BG60679B1

BG60679B1 - Аналози на 1,3-оксатиоланнуклеозида

Info

Publication number: BG60679B1
Application number: BG95705A
Authority: BG
Inventors: Jonathan A Coates; Ian M Mutton; Charles R Penn; Richard Storer; Christopher Williamson
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1991-12-28
Publication date: 1995-12-29
Also published as: US20030004175A1; CN1036196C; IE911482A1; NO920018L; RU2099338C1; SK283430B6; KR960007532B1; EP0625150A1; PT97520A; OA09559A; CA2059263A1; HU9200302D0; NZ238017A; CA2059263C; NO920018D0; FI111722B; JP2927546B2; TNSN91029A1; PL293181A1; NO180377B

Abstract

Изобретението се отнася до аналози на 1,3-оксатиоланнуклеозида, по-специално (-)-цис-4- амино-1 - (2-хидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил) - (1Н) -пиримидин-2-он с формула BG 60679 В1 до неговите фармацевтично приемливи производни, до фармацевтичните състави, които съдържат посочените съединения като активни съставки и до методите за получаването и приложението им като антивирусни средства.

Description

Настоящето изобретение се отнася до нуклеозидни аналози и приложението им в медицината.По-специално изобретението се отнася до аналози на 1,3-оксатиолан нуклеозид, фармацевтич

ни състави на тяхна база и приложението им в медицината за лечение на вирусни инфекции.

Съединението с формула (I):

(I) иззестяо също като ВСЕ-189 или \&РЗ-21,е описано като пра те казако антивирусно действие, в частност срещу вирусите на имунна недостатъчност при човека /HIV/', причинителите на СПИН /:/. Съединението ст формула /X' е рацемячна смес на двзтз. енантиокера от формулите /1-1/ и /1-2/:

/1-2/

ЖМ1.

р и е описано и подложено на експеримент във вид на неговия рацемат .

Единственото съединение, което е понастоящем одобрено за лечение-

то на състояния, причинени от HIV, е 3’-азид-3’-дезокситимидин /А2Т, зидовудин, BW 5090/· Това съединение обаче оказва значителни странични въздействия, при което или не може да бъде използвано или, ако се използва, то при значителен брой пациенти тряб-. ва да бъде прекъснато. Следователно, съществува належаща необходимост от предоставяне на съединения, които са ефикасни срещу H2V, но с едновременно един значително по-добър терапевтичен индекс.

с С изненада се установи, че енантиомерите от съединението от формула /I/ са еднакво ефикасни срещу HIV, но че единият от енантиомерите //-/-енантиомерет/ притежава значително по-ниска цитотоксичност, отколкото другия енантиомер. Така, една от задачите на изобретението е предоставянето на /-/ /или лявовъртящ/ енантиомер от съединението от формула /Т/ и неговите фармацевтич но приемлив?! производни.

/-/ Енантиокерат има химическо название /-/-цис-ч·амим- ; -/2-хпдроксикетил- ί ,3-оксатлола:-·-ф-лл/-/ 1Н/-пиримидин2-он /от тук нататък съединение /А//. 2о притежава абсолютната стереохимии на съединението от формула. /1-1/, чието название е /22, --ле, 7-ф-амик-1 -/2-хидроксиметил-1 ,р-оксатиолан-р-ил/-/1Е/диримидин-2-он.

ja предпочитане, предоставя значително

/ '-/- е нан т ио м е ра от около 2/, а най- обре по

Фразата фармацевтично

С2 J-j А? ж СЛ цевтично приемлива сол, по вече алко от 1 . \v/vz.

приемливо производно¹¹ означава естер или сол на такъв естер, ня съединение /А/ или всяко друго което при назначаване то му на пациента е тно/ съединение /А/ остатък.

Специалистите /А/ моде цевтично в частта / директно или индирекили антивирусен активен метаболит или техен да бъде модифицирано от областта ще оценят факта, че съединение така-че да се осигурят негови сармаприемливи производни на основата,така и в зъз функционалните групи както хидроксиметилната група на океатиолановия пръстен. Модификациите на всички такива Функционални групи са включени з рамките на настоящото изобретение. От изключителен интерес обаче са фармацевтично приемливите производни, получени посредством модифицирането на 2-хидрокси.е тилната група на оксатиолановия пръстен.

Предпочитани естери на съединение /А/ включват съединения, в които водородът от 2-хидроксиметилната група е заменен от ацил0 н

на функция R-C- , в която не-карбонилната неопределена част R на естера се избира от водород, право- или разклонено-веризен

Ч

алкил /напр. *метил, етил, и'-пропил, Т -бутил, н-бутил/, алконсил / напр. 'меткоспметил/, аралкил /напр. бензил/, арилоксиалкил /напр. ценоксиметил/, арил /напр. .енил, по избор заместен с халоген, С. , алкил или С, , алкоксил/; естери на сулфокиселини1-½ 1-4 те като алкил- или аралкилсул·..онил /напр. метансул.;.онил/; естери на аминокиселините /напр. 1-залил или i-изолевщил/ и естери на моно-, ди- или трифасфата.

По отношение на горепосочените естери, осзен ако не е специално уточнено друго, благоприятното е,че всяка присъстваща алкидна част съдържа от 1 до 1б въглеродни атома, по-специално от 'ί до 4 въглеродни атома. Също така предимство е, че всяка присъстваща арилна част в такива есетери включва фенилна група.

В частност, естерите могат да бъдат алкидни естери, незаместен бензилов естер или бензилов естер, заместен с поне един халоген /бром, хлор, -_.луор, Под/, С. алкил, С. .< алкоксил, нитро или трифлуорметилна групи.

