KR20230112620A - 헤모글로빈 보정 장치를 사용한 변형된 elisa 및 이의 방법 - Google Patents

헤모글로빈 보정 장치를 사용한 변형된 elisa 및 이의 방법 Download PDF

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Abstract

전혈 및 혈장에서의 단일 환자에 대한 효소-결합 면역흡착 검정을 수행하기 위한 일회용 생물검정 진단 카트리지로서, 여기서 카트리지는 복수의 웰을 갖는다. 카트리지는 복수의 웰 중의 하나의 웰에 배치된 내부 측벽을 갖는 피펫 팁으로서, 내부 측벽은 전처리되고 항체로 코팅되는 피펫 팁, 복수의 웰 중의 다른 웰에 배치된 시약 혼합물로서 pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제, 항체, 및 접합체 안정화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 시약을 포함하는 시약 혼합물을 포함한다. 적어도 발색 기질 및 시각화 시약은 복수의 웰의 통합된 큐벳에 배치된다. 이는 또한 혈액 샘플에서 헤모글로빈 양의 검출을 포함하고, 이로써 샘플 중의 혈장 양에 대한 보정이 수행될 수 있다.

Description

헤모글로빈 보정 장치를 사용한 변형된 ELISA 및 이의 방법
본 발명은 일반적으로 효소-결합 면역흡착 검정을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)은 샘플에서 항체 또는 항원을 검출하고 및/또는 정량화하기 위해 사용되는 생화학적 기술이다. 고전적 2단계 샌드위치 ELISA(Classical 2 step sandwich ELISA)는 분석물에 대한 포집 항체에의 분석물의 초기 결합 이후 포집된 분석물에의 표지된 검출 항체의 결합에 기초한다. 1단계 샌드위치 ELISA에서, 포집 및 검출 항체에 대한 분석물 결합은 동시에 수행된다. 검출 항체는 호스래디시 페록시다아제 (HRP) 또는 알칼리 포스파타아제 (AP)와 같은 효소에 접합될 수 있다. 포집된 면역 복합체에 대한 효소 기질의 후속 도입은 광학적으로 또는 다른 수단에 의해 측정될 수 있는 색상 형성을 초래한다. 색상 형성의 속도 및 정도는 항원의 농도에 비례한다.
ELISA는 통상적으로 마이크로타이터 플레이트 형식(microtiter plate format)으로 수행되며, 복잡한 기기 및/또는 고도의 숙련가를 필요로 한다. ELISA는 또한 통상적으로 96-웰 또는 384-웰 폴리스티렌 플레이트 및 용액 중의 샘플을 사용하여 수행된다. 샘플이 첨가될 때 포집 항체만을 포함하는 종래의 ELISA 키트 이외에, 다른 인스턴트 ELISA 키트는 포집 항체와 동결건조된 검출 항체, 스트렙타비딘-HRP, 및 샘플 희석제를 보유하는 전처리된 플레이트를 포함한다.
생물학적 샘플의 자동화된 처리를 위한 장치 및 이의 방법을 명칭으로 하는 미국 특허 제9,011,772호는 바이오프로세싱 장치, 바이오프로세싱 카드, 및 샘플의 자동화된 바이오프로세싱을 수행하기 위한 유체 카트리지를 개시하고 있다. 바이오프로세싱 카드는 복수의 피펫 팁; 및 복수의 피펫 팁과 유체 연통되는 적어도 하나의 펌프를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펌프 및 피펫 팁은 마이크로스케일 채널일 수 있는 처리 채널을 통해 유체 연통된다. 또한, 적어도 하나의 바이오프로세싱 카드; 적어도 하나의 유체 카트리지; 및 샘플의 자동화된 바이오프로세싱을 제어하도록 구성된 자동화된 제어 시스템을 포함하는 자동화된 바이오프로세싱 장치가 본원에 제공된다. 추가로 상기 장치, 카드, 및 카트리지의 사용 방법이 본원에 제공된다.
다중-분석을 위한 시스템 및 방법을 명칭으로 하는 미국 특허 제9,810,704호는 샘플 처리를 위한 시스템 및 방법을 개시한다. 구체적으로, 샘플을 받고, 샘플 준비, 샘플 검정, 및 검출 단계 중 하나 이상을 수행할 수 있는 공개된 장치가 제공될 수 있다. 상기 장치는 복수의 검정을 수행할 수 있다. 상기 장치는 샘플 준비, 샘플 검정, 및 검출 단계 중 하나 이상을 수행할 수 있는 하나 이상의 모듈을 포함할 수 있다. 상기 장치는 작은 부피의 샘플을 사용하여 상기 단계들을 수행할 수 있다.
공지된 선행 기술에 대한 본 발명의 장점 및 차이점
선행 기술의 상기 기재된 부분은 산업의 요건 모두를 충족시키기 위해 완전하게 만족스러운 것으로 입증되지 않았다.
증가된 능력을 제공하는 변형된-ELISA 자체-포함 키트를 제공하는 본 발명의 방법의 몇몇 장점이 이하 논의될 것이다. 일반 ELISA 방법론을 변형하는 하나의 장점은 연관된 피펫 팁의 기능을 증가시키는 것을 포함한다. 추가의 이익은 감소되거나 근절된 교차-오염을 야기하는 증가된 세척과 관련된다. 본 발명의 방법의 추가의 이익은 효소-기질 반응이 시험 전에 중단될 필요가 없다는 것이다. 본 발명의 변형된-ELISA의 추가의 이익은 더 빠른 면역검정이고, 이는 15분 미만, 보다 바람직하게는, 약 10-14분 내에, 일부 구현예에서, 7-9분 범위 내에 결과를 제공한다.
본 발명의 목적의 충족
본 발명은 포집 친화도 시약이 결합되는 이동가능한 성분을 갖는 효소-결합 면역흡착 검정 시스템을 제공한다. 일 구현예에서, 포집 친화도 시약은 항체이다. 일 구현예에서, 이동가능한 성분은 피펫 팁이다. 추가의 구현예에서, 시스템은 복수의 별개의 시약을 보유할 수 있는 복수의 웰을 갖는 일회용 카트리지를 이용한다. 이 구현예에서, 웰의 치수는 상술한 이동가능한 성분과 상용성이고, 이로써 이동가능한 성분은 웰로 삽입되고, 흡입되고, 보유되고, 분배되어, 카트리지 주변에서 액체를 이동시킬 수 있다.
상기 시스템은 특정 부피의 샘플을 카트리지로 전달할 수 있는 샘플 수집 장치를 이용할 수 있다. 바람직한 시스템은 또한 이동가능한 성분과 결합하고, 다양한 생체물질을 정확하게 흡입하고, 분배하고, 수송하고, 혼합하고, 광학적으로 상이한 분석물의 존재를 검출할 수 있는 기기를 이용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이동가능한 성분 예컨대 피펫 팁 및 시약 카트리지는 다양한 물질 예컨대 폴리스티렌 (PS), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 PE), 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 폴리디메틸실록산 (PDMS), 폴리카보네이트 (PC), 시클릭 올레핀 공중합체 예컨대 TOP AS®, 시클로-올레핀 중합체 예컨대 Zeonor®, 및 Zeonex®, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 규소 및 그의 유도체, 유리, 석영, 또는 금속으로 제조될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이동가능한 성분 예컨대 피펫 팁은 단백질 예컨대 항체, 항체 단편, 재조합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 스트렙타비딘, 또는 재조합 단백질 또는 이의 단편, 핵산, 다당류, 당단백질, 펩티도글리칸, 분자 각인 폴리머 또는 압타머 분자로 코팅될 수 있다. 항체는 바람직한 친화도 제제(affinity agent)이다. 고정화는 비특이적 흡착에 의해 또는 공유 접합에 의해 달성될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 카트리지 웰은 시약 예컨대 샘플 용해 버퍼, 세척 버퍼, 검출 항체 접합체 및 효소 기질로 사전-충전된다. 바람직한 구현예에서, 검출 항체는 효소 예컨대 호스래디시 페록시다아제 (HRP) 또는 알칼리 포스파타아제 (AP)에 접합될 수 있다.
다른 목적은 복수의 유형의 ELISA가 수행될 수 있는 시스템 및 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라, 1-단계 및 2-단계 둘 모두가 수행될 수 있다.
본 발명은 효소-결합 면역흡착 검정을 수행하기 위해 일회용 현장 진료 생물검정 진단 카트리지를 제공함으로써 이러한 그리고 기타 목적을 달성한다. 일회용 카트리지는 복수의 웰을 가질 수 있고, 제1 웰은 전처리되고 특정 항체로 코팅된 내부 측벽을 가진 피펫 팁을 보유할 수 있다. 카트리지의 제2 웰은 적어도 하나의 시약 혼합물을 가질 수 있고, 적어도 하나의 시약은 pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제(negative control agent), 킬레이트제 및 살생물 보존제, 항체, 및 접합체 안정화제이다. 항체는 항-c-반응성 단백질 항체, 항-시스타틴-c 항체, 항-IGF-1 항체, 항-알라닌 아미노전이효소 항체, 및 항-아스파테이트 아미노전이효소 항체 중 하나 이상일 수 있다. 제3 웰은 발색 기질 및 시각화 시약 중 적어도 하나를 갖는 시약 혼합물을 보유할 수 있다.
본 발명은 또한 핑거스틱 장치(fingerstick device) 및 일체형 자체-포함 일회용 진단 카트리지를 갖는 효소-결합 면역흡착 생물검정 진단 키트를 제공함으로써 이러한 목적들을 충족시킨다. 상기 카트리지는 카트리지 내에 함유된 생물검정 컴포넌트 및 피펫-팁을 가질 수 있다. 상기 카트리지는 또한 집적 광학 큐벳을 가질 수 있다. 상기 카트리지는 또한 사용자의 편의를 위해 외부 표면에 따라 식별자를 가질 수 있다.
카트리지 내의 피펫-팁은 항체로 코팅된 내부 측벽, 및 내부 측벽에 개방되어 접근가능하게 유지되는 피펫-팁의 내부 챔버 내의 적어도 일부를 갖는다. 즉, 코팅된 피펫-팁은 완전하게 충전되지 않지만, 충전가능하게 유지된다.
