BR112018001514B1

BR112018001514B1 - Modificador de carne, e, métodos para produzir um produto de carne processada e para modificar carne, e, uso de uma protease e de uma levedura contendo metal

Info

Publication number: BR112018001514B1
Application number: BR112018001514-8A
Authority: BR
Inventors: Ryusuke KOBA; Koichiro Watabe
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2022-05-03
Also published as: CN107846944B; BR112018001514A2; JPWO2017018503A1; CN107846944A; JP6756333B2; MY197893A; WO2017018503A1

Abstract

MODIFICADOR DE CARNE, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE CARNE PROCESSADA E PARA MODIFICAR CARNE. É fornecido um meio para modificar carne, por exemplo, amaciando tendões de carne. Uma carne é modificada tratando a carne com uma protease derivada de uma bactéria que pertence ao gênero Bacillus ou um fungo que pertence ao gênero Aspergillus, e uma levedura contendo metal.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a um modificador de carne, um método para produzir um produto de carne processada, e um método para modificar carne.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[002] O consumo de carne no mundo é crescente, e o aumento ainda maior da demanda de carne é esperado no futuro. “Maciez da carne” pode ser mencionada como um dos importantes fatores que determinam a delicadeza da carne. Além da delicadeza, em decorrência da facilidade de mastigação, a carne macia também é melhor para a facilidade de comer, e em decorrência de melhorar a eficiência de digestão, carne macia também é melhor com relação à nutrição. Especialmente em países desenvolvidos onde o envelhecimento ocorre, existem crescentes necessidades de agentes modificadores de carne tais como agentes amolecedores de carne, os quais tornam a carne adequadamente macia.

[003] Os métodos de utilização de uma protease como um agente amolecedor de carne são realizados de maneira convencional (Documento de patente 1). Como agentes amolecedores de carne geralmente usados, podem ser mencionados papaína derivada da fruta papaia, bromelina derivada da fruta abacaxi, actinidina derivada da fruta kiwi e assim por diante (Documentos de patente 2 e 3). Entretanto, quando estas enzimas são usadas, é difícil controlar o grau de amaciamento, e surge um problema que o amaciamento excessivo fornece uma textura do tipo fígado para a carne. Além disso, quando estas enzimas são usadas, as partes magras que são constituídas principalmente de miofibrilas podem ser decompostas, mas o amaciamento de partes de tendão contendo muitos tecidos conjuntivos constituídos por proteínas duras (colágeno) é insuficiente.

[004] Existem também métodos conhecidos para amaciar a carne decompondo principalmente proteínas duras contidas em carne usando colagenase ou elastase, que é uma enzima que decompõe seletivamente colágeno ou elastina como um constituinte de tecidos conjuntivos (Documentos de patente 4 e 5). Entretanto, o uso destas enzimas apresenta problemas em que a produção e preparação dos mesmos são mais difíceis, comparados com papaína, bromelina e actinidina mencionadas anteriormente, em que uma grande quantidade de enzima ou um período de tratamento longo é exigido para a decomposição de proteínas duras, e mesmo se a quantidade de enzima ou período de tratamento forem maiores, as proteínas duras poderão ainda não ser suficientemente decompostas, o que resulta em amaciamento insuficiente de carne (Documento de patente 6).

[005] Da maneira descrita anteriormente, há margem para melhoria em técnicas de modificação de carne, tal como amaciamento de carne usando uma protease.

REFERÊNCIAS DE TÉCNICA PRECEDENTE

[006] Documentos de patente Documento de patente 1: Patente Japonesa publicada (KOKAI) No. 2007-319166 Documento de patente 2: Patente Japonesa publicada (KOKAI) No. 5-7476 Documento de patente 3: Patente Japonesa publicada (KOKAI) No. 5-252911 Documento de patente 4: Patente Japonesa publicada (KOKAI) No. 4-197156 Documento de patente 5: Patente Japonesa publicada (KOKAI) No. 5-276899 Documento de patente 6: Patente Japonesa publicada (KOKAI) No. 6-169729

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Objetivo a ser atingido pela invenção

[007] Da maneira descrita anteriormente, ainda não foi estabelecido nenhum método para amaciar de maneira vantajosa os tecidos conjuntivos, que constituem um dos principais fatores de dureza de carne. Portanto, se uma técnica como esta foi estabelecida, a modificação favorável de vários tipos de carne é possível, e são esperados vários méritos, por exemplo, melhoria adicional na delicadeza da carne, facilidade para cozinhar tal como menor tempo de cozimento, melhoria na qualidade da carne de qualidade baixa, uso eficiente de fontes de alimento tal como uso eficiente de partes duras da carne, as quais foram descartadas, e de animais velhos, e assim por diante.

[008] Portanto, um objetivo da presente invenção é fornecer um método para modificar carne, um método para produzir um produto de carne processada, e um modificador de carne que pode ser preferivelmente usado para tais métodos. Em particular, o objetivo da presente invenção pode ser fornecer um método para amaciar partes de tendão da carne, que constituem um dos tecidos conjuntivos de carne, um método para produzir um produto de carne processada, em que partes de tendão são amaciadas, e um agente amaciador de carne que pode ser usado preferivelmente para tais métodos.

Meios de atingir o objetivo

[009] Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas. Em função disso, observaram que usando uma protease derivada de uma bactéria Bacillus ou fungo Aspergillus e uma levedura contendo metal tal como levedura contendo manganês em combinação, a capacidade de decomposição específica de colágeno da protease pode ser melhorada, e o amaciamento de partes de tendão da carne pode ser promovido e realizado pela presente invenção.

[0010] Assim, a presente invenção pode ser incorporada da maneira a seguir. [1] Um modificador de carne contendo uma protease e uma levedura contendo metal, em que a protease consiste em um ou dois ou mais tipos de proteases selecionadas de uma protease derivada de uma bactéria Bacillus e uma protease derivada de um fungo Aspergillus. [2] O modificador de carne de acordo com [1], em que a levedura contendo metal consiste em um ou dois ou mais tipos de leveduras selecionadas de uma levedura contendo manganês, uma levedura contendo zinco, uma levedura contendo magnésio, e uma levedura contendo ferro. [3] O modificador de carne de acordo com [1] ou [2], em que a levedura contendo metal é uma levedura contendo manganês. [4] O modificador de carne de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que a protease é uma protease que exibe uma razão de capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação, com relação a capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação (capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação/capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação) maior que 1. [5] O modificador de carne de acordo com [4], em que a razão é 1,1 ou mais. [6] O modificador de carne de acordo com qualquer um de [1] a [5], que contém 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol da levedura contendo metal, em termos de quantidade de metal por 1 U da protease. [7] O modificador de carne de acordo com qualquer um de [1] a [6], que é um agente amolecedor de tendão da carne. [8] Um método para produzir um produto de carne processada, o método compreendendo tratar carne com o modificador de carne, de acordo com qualquer um de [1] a [7]. [9] Um método para produzir um produto de carne processada, o método compreendendo tratar carne com uma protease e uma levedura contendo metal, em que a protease consiste em um ou dois ou mais tipos de proteases selecionadas de uma protease derivada de uma bactéria Bacillus e uma protease derivada de um fungo Aspergillus. [10] O método de acordo com [9], em que a levedura contendo metal consiste em um ou dois ou mais tipos de leveduras selecionadas de uma levedura contendo manganês, uma levedura contendo zinco, uma levedura contendo magnésio, e uma levedura contendo ferro. [11] O método de acordo com [9] ou [10], em que a levedura contendo metal é uma levedura contendo manganês. [12] O método de acordo com qualquer um de [9] a [11], em que a protease é uma protease que exibe uma razão de capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação, com relação a capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação (capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação/capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação) maior que 1. [13] O método de acordo com [12], em que a razão é 1,1 ou mais. [14] O método de acordo com qualquer um de [8] a [13], em que 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol da levedura contendo metal, em termos de quantidade de metal por 1 U da protease é preparada para agir na carne. [15] O método de acordo com qualquer um de [8] a [14], em que 0,1 U ou mais da protease por 1 g da carne é preparada para agir na carne. [16] Um método para modificar carne, o método compreendendo tratar a carne com o modificador de carne, de acordo com qualquer um de [1] a [7]. [17] Um método para modificar carne, o método compreendendo tratar a carne com uma protease e uma levedura contendo metal, em que a protease consiste em um ou dois ou mais tipos de proteases selecionadas de uma protease derivada de uma bactéria Bacillus e uma protease derivada de um fungo Aspergillus. [18] O método de acordo com [17], em que a levedura contendo metal consiste em um ou dois ou mais tipos de leveduras selecionadas de uma levedura contendo manganês, uma levedura contendo zinco, uma levedura contendo magnésio, e uma levedura contendo ferro. [19] O método de acordo com [17] ou [18], em que a levedura contendo metal é uma levedura contendo manganês. [20] O método de acordo com qualquer um de [17] a [19], em que a protease é uma protease que exibe uma razão de capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação, com relação a capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação (capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação/capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação) maior que 1. [21] O método de acordo com [20], em que a razão é 1,1 ou mais. [22] O método de acordo com qualquer um de [16] a [21], em que 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol da levedura contendo metal, em termos de quantidade de metal por 1 U da protease é preparada para agir na carne. [23] O método de acordo com qualquer um de [16] a [22], em que 0,1 U ou mais da protease por 1 g da carne é preparada para agir na carne. [24] O método de acordo com qualquer um de [16] a [23], que é um método para amaciar partes de tendão da carne.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DO DESENHO