Фармацевтично приемливи соли на съединението /А/ включват онези, извлечени от фармацевтично приемливите неорганични и. органични киселини и основи. Примери на подходяци киселини включват солна киселина, бромоводородна киселина, сярна киселина, азотна киселина, перхлорна киселина, фумарова киселина, малеинова киселина,фосфорна киселина, гликолова киселина, млечна киселина, салицилова киселина, янтарна киселина, толуол-р-сулфонова киселина, винена киселина, оцетна киселина, лимонена киселина, метансулфонова киселина, мравчена киселина, бензоена киселина, малонова киселина, нафталин-2-сулфонова киселина и бензолсулфонова киселина. Други киселини като оксаловата киселина, които сами по себе си не са фармацевтично приемливи, могат да бъдат използвани като спомагателни при получаването на съединенията от нас тоя;, .ο то изобретение и тяхната фармацевтично приемлива кисели-

на и с ъо т в е т но coлл.

сол ка

Соли, извлечени от съответни основи включват алкален метал /напр. натрий/, алкално земен метал /напр. магнезий/, аконие за сол и и?. + /където ? е С. . алкил/ сол.

ι-ч-

Споменаването от тук па татък на. съединение, съгласно настои до то изобретение, се отнася както за съединението /к/, така и за неговите .армацевтично приемливи производни.

Съединенията от настоящото изобретение или сами по себе си притежават антивирусна активност/действие и/или могат да се ие таболизират са ефикасни за спирането на възпроизвеждането на ретровируси, включително татъчност при човека /ЕIV/, причинителя на СПИН.

Следователно, представен ^е още един аспект на настоящото изобретение, при който съединение /А/ или неговите фармацевтич но приемливи производни могат да се използват като действено те

рапевтично средство - в частност като антивирусно средство, напВ настоящото изобретение е представен и метод за лечение на вирусна ин.екция, на инжекция, рус като ΠIV, при бозайниците, от назначаване на ефективно количество от съединение /к/ или не гозо фармацевтично приемливо производно.

Б друг или алтернативен аспект от настоящото изобретение се представя употребата на съединение /А/ или негово фармацевтично приемливо производно за производството на медикамент за лечение на вирусна инфекция.

Съединенията от настоящото изобретение са полезни при лече6 ние също кг състояния, сзързани със СП’П<, като свързан със СПИН комплекс /ARC/, прогресизна о5:;а ли?··..аденопатия /PGL/, неврологични състояния, сзързани със CICCH /като деменция или тропическа парапареза/, състояния на Н.1У-по ложите лен и положителен анти-HIV антитела, саркома на Аапохи, тромбоцитопения пурпуреа и свързаните СЪС CxLiL· ИН.вКЦИИ, например Pneumocystis carinii

Съединенията от настоящото изобретение са полезни също та

ка при предотвратяване на развитие на клинични заболявания на лица с анти-HIV ат^титела яли HIV-антиген кслзжйтели.ч и при прс) дидактиката, необходима след излагане на И1У.

Съединението /А/ или неговите фармацевтично приемливи произ-; водни могат да бъдат полезни също при предотвратяване на ви- | русно замърсяване с физиологични течности като кръв или сперма | ин витро. i

Специалистите от областта ще оценят факта, че споменаваното тук лечение включва както профилактика, така и лечение на установени инфекции или симптоми.

По-нататък ще бъде оценено и това, че количеството съединение от настоящото изобретение, което е необходимо за лечението, варира не само по отношение на отделното съединение, което се избира за лечение, но и по отноиение на начина на прилагане, природата на състоянието, което се лекува, възрастта и състоянието на пациента и се прилага изцяло по преценка на лекуващия лекар или ветеринар. По принцип, обаче, една подходяща доза е в рамките на от около 0.1 до около 7р0 мг/кг живо тегло на ден, за предпочитане в рамките на 0.5 ДО 60 мг/кг/ден, а най-добре в рамките на от 1 до 20 мг/кг/ден.

желателната доза може за удобство да бъде еднократна' доза или да бъде разделена на по-малки дози, назначавани на подходя7 щи интервали, например дзе, три, четири или повече под-дози на _ . - ·

0с1 уДОиСТВО j СЪс ”ΐΘ НИ Ο ΤΟ 0Θ НО. 3 HS- 43.BS, ВЪЗ -5- Θ Д*1 ЧЧИ дозировки, например, съдържащи 1ν до 1 5 00 мг, по-до5ре 20 до

1000 мг, а нам-^обре 5- Д° 700 мг активен ингредпонт на единична до злровка.

Теоретично, активният·ингредиент трябва да съде назначазан така, че да се постигне зърно за плазмена концентрация на актив-

ингредиент, по избор във Физиологичен разтвор, или назначавано за приемане през устата във вид на болус, съдържащ от около 1 до около 100 мг активен ингредиент. желаното ниво на кръвта може да се поддържа посредством непрекъснато преливане, което*да осигури от около 0.01 до около 5.0 »

мг/кг/час или посредством периодични преливания, съдържащи от о

около 0.4 до около 15 мг/кг акитзен ингредиент.

Въпреки,че е възможно съединението от настоящото изобретение да бъде назначавано за целите на терапията въз вид на необработено химическо вещество, за предпочитане е . да бъде представен активният ингредиент във зид на фармацевтична рецептура.