카트리지 내의 생물검정 컴포넌트는 하기 적어도 하나의 반응성 또는 비반응성 시약을 갖는다: pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제, 항체, 접합체 안정화제, 발색 기질, 및 시각화 시약.
본 발명의 피펫-팁은 다양한 양의 항체로 코팅된 내부 벽을 가질 수 있다. 유사하게는, 본 발명의 카트리지 웰은 다양한 양의 생물검정 컴포넌트를 가질 수 있다. 본 발명에 따라 수행되는 변형된-ELISA의 예는 특정 양을 사용하여 본원에 제공된다. 그러나, 이러한 양은 본 발명의 사상을 벗어남 없이 이용되는 카트리지 및 팁의 크기에 따라 변화될 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 일반적으로 유사한 양으로 항체 및 발색 기질을 이용한다.
예를 들어, 항체 대 발색 기질의 1:1의 대략적 상관관계는 대부분 구현예에 존재한다. 40 ul 내지 60 ul의 항체가 이용될 때, 일반적으로 제공되는 40 ul 내지 60 ul의 범위의 발색 기질이 또한 이용된다. 대략 90 ul 내지 110 ul의 항체가 이용될 때, 일반적으로 제공되는 90 ul 내지 110 ul의 범위의 발색 기질이 또한 이용된다. 300 ul 내지 320 ul의 범위의 양의 항체가 사용될 때, 일반적으로 제공되는 약 300 ul 내지 320 ul의 발색 기질이 존재한다.
본 발명의 컨셉은 추가로 효소-결합 면역흡착 검정을 수행하기 위해 카트리지를 준비하는 신규한 방법을 제공함으로써 본 목적을 충족시킨다. 상기 방법은 (1) 피펫 팁의 내부 표면을 코팅함으로써 피펫 팁을 전처리하는 단계; (2) 친화도 제제를 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제1 코팅을 제공하는 단계; (3) 차단 용액을 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제1 코팅 상에 제2 코팅을 제공하는 단계; (4) 활성 보존제를 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제2 코팅 상에 제3 코팅을 제공하는 단계; (5) pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제, 항체, 및 접합체 안정화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 시약 혼합물을 사용한 직접 피펫팅을 용이하게 함으로써 세척 시간을 감소시키는 단계; 및 (6) 발색 기질 및 시각화 시약과 직접적으로 반응시키기 위해 카트리지 내에 하나의 웰을 제공하는 단계를 갖는다.
이 방법은 또한 항체, 항체 단편, 재조합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 스트렙타비딘, 재조합 단백질 단편, 핵산, 다당류, 당단백질, 펩티도글리칸, 분자 각인 폴리머, 및 압타머 분자로 이루어진 군으로부터 친화도 제제를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
이 방법은 또한 탄산염/중탄산염 버퍼, 수크로오스 버퍼, 인산 완충 식염수 (PBS), 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 식염수로 이루어진 군으로부터 코팅 버퍼를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
친화도 제제를 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제1 코팅을 제공하는 단계는 또한 친화도 제제를 선택하고; 코팅 버퍼를 선택하고; 선택된 항체 및 선택된 코팅 버퍼를 혼합하여 항체 용액을 준비하고; 혼합된 항체 용액으로 피펫 팁을 충전하고; 그리고 제1 시간 동안 제1 온도에서 피펫 팁을 인큐베이션함으로써 추가로 정의될 수 있다.
차단 용액을 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제1 코팅 상에 제2 코팅을 제공하는 단계는 또한 차단 용액을 선택하고; 차단 용액으로 피펫 팁을 충전하고; 그리고 제2 시간 동안 제2 온도에서 피펫 팁을 인큐베이션함으로써 추가로 정의될 수 있다.
활성 보존제를 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제2 코팅 상에 제3 코팅을 제공하는 단계는 또한 활성 보존제를 선택하고; 활성 보존제로 피펫 팁을 충전하고; 그리고 제3 시간 동안 제3 온도에서 피펫 팁을 인큐베이션함으로써 추가로 정의될 수 있다.
도 1은 나타난 바와 같은 스캐너과 함께 사용하기 위한 본 발명의 생물검정 카트리지 키트의 예시이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 카트리지의 단면도이다.
도 3은 본 발명의 추가의 구현예에 따른 카트리지 및 피펫 팁의 단면도이다.
도 4는 본 발명의 추가의 구현예에 따른 카트리지 및 피펫 팁의 단면도이다.
도 5는 본 발명의 카트리지의 식별자를 스캐닝하는 사용자의 예시이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따른 혈액 샘플을 얻기 위해 핑거스틱 장치를 사용하는 사용자의 예시이다.
도 7은 본 발명의 카트리지로부터 샘플러를 회수하는 사용자의 예시이다.
도 8은 혈액 샘플로 본 발명의 카트리지로부터의 샘플러를 충전하는 사용자의 예시이다.
도 9는 본 발명의 카트리지로 다시 충전된 샘플러를 혈액 샘플로 대체하는 사용자의 예시이다.
도 10은 본 발명의 카트리지를 분석기로의 충전된 샘플로 대체하는 사용자의 예시이다.
도 11은 본 발명의 방법의 개요를 예시한다.
도 12는 본 발명의 팁의 제조 과정의 개요를 예시한다.
도 13은 도 12에서의 과정의 추가 연속을 예시한다.
도 14는 도 12에서의 과정의 양태를 예시한다.
도 15는 CRP (mg/L)에 대해 660 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 CRP의 용량 반응을 이용하는 제1 구현예의 결과를 예시하는 그래프이다.
도 16은 시스타틴 (mg/L)에 대해 660 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 시스타틴의 용량 반응을 이용하는 추가의 구현예의 결과를 예시하는 그래프이다.
도 17은 (U/L)의 ALT 농도에 대해 660 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 ALT의 용량 반응을 이용하는 추가의 구현예의 결과를 예시하는 그래프이다.
도 18은 (U/L)의 AST 농도에 대해 660 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 비-처리된 AST의 용량 반응을 이용하는 추가의 구현예의 결과를 예시하는 그래프이다.
도 19는 (mg/L)의 hs-CRP 농도에 대해 660 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 hs-CRP의 용량 반응을 이용하는 추가의 구현예의 결과를 예시하는 그래프이다.
도 20은 (ng/mL)의 IGF-1 농도에 대해 660 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 IGF-1의 용량 반응을 이용하는 추가의 구현예의 결과를 예시하는 그래프이다.
도 21은 정상 CRP 광학 밀도 판독에 대한 HGB 효과의 결과를 예시하는 그래프이다.
도 22는 HGB 효과를 설명하기 위해 보정된 정상 CRP 광학 밀도 판독을 예시하는 그래프이다.
본 발명의 바람직한 구현예는 도 1-22를 참조하여 논의된다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 헤모글로빈 보정을 사용한 변형된 ELISA를 위한 방법 및 장치와 관련된 공정, 방법론, 시스템, 및 장치를 제공한다.
포괄적 카트리지 키트
잠재적 분석기 시스템(1) 옆에 나타난 본 발명의 완전하게 포괄적이고 종합적인 카트리지 키트(10)의 예시가 도 1에 나타나 있다. 이 카트리지 키트(10)은 변형된 ELISA 카트리지(12) 및 별도의 분석기 시스템(1)과 함께 1회 사용하기 위해 사전패키징된 핑거스틱 장치(14)를 포함한다. 키트가 본 발명의 다양한 구현예에 따라 설계되는 특정 테스트에 따라, 카트리지 키트는 또한 적어도 하나의 피펫 팁(20), 샘플러(18), 및 통합된 큐벳(16g)를 포함할 수 있고, 이는 도 2-4와 관련하여 하기에 보다 상세하게 논의된다. 단일 패키지(19)에 통합된 키트로서 이러한 컴포넌트를 제공함으로써, 본 발명은 전체적 절차 시간을 감소시키면서 사용자 오류를 감소시킨다.
본원에 기재된 바와 같은 검정을 수행할 수 있는 예시적인 분석기 시스템(1)은 NOVA Biomedical Corporation의 ALLEGROTM 분석기이다. 본원에 기재된 바와 같은 카트리지(12)와 함께 사용될 수 있는 예시적인 샘플러 및 카트리지 베이스는 NOVA Biomedical Corporation의 미국 특허 제10,117,615호에 보다 전체적으로 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 편입되어 있다.
변형된 ELISA 카트리지
본 발명의 시스템 및 방법론과 함께 사용될 수 있는 예시적인 카트리지 키트는 자체-포함 단일-사용 일회용 통합된 카트리지(12)를 포함할 수 있고 예컨대 이하에서 도 2-4를 추가로 참조하여 기재될 것이다.
제1 카트리지 구현예는 도 2에 예시되어 있고, 단면도에서 볼 수 없지만, 이는 식별자(13), 예컨대 바코드 (분석기(1)에 대해 카트리지의 특정 유형 (및 이에 따라 ELISA)를 식별할 수 있음)를 갖는다. 이 식별자(13)은 카트리지(12)의 가시가능한 외부 표면에 따라 가시가능할 수 있고, 또한 주요 패키징(19)의 외부 표면에 따라 제공될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 이 패키징(19)는 카트리지(12) 및 적어도 하나의 핑거스틱 란셋(fingerstick lancet)(14) 또는 테스트를 위한 혈액 샘플을 얻기 위해 피부를 절제할 수 있는 다른 유사한 장치를 함유할 수 있다.
