BR0209540B1 - Aparelho, cartucho e dispositivo de exame e uso do aparelho de exame - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "APARELHO, CARTUCHO E DISPOSITIVO DE EXAME E USO DO APARELHO DE E- XAME".

Essa invenção refere-se a aperfeiçoamentos em e relacionados com sistemas de exame, especialmente sistemas de exame diagnóstico, em particular sistemas utilizáveis no ponto de cuidado, por exemplo no lugar de trabalho do médico ou ao lado do leito do paciente.

Muitos exames diagnósticos estão atualmente disponíveis, por exemplo exames para gravidez, açúcar no sangue, homocisteína, transferina deficiente de carboidrato, coágulo do sangue, colesterol do sangue, etc. Al- guns tais exames podem ser executados pelo paciente, e alguns pelo médi- co do paciente, mas muitos, especialmente esses que proporcionam um re- sultado quantitativo, devem ser atualmente executados em um laboratório distante de ambos o paciente e o médico e então resultam em atrasos signi- ficativos entre a amostragem e o teste e geralmente exigem que o paciente fa- ça uma visita adicional ao médico para obter os resultados do exame. Isso não é somente inconveniente para o paciente mas também aumenta os custos para o paciente ou para a organização que paga o cuidado da saúde do paciente.

Existe assim uma necessidade contínua de sistemas de exame, especialmente alguns proporcionando resultados quantitativos, operáveis pelo médico ou os colegas do médico no ponto de cuidado do paciente.

Sistemas de exame quantitativo freqüentemente exigem disposi- tivos de medição de volume altamente precisos, vários reagentes e detecto- res de leitura de resultado específicos do exame, e não é prático proporcio- nar aparelho de exame dedicado para uma ampla variedade de sistemas diferentes de exame no ponto de cuidado, tanto por razões de espaço quan- to custo.

Portanto, foi desenvolvido um aparelho de exame que, em mo- dalidades preferidas, é capaz de uso no ponto de cuidado, é capaz de utili- zação em uma faixa de exames diferentes, é capaz de produção de resulta- dos de exame quantitativos e é relativamente econômico.

Observada de um aspecto, a invenção proporciona um aparelho de exame, preferivelmente um aparelho de exame diagnóstico, que compre- ende: i) um cartucho de exame compreendendo pelo menos duas ca- vidades e uma pipeta posicionável em pelo menos duas das ditas cavidades, a dita pipeta tendo uma extremidade proximal e uma extremidade distai, a dita extremidade distai sendo fechada por uma membrana permeável ao lí- quido, ii) um suporte disposto para receber o dito cartucho, iii) recurso de acionamento operável para posicionar a dita pi- peta em cavidades selecionadas do dito cartucho, iv) um aplicador de pressão de gás que pode ser acoplado na dita pipeta, por meio disso, induzindo o fluxo do líquido através da dita mem- brana, v) um detector de radiação operável para detectar a radiação de uma cavidade do dito cartucho ou da dita pipeta; e, opcionalmente mas pre- ferivelmente, vi) uma fonte de radiação eletromagnética.

Observada de um aspecto adicional, a invenção proporciona um cartucho de exame compreendendo pelo menos duas cavidades e uma pi- peta posicionável em pelo menos duas das ditas cavidades, a dita pipeta tendo uma extremidade proximal e uma extremidade distai, a dita extremida- de distai sendo fechada por uma membrana permeável ao líquido.

Uma pipeta é um tubo com uma abertura em uma extremidade (a extremidade distai) para dentro da qual um líquido pode fluir na aplicação de uma pressão reduzida na outra extremidade (a extremidade proximal). No aparelho citado nos parágrafos precedentes, a extremidade distai da pipeta é formada em ponta com (fechada por) uma membrana permeável ao líqui- do. A extremidade proximal dessa pipeta pode ser aberta ou fechada mas se fechada então claramente isso deve ser por algum recurso que permite a aplicação de pressão necessária para a pipeta funcionar como uma pipeta.

Em uma modalidade descrita abaixo, a extremidade proximal da pipeta com ponta de membrana é fechada com uma membrana de autovedação perfu- rável (por exemplo uma gaxeta de borracha) e pressão pode ser aplicada através de uma agulha oca inserida através da membrana. Alternativamente, a extremidade proximal pode ser fechada por uma tampa removível ou rolha que é removida para permitir a aplicação da pressão, ou por um vedador frágil que é rompido para permitir a aplicação de pressão.

Observada de ainda um aspecto adicional a invenção proporcio- na um dispositivo de exame compreendendo a) um suporte de cartucho ca- paz de receber um cartucho de exame de acordo com a invenção; b) recurso de acionamento operável para posicionar a pipeta de um dito cartucho em cavidades selecionadas do dito cartucho; c) um aplicador de pressão de gás que pode ser acoplado na pipeta de um dito cartucho, por meio disso, indu- zindo o fluxo do líquido através dele; d) um detector de radiação operável para detectar a radiação de uma cavidade de um dito cartucho ou da sua pipeta; e, opcionalmente mas preferivelmente, e) uma fonte de radiação ele- tromagnética.

Assim a combinação do dispositivo e do cartucho da invenção proporciona um aparelho de exame de acordo com a invenção. O cartucho de exame preferivelmente é proporcionado para o usuário pré-cheio com os reagentes exigidos para o exame ou exames parti- culares a serem executados usando esse cartucho. Onde dois ou mais rea- gentes são necessários e esses não devem ser misturados antes que o exame seja executado, esses podem ser pré-cheios em cavidades diferentes no cartucho. De forma geral, tais reagentes serão pré-cheios nas cavidades em quantidades medidas. Tais reagentes podem por exemplo ser líquidos, pós, bolhas, revestimentos nas paredes da cavidade, revestimentos nas bo- lhas ou materiais impregnados em ou imobilizados na membrana da pipeta.

Onde os reagentes são líquidos ou onde eles são suscetíveis à degradação com a exposição ao ar ou umidade, o cartucho pode ser vedado para evitar a perda do líquido ou o acesso do ar ou umidade ao reagente suscetível. Tal vedação é convenientemente atingida pela formação do cartucho com uma base contendo a cavidade e uma tampa cobrindo a cavidade, e se necessá- rio colocando um vedador impermeável ao fluido, por exemplo um anel em O, entre as aberturas da cavidade na base e a tampa de cobertura da cavi- dade, e se desejado colocando um vedador removível, por exemplo uma tira de vedação adesiva, sobre a junção externa entre a tampa e a base. Em uma outra modalidade mais preferida, uma ou mais das cavidades podem ser vedadas com folha metálica antes do uso: nessa modalidade a tampa de cobertura da cavidade é preferivelmente equipada com cortadores de veda- ção de folha metálica para cortar os vedadores de folha metálica de cobertu- ra da cavidade para permitir que a pipeta seja inserida dentro dessas cavi- dades. Alternativamente, a tampa pode ser proporcionada com material resi- liente nas posições correspondendo aos topos das cavidades (ou apenas as cavidades contendo líquido) tal que quando a tampa e a base são impulsio- nadas, um vedador à prova de líquido é formado nos topos da cavidade. Tal material pode por exemplo ser uma camada revestida sobre a tampa ou dis- cos ou gaxetas presas (por exemplo, soldadas ou aderidas) na tampa. Em uma modalidade, a superfície inferior da tampa é produzida com projeções resilientes capazes de funcionar como rolhas para as cavidades. Dessa ma- neira, as rolhas servem para manter a tampa e a base juntas antes do uso do cartucho em um exame e depois da execução do exame, a base e tampa podem ser vedadas para descarte simplesmente impelindo as duas juntas fazendo com que as rolhas novamente vedem as cavidades. Isso é particu- larmente vantajoso quando as cavidades seguinte a execução do exame contêm materiais tóxicos ou potencialmente infecciosos. Tais tampas po- dem, se desejado, ser removidas antes do uso; entretanto, em uma modali- dade preferida, a tampa servirá para manter a pipeta e possivelmente tam- bém para proporcionar um recurso de fixação para o aplicador de pressão.

Em uma tal modalidade, o recurso de acionamento pode servir para mover a base em relação à tampa de modo a posicionar a pipeta nas cavidades de- sejadas nos diferentes estágios do exame.

Em geral, e particularmente onde a tampa do cartucho é propor- cionada com rolhas resilientes para as cavidades na base do cartucho, o aparelho e dispositivo da invenção preferivelmente compreendem recursos para separar a tampa da base, de modo que o cartucho possa ser carregado no dispositivo ainda vedado. Em uma modalidade, tal recurso de separação compreende uma cunha que é movida além do cartucho carregado e engata com projeções, por exemplo flanges, na tampa e base para forçar os dois a se separarem. Desejavelmente esse recurso de separação é automatica- mente colocado em operação seguinte ao carregamento do cartucho, por exemplo em resposta ao fechamento da tampa na câmara contendo o cartu- cho carregado ou no transporte do cartucho para dentro da câmara, por exemplo usando um transportador que pode remover similarmente o cartu- cho da câmara seguinte a execução do exame.

Para exames diferentes, por exemplo para diferentes analitos, diferentes cartuchos de exame podem ser proporcionados; entretanto, os cartuchos podem ser projetados para execução de dois ou mais exames di- ferentes. Nesse último caso, freqüentemente será desejável que o cartucho contenha duas ou mais pipetas tampadas com membrana, isto é, de modo que uma pipeta diferente possa ser usada para cada um dos exames.

As cavidades no cartucho podem ser proporcionadas em qual- quer modelo desejado, por exemplo como uma formação bidimensional (por exemplo como em placas de múltiplas cavidades convencionais), como uma formação linear ou como uma formação circular. O uso de formações circula- res e especialmente lineares é particularmente preferido já que o mecanismo exigido para mover o cartucho entre as posições pré-estabelecidas fica sim- plificado, isto é, o recurso de acionamento pode então operar para mover o cartucho ao longo de um caminho linear ou para girar o cartucho. O uso de uma formação linear de cavidades é especialmente preferido, particularmente uma formação compreendendo, em seqüência: uma cavidade de manipulação de material (opcionalmente antes do uso ar- mazenando uma pipeta com ponta capilar montada de modo removível na tampa do cartucho ou adaptada para receber durante o uso uma pipeta com ponta capilar que pode ser montada na tampa do cartucho); uma cavidade que antes do uso armazena a pipeta com ponta de membrana ou uma pipeta com ponta capilar adicional montada na tampa do cartucho, e uma ou uma série de duas ou mais (por exemplo até seis) cavidades para execução do exame e leitura do resultado do exame - essas cavidades podem conter rea- gentes e antes do uso tais cavidades que contêm o reagente podem ser ve- dadas com folha metálica e uma dessas cavidades pode ser de extremidade aberta ou lado aberto para facilitar a leitura do resultado. Em uma tal dispo- sição, a tampa e a base podem ser desejavelmente separadas antes que a execução do exame comece e novamente engatada somente quando a exe- cução do exame está concluída. Assim, a leitura do resultado nessa disposi- ção acontece enquanto a tampa e a base estão desengatadas uma da outra.

Nessa disposição, a tampa e a base ficam preferivelmente fechadas uma na outra, por exemplo por um fecho de pressão. A cavidade de manipulação do material pode conter, por exemplo, reagente seco para a mistura durante a execução do exame, um filtro para a separação da amostra (por exemplo para remover os eritrócítos de uma amostra de sangue), ou uma pipeta adi- cional capaz de engate correspondente com uma pipeta montada na tampa (por exemplo uma pipeta com ponta capilar).

Embora o cartucho deva conter pelo menos duas cavidades, uma ou mais posições na formação da cavidade de um cartucho de múltiplas cavidades podem ser de extremidade aberta ou lado aberto tal que a detec- ção da radiação da pipeta quando localizada em tais posições é facilitada.

Se a radiação de uma pipeta em uma cavidade é para ser detectada, então pelo menos uma porção da parede da cavidade deve ser transparente para o tipo de radiação a ser detectada.