Така, настоящото изобретение представя също така и фармацевтична рецептура, включваща съединение /А/ или негово фармацевтично приемливо производно заедно с един или повече фармацевтично приемливи за целта носители и, по избор, други терапевтични и/или профилактични ингредиенти. Носителят/ите/ трябва да бъдат приемливи в. смисъла на това да бъдат съвместими с другите ингредиенти от рецептурата и да не са вредни аа пациента.

_армацезтичн?1 ‘.ормулиро вки включзат такива, които са подходя :\и за назначаване през устата, ректално, през поса, локално /включително върху устните и под езика/, вагинално или парентералпо /включително мускулно, подкожно и венозно/ или въз зид, подходящ за назначаване чрез инхалация или инсуфлация. Рецептурите могат, където е подходящо, да бъдат представени във вид на отделни единици дозировка и могат да бъдат изпълнени съгласно всяка от методиките, които са добре известни в областта на фармацевтиката. Зсички методики включват стадия на свързване на активния ингредиент с течни носители или с ;ино раздробени твърди носители или и с двата вида и след това, ако е необходимо, оформянето на продукта в желаната рецептура.

Фармацевтични рецептури, подходящи за приемане през устата, могат за удобство да бъдат представени като отделни единици като капсули, облатки или таблетки, при което всяка съдър.па предварително определено количество активен ингредиент; въз вид на прах или гранули; във вид на разтвор, суспензия или емулсия. Активният ингредиент нозе да бъде представен също във вид на болус, електуарий или паста. Таблетките и капсулите за приемане през устата могат да съдържат конвенционални инертйи пълнители като свързващи средства, пълнители, мазилни вещества, разединители или овлажняващи средства. Таблетките могат да бъдат покрити съгласно методиките, известни в областта. Течни препарати за приемане през устата могат да бъдат във вид на, например водни или маслени суспензии, разтвори, емулсии, сиропи или еликсири, или могат да бъдат представени във вид на сух продукт за разтваряне с вода или друг подходящ носител преди употреба.

Такива течни препарати могат да съдържат конвенционални адитизи като суспендиращи средства, емулеибицираци средства, незодни носители /които могат да включват ядивни масла/, или кон9 също

ССрВаНТ-1 бъедиквхи.-та, съгласно г-тастовцото изобретение могат да бъдат формулираш: с цел napeнторадиото им назначаване /нанр. 4ΌΘ 3 ΗΗ3£Θ ΚΤ’Ίρδ,ΗΘ , Ч2.ПрИ?16 р ЗОл^СНН. -/'НЧЗКДИЯ ΗΘ χΐ^-θ КЪС ИНТ 0 11р6~ ллзане/ и могат да съдат преде .’азени зъв зид на единични доен Че. с1ЧПр’Л11 , ^_р;.; viraO ИЗ„ ДЪЧИв 47- С-..р_п .х.ЧО 37-3 , Μ/ΛΎΚίϊ Об-?)н 33 иреялзане илч з контейнери за многократна’ доза. с добазен :<ъч нея консервант. Съставите ногат да имат вид на суспзкзи.-, раз~ твори, или емулсия в маслени или водни носители и могат да съ* държат средства за суспендиране, стабилизиране и/или диспергиране. Алтернативно, активният ингредиент може да бъде във вид на прах, получен чрез асептично изолиране на стерилното твърдо вещество или посредством лио_Л.иллзация от разтвор, която прах се разтваря в подходящ носител, например стерилна, без пироген, вода, преди употреба.

За локално назначение към епидермиса съединенията, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат рецептурирани като мазила, кремове или лосиони, или пластир. Мазилата и кремовете могат, например да бъдат рецептурирани с водна или маслена основа с добавяне на подходящи средства за сгъстяване и/илх получазане на гел. Лосионите могат да бъдат рецептурирани с водна или маслена основа и обикновено също съдържат едно или повече средства за емулгиране, стабилизиране, диспергиране,суспендиране, сгъстяване или оцветяване.

Рецептури, подходящи за локално назначаване в устата,включват таблетки със захарна обвивка, съдържащи активния ингредиент в ароматизирана основа, обикновено захароза, акация или трагант; пастили, съдържащи активния ингредиент в инертна основа като желатин и глицерин или захароза и акация; и течности за пуоми10 ване на устата,

з по дхо

фармацевтичните рецептури подходящи за ректално назнача-

ване, при които носителят е твърдо вещество, са ,за предпочитане, представени като единични дози във вид па сунозлторни. Подходящи носители включват какаово масло и други материали, които обикновено се използзат з тази област,и супозиториите могат да бъдат за удобство получени чрез смесване на активния ингредиент с омекотен/и/ или разтопен/и/ носител/и/, след което сместа се омламда и оформя в свецмчки.

Σ-ецелтури, подходящи за вагинално назначаване, могат да бъдат представени като песарии, тампони, кремозе, телове, пасти, пяна или спрей, съдържащи в допълнение към активния ингредиент такива носители, които се считат за подходящи в тази област.

* За назначаване в носа съединенията от настоящото изобретение могат да се използват като течен спрей или диспаргиращ се прах или във вид на капки.

Капките могат *а бъдат рецептурирани с водна или не-водна основа и да съдържат също едно или повече диспергиращи средства, разтварящи средства или суспендиращи средства. Течните спрейове са удобни за ползване, поради опаковките им код налягане.

При назначаване лечение чрез инхалация съединенията от настоящото изобретение са удобни за ползване от инсу,.латор,или пулверизатор или други удобни средства за ползване на аерозолен спрей. Опакозките под налягане могат да съдъргат подходящ реактивен газ като дихлордифлуорметан, трихлорфлуорметан, дихлортетрафлуоретан, въглероден двуокис или друг подходящ газ. В случаите на аерозолна опаковка под налягане,дозата моке да бъде ί

определена,като се постави клапан, който да отпуска отмерено ко // личестно.

