CN116457667A - 具有血红蛋白校正仪器的改进elisa和其方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于对单个患者执行全血和血浆中的酶联免疫吸附测定的一次性生物测定诊断筒，其中所述筒具有多个孔。所述筒包括：安置在多个孔中的一个孔中的具有内部侧壁的移液管吸头，所述内部侧壁被预处理并且涂有抗体；安置在多个孔中的另一个孔中的试剂混合物，所述试剂混合物包含至少一种选自由以下组成的组的试剂：pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂、抗体、和缀合物稳定剂。安置在多个孔中的集成比色皿中的至少一种发色底物和显示试剂。它还包括检测血液样品中的血红蛋白量，因此可对样品中的血浆量进行校正。

Description

具有血红蛋白校正仪器的改进ELISA和其方法
技术领域
本发明一般涉及酶联免疫吸附测定的方法和仪器。
背景技术
酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种用于检测和/或量化样品中的抗体或抗原的生物化学技术。经典的2步骤夹心ELISA基于分析物与针对分析物的捕获抗体的最初结合，随后被标记的检测抗体与所捕获的分析物结合。在一步骤夹心ELISA中，分析物与捕获抗体和检测抗体的结合是同时进行的。检测抗体可与例如辣根过氧物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的酶缀合。随后将酶底物引入所捕获的免疫复合物导致颜色形成，这可以通过光学或其他方式来测量。颜色形成的速度和程度与抗原浓度成正比。
ELISA通常以微量滴定板形式进行并且需要复杂的仪器和/或高度熟练的人员。ELISA通常也使用96孔或384孔聚苯乙烯板和溶液中的样品来进行。除了在添加样品时只包含捕获抗体的传统ELISA试剂盒以外，其他即时ELISA试剂盒含有预处理板，所述板容纳捕获抗体和冻干检测抗体、链霉亲和素-HRP和样品稀释剂。
标题为Apparatus for And Method of Automated Processing Of BiologicalSamples的美国专利9,011,772公开用于执行样品的自动生物处理的生物处理装置、生物处理卡、和流控筒。生物处理卡可包括多个移液管吸头；和与多个移液管吸头流体连通的至少一个泵。在一些实施方式中，泵和移液管吸头经由可为微型通道的处理通道来流体连通。其中也提供一种自动生物处理装置，所述装置包括至少一个生物处理卡；至少一个流控筒；和被配置来控制样品的自动生物处理的自动控制系统。其中还提供使用所述装置、卡、和筒的方法。
标题为Systems and Methods for Multi-Analysis的美国专利号9,810,704公开用于样品处理的系统和方法。具体地说，公开可提供一种装置，所述装置能够接受样品，并且执行样品制备、样品测定、和检测步骤中的一个或多个。所述装置可能能够执行多个测定。所述装置可包含一个或多个模块，所述模块可能能够执行样品制备、样品测定、和检测步骤中的一个或多个。所述装置可能能够使用小量样品来执行步骤。
发明内容
本发明相较于已知现有技术的优势和差异
上述现有技术部分未被证明对于满足行业的所有要求为完全令人满意的。
现在论述提供改进ELISA自给试剂盒的本发明方法的几个优势，所述试剂盒提供增加的能力。改进常用ELISA方法的一个优势是包括增加相关移液管吸头的功能。另一个益处与增加洗涤，从而导致减少或消除交叉污染相关。本发明方法的另一个益处是不需要在测试之前停止酶-底物反应。本发明的改进ELISA的附加益处是在少于15分钟内，更优选在约10-14分钟中，并且在一些实施方式中在7-9分钟范围内提供结果的更快速免疫测定。
满足本发明的目标
本发明提供具有可移动元件的酶联免疫吸附测定系统，捕获亲和试剂结合至所述可移动元件。在一个实施方式中，捕获亲和试剂是抗体。在一个实施方式中，可移动元件是移液管吸头。在另一个实施方式中，系统使用一次性筒，所述筒具有能够容纳多种不同试剂的多个孔。在此实施方式中，孔的尺寸与上述可移动元件相容，以使得可移动元件可插入孔中并且吸取、保持、分配液体并且将液体在筒中各处移动。
系统可使用能够将指定体积的样品递送至筒的样品收集装置。优选系统也可使用仪器，所述仪器能够接合可移动元件并且精确地吸取、分配、转移和混合各种生物材料并且光学检测不同分析物的存在。
在一个优选实施方式中，例如移液管吸头的可移动元件和试剂筒可由例如以下的各种材料制成：聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、环状烯烃共聚物例如环烯烃聚合物例如和/>纤维素和其衍生物、硅和其衍生物、玻璃、石英、或金属。
在一个优选实施方式中，例如移液管吸头的可移动元件可涂有蛋白例如抗体、抗体片段、重组蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、链霉亲和素、或重组蛋白或其片段、核酸、多糖、糖蛋白、肽聚糖、分子印迹聚合物或适体分子。抗体是优选亲和剂。固定可通过非特异性吸附或通过共价缀合来实现。
在一个优选实施方式中，筒孔用例如样品裂解缓冲液、洗涤缓冲液、检测抗体缀合物和酶底物的试剂来预填充。在一个优选实施方式中，检测抗体可与例如辣根过氧物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的酶缀合。
另一个目标是提供可用来执行多种类型ELISA的系统和方法。因此，根据本发明方法，可执行1步骤和2步骤ELISA。
本发明通过提供用于执行酶联免疫吸附测定的护理点一次性生物测定诊断筒来实现这些和其他目标。一次性筒可具有多个孔，第一孔可容纳具有内部侧壁的移液管吸头，所述侧壁被预处理并且涂有特异性抗体。筒的第二孔可具有至少一种试剂混合物，其中至少一种试剂为pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂、抗体、和缀合物稳定剂。抗体可为抗c-反应蛋白抗体、抗胱抑素-c抗体、抗IGF-1抗体、抗丙氨酸转氨酶抗体、和抗天冬氨酸转氨酶抗体中的一种或多种。第三孔可容纳具有发色底物和显示试剂中的至少一种的试剂混合物。
本发明也通过提供具有手指针刺装置和一体式自给一次性诊断筒的酶联免疫吸附生物测定诊断试剂盒来满足这些目标。所述筒可具有包含在筒内的移液管吸头和生物测定部件。所述筒也可具有一体式光学比色皿。为了方便使用者，筒也可沿着外表面具有标识符。
筒内的移液管吸头具有涂有抗体的内部侧壁，并且移液管吸头的内部腔室的至小一部分保持开放并且可接近内部侧壁。也就是说，被涂布的移液管吸头并未完全填充，而是仍可填充的。
筒内的生物测定组分具有至少一种反应性或非反应性试剂：pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂、抗体、缀合物稳定剂、发色底物、和显示试剂。
