4). Um anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável com a seguinte estrutura: (CDR-H1 )-(HC-FR2)-(CDR-H2)-(HC-FR3)-(CDR-H3). Um anticorpo pode incluir também uma cadeia leve variável com a seguinte estrutura: (LC-FR1 )-(CDR-L1 )-(LC-FR2)-(CDR-L2)-(LC-FR3)-(CDR-L3)-(LCFR4). Um anticorpo pode incluir também uma cadeia leve variável com a seguinte estrutura: (CDR-L1)-(LC-FR2)-(CDR-L2)-(LC-FR3)-(CDRL3).
[85] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma ou mais de (a) uma sequência de arcabouço da região variável da cadeia pesada 1 (HC FR1) da SEQ ID NO: 4, (b) uma sequência HC-FR2 da SEQ ID NO: 5, (c) uma sequência HC-FR3 da SEQ ID NO: 6, (d) uma sequência HC-FR4 da SEQ ID NO: 7, (e) uma sequência de arcabouço da região variável da cadeia leve 1 (LC-FR1) da SEQ ID NO: 11, (f) uma sequência LC FR2 da SEQ ID NO: 12, (g) uma sequência LC FR3 da SEQ ID NO: 13, ou (h) uma sequência LC-FR4 da SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma sequência da cadeia leve variável da (a) SEQ ID NO: 16, (b) SEQ ID NO: 24, ou (c) SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma sequência da cadeia pesada variável da (a) SEQ ID NO: 15; (b) SEQ ID NO: 25; ou (c) SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende (a) uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 16 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 15; (b) uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 24 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 25; ou (c) uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 32 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 33.
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30/79 [86] O termo região constante conforme usado aqui refere-se a uma região compreendendo pelo menos três domínios constantes. Os termos região constante da cadeia pesada ou cadeia pesada constante são usados de forma intercambiável para se referir a uma região compreendendo ao menos três domínios constantes da cadeia pesada CH1, CH2 e CH3. Regiões constantes da cadeia pesada exemplares não limitantes incluem γ, δ, α, ε e μ. Cada região constante da cadeia pesada corresponde a um isotipo de anticorpos. Por exemplo, um anticorpo compreendendo uma região constante γ é um anticorpo IgG, um anticorpo compreendendo uma região constante δ é um anticorpo IgD, um anticorpo compreendendo uma região constante α é um anticorpo IgA, um anticorpo compreendendo uma região constante μ é um anticorpo IgM e um anticorpo compreendendo uma região constante ε é um anticorpo IgE. Certos isotipos podem ser subdivididos ainda em subclasses. Por exemplo, anticorpos IgG incluem, mas não estão limitados a, anticorpos lgG1 (compreendendo uma região constante γ1), lgG2 (compreendendo uma região constante γ2), lgG3 (compreendendo uma região constante γ3), e lgG4 (compreendendo uma região constante γ4); anticorpos IgA incluem, mas não estão limitados a, anticorpos lgA1 (compreendendo uma região constante a1) e lgA2 (compreendendo uma região constante a2); e anticorpos IgM incluem, mas não estão limitados a, lgM1 e lgM2. Os termos região constante da cadeia leve ou cadeia leve constante são usados de forma intercambiável para se referir a uma região compreendendo um domínio constante da cadeia leve, CL. Regiões constantes da cadeia leve exemplares não limitantes incluem λ e k. Exclusões e alterações que não alteram a função dentro dos domínios estão compreendidas dentro do escopo do termo região constante, a menos que designado caso contrário. Caninos, felinos e equinos têm classes de anticorpos como IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. Dentro da classe de anticorpo IgG ca
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31/79 nino estão IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D. Dentro da classe de anticorpo IgG felino estão lgG1a, lgG1b e lgG2. Dentro da classe de anticorpo IgG equino estão IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG5, lgG6 e lgG7.
[87] O termo anticorpo quimérico ou quimérico refere-se a um anticorpo, em que uma parte da cadeia pesada ou da cadeia leve é derivada de uma fonte particular ou espécie, enquanto ao menos parte do restante da cadeia pesada ou da cadeia leve é derivada de uma fonte diferente ou espécie. Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo, compreendendo, pelo menos, uma região variável a partir de uma primeira espécie (como camundongo, rato, macaco cynomolgus, etc) e pelo menos uma região constante de uma segunda espécie (como humanos, cães, gatos, equinos, etc). Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico compreende pelo menos uma região variável do camundongo e pelo menos uma região constante do canino. Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico compreende pelo menos uma região variável do camundongo e pelo menos uma região constante do felino. Em algumas modalidades, todas as regiões variáveis de um anticorpo quimérico são de uma primeira espécie e de todas as regiões constantes do anticorpo quimérico são de uma segunda espécie. Em algumas modalidades, o anticorpo quimérico compreende uma região constante da cadeia pesada ou região constante da cadeia leve de um animal de estimação. Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico compreende cadeias pesada e leve variáveis de camundongo e cadeias pesada e leve constantes de animal de estimação. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode incluir cadeias pesada e leve variáveis de camundongo e cadeias pesada e leve constantes de canino; um anticorpo quimérico pode incluir cadeias pesada e leve variáveis de camundongo e cadeias pesada e leve constantes de felino, ou um anticorpo quimérico pode compreender cadeias pesada e leve variáveis de camundongo e cadeias
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32/79 pesada e leve constantes de equinos.
[88] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende um anticorpo quimérico compreendendo:
[89] a. (i) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 26; (ii) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 27; ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve como em (i) e uma sequência da cadeia pesada como em (ii); ou [90] b. (i) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 30; (ii) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 31; ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve como em (i) e uma sequência da cadeia pesada como em (ii).
[91] Um quimérico canino ou anticorpo quimérico canino refere-se a um anticorpo quimérico tendo pelo menos uma parte de uma cadeia pesada ou uma parte de uma cadeia leve proveniente de um cão. Um quimérico felino ou anticorpo quimérico felino refere-se a um anticorpo quimérico tendo pelo menos uma parte de uma cadeia pesada ou uma parte de uma cadeia leve proveniente de um gato. Um quimérico equino ou anticorpo quimérico equino refere-se a um anticorpo quimérico tendo pelo menos uma parte de uma cadeia pesada ou uma parte de uma cadeia leve proveniente de um cavalo. Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico canino compreende cadeias pesada e leve variáveis de camundongo e cadeias pesada e leve constantes de canino. Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico felino compreende cadeias pesada e leve variáveis de camundongo e cadeias pesada e leve constantes de felino. Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico equino compreende cadeias pesada e leve variáveis de camundongo e cadeias pesada e leve constantes de equino. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico compreendendo regiões de arcabouço de cadeia pesada variáveis murinas ou regiões de arcabouço de cadeia leve variáveis
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33/79 murinas.
[92] Um anticorpo canino, como usado aqui, abrange anticorpos produzidos em um canino; anticorpos produzidos em animais não caninos que compreendem genes da imunoglobulina canina ou compreendem peptídeos da imunoglobulina canina; ou anticorpos selecionados usando métodos in vitro, como exibição de fagos, onde o repertório de anticorpos é baseado em uma sequência de imunoglobulina canina. O termo anticorpo canino indica o gênero de sequências que são sequências de canino. Assim, o termo não está designando o processo pelo qual o anticorpo foi criado, mas o gênero de sequências que são relevantes.
[93] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma região constante da cadeia pesada de canino selecionada de uma região constante de IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 é um anticorpo IgG-A, IgG-B, IgG-C ou IgG-D de canino. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 é (a) um anticorpo IgG-A de canino compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17); (b) um anticorpo IgG-B de canino compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 18; e (c) um anticorpo IgG-C de canino compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19, e (d) um anticorpo IgG-D de canino compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 20.
[94] Um anticorpo felino, como usado aqui, abrange anticorpos produzidos em um felino; anticorpos produzidos em animais não felinos que compreendem genes da imunoglobulina felina ou compreendem peptídeos da imunoglobulina felina; ou anticorpos selecionados usando métodos in vitro, como exibição de fagos, onde o repertório de anticorpos é baseado em uma sequência de imunoglobulina felina. O termo anticorpo felino indica o gênero de sequências que são se
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34/79 quências de felino. Assim, o termo não está designando o processo pelo qual o anticorpo foi criado, mas o gênero de sequências que são relevantes.
[95] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma região constante da cadeia pesada de felino selecionada de uma região constante de lgG1, lgG2a e lgG2b. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 é um anticorpo lgG1, lgG2a ou lgG2b de felino.
[96] Um anticorpo equino, como usado aqui, abrange anticorpos produzidos em um equino; anticorpos produzidos em animais não equinos que compreendem genes da imunoglobulina equina ou compreendem peptídeos da imunoglobulina equina; ou anticorpos selecionados usando métodos in vitro, como exibição de fagos, onde o repertório de anticorpos é baseado em uma sequência de imunoglobulina equina. O termo anticorpo equino indica o gênero de sequências que são sequências de equino. Assim, o termo não está designando o processo pelo qual o anticorpo foi criado, mas o gênero de sequências que são relevantes.
[97] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma região constante da cadeia pesada de equino selecionada de uma região constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG5, lgG6 e lgG7. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 é um anticorpo lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG5, lgG6 e lgG7 de equino.
[98] Um anticorpo caninizado significa um anticorpo em que pelo menos um aminoácido em uma porção de uma região variável não canina foi substituído com o aminoácido correspondente de uma região variável canina. Em algumas modalidades, um anticorpo caninizado compreende pelo menos uma região constante canina (por exemplo, uma região constante γ, uma região constante a, uma região constante δ, uma região constante ε, uma região constante μ, ou etc)
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35/79 ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um anticorpo caninizado é um fragmento de anticorpo, como Fab, scFv, (Fab’)2, etc. O termo “caninizado” também denota formas de anticorpos não caninos (por exemplo, murinos) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina, ou seus fragmentos (como Fv, Fab, Fab’, F(ab')2, ou outras sequências de ligação ao antigeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não canina. Os anticorpos caninizados podem incluir imunoglobulinas caninas (anticorpo destinatário) em que os resíduos de uma CDR do destinatário são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não canina (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho tendo a especificidade do anticorpo desejada, afinidade e capacidade. Em alguns casos, os resíduos da região de arcabouço Fv (FR) da imunoglobulina canina são substituídos por resíduos não caninos correspondentes. Além disso, o anticorpo caninizado pode incluir os resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR importado ou sequências de arcabouço, mas estão incluídos para aperfeiçoar e otimizar o desempenho do anticorpo.
[99] Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de aminoácido em uma porção de uma cadeia pesada variável de camundongo ou uma cadeia leve variável de camundongo foi substituído com o aminoácido correspondente de uma região variável de canino. Em algumas modalidades, a cadeia modificada é fundida a uma cadeia pesada constante de canino ou uma cadeia leve constante de canino. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 é um anticorpo caninizado compreendendo (a) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 15, (b) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 17, (c) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 18, (d) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 19, (e) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 20, (f) uma sequência da cadeia leve
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36/79 da SEQ ID NO: 16, ou (g) uma sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 21.