З.лтзрнативно, за назначаване на лечение чрез инхалация ил:: ису;ладия съединението, съгласно настоящото изобретение, моме да бъде въз зид на състав от сух пран, напрч..ер, прало за смес от съединението и подходяща дра.иоза осиоза като лактоза ,..о. .-А— пеете. Праховият състав ::о:::е да бъде представен зъз форма на единична доза в, например. капсули или патрони или напр., желатинови или кухи опаковки, от които прахгт но.™е да се приела с помощта на инхалатор или инсуфлатор.

Когато е необходимо, го ре по co че ни те рецептури могат да се адаптират така, че да се получи оезобо.тедаване на активния кнгредиент.

•тариацезтнчните състави, съгласно изобретението, могат да съдържат също и други активни ингредиенти като антимикробни средства или консерванти.

Съединенията от настоящото изобретение могат да бъдат използвани също и в комбинация с други терапевтични средства, например други антиинцекциозни средства. 3 частност, съединенията от изобретението могат да се използват заедно с известни антивирусни средства.

По този начин се представя и един друг аспект на изобретението - комбинация, включваща съединението /А/ или негово физиологично приемливо производно, заедно с друго терапевтично активно средство, в частност антивирусно средство.

Гореспоменатите комбинации могат удобно да бъдат представени за употреба във вид на фармацевтична рецептура, като по този начин фармацевтичните рецептури, съдържащи комбинация, като определената по-горе, заедно с фармацевтично приемлив за целта носител, включва още един аспект от настоящото изобретение.

Под::одя:;и терапевтични с детства за използване при такива

г.о:.оииацми вклччзат аиилллпни куклеозидл като ащнклозид иди гапциг.ловир, интерерони като ал-.'а, бета или гама-илтер'ерои, пнхииитори на ^ъоречйо“ОТдвляне като пробнецид, инхлбитори на нуклеозпден пренос като дпиирлдамол, .6’ ,3’/дцдеокслнуклеоз:ди като ΑΖΊ, 2’,5>-дидеоксицктид1-1Н, 2’ ,5’-длдеоксДенозин, 2’,ф’дидеоксинозин, 2’-длдеокситимидин, 2’,3’-дидеокси-2’,J’дидехидротимидин и 2»,5»-дидеокси-2»,5»-дидехидроцитлдин, имуномодулатори като интерлевнин И /ТЬ2/ и -фактор, стимулиращ колонии от макрофагови гранулоцити /GM-CSP/, еритропоетин, амплиген, тимомодулни, тимопентин, фоскарнет, рибавирин и инхибитори на HIV свързване с CD4 рецептори, например, разтворими CD4, С£>4 части, CD4 хибридни молекули, инхибитора на гликозилация като 2-деокси-0-гллкоза, кастаноспермин и 1-деоксинодкири1Я ·

Отделните комлоиентн на такива комбина:,ил могат да се назначават след ллп едновременно з отделни или комбинирани фармацевтични рецептури.

Когато съединението /А/ или негово фармацевтично приемливо производно се използва в комбинация с второ терапевтично средство, което е активно поотнопение на същия вирус, то дозата на всяко съединение може да бъде или същата, или да се различаза от тази, при която съединението се използва самостоятелно. Специалистите от областта лесно ще оценят подходящите дози.

Съединението /А/ и неговите фармацевтично приемливи производни могат да бъдат получени, съгласно всеки метод, който е известен в областта, за получаване на съединения с аналогична структура, например, както е описано в /1/·.

Специалистите от областта ще оценят това, че съгласно определени методи, описани тук по-долу, келана-та стереохимия на /А / f / -V ато ‘Ο’ отдел.е да бъде получен чрез 'амнил. нроду

такъв метод /А/ 1 ,^-оксатиолан от ормула /VIII/ /VIII/ килова група, например С, < алкилова група като Метил, или R I о е ацилова група, например С, _г алкилова група като ацетил или ί - о халоген, напримел йод, бром или хлор

Съединението от формула

VH1 ’ реагира лесно с цитозин или с подходящ негов предшественик с пиримидинова основа /предварително силилиран със силилиращо средство като хексаметилдизилизан/ в съвместим разтворител като метиленхлорид с помощта на киселина по Люис, като титанов тетрахлорид, калаено /IV/| съединение като калаен хлорид, или:. триметилсилилтри<лат.

1,3-оксатиоланите от формула /VIII// могат да бъдат полу чени, например, при реакция на алдекид от фармула /УП/ с меркаптоацетал от формула /VI/ в съвместим органичен като толуол, в присъствието например люисова киселина, като цинков хлорид.

HSCH₂CH/0C₂H₅/₂

С₆Н₅С0₂СН₂СН0 ,/νι/ /VII/

Меркаптоацеталите от формула /VI/ могат да бъдат получени *

оъг.:.‘ояо изсестниге в Областта /методики, иаарияер, както е лосочеир ζ>

Алдехм&ит? от <£ормул: /VI/ могат да бъдат получени съгласно известните з областта методики, например, калето е описано з /3/· Суровият алдехид /VII/ козе да бъде пречистен посредством превръщането му в кристален бисул^итен адиционен адукт, който след това отново се превръща в свободен алдехид.