本发明的移液管吸头可具有涂有不同量抗体的内壁。类似地，本发明的筒孔可具有不同量的生物测定组分。根据本发明进行的改进ELISA的示例在本文中以具体量来提供。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，这些量可以根据所使用的筒和吸头的尺寸而变化。本发明一般使用相似量的抗体和发色底物。
例如，在大多数实施方式中存在1:1的抗体与发色底物的近似相关性。当使用40ul至60ul抗体时，通常也使用40ul至60ul范围内的发色底物。当使用约90ul至110ul抗体时，通常也使用90ul至110ul范围内的发色底物。当使用300ul至320ul范围内的量的抗体时，通常也存在约300ul至320ul发色底物。
通过提供用于制备执行酶联免疫吸附测定的筒的新方法，本发明概念进一步满足当前目标。所述方法具有以下步骤：(1)通过涂布移液管吸头的内表面来预处理移液管吸头；(2)沿着移液管吸头的内表面，用亲和剂来提供第一涂层；(3)沿着移液管吸头的内表面，用阻断溶液来提供第一涂层上方的第二涂层；(4)沿着移液管吸头的内表面，用活性防腐剂来提供第二涂层上方的第三涂层；(5)用至少一种选自由以下组成的组的试剂混合物来促进直接移液，从而缩短洗涤时间：pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制药剂、螯合剂、和杀生物防腐剂、抗体、和缀合物稳定剂；和(6)在筒内提供一个孔，用于与发色底物和显示试剂直接反应。
这个方法也可包括选择由以下组成的组的亲和剂：抗体、抗体片段、重组蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、链霉亲和素、重组蛋白片段、核酸、多糖、糖蛋白、肽聚糖、分子印迹聚合物、和适体分子。
这个方法也可包括选择来自由以下组成的组的涂布缓冲液：碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液、蔗糖缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、和三(羟甲基)氨基甲烷盐水。
沿着移液管吸头的内表面，用亲和剂来提供第一涂层也可通过以下来进一步定义：选择亲和剂；选择涂布缓冲液；通过混合选定抗体和选定涂布缓冲液来制备抗体溶液；用混合抗体溶液来填充移液管吸头；并且在第一温度下，将移液管吸头孵育第一时间。
沿着移液管吸头的内表面，用阻断溶液来提供第一涂层上方的第二涂层也可通过以下来进一步定义：选择阻断溶液；用阻断溶液来填充移液管吸头；并且在第二温度下，将移液管吸头孵育第二时间。
沿着移液管吸头的内表面，用活性防腐剂来提供第二涂层上方的第三涂层也可通过以下来进一步定义：选择活性防腐剂；用活性防腐剂来填充移液管吸头；并且在第三温度下，将移液管吸头孵育第三时间。
附图说明
图1为用于与如图所示的扫描器一起使用的本发明的生物测定筒试剂盒的图示。
图2为根据本发明的一个实施方式的筒的横截面视图。
图3为根据本发明的另一个实施方式的筒和移液管吸头的横截面视图。
图4为根据本发明的另一个实施方式的筒和移液管吸头的横截面视图。
图5为使用者扫描本发明的筒的标识符的图示。
图6为根据本发明的方法，使用者使用手指针刺装置来获得血液样品的图示。
图7为使用者获得来自本发明的筒的采样器的图示。
图8为使用者用血液样品填充来自本发明的筒的采样器的图示。
图9为使用者将用血液样品填充的采样器放回到本发明的筒的图示。
图10为使用者将具有已填充的采样器的本发明的筒放置在分析器中的图示。
图11示出本发明的方法的概观。
图12示出产生本发明的吸头的过程的概观。
图13示出图12的过程的进一步继续。
图14示出图12的过程的方面。
图15为通过测量针对CRP(mg/L)的660nm下的光密度，示出使用CRP的剂量反应的第一实施方式的结果的图表。
图16为通过测量针对胱抑素(mg/L)的660nm下的光密度，示出使用胱抑素的剂量反应的其他实施方式的结果的图表。
图17为通过测量针对以(U/L)为单位的ALT浓度的660nm下的光密度，示出使用ALT的剂量反应的其他实施方式的结果的图表。
图18为通过测量针对以(U/L)为单位的AST浓度的660nm下的光密度，示出使用未被处理的ALT的剂量反应的其他实施方式的结果的图表。
图19为通过测量针对以(mg/L)为单位的hs-CRP浓度的660nm下的光密度，示出使用hs-CRP的剂量反应的其他实施方式的结果的图表。
图20为通过测量针对以(ng/mL)为单位的IGF-1浓度的660nm下的光密度，示出使用IGF-1的剂量反应的其他实施方式的结果的图表。
图21为示出对于正常CRP光密度读数的HGB效应的结果的图表。
图22为示出考虑到HGB效应的校正正常CRP光密度读数的图表。
具体实施方式
本发明的优选实施方式参照图1-22来论述。如以上论述，本发明提供与通过血红蛋白校正来改进ELISA的方法和仪器有关的过程、方法、系统、和仪器。
全包式筒试剂盒
图1显示与可能分析器系统1附近示出的本发明的全包式和综合筒试剂盒10的图示。这个筒试剂盒10包括改进ELISA筒12和被预先封装以便在单独分析器系统1中单次使用的手指针刺装置14。取决于这种试剂盒被设计来待接受的特定测试，根据本发明的各种实施方式，筒试剂盒也可包括至少一个移液管吸头20、采样器18、和集成比色皿16g，以下相对于图2-4更详细地论述。通过将这些组件提供为单个包装19中的统一试剂盒，本发明既减少了整个过程时间又减少了使用者错误。
能够执行如本文所述的测定的示例性分析器系统1是NOVABiomedicalCorporation的ALLEGROTM分析器。能够与如本文描述的筒12一起使用的示例性采样器和筒底座更完全地描述于NOVABiomedical Corporation的美国专利10,117,615中，所述专利的全部内容并入本文。
改进ELISA筒
可与本发明的系统和方法一起使用的示例性筒试剂盒可包括自给一次性使用集成筒12，例如现在将进一步参考图2-4进行描述。
第一筒实施方式在图2中示出，并且虽然在横截面视图中不可见，但是它具有能够将筒(和由此ELISA)的特定类型识别给分析器1的标识符13，诸如条形码。这个标识符13可沿着筒12的可见外表面为可见的并且也可沿着主包装19的外表面提供。如以上论述，这个包装19可含有筒12和至少一个手指刺血针14或能够刺破皮肤以便获得供测试的血液样品的其他类似装置。
在大多数实施方式中，筒12具有毛细管采样器18，所述采样器为筒12本身的可移除部件。另外，大多数筒12也具有集成比色皿16g，所述比色皿具有能够促进光学测量的侧壁。然而，也预期包装19可含有筒12，所述筒需要除了筒底座以外提供的单独不同比色皿16g。然而，这些筒至少必须具有一系列孔16，所述孔预负载有根据本发明方法的测定的组分。
如可在图2中发现，采样器18具有毛细管元件(未编号)，所述元件通过一次性测试筒12的覆盖延伸部分的阶梯状延伸部分的延伸部分顶部表面中的对应毛细管接收孔来插入，然后安置在阶梯状延伸部分中。在插入和设置过程期间，采样器18的毛细管通过位于毛细管擦拭器的顶端的下部孔来插入。因为下部孔的横截面面积小于毛细管的横截面面积，所以下部孔像刮板一样抵靠毛细管的外表面并且防止无意地安置在毛细管的外表面上的任何样品进入和沉积到筒12的腔室16b中。