[100] Um anticorpo felinizado significa um anticorpo em que pelo menos um aminoácido em uma porção de uma região variável de não felino foi substituído com o aminoácido correspondente de uma região variável de felino. Em algumas modalidades, um anticorpo felinizado compreende pelo menos uma região constante felinizada (por exemplo, uma região constante γ, uma região constante a, uma região constante δ, uma região constante ε, uma região constante μ, ou etc) ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um anticorpo felinizado é um fragmento de anticorpo, como Fab, scFv, (Fab’)2, etc. O termo “felinizado” também denota formas de anticorpos não felinos (por exemplo, murinos) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina, ou seus fragmentos (como Fv, Fab, Fab’, F(ab')2, ou outras sequências de ligação ao antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não felina. Os anticorpos felinizados podem incluir imunoglobulinas felinas (anticorpo destinatário) em que os resíduos de uma CDR do destinatário são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não felina (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho tendo a especificidade do anticorpo desejada, afinidade e capacidade. Em alguns casos, os resíduos da região de arcabouço Fv (FR) da imunoglobulina felina são substituídos por resíduos não felinos correspondentes. Além disso, o anticorpo felinizado pode incluir os resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR importado ou sequências de arcabouço, mas estão incluídos para aperfeiçoar e otimizar o desempenho do anticorpo.
[101] Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de aminoácido em uma porção de uma cadeia pesada variável de camundongo ou uma cadeia leve variável de camundongo foi substituído com
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37/79 o aminoácido correspondente de uma região variável de felino. Em algumas modalidades, a cadeia modificada é fundida a uma cadeia pesada constante de felino ou uma cadeia leve constante de canino. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 é um anticorpo felinizado compreendendo (a) uma sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 32, (b) uma sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 34, (c) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 33, ou (d) uma sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 35.
[102] Um anticorpo equinizado significa um anticorpo em que pelo menos um aminoácido em uma porção de uma região variável de não equino foi substituído com o aminoácido correspondente de uma região variável de equino. Em algumas modalidades, um anticorpo equinizado compreende pelo menos uma região constante equinizada (por exemplo, uma região constante γ, uma região constante a, uma região constante δ, uma região constante ε, uma região constante μ, ou etc) ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um anticorpo equinizado é um fragmento de anticorpo, como Fab, scFv, (Fab’)2, etc. O termo “equinizado” também denota formas de anticorpos não equinos (por exemplo, murinos) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina, ou seus fragmentos (como Fv, Fab, Fab’, F(ab')2, ou outras sequências de ligação ao antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não equina. Os anticorpos equinizados podem incluir imunoglobulinas equinas (anticorpo destinatário) em que os resíduos de uma CDR do destinatário são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não equina (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho tendo a especificidade do anticorpo desejada, afinidade e capacidade. Em alguns casos, os resíduos da região de arcabouço Fv (FR) da imunoglobulina equina são substituídos por resíduos não equinos correspondentes. Além disso, o anticorpo equinizado pode incluir os resí
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38/79 duos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR importado ou sequências de arcabouço, mas estão incluídos para aperfeiçoar e otimizar o desempenho do anticorpo.
[103] Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de aminoácido em uma porção de uma cadeia pesada variável de camundongo ou uma cadeia leve variável de camundongo foi substituído com o aminoácido correspondente de uma região variável de equino. Em algumas modalidades, a cadeia modificada é fundida a uma cadeia pesada constante de equino ou uma cadeia leve constante de canino.
[104] O termo IgX Fc significa que a região Fc é derivada de um isotipo de anticorpo específico (por exemplo, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, etc), onde X representa o isotipo do anticorpo. Assim, IgG Fc denota a região Fc de uma cadeia γ, IgA Fc denota a região Fc de uma cadeia a, IgD Fc denota a região Fc de uma cadeia δ, IgE Fc denota a região Fc de uma cadeia ε, IgM FC denota a região Fc de uma cadeia μ, etc. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG compreende CH1, dobradiça, CH2, CH3 e CL1. IgX-N-Fc indica que a região Fc é derivada de uma determinada subclasse do isotipo do anticorpo (como subclasse de IgG canina A, B, C ou D; subclasse de IgG felina 1,2a ou 2b; ou subclasse de IgG equina IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG5, lgG6 ou lgG7, etc), onde N denota a subclasse. Em algumas modalidades, as regiões IgX Fc ou IgX-N-Fc são derivadas de um animal de estimação, como um cão, um gato ou um cavalo. Em algumas modalidades, as regiões Fc de IgG são isoladas de cadeias pesadas γ de canino, como IgG-A, IgG-B, IgG-C ou IgG-D. Em alguns casos, as regiões Fc de IgG são isoladas de cadeias pesadas γ de felino, como lgG1, lgG2a ou lgG2b. Anticorpos compreendendo uma região Fc de IgG-A, IgG-B, IgG-C ou IgG-D podem proporcionar maior níveis de expressão em sistemas de produção de recombinação.
[105] O termo “afinidade refere-se à força da soma total de inte
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39/79 rações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antigeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidas na técnica, como, por exemplo, imunoblot, ELISA KD, KinEx A, interferometria de biocamada (BLI) ou dispositivos de ressonância de plásmon superficial.
[106] Os termos Kd, Kd” “Kd” ou valor de Kd como usado de forma intercambiável se referem à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno. Em algumas modalidades, o Kd do anticorpo é medido usando ensaios de interferometria de biocamada usando um biossensor, como um Octet® System (Pall ForteBio LLC, Fremont, CA) de acordo com as instruções do fornecedor. Brevemente, o antigeno biotinilado é ligado à ponta do sensor e a associação do anticorpo é monitorada por 90 segundos e a dissociação é monitorada por 600 segundos. O tampão para diluições e etapas de ligação é 20 mM fosfato, 150 mM NaCI, pH 7,2. Uma curva em branco somente do tampão é subtraída para corrigir qualquer desvio. Os dados são ajustados para um modelo de ligação 2:1 usando o software de análise de dados ForteBio para determinar a constante da taxa de associação (kon), constante da taxa de dissociação (koff) e a Kd. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a razão de koff/kon. O termo kon refere-se à taxa constante para associação de um anticorpo a um antigeno e o termo koff refere-se à taxa constante para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno.
[107] O termo liga para um antigeno ou epítopo é um termo que é bem compreendido na técnica, e métodos para determinar tal ligação também são bem conhecidos na técnica. Uma molécula é dita como
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40/79 exibindo ligação se ela reage, associa com, ou tem afinidade para uma determinada célula ou substância e a reação, associação, ou afinidade é detectável por um ou mais métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, imunoblot, ELISA KD, KinEx A, interferometria de biocamada (BLI) ou dispositivos de ressonância de plásmon de superfície ou etc.
[108] Ressonância de plásmon de superfície denota um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real por detecção de alterações nas concentrações de proteínas dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, utilizando o sistema BIAcore™ (BIAcore International AB, uma empresa GE Healthcare, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.). Para mais descrições, ver Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26.
[109] Interferometria de biocamada refere-se a uma técnica analítica ótica que analisa o padrão de interferência de luz refletida a partir de uma camada de proteínas imobilizadas em uma ponta do biossensor e uma camada de referência interna. Alterações no número de moléculas ligadas à ponta do biossensor causam mudanças no padrão de interferência que pode ser medido em tempo real. Um dispositivo exemplar não limitante para interferometria de biocamada é um sistema Octet® (Pall ForteBio LLC). Ver, por exemplo, Abdiche et al., 2008, Anal. Biochem. 377: 209-277.
[110] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL31 se liga à IL31 canina, IL31 felina ou IL31 equina com uma constante de dissociação (Kd) menor que 5 x 10-6 M, menor que 1 x 10-6 M, menor que 5 x IO 7 M, menor que 1 x 10-7 M, menor que 5 x 10-8 M, menor que 1x10’ 8 M, menor que 5 x 10-9 M, menor que 1 x 10-9 M, menor que 5 x 10 10 M, menor que 1 x 10 10 M, menor que 5 x 10-11 M, menor que 1 x 10 11 M, menor que 5 x 10-12 M, ou menor que 1 x 10-12 M, medida por interferometria de biocamada. Em algumas modalidades, um anticorpo an
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41/79 ti-IL31 se liga à IL31 canina, IL31 felina ou IL31 equina com uma Kd entre 5 x 10-6 M e 1 x 10-6 M, entre 5 x 10-6 M e 5 x 10-7 M, entre 5x10’ 6 M e 1 x 10’7 M, entre 5 x 10’6 M e 5 x 10’8 M, 5 x 10’6 M e 1 x 10’8 M, entre 5 x 10-6 M e 5 x 10-9 M, entre 5 x 10-6 M e 1 x 10-9 M, entre 5x10’ 6 M e 5 x 10 10 M, entre 5 x 10-6 M e 1 x 10 10 M, entre 5 x 10-6 M e 5 x 10-11 M, entre 5 x 10-6 M e 1 x 10-11 M, entre 5 x 10-6 M e 5 x 10-12 M, entre 5 x 10-6 M e 1 x 10-12 M, entre 1 x 10-6 M e 5 x 10-7 M, entre 1 x 10’6 M e 1 x 10’7 M, entre 1 x 10’6 M e 5 x 10’8 M, 1 x 10’6 M e 1 x 10’8 M, entre 1 x 10-6 M e 5 x 10-9 M, entre 1 x 10-6 M e 1 x 10-9 M, entre 1 x 10’6Me5x 10’1°M, entre 1 x 10’6Me 1 x 10’1°M, entre 1 x 10’6Me5 x 10’11 M, entre 1 X 10’6 M e 1 x 10’11 M, entre 1 x 10’6 M e 5 x 10’12 M, entre 1 x10'6Me1 x 10-12 M, entre 5 x 10-7 M e 1 x 10-7 M, entre 5 x 10-7 M e 5 x 10-8 M, 5 x 10-7 M e 1 x 10-8 M, entre 5 x 10-7 M e 5 x 10-9 M, entre 5 x 10-7 M e 1 x 10-9 M, entre 5 x 10-7 M e 5 x 10 10 M, entre 5 x 10 7 M e 1 x 10’10 M, entre 5 x 10-7 M e 5 x 10-11 M, entre 5 x 10-7 M e 1 x 10-11 M, entre 5 x 10-7 M e 5 x 10-12 M, entre 5 x 10-7 M e 1 x 10 12 M, entre 1 x 10-7 M e 5 x 10-8 M, 1 x10'7Me1 x 10-8 M, entre 1 x 10-7 M e 5 x 109 M, entre 1 x 10-7 M e 1 x 10-9 M, entre 1 x 10-7 M e 5 x 10’ 10 M, entre 1 x10'7Me1 x 10 10 M, entre 1 x 10-7 M e 5 x 10-11 M, entre 1 x 10’7 M e 1 x 10’11 M, entre 1 x 10’7 M e 5 x 10’12 M, entre 1 x 10’7 M e 1 x 10-12 M, entre 5 x 10-8 M e 1 x 10-8 M, entre 5 x 10-8 M e 5 x 10-9 M, entre 5 x 10-8 M e 1 x 10-9 M, entre 5 x 10-8 m e 5 x 10 10 M, entre 5 x 10’8 M e 1 x 10 10 M, entre 5 x 10-8 M e 5 x 10-11 M, entre 5 x 10-8 m e 1 x 10’11 M, entre 5 x 10’8 M e 5 x 10’12 M, entre 5 x 10’8 M e 1 x 10’12 M, 1 x 10’8 M e 5 x 10’9 M, entre 1 x 10’8 M e 1 x 10’9 M, entre 1 x 10’8 M e 5 x 10 10 M, entre 1 x10'8Me1 x 10 10 M, entre 1 x 10-8 M e 5 x 10-11 M, entre 1 x 10-8 m e 1 x 10-11 M, entre 1 x 10-8 M e 5 x 10-12 M, entre 1 x10'8Me1 x 10-12 M, entre 5 x 10-9 M e 1 x 10-9 M, entre 5 x 10-9 M e 5 x 10 10 M, entre 5 x 10-9 M e 1 x 10 10 M, entre 5 x 10-9 m e 5 x 10-11 M, entre 5 x 10-9 m e 1 x 10-11 M, entre 5 x 10-9 M e 5 x 10-12 M,
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42/79 entre 5 x 10-9 M e 1 x 10-12 m, entre 1 x 10-9 M e 5 x 10 10 M, entre 1 x 10’9 M e 1 x 10’1° M, entre 1 x 10’9 M e 5 x 10’11 M, entre 1 x 10’9 M e 1 x 10’11 M, entre 1 x 10’9 M e 5x 10’12 M, entre 1 x 10’9 M e 1 x 10’12 M, entre 5 x 10 10 M e 1 x 10 10 M, entre 5 x 10 10 M e 5 x 10-11 M, entre 1 x 10’1° M e 5x 10’11 M, 1 x 10’1° M e 1 x 10’11 M, entre 1 x 10’1° M e 5x 10’12 M, entre 1 x 10’1° M e 1 x 10’12 M, entre 5 x 10’11 M e 1 x 10’12 M, entre 5 x 10-11 M e 5 x 10-12 M, entre 5 x 10-11 M e 1 x 10-12 M, entre 1 x 10-11 M e 5x 10-12 M ou entre 1 x 10-11 M e 1 x 10-12 M, conforme medido por interferometria de biocamada. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 se liga à IL31 canina, IL31 felina ou IL31 equina, conforme determinado pela análise de imunoblot.