При втория метод /д/ съединението /А/ се получава посред

ством в заимнопре връщане носн, е» 'О>

на основа на съединението от Гормула /'.У/ /W

където В е основа, която моме да се превърне в цитозин. Такова взаимно преобразуване може да се осъществи или чрез просто химично преобразуване /напр., преобразуване на урацилова основа в цитозин/, или чрез ензимно преобразуване с помощта на деоксирибозилова трансфераза. Такива методики и условия за взаимно добре известни в областта на нуклеосъединението от формула /XI/ /XI/ в съединението /А/ посредством преобразуване на аномеричната Ί1група в цитозинова основа с помощта на методите, които са добре известни в областта на нуклеозидната химия.

много от реакциите, посочени тук по-горе, са подробно описани в контекста на «нуклеозидния синтез, например в /А/ и /р/, преобразуване на основи са зидната химия.

При третия метод /С/

2.

може да бъде преобразувано /5

цитати от ι.οκτο привеждам? тук.

Ще co оцени фактът, че горепосочен.: те ре-акги:: могат да и зк си ват употребата не., ;.лп да Jenao удобно при по-:.1021¼ към лзмо :,ни -материали, които имат за.щтени функционални групи и отстраняването на защитеността мо..:е, следователно, да. е необходимо като междикел или краен стадий при получаването на необходимото съединение. бацитеността и отстра^аването на зацитеността на .ункциокалните групи може да бъде осъществено с помощта на конвенционални средства. Така например, аминогрупите могат да бъдат защитени от група, избрана, от аралкил /например бензил/, ацил, арил /например 2,4-динлтро.енил/ или силил; отстраняването впоследствие на защитната група, се осъцествяза, когато е необходимо,чрез хидролиза или хпдрогенолиза, като съответно се използват стандартните за целта условия. Хидроксилните групи могат да бъдат защитени с помощта на всяка конвенционална хидроксил. ' . защитна група, например, както е описано в /6/ или /7/. Примери на подходящи хидроксил защитаващи групи включват групи, избрани от алкил /например метил, те-бутил или метоксиметил/, аралкил /например бензил, дифенилметил или трифенилметил/, хетеро циклични групи, като тетрахидропиранил, -ацил /например, ацетили или бензоил/ и силилови групи като триалкилсилил /например, те-бутилдиметилсилил/. Хидроксил защитаващите групи могат да бъдат отстранени посредством конвенционални методики. Така.—например, групите на алкила, силила, ацила или хетероцикличните групи могат да бъдат отстранени посредством солволиза, например, посредством хидролиза в условия на киселина или основа. Алкил©вите групи като трифенилметил могат по подобен начин да бъдат отстранени чрез солволиза, например чрез хидролиза в условия на киселина. Аралкиловите групи като бензил могат да бъдат отцепени, ’например чрез третиране с ВР^/етерат и оцетен анхидрид следзано от отстраняване на така образуваните ацетатни групи на съответен стадий на синтеза. Силиловите групи чогат също да бъдат лесно отстранени с помощта на източни?; на улуоридни йони, като тетра-ек-оутила.;;ониев ,'луорид.

Б горепосочените методи съединението /А/ обикновено се получава като смес от цис и ттзанс изомери, от които цис изомервт е съединението, представляващо интерес.

s з и и зо ме ри по цизичен начин,

силикагел или посредством гракционна кристализация или непосредствено щи производни, например ацетати /получени, например с оцетен анхидрид/, след което, след отдс.тднзто, следза превръщане обратно в основния продукт /например посредством деацетилация с метанолен амоняк/.

Фармацевтично приемливи соли на съединението от настоящото изобретение могат да бъдат получени, съгласно описанието в /8/, което се цитира тук. Така например, когато е желателно да се получи кисела адиционна сол на съединението /А/ продуктът на всяка от горепосочените методики може да бъде превърнат в сол посредством третиране на получената свободна основа с подходяща киселина с помощта на конвенционални методи. Фармацевтично приемливи кисели адиционни соли могат да се получат в резултат от реагиране на свободна основа със съответна киселина по избор в присъствието на подходящ разтворител, като естер /например етилацетат/ или алкохол /например, метанол, етанол или изопропанол/. Неорганични соли с основен характер могат да бъдат получени в резултат на реакция на основното съединение с подходяща основа като алкохохат /например натриев метилат/ по избор в присъствието на разтворител като алкохол /например /7

метанол/. .арма^евтично приемлив;·! соли могат да бъдат също така получени от други соли, вклп-члте.д-ю от други фалмз.щевтлчно хрхсмлнви соли, нп съединени.το /А/ с помощта на конвенционални методики .

Съединението /_4/ може да бъде преобразувано във фармацевтично приемлив фосфат или друг естер в резултат на реакция с цосфорилизиращо средство, като РОС1-, или друг подходящ естерифициращ агент, като кисел халогенид или анхидрид, както е подходящо. Естер или сол на съединението /А/ може да. бъде превър ната в основното съединение например чрез хидролиза.

Отделянето на крайния продукт или на междинен продукт или на изходен материал за целта може да бъде осъществено посредством всяка подходяща методика, известна в областта, виж например /9/ и /10/.

f *

Така например, съединението /А/ може да бъде получено посредством HPLC с конфигурационен ред с помощта на подходяща стационарна фаза, например- ацетилиран бета-циклодекстрин или

целулозен триацетат и подходящ разтворител, например алкохол като етанол или воден разтворител, например триетилов амониев ацетат. Алтернативно, съединенията могат да бъдат отделени чрез ензимно осъществяван енантиоселективен катаболизъм с подходящ ензим, като цитидиндезаминаза или селективно ензимно разграждане на подходящо производно с помощта на 5’-нуклеотидаза. Когато отделянето се осъществява ензимно, ензимът може да бъде използван или в разтвор или, за по-удобно, в неподвижна /свързана/ форма.’Ензимите могат да бъдат направени неподвижни посредством всяка от известните в областта методики, например чрез абсорбция върху смола като Euper^vt С.