这些筒12的毛细管擦拭器将任何样品7从毛细管的外表面上移除。由此防止样品7“过度填充”测试筒12中的合适孔16b所导致的错误结果。同样地，因为毛细管不通过使用者来擦拭，所以不存在或存在极少以下可能性：毛细管内的任何样品7被无意地移除，由此可产生由于样品7“不充分地填充”测试筒12中的孔16b所导致的错误结果。
在一体式筒12的第一孔16a中提供的移液管吸头20可为沿着外表面具有测量标记的移液管吸头，如图2所示。或者，这些吸头可为倾斜、延伸，和/或有刻度的，如图3-4所示。然而，筒12的第一孔16中的至少一个移液管吸头20具有沿着内壁的涂层30。各种类型的涂层30和提供这些涂层的方法在以下进一步参考图12-14来更详细地论述。
使用者视角的方法
使用者视角的一般概观现在参考图5-11来论述。如本文示出，最初，改进ELISA筒或筒试剂盒通过使用者102来选择。在手动地选择改进ELISA筒102之后，筒可通过分析器来扫描以便识别所选择的测定103。然后，获得血液样品104可涉及简单的手指针刺105以提供所需的血液样品量。相对于需要静脉穿刺或其他大量血液样品收集的其他现有技术系统和方法，在此步骤中可以很容易地获得血液样品表明本发明系统的优势之一。
如果生物测定最初得以识别，毛细管采样器可从筒106中移除，用血液样品107填充，并且放回指定筒108中，所有这些在执行手指针刺105的30秒内。将已填充的采样器108放回筒中之后，标识符可通过分析器来扫描103，并且将筒插入分析器109中。将筒负载至分析器中之后，自动过程110开始。取决于所选择的生物测定，自动过程然后根据生物测定组分的指定顺序，包括添加112、混合114、测量116、孵育117、校正118、和向使用者或其他指定个体报告119结果的自动步骤。
用CRP抗体来涂布移液管吸头的方法
根据本发明方法来制备移液管吸头20的各种方法现在具体参考图12-14来论述。通常，制备移液管吸头20包括四个主要步骤：用抗体溶液来涂布160、用阻断溶液来涂布170、用活性防腐剂溶液来涂布175、和干燥吸头180以便准备使用。应了解，虽然体积范围得以公开，但是所使用的体积取决于毛细管吸头的大小和筒12中的孔的尺寸。
图12更详细地观察第一主要步骤的步骤，用抗体溶液来涂布160。根据一个实施方式，此第一主要步骤开始于选择抗体储备物161，在此情况下为抗CRP，并且选择涂布缓冲液162，在此情况下为具有pH 9.6的200mM碳酸盐。还应理解这适用于任何类似蛋白诸如抗体、抗体片段、重组蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、链霉亲和素、或重组蛋白或其片段、核酸、多糖、糖蛋白、肽聚糖、分子印迹聚合物或适体分子。抗体是通常用于ELISA系统中的优选亲和剂。固定可通过非特异性吸附或通过共价缀合来实现，如以上论述。
类似地，虽然用于在此方法中的涂布缓冲液包括碳酸盐/碳酸氢盐缓冲系统和蔗糖，应了解，也可使用类似涂布缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水，并且例如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐水的缓冲液也是可接受的。
随后，抗体溶液(抗CRP，5ug/ml)通过将选定抗体储备物和涂布缓冲液混合163来制备。然后将此溶液分配至96孔板164中。使用具有附加移液管吸头的多通道移液管将抗体溶液吸取至选定移液管吸头中直到填充166为止。具体地说，抗体溶液的量大约在100份-300份之间，优选地150ul与200ul之间，并且更优选地50ul-300ul之间的约165份，优选地75ul与200ul之间，并且更优选地约100ul抗体溶液置于选定移液管吸头中直到填充166为止。然后将这些已填充的移液管吸头在10℃-50℃之间，优选地20℃-30℃之间，并且更优选地在大约22℃-25℃的室温下孵育167达200-2分钟之间，优选地50-10分钟之间，并且更优选地约30min的第一时间。一层抗体溶液现在粘附至移液管吸头的内壁。然后将过量溶液从移液管吸头中排出并丢弃。在排出过量溶液之后，移液管吸头进一步经历用阻断溶液170来涂布，然后用活性防腐剂溶液175来涂布，随后干燥吸头180。用阻断溶液170来涂布和用活性防腐剂溶液来涂布的步骤进一步在图13中示出。
现在转向图13，图13更详细地观察接下来的步骤，可以看出，随后用阻断溶液170涂布吸头。具体地说，首先选择阻断缓冲液171。足以用于此步骤的阻断缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，所述盐水含有0.5％-5％之间并且更优选地1％的牛血清白蛋白、明胶、干奶粉。
随后，将选定阻断缓冲液吸取至吸头中，以使得其用选定阻断缓冲液，大约50ul与1,000ul之间，优选地100ul与400ul之间，并且更优选地约200ul选定阻断缓冲液来填充172。然后将已填充的吸头孵育173大约2-30分钟之间，优选地5-20分钟之间，并且更优选地约10分钟的第二段时间。此孵育173通常在100℃-50℃之间，优选地200℃-30℃之间的温度下执行，并且更优选地在约220℃-25℃的室温下执行。一层阻断缓冲液现在在第一层抗体溶液上方，过量阻断缓冲液现在从移液管吸头174中排出并分配。
随后，提供活性防腐剂的涂层175。具体地说，首先选择活性防腐剂176。足以用于此步骤的活性防腐剂将包括0.5％-5％之间并且更优选地2％蔗糖、海藻糖、明胶和其他类似活性防腐剂。
随后，将选定活性防腐剂分配177至已经具有第一和第二层(即分别为抗体溶液的涂层和阻断溶液的涂层)的吸头中。然而，此层完全覆盖前面的层，包括沿着顶部和底部，以使得其仍然用50ul与1,000ul之间，优选地100ul与400ul之间，并且更优选地约110ul选定活性防腐剂176来填充。然后在10℃-50℃之间，优选地20℃-30℃之间的温度下，并且更优选地在约22℃-25℃的大约室温下，将已填充的吸头177孵育178大约1分钟的第三段时间。第三层活性防腐剂现在在第一层阻断缓冲液和第二层抗体溶液上方，并且完全覆盖所述层。孵育之后，过量活性防腐剂现在从移液管吸头中排出并分配179。然后在真空腔室中将吸头干燥二至十小时之间，优选地四至十小时之间，并且更优选地约八小时180。
此过程通常在图14中直观地示出。具体地说，示出在根据上述方法制备吸头20过程期间的移液管吸头20的横截面视图。首先，示出具有空的内部腔穴24的移液管吸头20，所述腔穴从移液管吸头20的第一末端的开口22经由主要部分26延伸至移液管吸头20的第二末端的第二开口28。然后，移液管吸头20用抗体溶液31来填充以使得内部腔穴24基本上被填充。