[111] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL31 não se liga à IL31 humana, conforme determinado por análise de imunoblot e/ou de interferometria de biocamada.
[112] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 é fornecido o qual compete com um anticorpo anti-IL31 descrito aqui (como M14, M18, M19 ou M87) para ligação à IL31. Em algumas modalidades, um anticorpo que compete com ligação com qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui pode ser feito ou usado. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL31 é fornecido o qual compete com o anticorpo monoclonal M14 na ligação à IL31 canina ou IL31 felina.
[113] Uma variante” significa um polipeptídeo biologicamente ativo com, pelo menos, cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência nativa de polipeptídeo depois de alinhar as sequências e introduzindo gaps, se necessário, para obter a máxima porcentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Tais variantes incluem, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, excluídos no Ne C- terminal do polipeptídeo.
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43/79 [114] Em algumas modalidades, uma variante tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos com polipeptídeo de sequência nativa.
[115] Como usado aqui, “porcentagem (%) de identidade de sequência do aminoácido” e “homologia” em relação a uma sequência de peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo são definidas como a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que é idêntica com os resíduos de aminoácidos em uma sequência específica de peptídeo, ou polipeptídeo, depois do alinhamento das sequências e introduzindo lacunas, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para efeitos de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, BLAST, BLAST-2, ALIGN ou MEGALINE™ (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o máximo alinhamento ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas.
[116] A substituição de um aminoácido pode incluir, mas não está limitada à, substituição de um aminoácido em um polipeptídeo com
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44/79 outro aminoácido. Substituições exemplificadoras são mostrados na Tabela 2. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para a atividade desejada, por exemplo, ligação mantida/melhorada do antígeno, imu nogenicidade diminuída ou ADCC ou CDC melhorada.
Tabela 2
Resíduo original Substituições exemplificadoras
Ala (A) Vai; Leu; Ile
Arg (R) Lys; Gin; Asn
Asn (N) Gin; His; Asp; Lys; Arg
Asp (D) Glu; Asn
Cys (C) Ser; Ala
Gin (Q) Asn; Glu
Glu (E) Asp; Gin
Gly (G) Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg
He (I) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina
Leu (L) Norleucina; He; Vai; Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg; Gin; Asn
Met (M) Leu; Phe; Ile
Phe (F) Trp; Leu; Vai; Ile; Ala; Tyr
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr
Thr (T) Vai; Ser
Trp(W) Tyr; Phe
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser
Vai (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina
[117] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades de cadeia lateral comum:
[118] (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;
[119] (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
[120] (3) ácido: Asp, Glu;
[121] (4) básico: His, Lys, Arg;
[122] (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro;
[123] (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[124] Substituições não conservativas implicarão na troca de um
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45/79 membro de uma dessas classes por outra classe.
[125] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que:
[126] a. a cadeia pesada compreende uma sequência de CDR-H1 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; uma sequência de CDRH2 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 87; e uma sequência de CDR-H3 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e [127] b. a cadeia leve compreende uma sequência de CDR-L1 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 63; uma sequência de CDR-L2 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; e uma sequência de CDR-L3 com, pelo menos, 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
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46/79 [128] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que:
[129] a. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou [130] b. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou [131] c. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou [132] d. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo me
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47/79 nos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou [133] e. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou [134] f. (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66; (ii) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii).
[135] O termo vetor é usado para descrever um polinucleotídeo que pode ser projetado para conter um polinucleotídeo ou polinucleotídeos clonados que podem ser propagados em uma célula hospedeira. Um vetor pode incluir um ou mais dos seguintes elementos: uma origem de replicação, uma ou mais sequências regulatórias (como, por exemplo, promotores ou potenciadores) que regulam a expressão do polipeptídeo de interesse, ou de um ou mais genes marcadores selecionáveis (como, por exemplo, genes de resistência a antibióticos e genes que podem ser usados em ensaios colorimétricos, por exemplo, β galactosidase). O termo vetor de expressão refere-se a um vetor
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48/79 que é usado para expressar um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira.
[136] Uma célula hospedeira refere-se a uma célula que pode ser ou foi um receptor de um vetor ou polinucleotídeo isolado. Células hospedeiras podem ser células procarióticas e células eucarióticas. Células eucarióticas exemplares incluem células de mamíferos, como células animais primatas ou não primatas; células fúngicas, como levedura; células vegetais; e células de inseto. Células de mamíferos exemplares não limitantes incluem, mas não se limitam a, células NSO, células PER.C6® (Crucell), 293 células e células CHO, e seus derivados, como células 293-6E, DG44, CHO-S e CHO-K. Células do hospedeiro incluem a progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento do DNA genômico) para a célula-mãe original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo(s) codificando uma sequência(s) de aminoácidos fornecido aqui.
[137] O termo isolado aqui refere-se a uma molécula que foi separada de pelo menos alguns dos componentes com s quais são normalmente encontrados na natureza ou produzidos. Por exemplo, um polipeptídeo é referido como isolado quando é separado de pelo menos alguns dos componentes da célula na qual foi produzido. Onde um polipeptídeo é secretado por uma célula depois de expressão, separando fisicamente o sobrenadante contendo o polipeptídeo produzido a partir da célula é considerado isolar o polipeptídeo. Da mesma forma, um polinucleotídeo é referido como isolado quando não é parte do maior polinucleotídeo (como, por exemplo, o DNA genômico ou o DNA mitocondrial, no caso de um polinucleotídeo do DNA) em que é normalmente encontrado na natureza, ou está separado de pelo menos alguns dos componentes da célula em que foi produzido, por
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49/79 exemplo, no caso de um polinucleotídeo de RNA. Assim, um polinucleotídeo de DNA que está contido em um vetor dentro de uma célula hospedeira pode ser referido como isolado. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL31 é purificado usando cromatografia, como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia em coluna de proteína A, cromatografia de interação hidrofóbica, e cromatografia CHT.
[138] O termo espécie de animal de estimação refere-se a um animal adequado para ser um companheiro para os seres humanos. Em algumas modalidades, uma espécie de animal de estimação é um pequeno mamífero, como um canino, felino, cão, gato, cavalo, coelho, furão, porquinho-da-índia, roedor, etc. Em algumas modalidades, uma espécie de animal de estimação é um animal de fazenda, como um cavalo, uma vaca, um porco, etc.
[139] O termo função de sinalização da IL31 refere-se a qualquer uma ou uma combinação das atividades a jusante que ocorrem quando a IL31 se liga ao seu receptor ou ao complexo de receptor. Em algumas modalidades, a função de sinalização da IL31 compreende a ativação de moléculas de sinalização de Janus quinase (Jak) 1 ou Jak
2. Em algumas modalidades, a função da sinalização da IL31 compreende a fosforilação das proteínas STAT-3 ou STAT-5. Em algumas modalidades, a função da sinalização da IL31 compreende a ativação da via de sinalização da quinase ERK1/2 MAP. Em algumas modalidades, a função da sinalização da IL31 compreende a ativação da via de sinalização da PI3K/Akt. Em algumas modalidades, a função da sinalização da IL31 compreende a ativação da via de sinalização da Jak1/2.
[140] Fosforilação STAT significa a modificação pós-expressão de uma proteína STAT por fosforilação. Por exemplo, fosforilação STAT-3 refere-se à fosforilação de STAT-3 e fosforilação STAT-5
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50/79 refere-se à fosforilação de STAT-5. Em algumas modalidades, a fosforilação de STAT-3 é medida pela análise de imunoblot. Por exemplo, células (por exemplo, células DH82 monocítica canina) estão plaqueadas em uma placa de cultura de células de 96 poços, a uma densidade de 1x105 células por poço em meio de crescimento (por exemplo, MEM, Life Technologies®) contendo 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor, 2 mmol/L GlutaMax, 1 mmol/L piruvato de sódio e 10 nm/mL interferon-c canino (R&D Systems, Mineápolis, MN, EUA) por 24 horas a 37°C na presença de anticorpo anti-IL31 conforme descrito aqui. A análise de imunoblot do lisado de células usando anticorpos anti-fosfo STAT-3 e anti-STAT-3 (R&D Systems) foi usada para detectar a concentração de STAT-3 e STAT-3 não fosforilado em relação uns aos outros e em relação a um controle beta-actina. Métodos para determinação da concentração de proteínas, quer qualitativa ou quantitativamente, por imunoblot são compreendidos por versados na técnica. Em algumas modalidades, a concentração relativa é determinada qualitativamente por inspeção visual do imunoblot. Em algumas modalidades, a concentração de STAT 3 fosforilado e STAT 3 não fosforilado é quantitativamente determinada por uma imagem digital do imunoblot, determinando a intensidade das bandas e, usando uma curva padrão linear de concentrações conhecidas de proteína STAT-3 para o cálculo de volta da concentração de STAT-3 fosforilado em uma amostra.
[141] Reduzir ou inibir significa diminuir, reduzir ou parar uma atividade, função ou quantidade em relação a uma referência. Em algumas modalidades, reduzir ou inibir significa a capacidade de causar uma diminuição global de 20% ou mais. Em algumas modalidades, reduzir ou inibir significa a capacidade de causar uma diminuição global de 50% ou mais. Em algumas modalidades, reduzir ou inibir significa a capacidade de causar uma diminuição global de
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75%, 85%, 90%, 95%, ou mais. Em algumas modalidades, a quantidade observada acima é inibida ou diminuída durante um período de tempo, em relação a uma dose de controle (como um placebo) durante o mesmo período de tempo. Uma referência, como usado aqui, refere-se a qualquer amostra, padrão ou nível que é usado para fins de comparação. Uma referência pode ser obtida a partir de uma amostra saudável ou sem doença. Em alguns exemplos, uma referência é obtida a partir de uma amostra sem doença ou não tratada de um animal de estimação. Em alguns exemplos, uma referência é obtida a partir de um ou mais animais saudáveis de uma determinada espécie, que não é o animal que está sendo testado ou tratado.
[142] O termo substancialmente reduzido, como usado aqui, denota um grau suficientemente elevado de redução entre um valor numérico e uma valor numérico de referência, de forma que um profissional versado na técnica iria considerar a diferença entre os dois valores de significância estatística no contexto da característica biológica medida pelos ditos valores. Em algumas modalidades, os valores numéricos substancialmente reduzidos são reduzidos por maior que cerca de qualquer um de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em relação ao valor de referência.