대부분 구현예에서, 카트리지(12)는 카트리지(12) 자체의 제거가능한 컴포넌트인 모세관 샘플러(18)을 갖는다. 마찬가지로, 대부분 카트리지(12)는 또한 광학 측정을 용이하게 할 수 있는 측벽과 함께 통합된 큐벳(16g)를 갖는다. 그러나, 또한 패키징(19)가 카트리지 베이스 이외에 제공되는 분리된 별개의 큐벳(16g)를 필요로 하는 카트리지(12)를 함유할 것으로 예상된다. 그럼에도 불구하고, 적어도 이들 카트리지는 본 발명의 방법에 따른 검정의 컴포넌트가 사전 장입된 일련의 웰(16)을 가져야 한다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 샘플러(18)은 모세관 구성요소 (부호 없음)를 갖고, 이는 상응하는 모세관-수용 구멍을 통해 일회용 테스트 카트리지(12)의 커버 확장의 계단형 확장부의 확장부 상부 표면에 삽입되고, 이후 계단형 확장부에 놓여진다. 삽입 및 세팅 과정 동안, 샘플러(18)의 모세관 튜브는 모세관 와이퍼의 정점 단부에 위치한 하부 구멍을 통해 삽입된다. 하부 구멍의 단면적이 모세관 튜브의 단면적보다 더 작기 때문에, 하부 구멍은 모세관 튜브의 외부 표면에 대한 스퀴지(squeegee)와 같은 역할을 하고, 모세관 튜브의 외부 표면 상에 우연하게 배치된 임의의 샘플이 카트리지(12)의 챔버(16b)로 유입되어 그 안에 침착되는 것을 방지한다.
카트리지(12)의 모세관 와이퍼는 모세관 튜브의 외부 표면으로부터 임의의 샘플(7)을 제거한다. 이에 의해 샘플(7)을 가진 테스트 카트리지(12)에서의 적절한 웰(16b)의 "과충전"으로부터 잘못된 결과가 방지된다. 유사하게는, 모세관 튜브가 사용자에 의해 와이핑되지 않기 때문에, 모세관 튜브 내의 임의의 샘플(7)이 우연하게 제거되어, 샘플(7)을 가진 테스트 카트리지(12)의 웰(16b)의 "저충전"으로부터 잘못된 결과를 초래할 수 있는 기회가 없거나 매우 적다.
일체형 카트리지(12)의 제1 웰(16a)에 제공되는 피펫 팁(20)은 도 2에 나타난 바와 같이 외부 표면에 따라 측정 표시를 가진 피펫 팁일 수 있다. 대안적으로, 이러한 팁은 도 3-4에 나타난 바와 같이, 경사지고, 연장되고, 및/또는 눈금이 매겨질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 카트리지(12)의 제1 웰(16)에서의 적어도 하나의 피펫 팁(20)은 내부 벽을 따라 코팅(30)을 가질 것이다. 다양한 유형의 코팅(30) 및 이 코팅을 제공하는 방법은 추가로 하기에 도 12-14를 참조하여 보다 상세하게 논의된다.
사용자 관점으로부터의 방법
사용자 관점의 일반적인 개요는 이하 도 5-11을 참조하여 논의된다. 본원에 나타낸 바와 같이, 초기에, 변형된 ELISA 카트리지 또는 카트리지 키트는 사용자에 의해 선택된다(102). 변형된 ELISA 카트리지를 수동으로 선택한 후(102), 카트리지는 선택된 검정을 식별하기 위해 분석기에 의해 스캐닝될 수 있다(103). 이후, 혈액 샘플를 수득하는 것(104)은 요망되는 혈액 샘플 크기를 제공하도록 간단한 핑거스틱(105)를 수반한다. 혈액 샘플이 이 단계에서 쉽게 수득될 수 있는 것은 정맥 천자 또는 다른 큰 혈액 샘플 크기 수집을 필요로 하는 다른 선행 기술 시스템 및 방법에 비해 본 발명의 시스템의 이점 중 하나를 나타낸다.
생물검정이 초기에 식별되면, 모세관 샘플러는 카트리지로부터 제거되고(106), 혈액 샘플로 충전되고(107), 특정 카트리지에서 대체될 수 있고(108), 모두는 핑거스틱를 수행하는 30초 이내이다(105). 카트리지로 다시 충전된 샘플러를 대체한 후(108), 식별자는 분석기에 의해 스캐닝될 수 있고(103), 분석기에 카트리지가 삽입된다(109). 분석기로 카트리지를 장입한 후, 자동화 공정(110)이 시작된다. 선택된 생물검정에 따라, 자동화 공정은 이후 생물검정 컴포넌트의 특정 순서에 따를 것이고, 첨가(112), 혼합(114), 측정(116), 인큐베이션(117), 보정(118), 및 사용자 또는 다른 지정된 개체로의 결과의 보고(119)의 자동화된 단계를 수반한다.
CRP 항체를 사용한 피펫 팁의 코팅 방법
본 발명의 방법에 따른 피펫 팁(20)을 제조하는 다양한 방법이 도 12-14를 특별하게 참조하여 이하 논의될 것이다. 일반적으로, 피펫 팁(20)을 제조하는 것은 하기 4개의 주요 단계를 수반한다: 항체 용액으로 코팅하는 단계(160), 차단 용액으로 코팅하는 단계(170), 활성 보존제 용액로 코팅하는 단계(175), 및 사용할 준비가 되도록 팁을 건조하는 단계(180). 개시된 부피 범위에도 불구하고, 사용되는 부피는 모세관 팁의 크기와 카트리지(12)의 웰 치수에 따라 달라질 것으로 이해되어야 한다.
도 12는 항체 용액(160)으로 코팅하는 제1 주요 단계의 단계들을 자세하게 보여준다. 일 구현예에 따라, 제1 주요 단계는 항체 스톡, 이 경우 항-CRP를 선택하고(161), 그리고 코팅 버퍼, 이 경우 pH 9.6인 200 mM 카보네이트를 선택(162)함으로써 시작된다. 이는 또한 임의의 유사한 단백질 예컨대 항체, 항체 단편, 재조합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 스트렙타비딘, 또는 재조합 단백질 또는 이의 단편, 핵산, 다당류, 당단백질, 펩티도글리칸, 분자 각인 폴리머 또는 압타머 분자를 사용하여 작업될 것임을 이해하여야 한다. 항체는 바람직한 친화도 제제이고, 이는 ELISA 시스템에서 일반적으로 사용된다. 고정화는 상기 논의된 바와 비특이적 흡착에 의해, 또는 공유 접합에 의해 달성될 수 있다.
유사하게는, 이 방법에서 사용되는 코팅 버퍼가 탄산염/중탄산염 버퍼 시스템 및 수크로오스를 포함하는 한편, 유사한 코팅 버퍼가 또한 사용될 수 있고, 예컨대 인산 완충 식염수 및 버퍼 예컨대 Tris 완충 식염수가 또한 허용가능할 것으로 이해되어야 한다.
그 다음, 선택된 항체 스톡 및 코팅 버퍼을 혼합(163)함으로써 항체 용액 (항-CRP, 5 ug/ml)를 제조하였다. 이 용액을 이후 96 웰 플레이트에 분배하였다(164). 부착된 피펫 팁을 가진 다중채널 피펫을 사용하여 충전(166)까지 선택된 피펫 팁 내로 항체 용액을 흡입하였다. 구체적으로, 항체 용액의 양은 대략 100 회분 - 300 회분이고, 바람직하게는 150 ul 내지 200 ul, 보다 바람직하게는 50 ul - 300 ul의 약 165 회분, 바람직하게는 75 ul 내지 200 ul, 보다 바람직하게는 충전(166)까지 선택된 피펫 팁으로의 항체 용액 약 100ul이다. 이러한 충전된 피펫 팁을 10℃-50℃, 바람직하게는 20℃-30℃, 보다 바람직하게는 실온, 대략, 22℃-25℃에서, 200-2분, 바람직하게는 50-10분, 보다 바람직하게는, 약 30분의 제1 시간 동안 인큐베이션하였다(167). 항체 용액의 층을 이후 피펫 팁의 내부 벽에 부착시켰다. 과량의 용액을 이후 피펫 팁의 외부로 분배하여 폐기하였다. 과량의 용액을 배출한 후, 피펫 팁에 차단 용액으로의 코팅(170), 이후 활성 보존제 용액으로의 코팅(175), 이후 팁의 건조(180)를 추가로 진행시킨다. 차단 용액으로의 코팅(170) 및 활성 보존제 용액으로의 코팅의 단계는 추가로 도 13에 예시되어 있다.
이제 도 13을 참조하면, 도 13은 팁이 그 다음 차단 용액으로 코팅(170)된 것을 볼 수 있는 다음 단계들을 자세히 보여준다. 구체적으로, 차단 버퍼가 우선 선택된다(171). 이 단계에 대해 충분할 것인 차단 버퍼는 0.5% - 5%, 보다 바람직하게는, 1% 소 혈청 알부민, 젤라틴, 건조된 분유를 함유하는 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함할 것이다.
그 다음, 선택된 차단 버퍼는 팁 내로 흡입되고, 이로써 이는 선택된 차단 버퍼, 대략 50 ul 내지 1,000 ul, 바람직하게는 100 ul 내지 400 ul, 보다 바람직하게는 약 200 ul의 선택된 차단 버퍼로 충전된다(172). 충전된 팁은 이후 대략 2 - 30분, 바람직하게는 5 - 20분, 보다 바람직하게는, 약 10분의 제2 기간 동안 인큐베이션된다(173). 이 인큐베이션(173)은 일반적으로 10℃-50℃, 바람직하게는 20℃-30℃, 보다 바람직하게는, 약 22℃-25℃의 실온의 온도에서 수행된다. 차단 버퍼의 층은 이후 항체 용액의 제1 층 위에 위치하고, 과량의 차단 버퍼는 이후 피펫 팁로부터 배출되어 분배된다(174).
그 다음, 활성 보존제의 코팅이 제공된다(175). 구체적으로, 활성 보존제가 우선 선택된다(176). 이 단계에 대해 충분할 것인 활성 보존제는 0.5% - 5%, 보다 바람직하게는, 2% 수크로오스, 트레할로오스, 젤라틴 및 다른 유사한 활성 보존제를 포함할 것이다.