当将过量材料排出时，抗体溶液31的第一层34沿着内部腔穴24的内部部分的表面保持干燥。由于剩余的抗体溶液31的第一层34的体积而导致内部腔穴的空容积减少。然而，涂布缓冲液37通常添加至高于抗体溶液31的垂直水平。因此，当然后将涂布缓冲液37添加至移液管吸头20时，填充移液管吸头20仍然需要类似量的附加体积的涂布缓冲溶液37。将过量缓冲液材料排出之后，一层涂布缓冲液36沿着内部腔穴24中的抗体溶液34的第一层的内部朝向表面而保持固定。活性防腐溶液38通常添加至高于涂布缓冲液36的垂直水平。因此，当然后将活性防腐溶液38添加至移液管吸头20时，填充移液管吸头20仍然需要类似量的附加体积的活性防腐溶液38。将过量活性防腐溶液38排出之后，一层活性防腐溶液38沿着内部腔穴24中的抗体溶液34的第二层的内部朝向表面而保持固定。更多层的涂布缓冲液36，和/或活性防腐剂39可根据以上描述方法来类似地涂覆。应了解，所示的层比它们应有的厚度更厚，并且只出于解释目的来示出并且不代表每个层相对于移液管吸头的壁厚或彼此的实际相对厚度。
应注意叙述用于制备上述移液管吸头的试剂的特定量。应当注意，只要表面积与体积的比率大于1/6(不考虑单位)，任何相应的量都是足够的。其中吸头的表面积＝πrh+πr2并且吸头的体积＝1/3πr2l，其中r＝吸头的较大半径，l＝吸头的长度，并且h＝吸头的斜边。举例来说，对于具有3mm的半径，和10.6mm的长度的吸头，对于132:100或1.32比1的表面积与体积的比率，对于100mm3的体积，沿着移液管吸头的内部侧面的表面积变成至少132.1mm2。
或者，对于具有7.87mm的基圆半径，和58.42mm的长度的吸头，对于1652:3789或0.43:1的表面积与体积的比率，沿着移液管吸头的内部侧面的表面积变成1652mm2并且吸头可容纳3789mm3的体积。吸头暴露于试剂的表面面积越大，总体反应速率的增加越大，从而可减少所需的反应时间。然而，表面积与体积的比率不必大于一。研究表明表面与体积的比率在5至1/5之间，更优选地在1至1/4之间，并且更优选地约0.43为足够的。
一般测定试剂和附加组分
根据一个实施方式的第一试剂混合物具有pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂。
根据一个实施方式的第二试剂混合物具有pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂。
根据一个实施方式的第三试剂混合物具有抗体、缀合物稳定剂、和负控制。
根据一个实施方式的第四试剂混合物具有发色底物或显示试剂中的至少一种。
根据一个实施方式的第一试剂混合物具有pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂。
根据一个实施方式的第二试剂混合物具有pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂。
根据一个实施方式的第三试剂混合物具有抗体、缀合物稳定剂、和负控制。
根据一个实施方式的第四试剂混合物具有发色底物或显示试剂中的至少一种。
可用于本发明方法中的示例性pH稳定剂为促进保持7.4的pH值的10mM磷酸盐缓冲液。
可用于本发明方法中的示例性离子催化控制剂为138mM NaCl溶液。
可用于本发明方法中的示例性离子细胞内抑制控制剂为2.7mM KCl溶液。
可用于本发明方法中的示例性杀生物防腐剂为在商标ProClinTM300下出售的0.03％杀生物防腐剂，它是水溶性的，包含含有羧酸烷基酯稳定剂的无盐专有二醇中的3％CMIT/MIT。
可用于本发明方法中的示例性螯合剂为5mM乙二胺四醋酸(EDTA)。
可用于本发明方法中的示例性清洁剂为在商标TritonTMX-100(TX100)下出售的0.1％清洁剂，所述清洁剂是裂解细胞以便提取蛋白和其他细胞器或透化活细胞膜以便用于转染的最广泛使用的非离子表面活性剂之一。
可用于本发明方法中的示例性乳化剂为在商标20TM下出售的0.05％乳化剂(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯)。
可用于本发明方法中的示例性负控制为可获自Meridian Life Science,Inc.(Tennessee)的小鼠IgG，通常由75％血清免疫球蛋白构成并且通过血浆B细胞来合成和分泌。
可用于本发明方法中的抗体为抗CRP抗体-HRP(250ng/mL)，与辣根过氧物酶(HRP)缀合的C-反应蛋白(CRP)初级抗体。
CRP是通过环状五聚物结构来表征的五聚蛋白家族的成员。人类CRP基因编码224个氨基酸的前体。成熟人类CRP蛋白具有非共价连接来形成五聚物的206个氨基酸。人类CRP分别与小鼠和大鼠共有71％和64％氨基酸序列同源性。
通过肝细胞来合成的CRP是人类中的主要急性期血清蛋白。IL-6、IL-1和糖皮质激素是CRP基因的主要诱导因子。响应于感染、炎症或组织破坏，人类血清中的CRP水平可在24-48小时内增加1,000倍。它很快回到小于1μg/mL的基础水平。人类CRP是一种在宿主先天宿主防御的第一道防线中发挥作用的急性期血清蛋白。像其他五聚蛋白一样，CRP表现出与配体的Ca++依赖性结合。作为许多细菌和真菌壁的成分的磷酸胆碱(PCh)是CRP的主要配体。
CRP还与受损细胞的膜、坏死和凋亡细胞的膜和核成分结合。在与配体结合后，CRP被C1q识别并启动补体级联的激活。配体结合的CRP也与吞噬细胞上的FcγRl和FcγRlla结合并激活吞噬反应。除了吞噬作用，CRP还可以诱导单核细胞产生过氧化氢和炎性细胞因子，例如IL-1、IL-6和TNF-α。由于这些功能，人类CRP是一种用于抗菌病原体和清除受损和凋亡细胞的重要血清蛋白。然而，在小鼠中，CRP的表达水平非常低，并且不是急性期反应物。作为另一种五聚蛋白的血清淀粉样蛋白P成分(SAP)是小鼠中的主要急性期血清蛋白。已经表明，人体中高水平的CRP与心血管疾病的风险增加有关。
可用于本发明方法中的缀合物稳定剂是在商标StabiIZymeTM下出售的缀合物稳定剂，它是一种多用途HRP缀合物稳定解决方案，旨在维持免疫测定中常用的抗体/抗原缀合物、抗体涂布颗粒和未修饰蛋白的构象。
可用于本发明方法中的发色底物或显示试剂是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
消泡/防泡剂可用于本发明方法中。这类剂的示例在商标Foam AwayTM下出售并且可从ThermoFisher Scientific获得。
实施例-图15示出的CRP结果
测定筒和比色皿制备包括根据上述方法用捕获抗CRP抗体来制备移液管吸头。具体地说，在制备150移液管吸头20期间，捕获抗CRP抗体结合至移液管吸头20的内部，所述移液管吸头原本能够容纳300ul体积的溶液。
根据上述方法通过将以下量分配至指示孔中来制备所述筒：
制备所述筒之后，根据上述方法经由毛细管采样器18来获得104血液样品。在分析器识别所选择的生物测定之后，将筒负载至分析器中，并且自动过程110开始。具体地说，分析器根据指定自动过程110，使用移液管臂和挤出重力来转移试剂或血液样品112。