[143] Em algumas modalidades, um anticorpo IL31 pode reduzir a função de sinalização da IL31 em uma espécie de animais de estimação em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou 100% em relação a função de sinalização da IL31 na ausência do anticorpo, medido por uma redução na fosforilação de STAT-3. Em algumas modalidades, a redução na função de sinalização da IL31 ou a redução na fosforilação de
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STAT-3 está entre 10% e 15%, entre 10% e 20%, entre 10% e 25%, entre 10% e 30%, entre 10% e 35%, entre 10% e 40%, entre 10% e 45%, entre 10% e 50%, entre 10% e 60%, entre 10% e 70%, entre 10% e 80%, entre 10% e 90%, entre 10% e 100%, entre 15% e 20%, entre 15% e 25%, entre 15% e 30%, entre 15% e 35%, entre 15% e 40%, entre 15% e 45%, entre 15% e 50%, entre 15% e 60%, entre 15% e 70%, entre 15% e 80%, entre 15% e 90%, entre 15% e 100%, entre 20% e 25%, entre 20% e 30%, entre 20% e 35%, entre 20% e 40%, entre 20% e 45%, entre 20% e 50%, entre 20% e 60%, entre 20% e 70%, entre 20% e 80%, entre 20% e 90%, entre 20% e 100%, entre 25% e 30%, entre 25% e 35%, entre 25% e 40%, entre 25% e 45%, entre 25% e 50%, entre 25% e 60%, entre 25% e 70%, entre 25% e 80%, entre 25% e 90%, entre 25% e 100%, entre 30% e 35%, entre 30% e 40%, entre 30% e 45%, entre 30% e 50%, entre 30% e 60%, entre 30% e 70%, entre 30% e 80%, entre 30% e 90%, entre 30% e 100%, entre 35% e 40%, entre 35% e 45%, entre 35% e 50%, entre 35% e 60%, entre 35% e 70%, entre 35% e 80%, entre 35% e 90%, entre 35% e 100%, entre 40% e 45%, entre 40% e 50%, entre 40% e 60%, entre 40% e 70%, entre 40% e 80%, entre 40% e 90%, entre 40% e 100%, entre 45% e 50%, entre 45% e 60%, entre 45% e 70%, entre 45% e 80%, entre 45% e 90%, entre 45% e 100%, entre 50% e 60%, entre 50% e 70%, entre 50% e 80%, entre 50% e 90%, entre 50% e 100%, entre 60% e 70%, entre 60% e 80%, entre 60% e 90%, entre 60% e 100%, entre 70% e 80%, entre 70% e 90%, entre 70% e 100%, entre 80% e 90%, entre 80% e 100% ou entre 90% e 100%.
Composições farmacêuticas [144] Os termos formulação farmacêutica e composição farmacêutica referem-se a uma preparação que é de tal forma que permita a atividade biológica do(s) ingrediente(s) ativo(s) contido(s) nela para
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53/79 ser eficaz, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito para o qual a formulação deveria ser administrada.
[145] Um veículo farmaceuticamente aceitável refere-se a um veículo não tóxico, sólido, semissólido, ou carga líquida, diluente, material de encapsulação, formulação de material auxiliar, ou veículo convencional na técnica para uso com um agente terapêutico que, em conjunto, compõem uma composição farmacêutica para administração a um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável é não tóxico para destinatários nas doses e concentrações utilizadas e é compatível com outros ingredientes da formulação. O veículo farmaceuticamente aceitável é apropriado para a formulação empregada. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem alumina; estearato de alumínio; lecitina; proteínas séricas, como albumina sérica humana, albumina canina ou de outras animais; tampões como fosfato, citrato, trometamina ou HEPES; glicina; ácido sórbico; sorbato de potássio; misturas parciais de glicerídeo de ácidos graxos vegetais saturados; água; sais e eletrólitos, como o sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato dipotássio, cloreto de sódio, sais de zinco, silica coloidal, ou trissilicato de magnésio, pirrolidona de polivinila; substâncias, à base de celulose, polietileno glicol; sacarose; manitol; ou aminoácidos, incluindo, mas não limitado a, arginina.
[146] A composição farmacêutica pode ser armazenada na forma liofilizada. Assim, em algumas modalidades, a processo de preparação inclui a etapa de liofilização. A composição liofilizada pode então ser reformulada, tipicamente como uma composição aquosa adequada para administração parenteral, antes da administração ao cão, gato ou cavalo. Em outras modalidades, especialmente nos casos em que o anticorpo é altamente estável para desnaturação térmica e oxidativa, a composição farmacêutica pode ser armazenada como um líquido, ou
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54/79 seja, como uma composição aquosa, que pode ser administrada diretamente, ou com diluição adequada para o cão, gato ou cavalo. Uma composição liofilizada pode ser reconstituída com água estéril para injeção (WFI). Agentes antibacterianos, por exemplo, reagentes bacteriostáticos, como álcool benzílico, podem ser incluídos. Assim, a invenção fornece composições farmacêuticas em forma líquida ou sólida.
[147] O pH das composições farmacêuticas pode estar na faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8, quando administradas. As composições da invenção são estéreis, se elas não forem ser utilizadas para fins terapêuticos. A esterilidade pode ser obtida através de qualquer um dos vários meios conhecidos na técnica, incluindo por filtração através de membranas de filtração estéril (por ex., membranas de 0,2 micron). A esterilidade pode ser mantida com ou sem agentes antibacterianos.
[148] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 6,2, de 5,0 a 6,0 ou de 5,3 a 5,7. Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica tem um pH de 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1 ou 6,2.
[149] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende L histidina, cloreto de sódio e polissorbato 80.
[150] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende cloreto de sódio em uma concentração de 80 nM a 200 nM, de 100 nM a 180 nM, de 100 nM a 175 nM, de 110 nM a 170 nM, de 120 nM a 160 nM, de 120 nM a 150 nM, de 130 nM a 150 nM, de 130 nM a 160 nM, de 100 nM, de 80 nM, de 110 nM, de 120 nM, de 130 nM, de 140 nM, de 150 nM, de 160 nM, de 170 nM, de 180 nM, ou de 200 nM.
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55/79 [151] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende polissorbato 80 a uma concentração de 0,005 mg/mL a 0,5 mg/mL, de 0,01 mg/mL a 0,1 mg/mL, de 0,1 mg/mL a 0,5 mg/mL, de 0,005 mg/mL a 0,01 mg/mL, de 0,1 mg/mL, de 0,2 mg/mL, de 0,3 mg/mL, de 0,4 mg/mL, de 0,05 mg/mL, de 0,06 mg/mL, de 0,07 mg/mL, de 0,08 mg/mL, de 0,09 mg/mL ou de 0,1 mg/mL.
[152] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende L-histidina na concentração de 5 mM a 100 mM, de 10 mM a 50 mM, de 20 mM a 30 mM, de 10 mM a 30 mM, de 20 mM a 80 mM, de 30 mM a 70 mM, de 40 mM a 60 mM, de 10 mM, de 15 mM, de 20 mM, de 25 mM, de 30 mM, de 40 mM ou de 50 mM.
[153] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende o m-cresol ou álcool benzílico. Em algumas modalidades, a concentração de mcresol é de cerca de 0,2%, cerca de 0,1% a cerca de 0,3%, de cerca de 0,08% a cerca de 0,25%, ou de cerca de 0,05% a cerca de 0,25%. Em outras modalidades, a concentração de álcool benzílico é de cerca de 1 %, de cerca de 0,5% a cerca de 2%, de cerca de 0,2% a cerca de 2,5%, de cerca de 1% a cerca de 5%, de cerca de 0,5% a cerca de 5%, ou de cerca de 1 % a cerca de 3%.
[154] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende um açúcar. Em algumas modalidades, o açúcar é sacarose, trealose, D-manitol, maltose e/ou sorbitol. Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende um açúcar na concentração de 0,5% a 20%, de 1% a 10%, de 1% a 5%, de 1% a 3%, de 0,5%, de 1%, de 2%, de 3%, de 4%, de 5% ou de 10%.
[155] Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente
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56/79 aceitável ou a composição farmacêutica compreende um agente antibacteriano. Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende o m-cresol ou metilparabeno. Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende o m-cresol a 0,2%. Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável ou a composição farmacêutica compreende o metilparabeno a 0,9%.
Usos de anticorpos e composições farmacêuticas [156] Os anticorpos ou composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos da invenção podem ser úteis para o tratamento de uma condição induzida por IL-31. Como usado aqui, um uma condição induzida por IL31” significa uma doença associada, causada por, ou, caracterizada por níveis elevados ou gradientes alterados de concentração de IL31. Tais condições induzidas por IL31 incluem, mas não estão limitadas a, doença pruriginosa ou alérgica. Em algumas modalidades, a condição induzida por IL31 é dermatite atópica, prurido, asma, psoríase, escleroderma ou eczema. Uma condição induzida por IL31 pode ser exibida em um animal de estimação, incluindo, mas não limitada a, caninos, felinos ou equinos.
[157] Conforme usado neste documento, tratamento é uma abordagem para a obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados. Tratamento, conforme usado aqui, abrange qualquer administração ou aplicação de uma terapêutica para a doença em um mamífero, incluindo um animal de estimação. Para fins da revelação, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, qualquer um ou mais de: alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, prevenção ou retardamento da propagação da doença, prevenção ou retardamento da recorrência da doença, atraso ou diminuição da progressão da doença, melhoria do estado da doen
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57/79 ça, inibição da doença ou progressão da doença, inibição ou retardando da doença ou sua progressão, parar o seu desenvolvimento, e remissão (parcial ou total). Também abrangidas pelo tratamento é a redução de consequências patológicas de uma doença proliferativa. Os métodos fornecidos aqui contemplam um ou mais destes aspectos do tratamento. De acordo com o acima exposto, o tratamento não requer cem por cento a remoção de todos os aspectos da doença.
[158] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 ou composições farmacêuticas o compreendendo podem ser utilizadas de acordo com os métodos da presente invenção para tratar condições induzidas por IL31. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 ou composições farmacêuticas são administrados para um animal de estimação, como um canino, um felino ou um equino, para tratar uma condição induzida por IL31.
[159] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma substância/molécula, agonista ou antagonista pode variar de acordo com fatores como o tipo de doença a ser tratada, o estado da doença, a gravidade e o curso da doença, o tipo de propósito terapêutico, qualquer terapia anterior, a história clínica, a resposta ao tratamento anterior, o critério do veterinário em atendimento, idade, sexo e peso do animal e a habilidade da substância/molécula, agonista ou antagonista, para obter uma resposta desejada no animal. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos da substância/molécula, agonista ou antagonista são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aplicada em uma ou mais administrações. Uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessário, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado.
[160] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 ou a
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58/79 composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL31 é administrado parenteralmente, por administração subcutânea, infusão intravenosa ou injeção intramuscular. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 ou composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL31 é administrado como uma injeção em bolus ou em infusão contínua durante um período de tempo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL31 ou a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-IL31 é administrado por uma via intramuscular, intraperitonial, intracerebrospinal, subcutânea, intra-arterial, intrassinovial, intratecal ou inalação.
[161] Anticorpos anti-IL31 descritos aqui podem ser administrados em uma quantidade na faixa de 0,1 mg/kg de peso corporal de 100 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL31 podem ser administrados em uma quantidade na faixa de 0,5 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL31 podem ser administrados em uma quantidade na faixa de 1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL31 podem ser administrados em uma quantidade na faixa de 0,5 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, na faixa de 1 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, na faixa de 5 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, na faixa de 10 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, na faixa de 20 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, na faixa de 50 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, na faixa de 1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, na faixa de 5 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, na faixa de 0,5 Mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, ou na faixa de 5 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal.
[162] Um anticorpo anti-IL31 ou uma composição farmacêutica
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59/79 compreendendo um anticorpo anti-IL31 pode ser administrado a um animal de estimação, uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Por exemplo, um anticorpo anti-IL31 ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL31 pode ser administrado pelo menos uma vez, mais de uma vez, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes.