As cavidades no cartucho podem permanecer estacionárias du- rante o exame; entretanto, como pode ser desejável usar o detector para monitorar o progresso do exame, geralmente é preferível que o recurso de acionamento seja operável para mover o cartucho entre duas ou mais posi- ções pré-estabelecidas de modo que o detector possa detectar a radiação de diferentes cavidades no cartucho. Alternativamente, mas menos preferi- velmente, o próprio detector pode ser móvel entre posições pré- estabelecidas ou espelhos móveis podem ser proporcionados de modo a permitir que o caminho de luz do cartucho para o detector seja variado para atingir o mesmo efeito.

Assim, em uma modalidade preferida, o recurso de acionamento operará durante o exame para levantar a tampa do cartucho e pipeta para longe da base que contém a cavidade (ou mais preferivelmente para afastar a base da tampa), para mover a base em relação a tampa (preferivelmente movendo a base, por exemplo linearmente ou por rotação) para trazer a pi- peta para alinhamento com a cavidade desejada, e para mover a tampa e a base juntas para colocar a pipeta na cavidade desejada, e assim por diante até que o exame esteja completo.

Em alguns exames, pode ser desejável inclinar as cavidades durante a transferência do líquido ou agitar o líquido em uma cavidade e dessa maneira é desejável que o recurso de acionamento também seja ope- rável para inclinar ou agitar (por exemplo balançar ou sacudir) pelo menos a porção contendo a cavidade do cartucho. O recurso de acionamento pode ser manualmente operável, por exemplo um acionamento mecânico ou um acionamento acionado por motor ativado em cada estágio pelo operador; entretanto ele preferivelmente será um acionamento a motor ativado para executar as ações exigidas por um computador externo ou mais preferivelmente interno que opera o aparelho de exame.

As cavidades no cartucho podem ser de qualquer forma ou vo- lume desejado; entretanto preferivelmente elas serão cilíndricas com lado reto ou menos preferivelmente cilíndricas cônicas. O perfil de tais cavidades cilíndricas pode ser de qualquer forma desejada, por exemplo circular, oval, poligonal (por exemplo retangular), semicircular, etc. As bases da cavidade podem ser planas ou curvadas; entretanto para cavidades que devem ser monitoradas de debaixo durante ou no final do exame, a base da cavidade preferivelmente será plana. Em uma modalidade particularmente preferida, a base da cavidade é plana e inclinada, isto é não horizontal. As cavidades podem ficar dentro de uma base sólida ou alternativamente, e menos prefe- rivelmente, as cavidades podem ser conectadas em um formato de tira, pla- ca, disco, margarida de impressão, etc. As paredes da cavidade, por exem- plo a base contendo a cavidade sólida, preferivelmente será de plástico, es- pecialmente plástico transparente claro, por exemplo plástico acrílico, viníli- co, estirênico ou olefínico. A escolha do plástico particular, entretanto, de- penderá, como é convencional, da natureza dos reagentes usados. Foi veri- ficado ser particularmente preferível usar plásticos com boas propriedades óticas e pequena permeabilidade ao gás e/ou líquido. Para essa finalidade, copolímeros de alfa-olefinas (por exemplo etileno e propileno, especialmente etileno) e olefinas cíclicas (por exemplo norborneno) são especialmente preferidos, por exemplo o produto vendido sob o nome comercial Topas® 8007 por Ticona GmbH de Frankfurt, Alemanha (Topas® 8007 é um copolí- mero de etileno/norborneno). Desejavelmente tais copolímeros têm uma transmissão de luz (medida de acordo com ASTM D1003 para uma espessu- ra de parede de 2 mm) de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo me- nos 90%, e uma permeabilidade ao vapor de água (em 23°C e 85% RH, me- dida de acordo com DIN 53122 em uma amostra de 80 x 80 x 1 mm) menor do que 0,2 g.mm.m’2d'1, mais preferivelmente menor do que 0,5 g.mm.m’2d‘1.

Tipicamente, as cavidades terão diâmetros internos de 3 a 20 mm, especialmente 5 a 15 mm e volumes de 0,1 a 5 mL, especialmente 0,5 a 1,5 mL. A pipeta com ponta de membrana no cartucho da invenção é preferivelmente cilíndrica e a membrana fica preferivelmente em ou mais preferivelmente cobrindo uma extremidade. A outra extremidade aberta é preferivelmente moldada para fixação substancialmente à prova de gás em um aplicador de pressão. A pipeta pode ser de qualquer material adequado; entretanto plástico transparente ou vidro é preferido. A membrana pode ser presa na pipeta em qualquer modo apropriado, por exemplo pela sondagem (por exemplo soldagem ultra-sônica ou térmica), adesivo, fusão de um pre- cursor de membrana granular, etc. A própria membrana pode ser de qualquer material apropriado, por exemplo plásticos (por exemplo náilon, polissulfonas, etc.), vidro (por exemplo fibra de vidro), metal, etc. Entretanto membranas celulósicas (por exemplo nitrocelulose reforçada) são especialmente preferidas já que elas são relativamente diretas para imobilizar os anticorpos ou outros reagentes do exame em tais materiais.

Em várias modalidades da invenção, a membrana é preferivel- mente planar e perpendicular ao eixo da pipeta; tais membranas são parti- cularmente efetivas para remoção do líquido de uma cavidade com fundo horizontal plano ou côncavo. A membrana, entretanto, pode alternativamente e mais preferi- velmente ser planar mas inclinada em relação ao eixo da pipeta, por exem- plo até 85° afastada da perpendicular ao eixo, preferivelmente 10 a 80° afastada da perpendicular, mais preferivelmente 50 a 70° afastada da per- pendicular, especialmente cerca de 60° afastada da perpendicular. Onde a pipeta e uma ou mais das cavidades é retangular (por exemplo quadrada) na seção transversal, é preferido que a membrana seja inclinada e que a base de uma ou mais tais cavidades, da mesma forma, seja inclinada de modo a ficar substancialmente paralela à membrana quando a pipeta está nessa cavidade. O uso de uma membrana inclinada é especialmente vantajoso já que para uma dada área transversal da pipeta, a área de superfície da membrana é aumentada à medida que ela é inclinada progressivamente mais da horizontal, assim produzindo uma área de superfície maior a ser lida ou monitorada durante o exame. Mais surpreendentemente, não somente as membranas inclinadas permitem que essencialmente todos os conteúdos de uma cavidade correspondentemente moldada sejam absorvidos através da membrana mas também a absorção é uniforme através da membrana (isto é se um analito colorido fica preso na membrana, a membrana fica uniforme- mente colorida). Uma vantagem adicional é que a membrana pode ser ob- servada a partir do lado evitando qualquer risco de queda de gotículas da amostra, reagente, etc., sobre a ótica do aparelho. Uma vantagem ainda adicional é que a membrana pode facilmente ser iluminada sem fazer com que uma alta incidência da luz que ilumina seja refletida para dentro do de- tector de luz. Uma outra vantagem é que, mesmo com uma amostra colorida (por exemplo, sangue), é possível monitorar a superfície da membrana atra- vés da parede lateral da cavidade e assim terminar qualquer etapa de rea- ção quando a mudança desejada na superfície da membrana tiver ocorrido já que o espaçamento da parede da membrana para a cavidade pode ser menor do que esse para uma membrana horizontal em uma cavidade con- tendo líquido. Ainda uma outra vantagem adicional é que a formação de bo- lhas entre a membrana e a parede da cavidade em confrontação é reduzida em relação ao caso para membranas horizontais, assim reduzindo a neces- sidade de inclinar ou sacudir a base do cartucho. O uso de pipetas com pontas de membrana inclinadas é imagi- nado ser novo e assim observada de um aspecto adicional, a invenção pro- porciona uma pipeta cuja extremidade distai é cilíndrica e com ponta tampa- da por uma membrana porosa, cuja superfície externa é inclinada para longe do plano perpendicular ao eixo cilíndrico da dita extremidade distai, a dita pipeta preferivelmente formando parte de um cartucho de exame diagnósti- co. O uso de uma seção transversal retangular para uma cavidade é especialmente preferido já que ele reduz a incidência do aprisionamento dos reagentes líquidos na extremidade superior das cavidades pelos efeitos ca- pilares seguinte a inversão dos cartuchos de exame durante o transporte ou armazenamento. Os cantos onde as paredes laterais da cavidade se encon- tram, portanto, devem desejável mente ser tão fechados quanto possível nas extremidades superiores das cavidades, por exemplo tendo um raio de cur- vatura de 0,5 mm ou menos, por exemplo 0,1 mm ou menos. Entretanto, para evitar que os líquidos na base das cavidades "aproximem-se" dos can- tos da cavidade, é desejável que na extremidade inferior das cavidades os cantos sejam chanfrados ou mais arredondados, por exemplo tendo um raio de curvatura de pelo menos 0,5 mm, de preferência pelo menos 0,8 mm.

Onde uma cavidade é para ser usada para a leitura do exame, por exemplo onde a absorção da luz que passa através de um líquido na cavidade é para ser medida, é também particularmente preferido usar uma cavidade de perfil retangular com uma base inclinada. Dessa maneira, pela dissimulação apropriada da seção da cavidade visível para o detector, a pessoa pode escolher medir a luz transmitida através da largura total da ca- vidade ou através de uma largura mais estreita na base da cavidade (isto é entre uma parede lateral e a base inclinada). Dessa maneira o comprimento da trajetória da luz através da cavidade pode ser aumentado ou diminuído movendo a seção visível para cima ou para baixo. Dessa maneira, por exemplo, onde a densidade ótica dos conteúdos da cavidade é alta, um comprimento de trajetória mais curto pode ser escolhido.

Além do mais, pela medição da intensidade de transmissão da luz em um ou mais comprimentos da trajetória (por exemplo dentro e acima da porção de base cônica da cavidade), a contribuição das paredes da cavi- dade para o sinal detectado pode ser determinada e corrigida.

Onde a luz dispersa é para ser detectada (por exemplo onde a amostra sendo lida contém partículas ou aglomerados ou é fluorescente ou fosforescente), novamente será desejável usar cavidades com perfil retan- gular com a luz incidente sendo direcionada perpendicular a um par das pa- redes da cavidade e com a luz dispersa sendo detectada por um detector (por exemplo, câmera digital) direcionada em uma das outras paredes. Onde o cartucho contém uma formação linear de cavidades, a cavidade de leitura para medições de dispersão da luz fica preferivelmente em uma extremidade da formação.

Esse uso das cavidades de parede inclinada é também novo e forma aspectos adicionais da invenção.

Observada de um aspecto adicional a invenção assim proporci- ona um aparelho de exame que compreende: i) um cartucho de exame compreendendo pelo menos uma cavi- dade e uma pipeta que pode ser posicionada em pelo menos uma dita cavi- dade, pelo menos uma dita cavidade tendo duas paredes laterais planares paralelas unidas por uma parede de base compreendendo pelo menos uma face planar, cuja normal à sua superfície é coplanar com e não perpendicular às normais às superfícies planares paralelas das ditas paredes laterais, ii) um suporte disposto para receber o dito cartucho, iii) recurso de acionamento operável para posicionar a dita pi- peta em cavidades selecionadas do dito cartucho, iv) um aplicador de pressão de gás que pode ser acoplado na dita pipeta por meio disso induzindo o fluxo do líquido através da dita mem- brana e v) um detector de radiação operável para detectar a radiação de uma cavidade do dito cartucho ou da dita pipeta.

Nesse aspecto a base é preferivelmente planar, inclinada para a horizontal como descrito acima e a cavidade é preferivelmente de perfil re- tangular. O cartucho, além disso, preferivelmente contém pelo menos uma pipeta com ponta capilar e/ou pipeta com ponta de membrana, novamente como descrito aqui.

Observada de um aspecto ainda adicional, a invenção proporci- ona um cartucho de exame compreendendo pelo menos uma cavidade e uma pipeta posicionável em pelo menos uma dita cavidade, pelo menos uma dita cavidade tendo duas paredes laterais planares paralelas unidas por uma parede de base compreendendo pelo menos uma face planar, cuja normal a sua superfície é coplanar com e não perpendicular às normais às superfícies planares paralelas das ditas paredes laterais.