在此生物测定中，自动步骤包括添加112、混合114、测量116、孵育117、校正118、和向使用者或其他指定个体报告119结果。通过将290ul的第一试剂量从第三孔16c转移到第二孔16b中来开始测定。
接下来，将5ul的血液样品从毛细管采样器18挤出112到第二孔16b中。然后使用来自第一孔16a的带有抗体的移液管吸头吸取来自第二孔的100uL样品。然后将此样品保持117在移液管吸头内60秒，之后将裂解的血液样品丢弃回第二孔16b中。
然后进行第一次洗涤，其中从第六孔16f吸取130uL的第四试剂，然后再次丢弃。然后用来自第四孔16d的55uL第二试剂，随后是75uL气隙来进行第二次洗涤。然后这被丢弃到第三孔16c中。这作为第三次洗涤来重复。
接下来，通过混合114并从第五孔16e吸取100uL的第三试剂并在117保持4分钟，用抗CRP-HRP标记分析物。然后这被丢弃回到第五孔16e中。
然后对移液管吸头进行四次附加洗涤。在第四次洗涤中，130uL的第一试剂被吸取114，然后丢弃回到第三孔16c中。在第五次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第六次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第七次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的130uL第三试剂。然后这被丢弃到第四孔16d中。接下来，吸取114来自比色皿16g的100ul第五试剂，在117保持2分钟，然后丢弃回到比色皿16g中并混合114。然后如本文别处所述在660nm处读取116样品。
对六种不同浓度的CRP重复此程序。数据显示于下表中：
CRP(mq/L) OD660nm
0 0.0045
4.25 0.0897
17.97 0.2658
56.92 0.6953
95.87 0.8837
203.28 1.0881
如前所述，此数据也在图15中直观地示出。
实施例-图16示出的胱抑素结果
测定筒和比色皿制备包括根据上述方法用捕获抗胱抑素C抗体来制备移液管吸头。具体地说，在制备150移液管吸头20期间，捕获抗胱抑素C抗体结合至移液管吸头20的内部，所述移液管吸头原本能够容纳300ul体积的溶液。
根据上述方法通过将以下量分配至指示孔中来制备所述筒：
制备所述筒之后，经由毛细管采样器18来获得104具有不同浓度的胱抑素的样品。在分析器识别所选择的生物测定之后，将筒负载至分析器中，并且自动过程110开始。具体地说，分析器根据指定自动过程110，使用移液管臂和挤出重力来转移试剂或血液样品112。
在此生物测定中，自动步骤包括添加112、混合114、测量116、孵育117、校正118、和向使用者或其他指定个体报告119结果。通过将290ul的第一试剂量从第三孔16c转移到第二孔16b中来开始测定。
接下来，将5ul的样品从毛细管采样器18挤出112到第二孔16b中。然后使用来自第一孔16a的带有抗体的移液管吸头将来自第二孔16b的75uL稀释血液样品吸取到第六孔16f。接下来，来自第五孔16e的75uL第三试剂随后也从第五孔16e移动112至第六孔16f。
然后，通过上下吸移三次在第六孔16f中混合114试剂混合物和稀释样品来进行分析物标记。接下来，然后将100uL的此样品混合物吸取至移液管吸头中并且在117孵育60秒，之后将裂解血液样品混合物丢弃回到第六孔16f中。
然后对移液管吸头进行四次洗涤。在第一次洗涤中，在114吸取50uL的第一试剂，然后将其丢弃回第三孔16c中。在第二次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的110uL第二试剂，随后是20uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第三次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的110uL第二试剂，随后是20uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第四次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的110uL第三试剂。然后这被丢弃到第二孔16b中。
接下来，吸取114来自比色皿16g的100ul第四试剂，在117保持2分钟，然后丢弃回到比色皿16g中并混合114。然后如本文别处所述在660nm处读取116样品。
对七种不同浓度的已知胱抑素浓度重复此程序。数据显示于下表中：
胱抑素(mg/L) OD660nm
0 0.0173
0.25 0.1043
0.50 0.2541
1.00 0.4780
2.00 0.8195
4.00 1.3768
8.00 1.9523
如前所述，此数据也在图16中直观地示出。
实施例-图17示出的ALT结果
测定筒和比色皿制备包括根据上述方法来制备移液管吸头，除了这一次，涂布使用抗丙氨酸转氨酶(抗ALT)抗体来完成以外。具体地说，在制备150移液管吸头20期间，捕获抗ALT抗体结合至移液管吸头20的内部，所述移液管吸头原本能够容纳300ul体积的溶液。
根据上述方法通过将以下量分配至指示孔中来制备所述筒：
制备所述筒之后，经由毛细管采样器18来获得104具有不同浓度的ALT的样品。在分析器识别所选择的生物测定之后，将筒负载至分析器中，并且自动过程110开始。具体地说，分析器根据指定自动过程110，使用移液管臂和挤出重力来转移试剂或血液样品112。
在此示例性生物测定中，自动步骤包括添加112、混合114、测量116、孵育117、校正118、和其后向使用者或其他指定个体报告119结果。通过将290ul的第一试剂量从第三孔16c转移到第二孔16b中来开始测定。
接下来，将5ul的样品从毛细管采样器18挤出112到第二孔16b中。然后使用来自第一孔16a的带有抗体的移液管吸头吸取来自第二孔16b的100uL裂解血液样品。然后将此样品保持117在移液管吸头内10分钟，之后将裂解的血液样品丢弃回第二孔16b中。
然后进行第一次洗涤，其中从第三孔16c吸取130uL的第四试剂，然后再次丢弃。然后用来自第四孔16d的55uL第二试剂，随后是75uL气隙来进行第二次洗涤。然后这被丢弃到第三孔16c中。这作为第三次洗涤来重复。
接下来，通过混合114并从第五孔16e吸取100uL的第三试剂并在117保持4分钟，执行分析物标记。然后这被丢弃回到第五孔16e中。
然后对移液管吸头进行四次附加洗涤。在第四次洗涤中，吸取114来自第三孔16c的130uL第一试剂，然后丢弃回到第三孔16c中。在第五次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第六次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第七次洗涤中，再次吸取114来自第四孔16d的130uL第二试剂。然后将其再次丢弃到第四孔16d中。接下来，吸取114来自比色皿16g的100ul第五试剂，在117保持10分钟，然后丢弃回到比色皿16g中并混合114。然后如本文别处所述在660nm处读取116样品。