[0011] [Figura 1] Um gráfico que exibe melhores efeitos na capacidade de decomposição específica de colágeno das proteases obtidas pelo uso combinado de uma levedura contendo metal.

Modos para realizar a invenção <1> Modificador de carne da presente invenção

[0012] O modificador de carne da presente invenção é um modificador de carne contendo uma protease e uma levedura contendo metal. A protease e a levedura contendo metal são daqui por diante também referidas de maneira genérica como “ingredientes ativos”.

[0013] O modificador de carne da presente invenção pode ser usado a fim de modificar carne. Exemplos de modificação de carne incluem amaciamento de carne. Exemplos de amaciamento de carne incluem amaciamento de partes de tendão da carne. Isto é, o modificador de carne da presente invenção pode ser, por exemplo, um agente amaciador de carne, especificamente um agente amolecedor de tendão da carne.

[0014] De acordo com a presente invenção, um efeito mais eficiente para modificação de carne pode ser obtido pelo uso combinado de uma protease e uma levedura contendo metal, comparado com o uso da protease sozinho. Este efeito também é referido como “efeito de uso combinado”. Exemplos do efeito de uso combinado incluem um efeito de melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno de uma protease, e um efeito de melhorar (promover) o amaciamento de partes de tendão da carne por uma protease. Isto é, por exemplo, a maciez de partes de tendão da carne pode ser melhorada, ou o tempo e/ou quantidade de enzima exigida para amaciar partes de tendão da carne podem ser diminuídos pelo uso combinado de uma protease e uma levedura contendo metal, comparado com o uso da protease sozinho.

[0015] O modificador de carne da presente invenção contém uma protease.

[0016] O termo “protease” se refere a uma enzima que hidrolisa ligações peptídicas de proteínas. Uma protease também é referida como proteinase.

[0017] A protease usada na presente invenção é selecionada de uma protease derivada de uma bactéria Bacillus e uma protease derivada de um fungo Aspergillus. A protease não é particularmente limitada, contanto que seja derivada de uma bactéria Bacillus ou um fungo Aspergillus. Exemplos da bactéria Bacillus incluem, por exemplo, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus intermedius, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thermoproteolyticus. Exemplos do fungo Aspergillus incluem, por exemplo, Aspergillus fumigatus, Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae e Aspergillus sojae. A protease pode ser, por exemplo, uma protease ácida, uma protease neutra, ou uma protease alcalina. A protease pode ser, por exemplo, uma aspartato protease, uma serina protease, ou uma metaloprotease. Exemplos da protease derivada de uma bactéria Bacillus incluem, por exemplo, serina proteases tal como subtilisina (EC 3.4.21.62, também referida como protina, bioprase, alcalase ou similares), metaloproteases tal como termolisina (EC 3.4.24.27), e outros vários tipos de proteases ácidas, neutras ou alcalinas. Exemplos da protease derivada de um fungo Aspergillus incluem, por exemplo, protease neutras tal como NPI ou NPII, protease alcalinas tal como ALP, e aspartato proteases (proteases ácidas) tal como PEPO.

[0018] Exemplos específicos da protease derivada de uma bactéria Bacillus incluem, por exemplo, os seguintes. As proteases neutras: Protease N “Amano” G (derivada de Bacillus subtilis, Amano Enzyme) Protina SD-NY10 (derivada de Bacillus amyloliquefaciens, Amano Enzyme) Termoase PC10F (derivada de Bacillus stearothermophilus, Amano Enzyme) Brewers protease (derivada de Bacillus amyloliquefaciens, D.S.M. Japão) Accelerzyme NP50.000 (derivada de Bacillus amyloliquefaciens, D.S.M. Japão) Neutrase (derivada de Bacillus amyloliquefaciens, Novozymes Japão) Nucleicina (derivada de Bacillus subtilis, H.B.I.) Orientase 90N (derivada de Bacillus subtilis, H.B.I.) Cololase N (derivada de Bacillus subtilis, Higuchi) Aroase NS (derivada de Bacillus subtilis, Yakult Pharmaceutical Industry) Aroase AP-10 (derivada de Bacillus subtilis, Yakult Pharmaceutical Industry) Aroase NP-10 (derivada de Bacillus subtilis, Yakult Pharmaceutical Industry) As proteases alcalinas: Protins SD-AY10 (derivada de Bacillus licheniformis, Amano Enzyme) Delvolase (derivada de Bacillus licheniformis, D.S.M. Japão) Esperase (derivada de Bacillus sp., Novozymes Japão) Savinase (derivada de Bacillus sp., Novozymes Japão) Everlase (derivada de Bacillus sp., Novozymes Japão) Alcalase (derivada de Bacillus licheniformis, Novozymes Japão) Bioprase OP (derivada de Bacillus sp., Nagase Chemtex) Bioprase SP-20FG (derivada de Bacillus sp., Nagase Chemtex) Orientase 22BF (derivada de Bacillus subtilis, H.B.I.).

[0019] Exemplos específicos da protease derivada de um fungo Aspergillus incluem, por exemplo, os seguintes. As proteases ácidas: Protease M “Amano” G (derivada de Aspergillus oryzae, Amano Enzyme) Sumizyme AP (derivada de Aspergillus niger, Shinnihon Chemicals) Denapsin 2P (derivada de Aspergillus sp., Nagase Chemtex) Orientase AY (derivada de Aspergillus niger, H.B.I.) Tetrase S (derivada de Aspergillus niger, H.B.I.) Brewers Clarex (derivada de Aspergillus niger, D.S.M. Japão) Varidase AFP (derivada de Aspergillus niger, D.S.M. Japão) Protease YP-SS (derivada de Aspergillus niger, Yakult Pharmaceutical Industry). As proteases neutras: Protease A “Amano” SD (derivada de Aspergillus oryzae, Amano Enzyme) Protease P “Amano” 3SD (derivada de Aspergillus melleus, Amano Enzyme) Sumizyme ACP-G (derivada de Aspergillus oryzae, Shinnihon Chemicals) Sumizyme LP (derivada de Aspergillus oryzae, Shinnihon Chemicals) Sumizyme FP-G (derivada de Aspergillus oryzae, Shinnihon Chemicals) Varidase FP60 (derivada de Aspergillus oryzae, D.S.M. Japão) Denazyme AP (derivada de Aspergillus sp., Nagase Chemtex) Orientase OP (derivada de Aspergillus oryzae, H.B.I.) Pantidase (derivada de Aspergillus sp., Yakult Pharmaceutical Industry) Pantidase NP-2 (derivada de Aspergillus oryzae, Yakult Pharmaceutical industry) As proteases alcalinas: Sumizyme MP (derivada de Aspergillus sp., Shinnihon Chemicals).