Além de uma pipeta com ponta de membrana, os cartuchos da invenção podem conter uma ou mais pipetas adicionais, novamente de pre- ferência transportadas pela tampa do cartucho, por exemplo para medir um volume preciso de reagente ou amostra ou para misturar os reagentes e amostras. Em uma modalidade preferida o cartucho contém uma pipeta com ponta capilar que puxa para cima uma quantidade desejada do fluido de uma amostra em virtude da sua ação capilar. Particularmente de modo desejável isso compreende uma abertura capilar em uma câmara de diâmetro interno mais largo tal que a ação capilar faz com que somente a ponta capilar en- cha. Com a ponta retirada do líquido circundante, os conteúdos da ponta podem então ser ejetados para dentro de uma cavidade do cartucho sob pressão ou aspirados para cima mais para dentro da pipeta além da ponta capilar e câmera.

Em um outro aspecto da invenção, o cartucho pode compreen- der uma pipeta com ponta capilar no lugar da pipeta com ponta de membra- na. Como será discutido adicionalmente abaixo, um tal cartucho pode ser usado por exemplo em um exame do tempo de coagulação. O diâmetro externo da pipeta com ponta de membrana é preferi- velmente pelo menos 0,8 mm, por exemplo 1 a 5 mm, especialmente 1,5 a 2,5 mm, menor do que o diâmetro interno das cavidades de modo a facilitar o fluxo do gás entre a parede da cavidade e a pipeta durante a transferência do líquido através da membrana da pipeta e para garantir absorção substan- cialmente completa do líquido das cavidades. O vão livre também permite que a cavidade contenha o líquido (por exemplo 200 μΙ_) e a pipeta com ponta de membrana antes da absorção do líquido para dentro da pipeta.

Embora a pipeta e as cavidades possam ter o mesmo modo de forma transversal (isto é, circular, quadrada, etc.), pode ocasionalmente ser preferido que as formas difiram ligeiramente, por exemplo uma sendo circu- lar e a outra elíptica, já que isso reduz o risco da pipeta com ponta de mem- brana ser mantida pela sucção no fundo de uma cavidade. Esse problema pode ser similarmente tratado fazendo a ponta da pipeta ou a base da cavi- dade ligeiramente irregular, por exemplo com indentações ou projeções.

Em uma modalidade particularmente preferida, o cartucho com- preende: uma base contendo uma pluralidade, por exemplo 2 a 8 ou 10, das cavidades, pelo menos duas e preferivelmente pelo menos 3 das quais são livres de reagentes líquidos e pelo menos uma das quais contém um rea- gente líquido; e uma tampa transportando a pipeta com ponta de membrana tal que ela é disposta com a extremidade da membrana em uma das cavida- des vazias e com a extremidade aberta acessível na superfície externa da cobertura, e tendo uma abertura de aplicação de amostra através da cober- tura para se comunicar com uma outra das cavidades isentas de líquido. De- sejavelmente vedadores removíveis são proporcionados para cobrir as ex- tremidades abertas da pipeta e a abertura de aplicação da amostra. A me- nos que a tampa transporte rolhas de vedação da cavidade ou as cavidade sejam vedadas como descrito acima, um vedador removível adicional prefe- rivelmente será proporcionado para circundar a junção externa da tampa e base e anel em O ou outros vedadores serão proporcionados ao redor pelo menos das cavidades contendo líquido entre a tampa e a base. Em qualquer dessas maneiras, o interior do cartucho é isolado do ar e umidade antes do uso. A base e tampa preferivelmente têm indentações ou projeções para engate com o suporte do cartucho e recurso de acionamento, para garantir o alinhamento correto entre a tampa e a base durante a execução do exame, e se a tampa transporta rolhas de vedação da cavidade, para engate com um separador tal como descrito acima que opera para separar a tampa e a base para permitir que o exame prossiga. A base e a tampa são preferivelmente tais que a pipeta com ponta de membrana pode ser colocada dentro de uma "cavidade de leitura" ou em uma posição livre de cavidade na qual a radiação da pipeta é acessí- vel para o detector. Uma tal "cavidade de leitura" pode, por exemplo, ter uma base plana transparente à luz ou seção de cavidade lateral plana através da qual a luz pode passar para o detector. No caso onde a leitura fica em uma posição isenta de cavidade, essa pode ser por exemplo uma abertura com extremidade aberta através da base ou uma porção da base onde sua pare- de lateral é removida ou rebaixada tal que a luz da pipeta pode alcançar o detector sem passar através do material do qual a base é formada. O uso de uma "cavidade de leitura" é preferido desde que a pos- sibilidade dos reagentes ou amostra pingarem dentro do corpo do aparelho do exame é reduzida. Onde uma membrana inclinada é para ser lida, o uso de uma cavidade de leitura separada pode ser evitado já que levantar sim- plesmente a membrana para fora do líquido em uma cavidade ou aspirar o liquido através da membrana para dentro da pipeta deixa a superfície da membrana exposta para a leitura.

Em uma modalidade, a base pode ser formada para proporcio- nar uma superfície refletida (por exemplo, uma superfície de prisma plástico) sob o fundo da cavidade de leitura que reflete a luz do fundo da cavidade de leitura, por exemplo da vertical para a horizontal. Dessa maneira, o detector não precisa ser posicionado abaixo do cartucho e problemas com queda de poeira ou líquido sobre o detector podem ser evitados. Como em uma lente Fresnel, o prisma pode similarmente ser produzido como uma combinação integral de elementos de prisma individuais paralelos. Essa estrutura do prisma é citada aqui como "prisma Fresnel", e tais prismas e seus usos, por exemplo como modificadores da trajetória de luz no aparelho ótico, por exemplo dispositivos de exame, formam aspectos adicionais da presente invenção. A distorção da imagem, devido à distorção da superfície freqüen- temente observada nas moldagens plásticas com uma espessura de mais do que poucos milímetros, é reduzida ou evitada pelo uso de um prisma Fresnel plástico ao invés de um prisma plástico convencional tendo a mesma área de superfície de incidência da luz. Assim, o uso de um prisma Fresnel for- mado na base do cartucho para obter a reflexão da luz é especialmente preferido nos dispositivos da invenção. Um "prisma Fresnel" típico, é uma estrutura de material transparente escalonado em um lado e plano no outro - a luz incidente normalmente na parte horizontal de um degrau é interna- mente refletida pela superfície plana e parte normalmente através da parte vertical de um degrau. Na realidade, portanto, ele funciona como um espe- lho. Com uma membrana inclinada, entretanto, um tal prisma Fresnel geral- mente não será necessário.

Nos cartuchos da invenção, a extremidade proximal ou "aberta" de pelo menos uma pipeta é preferivelmente vedada com uma membrana de autovedação resiliente, por exemplo uma membrana de borracha, que pode ser perfurada por uma agulha oca para permitir a aplicação da pressão do gás. Nessa modalidade, um reservatório de resíduo é preferivelmente dis- posto na pipeta entre a ponta da pipeta e a membrana resiliente. Com essa modalidade, o líquido no cartucho pode ser puxado para cima para dentro do reservatório de resíduo durante ou no fim da execução do exame, de modo que o cartucho usado pode ser removido e descartado sem que vazamento de resíduo ocorra. O aplicador de pressão de gás no aparelho da invenção pode compreender, por exemplo, uma bomba e um conduto da bomba para um acessório do cartucho, e opcionalmente pelo menos um reservatório e duas ou mais válvulas de posição. A inclusão de um reservatório, por exemplo de capacidade de um ou mais litros, e preferivelmente pelo menos dois reser- vatórios, permite que pressões acima e/ou abaixo da ambiente sejam aplica- das na pipeta por curtas durações com variação de tempo insignificante da pressão aplicada devido à capacidade de isolar a pipeta da bomba e devido à mudança relativamente pequena de pressão dentro do reservatório duran- te o período de aplicação de pressão (como resultado do tamanho relativa- mente grande do reservatório). Entre as aplicações da pressão, a bomba pode ser usada para trazer a pressão do reservatório de volta para o nível desejado. Desde que pode ser desejável descarregar a pipeta para a atmos- fera e/ou produzir pressões acima e abaixo da ambiente para a pipeta, é de- sejável colocar uma válvula de múltiplas posições no conduto a montante da pipeta para permitir tais aplicações de pressão diferente. A válvula, que de- sejavelmente deve também incluir uma posição fechada não permitindo fluxo de gás para ou da pipeta, é preferivelmente operada por computador. O uso de reservatórios de pressão como descrito acima, entretanto, resulta em uma exigência de espaço relativamente grande para o aparelho e dispositivo da invenção. Desde que o dispositivo é preferivelmente portátil, é preferido, ao invés disso, usar uma bomba com base em êmbolo (por exemplo, uma seringa) acoplada via um conduto (preferivelmente de volume mínimo) em um acessório do cartucho. Na realidade, é especialmente preferido ter uma formação de bombas de êmbolo acopladas, cada uma conectada em um acessório separado do cartucho de modo que, quando o cartucho está no lugar, a operação de um motor de bomba faz com que todas as bombas o- perem. Nessa modalidade, o cartucho é preferivelmente proporcionado com recurso vago ou ativo para engatar cada um desses acessórios, o recurso de engate vago simplesmente permitindo que a bomba do êmbolo respectiva descarregue. Em certas modalidades, por exemplo nas medições do tempo de coagulação ou onde um analito é exigido para se aglutinar a um ligante imobilizado na membrana da pipeta, pode ser desejável acelerar ou retardar a passagem do líquido sob a influência do aplicador de pressão, nessas cir- cunstâncias isso pode ser realizado, por exemplo, acelerando ou retardando a velocidade dos êmbolos nas bombas de êmbolo. O aplicador de pressão é preferivelmente acoplado diretamente na extremidade aberta da pipeta; entretanto, alternativamente e muito menos preferivelmente, ele pode ser acoplado diretamente em uma cavidade no cartucho com a extremidade aberta da pipeta aberta para a pressão ambi- ente.

Em uma modalidade particular, um acessório do aplicador de pressão (preferivelmente móvel) é proporcionado para cada cavidade ou posição de leitura livre de cavidade do cartucho e o cartucho é proporciona- do com recurso vago ou ativo para engatar cada um desses acessórios.

Dessa maneira, pode ser possível evitar a necessidade pela orientação cui- dadosa do cartucho durante a colocação no suporte — o cartucho podería ser colocado em qualquer uma das orientações permitidas préestabelecidas e a tampa do aparelho fechada para colocar os acessórios automaticamente em engate com o recurso de engate vago e ativo no cartucho. A identificação do cartucho (como discutido adicionalmente abaixo) pelo aparelho então permi- tiría que o cartucho fosse movido automaticamente para a orientação correta para o começo do exame. Entretanto, isso é, somente especialmente dese- jável se é importante reduzir o tempo exigido para a colocação do cartucho ou se o cartucho é projetado para uso em múltiplos exames (isto é, tem múl- tiplas pipetas). O detector no aparelho da invenção pode ser qualquer detector de radiação apropriado, por exemplo, um detector de emissão radioativa ou um detector de radiação eletromagnética. Alternativamente, o aparelho pode conter dois ou mais detectores capazes de detectar tipos diferentes de radi- ação. Entretanto, para uso no ponto de cuidado, é preferido que o detector seja um detector de radiação eletromagnética e mais especificamente um detector capaz de detectar a luz em pelo menos parte da faixa UV a IV, par- ticularmente a faixa perto do UV a perto do IV e mais especialmente a faixa visível. (O termo luz é usado aqui para significar a radiação eletromagnética na faixa do UV ao IV.) Para essa finalidade, é especialmente preferido usar uma câmara digital como o detector. O uso de uma câmera digital como o detector é especialmente preferido desde que ela possa funcionar não somente como um detector de luz, mas como um analisador da estrutura da imagem. Assim, por exemplo, irregularidades na imagem de uma membrana em uma pipeta podem ser detectadas e corrigidas.

Entre o detector e o cartucho pode ser desejável colocar, de maneira móvel ou fixa, itens que servem para selecionar a energia de radia- ção que pode passar para o detector (por exemplo, filtros, prismas, etc.) ou para reduzir o impacto de radiação perdida no detector (por exemplo, abertu- ras e armadilhas para luz).