对三种不同浓度的丙氨酸转氨酶浓度重复此程序。数据显示于下表中：
ALT浓度(U/L) OD660
0 0.0627
250 0.4169
1000 0.6375
实施例-预处理和任选的附加辅助预处理的AST结果-在图18中示出
在图18中，通过对于附加等离子体处理吸头和本方法处理吸头关于天冬氨酸氨基转移酶(AST)抗体的分析进行比较，显示一些结果，这些结果说明与本方法相比，辅助任选预处理赋予的附加益处。在根据本文论述的正常本发明方法来进行抗体涂布之前，在等离子体腔室中对移液器吸头进行附加预处理可以导致与按照制造商提供的原状来使用的移液器吸头相比，抗体与预处理移液器吸头的结合得到改善。这种增加的抗体结合随后反映在增加的测定信号中。测定筒和比色皿制备包括根据以上论述的改进方法来制备移液管吸头。此涂布程序与上述程序基本相似，不同之处在于附加程序现在包括任选的额外预处理(称为等离子体处理)。以下描述的涂层处理和附加等离子体涂层处理是用捕获抗天冬氨酸氨基转移酶(抗AST)抗体进行的。
具体地说，在制备150移液管吸头20期间，捕获抗AST抗体结合至移液管吸头20的内部，所述移液管吸头原本能够容纳300ul体积的溶液。最初，吸取具有KPL缓冲液中的5ug/mL捕获AB的100uL抗体溶液并保持两小时。然后丢弃未结合到侧壁的部分。接下来，将200uL的10mM PBS和0.05％ Tw-20吸取至移液器吸头中，其中一部分与移液器吸头的侧壁结合。然后丢弃未结合到侧壁的部分。最后，将200uL的10mM PBS、0.05％ Tw-20、0.1％ BSA吸取至移液器吸头中并孵育5分钟，沿着移液器吸头的侧壁形成第三层。然后丢弃未结合到侧壁的部分。
根据上述方法通过将以下量分配至指示孔中来制备所述筒：
制备所述筒之后，获得104测试样品并且将其放入毛细管采样器18中。在分析器识别所选择的生物测定之后，将筒负载至分析器中，并且自动过程110开始。具体地说，分析器根据指定自动过程110，使用移液管臂和挤出重力来转移试剂或血液样品112。
在此示例性生物测定中，自动步骤包括添加112、混合114、测量116、孵育117、校正118、和其后向使用者或其他指定个体报告119结果。通过将290ul的第一试剂量从第三孔16c转移到第二孔16b中来开始测定。
接下来，将8ul的AST校准器从毛细管采样器18挤出112到第二孔16b中。然后使用来自第一孔16a的带有抗体的移液管吸头吸取来自第二孔的100uL样品。然后将此样品保持117在移液管吸头内10分钟，之后将样品丢弃回第二孔16b中。
然后进行第一次洗涤，其中从第六孔16f吸取130uL的第四试剂，然后再次丢弃。然后用来自第四孔16d的55uL第二试剂，随后是75uL气隙来进行第二次洗涤。然后这被丢弃到第三孔16c中。这作为第三次洗涤来重复。
接下来，通过从第五孔16e吸取100uL的第三试剂并在117保持10分钟，执行分析物标记。然后这被丢弃回到第五孔16e中。
然后对移液管吸头进行四次附加洗涤。在第四次洗涤中，吸取114来自第三孔16c的130uL第一试剂，然后丢弃回到第三孔16c中。在第五次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第六次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第七次洗涤中，再次吸取114来自第四孔16d的130uL第二试剂。然后将其再次丢弃到第四孔16d中。接下来，吸取114来自比色皿16g的100ul第五试剂，在117保持10分钟，然后丢弃回到比色皿16g中并混合114。然后如本文别处所述在660nm处读取116样品。
对于等离子体处理的吸头和处理的吸头中的每一个，针对八种不同浓度的AST重复此程序。数据显示于下表中：
AST浓度(U/L) 等离子体处理吸头 处理吸头
0 0.091 0.051
187.5 0.414 0.101
375 0.658 0.146
937.5 1.217 0.254
1875 1.637 0.36
3750 2.096 0.449
9375 2.669 0.64
18750 3.1 0.882
实施例-图19示出的hs-CRP结果
测定筒和比色皿制备包括根据上述方法用捕获抗CRP抗体来制备移液管吸头。具体地说，在制备150移液管吸头20期间，捕获抗CRP抗体结合至移液管吸头20的内部，所述移液管吸头原本能够容纳300ul体积的溶液。
根据上述方法通过将以下量分配至指示孔中来制备所述筒：
制备所述筒之后，获得104测试样品并且将其放入毛细管采样器18中。在分析器识别所选择的生物测定之后，将筒负载至分析器中，并且自动过程110开始。具体地说，分析器根据指定自动过程110，使用移液管臂和挤出重力来转移试剂或血液样品112。
在此示例性生物测定中，自动步骤包括添加112、混合114、测量116、孵育117、校正118、和其后向使用者或其他指定个体报告119结果。通过将290ul的第一试剂量从第三孔16c转移到第二孔16b中来开始测定。
接下来，将5ul的具有超灵敏c-反应蛋白(hs-CRP)的样品从毛细管采样器18挤出112到第二孔16b中。然后使用来自第一孔16a的带有抗体的移液管吸头吸取来自第二孔16b的100uL样品。然后将此样品保持117在移液管吸头内，之后丢弃回第二孔16b中。
然后进行第一次洗涤，其中从第六孔16f吸取130uL的第四试剂，然后再次丢弃。然后用来自第四孔16d的55uL第二试剂，随后是75uL气隙来进行第二次洗涤。然后这被丢弃到第三孔16c中。这作为第三次洗涤来重复。
接下来，通过从第五孔16e吸取100uL的第三试剂并在117保持3分钟，执行分析物标记。然后这被丢弃回到第五孔16e中。
然后对移液管吸头进行四次附加洗涤。在第四次洗涤中，吸取114来自第三孔16c的130uL第一试剂，然后丢弃回到第三孔16c中。在第五次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第六次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第七次洗涤中，再次吸取114来自第四孔16d的130uL第二试剂。然后将其再次丢弃到第四孔16d中。接下来，吸取114来自比色皿16g的100ul第五试剂，在117保持2分钟，然后转移回到比色皿16g中并混合114。然后如本文别处所述在660nm处读取116样品。
对六种不同浓度的hs-CRP重复此程序。数据显示于下表中：
此数据在图19中直观地示出。
实施例-图20示出的IGF-1结果
测定筒和比色皿制备包括根据以上论述的改进方法来制备移液管吸头。此涂布程序与上述程序基本相似，不同之处在于程序现在用捕获抗胰岛素样生长因子1(抗IGF-1)抗体来执行。