그 다음, 선택된 활성 보존제는 제1 및 제2 층 (즉, 각각 항체 용액의 코팅 및 차단 용액의 코팅)을 미리 갖는 팁 내로 분배된다(177). 그러나, 이 층은 상부 및 하부에 따라 포함되는 이전 층들을 완전하게 피복할 것이고, 이로써 이는 여전히 50 ul 내지 1,000 ul, 바람직하게는 100 ul 내지 400 ul, 보다 바람직하게는 약 110 ul의 선택된 활성 보존제(176)로 충전된다. 이 충전된 팁(177)은 이후 대략 1분의 제3 기간 동안, 10℃-50℃, 바람직하게는 20℃-30℃, 보다 바람직하게는, 대략 약 22℃-25℃의 실온의 온도에서 인큐베이션된다(178). 활성 보존제의 제3 층은 차단 버퍼 및 항체 용액의 제1 및 제2 층 위에 배치되고, 이를 완전하게 피복한다. 인큐베이션 후, 과량의 활성 보존제는 이후 피펫 팁으로부터 배출되어 분배된다(179). 상기 팁은 이후 진공 챔버에서 2 내지 20시간, 바람직하게는 4 내지 10시간, 보다 바람직하게는, 약 8시간 동안 건조되었다(180).
이 과정은 도 14에 시각적으로 일반적으로 나타나 있다. 구체적으로, 피펫 팁(20)의 단면도는 상기 방법에 따라 팁(20)의 제조 과정 동안 나타나 있다. 첫 번째로, 피펫 팁(20)은 피펫 팁(20)의 제1 말단에서의 개구(22)로부터 주요부(26)을 통해 피펫 팁(20)의 제2 말단의 제2 개구(28)까지 연장되는 비어 있는 내부 공동(24)를 갖는 것을 나타낸다. 피펫 팁(20)은 이후 항체 용액(31)로 충전되고 이로써 내부 공동(24)은 실질적으로 충전된다.
과량의 물질이 배출될 때, 항체 용액(31)의 제1 층(34)가 내부 공동(24)의 내부 부분의 표면에 따라 건조되어 유지된다. 내부 공동의 비어 있는 부피는 유지되는 항체 용액(31)의 제1 층(34)의 부피에 의해 감소된다. 그러나, 코팅 버퍼(37)은 보통 항체 용액(31)의 것보다 더 높은 수직 수준까지 첨가된다. 따라서, 코팅 버퍼(37)이 이후 피펫 팁(20)에 첨가될 때, 피펫 팁(20)을 충전하는 것은 여전히 코팅 버퍼 용액(37)의 추가 부피의 유사한 양을 필요로 한다. 과량의 버퍼 물질이 배출된 후, 코팅 버퍼(36)의 층은 내부 공동(24) 내의 항체 용액(34)의 제1 층의 표면와 마주하는 내부에 따라 고정되어 유지된다. 활성 보존제 용액(38)은 보통 코팅 버퍼(36)의 것보다 더 높은 수직 수준까지 첨가된다. 따라서, 활성 보존제 용액(38)은 이후 피펫 팁(20)에 첨가되고, 피펫 팁(20)을 충전하는 것은 여전히 활성 보존제 용액(38)의 추가 부피의 유사한 양을 필요로 한다. 과량의 활성 보존제 용액(38)이 배출된 후, 활성 보존제 물질(39)의 층은 내부 공동(24) 내의 코팅 버퍼(36)의 제2 층의 표면와 마주하는 내부에 따라 고정되어 유지된다. 코팅 버퍼(36), 및/또는 활성 보존제(39)의 추가의 층은 상기 기재된 방법에 따라 유사하게 적용될 수 있다. 예시된 층은 이것일보다 더 두껍고, 이는 단지 설명을 위한 목적으로 나타내고, 피펫 팁의 벽 두께 또는 서로에 대한 각 층의 실제 상대적인 두께를 나타내지 않는 것으로 이해되어야 한다.
시약의 특정 양은 상기 피펫 팁의 제조에 대해 인용되는 것임을 유의한다. 임의의 상응하는 양은 표면적 대 부피의 비율이 1/6 (단위 별도)보다 크기만 하면 충분한 것임의 유의하여야 한다. 여기서 팁의 표면적 = 이고, 팁의 부피 = 이고, 여기서 r = 팁의 큰 반경, l = 팁의 길이이고, h = 팁의 빗변이다. 예를 들어, 3 mm의 반경, 및 10.6 mm의 길이를 가진 팁의 경우, 피펫 팁의 내면에 따른 표면적은 132:100 또는 1.32 대 1의 표면적 대 부피 비율의 경우 100 mm3의 부피에 대해 적어도 132.1 mm2가 된다.
대안적으로, 7.87 mm의 베이스 반경, 및 58.42 mm의 길이를 갖는 팁의 경우, 피펫 팁의 내면에 따른 표면적은 1652 mm2이 되고, 팁은 1652:3789 또는 0.43:1의 표면적 대 부피 비율의 경우 3789 mm3의 부피를 유지할 수 있다. 시약에 팁의 노출된 표면적이 더 클수록, 반응의 증가된 속도가 전체적으로 더 높고, 이는 요구되는 반응 시간을 감소시킬 수 있다. 그러나, 표면적 대 부피 비율은 1보다 클 필요는 없다. 연구들은 표면적 대 부피 비율이 5 내지 1/5, 보다 바람직하게는 1 내지 ¼, 보다 바람직하게는 약 0.43인 것으로 충분하다는 것을 나타내었다.
일반 검정 시약 및 추가적인 컴포넌트
일 구현예에 따른 제1 시약 혼합물은 pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제를 갖는다.
일 구현예에 따른 제2 시약 혼합물은 pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제를 갖는다.
일 구현예에 따른 제3 시약 혼합물은 항체, 접합체 안정화제, 및 음성 제어제를 갖는다.
일 구현예에 따른 제4 시약 혼합물은 발색 기질 또는 시각화 시약 중 적어도 하나를 갖는다.
일 구현예에 따른 제1 시약 혼합물은 pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제를 갖는다.
일 구현예에 따른 제2 시약 혼합물은 pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제를 갖는다.
일 구현예에 따른 제3 시약 혼합물은 항체, 접합체 안정화제, 및 음성 제어제를 갖는다.
일 구현예에 따른 제4 시약 혼합물은 발색 기질 또는 시각화 시약 중 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 pH 안정화제는 10 mM 인산염 버퍼이고, 이는 7.4의 pH를 유지하는 것을 용이하게 한다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 이온성 촉매 제어제는 138 mM NaCl 용액이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 이온성 세포내 억제 제어제는 2.7 mM KCl 용액이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 살생물 보존제는 상표명 ProClinTM 300하에 시판되는 0.03% 살생물 보존제이고, 이는 수용성이고, 무염 독점 글리콜을 함유하는 알킬 카르복실레이트 안정화제 중의 3% CMIT/MIT로 이루어진다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 킬레이트제는 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 세제는 상표명 TritonTM X-100(TX100)하에 시판되는 0.1% 세제이고, 이는 단백질 및 다른 세포 소기관을 추출하기 위해 또는 형질감염을 위해 살아있는 세포막을 투과성화하기 위해 세포를 용해하기 위한 가장 널리 사용되는 비이온성 계면활성제 중 하나이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 유화제는 상표명 Tween® 20TM 하에 시판되는 0.05%의 유화제 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트)이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 음성 제어제는 테네시주 소재의 Meridian Life Science, Inc.로부터 이용가능한 마우스 IgG이고, 이는 통상적으로 75%의 혈청 면역글로불린으로 구성되고, 합성되고 형질 B 세포에 의해 분비된다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 항체는 항 CRP-항체-HRP (250 ng/mL), C-반응성 단백질 (CRP) 일차 항체 (호스래디시 페록시다아제 (HRP)가 접합됨)이다.
CRP는 시클릭 펜타머 구조를 특징으로 하는 단백질의 펜트락신 부류의 구성원이다. 인간 CRP 유전자는 224개의 아미노산 전구체를 코딩한다. 성숙한 인간 CRP 단백질은 비공유결합되어 펜타머를 형성하는 206개의 아미노산을 갖는다. 인간 CRP는 마우스 및 래트와 각각 71% 및 64% 아미노산 서열 상동성을 공유한다.
간세포에 의해 합성되는 CRP는 인간에서 주요 급성기 혈청 단백질이다. IL-6, IL-1 및 글루코코르티코이드는 CRP 유전자의 주요 유도제이다. 감염, 염증 또는 조직 손상에 대한 반응에서, 인간 혈청에서의 CRP의 수준은 24-48시간 이내에 1,000배 증가할 수 있다. 이는 매우 빠르게 1 μg/mL 미만의 기본 수준으로 다시 돌아갈 것이다. 인간 CRP는 숙주 선천적 숙주 방어에서 제1선 역할을 하는 급성기 혈청 단백질이다. 다른 펜트락신과 유사하게, CRP는 리간드에 대한 Ca++ - 의존적 결합을 나타낸다. 다수의 박테리아 및 진균 벽의 구성 성분인 포스포콜린 (PCh)은 CRP의 주요 리간드이다.
CRP는 또한 괴사 및 사멸 세포의 손상된 세포, 막 및 핵 성분에 결합된다. 리간드와의 결합시, CRP는 C1q에 의해 인식되고, 보체 연쇄반응의 활성화를 개시한다. 리간드 결합 CRP는 또한 식세포 상의 Fc 감마 RI 및 Fc 감마 RIIa에 결합하고 식세포 반응을 활성화시킨다. 식세포작용 이외에, CRP는 또한 단핵구에 의한 과산화수소 및 염증성 사이토카인, 예컨대 IL-1, IL-6 및 TNF-알파의 생성을 유도할 수 있다. 이러한 기능으로, 인간 CRP는 항-박테리아 병원균 및 손상된 및 사멸된 세포의 제거를 위해 중요한 혈청 단백질이다. 그러나, 마우스에서, CRP는 매우 낮은 수준으로 발현되고, 급성기 반응물이 아니다. 다른 펜트락신인 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)은 마우스에서의 주요 급성기 혈청 단백질이다. 인간에서의 높은 수준의 CRP는 심혈관 질환의 증가된 위험과 관련되는 것을 나타내었다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 접합체 안정화제는 상표명 StabilZymeTM 하에 시판되는 접합체 안정화제이고, 이는 면역검정에서 일반적으로 사용되는 항체/항원 접합체, 항체 코팅된 입자 및 변형되지 않은 단백질의 형태를 유지하도록 설계된 다목적 HRP 접합체 안정화 용액이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 발색 기질 또는 시각화 시약은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)이다.