Os itens de redução da radiação perdida são especialmente im- portantes onde a radiação a ser detectada é fraca (por exemplo, resultante da quimioluminescência ou fluorescência) ou estimulada ou resulta da transmissão ou reflexão da radiação mensurável pelo detector. Em tais cir- cunstâncias, as barreiras de luz ou colimadores podem também ser propor- cionados em outro lugar no aparelho ou dentro do cartucho.

Em geral, o aparelho da invenção será proporcionado com fon- tes de radiação eletromagnética (por exemplo, fontes de luz visível ou perto do IR a perto do UV), dispostas para fazer com que a radiação emitida, re- fletida ou transmitida pelas cavidades do cartucho desejado ou pipetas pas- se para o detector. Como resultado é também preferido que o cartucho, su- porte do cartucho e detector sejam dispostos em uma câmera à prova de luz no aparelho e que o aparelho seja proporcionado com um orifício de acesso que pode ser fechado para a colocação do cartucho, por exemplo uma tam- pa. É especialmente preferido que uma fonte de luz seja proporcio- nada que, quando o cartucho está no lugar, tem uma cavidade entre ela e o detector, por exemplo, de modo que a transmitância da luz na cavidade pos- sa ser determinada. Para essa finalidade, o cartucho pode ser proporcionado com uma abertura dentro da qual uma tal fonte de luz pode ser inserida no carregamento do cartucho, de preferência uma abertura axialmente posicio- nada onde as cavidades no cartucho são dispostas ao redor de um eixo central.

Será verificado que o detector pode ser posicionado em relação à cavidade e fonte de luz de modo a detectar a luz transmitida, refletida, dis- persa ou emitida.

Onde o detector é uma câmera digital (ou um leiser de varredu- ra), ele pode também ser usado para identificação do exame. Assim, um có- digo de barras ou código legível por máquina similar pode ser colocado no cartucho de exame e, lendo esse, o computador que faz funcionar o apare- lho pode identificar a natureza do exame e, portanto, as etapas de exame necessárias a efetuar. O usuário do exame pode similarmente aplicar um código de barras ou código legível por máquina no cartucho de exame para identificar o paciente de modo que o aparelho pode gerar um relatório identi- ficando o paciente e exame ou pode gerar uma entrada em ou para os re- gistros computadorizados do paciente. Os sistemas de leitura de código e leitura de resultado dessa natureza são discutidos por exemplo, no WO 98/32004.

Como mencionado acima, os cartuchos nos quais a pipeta é com ponta capilar ao invés da ponta com membrana podem conveniente- mente ser usados para examinar o tempo de coagulação no sangue ou plasma (preferivelmente sangue). A pipeta convenientemente compreende em seqüência uma ponta capilar, uma câmara e um segundo capilar, que pode ser não linear, por exemplo tortuoso, se desejado. Abrir o cartucho e mergulhar a ponta capilar em uma amostra de sangue faz com que ele se encha até a junção com a câmara, isto é, absorva um volume predetermina- do da amostra. O cartucho pode então ser fechado e colocado no dispositivo de exame. O segundo capilar ou uma das cavidades no cartucho é revestida com um agente de estimulação de coágulo (por exemplo, fator de tecido) e a amostra líquida pode ser colocada em contato com ele pela aplicação de pressão sub-ambiente ou acima da ambiente respectivamente na extremida- de aberta da pipeta. No primeiro caso, a pressão faz com que a amostra seja puxada através da câmara para dentro do segundo capilar e então fique em contato com o agente de estimulação do coágulo. No segundo caso, a pres- são aplicada expele a amostra para dentro da cavidade revestida. Se dese- jado, nesse segundo caso, a amostra e o agente de estimulação do coágulo podem ser misturados sendo puxados de volta para dentro da pipeta e expe- lidos novamente uma ou mais vezes. A seguir, a amostra é puxada através da ponta do capilar e da câmera no interior do segundo capilar. Em ambos os casos, o movimento da amostra no segundo capilar sob a pressão aplica- da é monitorado pelo detector até que a coagulação tenha prosseguido até a extensão que o movimento não seja mais detectável. Isso pode exigir que a amostra seja movimentada de um lado para outro no segundo capilar pela aplicação alternada de pressões abaixo e acima da ambiente.

Será verificado, portanto, que o mesmo capilar pode ser usado para coletar a amostra (por exemplo, sangue) e misturá-la com um ou mais reagentes (por exemplo, pelo seu bombeamento para dentro e para fora de uma cavidade no cartucho).

Em qualquer eventualidade, para medições do tempo de coagu- lação é importante que a temperatura da amostra seja controlada e assim é desejável que o dispositivo, por exemplo no suporte do cartucho, seja pro- porcionado com um controle de temperatura, por exemplo, uma placa quente com termostato, uma fonte de ar quente, etc.

Em uma modalidade alternativa, o tempo de coagulação no san- gue ou plasma pode ser determinado depositando a amostra em uma cavi- dade contendo um agente efervescente e controlando a taxa de elevação das bolhas geradas usando uma câmera digital.

Onde uma pipeta com ponta capilar é usada, pode ser desejável que ela seja proporcionada separada do cartucho, formada para poder ser posicionada em uma cavidade e que possa ser acoplada no aplicador de pressão.

Tais pipetas com ponta capilar e seu uso em conjunto com car- tuchos de exame formam aspectos adicionais da invenção.

Dessa maneira, observada de um aspecto adicional, a invenção proporciona um aparelho de exame que compreende: i) um cartucho de exame compreendendo pelo menos uma, e preferivelmente, pelo menos duas cavidades e uma pipeta que pode ser po- sicionada em pelo menos uma, e preferivelmente pelo menos duas das ditas cavidades, a dita pipeta tendo uma ponta capilar, ii) um suporte disposto para receber o dito cartucho, iii) recurso de acionamento operável para posicionar a dita pi- peta em cavidades selecionadas do dito cartucho, iv) um aplicador de pressão de gás que pode ser acoplado na dita pipeta por meio disso induzindo o fluxo do líquido através da dita mem- brana; e v) um detector de radiação operável para detectar a radiação de uma cavidade do dito cartucho ou da dita pipeta. Observada de ainda um aspecto adicional, a invenção também proporciona um cartucho de exame compreendendo pelo menos uma, e preferivelmente pelo menos duas, cavi- dades e uma pipeta que pode ser posicionada em pelo menos uma, e prefe- rivelmente pelo menos duas, das ditas cavidades, a dita pipeta tendo uma ponta capilar.

Usando as pipetas nos cartuchos de exame da invenção, é as- sim possível introduzir amostras de teste nas cavidades do cartucho, para misturar os reagentes ou reagentes e a amostra nas cavidades, para transfe- rir líquidos de uma cavidade para uma outra, etc. Pelo bombeamento dos líquidos para dentro e para fora de uma pipeta em uma cavidade é possível melhorar a homogeneidade da mistura e pelo bombeamento dos líquidos de um lado para outro através de uma membrana da pipeta de transporte do reagente, é possível aumentar a extensão da reação com o reagente. Pela variação da taxa na qual o líquido é bombeado através de uma membrana da pipeta de transporte do reagente, é também possível variar a extensão até a qual o reagente reage. Dessa maneira, o formato da pipeta e cartucho proporciona grande versatilidade para a execução do exame.

Onde o cartucho do exame inclui uma pipeta com ponta capilar, por exemplo para transportar as amostras de sangue, é freqüentemente de- sejável remover o fluido excessivo da superfície externa do capilar. Em tais casos, é preferido que uma das cavidades seja proporcionada com um lim- pador de pipeta absorvente contra o qual a ponta do capilar pode ser puxada de modo a fazer com que o limpador absorva qualquer fluido na superfície externa do capilar. Esse limpador pode, por exemplo, tomar a forma de uma compressa absorvente disposta em ou perto da extremidade superior da ca- vidade, por exemplo uma compressa em formato de U, preferivelmente en- talhada na base do U. Em uma tal modalidade, à medida que o capilar é reti- rado da cavidade, ele pode ser deslocado para o lado para engatar a ponta capilar com o entalhe. Desde que um tal deslocamento pode ocorrer antes que a pipeta com ponta de membrana seja totalmente retirada da cavidade na qual ela está disposta, pode ser necessário projetar as cavidades para evitar que a pipeta com ponta de membrana seja conduzida para uma pare- de lateral da cavidade. Assim, a cavidade para a pipeta com ponta de mem- brana pode ser mais larga ou alternativamente sua parede lateral pode ser parcialmente removida na extremidade superior da cavidade.

Ao invés de limpar a ponta capilar para remover a amostra ex- cessiva da parte externa da ponta, uma alternativa é inserir a ponta capilar em uma formação absorvente disposta paralela com o eixo da ponta capilar, por exemplo, fibras absorventes que se situam paralelas à ponta ou folhas de material absorvente (por exemplo, papel) com superfícies paralelas ao eixo da ponta capilar. Desde que a ponta aberta do capilar não entrará em contato com o material absorvente, os conteúdos do capilar não são removi- dos, enquanto a parte externa do capilar é limpa do fluido excessivo. Isso é particularmente importante com amostras de sangue. Dessa maneira, por exemplo, um capilar de 1 μΙ_ mostra precisão insuficiente a menos que o sangue que está aderido na parte externa do capilar seja removido. Na mé- dia, um capilar de 1 μΙ_ transporta 0,25 μΙ_ na parte externa. Sem a remoção do sangue que está aderido na parte externa, um CV (coeficiente de varia- ção) de cerca de 7-8% (volume do sangue distribuído) é encontrado. Com a remoção eficiente do sangue transportado na parte externa, o CV é reduzido para 1,0 -1,5%.

Onde a limpeza do capilar acontece como parte da execução do exame, o atraso de tempo antes da limpeza ocorrer pode levar a secagem do sangue na parte externa do capilar. Quando isso acontece o sangue não será todo absorvido e pode ser solubilizado durante uma etapa de diluição subseqüente. Se o usuário espera um minuto para coletar o sangue para o capilar para iniciar o instrumento, a limpeza é um tanto ineficiente. Esperar três minutos significa nenhuma absorção de sangue absolutamente.

Portanto, é grandemente preferível se a limpeza do capilar acontece imediatamente depois da absorção da amostra de sangue pelo capilar. Isso pode ser realizado dispondo em uma cavidade de recepção do capilar do cartucho uma formação absorvente como descrito acima, por exemplo uma tira de papel dobrada em uma forma de V com a extremidade aberta do V recebendo a ponta do capilar. O papel pode ser posicionado e mantido estável na cavidade pelo uso das forças do papel empurrando para fora contra as paredes da cavidade ou se necessário pela montagem do pa- pel em uma armação de sustentação. Quando o usuário introduz o suporte do capilar no cartucho, o capilar separará os dois braços superiores e o ca- pilar deslizará para baixo em contato com o papel nos dois lados opostos entre si. Essa construção com o papel paralelo ao capilar garante que ne- nhum sangue possa ser absorvido do interior do capilar e além disso, o ca- pilar nunca atingirá a parte do fundo do papel dobrado. Usando um capilar de 1 μ!_ e o sangue total, um CV (volume de sangue) de 0,75% foi atingido com essa construção.

Em uma modalidade preferida adicional, o cartucho de exame é proporcionado para o usuário com uma pipeta com ponta capilar a ser usada para retirada de amostra solta ou montada de modo separável no cartucho, por exemplo em uma cavidade final de uma formação de cavidade linear.

Nessa modalidade, montada de modo separável na ponta capilar, isto é, na extremidade distai da pipeta, está uma luva que engata firmemente e está preferivelmente nivelada com a extremidade aberta da ponta capilar. Na reti- rada da amostra pelo capilar, qualquer líquido externo excessivo, dessa ma- neira, gruda na parte externa da luva ao invés de na parte externa do próprio capilar. A luva é preferivelmente proporcionada, por exemplo na sua superfí- cie externa, com recurso para engatar com a superfície interna ou superior de uma cavidade no cartucho (por exemplo um flange que pode ser torcido, etc.) de modo que, quando a pipeta com ponta capilar carregada é pressio- nada para dentro dessa cavidade a pipeta com ponta capilar pode então ser removida da cavidade (por exemplo, no início da execução de um exame automático) deixando a luva e o líquido externo excessivo atrás na cavidade.