[0020] Como a protease, homólogos de tais proteases conhecidas, da maneira exemplificada anteriormente, também podem ser usados. Tais homólogos não são particularmente limitados, contanto que sejam encontrados em uma bactéria Bacillus ou fungo Aspergillus e com uma atividade de protease desejada. Como a protease, enzimas modificadas de maneira artificial de tais proteases conhecidas, da maneira exemplificada anteriormente, ou homólogos destas, também podem ser usadas. Tais enzimas modificadas de maneira artificial não são particularmente limitadas, contanto que sejam aquelas com uma atividade de protease desejada. Isto é, a expressão que a frase “uma protease é derivada de uma bactéria Bacillus ou fungo Aspergillus” também pode incluir casos onde a protease é uma enzima modificada de maneira artificial de uma protease encontrada em uma bactéria Bacillus ou fungo Aspergillus.

[0021] Como a protease, um tipo de protease pode ser usado, ou dois ou mais tipos de proteases podem ser usados em combinação.

[0022] A protease usada na presente invenção pode apresentar elevada capacidade de decomposição específica de colágeno. A “capacidade de decomposição específica de colágeno” também pode ser referida como “capacidade de decomposição específica de tendão”. Na presente invenção, a “capacidade de decomposição específica de colágeno” é expressa em termos de uma razão de atividade de decomposição de colágeno com relação à atividade de decomposição de proteína miofibrilar (atividade de decomposição de colágeno/atividade de decomposição de proteína miofibrilar). Isto é, a “capacidade de decomposição específica de colágeno” significa o grau de propriedade de colágeno que se decompõe seletivamente entre proteínas miofibrilares e colágeno. O valor da capacidade de decomposição específica de colágeno da protease usada na presente invenção pode ser maior que, por exemplo, o valor da capacidade de decomposição específica de colágeno de papaína. O valor da capacidade de decomposição específica de colágeno da protease usada na presente invenção pode ser, por exemplo, 0,20 ou mais, 0,25 ou mais, 0,30 ou mais, 0,35 ou mais, 0,50 ou mais ou 0,70 ou mais, em termos de um valor observado quando não é usada em combinação com a levedura contendo metal. Embora o valor máximo da capacidade de decomposição específica de colágeno da protease usada na presente invenção pode não ser particularmente definido, e pode ser, por exemplo, 10.000 ou menos, 1.000 ou menos, ou 100 ou menos, em termos de um valor observado quando não é usada em combinação com a levedura contendo metal. O valor da capacidade de decomposição específica de colágeno da protease usada na presente invenção pode ser em uma faixa constituída por uma combinação dos valores exemplificados anteriormente, em termos de um valor observado quando não é usada em combinação com a levedura contendo metal.

[0023] A razão da atividade de decomposição de colágeno com relação à atividade de decomposição de proteína miofibrilar (atividade de decomposição de colágeno/atividade de decomposição de proteína miofibrilar) é calculada como a razão de quantidade de dissolução de colágeno no momento do aquecimento com relação à quantidade de dissolução de proteína miofibrilar no momento do aquecimento (quantidade de dissolução de colágeno no momento do aquecimento/quantidade de dissolução de proteína miofibrilar no momento do aquecimento).

[0024] A quantidade de dissolução de proteína miofibrilar no momento do aquecimento é medida com o procedimento descrito no exemplo 1. Isto é, volumes iguais de uma solução aquosa de protease de 0,02 μg/mL e uma suspensão de proteína miofibrilar de 800 μg/mL são misturados, a mistura é deixada na vertical em temperatura normal por 10 minutos, a seguir aquecida a 80 °C por 10 minutos, aquecida novamente a 100 °C por 10 minutos, e resfriada em gelo por 1 minuto, e a quantidade de proteínas em um sobrenadante de centrifugação é quantificada como a quantidade de dissolução de proteína miofibrilar no momento do aquecimento. As proteínas miofibrilares usadas como o substrato podem ser preparadas de acordo com, por exemplo, o procedimento descrito no exemplo 1, (1-1), usando carne moída como uma matéria prima.

[0025] A quantidade de dissolução de colágeno no momento do aquecimento é medida com o procedimento descrito no exemplo 1. Isto é, volumes iguais de uma solução aquosa de protease de 2 μg/mL e uma suspensão de colágeno de 80 mg/mL são misturados, a mistura é deixada na vertical em temperatura normal por 10 minutos, a seguir aquecida a 80 °C por 10 minutos, aquecida novamente a 100 °C por 10 minutos, e resfriada no gelo por 1 minuto, e a quantidade de proteínas em um sobrenadante de centrifugação é quantificada como a quantidade de dissolução de colágeno no momento do aquecimento. O colágeno usado como o substrato pode ser preparado de acordo com, por exemplo, o procedimento descrito no exemplo 1, (1-2), usando tendões de carne como uma matéria prima.

[0026] A capacidade de decomposição específica de colágeno de uma protease pode ser melhorada pelo uso combinado da protease e uma levedura contendo metal. O grau da melhoria da capacidade de decomposição específica de colágeno não é particularmente limitado. O grau da melhoria da capacidade de decomposição específica de colágeno é expresso em termos de uma razão de capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação, com relação à capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação (capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação/capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação, daqui por diante também referida simplesmente como “razão seletiva”). A razão seletiva pode ser, por exemplo, maior que 1, 1,01 ou mais, 1,03 ou mais, 1,05 ou mais, 1,1 ou mais, 1,15 ou mais, 1,2 ou mais, 1,3 ou mais, 1,4 ou mais, 1,5 ou mais, ou 1,7 ou mais. Embora o valor máximo da razão seletiva possa não ser particularmente definido, este pode ser, por exemplo, 5 ou menos, ou 3 ou menos. A razão seletiva pode estar em uma faixa definida por uma combinação dos valores exemplificados anteriormente. A expressão de “usar uma levedura contendo metal em combinação”, usada para a definição da razão seletiva, significa usar 8,0 x 10-6 mol de uma levedura contendo metal (por exemplo, levedura contendo manganês), em termos de quantidade de metal em combinação com 1 g de protease.

[0027] Como a protease, produtos comercializados podem ser usados, ou aqueles produzidos e obtidos da maneira exigida também podem ser usados. O método para produzir a protease não é particularmente limitado. A protease pode ser produzida, por exemplo, cultivando um micro-organismo que produz a protease e coletando a protease de um produto da cultura. O micro-organismo que produz a protease pode ser um que produz intrinsecamente a protease, ou pode ser um que foi modificado de maneira a produzir a protease. O micro-organismo que produz a protease pode ser obtido, por exemplo, introduzindo expressivamente um gene que codifica a protease em um micro-organismo. Um gene pode ser introduzido, por exemplo, introduzindo um vetor que carrega o gene em um micro-organismo, ou introduzindo o gene em um cromossomo de um micro-organismo. As sequências de aminoácidos de várias proteases derivadas de uma bactéria Bacillus ou fungo Aspergillus, e as sequências de nucleotídeos de genes que codificam as mesmas podem ser obtidas de base de dados públicas tal como NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). As condições de cultivo do microorganismo não são particularmente limitadas, contanto que o microorganismo possa crescer e produzir a protease. O micro-organismo pode ser cultivado em condições normais para cultivar micro-organismos tais como bactérias e fungos.

[0028] A protease pode ou não conter ingredientes sem ser protease. Isto é, como a protease, uma protease purificada pode ser usada, ou um material contendo uma protease pode ser usado. Exemplos de um material contendo uma protease como este incluem, por exemplo, um produto de cultivo de um micro-organismo que produz a protease, um sobrenadante de cultivo separado de um produto de cultivo como este, células separadas de um produto de cultivo como este, e um produto processado de tais células. A protease pode ser purificada em um grau desejado.