[163] Em algumas modalidades, a dose é administrada uma vez por semana, por pelo menos duas ou três semanas consecutivas e, em algumas modalidades, este ciclo de tratamento é repetido duas ou mais vezes, opcionalmente, intercalados com uma ou mais semanas sem nenhum tratamento. Em outras modalidades, a dose terapeuticamente eficaz é administrada uma vez por dia durante dois a cinco dias consecutivos e, em algumas modalidades, este ciclo de tratamento é repetido duas ou mais vezes, opcionalmente, intercalados com um ou mais dias ou semanas de tratamento.
[164] Administração em combinação com um ou mais agentes terapêuticos inclui administração simultânea (concomitantemente) e consecutiva ou sequencial em qualquer ordem. O termo concomitantemente é usado aqui para se referir a administração de dois ou mais agentes terapêuticos, onde pelo menos parte da administração se sobrepõe no tempo ou onde a administração de um agente terapêutico cai dentro de um curto período de tempo, em relação à administração do outro agente terapêutico. Por exemplo, os dois ou mais agentes terapêuticos são administrados com um tempo de separação não mais que cerca de um número determinado de minutos. O termo sequencial é usado aqui para se referir à administração de dois ou mais agentes terapêuticos, onde a administração de um ou mais agentes(s) continua após a interrupção da administração de um ou mais outro(s) agente(s), ou em que a administração de um ou mais agentes(s) co
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60/79 meça antes da administração de um ou mais outro(s) agente(s). Por exemplo, a administração de dois ou mais agentes terapêuticos são administrados com um tempo de separação de mais do que sobre um determinado número de minutos. Como usado aqui, junto com referese à administração de uma modalidade de tratamento além de uma outra modalidade de tratamento. Como tal, junto com refere-se a administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou após a administração de outra modalidade de tratamento para o animal.
[165] Em algumas modalidades, o método compreende administrar em combinação com um anticorpo anti-IL31 ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL31, um inibidor de Jak, um inibidor de PI3K, um inibidor de AKT ou um inibidor de MAPK. Em algumas modalidades, o método compreende administrar em combinação com um anticorpo anti-IL31 ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL31, um anticorpo antiIL17, um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-CD25, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti-IL13, um anticorpo anti-IL23, um anticorpo anti-lgE, um anticorpo anti-CD11a, um anticorpo anti-IL6R, um anticorpo anti-a4Integrina, um anticorpo anti-IL12, um anticorpo anti-ILip ou um anticorpo anti-BlyS.
[166] São fornecidos aqui métodos de exposição para uma célula um anticorpo anti-IL31 ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL31 em condições permissivas para a ligação do anticorpo à IL31. Em algumas modalidades, a célula é exposta ao anticorpo ou à composição farmacêutica ex vivo. Em algumas modalidades, a célula é exposta ao anticorpo ou à composição farmacêutica in vivo. Em algumas modalidades, uma célula é exposta ao anticorpo anti-IL31 ou à composição farmacêutica sob condições permissivas
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61/79 para a ligação do anticorpo à IL31 intracelular. Em algumas modalidades, uma célula é exposta ao anticorpo anti-IL31 ou à composição farmacêutica sob condições permissivas para a ligação do anticorpo à IL31 extracelular. Em algumas modalidades, uma célula pode ser exposta in vivo ao anticorpo anti-IL31 ou à composição farmacêutica por qualquer um ou mais dos métodos de administração descritos aqui, incluindo, mas não limitado a, injeção intraperitoneal, intramuscular, endovenosa ao indivíduo. Em algumas modalidades, uma célula pode ser exposta ex vivo ao anticorpo anti-IL31 ou à composição farmacêutica, expondo a célula a um meio de cultura compreendendo o anticorpo ou a composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a permeabilidade da membrana celular pode ser afetada pelo uso de qualquer número de métodos compreendido por aqueles versados na técnica (como a eletroporação de células ou expondo as células a uma solução contendo cloreto de cálcio) antes de expor a célula a um meio de cultura contendo o anticorpo ou a composição farmacêutica.
[167] Em algumas modalidades, a ligação resulta em uma redução da função de sinalização de IL31 pela célula. Em algumas modalidades, um anticorpo IL31 pode reduzir a função de sinalização da IL31 em uma célula em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou 100% em relação a função de sinalização da IL31 na ausência do anticorpo, medido por uma redução na fosforilação de STAT-3. Em algumas modalidades, a redução na função de sinalização da IL31 ou a redução na fosforilação de STAT-3 está entre 10% e 15%, entre 10% e 20%, entre 10% e 25%, entre 10% e 30%, entre 10% e 35%, entre 10% e 40%, entre 10% e 45%, entre 10% e 50%, entre 10% e 60%, entre 10% e 70%, entre 10% e 80%, entre 10% e 90%, entre 10% e 100%, entre 15% e
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20%, entre 15% e 25%, entre 15% e 30%, entre 15% e 35%, entre 15% e 40%, entre 15% e 45%, entre 15% e 50%, entre 15% e 60%, entre 15% e 70%, entre 15% e 80%, entre 15% e 90%, entre 15% e 100%, entre 20% e 25%, entre 20% e 30%, entre 20% e 35%, entre 20% e 40%, entre 20% e 45%, entre 20% e 50%, entre 20% e 60%, entre 20% e 70%, entre 20% e 80%, entre 20% e 90%, entre 20% e
100%, entre 25% e 30%, entre 25% e 35%, entre 25% e 40%, entre 25% e 45%, entre 25% e 50%, entre 25% e 60%, entre 25% e 70%, entre 25% e 80%, entre 25% e 90%, entre 25% e 100%, entre 30% e
35%, entre 30% e 40%, entre 30% e 45%, entre 30% e 50%, entre 30% e 60%, entre 30% e 70%, entre 30% e 80%, entre 30% e 90%, entre 30% e 100%, entre 35% e 40%, entre 35% e 45%, entre 35% e 50%, entre 35% e 60%, entre 35% e 70%, entre 35% e 80%, entre 35% e 90%, entre 35% e 100%, entre 40% e 45%, entre 40% e 50%, entre 40% e 60%, entre 40% e 70%, entre 40% e 80%, entre 40% e 90%, entre 40% e 100%, entre 45% e 50%, entre 45% e 60%, entre 45% e 70%, entre 45% e 80%, entre 45% e 90%, entre 45% e 100%, entre 50% e 60%, entre 50% e 70%, entre 50% e 80%, entre 50% e 90%, entre 50% e 100%, entre 60% e 70%, entre 60% e 80%, entre 60% e 90%, entre 60% e 100%, entre 70% e 80%, entre 70% e 90%, entre 70% e 100%, entre 80% e 90%, entre 80% e 100% ou entre 90% e 100%.
[168] São fornecidos aqui métodos para uso dos anticorpos antiIL31, polipeptídeos e polinucleotídeos para detecção, diagnóstico e monitoração de uma condição induzida por IL31. São fornecidos aqui métodos para determinar se um animal de estimação irá responder à terapia com anticorpo anti-IL31. Em algumas modalidades, o método compreende detectar se o animal tem células que expressam IL31 usando um anticorpo anti-IL31. Em algumas modalidades, o método de detecção compreende colocar a amostra em contato com um anti
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63/79 corpo, polipeptideo ou polinucleotídeo e determinar se o nível de ligação é diferente do nível de uma referência ou amostra de comparação (como um controle). Em algumas modalidades, o método pode ser útil para determinar se os anticorpos ou polipeptídeos descritos aqui são um tratamento adequado para o animal.
[169] Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra biológica. O termo amostra biológica significa uma quantidade de uma substância de uma coisa viva ou anteriormente viva. Em certas modalidades, a amostra biológica é uma célula ou um lisado de célula/tecido. Em algumas modalidades, a amostra biológica inclui, mas não está limitada a, sangue (por exemplo, sangue total), plasma, soro, urina, líquido sinovial e células epiteliais.
[170] Em algumas modalidades, as células ou o lisado de célula/ tecido são colocados em contato com um anticorpo anti-IL31 e a ligação entre o anticorpo e a célula é determinada. Quando as células de teste mostram atividade de ligação em comparação com uma célula de referência do mesmo tipo de tecido, pode indicar que o indivíduo podería se beneficiar de tratamento com um anticorpo anti-IL31. Em algumas modalidades, as células de teste são do tecido de um animal de estimação.
[171] Vários métodos conhecidos na técnica para a detecção de ligação anticorpo-antígeno específica podem ser usados. Os imunoensaios exemplares que podem ser realizados incluem imunoensaio de polarização de fluorescência (FPIA), imunoensaio de fluorescência (FIA), ensaio imunoenzimático (EIA), imunoensaio de inibição nefelométrica (NIA), ensaio imunoabsorvente de ligação enzimática (ELISA) e radioimunoensaio (RIA). Uma porção indicadora ou grupo marcador pode ser acoplado aos anticorpos do indivíduo e é selecionado de modo a atender às necessidades de diversos usos do método que são muitas vezes ditados pela disponibilidade de equipamento de ensaio e
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64/79 os procedimentos de imunoensaio compatíveis. Marcadores adequados incluem, sem limitação, radionuclídeo (por exemplo, 1251, 1311, 35S, 3H ou 32P), enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, luciferase ou p glactosidase), porções fluorescentes ou proteínas (por exemplo, fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, GFP ou BFP) ou porções luminescentes (por exemplo, nanopartículas Qdot™ fornecidas pela Quantum Dot Corporation, Paio Alto, Califórnia, EUA). Técnicas gerais a serem usadas na execução de diversos imunoensaios mencionados acima são conhecidas dos versados na técnica.
[172] Para fins de diagnóstico, o polipeptídeo incluindo os anticorpos podem ser marcados com uma porção detectável, incluindo, mas não limitada a, radioisótopos, marcadores fluorescentes e vários marcadores de enzima-substrato conhecidos na técnica. Métodos para conjugar marcadores a um anticorpo são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL31 não necessitam ser marcados, e a presença destes pode ser detectada usando um segundo anticorpo marcado ao primeiro anticorpo anti-IL31. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser empregado em qualquer método de ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitiva, ensaios diretos e indiretos do tipo sanduíche e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Os anticorpos anti-IL31 e polipeptídeos também podem ser usados para ensaios de diagnóstico in vivo, como imageamento in vivo. Geralmente, o anticorpo ou o polipeptídeo é marcado com um radionuclídeo (como, por exemplo, 1111n, 99Tc, 14C, 1311, 1251, 3H, ou qualquer outro radionuclídeo marcado, incluindo aqueles descritos aqui) de modo que as células ou tecidos de interesse possam ser localizados com imunoscintiografia. O anticorpo também pode ser usado como reagente de coloração em patologia usando técnicas
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65/79 bem conhecidas na área.
[173] Em algumas modalidades, um primeiro anticorpo é usado para um diagnóstico e um segundo anticorpo é usado como uma terapêutica. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo anticorpo são diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo anticorpo podem ambos se ligar ao antígeno ao mesmo tempo, ao se ligar a epítopos separados.
[174] Os exemplos a seguir ilustram aspectos específicos da revelação e não são de maneira nenhuma destinados a limitar a revelação.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Identificação de anticorpos monoclonais de camundongo que ligam à IL31 canina [175] A proteína IL31 que codifica o gene de IL31 canina (SEQ ID NO: 22) foi sintetizada com o marcador poli-His no terminal C e clonada em um vetor de expressão em mamíferos. O plasmídeo que carrega o gene de IL31 canina foi transfectado para 293 células.
[176] O sobrenadante contendo proteína IL31 canina foi coletado e filtrado. A IL31 canina foi purificada por afinidade usando a coluna de Ni-NTA (resina de afinidade da proteína A CaptivA®, Repligen).