Настоящото изобретение е описано по-долу чрез следните /6 при?;ерп, които з никакъв случаи нямат за цел да ограничазат изобретението. йсички данни за температура са да цени в:, градуси по Целзий.

Междинно съединение 1 р-метокси-1,5-оксатиолан-й-метанол, бензоат

Разтвор от цинков хлорид /1.6 г/ в горец метанол /15 мл/ се добавят към разбъркван разтвор на иорк.аптоацеталдехид, диметилов ацетал /34.2 г/ и бензоилоксиацеталдехид /48.3 г/ в толуол /1300 мл/, след което се нагрява с обратен хладник под азот в течение на 50 минути. Охладената смес се концентрира, разрежда се с известно количество толуол и след това се филтрира през кизелгур. Смесените филтрати и толуолът се измиват с воден наситен разтвор на натриев бикарбонат /два пъти/ и солна, луга, изсушават се /магнезиев сулфат/, след това се изпаряват до получаване на масло, което се подлага на колонна хроматография върху силициев двуокис /2 кг, Mark 9385/ел^иран с хлороформ, за да се получи посоченото в заглавието на настоящия пример съединение във вид на масло /45·1 г/, една смес от аномери /са 1:ι/; 1Ξ NJMR/pMSO-A^/ 3·1-5·3 /4Н/, 5.42 /оЕ/,

4.4-4.6 /4Н/, 5.41 /1Н/, 5.46 /1Е/, 5.54 /1Е/, 5.53 /1Н/, 7.45 /4Е/, 7.58 /2Е/, с.С7 /4Н/;^тлах /СНВг-/;717.бсм‘.

Междинно съединение 2 /—/—цис—I-/2-бензоилоксиметил-1,5-оксатнолан-5-ил/-/1Е/-пиримидик-2-4-ДИОн

Смес от фино смлян урацил /9.52 г/, хексаметилдисилазак /50 мл/ и амониев сулфат /ЗС мг/ се нагряват с обратен хладник ♦

под азот,докато се получи прозрачен разтвор. Разтворът се охлажда и след това се изпарява, при което се получава безцветно масло, което се разтваря под азотно налягане в ацетонитрил /100 мл/ /.9 ±Ή 3 Ί’ 23_,ώ Τ

иетансул „онат /'14.7 мл/. медената баня се от страня за и разтзо-

мпнути. След охлаждане и изпаряване утайката се пречиства чрез колонна хрояатограция върху 1 кг слликагел /i.erk 7385/ ^и се елюнра с хлоройорм/хетанол 9:1. Съответните части се охлаждат и изпаряват, за да се получи непречистена утайка, тайната се подлага на ракдиокна кристализация с минимално количество горещ метанол /с.12СС мл/, за да се получи посоченото в заглавието на настоящия пример съединение /5.52 г/ във вид на бели кристали. 12 NMR /d°PMSO/ .Pl 1 .56 7.50-8.00 /5Н,-»/, 6.20 /iH,t/> 5.40 /2Н,щ/, 4.52 /2Н, та/, 5-48 /ТЕ, уц/, 5.25 /1Н,Ш/.

Междинно съединение 5 /+/-/цис/-4-амино-1-/2-бензоилоксиметил-1.5-оксатиолан-5-ил/~ /1Е/-пиримидин-2-он

Метод /а/

Суспензия от цитозин /22.70 г/ и амониев сулфат /няколко милиграма/ в хексаметилдисилизан /110 мл/ се разбърква и нагрява с обратен хладник в течение на два и половина часа под азот. Разтворителят се отстранява чрез изпаряване и остатъкът, който е във вид на твърдо вещество,се разтваря в сух ацетонитрил /350 мл/. Този разтвор се пренася с помощта на подвижна игла в разбъркван, леденостуден разтвор на 5-метомси-1,5-оксатиолан2-метанол, бензоат /междинна съединение 1/ /43,57 г/ в ацетонитрил /650 мл/ под азот. Добавят се /53 мл/ триметилсилилтрифлуорметансулфонат, разтворът се оставя да се затопли до стайна температура /в продължение на час и половина/, след това се чагряза с обратен хладник з продължение на една нощ. Остатъкът се концентрира, разрежда се с наситен зоден разтвор на натриез бикарбонат /5-Ό ::л/ и след това се извлича с етилацетат /ф х 500 мл/. Смесените екстракти се измиват с вода / две по £50 мл/ и солна луга /250 мл/, изсуиазат се /магнезиев сул_ат/, след което се изпаряват до образуване на пяна, която се .о у ага иа и.олсииг, хроматография върху силициев дзуокис /60’0 г, Herb 7754/ смес от аномери /са /9.0 мл/, при което се получава твърдо щество /10.2_>

г/, което се рекристализира · ©талОЛ / 120 мл/ вевода />0 мл/, при което се получава съединението, посочено настоящия пример, във зид во /9.26 г/; л»ах /КеОН/ 229-4 wm/E¹^

1см заглавието на на бяло твърдо вещест610/; 272.4 w/E¹'^ см

295/; ¹Н KMR ДЖО ά⁶/ /1Н/, 3.50 /1Н/, 4.07 /2Н/,

5.52 /1Н/, 5.65 /1Н/, 0.28 /1Н/, 7.22 /2Н/, 7-56 /2Н/, 7.72

/2Н/, 8.10 /2Н/.