具体地说，在制备150移液管吸头20期间，捕获抗IGF-1抗体结合至移液管吸头20的内部，所述移液管吸头原本能够容纳300ul体积的溶液。最初，吸取具有KPL缓冲液中的5ug/mL捕获抗体的100uL抗体溶液并保持30分钟。然后丢弃未结合到侧壁的部分。接下来，将200uL的10mM PBS和0.05％ Tw-20吸取至移液器吸头中，其中一部分与移液器吸头的侧壁结合。然后丢弃未结合到侧壁的部分。最后，将200uL的10mM PBS、0.05％ Tw-20、0.1％BSA吸取至移液器吸头中并孵育10分钟，沿着移液器吸头的侧壁形成第三层。然后丢弃未结合到侧壁的部分。
根据上述方法通过将以下量分配至指示孔中来制备所述筒：
制备所述筒之后，获得104测试样品并且将其放入毛细管采样器18中。在分析器识别所选择的生物测定之后，将筒负载至分析器中，并且自动过程110开始。具体地说，分析器根据指定自动过程110，使用移液管臂和挤出重力来转移试剂或血液样品112。
在此示例性生物测定中，自动步骤包括添加112、混合114、测量116、孵育117、校正118、和其后向使用者或其他指定个体报告119结果。通过将150ul的第一试剂量从第三孔16c转移到第二孔16b来开始这一系列的测定。
接下来，将8ul的具有IGF-1的样品从毛细管采样器18挤出112到第二孔16b中。然后使用来自第一孔16a的带有抗体的移液管吸头吸取来自第二孔16b的100uL样品。然后将此样品保持117在移液管吸头内五分钟，之后丢弃回第二孔16b中。
然后进行第一次洗涤，其中从第六孔16f吸取130uL的第四试剂，然后再次丢弃。然后用来自第四孔16d的55uL第二试剂，随后是75uL气隙来进行第二次洗涤。然后这被丢弃到第三孔16c中。这作为第三次洗涤来重复。
接下来，通过从第五孔16e吸取100uL的第三试剂并在117保持5分钟，执行分析物标记。然后这被丢弃回到第五孔16e中。
然后对移液管吸头进行四次附加洗涤。在第四次洗涤中，吸取114来自第三孔16c的130uL第一试剂，然后丢弃回到第三孔16c中。在第五次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第六次洗涤中，吸取114来自第四孔16d的65uL第二试剂，随后是65uL气隙。然后这也被丢弃到第三孔16c中。在第七次洗涤中，再次吸取114来自第四孔16d的130uL第二试剂。然后将其再次丢弃到第四孔16d中。接下来，吸取114来自比色皿16g的100ul第五试剂，在117保持5分钟，然后转移回到比色皿16g中并混合114。然后如本文别处所述在660nm处读取116样品。
对六种不同浓度的IGF-1重复此程序。数据显示于下表中：
IGF-1(mg/L) OD660
0 0.239
10 0.259
20 0.333
40 0.399
100 0.54
1000 1.086
此数据在图20中直观地示出。
校正血红蛋白水平的方法-图21和22
本发明寻求解决与光学检测相关的ELISA程序的实验室误差的几个来源。由于样品内的凝块形成会影响光学吸收读数，并且凝块形成取决于时间的流逝，因此与光学检测相关的ELISA程序的实验室误差的最大来源之一是由于采样和测量之间的时间流逝。
本发明的原理之一是解决现有技术未能解决的由于采样和检测(测量)之间的时间流逝而可能发生的误差数量增加的问题。通过将检定组分预先包装在全包式筒中并为检定方法提供预先选择的组分，本发明加快了预检测阶段。
本发明实现此目标的另一种方式是提供一种生物测定法，所述生物测定法能够通过使用全血样品来获得准确的结果，而无需在测试前将红细胞与血浆分离。当前可用的护理点分析器需要使用血浆作为样品。这需要在获得测试结果之前将血液样品中的红细胞与血浆分离，并进一步延长采样和测试之间的时间段。
发现目前的分析器需要血浆的原因之一是由于现有技术的自动化系统和测定不能提供自我校正分析。血液样品中血红蛋白的水平将对样品的光密度产生影响。本发明人已经发现，不能调整光密度的信号输出以考虑到个人血红蛋白量的变化会在正确识别CRP水平方面产生误差。
为了解决涉及这种潜在误差来源的现有技术的误差，本发明提供具有用于血红蛋白的自动校正的改进ELISA生物测定方法。对于所描述的使用全血的测定实施方式，样品的光密度是在可见波长下测量的。随后，通过在另一个可见波长下测量样品光密度来确定血红蛋白水平。然后使用血红蛋白测量结果来校正CRP水平以获得样品调整后的真实血浆值。
以这种方式，本发明实现另一个目的：解决现有技术方法无法考虑到个人患者血浆容量变化的问题。从统计学上讲，患者血液样品中的血浆量与检测到的血红蛋白量之间存在直接相关性。健康的典型人的血液可能含有12-17g/dL的血红蛋白。世界卫生组织报告称，非贫血个体的检测到的血红蛋白水平可能因年龄、海拔和性别而异：
6个月至4岁：等于或高于11g/dL
5-12岁：等于或高于11.5g/dL
12-15岁：等于或高于12g/dL
成年男性：等于或高于13.0g/dL至17.2g/dL
成年女性：等于或高于12.1至15.1g/dL
怀孕期间：等于或高于11g/dL
然而，特定患者的血红蛋白量的变化已被记录，例如，在患有贫血的患者中，在8-12g/dL之间变化，或例如在吸烟、居住在高海拔地区或服用药物或激素(例如刺激红细胞生成的促红细胞生成素)的患者中，在15.0g/dL和19g/dL之间变化。较高的HGB水平表明全血样品体积的较大百分比被红细胞占据。较低的HGB水平表明全血样品体积的较小百分比被红细胞占据。
如前所述，被检测的分析物携带在患者血浆中。那么实际上，当使用光学检测来确定分析物浓度时，较高的HGB水平(相对于样品量)意味着可用于分析的血浆体积较小(相对于样品量)。在未能考虑到血浆水平变化的现有技术方法中，这导致以下结果：所报告的值低于患者体内实际存在的值。
或者，低于正常值的HGB水平(相对于样品量)表明存在可用于分析的更高体积的血浆(相对于样品量)。在未能考虑到血浆水平变化的现有技术方法中，这导致以下结果：所报告的分析物值高于患者体内实际存在的分析物值。
本发明方法促进仪器能力的扩展，以包括多个信号测量装置，例如但不限于多个波长的发光二极管(LED)。测量混合物的光密度以读取测定优选在620nm至700nm，更优选在650nm至680nm之间，甚至更优选在658nm和668nm之间的范围内，并且最优选在660nm的可见波长下进行。测量样品的光密度以读取血红蛋白水平优选在500nm和550nm，更优选在510nm和545nm之间，甚至更优选在520nm和540nm之间的范围内，并且最优选在530nm的可见波长下进行。
进行测试以示出不同水平的血红蛋白对检测到的CRP的效应(血细胞比容效应)，结果在图21和22中以图形方式示出。如本文示出，血红蛋白在0至23g/dL的范围内。随着血红蛋白增加，现有技术方法计算的CRP减少。通过可见光范围内的附加LED，可以针对检测到的血红蛋白来校正通过本发明方法确定的CRP水平。具体地说，图22显示针对血红蛋白来校正的CRP。
下表显示在图21中以图形方式示出的数据，识别样品ID、血红蛋白水平、和校正之前的CRP值：