[177] Anticorpos monoclonais de camundongo foram identificados usando imunização padrão com IL31 canino produzido por 293 células como imunógeno. Foram usados dois diferentes adjuvantes durante imunizações (soluções de anticorpo, Sunnyvale, CA) e anticorpos monoclonais foram obtidos por meio de tecnologia de hibridomas padrão. Ensaio imunoabsorvente de ligação enzimática (ELISA) foi desenvolvido para a triagem de clones que produzem anticorpos de ligação da IL31. Primeiro a IL31 de canino foi biotinilada e, em seguida, ela foi introduzida a poços revestidos de estreptavidina. Soro imunizado foi então adicionado aos poços, seguido de lavagem e detec
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66/79 ção com anticorpos anticamundongo conjugados com HRP. A presença de anticorpo ligado à IL31 de canino desenvolveu um sinal positivo. Dos milhares de clones testados por ELISA, 170 clones de maior afinidade de ligação baseada na intensidade de sinal foram selecionados para ensaios adicionais por ensaio de biossensor (Forte Bio Octet). IL31 canina biotinilada foi ligada à ponta do sensor e os sobrenadantes do clone de hibridoma contendo anticorpos anti-IL31 de canino foram selecionados com base em uma dissociação lenta (a taxa de dissociação entre anticorpo e ligante). A afinidade de ligação dos melhores 19 candidatos foi medida na concentração única e relatada como a constante de dissociação de equilíbrio (Kd) após as concentrações de anticorpos serem medidas por ensaio de titulação de proteína A usando Biosensor Octet. O Kds dos melhores 19 candidatos foram cada um menor que 10 nM.
[178] Além disso, cada um dos 170 clones com alta atividade de ligação com base em ELISA foi testado para atividade de neutralização. O ensaio funcional baseado em célula descrito abaixo no Exemplo 4 foi realizado para avaliar a atividade dos melhores candidatos na redução da sinalização pSTAT mediada por IL31 de canino usando células DH82 caninas. Quatro melhores clones (M14, M18, M19 e M87) foram selecionados para uma investigação mais aprofundada. Notadamente, a maioria dos ligantes de alta afinidade identificados por ELISA não eram funcionais.
Exemplo 2: Identificação de sequências de DNA codificando VH e VL de anticorpos monoclonais [179] Células de hibridomas produtoras de M14, M18, M19 e M87 foram peletizadas. O RNA foi extraído e oligonucleotídeos primers para amplificação de domínios variáveis de imunoglobulina (Ig) de camundongo foram utilizados para a obtenção de cDNA usando técnicas convencionais. A cadeia pesada variável (VH) e cadeia leve variável
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67/79 (VL) de cada um dos quatro clones foram sequenciadas e analisadas pelo alinhamento de sequência (Figura 1; SEQ ID NOs 36 a 43). Notadamente, três dos quatro anticorpos ativos (M14, M18 e M19) compartilham as mesmas seis sequências de CDR, com a exceção de que a CDR-L1 de M18 tem uma isoleucina na posição 14 (SEQ ID NO: 63), onde M14 e M19 têm uma metionina na posição 14 (SEQ ID NO: 8), e CDR-H2 de M18 tem uma tirosina na posição 9 (SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 87), onde M14 e M19 têm um ácido aspártico na posição 14 (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 89). A similaridade nas sequências de CDR sugere que a M14, M18 e M19 compartilham um epítopo comum.
Exemplo 3: Expressão e purificação de mAb IL31 caninizado e quimérico de murino canino M14 de células CHO [180] Sequências de DNA codificando um anticorpo quimérico foram concebidas para uma fusão de VH M14 murino (SEQ ID NO: 25) e VL de murino (SEQ ID NO: 24) para a cadeia pesada constante de canino e cadeia leve constante de canino. As sequências nucleotídicas foram sintetizados quimicamente e inseridas em um vetor de expressão adequado para a transfecção em células hospedeiras CHO. Após a transfecção em células CHO, a proteína de cadeia leve ou a cadeia pesada ou ambas eram secretadas da célula. Por exemplo, M14 quimérico que usa IgG-B canina foi purificado por cromatografia em coluna de proteína A de etapa única.
[181] VH e VL de M14 de murino foram caninizadas pesquisando e selecionando sequências de anticorpo de linha germinativa de canino adequada como um modelo para o enxerto de CDR, seguido pela modelagem de proteínas. IgG-B de M14 caninizada (SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 21) foi prontamente expressada e purificada em uma única etapa com uma coluna de proteína A ou outros métodos cromatográficos, como a cromatografia em coluna de troca iônica, cromatogra
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68/79 fia em coluna de interação hidrofóbica, cromatografia em coluna de modo misto como CHT ou cromatografia em coluna de modo multimodal como CaptoMMC. Baixo pH ou outra inativação viral e etapas de remoção viral podem ser aplicados. A proteína purificada é misturada com excipientes e esterilizada por filtração para preparar uma composição farmacêutica da invenção. A composição farmacêutica é administrada a um cão com dermatite atópica em uma quantidade suficiente para se ligar para inibir a IL31.
[182] Os vetores foram então usados para executar transfecção piloto em escala em células CHO-S usando o reagente de transfecção FreestyleMax™ (Life Technologies). O sobrenadante foi colhido por clarificação do meio condicionado. A proteína foi purificada com uma etapa de cromatografia de proteína A de passo único e usada para investigação posterior.
Exemplo 4: Demonstração da atividade de ligação da IL31 [183] Este exemplo demonstra que os anticorpos da invenção, ilustrados com ο M14 quimérico (SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27) e M14 caninizado (SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:21), se ligam a IL31 canina com requisito cinética para atividade terapêutica.
[184] A análise de ligação foi realizada utilizando um biosensor Octet da seguinte forma. Em resumo, a IL31 canina foi biotinilada em grupos amina primária usando EZ-LinkTM NHS-LC-Biotina (Thermo Scientific, Catálogo n.Q 21336) ou em grupos glicano usando EZLinkTM Biotina-LC-Hidrazida (ThermoFisher Scientific, Catálogo n.Q 21340), de acordo com as instruções do fabricante. A biotina não reagida livre foi removida da IL31 biotinilada por diálise extensiva. IL31 canina biotinilada foi capturada em pontas de sensor de estreptavidina. A associação de quatro concentrações diferentes (400, 200, 66,6 e 33 nM) do anticorpo M14 caninizado e quimérico e IL31 humana e canina (biotina conjugada com amina) e a associação de 100 nM de anticorpo
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M14 caninizado e IL31 canina (biotina conjugada com glicano) foram monitoradas por 90 segundos. A dissociação foi monitorizada por 600 segundos. Uma curva em branco somente do tampão foi subtraída para corrigir qualquer desvio. Os dados foram ajustados para um modelo de ligação 2:1 usando o software de análise de dados ForteBio™ para determinar a kon, koff e Kd. O tampão para todas as diluições e todas as etapas de ligação foi: 20 mM fosfato, 150 mM NaCI, pH 7,2.
[185] IL31 canina com marcador poliHis C-terminal foi expressada e purificada de células CHO S. A IL31 humana foi obtida a partir de Sino Biologicaland, biossensores de estreptavidina foram obtidos a partir de ForteBio (Cat. #18-509). As cinéticas de ligação foram da seguinte forma: Para o ligante IL31 canina (biotina conjugada com amina), a Kd (M) para M14 quimérica foi <1,0x10-11 (Figura 2) e <1,0x10-11 (Figura 3) para M14 caninizado. Para o ligante IL31 canina (biotina conjugada com glicano), a Kd (M) para M14 caninizado foi <1,0x10-12 e koff (1/s) foi <1,0x10’7.
[186] M14 quimérico e M14 caninizado não tinha nenhum sinal de ligação óbvio com a IL31 humana. Portanto, a Kd não podería ser medida.
Exemplo 5: Demonstração de que ο M14 inibe a sinalização da IL31 canina [187] Após a ligação ao seu receptor de IL31, IL-31 ativa as moléculas de sinalização Janus quinase (Jak) 1 e Jak2. Por sua vez, as Jaks ativadas estimulam a fosforilação de sinalização a jusante STAT3 e STAT-5. A análise imunoblot anti-fosfo-Stat3 foi usada para detectar a atividade anti-IL31 a partir de uma fração purificada da proteína A de meio de cultura livre de células (Gonzales et al. Vet Dermatol 2013; 24: 48-e12). Em resumo, as células DH82 monocítica canina (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) foram plaqueadas em placas de cultura de células de fundo plano de 96 poços, a uma
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70/79 densidade de 1x105 células por poço em meio de crescimento MEM (Life Technologies), contendo soro fetal bovino inativado por calor a 15%, 2 mmol/L GlutaMax, 1 mmol/L piruvato de sódio e 10 ng/mL interferon-c canino (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) por 24 h a 37°C. Neste experimento, a concentração de IL31 -Fc canino foi de 5 ng/mL (8 nM). Anticorpos anti-fosfo STAT-3 e anti-STAT-3 foram comprados de R&D Systems. Anticorpo anti-beta actina foi da SigmaAldrich. Como mostrado na Figura 4, a sinalização da IL31 canina diminuiu (como evidenciado por uma redução na fosforilação de STAT3) uma vez que a concentração do M14 caninizado exposto às células aumentou (linha 1: sem anticorpos anti-IL31; linha 2: 3,3 nM; linha 3:
6,6 nM; linha 4: 9,9 nM; e linha 5: 13,2 nM).
Exemplo 6: Identificação do epítopo de ligação da IL31 canina M14 [188] Para identificar o epítopo da IL31 canina reconhecido por M14, várias moléculas de fusão do fragmento da IL31 canina GST foram geradas e as proteínas foram expressadas intracelularmente em E. coli. Depois que as proteínas de fusão GST foram transferidas para uma membrana, ο M14 quimérico foi usado para sondar a membrana. Um sinal positivo resultou quando o fragmento de IL31 continha o epítopo.
[189] A Figura 5 combinada com a Figura 6 demonstrou que o M14 pode reconhecer o fragmento mínimo (SEQ ID NO: 23).
Exemplo 7: Demonstrando que ο M14 reage de forma cruzada com a IL31 felina [190] Para examinar se o anticorpo M14 felino reconhece a IL31 felina (SEQ ID NO: 28) ou IL31 equina (SEQ ID NO: 29), cada proteína foi fundida a Fc humana expressada em 293 células de mamíferos. As proteínas parcialmente purificadas foram transferidas para membrana e sondadas com anticorpo M14. O imunoblot da Figura 1 demonstra que ο M14 se liga à IL31 felina. O ensaio de imunoblot não detectou a
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71/79 ligação entre M14 e IL31 equina. No entanto, análise de interferometria de biocamada revelou que o anticorpo M14 se liga à IL31 equina, mas com menor afinidade. A medição da Kd preliminar usando a IL31 equina biotinilada imobilizada ao sensor revelou que a afinidade (Kd) é de cerca de 10 a 50 nM.
Exemplo 8: M14 felinizado [191] A cadeia leve variável foi felinizada como (SEQ ID NO: 32) e a cadeia pesada variável M14 foi felinizada como (SEQ ID NO: 33). Primeiro, as sequências variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de camundongo foram usadas para pesquisar variantes adequadas da VH e VL de felino. Estruturas de felino adequadas foram escolhidas para o enxerto das CDRs. Elas são ainda mais otimizadas usando modelagem estrutural. As VH e VL felinizadas foram fundidas para um dos domínios constante da cadeia pesada da IgG felina (CH1, CH2 e CH3) e domínio constante de cadeia leve felina (CL1).
[192] O anticorpo quimérico do M14 felino (SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31) ou anticorpo M14 felinizado (SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35) pode ser administrado a gatos para tratamento de uma condição induzida por IL31.