Experimentos mostraram que, na transferência de uma amostra de sangue de 1 μι usando um tal capilar protegido com luva, um CV (volume do san- gue) tão pequeno quanto esse que pode ser atingido com o limpador de pa- pel dobrado descrito no parágrafo prévio pode ser obtido.

Para certos exames, pode ser desejável executar uma separa- ção da amostra, por exemplo para gerar uma amostra de plasma a partir de uma amostra de sangue original. Em tais casos, pode ser desejável colocar um filtro em uma das cavidades. Esse pode ser removível ou alternativa- mente pode formar parte de uma extensão da pipeta integral acomodada na cavidade. Uma tal extensão de pipeta pode compreender, por exemplo, um cilindro aberto na sua extremidade superior onde ele é formado para engate com uma pipeta montada na tampa do cartucho, e embalado na sua extre- midade inferior com fibra de vidro. Em uma tal modalidade, a amostra pode ser puxada para cima para dentro de uma pipeta com ponta capilar montada na tampa do cartucho quando a tampa e a base são separadas ou em uma pipeta com ponta capilar que pode ser montada na tampa do cartucho. A seguir, com a tampa e a base engatadas, a amostra pode ser expelida sob pressão do ar para dentro do cilindro da extensão da pipeta; o filtrado irá passar para dentro da base da cavidade. Uma segunda pipeta com ponta em capilar montada na tampa pode então ser usada para puxar o filtrado para cima depois que a pipeta e a extensão da pipeta foram retiradas da ca- vidade. Dessa maneira, iniciando de uma amostra de sangue, uma amostra de plasma não diluído pode ser produzida.

Bem como extensões de pipeta, limpadores de capilar, etc., ou- tros itens podem ser dispostos dentro das cavidades do cartucho. Dessa maneira, por exemplo, a cavidade para receber um capilar de amostragem pode conter uma cavidade adicional fixa ou removível contendo um reagente seco, de modo que a amostra e esse reagente podem ser misturados no início da execução do exame. O aparelho, dispositivo e cartuchos da invenção são para uso em métodos de exame. Tais métodos, usando o aparelho, dispositivo ou cartuchos da invenção formam aspectos adicionais da invenção. Embora a invenção seja particularmente adequada para o exame de diagnóstico médi- co, ela pode também ser usada para outros exames, por exemplo ambien- tais, nutritivos, etc., incluindo exames de amostras de processos de fabrica- ção. Ela é particularmente adequada para tais usos já que os cartuchos e dispositivos podem ser produzidos suficientemente pequenos de modo a serem totalmente portáteis, por exemplo com a dimensão máxima do dispo- sitivo (excluindo quaisquer conectores para o equipamento externo ou fontes de energia) sendo menor do que 30 cm, mais preferivelmente menor do que 20 cm. O uso das pipetas com ponta de membrana nos exames é tam- bém novo e forma um aspecto adicional da invenção. Observada desse as- pecto a invenção proporciona um método de exame onde o líquido é transfe- rido de um recipiente para dentro de uma pipeta, caracterizado em que a extremidade da dita pipeta através da qual o líquido entra é vedada por uma membrana permeável ao líquido.

Observada de um outro aspecto, a invenção também proporcio- na o uso do aparelho da invenção para exame de um analito em uma amos- tra biológica ou para uma propriedade de uma amostra biológica, por exem- plo para examinar o tempo de coagulação em uma amostra de sangue ou derivada de sangue ou para examinar um analito de proteína em um fluido corpóreo ou amostra derivada de fluido corpóreo.

Os documentos citados aqui são incorporados por referência.

Exemplos de aparelho e métodos de acordo com a invenção se- rão agora mais ilustrados com referência aos Exemplos não-limitadores se- guintes e os desenhos acompanhantes, nos quais: A Figura 1 é um corte transversal esquemático através de um cartucho de acordo com a invenção, A Figura 2 é um corte transversal parcial esquemático através de um cartucho de acordo com a invenção, A Figura 3 é um corte transversal parcial esquemático através de um cartucho de acordo com a invenção, A Figura 4 é um desenho esquemático do aparelho de acordo com a invenção, A Figura 5 é um corte transversal esquemático através de um cartucho de acordo com a invenção.

As Figuras 6 e 7 mostram curvas de resposta de dose para os exames dos exemplos 1 e 2, A Figura 8 mostra os resultados do exame do exemplo 3, As Figuras 9 a 19 são vistas esquemáticas de modalidades adi- cionais dos cartuchos de acordo com a invenção nos quais as cavidades são dispostas em uma formação linear, A Figura 20 é uma vista esquemática mostrando como um ímã móvel pode ser usado para separar bolhas de polímero magnético de uma amostra em uma cavidade de um cartucho de acordo com a invenção, A Figura 21 é uma vista esquemática mostrando como uma tira de papel pode ser usada para limpar o líquido excessivo para fora da super- fície externa de uma pipeta com ponta capilar em um cartucho de acordo com a invenção, A Figura 22 é uma vista esquemática mostrando como um re- servatório de resíduo vedado com membrana pode formar parte de uma pi- peta em um cartucho de acordo com a invenção; e A Figura 23 é uma vista lateral transversal esquemática de uma pipeta com ponta capilar para uso em um cartucho de exame de acordo com a invenção.

Com referência à Figura 1, é mostrada uma base de cartucho cilíndrica plástica transparente 1 contendo cavidades cilíndricas 2 (somente duas das quais são mostradas) dispostas em uma formação circular ao redor do eixo do cartucho 3. Acima da base do cartucho 1 está disposta a cobertu- ra do cartucho 5. As entradas de cada cavidade são vedadas por rolhas 4 presas na cobertura 5. A cobertura 5 também mantém a pipeta 6, apresen- tando uma extensão do acessório do aplicador de pressão 7 para a parte externa da cobertura e com a membrana 8 - extremidade da pipeta com ponta disposta em uma cavidade 2 da base 1. Um orifício de introdução da amostra 9 está também presente na cobertura 5. O orifício 9 e a pipeta 6 são mantidos em alinhamento com as cavidades 2 por projeções e recessos cor- respondentes 10, 11, 12, 13. Projeções e/ou recessos correspondentes si- milares 14 (aqui mostrados como recessos) são proporcionados na base 1 e cobertura 5 para permitir que a base e cobertura engatem com o suporte do cartucho e recurso de acionamento (não-mostrado) do aparelho de exame. A base e a cobertura são proporcionadas com flanges 15 para engatarem com o separador (não-mostrado) que separa os vedadores da base e cobertura 16 antes que a execução do exame inicie. A natureza do exame para o qual o cartucho é planejado é identificada por uma etiqueta de código de barras 17 no lado da base. A pipeta e o orifício de aplicação da amostra são mos- trados vedados por vedadores de tira removíveis 16. Esses são removidos antes do cartucho ser usado.

Na Figura 2, o cartucho da Figura 1 é mostrado em uma orienta- ção diferente para a leitura do resultado do exame no final da execução do exame. Nessa orientação, as cavidades 18 e 19 mostradas são diferentes da cavidade 2 na Figura 1. A cavidade 18 é uma "cavidade de leitura" tendo um prisma plástico 20 colocado na sua base e parte da trajetória da luz da membrana para o detector é mostrada como uma linha pontilhada 21. A pi- peta 7 é mostrada como contendo o reagente usado 22. A fonte de luz 44 é mostrada no lugar dentro do canal axial 45 na base do cartucho.

Na Figura 3 é mostrada uma modalidade diferente do cartucho da Figura 2 na qual o fundo da cavidade de leitura 18 é escalonado e a base abaixo da cavidade de leitura 18 é inclinada por meio do que juntos formam um prisma Fresnel 29. A fonte de luz 46 é disposta para iluminar a membra- na. Nessa modalidade, a pipeta 7 é também mostrada com uma câmara de volume relativamente grande 47. Isso facilita a retenção dos líquidos usados no exame na pipeta.

Na Figura 4 os componentes do aparelho da invenção são mos- trados esquematicamente. O cartucho 23 (com a base 1, cobertura 5 e pi- peta 6) é mantido pelo suporte 24 e movido pelo recurso de acionamento 25. A pipeta 6 é conectada via condutos 26 nas bombas de êmbolo 27 aciona- das pelo motor 28. Um detector, uma câmera digital 32, é disposto para de- tectar a luz da cavidade de leitura do cartucho 23 quando o exame é con- cluído e as fontes de luz 44 e 46 com o abastecimento de energia 34 são dispostas para iluminar a cavidade de leitura. O recurso de acionamento 25, motor 28, câmera 32 e fonte de energia 34 são operados pelo computador 35 que proporciona uma saída no monitor/impressão 36 ou no computador remoto 37 (por exemplo, via uma conexão sem fio de infravermelho). A câmera 32, fontes de luz 44 e 46, su- porte 24 e cartucho 23 ficam dentro de uma câmara à prova de luz 38 pro- porcionada com um orifício de carga e descarga do cartucho 39. A Figura 5 mostra um corte transversal através de uma pipeta alternativa com ponta capilar utilizável nos cartuchos da invenção. A extremidade aberta da pipeta 39 é adaptada para ser presa no aplicador de pressão. A outra extremidade da pipeta é produzida com uma ponta capilar 40 que se comunica com a câmera 41 e daí via um capilar tor- tuoso adicional 42 para a extremidade aberta 39. A parte 43 da base da ca- vidade 2 é revestida com um agente de estimulação da coagulação, por exemplo fator de tecido. Mergulhar a ponta capilar 40 no sangue ou plasma faz com que uma amostra de volume fixo seja puxada para dentro pela ação capilar. Retirar a pipeta da amostra e, a seguir, expelir o conteúdo para den- tro da cavidade revestida com o agente de estimulação do coágulo e depois aspirar a amostra de volta para dentro do capilar ou aspirar a amostra além do fator de tecido no capilar, acelera o início da coagulação e a câmera di- gital pode ser usada para determinar o tempo no qual o fluxo da amostra ao longo do capilar 42 eficazmente cessa, isto é o tempo de coagulação.

As Figuras 9 a 19 mostraram disposições alternativas para um cartucho de exame no qual as cavidades são dispostas em uma maneira linear. A Figura 9 mostra uma pipeta com ponta capilar separada 50 que pode ser mergulhada em um líquido para absorver uma amostra. A pi- peta carregada pode então ser entalhada na abertura 51 na tampa do cartu- cho 52 assim dispondo a ponta capilar em uma cavidade de extremidade na base do cartucho 53. A extremidade superior aberta da pipeta 50 é proporci- onada com entalhes 54 de modo que se o operador engata a pipeta com a tampa do cartucho e base pressionando no topo da pipeta, isso não eleva a pressão na pipeta e assim expele um pouco ou toda a amostra prematura- mente. A Figura 10 mostra o cartucho da Figura 9 montado seguinte a inser- ção da pipeta de amostragem, isto é no estágio quando o cartucho está pronto para ser colocado no aparelho da invenção.

Durante a execução do exame, a tampa e base do cartucho se- rão separadas pelo desengate do mecanismo de fecho 84. O cartucho sepa- rado é mostrado na Figura 11. A tampa do cartucho 52 é mostrada trans- portando a pipeta com ponta capilar 50 e pipeta com ponta de membrana 55. A pipeta com ponta de membrana 55 é de perfil retangular e tem uma ponta inclinada 56. Por clareza, a membrana que cobre a extremidade inferior aberta da pipeta 55 não é mostrada. A base do cartucho 53 é mostrada com seis cavidades 57-62, todas geralmente de perfil retangular. Para permitir a limpeza da ponta capilar, uma porção da seção superior da parede entre as cavidades 57 e 58 é ausente. Como mostrado na Figura 12, as bases 63 das cavidades 59 a 62 são inclinadas de modo a ficarem paralelas com a ponta 56 da pipeta com ponta em membrana. As cavidades 59 a 62 são vedadas com folha metálica nas suas extremidades superiores. Os vedadores de fo- lha metálica são perfurados durante a execução do exame por perfuradores 64 inicialmente montados na tampa do cartucho (ver Figura 13). Os perfura- dores individuais são unidos em uma tira 65 mostrada na Figura 14. Cada perfurador, que pode ser metal mas preferivelmente é plástico, é um cilindro transversal retangular oco com uma borda de lâmina 66 no aro inferior e flanges 67 no aro superior que fazem com que o perfurador seja mantido pela base do cartucho depois que ele foi forçado para engate com a base (como mostrado na Figura 15). O perfil interno dos perfuradores é formado para agir como uma guia para as pipetas. A Figura 16 mostra a tampa e base do cartucho sendo separa- das com um deslocamento lateralmente para trazer a ponta capilar da pipeta 50 para contato com um limpador absorvente 68 disposto no topo da cavida- de 57. Como mostrado, a pipeta com ponta de membrana 55 é parcialmente deslocada da cavidade 58 para dentro da cavidade 57.