l ie то д /б/ 'Фосфорен оксихлорид /7.0 мл/ се подава на капки към раз бърквана, ледено-охладена суспензия на 1, £,4-тр2азол /11,65 ^г/ в ацетонитрил /120 мл/, след което, поддържайки вътрешната температура под 15°С, се подава на капки триетиламин /22.7 мл/. След десет минути се добавя на калки разтвор на /+/-цис-1/2-бензоилоксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил/-/1И/-пиримидин-2,4дион /междинно съединение 2/ /6.27 г/ в ацетонитрил . Разбъркването продължава при стайна температура в продължение на една нощ. Сместа се охлажда посредством ледена баня и към нея бавно се подава триетиламин /30 мл/, следван от вода /21 мл/. Полученият разтвор се изпарява и остатъкът се разпределя между

наситен разтвор на натриев 'инарбонат /400 мл/ и хлороформ /три по 200 мл/. Смесените хлоро ормни екстракти се изсумаза.т зъъиу магнезнез сулфат, ...илтрпрат се и се изпарязат, при което се получаза непречистен остатък /7.7 г/. Остатъкът се разтваря з 1 ,4-диокса.н /240 мл/ и се прибазя концентриран воден амокяпек растзор /^.^, 0.880, 50 мл/. След час и поло зина. разтворът се изпаря за, и остатъкът се разтвз.ря з метанол. боза води до поду'‘I. C'j 3 С·'· Τί θ 3 3? 4З ί · ι..'j 3> O', J T — !ка на твърдо вещество, което се отйллтрира. батериите разтвори се пречист за т чрез колонна хроматогра.. ля върху силикагел /Clerk 9385, όΟΟ г/. Съответните -ракции се утая ват и изпаряват,при което се получава, съединението, посочено в названието на примера,във вид на сивобелозо твърдо вещество /2.1о г/, идентично на това, получено съгласно 1.етод /а/.

Пример 1 /±/-/цис/-4-амино-1-/2-хидроксиметил-1,З-оксатиолан-5-ил//1Е/-пиримидин-2-он

Суспензия на /цис/-4-амино-1-/2-бензоилоксиметил-1,3оксатиолан-5-ил/-/1И/-пиримидин-2-он /Междинно съединение 3/ /8.19 г/ ^и смола Амберлит [РА-фОС /ОН/ /8.24 г/ в метанол /250 мл/ се разбърква и нагрява с обратен хладник в продължение на час и четвърт. Твърдите вещества се отстраняват чрез филтриране, след което се измиват с етанол. Смесените филтрати се изпаряват. Остатъкът се превръща в прах с етилацетат /80 мл/.

>

Полученото бяло твърдо вещество се* Събира чрез филтрация, при което се получава продуктвт посочен в названието на примера /5.09 г/, 1Н NMR /phSO-άθ/ - /_1Н/_? /_1Нд 3,73 /2Н/,

5.18 /1Н/, 5.29 /1Н/, 5.73 /1Н/,’б.21 /1Н/, 7.19 /2Н/, 7.81 /1Н/.

Пример 2

Чирално HPLC отделяне на. енантионери на /+/-/дис/-щ-г.мпко-1 22

/T-Xj/дл- ( , ^-^::?атиола:-:-5~И7/-/1Е/-плрип:1Дпн-2-он.

/Л/ Рацемичният продукт, получен съгласно описанието з ~рн«ер 1. /25 мг/ се подлага на подготвителна EPLC при следните условия: Колона: ИегскНТЬаг целулозен триацетат, 250 х 10 «од 10 jt

Еллиращ агент: етанол

Поток: 3 мл/минута

Откриване: WV, 270 tim

Температура: етапна.

Изпаряването на съответните утаени Оракции дават /2R, цис/-4-амино-1—/2—хидроксиметил—1,З-оксатиолан-5-ил/-/1Н/пиримидин-2-он /6.6 мг, е.е. са 100%/ и /2£,цис/-п-амино-1/2-хидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил/-/1Е/-пиримидин-2-он /3.6 мг, е.е. са 9С'7с/· /В/ Рацемичният продукт, получен съгласно описанието в Пример 1, /26 мг/ се подлага на подготвителна HPLC при следните условия: Колона: А$ТЕС цикловръзка 7 ацетил, 250 χ 4·6

Елюирац агент: 0.2% триетиламониев ацетат /получен чрез добавяне на ледена оцетна киселина към 0.2% триетиламин във вода до получаване на pH 7«2/;

Поток: 2 мл/минута

Откриване: VV, 500 ПЛЦ

Температура: стайна.