Exemplo 9: Identificação do epítopo de ligação da IL31 canina M14 [193] Para melhor identificar os resíduos de aminoácidos do epítopo da IL31 canina reconhecido por M14, várias moléculas de fusão do fragmento do epítopo da IL31 canina GST carregando mutações da alanina foram expressadas em E. coli. As Figuras 8 a 12 mostram imunoblots de mapeamento fino do epítopo da proteína de fusão GSTIL31 canina sondada com mAb IL31 anticanina (M14) ou M14 caninizado (painéis superiores) e anticorpo controle anti-GST (painéis inferiores). O fragmento do epítopo testado em cada linha é listado abaixo dos imunoblots. O nome do fragmento indica a faixa de aminoácidos da IL31 canina madura (SEQ ID NO: 44) testados e a posição da mu
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72/79 tação da alanina, se uma for incluída. Um sinal positivo resultou quando o fragmento de IL31 continha o epítopo do tipo selvagem, enquanto um sinal negativo resultou quando o fragmento de IL31 continha uma substituição de alanina um resíduo importante para interação anticorpo-ligante.
[194] Os resultados do estudo de mapeamento do epítopo são resumidos na Tabela 3 abaixo. Os resultados sugerem que P12, S13, D14 e K17 da IL31 canina madura (SEQ ID NO: 44) estão envolvidos na ligação do anticorpo M14 e que o R16 e 118 estão parcialmente envolvidos no reconhecimento de M14. Em resumo, os resultados deste estudo sugerem que o motivo de um polipeptídeo da IL31 que se liga às CDRs do anticorpo M14 é: PSDX1X2KI, onde Xi e X2 são variáveis (SEQ ID NO: 45).
Tabela 3.
Substituição de aminoácidos A substituição evita a ligação?
P12A Sim
S13A Sim
D14A Sim
V15A Não
RI 6 A Parcialmente
K17A Sim
I18A Parcialmente
I19A Não
L20A Não
Exemplo 10: M14 se liga especificamente a IL31 de outras espécies, tendo 0 motivo do epítopo PSDX1X2KI [195] O motivo do epítopo da IL31 reconhecido pelo M14 (PSDX1X2KI; SEQ ID NO: 45) não está presente nas sequências de aminoácidos da IL31 de humano (SEQ ID NO: 46) ou camundongo (SEQ ID NO: 61). No entanto, 0 motivo foi identificado em várias outras espécies, incluindo felino:
[196] Felis catus (XP_011286140.1; SEQ ID NO: 28) [197] Odobenus rosmarus divergens (XP_004395998.1; SEQ ID
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NO: 47) [198] Papio Anubis (XP_003907358.1; SEQ ID NO: 49) [199] Ursus maritimus (XP_008687166.1; SEQ ID NO: 51) [200] Leptonychotes weddellii (XP_006746595.1; SEQ ID NO: 52) [201] Panthera tigris altaica (XP_007079636.1; SEQ ID NO: 53) [202] Acinonyx jubatus (XP_014919275.1; SEQ ID NO: 54) [203] Macaca fascicularis (EHH66805.1; SEQ ID NO: 55) [204] Macaca mulatta (EHH21279.1; SEQ ID NO: 56) [205] Mandrillus leucophaeus (XP_011819882.1; SEQ ID NO: 57) [206] Chlorocebus sabaeus (XP_008003211.1; SEQ ID NO: 58) [207] Cercocebus atys (XP_011926625.1; SEQ ID NO: 59) [208] Rhinopithecus roxellana (XP_010366647.1; SEQ ID NO: 60) [209] IL31 de morsa (SEQ ID NO: 47) e IL31 de babuíno-anúbis (SEQ ID NO: 49) possui o epítopo PSDX1X2KI (SEQ ID NO: 45), que pode ser reconhecido pelo anticorpo M14. Para facilitar a purificação de proteínas, 0 marcador His C-terminal foi adicionado à IL31 de morsa (SEQ ID NO: 48) e à IL31 de babuíno-anúbis (SEQ ID NO: 50). A análise de Western blot confirmou que ο M14 se liga à IL31 da morsa (Figura 13). O anticorpo M14 ou seus derivados podem ser usados para agentes terapêuticos e de diagnósticos para uma doença induzida por IL31 em qualquer uma das espécies listadas acima.
Exemplo 11: Termoestabilidade do anticorpo M14 caninizado [210] A termoestabilidade do anticorpo M14 caninizado foi comparada a CYTOPOINT™ do Zoetis, um anticorpo anti-IL31 comercialmente disponível através de uma ampla faixa de pH foi analisado usando fluorescência de varredura diferencial (DSF). A temperatura de fusão (Tm) de cada anticorpo em diferentes pHs é listada na Tabela 4, abaixo. Ambos os anticorpos CYTOPOINT™ e M14 caninizado foram trocados no tampão para 0 tampão de ensaio listado na Tabela 4
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74/79 usando uma coluna PD Minitrap™ G-25 (GE Healthcare). Tm de cada anticorpo foi avaliada com a mesma concentração de tampão e de proteínas. O anticorpo M14 caninizado apresentou melhor termoestabilidade comparado ao CYTOPOINT™ em uma ampla faixa de pH. Além disso, sob condições de estresse a 55°C por 2 dias a 0,22 mg/ml de anticorpo, CYTOPOINT™ precipitou, enquanto nenhum precipitado foi observado com anticorpo M14 caninizado.
Tabela 4.
pH testado Tampão de ensaio M14 caninizada Temperatura de fusão (Tm °C) CYTOPOINT™ Temperatura de fusão (Tm °C)
3 0,lMNaAc 55,44 49,21
4 0,lMNaAc 61,68 57,54
5 0,lMNaAc 66,84 61,71
6 0,lMNaPO4 68,20 62,84
7 0,lMNaPO4 67,25 61,76
7,2 2xPBS 66,71 60,98
8 0,lMNaPO4 65,08 60,08
9 0,lMTrisHCl 64,25 59,25
Exemplo 12: Formulações tampão de anticorpo M14 caninizado [211] A termoestabilidade do anticorpo M14 caninizado em várias formulações de tampão foi analisada. Tampões contendo fosfato de sódio, acetato de sódio ou L-histidina foram considerados. Formulação de outras variáveis incluíram diferentes pHs (pH 5,2, 5,5, 6,0, 6,5 e 7,0), diferentes concentrações de cloreto de sódio (50 mM e 140 mM), diferentes polissorbatos (polissorbato 20 e polissorbato 80) e diferentes agentes antibacterianos (m-cresol e metilparabeno). A temperatura de fusão (Tm) do anticorpo M14 caninizado em cada tampão foi medida por técnica de fluorescência de varredura diferencial (DSF) de 20°C a 95°C. A Tabela 5 lista os valores de TM do anticorpo M14 nos diferentes tampões testados.
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Tabela 5
Formulação Designação Formulação do tampão Temperatura de fusão (Tm °C)
Al 20 mM fosfato de sódio 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 6,0 67,6
A2 Al + m-cresol (0,2%) 65,0
A3 Al + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,3
A4 20 mM fosfato de sódio 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 6,0 66,9
A5 A4 -ι- Ο,2% m-cresol 64,4
A6 A4 + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,3
A7 20 mM fosfato de sódio 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 6,0 66,3
A8 A7 -ι- Ο,2% m-cresol Nenhum pico*
A9 A7 + Metilparabeno 0,9mg/mL 66,1
A10 20 mM fosfato de sódio 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 6,0 65,8
All A10 -ι- Ο,2% m-cresol 63,6
A12 A10 + Metilparabeno 0,9mg/mL 65,5
Bl 20 mM fosfato de sódio 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 7,0 68,0
B2 Bl + m-cresol (0,2%) 66,2
B3 Bl + Metilparabeno 0,9mg/mL 68,1
B4 20 mM fosfato de sódio 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 7,0 68,1
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76/79
B5 B4 + 0,2% m-cresol 64,6
B6 B4 + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,2
B7 20 mM fosfato de sódio 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 7,0 67,6
B8 A7 + 0,2% m-cresol 64,7
B9 B7 + Metilparabeno 0,9mg/mL 66,9
BIO 20 mM fosfato de sódio 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 7,0 67,3
ΒΠ B10 + 0,2% m-cresol 64,8
B12 B10 + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,4
Cl 20 mM acetato de sódio 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 5,2 67,9
C2 Cl + m-cresol (0,2%) 65,4
C3 Cl + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,6
C4 20 mM acetato de sódio 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 5,2 67,7
C5 C4 + 0,2% m-cresol 64,7
C6 C4 + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,7
C7 20 mM acetato de sódio 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 5,2 66,6
C8 C7 + 0,2% m-cresol Nenhum pico*
C9 C7 + Metilparabeno 0,9mg/mL 66,9
CIO 20 mM acetato de sódio 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 5,2 68,0
Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 199/216
77/79
Cll C10 + 0,2% m-cresol 64,7
C12 C10 + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,7
Dl 20 mM L-Histidina 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 5,5 69,5
D2 Dl + m-cresol (0,2%) 68,1
D3 Dl + Metilparabeno 0,9mg/mL 69,6
D4 20 mM L-Histidina 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 5,5 69,6
D5 D4 + 0,2% m-cresol 67,2
D6 D4 + Metilparabeno 0,9mg/mL 69,1
D7 20 mM L-Histidina 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 5,5 68,0
D8 D7 + 0,2% m-cresol 66,2
D9 D7 + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,7
D10 20 mM L-Histidina 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 5,5 68,1
Dll D10 + 0,2% m-cresol 66,6
D12 D10 + Metilparabeno 0,9mg/mL 68,1
El 20 mM L-Histidina 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 6,5 68,2
E2 El + m-cresol (0,2%) Nenhum pico*
E3 El + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,9
E4 20 mM L-Histidina 140 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 6,5 67,9
Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 200/216
78/79
E5 E4 + 0,2% m-cresol Nenhum pico*
E6 E4 + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,6
E7 20 mM L-Histidina50 mM cloreto de sódio Polissorbato 80 (0,05mg/mL) pH 6,5 67,3
E8 E7 + 0,2% m-cresol Nenhum pico*
E9 E7 + Metilparabeno 0,9mg/mL 67,5
E10 20 mM L-Histidina 50 mM cloreto de sódio Polissorbato 20 (0,05mg/mL) pH 6,5 67,2
Eli E10 + 0,2% m-cresol 64,6
E12 E10 + Metilparabeno 0,9mg/mL 66,9
*Nenhum pico indica que nenhum ponto de fusão distinto foi observado.
[212] A Tm das fórmulas D1, D2, D3, D4, D5 e D6 na presença de um de cada um dos seguintes açúcares (1%): sacarose, trealose, D-manitol, maltose e sorbitol, foi ainda testada usando DSF.
[213] As formulações com e sem açúcares também foram testadas sob condições de estresse: 1 dia a 40°C, seguido por 1 dia a 45°C, seguido por 4 dias a 55°C. Análise HPLC de exclusão de tamanho foi usada para detectar e quantificar a forma monomérica e de agregação de anticorpos em várias formulações, após ter sido submetido a condições de estresse. A amostra foi carregada na coluna SHODEXTM KW803 (8 mm x 300 mm) e anexado a uma coluna de guarda KW-G. Um sistema de cromatografia Agilent 1100 foi usado com 2X PBS (270 mM NaCI, 5,4 mM KCI, 8,6 mM Na2PO4), pH 7,2 como um tampão de corrida em uma taxa de fluxo constante de 0,5 mL/min. A coluna foi calibrada com gel de filtração BIORAD padrão (Catálogo n.Q 151-1901) composta de tiroglobulina, γ-globulina bovina, ovalbumina de frango, mioglobina equina, e vitamina B12 (peso molecular 1.350-670.000). A quantidade de anticorpo monomérico rema
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79/79 nescente na solução foi determinada medindo a absorvância UV a 214 nm ou 280 nm e calculando a área de pico sob a curva.