[0029] O modificador de carne da presente invenção contém uma levedura contendo metal.

[0030] A levedura contendo metal não é particularmente limitada, contanto que contenha um metal. O tipo do metal não é particularmente limitado. Exemplos do metal incluem zinco, cálcio, crômio, selênio, cobre, magnésio, vanádio, manganês, molibdênio, cobalto, iodo, ferro e assim por diante. Isto é, exemplos da levedura contendo metal incluem levedura contendo zinco, levedura contendo cálcio, levedura contendo crômio, levedura contendo selênio, levedura contendo cobre, levedura contendo magnésio, levedura contendo vanádio, levedura contendo manganês, levedura contendo molibdênio, levedura contendo cobalto, levedura contendo iodo, levedura contendo ferro e assim por diante. Estre estas, levedura contendo manganês, levedura contendo zinco, levedura contendo magnésio e levedura contendo ferro são preferidas, e levedura contendo manganês é mais preferida. O metal pode estar contido na levedura contendo metal em qualquer forma, tal como a forma de substância simples, íon ou sal. Por exemplo, exemplos de sal de manganês incluem cloreto de manganês, sulfato de manganês, carbonato de manganês, ftalocianina de manganês, nitrato de manganês, acetato de manganês, fosfato de manganês, borato de manganês, fluoreto de manganês, triacetato de manganês, seleneto de manganês, dióxido de manganês, tetraóxido de trimanganês, permanganato de potássio e assim por diante. A levedura contendo metal pode conter um único tipo de metal, ou dois ou mais tipos de metais em combinação. A levedura contendo metal pode ser obtida, por exemplo, adicionando um metal no momento do cultivo de levedura, de maneira que o metal seja incorporado em células de levedura. Exemplos de levedura comercialmente disponível contendo metal incluem, por exemplo, as várias leveduras contendo mineral comercializadas por Sceti. A quantidade contida do metal na levedura contendo metal pode ser, por exemplo, 0,2 x 10-4 a 0,2 x 10-2 mol, preferivelmente 0,2 x 10-3 a 1,4 x 10-3 mol, mais preferivelmente 0,7 x 10-3 a 1,1 x 10-3 mol, por 1 g de peso seco de levedura. A forma da levedura contendo metal não é particularmente limitada. A levedura contendo metal pode estar em qualquer forma tal como, por exemplo, a forma de pó, pasta ou suspensão. A levedura contendo metal pode estar em um estágio de células vivas, ou pode ter sido esterilizada. O tipo da levedura não é particularmente limitado. Exemplos da levedura incluem, por exemplo, leveduras Saccharomyces tal como Saccharomyces cerevisiae, leveduras Schizosaccharomyces tal como Schizosaccharomyces pombe, e leveduras Candida tal como Candida utilis. Entre estas, as leveduras que pertencem ao gênero Saccharomyces ou Candida são preferidas.

[0031] Como a levedura contendo metal, um único tipo de levedura contendo metal pode ser usado, ou dois ou mais tipos de leveduras contendo metal podem ser usados em combinação.

[0032] O modificador de carne da presente invenção pode consistir apenas nos ingredientes ativos anteriormente mencionados, ou pode conter um outro ingrediente.

[0033] O “outro ingrediente” não é particularmente limitado, contanto que as vantagens da presente invenção não sejam degradadas. Como o “outro ingrediente”, por exemplo, aquele usado sendo misturado em temperos, alimentos, bebidas ou produtos farmacêuticos, pode ser usado. Exemplos do “outro ingrediente” incluem, por exemplo, excipientes tais como dextrina, amido, amido modificado, e açúcar de malte reduzido; temperos tais como aminoácidos, ácidos nucleicos, e extratos de carne; proteínas tais como proteínas vegetais, glúten, albumina e caseína; produtos processados de proteínas tais como hidrolisados proteicos, e produtos parcialmente decompostos de proteínas; emulsificantes tais como ésteres de glicerina e ácido graxo e monoglicerídeos de ácido orgânico; agentes de quelação tais como sais de citrato e sais de polifosfato; agentes de redução tais como glutationa e cisteína; e outros aditivos alimentares tais como ácido algínico, água salgada, óleos e gorduras, corante, acidulante e perfume. Como o “outro ingrediente”, um único tipo de ingrediente pode ser usado, ou dois ou mais tipos de ingredientes podem ser usados em combinação. É preferível adicionar um emulsificante em relação à melhoria do efeito amolecedor da carne.

[0034] A forma do modificador de carne da presente invenção não é particularmente limitada. O modificador de carne da presente invenção pode estar em qualquer forma tal como, por exemplo, a forma de líquido, pasta, grânulo, pó ou sólido.

[0035] As concentrações e razões de teor dos ingredientes contidos no modificador de carne da presente invenção (a saber, os ingredientes ativos e outros ingredientes da maneira exigida) não são particularmente limitadas, contanto que o efeito do uso combinado possa ser obtido, e o modificador de carne possa ser usado para modificar carne. As concentrações e razões de teor dos ingredientes do modificador de carne da presente invenção podem ser determinadas adequadamente, dependendo de várias condições, tal como a quantidade do modificador de carne da presente invenção a ser usado.

[0036] A concentração total dos ingredientes ativos no modificador de carne da presente invenção, por exemplo, pode ser 1 ppm (p/p) ou mais, 10 ppm (p/p) ou mais, 100 ppm (p/p) ou mais, ou 1.000 ppm (p/p) ou mais, ou pode ser 100% (p/p) ou menos, 10% (p/p) ou menos, ou 1% (p/p) ou menos, ou pode estar em uma faixa constituída por uma combinação dos mesmos.

[0037] A quantidade contida da levedura contendo metal, por exemplo, pode ser 0,4 x 10-10 mol ou mais, ou 0,4 x 10-9 mol ou mais, ou pode ser 2,0 x 10-6 mol ou menos, ou 2,0 x 10-7 mol ou menos, ou pode estar em uma faixa constituída por uma combinação dos mesmos, em termos de quantidade de metal por 1 U de protease. A quantidade contida da levedura contendo metal pode ser, por exemplo, 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol em termos de quantidade de metal por 1 U de protease. Especificamente, por exemplo, quando o modificador de carne da presente invenção contém uma protease e uma levedura contendo manganês, o modificador de carne da presente invenção pode conter 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol da levedura contendo manganês em termos da quantidade de manganês por 1 U de protease. Igualmente, a quantidade contida da levedura contendo metal, por exemplo, pode ser 1,0 x 10-7 mol ou mais, ou 1,0 x 10-6 mol ou mais, ou pode ser 1,0 x 10-3 mol ou menos, ou 1,0 x 10-4 mol ou menos, ou pode estar em uma faixa constituída por uma combinação dos mesmos, em termos de quantidade de metal por 1 g de protease.

[0038] Na presente invenção, a atividade de protease é avaliada pelo método Folin, usando caseína como o substrato. Isto é, na presente invenção, a quantidade de enzima que fornece um aumento de uma substância colorida para o reagente do teste de Folin, correspondendo a 1 μg de tirosina em 1 minuto quando a reação enzimática é realizada de uma maneira convencional, usando caseína como o substrato, é definida como 1 U da atividade de protease.