기포저지제/소포제(antifoaming/defoaming agent)가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 제제의 예는 상표명 Foam AwayTM 하에 시판되고 ThermoFisher Scientific로부터 이용가능하다.
실시예 - 도 15에 예시된 CRP 결과
검정 카트리지 및 큐벳 제조는 포집 항-CRP 항체를 사용한 상기 방법에 따른 피펫 팁의 제조를 포함하였다. 구체적으로, 피펫 팁(20)의 제조(150) 동안, 포집 항-CRP 항체는 그렇지 않으면 300 ul 부피의 용액을 보유할 수 있는 피펫 팁(20)의 내부에 결합되었다.
나타낸 웰에 하기 양을 분배함으로써 상기 방법에 따라 카트리지를 제조하였다:
카트리지의 제조 후, 혈액 샘플을 모세관 샘플러(18)을 통해 상기 기재된 방법에 따라 수득하였다(104). 분석기가 선택된 생물검정을 식별한 후, 카트리지를 분석기에 장입하고, 자동화 공정(110)이 시작된다. 구체적으로, 분석기는 피펫 아암(pipette arm)을 이용하고, 중력을 발현시켜 명시된 자동화 공정(110)에 따라 시약 또는 혈액 샘플을 이송시킨다(112).
이 생물검정에서, 자동화 단계는 첨가(112), 혼합(114), 측정(116), 인큐베이션(117), 보정(118), 및 사용자 또는 다른 지정된 개체로의 결과의 보고(119)를 포함한다. 상기 검정은 290 ul의 제1 시약 양을 제3 웰(16c)로부터 제2 웰(16b)로 이송함으로써 시작되었다.
그 다음, 5 ul의 혈액 샘플을 모세관 샘플러(18)로부터 제2 웰(16b)로 추출하였다. 제1 웰(16a)로부터의 항체를 갖는 피펫 팁을 이후 사용하여 제2 웰로부터 100 ul의 샘플을 흡입하였다. 이 샘플을 이후 60초 동안 피펫 팁 내에 보유하였고 (117) 이후 용해된 혈액 샘플을 이후 다시 제2 웰(16b) 안으로 폐기하였다.
제1 세척을 이후 수행하였고, 이에서 제6 웰(16f)로부터의 130 ul의 제4 시약을 이후 흡입하였고, 이후 다시 폐기하였다. 제2 세척을 이후 제4 웰(16d)로부터의 55 ul의 제2 시약으로 수행하였고 그 다음 75 uL 에어 갭(air gap)을 후속하였다. 이를 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 이는 제3 세척으로 반복되었다.
그 다음, 제5 웰(16e)로부터의 100 ul의 제3 시약을 혼합(114)하고 흡입하고, 4분 동안 정치(117)시킴으로써 항 CRP-HRP로 분석물 표지화를 수행하였다. 이를 이후 제5 웰(16e)에 다시 폐기하였다.
피펫 팁의 4회 추가 세척을 이후 수행하였다. 제4 세척에서, 130 ul의 제1 시약을 흡입하고(114), 이후 제3 웰(16c)에 다시 폐기하였다. 제5 세척에서, 65 ul의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하고(114) 이후 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제6 세척에서, 65 ul의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하고(114) 이후 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제7 세척에서, 130 ul의 제3 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였다 (114). 이를 이후 제4 웰(16d)에 폐기하였다. 그 다음, 100 ul의 제5 시약을 큐벳(16g)로부터 흡입하고(114), 2분 동안 정치시키고(117), 그리고 이후 큐벳(16g)에 다시 폐기하였고, 혼합하였다(114). 샘플을 이후 본원의 임의의 곳에 기재된 바와 같이 660 nm에서 판독하였다(116).
이 과정을 CRP의 6개의 상이한 농도에 대해 반복하였다. 데이터는 하기 표에 나타낸다:
앞서 언급한 바와 같이, 이 데이터는 또한 도 15에 시각적으로 예시되어 있다.
실시예 - 도 16에 예시된 시스타틴 결과
검정 카트리지 및 큐벳 제조는 포집 항-시스타틴 C 항체를 사용한 상기 방법에 따른 피펫 팁의 제조를 포함하였다. 구체적으로, 피펫 팁(20)의 제조(150) 동안, 포집 항-시스타틴 C 항체는 그렇지 않으면 300 ul 부피의 용액을 보유할 수 있는 피펫 팁(20)의 내부에 결합되었다.
나타낸 웰에 하기 양을 분배함으로써 상기 방법에 따라 카트리지를 제조하였다:
카트리지의 제조 후, 상이한 농도의 시스타틴을 갖는 샘플을 모세관 샘플러(18)을 통해 수득하였다(104). 분석기가 선택된 생물검정을 식별한 후, 카트리지를 분석기에 장입하고, 자동화 공정(110)이 시작된다. 구체적으로, 분석기는 피펫 아암을 이용하고, 중력을 발현시켜 명시된 자동화 공정(110)에 따라 시약 또는 혈액 샘플을 이송시킨다(112).
이 생물검정에서, 자동화 단계는 첨가(112), 혼합(114), 측정(116), 인큐베이션(117), 보정(118), 및 사용자 또는 다른 지정된 개체로의 결과의 보고(119)를 포함한다. 상기 검정은 290 ul의 제1 시약 양을 제3 웰(16c)로부터 제2 웰(16b)로 이송함으로써 시작되었다.
그 다음, 5 ul의 샘플을 모세관 샘플러(18)로부터 제2 웰(16b)로 추출하였다. 제1 웰(16a)로부터의 항체를 갖는 피펫 팁을 이후 사용하여 제2 웰(16b)로부터의 75 ul의 희석된 혈액 샘플을 제6 웰(16f)로 흡입하였다. 그 다음, 제5 웰(16e)로부터의 75 ul의 제3 시약을 이후 또한 제5 웰(16e)로부터 제6 웰(16f)로 이동시켰다.
이후, 시약 혼합물을 혼합(114)함으로써 분석물 표지화를 수행하였고, 상하로 3회 피펫팅함으로써 제6 웰(16f)에서 샘플을 희석시켰다. 이후, 100 ul의 이 샘플 혼합물을 이후 피펫 팁으로 흡입하고, 60초 동안 인큐베이션하고(117) 이후 용해된 혈액 샘플 혼합물을 이후 다시 제6 웰(16f)에 폐기하였다.
피펫 팁의 4회 세척을 이후 수행하였다. 제1 세척에서, 50 ul의 제1 시약을 흡입하였고(114) 이후 제3 웰(16c)에 다시 폐기하였다. 제2 세척에서, 110 ul의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 이후 20 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제3 세척에서, 110 ul의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 이후 20 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제4 세척에서, 110 ul의 제3 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였다(114). 이를 이후 제2 웰(16b)에 폐기하였다.
그 다음, 100 ul의 제4 시약을 이후 큐벳(16g)로부터 흡입하고(114), 2분 동안 정치시키고(117), 그리고 이후 큐벳(16g)에 다시 폐기하고, 혼합하였다(114). 샘플을 이후 본원의 임의의 곳에 기재된 바와 같이 660 nm에서 판독하였다(116).
이 과정을 알려진 시스타틴 농도 중 7개의 상이한 농도에 대해 반복하였다. 데이터는 하기 표에 나타낸다:
앞서 언급한 바와 같이, 이 데이터는 또한 도 16에 시각적으로 예시되어 있다.
실시예 - 도 17에 예시된 ALT 결과
검정 카트리지 및 큐벳 제조는 이 시점에 코팅이 항-알라닌 아미노전이효소 (항-ALT) 항체를 사용하여 실시된 것을 제외하고 상기 방법에 따른 피펫 팁의 제조를 포함하였다. 구체적으로, 피펫 팁(20)의 제조(150) 동안, 포집 항-ALT 항체는 그렇지 않으면 300 ul 부피의 용액을 보유할 수 있는 피펫 팁(20)의 내부에 결합되었다.
나타낸 웰에 하기 양을 분배함으로써 상기 방법에 따라 카트리지를 제조하였다:
카트리지의 제조 후, 상이한 농도의 ALT를 갖는 샘플을 모세관 샘플러(18)을 통해 얻었다(104). 분석기가 선택된 생물검정을 식별한 후, 카트리지를 분석기에 장입하고, 자동화 공정(110)이 시작된다. 구체적으로, 분석기는 피펫 아암을 이용하고, 중력을 발현시켜 명시된 자동화 공정(110)에 따라 시약 또는 혈액 샘플을 이송시킨다(112).
이 예시적인 생물검정에서, 자동화 단계는 첨가(112), 혼합(114), 측정(116), 인큐베이션(117), 보정(118), 및 이후 사용자 또는 다른 지정된 개체로의 결과의 보고(119)를 포함한다. 상기 검정은 290 ul의 제1 시약 양을 제3 웰(16c)로부터 제2 웰(16b)로 이송함으로써 시작되었다.
그 다음, 5 ul의 샘플을 모세관 샘플러(18)로부터 제2 웰(16b)로 추출하였다(112). 제1 웰(16a)로부터의 항체를 갖는 피펫 팁을 이후 사용하여 제2 웰(16b)로부터 100 ul의 용해된 혈액 샘플을 흡입하였다. 이 샘플을 이후 10분 동안 피펫 팁 내에서 정치시켰고(117) 이후 용해된 혈액 샘플을 이후 다시 제2 웰(16b)에 폐기하였다.
제1 세척을 이후 수행하였고 이에서 제3 웰(16c)로부터의 130 ul의 제4 시약을 이후 흡입하였고, 이후 다시 폐기하였다. 제2 세척을 이후 제4 웰(16d)로부터의 55 ul의 제2 시약으로 수행하였고, 이후 75 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 이를 제3 세척으로 반복하였다.
그 다음, 제5 웰(16e)로부터의 100 ul의 제3 시약을 혼합(114)하고 흡입하고, 4분 동안 정치(117)시킴으로써 분석물 표지화를 수행하였다. 이를 이후 제5 웰(16e)에 다시 폐기하였다.