样品 HGB mg/dl CRP
1 8.9 147.3
2 11.5 135.8
3 13.8 119.4
4 16.1 114.1
在下文中，此表显示在图22中以图形方式示出的数据，识别样品ID、血红蛋白水平、和校正之后的CRP值：
样品 HGB mg/dl CRP
1 8.9 117.4
2 11.5 123.1
3 13.8 118.5
4 16.1 122.3
以这种方式，本发明人调整光密度的信号输出以便考虑到个人血红蛋白量的变化，从而在正确识别CRP值的过程中避免误差。具体地说，在向使用者提供校正CRP水平之前，本发明方法将所有结果相对于14g/dL的HGB浓度来标准化。
结论
尽管本文中已描述本发明的优选实施方式，但以上描述仅为说明性的。各别领域技术人员将了解本文所公开的本发明的其他改进，且认为所有这些改进在如由附加权利要求书界定的本发明的范围内。

Claims (18)

1.一种用于对单个患者执行酶联免疫吸附测定的一次性生物测定诊断筒，其中所述筒具有多个孔，所述筒包括：
安置在所述多个孔中的一个孔中的具有内部侧壁的移液管吸头，所述内部侧壁被预处理并且涂有抗体；
安置在所述多个孔中的另一个孔中的试剂混合物，所述试剂混合物包括至少一种选自由以下组成的组的试剂：pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂、抗体、和缀合物稳定剂；和
安置在所述多个孔中的集成比色皿中的至少一种发色底物和显示试剂。
2.如权利要求1所述的一次性筒，其中涂布所述内部侧壁的所述抗体选自由以下组成的组：抗c-反应蛋白抗体、抗胱抑素-c抗体、抗IGF-1抗体、抗丙氨酸转氨酶抗体、和抗天冬氨酸转氨酶抗体。
3.如权利要求1所述的一次性筒，其中所述发色底物和所述抗体以大约1:1的比率存在。
4.如权利要求1所述的一次性筒，其中所述发色底物是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。
5.如权利要求1所述的一次性筒，其中所述至少一种试剂以与所述发色底物和显示试剂的量对应的量存在。
6.如权利要求1所述的一次性筒，其中所述至少一种试剂由具有0.002％皂角苷、0.01％低泡表面活性剂、和0.02％叠氮化钠的裂解溶液的至少150uL试剂混合物组成。
7.如权利要求1所述的一次性筒，其中所述第三孔具有PBS、0.05％聚山梨醇酯类型非离子表面活性剂、和0.03％杀生物防腐剂。
8.如权利要求1所述的一次性筒，进一步包括第四孔，所述孔具有选自由抗c-反应蛋白抗体、抗胱抑素-c抗体、抗IGF-1抗体、抗丙氨酸转氨酶抗体、和抗天冬氨酸转氨酶抗体组成的组的抗体，缀合物稳定剂，和0.5％消泡/防泡剂。
9.如权利要求1所述的一次性筒，其中涂布所述移液管的侧壁的所述抗体是抗胱抑素C抗体；并且所述第二孔中的所述至少一种试剂由具有0.002％皂角苷、0.01％低泡表面活性剂、和0.02％叠氮化钠的裂解溶液组成。
10.如权利要求1所述的一次性筒，进一步包括：
第四孔，所述孔具有10mM PBS、0.05％聚山梨醇酯类型非离子表面活性剂、和0.03％杀生物防腐剂；和
第五孔，所述孔具有选自由抗c-反应蛋白抗体、抗胱抑素-c抗体、抗IGF-1抗体、抗丙氨酸转氨酶抗体、和抗天冬氨酸转氨酶抗体组成的组的抗体，缀合物稳定剂，和0.5％消泡/防泡剂。
11.如权利要求2所述的一次性筒，所述集成比色皿具有第一和第二壁，所述第一和第二壁能够促进经由530nm下的第一LED的第一光学检测读取，和经由660nm下的第二LED的第二光学检测读取。
12.一种酶联免疫吸附生物测定诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
手指针刺装置；和
具有多个孔和光学比色皿的筒，所述筒具有安置在所述多个孔中的一个孔中的移液管吸头和安置在所述多个孔中的一或多个剩余孔中的生物测定组分，并且其中所述多个孔中的一个孔是光学比色皿；
其中所述移液管吸头具有涂有抗体的侧壁；和
其中所述生物测定组分包括至少一种选自由以下组成的组的试剂：pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂、抗体、缀合物稳定剂、发色底物、和显示试剂。
13.一种制备一次性移液管的方法，所述一次性移液管用于执行酶联免疫吸附测定，同时缩短洗涤时间，所述方法包括以下步骤：
通过涂布所述移液管吸头的内表面来预处理移液管吸头，所述预处理步骤包括：
沿着所述移液管吸头的内表面，安置含有亲和剂的第一涂层；
沿着所述移液管吸头的内表面，在第一涂层上方安置含有阻断溶液的第二涂层；
沿着所述移液管吸头的内表面，在所述第二涂层上方安置含有活性防腐剂的第三涂层，从而形成用于执行酶联免疫吸附测定的经涂布的移液管吸头，通过使用至少一种试剂混合物，促进直接移液至经涂布的移液管吸头中，从而缩短洗涤时间，所述至少一种试剂混合物选自由以下组成的组：pH稳定剂、离子催化控制剂、离子细胞内抑制控制剂、清洁剂、负控制剂、螯合剂、和杀生物防腐剂、抗体、和缀合物稳定剂；和
在所述筒内提供一个含有发色底物和显示试剂的孔，以便使所述发色底物和显示试剂与经涂布的移液管吸头中的所述亲和剂直接反应。
14.如权利要求13所述的方法，进一步包括：选择来自由以下组成的组的亲和剂：抗体、抗体片段、重组蛋白、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、链霉亲和素、重组蛋白片段、核酸、多糖、糖蛋白、肽聚糖、分子印迹聚合物、和适体分子。
15.如权利要求13所述的方法，进一步包括选择来自由以下组成的组的涂布缓冲液：碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液、蔗糖缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、和三(羟甲基)氨基甲烷盐水。
16.如权利要求13所述的方法，其中沿着所述移液管吸头的内表面，使用所述亲和剂来安置所述第一涂层的步骤，所述第一涂布步骤进一步包括：
选择所述亲和剂；
选择涂布缓冲液；
通过混合选定抗体和选定涂布缓冲液来制备抗体溶液；
用所述混合抗体溶液来填充所述移液管吸头；和
在第一温度下，将所述移液管吸头孵育预定义时间。
17.如权利要求13所述的方法，其中沿着所述移液管吸头的内表面，用所述阻断溶液来安置所述第一涂层上方的所述第二涂层的步骤，所述第二涂布步骤进一步包括：
选择所述阻断溶液；
用所述阻断溶液来填充所述移液管吸头；和
在第二温度下，将所述移液管吸头孵育预定义时间。
18.如权利要求13所述的方法，其中沿着所述移液管吸头的内表面，用所述活性防腐剂来安置所述第二涂层上方的所述第三涂层的步骤，所述第三涂布步骤进一步包括：
选择所述活性防腐剂；
用所述活性防腐剂来填充所述移液管吸头；和
在第三温度下，将所述移液管吸头孵育预定义时间。
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