[0039] Especificamente, a atividade de protease pode ser avaliada, por exemplo, pelo procedimento a seguir. Uma protease é dissolvida em uma solução de reagente com acetato de cálcio e cloreto de sódio (preparada misturando 5 mL de uma solução de acetato de cálcio 0,2 mol/L e 2,5 mL de uma solução de cloreto de sódio 2 mol/L, e diluindo a mistura em um volume de 500 mL com água destilada) com agitação, e a solução é diluída 7.000 vezes para obter uma solução de enzima. Uma alíquota de 160 mL de 0,05 mol/L de solução de reagente de hidrogenofosfato dissódio é adicionada à 1,2 g de caseína (produzida do leite), e caseína é dissolvida aquecendo em um banho Maria. A solução é resfriada com água corrente, ajustada a seguir em pH 8,0 com uma solução de reagente hidróxido de sódio, e diluída com água destilada em um volume de 200 mL para obter uma solução de substrato. Uma alíquota de 5 mL da solução de substrato é colocada em um tubo de teste, e aquecida a 37 °C por 10 minutos, a seguir 1 mL da solução de enzima é adicionado, e estas são misturadas. A mistura é deixada a 37 °C por 10 minutos, a seguir 5 mL de uma solução de reagente de ácido tricloroacético (preparada dissolvendo 36 g de ácido tricloroacético e 36 g de acetato de sódio anidro em 1,6 L de água destilada, misturando a solução resultante com 110 mL de uma solução de reagente de ácido acético 6 mol/L, e diluindo a mistura resultante em um volume de 2 L com água destilada) são adicionados, são misturados por agitação, e a mistura resultante é deixada novamente a 37 °C por 30 minutos, e filtrada. A seguir, 5 mL de uma solução de reagente de carbonato de sódio 0,55 mol/L são colocados em um tubo de teste, 2 mL do filtrado e a solução do teste de Folin (reagente fenol de Folin-Ciocalteu, Wako Pure Chemical Industries) diluída 3 vezes com água destilada são adicionados, misturados e a mistura resultante é deixada a 37 °C por 30 minutos. A seguir, a absorbância da mistura é avaliada em um comprimento de onda de 660 nm como absorbância da solução de reação enzimática usando água destilada como um controle. Separadamente, 1 mL da solução de enzima e 5 mL da solução de reagente de ácido tricloroacético são misturados, a seguir 5 mL da solução de substrato são adicionados à mistura, a mistura resultante é deixada a 37 °C por 30 minutos, e o branco da absorbância é obtido posteriormente por procedimento similar. A alteração da quantidade por tempo de reação única é calculada a partir do valor obtido subtraindo o branco da absorbância da absorbância da solução de reação enzimática, e a atividade de protease é calculada.

[0040] As concentrações dos ingredientes ativos no modificador de carne da presente invenção podem ser determinadas de maneira tal que, por exemplo, a concentração total e razão de teor dos ingredientes ativos exemplificados anteriormente sejam obtidos.

[0041] Os ingredientes contidos no modificador de carne da presente invenção (a saber, os ingredientes ativos e outros ingredientes da maneira exigida) podem estar contidos como uma mistura dos mesmos no modificador de carne da presente invenção, ou pode estar contido separadamente, ou contidos separadamente como combinações arbitrárias dos mesmos no modificador de carne da presente invenção. Por exemplo, o modificador de carne da presente invenção pode ser fornecido como um conjunto da protease e levedura contendo metal embalado separadamente. Em um caso como este, os ingredientes contidos no conjunto podem ser usados apropriadamente em combinação no momento do uso. <2> Método da presente invenção

[0042] De acordo com a presente invenção, a carne pode ser modificada usando os ingredientes ativos (a saber, protease e levedura contendo metal). Isto é, o método da presente invenção é um método para modificar carne, que compreende tratar a carne com os ingredientes ativos. O método para modificar carne pode ser, por exemplo, um método para amaciar carne, especificamente, um método para amaciar partes de tendão da carne. Um produto de carne processada pode ser produzido usando o método da presente invenção. Isto é, uma modalidade do método da presente invenção é um método para produzir um produto de carne processada, que compreende tratar carne com os ingredientes ativos. “Tratar carne com os ingredientes ativos” é também expresso como “tornar os ingredientes ativos em carne”. A etapa de “tratar carne com os ingredientes ativos” também é referida como “etapa de reação enzimática”.

[0043] De acordo com a presente invenção, por exemplo, a carne pode ser modificada usando o modificador de carne da presente invenção contendo os ingredientes ativos. Isto é, em outras palavras, o método da presente invenção pode ser um método para modificar carne, que compreende tratar a carne com o modificador de carne da presente invenção. Igualmente, uma modalidade do método da presente invenção pode ser um método para produzir um produto de carne processada, que compreende tratar a carne com o modificador de carne da presente invenção.

[0044] Um produto de carne processada obtido pelo método da presente invenção também é referido como “produto de carne processada da presente invenção”. O produto de carne processada da presente invenção é um produto modificado de carne processada. O produto modificado de carne processada pode ser, por exemplo, um produto de carne processada cuja maciez é melhorada, especificamente, um produto de carne processada cuja maciez de partes de tendão é melhorada.

[0045] O produto de carne processada da presente invenção pode ser produzido usando um método culinário e matéria prima similares àqueles usados para produtos de carne processadas comuns, exceto que o tratamento com os ingredientes ativos é usado. O método culinário pode ser alterado de maneira adequada. Por exemplo, o produto de carne processada da presente invenção pode ser possivelmente produzido com um tempo de aquecimento mais curto, comparado com um caso de produzir um produto de carne processada comum.

[0046] O tipo da carne não é particularmente limitado. Exemplos da carne incluem, por exemplo, carnes de animais tais como gado, porco e ovelha, carnes de pássaros tais como galinha, peru, pato e ganso, e carnes de peixe tais como cavala, salmão, bacalhau, peixe-chato, agulhão do pacífico e peixe balão. A parte da carne não é particularmente limitada. A parte da carne é preferivelmente uma parte contendo um lote de proteínas duras, tais como canela, ombro, pescoço, língua, bochecha, coxa, cauda e perna, uma vez que o efeito da presente invenção se torna mais significativo para uma parte como esta. A forma da carne não é particularmente limitada. A carne pode estar em qualquer forma tal como, por exemplo, a forma de bloco, cubo, pedaço, lâmina ou moída.

[0047] O método culinário para a carne não é particularmente limitado. O método culinário pode ser determinado adequadamente dependendo de várias condições, tais como o tipo, parte e forma da carne. Como o método culinário, um incluindo aquecimento é preferido. Exemplos do método culinário incluem, por exemplo, tais métodos como ferver, assar, fritar com agitação, fritar e vaporizar. O tipo do produto de carne processada da presente invenção não é particularmente limitado. Exemplos do produto de carne processada da presente invenção incluem, por exemplo, vísceras refogadas, ensopado de tendão de carne bovina, sopa de cauda, carne assada, bife, hambúrguer, costeleta, fritada, tempura, carne frita, carne marinada frita, caril, ensopado, shabu-shabu, peixe assado, peixe passado na farinha e frito na manteiga e peixe cozido.

[0048] Os ingredientes ativos podem ser preparados para agir na carne em qualquer estágio da etapa de cozimento, contanto que o efeito de uso combinado possa ser obtido, e a carne pode ser modificada. Isto é, os ingredientes ativos podem ser preparados para agir na carne antes do cozimento, podem ser preparados para agir na carne durante o cozimento, ou podem ser preparados para agir na carne após o cozimento. Os ingredientes ativos podem ser preparados para agir em carne deixando os ingredientes ativos per se, ou uma solução destes ou similares preparados da maneira exigida para coexistir com a carne. Por exemplo, os ingredientes ativos podem ser adicionados à carne, ou a carne pode ser imersa em uma solução de tratamento contendo os ingredientes ativos. Uma operação como esta de preparar os ingredientes ativos que coexiste com carne é daqui por diante referido também de maneira genérica como “adição” dos ingredientes ativos. O tempo e a temperatura de tratamento não são particularmente limitados, contanto que o efeito de uso combinado possa ser obtido, e a carne possa ser modificada. O tempo de tratamento e temperatura de tratamento podem ser determinados de maneira adequada dependendo de várias condições, tais como o tipo de carne e a quantidade de adição dos ingredientes ativos. A etapa de cozimento também pode funcionar como a etapa de reação enzimática, ou a etapa de reação enzimática pode ser realizada separadamente. O tempo de tratamento pode ser, por exemplo, preferivelmente 1 minuto a 72 horas. A temperatura de tratamento pode ser, por exemplo, preferivelmente 4 a 95 °C, mais preferivelmente 4 a 80 °C. A etapa de reação enzimática pode ser realizada na presença de todos os ingredientes ativos. Por exemplo, a etapa de reação enzimática pode ser iniciada adicionando simultaneamente todos os ingredientes ativos. Alternativamente, por exemplo, adicionando os ingredientes ativos separadamente, ou adicionando os ingredientes ativos separadamente como combinações arbitrárias dos mesmos, a etapa de reação enzimática pode ser iniciada quando todos os ingredientes ativos são preparados para estar presentes. A ordem da adição dos ingredientes ativos não é particularmente limitada. Especificamente, por exemplo, uma protease pode ser preparada para agir principalmente em carne, e a seguir uma levedura contendo metal pode ser preparada para coexistir com a carne para iniciar a etapa de reação enzimática. Cada um dos ingredientes ativos pode ser adicionado uma vez, ou pode ser adicionado duas ou mais vezes. Por exemplo, quando a protease é inativada, a protease pode ser adicionalmente adicionada. Uma enzima ou aditivo sem ser os ingredientes ativos também pode ser usada em combinação.