[214] Com base em análise DSF e HPLC, formulações contendo L-histidina, cloreto de sódio, polissorbato 80, e tendo um pH dentre 5,0 e 6,2, como, por exemplo, Fórmulas, D1, D2, D3, D4, D6, D7, D10 e D12, foram consideradas mais desejáveis. Por exemplo, as formulações desejáveis para dosagem única são: 20 mM L-histidina; 140 mM cloreto de sódio, polissorbato 80 (0,05 mg/mL); pH 5,5. Formulações desejáveis para multidosagem (na presença de conservantes) são:
[215] 1. 20 mM L-histidina; 140 mM cloreto de sódio, polissor- bato 80 (0,05 mg/mL); sacarose (1-3%); m-cresol (0,2%); pH 5,5.
[216] 2. 20 mM L-histidina; 140 mM cloreto de sódio, polissor- bato 80 (0,05 mg/mL); trealose (1-3%); metilparabeno (0,9%); pH 5,5.

Claims (60)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo isolado que se liga à IL31 canina, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.
  2. 2. Anticorpo isolado que se liga à IL31 canina, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo compreendendo a sequência de aminoácidos de PSDX1X2KI (SEQ ID NO: 45), em que X é qualquer resíduo de aminoácido.
  3. 3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que X1 é um aminoácido hidrofóbico,ou X1 é selecionado de A, V, I e L, ou X1 é selecionado de V e I; e X2 é um aminoácido hidrofílico, ou X2 é selecionado de A, R, K, Q e N; ou X2 é selecionado de R e Q.
  4. 4. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que X1 é V e X2 é R ou X1 é I e X2 é Q.
  5. 5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que 0 anticorpo se liga a um epítopo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88.
  6. 6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que 0 anticorpo se liga à IL31 canina com uma constante de dissociação (Kd) menor que 5x10’ 6 M, menor que 1 x 10-6 M, menor que 5 x 10-7 M, menor que 1 x 10-7 M, menor que 5 x 10-8 M, menor que 1 x 10-8 M, menor que 5 x 10-9 M, menor que 1 x 10-9 M, menor que 5 x 10 10 M, menor que 1 x 10-1° M, menor que 5 x 10-11 M, menor que 1 x 10-11 M, menor que 5 x 10-12 M, ou menor que 1 x 10-12 M, como medida por interferometria de biocamada.
  7. 7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que 0 anticorpo reduz a função de sinalização da IL31 em uma espécie de animal de estima
    Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 203/216
    2/12 ção, como medido por uma redução na fosforilação de STAT-3.
  8. 8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a espécie de animal de estimação é canina, felina ou equina.
  9. 9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à IL31 felina ou IL31 equina, conforme determinado por análise de imunoblot e/ou de interferometria de biocamada.
  10. 10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compete com anticorpo monoclonal M14 em ligação à IL31 canina.
  11. 11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compete com anticorpo monoclonal M14 em ligação à IL31 felina.
  12. 12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga à IL31 humana, conforme determinado por análise de imunoblot e/ou de interferometria de biocamada.
  13. 13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
  14. 14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo canino, caninizado, felino, felinizado, equino, equinizado ou quimérico.
  15. 15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico compreendendo regiões de arcabouço de cadeia pesada variáveis murinas ou regiões de arcabouço de cadeia leve variáveis murinas.
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    3/12
  16. 16. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, caracterizado pelo fato de que:
    a) a cadeia pesada compreende uma sequência de CDR-H1 com, pelo menos, 85%, pelo menos 90% , pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; uma sequência de CDR-H2 com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 62, 89 ou 87; e uma sequência de CDR-H3 com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e
    b) a cadeia leve compreende uma sequência de CDR-L1 com, pelo menos, 85%, pelo menos 90% , pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 63; uma sequência de CDR-L2 com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; e uma sequência de CDR-L3 com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
  17. 17. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:
    a) uma cadeia pesada compreendendo (i) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (ii) uma CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 89; e (iii) uma CDR-H3 compreendendo
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    4/12 uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou
    b) uma cadeia pesada compreendendo (i) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (ii) uma CDR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 87; e (iii) uma CDR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
  18. 18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:
    a) uma cadeia leve compreendendo (i) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (ii) uma CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; e (iii) uma CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, ou
    b) uma cadeia leve compreendendo (i) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63; (ii) uma CDR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; e (iii) uma CDR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
  19. 19. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais de (a) uma sequência de arcabouço da região variável da cadeia pesada 1 (HC FR1) da SEQ ID NO: 4, 70 ou 79; (b) uma sequência HC-FR2 da SEQ ID NO: 5, 71 ou 80; e (c) uma sequência HC-FR3 da SEQ ID NO: 6, 72, 73 ou 81; (d) uma sequência HC-FR4 da SEQ ID NO: 7, 74 ou 82; (e) uma sequência de arcabouço da região variável da cadeia leve 1 (LC-FR1) da SEQ ID NO: 11, 75 ou 83; (f) uma sequência LC-FR2 da SEQ ID NO: 12, 76 ou 84; (g) uma sequência LC-FR3 da SEQ ID NO: 13, 77 ou 85; ou (h) uma sequência LC-FR4 da SEQ ID NO: 14, 78 ou 86.
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    5/12
  20. 20. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:
    a) (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; (ii) uma sequência da cadeia pesada variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou
    b) (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; (ii) uma sequência da cadeia pesada variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii); ou
    c) (i) uma sequência da cadeia leve variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; (ii) uma sequência da cadeia pesada variável com, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33; ou (iii) uma sequência da cadeia leve variável como em (i) e uma sequência da cadeia pesada variável como em (ii).
  21. 21. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 24; SEQ ID
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    6/12
    NO: 16; ou SEQ ID NO: 32.
  22. 22. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 15; ou SEQ ID NO: 33.
  23. 23. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 24 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 25; uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 16 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 15; ou uma sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 32 e uma sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 33.
  24. 24. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada ou região constante da cadeia leve derivadas de um animal de estimação.
  25. 25. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma região constante da cadeia pesada canina selecionada de uma região constante de IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D; (b) uma região constante da cadeia pesada felina selecionada de uma região constante de IgG 1, lgG2a e lgG2b; ou (c) uma região constante da cadeia pesada equina selecionada de uma região constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG5, lgG6 e lgG7.
  26. 26. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:
    a) (i) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 26; (ii) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada
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    7/12 da SEQ ID NO: 27; ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve como em (i) e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada como em (ii); ou
    b) (i) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 30; (ii) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 31; ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve como em (i) e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada como em (ii); ou
    c) (i) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NO: 34; (ii) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO: 35; ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia leve como em (i) e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada como em (ii).
  27. 27. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO: 21.
  28. 28. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; ou SEQ ID NO: 20.
  29. 29. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado de Fv, scFv, Fab, Fab’, F(ab')2 e Fab'SH.
  30. 30. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é biespecífico, em que o anticorpo se liga à IL31 e um ou mais antígenos selecionados de IL17, TNFa, CD20, CD19, CD25, IL4, IL13, IL23, IgE, CD11a, IL6R, a4-lntergrina, IL12, IL1 β, ou BlyS.
  31. 31. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que
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    8/12 codifica o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
  32. 32. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de compreender o ácido nucléico como definido na reivindicação 31.
  33. 33. Método para produzir um anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 32 e isolar o anticorpo.
  34. 34. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  35. 35. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL31 e um veículo farmaceuticamente aceitável, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável compreende Lhistidina, cloreto de sódio e polissorbato 80, e em que a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 6,2.
  36. 36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica tem um pH de 5,0 a 6,0, ou de 5,3 a 5,7 ou 5,5.
  37. 37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica tem uma concentração de L-histidina de 5 mM a 100 mM, de 10 mM a 50 mM, de 20 mM a 30 mM, de 10 a 30 mM ou 20 mM.
  38. 38. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica tem uma concentração de cloreto de sódio de 80 a 200 mM, de 100 a 175 mM, de 120 a 150 mM ou 140 mM.
  39. 39. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica tem uma concentração de polissorbato 80 de 0,005 mg/mL a 0,5 mg/mL, de 0,01 mg/mL a 0,1 mg/mL ou de 0,05
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    9/12 mg/ml_.
  40. 40. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável compreende ao menos um açúcar.
  41. 41. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica tem uma concentração de açúcar de 0,5% a 20%, de 1% a 10%, de 1% a 5% ou de 1 % a 3%.
  42. 42. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 41, caracterizada pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável compreende sacarose, trealose, Dmanitol, maltose e/ou sorbitol.
  43. 43. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 42, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende um agente antibacteriano.
  44. 44. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 43, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende m-cresol ou metilparabeno.
  45. 45. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 44, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende m-cresol a 0,2% ou metilparabeno a 0,9%.
  46. 46. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 45, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-IL31 é o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
  47. 47. Método para tratar uma espécie de animal de estimação tendo uma condição induzida por IL31, o método caracterizado pelo fato de compreender a administração à espécie de animal de estimação uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo como defi
    Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 211/216
    10/12 nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 34 a 46.
  48. 48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a espécie de animal de estimação é canina, felina ou equina.
  49. 49. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de que a condição induzida por IL31 é uma condição pruriginosa ou alérgica.
  50. 50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizado pelo fato de que a condição induzida por IL31 é selecionada de dermatite atópica, prurido, asma, psoríase, escleroderma e eczema.
  51. 51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a composição farmacêutica é administrada parenteralmente.
  52. 52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 51, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a composição farmacêutica é administrado por uma via intramuscular, uma via intraperitonial, uma via intracerebrospinal, uma via subcutânea, uma via intra-arterial, uma via intrassinovial, uma via intratecal, ou uma via de inalação.
  53. 53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 52, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar em combinação com o anticorpo ou a composição farmacêutica um inibidor de Jak, um inibidor de PI3K, um inibidor de AKT ou um inibidor de MAPK.
  54. 54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 53, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar em combinação com o anticorpo ou a composição farmacêutica um ou mais anticorpos selecionados de um anticorpo anti-IL17,
    Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 212/216
    11/12 um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo antiCD19, um anticorpo anti-CD25, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti-IL13, um anticorpo anti-IL23, um anticorpo anti-lgE, um anticorpo anti-CD11a, um anticorpo anti-IL6R, um anticorpo anti-a4-lntergrina, um anticorpo anti-IL12, um anticorpo anti-ILip e um anticorpo antiBlyS.
  55. 55. Método de redução da função de sinalização de IL31 em uma célula, o método caracterizado pelo fato de que compreende expor à célula o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 34 a 46 em condições permissivas para a ligação do anticorpo à IL31 extracelular, reduzindo, assim, a ligação ao receptor de IL31 e/ou redução da função de sinalização de IL31 pela célula.
  56. 56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a célula é exposta ao anticorpo ou à composição farmacêutica ex vivo.
  57. 57. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a célula é exposta ao anticorpo ou à composição farmacêutica in vivo.
  58. 58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 57, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula canina,uma célula felina, ou uma célula equina.
  59. 59. Método para a detecção de IL31 em uma amostra de uma espécie de animal de estimação caracterizado pelo fato de que compreende colocar a amostra em contato com um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou com a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 34 a 46, em condições permissivas para a ligação de anticorpos à IL31, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo e a
    Petição 870190080836, de 20/08/2019, pág. 213/216
    12/12
    IL31 na amostra.
  60. 60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra biológica obtida a partir de um canino, felino ou um equino.
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