As Figuras 17 e 18 são vistas explodidas dos conjuntos de tampa e base do cartucho com extensões de pipeta 69 e 70 que em uso seriam dispostas na cavidade (57) dentro da qual a pipeta da a- mostragem 50 é inicialmente introduzida. No caso da Figura 18, a ex- tensão da pipeta 70 serve para transformar a pipeta da amostragem em uma pipeta com ponta de membrana, por exemplo, para permitir que uma amostra seja filtrada. A Figura 19 mostra as extremidades inferiores das três cavida- des dispostas para execução dos exames de coagulação do sangue tendo nas Figuras 19a e 19b uma bola de aço 72 móvel ao longo da base da cavi- dade e na Figura 19c uma bola de polímero 73 que irá flutuar na superfície da amostra enquanto ela ainda está fluida.

Alternativamente, a abertura pode ser vedada com um "êmbolo" alongado que é usado para pressionar os perfuradores através dos vedado- res de folha metálica das cavidades 58 a 62.

Na Figura 20, é mostrada uma cavidade 75 em um cartucho de acordo com a invenção. Essa cavidade contém um líquido 76 que contém bolhas de polímero magnético. Para separar as bolhas do líquido durante a execução do exame (por exemplo, como no exemplo 12 abai- xo), um ímã 77 é movido de uma posição (A) na qual ele está distante da cavidade para uma posição (B) na qual ele entra em contato com a pa- rede da cavidade. Uma pipeta com ponta de membrana pode então ser inserida na cavidade e usada para puxar o líquido deixando para trás as bolhas magnéticas.

Na Figura 21, é mostrado esquematicamente um cartucho 78 de acordo com a invenção com uma formação linear de cavidades 79-84, uma extremidade 79 das quais é disposta para receber um capilar de amostra- gem, cuja ponta 85 é mostrada. Dentro da cavidade 79 está disposta uma dobra em formato de V de papel absorvente 86 tal que a inserção da ponta capilar 85 na cavidade 79 faz com que os lados do capilar sejam limpos.

Na Figura 22, é mostrado parcialmente e esquematicamente um cartucho 87 de acordo com a invenção tendo pipetas com ponta capilar e ponta de membrana 88 e 89 na tampa do cartucho 90. A pipeta com ponta de membrana 89 tem em direção a sua extremidade proximal um reservató- rio de resíduo líquido 91 e quando no lugar dentro da tampa do cartucho 90 o reservatório é fechado por uma gaxeta de borracha de autovedação 92.

Onde a pressão é para ser aplicada na extremidade proximal da pipeta com ponta de membrana 89 isso é feito pela penetração da gaxeta 92 com uma agulha oca 93 presa em um aplicador de pressão (não-mostrado).

Na Figura 23 é mostrada uma pipeta com ponta capilar 94 que é proporcionada como parte de um cartucho de exame de acordo com a in- venção. Quando proporcionada para o usuário, a pipeta 94 está frouxamente posicionada em uma cavidade, por exemplo como a pipeta 50 na cavidade 57 na modalidade da Figura 11. A extremidade distai 95 da pipeta 94 é pro- porcionada com uma luva 96 que segura a extremidade da pipeta e firme- mente circunda e está nivelada com a ponta própria do capilar. O aro superi- or da luva 96 é proporcionado com um flange que pode ser torcido 97 que pode ser forçado além de um flange correspondente na cavidade de modo a prender a luva na cavidade. Em uso, a pipeta com ponta de capilar é remo- vida do cartucho com a luva 96 presa, mergulhada em uma amostra de lí- quido para puxar o líquido para dentro da ponta capilar, e reposta na cavida- de e pressionada para prender a luva na cavidade. O cartucho pode então ser carregado no dispositivo de exame e na operação do exame, a separa- ção da tampa e base do cartucho serve para desengatar a luva do capilar.

Exemplo 1 Exame para proteína C reativa no soro Amostras de 1 μΐ_ de sangue humano, reforçadas com proteína C reativa (CRP) purificada para concentrações variando de 0 a 160 mg/l são colocadas em uma cavidade com fundo redondo, diâmetro interno de 9 mm (em um cartucho de exame equivalente ao cartucho da Figura 1) contendo 200 μΙ_ de um líquido de diluição aquosa (30 mM de tampão de borato, pH 8,0 contendo 0,01% p/v de citrato de sódio, 0,02% p/v de NaN3 e desoxico- lato). A pipeta com ponta de membrana, tendo um diâmetro externo de 7,2 mm, é abaixada na cavidade que contém a amostra, e pressão abaixo da ambiente é aplicada na extremidade aberta da pipeta fazendo com que os conteúdos da cavidade fluam através da membrana para dentro da pipe- ta. Nesse Exemplo, a membrana da pipeta é uma folha de nitrocelulose ten- do imobilizada sobre ela um anticorpo anti-CRP monoclonal (preparado por técnicas convencionais). A pipeta é então removida da cavidade e abaixada em uma se- gunda cavidade da mesma configuração que contém 200 μΙ_ de uma disper- são aquosa de microbolhas de ouro (diâmetro médio de 4,5 nm, concentra- ção (densidade ótica em 540 nm) de cerca de 3, correspondendo a uma concentração de anticorpo de cerca de 50 pg/mL em 50 mM de tampão de borato pH 8,05, contendo 20 mM de NaCI, 0,05% p/v de NaN3 e 0,1% p/v de BSA) conjugadas no modo convencional para um anticorpo anti-CRP mono- clonal. Pressão abaixo da ambiente é novamente aplicada na extremidade aberta da pipeta fazendo com que o líquido na cavidade passe para dentro da pipeta, assim saturando a membrana com o conjugado de ouro. A pipeta é então removida da segunda cavidade e abaixada em uma terceira cavidade, novamente da mesma configuração, que contém 200 pL do líquido de diluição aquosa (supra). Pressão abaixo da ambiente é apli- cada na extremidade aberta da pipeta para puxar o reagente de lavagem para dentro da pipeta; dessa maneira, o conjugado de ouro não-aglutinado é removido da membrana. A pipeta é então removida da terceira cavidade e colocada em uma quarta cavidade vazia, com fundo plano, de 9 mm de diâmetro interno.

Para esse exame, essa quarta cavidade é a cavidade de leitura. A membra- na da pipeta é iluminada (por exemplo, com luz verde de um LED) através da base que contém a cavidade transparente do cartucho de exame e luz de 540 nm refletida pela membrana é detectada usando um detector (por exemplo, uma câmera digital ou um fotodiodo). A Figura 6 dos desenhos acompanhantes mostra a resposta da dose linear para esse exame usando um LED verde. A execução do exame exige cerca de 40 segundos da adição do soro até a determinação da refletância.

Exemplo 2 Exame para albumina do soro humano na urina A urina humana é esvaziada de albumina de soro humano (HSA) pela ultrafiltragem e depois reforçada com HSA purificada para concentra- ções entre 0 e 200 mg/L.

Uma amostra de 10 pL da urina é transferida em um capilar para uma cavidade de fundo redondo, de 9 mm de diâmetro interno, (em um car- tucho de exame equivalente ao cartucho da Figura 1) contendo 200 μι de tampão de fosfato de sódio aquoso, pH de 5,6 contendo 4,0% p/v de propan- 1 -ol, 0,05% p/v de NaN3, 0,003% p/v de Tropeolina-O e 0,5% p/v de BSA. A urina é misturada com o tampão de diluição sendo bombeada para dentro e para fora do capilar três vezes. O capilar é removido e a pipeta com ponta de membrana é abaixada na cavidade. Nesse exame a membrana é uma folha de nitrocelulose tendo imobilizado sobre ela um anticorpo anti-HSA mono- clonal. A amostra diluída é puxada para dentro da pipeta como no Exemplo 1. A pipeta é então removida da cavidade e abaixada em uma se- gunda cavidade tendo a mesma configuração porém contendo 200 μΙ_ de uma dispersão de conjugado de anticorpo de microbolha de ouro (como no Exemplo 1 porém com um anti-HSA ao invés de um anticorpo anti-CRP, 50 mM de tampão de borato pH 7,8, 0,05% p/v de NaN3 e 0,2% p/v de BSA).

Os conteúdos da cavidade são puxados para dentro da pipeta como no Exemplo 1, e como no Exemplo 1, a pipeta é então transferida para uma ter- ceira (lavagem) e quarta (leitura) cavidades. Nesse exame, o reagente de lavagem é PBS, pH 7,4. A Figura 7 dos desenhos acompanhantes mostra a curva de resposta de dose para esse exame.

Exemplo 3 Exame para hemoglobina com alicato no sangue 1 μι do sangue total é tirado de uma amostra de sangue usando um capilar montado na ponta de um recipiente cônico invertido, volume de cerca de 500 μι, isto é um dispositivo em formato de funil, na extremidade superior do qual é preso um aplicador de pressão. O capilar é abaixado em uma cavidade de fundo redondo, de 9 mm de diâmetro interno em um cartucho de exame (como descrito para os Exemplos prévios) contendo 200 μι de uma solução aquosa de conjugado de ácido borônico. A solução do conjugado compreende 0,25 mM de conjugado de ácido borônico de xileno-cianol (Exemplo 18 da US-A-5631364), 0,07% p/v de Triton X-100, 9 mM de cloreto de zinco e 100 mM de tampão HEPES, pH 8,15. A amostra do sangue é bombeada para dentro da cavidade e misturada com a solução do conjugado do ácido borônico pelo bombea- mento da solução para dentro e para fora do recipiente cônico três vezes. O capilar é removido e os conteúdos da cavidade podem incubar por dois mi- nutos. Isso permite que o detergente quebre as células sangüíneas, que o zinco precipite a hemoglobina e o conjugado do ácido borônico aglutine na hemoglobina com glicato. A pipeta com ponta de membrana é então abaixada na cavidade e pressão abaixo da ambiente é aplicada fazendo com que o líquido na cavi- dade passe para dentro da pipeta e a hemoglobina fique presa na membra- na. Nesse exame, a membrana é um filtro poroso tendo um diâmetro de poro de 1 μιτ). A pipeta é removida da cavidade e colocada em uma segunda cavidade de mesma configuração contendo 200 μΙ_ de um reagente de lava- gem aquoso (50 mM de tampão de morfolina, pH 9,5, contendo 200 mM de NaCI, 0,5% p/v de Triton X-100, 0,1% p/v de glicerol e 0,05% p/v de NaN3.

Pressão abaixo da ambiente é aplicada na pipeta puxando o reagente de lavagem e o conjugado do ácido borônico não-aglutinado para a pipeta. A pipeta é então removida e abaixada para dentro de uma cavi- dade de leitura vazia, de fundo plano, de 9 mm de diâmetro interno no cartu- cho para a medição refletométrica da hemoglobina presa na membrana da pipeta. A hemoglobina total é medida usando luz azul em 460 nm e hemo- globina com glicato usando luz vermelha em 620 nm (por exemplo usando LEDs vermelho e azul). A proporção da hemoglobina com glicato em relação à hemoglobina total (algumas vezes citado como %Hb1Ac) é determinada pela razão das refletâncias medidas, calibradas contra amostras com %Hb1Ac conhecidas. A Figura 8 dos desenhos acompanhantes mostra os resultados para o exame desse Exemplo para 6 amostras de sangue analisadas para %Hb1Ac 24 horas antes de usar HPLC (Variante, BioRad).