[0049] As quantidades de adição e razões de adição dos ingredientes usados no método da presente invenção (a saber, os ingredientes ativos e outros ingredientes usados da maneira exigida) não são particularmente limitadas, contanto que o efeito de uso combinado possa ser obtido, e a carne possa ser modificada. As quantidades de adição e razões de adição dos ingredientes usados no método da presente invenção podem ser determinadas de maneira adequada, dependendo de várias condições tais como o tipo, parte, e forma da carne.

[0050] A quantidade de adição da protease, por exemplo, pode ser 0,1 U ou mais, 10 U ou mais, ou 100 U ou mais, ou pode ser 100.000 U ou menos, 10.000 U ou menos, ou 1.000 U ou menos, ou pode estar em uma faixa constituída por uma combinação dos mesmos, em termos de atividade de protease por 1 g de carne. Igualmente, a quantidade de adição da protease, por exemplo, pode ser 1,0 x 10-7 g ou mais, 1,0 x 10-6 g ou mais, ou 1,0 x 10-5 g ou mais, ou pode ser 1,0 x 10-2 g ou menos, 1,0 x 10-3 g ou menos, ou 1,0 x 10-4 g ou menos, ou pode estar em uma faixa constituída por uma combinação dos mesmos, por 1 g de carne.

[0051] A quantidade de adição da levedura contendo metal, por exemplo, pode ser 0,4 x 10-10 mol ou mais, ou 0,4 x 10-9 mol ou mais, ou pode ser 2,0 x 10-6 mol ou menos, ou 2,0 x 10-7 mol ou menos, ou pode estar em uma faixa constituída por uma combinação dos mesmos, em termos de quantidade de metal por 1 U de protease. A quantidade de adição da levedura contendo metal pode ser, por exemplo, 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol em termos de quantidade de metal por 1 U de protease. Especificamente, por exemplo, quando uma protease e uma levedura contendo manganês são preparadas para agir na carne, a levedura contendo manganês em uma quantidade de 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol em termos de a quantidade de manganês pode ser usada em combinação com 1 U de protease. Igualmente, a quantidade de adição da levedura contendo metal, por exemplo, pode ser 1,0 x 10-7 mol ou mais, ou 1,0 x 10-6 mol ou mais, ou pode ser 1,0 x 10-3 mol ou menos, ou 1,0 x 10-4 mol ou menos, ou pode estar em uma faixa constituída por uma combinação dos mesmos, em termos de quantidade de metal por 1 g de protease.

EXEMPLOS

[0052] A presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos seguintes exemplos. A presente invenção não é limitada de maneira alguma por estes exemplos.

Exemplo 1: Avaliação de efeito de uso combinado de levedura contendo metal para melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno da protease (1)

[0053] Neste exemplo, capacidades de decomposição específicas do colágeno (capacidades de decomposição específicas de tendão) de várias proteases são comparadas com o caso de usar e não usar uma levedura contendo metal em combinação com esta, para avaliar o efeito de uso combinado de levedura contendo metal para melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno da protease. As proteases usadas são mostradas na tabela 1. Tabela 1

(1) Capacidades de decomposição específicas do colágeno de várias proteases observadas no momento de não uso de levedura contendo metal em combinação

[0054] Primeiro, as capacidades de decomposição específicas do colágeno de várias proteases (Tabela 1) observadas no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação foram avaliadas. (1-1) Atividades de decomposição de proteína miofibrilar das várias proteases

[0055] Como um índice de atividades de decomposição das várias proteases (Tabela 1) para proteínas miofibrilares, que constituem principalmente partes magras da carne, a quantidade de dissolução de proteína miofibrilar no momento do aquecimento foi avaliada de acordo com o procedimento descrito a seguir.

[0056] Como um tampão para extrair proteínas miofibrilares, um tampão de citrato-fosfato 30 mM (pH 5,5, contendo NaCl 0,1 M) foi preparado de acordo com o procedimento a seguir. Primeiro, solução aquosa de ácido cítrico 30 mM, solução aquosa de hidrogenofosfato dissódio 60 mM, e solução aquosa de cloreto de sódio 1 M foram preparadas. A seguir, 852 mL da solução aquosa de ácido cítrico 30 mM, e 1,148 mL da solução aquosa de hidrogenofosfato dissódio 60 mM foram misturados, e a mistura resultante foi ajustada em pH 5,5 adicionando a solução aquosa de ácido cítrico 30 mM pouco a pouco. À esta solução preparada, 400 mL da solução aquosa de cloreto de sódio 1 M foram adicionados, e o volume da solução resultante foi ajustado para 4 L com água destilada para obter tampão de citrato-fosfato 30 mM (pH 5,5, contendo NaCl 0,1 M).

[0057] Proteínas miofibrilares foram extraídas e preparadas de acordo com o procedimento a seguir. Carne moída (200 g, produto doméstico comercializado), e cerca de 7,5 vezes o volume (1.500 mL) do tampão de citrato-fosfato foram misturados em um béquer de plástico de 2-L, e homogeneizados em 6.000 rpm por 1 minuto (usando homogeneizador POLYTRON PT 3100 com eixo PT-DA3030), com gelo resfriando do lado de fora do béquer. A suspensão obtida foi filtrada com gaze (tamanho de malha 1 mm, Suzuran), o filtrado foi colocado em um tubo de precipitação de centrífuga de 1.000-mL e submetido à centrifugação a 1.660 x g e 5 °C por 10 minutos (usando máquina de centrifugação CR22G com rotor R9AF e tubo de precipitação de centrífuga com volume de 1.000-mL). O sobrenadante foi removido, os precipitados foram adicionados com cerca de 7,5 vezes o volume (500 mL) do tampão de citrato-fosfato e suspensos, e a suspensão foi centrifugada nas mesmas condições. Este procedimento foi realizado novamente, os precipitados obtidos foram adicionados com 30 mL do tampão de citrato-fosfato e suspensos, e a suspensão foi transferida para um tubo de precipitação de centrífuga de 50-mL e centrifugada a 9.520 x g e 5 °C por 5 minutos (usando máquina de centrifugação CR22G com rotor R12A2 e volume tubo de precipitação de centrífuga de 50-mL). Após o sobrenadante ser removido, o mesmo procedimento foi repetido duas vezes, os precipitados obtidos foram adicionados com cerca de duas vezes o volume (10 mL) do tampão de citrato-fosfato e suspensos, para obter uma amostra de proteína miofibrilar.