피펫 팁의 4회 세척을 이후 수행하였다. 제4 세척에서, 130 ul의 제1 시약을 제3 웰(16c)로부터 흡입하였고(114) 이후 제3 웰(16c)에 다시 폐기하였다. 제5 세척에서, 65 ul의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 이후 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제6 세척에서, 65 ul의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 이후 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제7 세척에서, 130 ul의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였다(114). 이를 이후 또 한번 다시 제4 웰(16d)에 폐기하였다. 그 다음, 100 ul의 제5 시약을 이후 큐벳(16g)로부터 흡입하고(114), 10분 동안 정치시키고(117), 이후 다시 큐벳(16g)에 폐기하고 혼합하였다(114). 샘플을 이후 본원의 임의의 곳에 기재된 바와 같이 660 nm에서 판독하였다(116).
이 과정을 알라닌 아미노전이효소 농도 중 3개의 상이한 농도에 대해 반복하였다. 데이터는 하기 표에 나타낸다:
실시예 - 도 18에 예시된 - 전처리 & 추가적인 2차 선택적 전처리에 대한 AST 결과
도 18에서, 본 방법과 비교되는 2차 선택적 전처리에 따른 추가의 이익을 예시하는 결과는 아스파테이트 아미노전이효소 (AST) 항체에 대한 추가적인 플라즈마 처리된 팁 및 본 발명으로 처리된 팁의 분석을 비교함으로써 나타내었다. 본원에 논의된 일반적인 본 발명의 방법에 따른 항체 코팅 전의 플라즈마 챔버에서의 피펫 팁의 추가적인 전처리는 제조사에 의해 제공된 바와 같이 사용되는 피펫 팁과 비교하여 전처리된 피펫 팁에 대한 개선된 항체 결합을 생성할 수 있다. 이러한 증가된 항체 결합은 이후 증가된 검정 신호에 반영된다. 검정 카트리지 및 큐벳 제조는 상기 논의된 바와 같이 변형된 방법에 따른 피펫 팁의 제조를 포함하였다. 이 코팅 과정은 추가적인 절차가 이후 추가적인 선택적 전처리 (플라즈마 처리로 지칭됨)를 포함하는 것을 제외하고 상기 기재된 것과 실질적으로 유사하였다. 코팅 처리 및 추가적인 플라즈마 코팅 처리 둘 모두의 하기 설명을 포집 항-아스파테이트 아미노전이효소 (항-AST) 항체를 사용하여 수행하였다.
구체적으로, 피펫 팁(20)의 제조(150) 동안, 포집 항-AST 항체는 그렇지 않으면 300 ul 부피의 용액을 보유할 수 있는 피펫 팁(20)의 내부에 결합되었다. 초기에, KPL 버퍼 중의 5 ug/mL 포집 AB를 갖는 100 uL의 항체 용액을 흡입하였고 2시간 동안 정치시켰다. 측벽에 결합하지 않은 부분을 이후 폐기하였다. 그 다음, 200 uL의 10 mM PBS 및 0.05% Tw-20을 피펫 팁으로 흡입하였고, 이의 일부는 피펫 팁의 측벽에 결합되었다. 측벽에 결합하지 않은 부분을 이후 폐기하였다. 마지막으로, 200 uL의 10 mM PBS, 0.05% Tw-20, 0.1% BSA를 피펫 팁으로 흡입하였고, 5분 동안 인큐베이션하여 피펫 팁의 측벽에 따라 제3 층을 형성하였다. 측벽에 결합하지 않은 부분을 이후 폐기하였다.
나타낸 웰에 하기 양을 분배함으로써 상기 방법에 따라 카트리지를 제조하였다:
카트리지의 제조 후, 테스트 샘플을 수득하였고(104) 모세관 샘플러(18) 내에 배치하였다. 분석기가 선택된 생물검정을 식별한 후, 카트리지를 분석기에 장입하고, 자동화 공정(110)이 시작된다. 구체적으로, 분석기는 피펫 아암을 이용하고, 중력을 발현시켜 명시된 자동화 공정(110)에 따라 시약 또는 혈액 샘플을 이송시킨다(112).
이 예시적인 생물검정에서, 자동화 단계는 첨가(112), 혼합(114), 측정(116), 인큐베이션(117), 보정(118), 및 이후 사용자 또는 다른 지정된 개체로의 결과의 보고(119)를 포함한다. 상기 검정은 290 ul의 제1 시약 양을 제3 웰(16c)로부터 제2 웰(16b)로 이송함으로써 시작되었다.
그 다음, 8 ul의 AST 칼리브레이터(calibrator)가 모세관 샘플러(18)로부터 제2 웰(16a)로 추출되었다(112). 제1 웰(16a)로부터의 항체를 가진 피펫 팁을 이후 사용하여 제2 웰로부터 100 ul의 샘플을 흡입하였다. 이 샘플을 이후 10분 동안 피펫 팁 내에서 정치시켰고(117) 그 이후 샘플을 이후 다시 제2 웰(16b)에 폐기하였다.
제1 세척을 이후 수행하였고, 이에서 제6 웰(16f)로부터의 130 uL의 제4 시약을 이후 흡입하였고, 이후 또 다시 폐기하였다. 제2 세척을 이후 제4 웰(16d)로부터의 55 ul의 제2 시약으로 수행하였고 이후 75 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 이를 제3 세척으로 반복하였다.
그 다음, 제5 웰(16e)로부터의 100 uL의 제3 시약을 흡입하고 10분 동안 정치(117)시킴으로써 분석물 표지화를 수행하였다. 이를 이후 다시 제5 웰(16e)에 폐기하였다.
피펫 팁의 4회 추가적인 세척을 이후 수행하였다. 제4 세척에서, 130 uL의 제1 시약을 제3 웰(16c)로부터 흡입하였고(114) 이후 제3 웰(16c)에 다시 폐기하였다. 제5 세척에서, 65 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 이후 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제6 세척에서, 65 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제7 세척에서, 130 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 다시 흡입하였다(114). 이를 이후 다시 한번 제4 웰(16d)에 폐기하였다. 그 다음, 100 ul의 제5 시약을 이후 큐벳(16g)로부터 흡입하였고(114), 10분 동안 정치시켰고(117), 이후 큐벳(16g)에 다시 폐기하고 혼합하였다(114). 샘플을 이후 본원의 임의의 곳에 기재된 바와 같이 660 nm에서 판독하였다(116).
이 절차를 플라즈마-처리된 팁 및 처리된 팁 각각에 대해 AST의 8개의 상이한 농도에 대해 반복하였다. 데이터는 하기 표에 나타낸다:
실시예 - 도 19에 예시된 hs-CRP 결과
검정 카트리지 및 큐벳 제조는 포집 항-CRP 항체를 사용하는 상기 방법에 따른 피펫 팁의 제조를 포함하였다. 구체적으로, 피펫 팁(20)의 제조(150) 동안, 포집 항-CRP 항체는 그렇지 않으면 300 ul 부피의 용액을 보유할 수 있는 피펫 팁(20)의 내부에 결합되었다.
나타낸 웰에 하기 양을 분배함으로써 상기 방법에 따라 카트리지를 제조하였다:
카트리지의 제조 후, 테스트 샘플을 수득하였고(104) 모세관 샘플러(18) 내에 배치하였다. 분석기가 선택된 생물검정을 식별한 후, 카트리지를 분석기에 장입하고, 자동화 공정(110)이 시작된다. 구체적으로, 분석기는 피펫 아암을 이용하고, 중력을 발현시켜 명시된 자동화 공정(110)에 따라 시약 또는 혈액 샘플을 이송시킨다(112).
이 예시적인 생물검정에서, 자동화 단계는 첨가(112), 혼합(114), 측정(116), 인큐베이션(117), 보정(118), 및 이후 사용자 또는 다른 지정된 개체로의 결과의 보고(119)를 포함한다. 상기 검정은 290 ul의 제1 시약 양을 제3 웰(16c)로부터 제2 웰(16b)로 이송함으로써 시작되었다.
그 다음, 고도로 민감성인 C-반응성 단백질 (hs-CRP)을 가진 5ul의 샘플을 모세관 샘플러(18)로부터 제2 웰(16b)로 추출하였다(112). 제1 웰(16a)로부터의 항체를 갖는 피펫 팁을 이후 사용하여 제2 웰(16b)로부터 100 uL의 샘플을 흡입하였다. 이 샘플을 이후 피펫 팁 내에서 정치시켰고(117) 이후 다시 제2 웰(16b)에 폐기하였다.
제1 세척을 이후 수행하였고, 이에서 제6 웰(16f)로부터의 130 uL의 제4 시약을 이후 흡입하였고, 이후 또 다시 폐기하였다. 제2 세척을 이후 제4 웰(16d)로부터의 55 ul의 제2 시약으로 수행하였고 이후 75 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 이를 제3 세척으로 반복하였다.
그 다음, 제5 웰(16e)로부터의 100 uL의 제3 시약을 흡입하고 3분 동안 정치(117)시킴으로써 분석물 표지화를 수행하였다. 이를 이후 다시 제5 웰(16e)에 폐기하였다.
피펫 팁의 4회 추가적인 세척을 이후 수행하였다. 제4 세척에서, 130 uL의 제1 시약을 제3 웰(16c)로부터 흡입하였고(114) 이후 제3 웰(16c)에 다시 폐기하였다. 제5 세척에서, 65 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 이후 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제6 세척에서, 65 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제7 세척에서, 130 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 다시 흡입하였다(114). 이를 이후 다시 한번 제4 웰(16d)에 폐기하였다. 그 다음, 100 ul의 제5 시약을 이후 큐벳(16g)로부터 흡입하였고(114), 2분 동안 정치시켰고(117), 이후 큐벳(16g)으로 다시 이송시키고 혼합하였다(114). 샘플을 이후 본원의 임의의 곳에 기재된 바와 같이 660 nm에서 판독하였다(116).
이 과정을 hs-CRP의 6개의 상이한 농도에 대해 반복하였다. 데이터는 하기 표에 나타낸다:
이 데이터는 도 19에 시각적으로 예시되어 있다.