Exemplo 4 Eficiência de coleta do líquido para pipetas com ponta de membrana A eficiência da coleta do líquido de diferentes configurações de cavidade foi testada para uma pipeta com ponta de membrana de nitrocelu- lose planar como descrita no Exemplo 1 em comparação com uma pipeta com ponta aberta, cônica padrão. Em cada caso, 200 μΙ_ do líquido eram para ser retirados de uma cavidade de 9 mm de diâmetro interno com fundo plano ou redondo em uma base plástica mole ou dura (LPDE e poliestireno, respectivamente). Os resultados são apresentados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 Exemplo 5 Exame para tempo de coaqulação do sangue A pipeta da Figura 5 é usada para coletar uma amostra de san- gue de aproximadamente 2 μι. O cartucho é então novamente montado e a pressão é aplicada na pipeta para expelir a amostra de sangue para dentro de uma cavidade do cartucho, cuja base é revestida com um agente de es- timulação de coagulação (por exemplo fator de tecido). Pressão abaixo da ambiente é então aplicada para puxar a amostra de volta para dentro da pi- peta, além da câmara para dentro do capilar tortuoso. A amostra é então movimentada de um lado para outro no capilar tortuoso sob a aplicação de pressões acima da ambiente e subambiente e, usando a câmera digital, o tempo entre o contato da amostra de sangue com o agente de estimulação da coagulação e o término eficaz do movimento da amostra de sangue é determinado. Isso pode tipicamente ser cerca de 40 segundos.

Exemplo 6 Exame para tempo de coagulação para o sangue total ou plasma Um cartucho de exame do tipo mostrado na Figura 11 é usado.

Uma das cavidades 59 a 62 contém fator de tecido seco e cloreto de cálcio ou gliconato bem como uma bola de aço, por exemplo de 2 mm de diâmetro (ver Figura 19a). O aparelho no qual o cartucho é para ser colocado é produzido com um elemento de aquecimento para manter os conteúdos do cartucho em cerca de 37°C e com um ímã para movimentar a bola de aço ao longo da base da cavidade na qual está disposta.

Na cavidade 57 está disposta uma pipeta com ponta capilar re- movível capaz de absorver um volume preestabelecido de amostra, por exemplo 1 a 15 μΙ_, preferivelmente 10 μΙ_, do sangue total, sangue venoso com citrato, plasma ou plasma com citrato. A amostra é absorvida pela pipeta com ponta capilar que é então colocada no cartucho que é a seguir colocado no aparelho de exame. A amostra é então transferida para a cavidade que contém a bola de aço e misturada. O cartucho é então movimentado em relação ao ímã em uma direção horizontal paralela com a ponta da cavidade que contém a bola. (Tanto o cartucho como um todo como o ímã podem ser movidos - entre- tanto de preferência o cartucho é movido com o ímã servindo inicialmente para manter a bola de aço estática).

Uma câmera digital é usada para controlar a posição da bola de aço. À medida que a mistura começa a coagular, a bola pára de ser estática em relação ao ímã e isso é detectado pela câmera assim permitindo que o tempo de coagulação (do contato da amostra com a solução de sal de cál- cio) seja determinado.

Em uma modalidade alternativa, menos preferida, o ímã abaixo do cartucho é omitido e a bola é colocada em uma cavidade com uma base inclinada (por exemplo como mostrado na Figura 19b). O movimento nítido do cartucho na direção da extremidade inferior da base, por exemplo através do impacto mecânico ou pela ativação de um eletroímã para o lado da cavi- dade, faz com que a bola se mova para cima da base inclinada e, antes que a coagulação ocorra, a bola retorna para a extremidade inferior da base sob a ação da gravidade.

Exemplo 7 Exame para tempo de coagulação para sangue total ou plasma Um cartucho de exame como no Exemplo 6 é usado com uma bola de polímero de baixa densidade (por exemplo, uma bola de poliestireno de 3-5 mm de diâmetro) no lugar da bola de aço. Essa bola fica preferivel- mente em uma cavidade de perfil circular, com fundo plano ou côncavo (ver Figura 19c).

Uma amostra é tirada e misturada como no Exemplo 6 e depois colocada na cavidade que contém a bola onde a bola irá flutuar na superfície da amostra. A bola é então repetidamente impulsionada sob a superfície da amostra possibilitada de flutuar de volta para cima para a superfície. À medi- da que a amostra coagula, a bola irá retornar para a superfície mais vagaro- samente e a seguir de modo algum. A bola pode ser impelida sob a superfície por pressão da ponta da pipeta ou alternativamente uma bola magneticamente móvel pode ser usada e um campo magnético pode ser ativado e desativado para puxar a bola para baixo e liberá-la, respectivamente. Tais bolas responsivas magne- ticamente podem ser preparadas, por exemplo, depositando cristais super- paramagnéticos na bola do polímero (por exemplo, como nas bolhas mag- néticas vendidas por Dynal Biotech, Oslo, Noruega).

Exemplo 8 Exame do tempo de coagulação para o plasma Um cartucho de exame similar a esse mostrado na Figura 11 é usado. Como no Exemplo 6, uma das cavidades 59 a 62 contém um tampão de citrato, uma outra contém fibrinogênio e fator de coagulação V e uma ter- ceira uma solução de sal de cálcio. A cavidade 57 contém uma pipeta com ponta capilar e a cavidade 58 contém uma extensão de filtro como mostrado na Figura 18.

Uma amostra é absorvida na pipeta com ponta capilar que é então colocada na cavidade 57 e o cartucho é colocado no aparelho de exame e lá aquecido para 37°C. A amostra é então transferida para a cavi- dade contendo o tampão e misturada. O total ou uma proporção preestabe- lecida da mistura é então transferida para a extensão da pipeta do filtro e o plasma diluído isento de célula é bombeado para dentro da base da cavida- de. Um volume predeterminado de plasma isento de célula é então transferi- do para dentro da cavidade contendo o fibrinogênio usando uma pipeta com ponta capilar adicional e essa pipeta adicional é também usada para transfe- rir um volume predeterminado da solução do sal de cálcio para a cavidade contendo fibrinogênio/plasma para iniciar a reação de coagulação. A cavida- de é iluminada e uma câmera digital é usada para registrar a turvação da mistura na cavidade. O tempo da adição do cálcio até o aumento da turva- ção para um valor predefinido é adotado como o tempo de coagulação.

Exemplo 9 Exame para coagulação do sangue total ou plasma Um cartucho de exame similar a esse mostrado na Figura 11 e descrito no Exemplo 8 é usado. Como no Exemplo 8, uma das cavidades 59 a 62 contém tampão de citrato e uma outra uma solução de sal de cálcio, entretanto a cavidade contendo a bola é omitida e no lugar do fator de coa- gulação V e fibrinogênio a cavidade do "reagente" contém uma substância cromogênica específica da trombina seca (por exemplo Nycotest Chrom (descrito em Janson et al. Thrombostasis and Haemostasis 62:530 (pôster 1677) (1989) e Jonker et al. Research in Clinic and Laboratory 20: 45-57 (1990)) ou uma das substâncias cromogênicas discutidas em DE-A- 3113350, DE-A-3413311, DE-A-3311287, US-A-4458015 ou US-A- 4784944). A amostra é tirada e misturada de maneira análoga ao procedi- mento no Exemplo 7. O processo de coagulação resulta na formação da trombina e assim a liberação de um corante da substância cromogênica (por exemplo para-nitroanilina amarela de Nycotest Chrom). A mudança na cor da amostra é seguida usando a câmera digital e o tempo de coagulação é adotado como o tempo da adição do cálcio até uma mudança de cor predeterminada.

Exemplo 10 Exame para proteína C reativa (CRP) no sangue total usando conjugado de enzima (ELISA1 Usando a pipeta com ponta capilar do cartucho, 1 μΙ_ do sangue total é adicionado em uma cavidade (por exemplo cavidade 59) de um cartu- cho similar a esse mostrado na Figura 11 e contendo 200 μ!_ de um líquido de diluição e quebra (30 mM de tampão de borato pH 8,0 contendo 0,01% w/v de citrato de sódio, 0,02% w/v de NaN3 e desoxicolato). As cavidades do cartucho têm uma seção transversal com dimensões internas de 6,0 por 6,5 mm. O fundo planar da cavidade é inclinado 30 graus ao eixo ao comprido da cavidade. A pipeta com ponta de membrana retangular (que tem dimen- sões externas de 3,7 por 4,2 mm é equipada com uma membrana de nitro- celulose revestida com anticorpo antiCRP montada 30 graus ao eixo ao comprido do tubo da membrana) é abaixada na cavidade e a solução da cé- lula de sangue lisada é absorvida através da membrana pela aplicação de pressão abaixo da ambiente no interior da pipeta com ponta de membrana.

Quando todo o líquido é absorvido, uma pressão acima da ambiente é apli- cada para forçar o líquido uma segunda vez através da membrana e de volta para dentro da cavidade. Passar a solução de CRP duas vezes através da membrana aumenta mais a eficiência de captura do CRP.

Subseqüentemente a pipeta com ponta de membrana é movida para uma cavidade similar (por exemplo cavidade 60) no cartucho que con- tém uma solução de alcalina fosfatase (ALP) conjugada a um anticorpo anti CRP (aproximadamente 40 μ9/ηιΙ de ALP e 40 pg/ml de anticorpo em 50 mM de tampão de borato pH 8,0 contendo 0,02% w/v de NaN3 e 0,5% w/v de BSA. A solução do conjugado é absorvida através da membrana e bombea- da de volta para dentro da cavidade aplicando uma seqüência de pressões abaixo e acima da ambiente dentro da pipeta com ponta de membrana como descrito acima para a captura do antígeno.

Na próxima etapa, a pipeta com ponta de membrana é movida para uma cavidade adicional (por exemplo cavidade 61) no cartucho que contém 200 μί da solução de lavagem (50 mM de tampão de borato pH 8,0 contendo 0,01% w/v de NaN3, 0,5 % w/v de BSA e desoxicolato) que é ab- sorvida e subseqüentemente bombeada de volta para dentro da cavidade.

Essa etapa de lavagem é repetida duas vezes movendo a pipeta com ponta de membrana para duas cavidades adicionais (não-mostradas na Figura 11 porém equivalentes à cavidade 61) que também contêm a solução de lava- gem. O total dos três ciclos de lavagem garante uma remoção eficiente do conjugado não-aglutinado.

Finalmente, a pipeta com ponta de membrana é movida para uma cavidade ainda adicional (por exemplo cavidade 62) no cartucho que contém 300 μί de uma solução do fosfato de para nitrofenil do substrato de alcalina fosfatase (1,0 mg/ml de pNPP em 1,0 M de tampão de dietanolami- na pH 9,6 contendo 0,5 mM de MgCb e 0,025% w/v de NaN3). O para- nitrofenol do produto da enzima amarela é desenvolvido pelo bombeamento da solução do substrato para dentro e para fora da pipeta com ponta de membrana através de um período de dois minutos. A incubação é terminada pelo bombeamento de todo o líquido de volta para dentro da cavidade e ele- vando a pipeta com ponta de membrana para fora da solução do substrato.

Usando 300 μί. da solução do substrato a altura de enchimento é cerca de 3 mm acima do topo da parte inclinada da cavidade, assim permitindo que a cor seja medida através das paredes paralelas da cavidade.

Com a pipeta com ponta de membrana elevada, a absorbância é medida usando um LED azul como uma fonte de luz e uma câmera digital para a medição da luz transmitida.

Exemplo 11 Exame para proteína C reativa (CRP) no sangue total usando medição de dispersão de luz das bolhas de látex agregadas Usando a pipeta com ponta capilar do cartucho, 2 μι de sangue total é adicionado em uma cavidade (por exemplo cavidade 62) de um cartu- cho similar a esse mostrado na Figura 11 e contendo 120 nm de bolhas de látex (0,2% w/v) suspensas em 300 μΙ_ de 50 mM de tampão de borato pH 8,0 contendo 0,01% w/v de citrato de sódio, 0,02% w/v de NaN3 e desoxico- lato. As bolhas são revestidas pela adsorção simples como anticorpos anti CRP. A cavidade tem uma seção transversal retangular e fica na extremida- de do cartucho para facilitar a medição da dispersão da luz. A luz é direcio- nada sobre uma parede lateral da cavidade. Depois de uma fase inicial de lise da célula que leva cerca de 10 segundos, o aumento da dispersão da luz é medido em um ângulo de 90 graus com a luz incidente. O aumento da dis- persão de luz devido à agregação mediada pelo CRP das bolhas de látex é medido pela câmera digital em um comprimento de onda de 425 nm.