[0058] Em microtubos com volume de 1,5-mL, 0,02 μg/mL de soluções das respectivas proteases foram preparadas com água destilada, e foram usadas como soluções de enzima. Após a amostra de proteína miofibrilar ser suficientemente suspensa pipetando e usando um misturador vórtex, uma solução de 800 μg/mL desta foi preparada com água destilada em um microtubo com volume de 1,5 mL para obter uma suspensão de proteína miofibrilar. Cada uma das soluções de enzima (250 μL) e a suspensão de proteína miofibrilar (250 μL) foram misturadas em um microtubo com volume de 1,5 mL (S/E = 40000:1), as proteínas foram suspensas de maneira suficiente, e a suspensão foi deixada na vertical em temperatura normal por 10 minutos. A seguir, a suspensão foi aquecida a 80 °C por 10 minutos usando um aquecedor de bloco (CTU-Neo). A seguir, a suspensão foi movida imediatamente para um aquecedor de bloco a 100 °C, e aquecida adicionalmente por 10 minutos. Após resfriar com gelo por 1 minuto, a suspensão foi centrifugada a 12.000 x g e temperatura normal por 1 minuto (usando máquina de centrifugação CF15RXII com rotor T15A39), e o sobrenadante foi coletado. As proteínas no sobrenadante foram quantificadas pelo método BCA, e a quantidade quantificada foi usada como a quantidade de dissolução de proteína miofibrilar no momento do aquecimento. (1-2) Atividade de decomposição de colágeno de várias proteases

[0059] Neste exemplo, como um índice de atividades de decomposição de várias proteases (Tabela 1) para colágeno, que é uma proteína dura que constitui principalmente partes de tendão da carne, a quantidade de dissolução de colágeno no momento do aquecimento foi medida de acordo com o procedimento descrito a seguir.

[0060] As partes magras e gordas anexadas aos tendões de carne (haste de carne doméstica comercializada) foram removidas usando uma faca de cozinha, e os tendões foram cortados em cubos de cerca de 5-mm de tamanho. Estes cubos (3,5 g) foram colocados em uma jarra de moagem do tipo cilindro com volume de 50-mL (usando jarra de moagem como acessórios de Mixer Mill Type MM301), e uma bola de moagem com um diâmetro de 25 mm foi colocada nos cubos (usando bola de moagem como acessório de Mixer Mill Type misturador do tipo MM301). A jarra de moagem foi fechada com uma tampa, e imersa por 5 minutos em nitrogênio líquido contido em um recipiente colocado em uma câmara de rascunho. O nitrogênio líquido foi usado de uma maneira tal que a jarra de moagem completa foi totalmente embebida em nitrogênio líquido, e sempre que o volume do nitrogênio líquido foi reduzido por evaporação, o nitrogênio líquido foi adicionalmente novamente. Após 5 minutos de imersão, a jarra de moagem foi retirada com um par de pinças para uso exclusivo e colocada no moedor, e a moagem foi realizada nas condições da frequência de vibração de 25 vezes/s por 1,5 minutos (usando moedor Mixer Mill Type MM301). A tampa da jarra de moagem foi removida para abrir a jarra, a bola de moagem foi retirada, e a amostra moída congelada foi coletada com uma espátula. Esta amostra foi usada como uma amostra em pó de colágeno.

[0061] Em microtubos de 1,5-mL, soluções das respectivas proteases 2 μg/mL foram preparadas com água destilada, e foram usadas como soluções de enzima. A amostra de colágeno em pó (80 mg) foi pesada em um microtubo de 1,5-mL, e suspensa com 1 mL de água destilada para obter suspensão de colágeno em pó. Cada uma das soluções de enzima (250 μL) e a suspensão de colágeno em pó (250 μL) foram misturadas em um microtubo de 1,5 mL (S/E = 40.000:1), o pó de colágeno foi suspenso de maneira suficiente, e a suspensão foi deixada na vertical em temperatura normal por 10 minutos. A seguir, a suspensão foi aquecida a 80 °C por 10 minutos usando um aquecedor de bloco (CTU-Neo). A seguir, a suspensão foi movida imediatamente para um aquecedor de bloco a 100 °C, e foi aquecida novamente por 10 minutos. Após resfriar com gelo por 1 minuto, a suspensão foi centrifugada a 12.000 x g e temperatura normal por 1 minuto (usando máquina de centrifugação CF15RXII e rotor T15A39), e o sobrenadante foi coletado. As proteínas no sobrenadante foram quantificadas pelo método BCA, e a quantidade quantificada foi usada como a quantidade de dissolução de colágeno no momento do aquecimento. (1-3) Capacidade de decomposição específica de colágeno

[0062] Para cada protease, dividindo a quantidade de dissolução de colágeno no momento do aquecimento, obtida em (1-2), pela quantidade de dissolução de proteína miofibrilar no momento do aquecimento, obtida em (11), a razão de atividade de decomposição de colágeno com relação à atividade de decomposição de proteína miofibrilar (atividade de decomposição de colágeno/atividade de decomposição de proteína miofibrilar) foi calculada, e o valor foi usado como a capacidade de decomposição específica de colágeno (capacidade de decomposição específica de tendão) no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação. A capacidade de decomposição específica de colágeno (capacidade de decomposição específica de tendão) da protease derivada de papaia (Carica papaya) foi 0,17. As capacidades de decomposição específicas do colágeno (capacidades de decomposição específicas de tendão) de todas as proteases derivadas de fungo Aspergillus ou bactéria Bacillus usadas para o exame foram 0,20 ou mais. (2) Capacidades de decomposição específicas do colágeno de várias proteases no momento de uso de levedura contendo metal em combinação

[0063] A seguir, as capacidades de decomposição específicas do colágeno de várias proteases (Tabela 1) no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação com estas foram avaliadas. Como a levedura contendo metal, uma levedura contendo manganês (Saccharomyces cerevisiae, SCETI) foi usada.

[0064] A quantidade de dissolução de colágeno no momento do aquecimento e quantidade de dissolução de proteína miofibrilar no momento do aquecimento foram avaliadas em relação às proteases da mesma maneira que (1-1) e (1-2), exceto que a levedura contendo manganês foi adicionada em uma concentração final de 0,2 μM, em termos de quantidade de manganês (0,4 μM como a concentração na solução de enzima antes da mistura) no memento da reação enzimática. A seguir, a razão de atividade de decomposição de colágeno com relação à atividade de decomposição de proteína miofibrilar (atividade de decomposição de colágeno/atividade de decomposição de proteína miofibrilar) foi calculada da mesma maneira que (1-3) para cada protease, e o valor foi usado como a capacidade de decomposição específica de colágeno (capacidade de decomposição específica de tendão) no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação. (3) Avaliação de efeito de uso combinado de levedura contendo metal para melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno da protease

[0065] O grau de melhoria na capacidade de decomposição específica de colágeno foi calculado dividindo a capacidade de decomposição específica de colágeno no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação, obtida em (2), pela capacidade de decomposição específica de colágeno no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação, obtida em (1), para cada protease. Os resultados são mostrados na figura 1. Na figura 1, “Cont (M.Q.)” indica os resultados obtidos da mesma maneira que (1-1) a (1-3), usando água ultrapura (água Milli Q) contendo ou não a levedura contendo manganês, em vez da solução de enzima. O uso combinado de levedura contendo manganês forneceu o efeito de melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno para todas as proteases derivadas de fungo Aspergillus e as proteases derivadas da bactéria Bacillus usadas para o exame. Por outro lado, em relação à protease derivada da bactéria Streptomyces, e a protease derivada de papaia (Carica papaya), o efeito de melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno não foi observado com uso combinado da levedura contendo metal.