실시예 - 도 20에서 예시된 IGF-1 결과
검정 카트리지 및 큐벳 제조는 상기 논의된 바와 같이 변형된 방법에 따른 피펫 팁의 제조를 포함하였다. 이 코팅 과정은 상기 과정이 이후 포집 항 인슐린-유사 성장 인자 1 (항-IGF-1) 항체를 사용하여 수행한 것을 제외하고 상기 기재된 것과 실질적으로 유사하였다.
구체적으로, 피펫 팁(20)의 제조(150) 과정에서, 포집 항-IGF-1 항체는 그렇지 않으면 300 ul 부피의 용액을 보유할 수 있는 피펫 팁(20)의 내부에 결합되었다. 초기에, KPL 버퍼 중의 5 ug/mL 포집 항체를 갖는 100 uL의 항체 용액을 흡입하였고 30분 동안 정치시켰다. 측벽에 결합하지 않은 부분을 이후 폐기하였다. 그 다음, 200 uL의 10 mM PBS 및 0.05% Tw-20을 피펫 팁으로 흡입하였고, 이의 일부는 피펫 팁의 측벽에 결합되었다. 측벽에 결합하지 않은 부분을 이후 폐기하였다. 마지막으로, 200 uL의 10 mM PBS, 0.05% Tw-20, 0.1% BSA를 피펫 팁으로 흡입하였고, 10분 동안 인큐베이션하여 피펫 팁의 측벽에 따라 제3 층을 형성하였다. 측벽에 결합하지 않은 부분을 이후 폐기하였다.
나타낸 웰에 하기 양을 분배함으로써 상기 방법에 따라 카트리지를 제조하였다:
카트리지의 제조 후, 테스트 샘플을 수득하였고(104) 모세관 샘플러(18) 내에 배치하였다. 분석기가 선택된 생물검정을 식별한 후, 카트리지를 분석기에 장입하고, 자동화 공정(110)이 시작된다. 구체적으로, 분석기는 피펫 아암을 이용하고, 중력을 발현시켜 명시된 자동화 공정(110)에 따라 시약 또는 혈액 샘플을 이송시킨다(112).
이 예시적인 생물검정에서, 자동화 단계는 첨가(112), 혼합(114), 측정(116), 인큐베이션(117), 보정(118), 및 이후 사용자 또는 다른 지정된 개체로의 결과의 보고(119)를 포함한다. 이 일련의 검정은 150 ul의 제1 시약 양을 제3 웰(16c)로부터 제2 웰(16b)로 이송함으로써 시작되었다.
그 다음, IGF-1을 가진 8 ul의 샘플을 모세관 샘플러(18)로부터 제2 웰(16a)로 추출되었다(112). 제1 웰(16a)로부터의 항체를 가진 피펫 팁을 이후 사용하여 제2 웰(16b)로부터 100 uL의 샘플을 흡입하였다. 이 샘플을 이후 5분 동안 피펫 팁 내에서 정치시켰고(117) 그 이후 샘플을 이후 다시 제2 웰(16b)에 폐기하였다.
제1 세척을 이후 수행하였고, 이에서 제6 웰(16f)로부터의 130 uL의 제4 시약을 이후 흡입하였고, 이후 또 다시 폐기하였다. 제2 세척을 이후 제4 웰(16d)로부터의 55 uL의 제2 시약으로 수행하였고 이후 75 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 이를 제3 세척으로 반복하였다.
그 다음, 제5 웰(16e)로부터의 100 uL의 제3 시약을 흡입하고 5분 동안 정치(117)시킴으로써 분석물 표지화를 수행하였다. 이를 이후 다시 제5 웰(16e)에 폐기하였다.
피펫 팁의 4회 추가적인 세척을 이후 수행하였다. 제4 세척에서, 130 uL의 제1 시약을 제3 웰(16c)로부터 흡입하였고(114) 이후 제3 웰(16c)에 다시 폐기하였다. 제5 세척에서, 65 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 이후 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제6 세척에서, 65 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 흡입하였고(114) 65 uL 에어 갭을 후속하였다. 이를 또한 이후 제3 웰(16c)에 폐기하였다. 제7 세척에서, 130 uL의 제2 시약을 제4 웰(16d)로부터 다시 흡입하였다(114). 이를 이후 다시 한번 제4 웰(16d)에 폐기하였다. 그 다음, 100 ul의 제5 시약을 이후 큐벳(16g)로부터 흡입하였고, 5분 동안 정치시켰고(117), 이후 큐벳(16g)에 다시 이송하였고 혼합하였다(114). 샘플을 이후 본원의 임의의 곳에 기재된 바와 같이 660 nm에서 판독하였다(116).
이 과정을 IGF-1의 6개의 상이한 농도에 대해 반복하였다. 데이터는 하기 표에 나타낸다:
이 데이터는 도 20에 시각적으로 예시되어 있다.
헤모글로빈 수준에 대한 보정 방법 - 도 21 & 22
본 발명은 광학 검출 관련 ELISA 절차에 대한 실험실 오류의 여러 원인을 해결하는 것을 추구한다. 샘플 내의 혈전 형성은 광 흡수 판독에 영향을 미칠 수 있고, 혈전 형성은 시간 경과에 따라 달라지고, 광학 검출 관련 ELISA 절차에 대한 실험실 오류의 가장 큰 원인 중 하나는 샘플링과 측정 사이의 시간 경과에 기인한다.
본 발명의 원칙 중 하나는 샘플 수거와 검출(측정) 사이의 시간의 경과로 인해 발생될 수 있는 증가된 수의 오류를 해결하기 위한 선행 기술의 실패를 해결하기 위한 것이다. 포괄적인 카트리지에의 검정 컴포넌트의 사전-패키징 및 검정 방법론에 대한 사전-선택된 컴포넌트를 제공함으로써, 본 발명은 사전-검출 단계를 촉진한다.
본 발명이 이 목표를 달성하는 또 다른 방법은 테스트 전에 혈장에서 적혈구를 분리할 필요 없이 전혈 샘플을 사용함으로써 정확한 결과를 달성할 수 있는 생물검정을 제공하는 것에 의한 것이다. 현재 이용가능한 현장 관리 분석기는 샘플로서 혈장의 사용을 필요로 한다. 이는 테스트 결과를 얻기 전에 혈액 샘플의 혈장에서 적혈구를 분리할 것이 요구되며, 샘플 수거와 테스트 사이의 기간을 더 연장한다.
현재의 분석기가 혈장을 필요로 하는 이유 중 하나는 선행 기술의 자동화 시스템 및 자가-교정 분석을 제공하기 위한 검정의 불능으로 인한 것으로 밝혀졌다. 혈액 샘플에서의 헤모글로빈의 수준은 샘플의 광학 밀도에 영향을 미칠 것이다. 본 발명자들은 개인 헤모글로빈 양의 변화를 설명하기 위해 광학 밀도의 신호 출력을 조정하지 못하면 CRP 수준을 정확하게 식별하는 데 오류가 발생할 수 있음을 발견하였다.
선행 기술의 오류를 해결하기 위해, 이러한 오류의 잠재적인 원인과 관련하여, 본 발명은 헤모글로빈에 대한 자동-보정이 있는 변형된 ELISA 생물검정 방법을 제공한다. 전혈을 사용하는 기재된 검정 구현예의 경우, 샘플의 광학 밀도는 가시 파장에서 측정된다. 순차적으로, 헤모글로빈 수준은 다른 가시 파장에서 샘플 광학 밀도를 측정함으로써 결정된다. CRP 수준은 이후 샘플의 조정된 실제 혈장 값에 대한 헤모글로빈 측정을 사용하여 보정된다.
이러한 방식으로, 본 발명은 하기 다른 목적을 충족한다: 개인 환자의 혈장 부피의 변화를 설명하기 위한 선행 기술 방법의 실패를 해결함. 통계적으로, 환자의 혈액 샘플의 혈장의 양과 검출된 헤모글로빈의 양 사이의 직접적인 보정이 존재한다. 건강한, 통상적인 인간의 혈액은 임의의 곳에 12-17 g/dL의 헤모글로빈을 함유할 수 있다. 세계 보건 기구는 빈혈이 없는 개체의 검출된 헤모글로빈 수준은 연령, 고도(altitude), 및 성별에 따라 변화될 수 있다:
6개월 내지 4년: 11 g/dL이나 또는 그 초과
5-12년: 11.5 g/dL이나 또는 그 초과
12-15년: 12 g/dL이나 또는 그 초과
성인 남성: 13.0 g/dL 내지 17.2 g/dL이나 또는 그 초과
성인 여성: 12.1 내지 15.1 g/dL이나 또는 그 초과
임신중: 11g/dL이나 또는 그 초과
그러나, 특정 환자에 대한 헤모글로빈 양의 변화는 예를 들어 빈혈을 가진 환자에서 8-12g/dL에 있거나, 또는 예를 들어 흡연하거나, 더 높은 고도에 살거나, 적혈구 세포 생성을 자극하는 에리트로포이에틴과 같은 호르몬 또는 약물을 복용하는 환자에서 15.0g/dL 내지 19g/dL에 있는 것으로 기록되었다. 더 높은 HGB 수준은 전혈 샘플의 더 높은 백분율의 부피가 적혈구에 의해 점유되는 것을 나타낸다. 더 낮은 HGB 수준은 전혈 샘플의 더 낮은 백분율의 부피가 적혈구에 의해 점유되는 것을 나타낸다.
앞서 나타난 바와 같이, 검출되는 분석물은 환자의 혈장 내에서 운반된다. 이후 실질적으로 말하면, 분석물 농도를 결정하기 위해 광학 검출을 사용할 때 (샘플 크기에 상대적인) 더 높은 HGB 수준은 분석에 이용가능한 혈장의 부피가 (샘플 크기에 상대적으로) 더 작다는 것을 의미한다. 혈장 수준의 변화를 설명하는 데 실패한 선행 기술 방법에서, 이는 환자 내에 실제로 존재하는 것보다 더 낮은 값을 기록한 결과를 초래한다.
대안적으로, (샘플 크기에 상대적인) 정상보다 더 낮은 HGB 수준은 분석에 이용가능한 (샘플 크기에 상대적인) 더 큰 부피의 혈장이 존재하는 것을 나타낸다. 혈장 수준의 변화를 설명하는 데 실패한 선행 기술 방법에서, 이는 환자 내에 실제로 존재하는 것보다 더 높은 분석물 값을 기록한 결과를 초래하였다.