Exemplo 12 Exame para albumina na urina usando bolhas magnéticas, bolhas de látex colorido e reflectometria.

Usando a pipeta com ponta capilar do cartucho, 2 μΙ_ de urina são adicionados em uma cavidade (por exemplo cavidade 62) de um cartu- cho similar a esse mostrado na Figura 11 e contendo 1000 nm de bolhas de polímero magnético (0,2% w/v) e 1000 nm de bolhas de látex azul (0,2% w/v) em 2Ò0 μΙ_ de 30 mM de tampão de fosfato de sódio pH 5,7 contendo 0,5% w/v de BSA e 0,05% w/v de NaN3. As bolhas magnéticas (por exemplo do tipo disponível de Dynal Biotech, Oslo, Noruega) são revestidas com um anticorpo reagindo com um epítopo na molécula da albumina diferente do epítopo reconhecido pelo anticorpo revestido sobre as bolhas de látex.

Depois da incubação por 60 segundos, um ímã de neodímio (10x7x2 mm) é movido de sua posição de repouso (20 mm da parede mais próxima da cavidade) para a cavidade para colocar o ímã em contato direto com a parede lateral da cavidade. O ímã faz contato com a parede oposta à inclinada e cobre a parte cheia com líquido da cavidade (200 μΙ_). A cavidade e o posicionamento do ímã são mostrados esquematicamente na Figura 20.

Na posição de repouso o campo magnético funcionando nas bolhas magné- ticas é muito fraco para mover as bolhas. Quando em contato com a cavida- de, a distância do ímã para a parede interna mais próxima e mais distante da cavidade é 0,8 mm e 6,3 mm respectivamente. Nessa distância as bolhas são quantitativamente coletadas na parede depois de 30 segundos. Na pre- sença do analito, o látex azul fica associado nas partículas magnéticas e a fração reagida das bolhas de látex será coletada na parede enquanto as partículas de látex não-reagidas permanecerão suspensas.

Com o ímã na posição de contato, a pipeta com ponta de capilar é usada para aspirar o líquido contendo as partículas de látex não-reagidas. O ímã é então movido para longe da cavidade para sua posição de repouso. O tubo da pipeta com ponta capilar é então movido para dentro de uma cavidade vazia (por exemplo cavidade 61) e o líquido é entregue para essa cavidade pela aplicação de pressão acima da ambiente no interior da pipeta. A pipeta com ponta capilar é então movida para uma cavidade adicional (por exemplo cavidade 60) que contém 500 μί_ da solução de lava- gem (PBS, pH 7,4) e 200 μΙ_ são absorvidos. A pipeta com ponta capilar é então movida de volta para a cavidade contendo as bolhas magnéticas e as bolhas são suspensas pelo bombeamento da solução de lavagem para den- tro e para fora da cavidade cinco vezes. O ímã é movido para a posição de contato e as bolhas magnéticas podem ser coletadas na parede da cavida- de. Depois de 30 segundos, a solução de lavagem é levada de volta para dentro da pipeta com ponta capilar. O ímã é subseqüentemente movido de volta para sua posição de repouso. A pipeta com ponta capilar é, na próxima etapa, movida para a cavidade contendo o primeiro sobrenadante (cavidade 61) e bombeada para dentro dessa cavidade. A pipeta com ponta capilar é subseqüentemente movida para a cavidade contendo a solução de lavagem (cavidade 60) e 200 μΙ_ são absor- vidos. A pipeta com ponta capilar é movida para a cavidade contendo as bolhas magnéticas (cavidade 62) e as bolhas são novamente suspensas pelo bombeamento da solução de lavagem para dentro e para fora 5 vezes.

Uma pipeta com ponta de membrana equipada com uma mem- brana microporosa de 0,45 pm é movida para a cavidade contendo as bo- lhas magnéticas suspensas (cavidade 62) e as bolhas são coletadas sobre a membrana por sucção. A pipeta com ponta de membrana é elevada para fora da cavi- dade 62 e partículas de látex azul e as bolhas magnéticas amarelo-marrom são quantificadas pela reflectometria usando um LED vermelho para as bo- lhas de látex azul e um LED azul para as bolhas magnéticas. A quantidade da luz vermelha absorvida/quantidade de luz azul absorvida é uma medida da fração do látex azul na mistura e portanto uma medida da quantidade de albumina presente na amostra. O mesmo cartucho pode também ser usado para determinação do conteúdo de creatinina da urina e portanto a razão de albumina:creatinina na amostra de urina. A albumina na urina proporciona um indicador da fun- ção dos rins e a razão de albumina:creatinina pode ser usada para corrigir a diurese. A medição de albumina:creatinina é descrita por exemplo em US-A- 5385847.

Nessa modalidade, uma fração da amostra de urina é misturada com um reagente de diluição e uma enzima ou mistura de enzima que reage com a creatinina para gerar um analito colorido que é detectado usando uma câmera digital pela medição da transmissão da luz através de uma cavidade contendo urina, enzimas e reagente de diluição.

Claims (38)

1. Aparelho de exame caracterizado pelo fato de que compreen- de: i) um cartucho de exame removível (52,53) compreendendo pelo menos duas cavidades (57-62) e uma pipeta (55) posicionável em pelo me- nos duas das ditas cavidades, a dita pipeta tendo uma extremidade proximal e uma extremidade distai (56), a dita extremidade distai sendo fechada por uma membrana permeável ao líquido, ii) um suporte (24) disposto para receber o dito cartucho, iii) recurso de acionamento (25) operável para posicionar a dita pipeta em cavidades selecionadas do dito cartucho, iv) um aplicador de pressão de gás (27) que pode ser acoplado na dita pipeta, por meio disso, induzindo o fluxo do líquido através da dita membrana e v) um detector de radiação (32) operável para detectar a radia- ção de uma cavidade do dito cartucho ou da dita pipeta, caracterizado pelo fato de que o cartucho compreende mem- bros de base (53) e tampa (52) destacáveis, em que as cavidades selecio- nadas são dispostas no membro de base e no membro de tampa são dis- postos para transportar a dita pipeta.

2. Aparelho de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito cartucho (52, 53) compreende uma pipeta com ponta capi- lar (50) e uma pipeta com ponta de membrana (55).

3. Aparelho de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito cartucho (52, 53) compreende uma pipeta (55), cuja extremidade (56) distai é fechada por uma membrana inclinada permeável ao líquido.

4. Aparelho de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita membrana inclinada situa-se em um plano em um ângulo de 20 a 40° em relação ao eixo da pipeta (55) na qual ela está presa.

5. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito cartucho (52, 53) compreende uma pipeta com ponta de membrana (55), cuja extremidade da ponta com mem- brana (56) é de seção transversal retangular.

6. Aparelho de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito membro de tampa (52) compreen- de recurso para receber uma pipeta com ponta capilar.

7. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das ditas cavidades (57- 62) é vedada na sua extremidade superior por um vedador frágil e onde o dito membro de tampa (52) é proporcionado com um cortador (64) disposto para perfurar o dito vedador.

8. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito membro de base (53) compreende um limpador absorvente (68) disposto para limpar a parte externa de uma pipeta com ponta capilar inserida nele.

9. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito cartucho (52, 53) compreende uma pipeta com ponta de membrana (55), cuja extremidade proximal é fechada por uma membrana de autovedação que pode ser perfurada.

10. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as cavidades (57-62) no dito cartucho (52, 53) são dispostas em uma formação linear.

11. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito detector de radiação compreende uma câmera digital.

12. Aparelho de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a parede de base (63) de pelo menos uma das cavidades no dito cartucho (52-53) é planar e não-perpendicular às paredes de lados contíguos da cavidade.

13. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma fonte de luz (44) dis- posta para iluminar o dito cartucho (52-53).

14. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende um ímã (77).

15. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende um aquecedor disposto para aquecer o dito cartucho (52-53).

16. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende um controlador (35) dis- posto para controlar a execução do exame pelo dito aparelho.

17. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o dito aplicador de pressão de gás com- preende um êmbolo disposto dentro de um alojamento cilíndrico e um motor de acionamento (28) disposto para acionar o dito êmbolo.

18. Cartucho de exame (52,53) que compreende pelo menos duas cavidades (57-62) e uma pipeta (55) que pode ser posicionada em pelo menos duas das ditas cavidades, a dita pipeta tendo uma extremidade pro- ximal e uma extremidade distai (56), a dita extremidade distai sendo fechada por uma membrana permeável ao líquido, caracterizado pelo fato de que o cartucho compreende membros de base (53) e de tampa (52) destacáveis, em que as cavidades são dispostas no membro de base e o membro de tampa é disposto para transportar a pipeta.

19. Cartucho de exame (52-53) de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito cartucho compreende uma pipeta com ponta capilar (50) e uma pipeta (55) com ponta de membrana.

20. Cartucho de exame (52-53) de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o dito cartucho compreende uma pipeta (55), cuja extremidade fechada é fechada por uma membrana inclina- da permeável ao líquido.

21. Cartucho de exame (52-53) de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a dita membrana situa-se em um plano em um ângulo de 20 a 40° em relação ao eixo da pipeta (55) na qual ela es- tá presa.

22. Cartucho de exame (52-53) de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que o dito cartucho compreende uma pipeta com ponta de membrana (55), cuja extremidade da ponta da membrana é de seção transversal retangular.

23. Cartucho de exame (52-53) de acordo com a qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que o dito membro de tampa (52) compreende recurso para receber uma pipeta com ponta capilar.

24. Cartucho de exame de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das ditas cavidades é vedada na sua extremidade superior por um vedador frágil e no qual o dito membro de tampa (52) é proporcionado com um cortador (64) disposto para perfurar o dito vedador.

25. Cartucho de exame de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 18 a 24, caracterizado pelo fato de que o dito membro de base compreende um limpador absorvente (68) disposto para limpar a parte ex- terna de uma pipeta com ponta capilar inserida nele.

26. Cartucho de exame (52-53) de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizado pelo fato de que o dito cartucho compreende uma pipeta com ponta de membrana (55), cuja extremidade proximal é fechada por uma membrana de autovedação que pode ser perfu- rada.

27. Cartucho de exame (52-53) de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que as cavidades (57- 62) no dito cartucho são dispostas em uma formação linear.

28. Cartucho de exame (52-53) de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 27, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das ditas cavidades contém um reagente do exame.

29. Dispositivo de exame caracterizado pelo fato de que com- preende a) um suporte de cartucho (24) capaz de receber um cartucho de exame (23) como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 28; b) recurso de acionamento (25) operável para posicionar a pipeta (6) de um dito cartucho em cavidades selecionadas do dito cartucho; c) um aplicador de pressão de gás (27) que pode ser acoplado à pipeta de um dito cartucho por meio disso induzindo o fluxo do líquido através dele e d) um detector de radiação (32) operável para detectar a radiação de uma cavidade de um dito cartucho ou da sua pipeta.

30. Dispositivo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o dito detector de radiação (32) compreende uma câmera digital.

31. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 e 30, caracterizado pelo fato de que compreende uma fonte de luz dis- posta para iluminar o dito cartucho.

32. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende um ímã.

33. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende um aquecedor disposto para aquecer o dito cartucho.

34. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, caracterizado pelo fato de que compreende um controlador (35) disposto para controlar a execução do exame pelo dito aparelho.

35. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 34, caracterizado pelo fato de que o dito aplicador de pressão de gás compreende um êmbolo disposto dentro de um alojamento cilíndrico e um motor de acionamento (28) disposto para acionar o dito êmbolo.

36. Uso do aparelho para examinar um analito em uma amostra biológica ou uma propriedade de uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que o aparelho é um aparelho tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

37. Uso de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por examinar o tempo de coagulação em uma amostra de sangue ou derivada de sangue.

38. Uso de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por examinar um analito de proteína em uma amostra de fluido corpóreo ou deri- vada do fluido corpóreo.