[0066] Da maneira descrita anteriormente, foi demonstrado que a capacidade de decomposição específica de colágeno (capacidade de decomposição específica de tendão) de proteases derivada de uma bactéria Bacillus ou fungo Aspergillus é melhorada pelo uso combinado de uma levedura contendo metal. Exemplo 2: Avaliação de efeito de uso combinado de levedura contendo metal para melhorar (promover) o amaciamento de partes de tendão da carne

[0067] Neste exemplo, o efeito de uso combinado de levedura contendo metal para melhorar (promover) o amaciamento de partes de tendão da carne foi avaliado para várias proteases em um sistema de alimentação atual. O procedimento foi da maneira a seguir. (1) O peso de lombo da parte traseira bovino (lâmina de 12 mm) produzido na Austrália foi ajustado para 200 g aparando gordura excessiva, e foi usado como uma amostra. (2) A amostra obtida em (1) foi colocada em uma sacola para embalagem a vácuo. (3) Cada uma das proteases (Tabela 2) foi pesada em um peso de 5 mg, em termos de peso de proteína contida (1/40.000 do peso do lombo da parte traseira bovino), e dissolvidas em 200 mL de água corrente, e o resultante foi usado como uma solução de enzima. (4) Em relação ao grupo de teste de uso combinado com levedura contendo manganês (Mn.Y. +), a levedura contendo manganês foi adicionada à solução de enzima obtida em (3) em uma concentração de 0,2 μM, em termos de concentração de manganês. (5) A solução de enzima obtida em (3) foi colocada na sacola obtida em (2) para o grupo de teste de não uso de levedura contendo manganês (Mn.Y. -), a solução de enzima obtida em (4) foi colocada na sacola obtida em (2) para o grupo de teste de uso combinado de levedura contendo manganês (Mn.Y. +), e a embalagem a vácuo foi realizada. Para o grupo controle (Cont.), água corrente contendo ou não a levedura contendo manganês foi colocada na sacola obtida em (2), em vez da solução de enzima, e a embalagem a vácuo foi realizada. (6) As amostras foram armazenadas por toda a noite (18 horas) em refrigeração a 4 °C. (7) A sacola embalada a vácuo foi aberta, e a porção líquida foi drenada do lombo da parte traseira bovino em um filtro. (8) Ambas as lâminas do lombo da parte traseira bovino obtidas em (7) foram assadas em um forno Impinger a 250 °C. (9) A maciez das partes de tendão foi avaliada para cada grupo de teste em 7-graus (-3 pontos a +3 pontos) de avaliação organoléptica (n = 6).

[0068] Os resultados são mostrados na tabela 2. O efeito de uso combinado de levedura contendo manganês para melhorar maciez de partes de tendão foi obtido para todas as proteases derivadas de fungo Aspergillus ou bactéria Bacillus usadas para o exame. Por outro lado, o efeito de uso combinado de levedura contendo metal para melhorar maciez de partes de tendão não foi observado para a protease derivada de papaia (Carica papaya), mas pelo contrário, a maciez foi reduzida. Tabela 2

(n = 6) - Critérios de avaliação: avaliação de 7-graus de -3 pontos a +3 pontos - 3: Muito dura - 2: Dura - 1: Levemente dura 0: Regular (nem dura, nem macia) 1: Levemente macia 2: Macia 3: Muito macia

[0069] Da maneira descrita anteriormente, demonstrou-se que o amaciamento de partes de tendão da carne pode ser melhorado (promovido) pelo uso combinado de uma protease derivada de bactéria Bacillus ou fungo Aspergillus e uma levedura contendo metal.

Exemplo 3: Avaliação de efeito de uso combinado de levedura contendo metal para melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno da protease (2)

[0070] Neste exemplo, o efeito de uso combinado de várias leveduras contendo metal para melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno de uma protease derivada de bactéria Bacillus foi avaliado.

[0071] Os grupos de teste são mostrados na tabela 3. Como a protease, uma protease neutra derivada de uma bactéria Bacillus foi usada. Como a levedura contendo metal, a levedura contendo manganês, levedura contendo zinco, levedura contendo ferro, e levedura contendo magnésio (todas foram Saccharomyces cerevisiae, SCETI) foram usadas. Para cada grupo de teste, a reação enzimática foi realizada de acordo com o procedimento descrito no exemplo 1 (S/E = 40.000:1, levedura contendo metal foi usada em uma concentração final de 0,2 μM, em termos de concentração de metal), e a capacidade de decomposição específica de colágeno (capacidade de decomposição específica de tendão) foi calculada.

[0072] Os resultados são mostrados na tabela 3. O efeito para melhorar a capacidade de decomposição específica de colágeno (capacidade de decomposição específica de tendão) da protease derivada de bactéria Bacillus foi obtido pelo uso combinado de todas as leveduras contendo metal. Tabela 3

Aplicabilidade Industrial

[0073] De acordo com a presente invenção, a carne pode ser modificada, e a qualidade da carne pode ser assim melhorada. De acordo com uma modalidade da presente invenção, em particular, partes de tendão, que constituem um dos tecidos conjuntivos de carne, pode ser amaciados.

Claims

1. Modificador de carne contendo uma protease e uma levedura contendo metal, caracterizado pelo fato de que a protease consiste em um ou dois ou mais tipos de proteases selecionadas de uma protease derivada de uma bactéria Bacillus e uma protease derivada de um fungo Aspergillus.

2. Modificador de carne de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a levedura contendo metal consiste em um ou dois ou mais tipos de leveduras selecionadas de uma levedura contendo manganês, uma levedura contendo zinco, uma levedura contendo magnésio, e uma levedura contendo ferro.

3. Modificador de carne de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a levedura contendo metal é uma levedura contendo manganês.

4. Modificador de carne de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a protease é uma protease que exibe uma razão de capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação, com relação à capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação (capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação/capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação) maior que 1.

5. Modificador de carne de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a razão é 1,1 ou mais.

6. Modificador de carne de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que contém 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol da levedura contendo metal, em termos de quantidade de metal por 1 U da protease.

7. Modificador de carne de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é um agente amolecedor de tendão da carne.

8. Método para produzir um produto de carne processada, o método caracterizado pelo fato de que compreende tratar a carne com o modificador de carne como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Método para modificar a carne, o método caracterizado pelo fato de que compreende tratar a carne com o modificador de carne como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

10. Método para produzir um produto de carne processada, o método caracterizado pelo fato de que compreende tratar carne com uma protease e uma levedura contendo metal, em que a protease consiste em um ou dois ou mais tipos de proteases selecionadas de uma protease derivada de uma bactéria Bacillus e uma protease derivada de um fungo Aspergillus.

11. Método para modificar a carne, o método caracterizado pelo fato de que compreende tratar carne com uma protease e uma levedura contendo metal, em que a protease consiste em um ou dois ou mais tipos de proteases selecionadas de uma protease derivada de uma bactéria Bacillus e uma protease derivada de um fungo Aspergillus.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a levedura contendo metal consiste em um ou dois ou mais tipos de leveduras selecionadas de uma levedura contendo manganês, uma levedura contendo zinco, uma levedura contendo magnésio, e uma levedura contendo ferro.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a levedura contendo metal é uma levedura contendo manganês.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a protease é uma protease que exibe uma razão de capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação, com relação a capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação (capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação/capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação) maior que 1.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a razão é 1,1 ou mais.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol da levedura contendo metal, em termos de quantidade de metal por 1 U da protease é preparada para agir na carne.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de que 0,1 U ou mais da protease por 1 g da carne é preparada para agir na carne.

18. Uso de uma protease e de uma levedura contendo metal, caracterizado pelo fato de que é para a manufatura de um modificador de carne, em que a protease consiste em um ou dois ou mais tipos de proteases selecionadas de uma protease derivada de uma bactéria Bacillus e uma protease derivada de um fungo Aspergillus.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a levedura contendo metal consiste em um ou dois ou mais tipos de leveduras selecionadas de uma levedura contendo manganês, uma levedura contendo zinco, uma levedura contendo magnésio, e uma levedura contendo ferro.

20. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a levedura contendo metal é uma levedura contendo manganês.

21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que a protease é uma protease que exibe uma razão de capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação, com relação à capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação (capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do uso de uma levedura contendo metal em combinação/capacidade de decomposição específica de colágeno observada no momento do não uso de qualquer levedura contendo metal em combinação) maior que 1.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a razão é 1,1 ou mais.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o modificador de carne contém 0,4 x 10-9 a 2,0 x 10-7 mol da levedura contendo metal, em termos de quantidade de metal por 1 U da protease.

24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que o modificador de carne é um agente amolecedor de tendão da carne.