본 발명의 방법은 복수의 파장에서 예컨대 비제한적으로 발광 다이오드(LED)와 같은 다중 신호 측정 장치를 포함하는 기기 용량의 확장을 용이하게 한다. 검정을 판독하는 혼합물의 광학 밀도를 측정하는 것은 바람직하게는 620 nm 내지 700nm, 보다 바람직하게는 650 내지 680 nm, 보다 더 바람직하게는 658 nm 내지 668 nm의 범위, 가장 바람직하게는 660 nm의 가시 파장에서 수행된다. 헤모글로빈 수준을 판독하는 샘플의 광학 밀도를 측정하는 것은 바람직하게는 500 nm 내지 550 nm, 보다 바람직하게는 510 nm 내지 545 nm, 보다 더 바람직하게는 520 nm 내지 540 nm, 가장 바람직하게는 530 nm의 가시 파장에서 수행된다.
검출된 CRP 상에 대한 다양한 수준의 헤모글로빈의 효과 (헤마토크리트 효과)를 예시하기 위해 시험을 수행하였고, 결과는 도 21 및 22에 그래프로 예시된다. 본원에 나타난 바와 같이, 헤모글로빈은 0 내지 23 g/dL의 범위이다. 헤모글로빈이 증가됨에 따라, 선행 기술 방법의 계산된 CRP가 감소되었다. 가시 범위에서의 추가의 LED로, 본 발명의 방법에 의해 결정된 CRP 수준은 검출된 헤모글로빈에 대해 보정될 수 있다. 구체적으로, 도 22는 헤모글로빈에 대한 보정된 CRP를 보여준다.
하기 표는 샘플 ID, 헤모글로빈 수준, 및 보정 전의 CRP 값을 식별하는 도 21에 그래프로 예시된 데이터를 나타낸다:
하기에 따라, 이 표는 샘플 ID, 헤모글로빈 수준, 및 보정 후의 CRP 값을 식별하는 도 22에 그래프로 예시된 데이터를 나타낸다:
이러한 방식으로, 본 발명자들은 개인 헤모글로빈 양의 변화를 설명하기 위해 광학 밀도의 신호 출력을 조정하여 정확하게 식별한 CRP 값의 오류를 제거하였다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 사용자에 보정된 CRP 수준을 제공하기 전에 모든 결과를 14 g/dL의 HGB 농도로 정규화한다.
결론
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 기재되어 있지만, 상기 설명은 단지 예시적인 것이다. 본원에 개시된 본 발명의 추가의 수정은 각 분야의 당업자에게 일어날 것이며, 모든 이러한 수정은 첨부된 청구항에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

Claims (18)

  1. 단일 환자에 대해 효소-결합 면역흡착 검정을 수행하기 위한 일회용 생물검정 진단 카트리지로서, 여기서 카트리지는 복수의 웰을 갖고, 카트리지는
    복수의 웰 중 하나의 웰에 배치된 내부 측벽을 갖는 피펫 팁으로서, 내부 측벽은 전처리되고 항체로 코팅된 것인 피펫 팁;
    복수의 웰 중 다른 웰에 배치된 시약 혼합물로서, pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제, 항체, 및 접합체 안정화제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 시약을 포함하는 것인 시약 혼합물; 및
    복수의 웰의 통합된 큐벳에 배치된 적어도 발색 기질 및 시각화 시약
    을 포함하는 일회용 생물검정 진단 카트리지.
  2. 제1항에 있어서, 내부 측벽을 코팅하는 항체는 항-c-반응성 단백질 항체, 항-시스타틴-c 항체, 항-IGF-1 항체, 항-알라닌 아미노전이효소 항체, 및 항-아스파테이트 아미노전이효소 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 일회용 카트리지.
  3. 제1항에 있어서, 발색 기질 및 항체는 대략 1:1의 비율로 존재하는 것인 일회용 카트리지.
  4. 제1항에 있어서, 발색 기질은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘인 일회용 카트리지.
  5. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 시약은 발색 기질 및 시각화 시약의 양에 상응하는 양으로 존재하는 것인 일회용 카트리지.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 시약은 0.002% 사포닌, 0.01% 저-발포 계면활성제, 및 0.02% 아지드화 나트륨을 갖는 용해 용액의 적어도 150 uL의 시약 혼합물로 이루어지는 것인 일회용 카트리지.
  7. 제1항에 있어서, 제3 웰은 PBS, 0.05% 폴리소르베이트-유형 비이온성 계면활성제, 및 0.03% 살생물 보존제를 갖는 것인 일회용 카트리지.
  8. 제1항에 있어서, 항-c-반응성 단백질 항체, 항-시스타틴-c 항체, 항-IGF-1 항체, 항-알라닌 아미노전이효소 항체, 및 항-아스파테이트 아미노전이효소 항체, 접합체 안정화제, 및 0.5% 기포저지제/소포제로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 갖는 제4 웰을 추가로 포함하는 것인 일회용 카트리지.
  9. 제1항에 있어서, 피펫의 측벽을 코팅하는 항체는 항-시스타틴 C 항체이고; 제2 웰 중의 적어도 하나의 시약은 0.002% 사포닌, 0.01% 저-발포 계면활성제, 및 0.02% 아지드화 나트륨을 갖는 용해 용액으로 이루어지는 것인 일회용 카트리지.
  10. 제1항에 있어서, 10 mM PBS, 0.05% 폴리소르베이트-유형 비이온성 계면활성제, 및 0.03% 살생물 보존제를 갖는 제4 웰; 및
    항-c-반응성 단백질 항체, 항-시스타틴-c 항체, 항-IGF-1 항체, 항-알라닌 아미노전이효소 항체, 및 항-아스파테이트 아미노전이효소 항체, 접합체 안정화제, 및 0.5% 기포저지제/소포제로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 갖는 제5 웰
    을 추가로 포함하는 것인 일회용 카트리지.
  11. 제2항에 있어서, 통합된 큐벳은 530 nm에서의 제1 LED를 통한 제1 광학 검출 판독, 및 660 nm에서의 제2 LED를 통한 제2 광학 검출 판독을 용이하게 할 수 있는 제1 및 제2 벽을 갖는 것인 일회용 카트리지.
  12. 효소-결합 면역흡착 생물검정 진단 키트로서,
    핑거스틱 장치; 및
    복수의 웰 및 광학 큐벳을 갖는 카트리지로서, 복수의 웰 중 하나에 배치된 피펫-팁 및 복수의 웰 중 하나 이상의 나머지 웰에 배치된 생물검정 컴포넌트를 포함하고, 여기서 복수의 웰 중 하나는 광학 큐벳인 카트리지
    를 포함하고,
    여기서 피펫 팁은 항체로 코팅된 측벽을 갖고;
    생물검정 컴포넌트는 pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제, 항체, 접합체 안정화제, 발색 기질, 및 시각화 시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 시약을 포함하는 것인 효소-결합 면역흡착 생물검정 진단 키트.
  13. 세척 시간을 감소시키면서 효소-결합 면역흡착 검정을 수행하는 데 사용하기 위한 일회용 피펫을 제조하는 방법으로서,
    피펫 팁의 내부 표면을 코팅하는 것에 의한 피펫 팁의 전처리 단계로서,
    피펫 팁의 내부 표면을 따라 친화도 제제를 함유하는 제1 코팅을 배치하는 단계;
    피펫 팁의 내부 표면을 따라 제1 코팅 위에 차단 용액을 함유하는 제2 코팅을 배치하는 단계;
    피펫 팁의 내부 표면을 따라 제2 코팅 위에 활성 보존제를 함유하는 제3 코팅을 배치하여, pH 안정화제, 이온성 촉매 제어제, 이온성 세포내 억제 제어제, 세제, 음성 제어제, 킬레이트제, 및 살생물 보존제, 항체, 및 접합체 안정화제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 시약 혼합물을 갖는 코팅된 피펫 팁 내로의 직접 피펫팅을 용이하게 함으로써 세척 시간을 감소시키는 효소-결합 면역흡착 검정을 수행하는 데 사용하기 위한는 코팅된 피펫 팁을 형성하는 단계
    를 포함하는 전처리 단계; 및
    발색 기질 및 시각화 시약을 코팅된 피펫 팁 중의 친화도 제제와 직접적으로 반응시키기 위한 카트리지 내의 발색 기질 및 시각화 시약을 함유하는 하나의 웰을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 항체, 항체 단편, 재조합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 스트렙타비딘, 재조합 단백질 단편, 핵산, 다당류, 당단백질, 펩티도글리칸, 분자 각인 폴리머, 및 압타머 분자로 이루어진 군으로부터 친화도 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 탄산염/중탄산염 버퍼, 수크로오스 버퍼, 인산 완충 식염수, 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 식염수로 이루어진 군으로부터 코팅 버퍼를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 친화도 제제를 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제1 코팅을 배치하는 단계로서, 제1 코팅 단계는
    친화도 제제를 선택하는 단계;
    코팅 버퍼를 선택하는 단계;
    선택된 항체 및 선택된 코팅 버퍼를 혼합함으로써 항체 용액을 제조하는 단계;
    혼합된 항체 용액으로 피펫 팁을 충전하는 단계; 및
    예정된 시간 동안 제1 온도에서 피펫 팁을 인큐베이션하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 차단 용액을 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제1 코팅 상에 제2 코팅을 배치하는 단계로서, 제2 코팅 단계는
    차단 용액을 선택하는 단계;
    차단 용액을 피펫 팁을 충전하는 단계; 및
    예정된 시간 동안 제2 온도에서 피펫 팁을 인큐베이션하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 활성 보존제를 사용하여 피펫 팁의 내부 표면을 따라 제2 코팅 상에 제3 코팅을 배치하는 단계로서, 제3 코팅 단계는
    활성 보존제를 선택하는 단계;
    활성 보존제로 피펫 팁을 충전하는 단계; 및
    예정된 시간 동안 제3 온도에서 피펫 팁을 인큐베이션하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
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