Изпаряването на съответните „ракцип води до получаване на суров /2Ц,цис/-4-амино-1-/2-хидроксиметил-1,3-оксатиолан-5ил/-/1П/-пиримидин-2-он /25 мг/ и суров /2$,цис/-4-амино-1/2-хидроксиметил-1,З-оксатиолан-5-ил/-/1Е/-пиримидин-2-он /17 мг/. Тези части се подлагат поотделно на по-нататъшна подготвителна HPLC, осъществявана при следните условия:

Колона: ASTEC цикловръзка Т ацетил, 250 х 4.6 WK

Пл^иращ агент: мЬ. амониев ацетат, сП о.8

Поток: ΰ.$ мл/ллкута

Откривахе : W, JOO _со ~ а е мпе уату ра: у ·

_А 3 Het J-H Зс4 ДАЧУ 30 хаЗ» С аЗ 0 Т AO ‘С-· Т ИЛ А 17 А -Д-- 4CvV 1 1'* Ο Ο _г τ* щО 110 _νзането на /2К,цис/-4-амино-'>. -/2-хидроксиметил-1 , 7 оксатиолахф-ил/-/;Н/-пирихидин-2-он /ф.С мг, е. е. са. 91/7 и /2$ ,цис/ц-ахлно-1 -/2-хидхоксихетил-', _.-оксатхолан-П-нл/-, 7 К/-пирхмхдин-2-он /?.3 мг, е.е. са 9о//·

Пример 5 /-/-цис-^-ампно~1-/2-хидроксиметил-1,5-окоатиолан-ф-нл/~/ίΞ/~ диримидин-2-он

Д, / /+/-цис-4-амхно-1 -/2-хидроксиметил-, , З-оксатиолан-ф-ил//1П/-пиримидинон, дихидрогенаосцат, амониева сол

Студена /0°С/, разбърквана суспензия на /+/-цис-ф-амино1-/2-хидроксиметил-1,ф-оксатиолан-ф-ил/-/1Н/-пиримидин-2-он /1.СО г/ /Пример 1/ в сух триметилсулфат /20 мл/ се третира с *

□оскорен оксихлорид /2.44 мл/, след което сместа се разбърква при С°С в продължение на фф минути и след тоза се охлажда рязко в ледена вода /50 г/. Студената смес се регулира до pH 2. ф посредством добавяне на воден N-натриев хидроокис, след това се нанася върху колона от активиран въглен /10 г, DARCO/, която е елюирана с водачи после с етанол-воден амоняк. Фракциите, съдържащи суровия монобосфат се смесват и концентрират.

Полученият разтвор се включва към колона, съдържаща 2ф г DSAE

Jephadex A-25 /НСО^-/.

Елюирането се осъществява с градиент вода /120 мл/ до 0.1 M-NH^HCO^ /240 мл/, 4МК|Н^НС0^ /съответно 120, 240 и''400 мл/.

след това 0.2, 0.3 и

Съответните отделни чавти се смесват и концентрират. Остатъчният разтвор се разрекд с вода (40 мл) и изсушава чрез сублимация, при което се получава продуктат, посочен в заглавието, във вид на бяло твърдо вещество (1.37 г); λ шах (рН6 буфер), 271.0 шп (Е¹%₁см190); ¹Н NMR (020)^3.23 (1Н), 3.55 (1Н) , 4.0-4.2 (2Н) , 5.43 (1Н) , 6.07 (1Н), 6.33 (1Н), 8.08 (1Н).

( i i) (2R, цис)-4-амино-1-(2-хидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)(1Н)-пиримидин-2-он и (2S,unc)-4-амино-1-(2-хидроксиметил1,З-оксатиолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он *-луклеотидаза (от crotalus atrox venom) (EC 3.1.3.5/ (60мг при 17 единици/мг) се добавят към разтвор на (-)-цис-4-амино(2-хидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)- (1Н) -пиримидин-2-он, 6’-дихидрогенфосфат, амониева сол (1.35 г) в буфер (30 мл, получен от глицин (526 мг) и магнезиев хлорид (190 мг) във вода (100 мл) и сместа се инкубира при 37°С в продължение на два и половина часа. Добавят’се още еняими (20 мг) и инкубацията се продължава за още три и половина часа. Получената смес се включва към колона от DEAE Sephadex А-25 (вид HCOj). Елюирането се извършва с вода (160 мп),а след това с 0.1, 0.2, 0.3 и 0.4 М NH4HCO3 (по 200 мл всеки път). Съответните фракции, съдържащи първия елюиран компонент,се смесват и изпаряват, остатъкът се подлага на колонна хроматография върху силициев двуокис (60 г, Merck 7734), елюира се със смеси от хлороформ-метанол. Изпаряването на съответните фракции от метанол-етиловия ацетат води до получаване на (+)~СЦис)-4-амино-1-(2-хидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил) - (1Н) - пиримидин-2-он във вид на бяло твърдо вещество (0.30 г) - /алфа/D^⁷· + 137° (с.1.04 МеОН); ^гН NMR (DMSO)# 3.04 (1Н), 3.40 (1Н), 3.73 (2Н), 5.18 (1Н) , 5.29 (1Н) , 5.73 (1Н) , 6.21 (1Н) , 7.19 (2Н) , 7.81 (1Н) .

Съответните фракции от Sephadex колоната, съдържащи втория елюиран компонент се смесват и изпаряват. Остатъкът се разтваря във вода (30 мл), третира се с алкална фосфатаза (от Escherichia coli) (EC 3.1.3.1) (1.5 мл при 416 единици/мл), след това се инкубира при 37°С в продължение на един час. Разтворителят се отстранява посредством изпаряване и остатъкът се подлага на колонна хроматография върху силициев двуокис (60 г, Merck 7734), елюира се със смеси на хлороформ-метанол.

Изпаряването на съответните фракции от метанол-етиловия ацетат води до получаването на (-J - (цис)-4-амино-1-(2-хидроксиметил

1,3-оксатиолан-5-ил)- (1Н) - пиримидин-2-он във вид на бяло твърдо вещество (0.32 г); (an$a)D^l -132° (с.1.08, МеОН); ^ХН NMR (DMSO) делта 3.04 (1Н),3,40 (1Н) , 3,73 (2Н) , 5,18 (1Н), 5,29 (1Н), 5,73 (1Н), 6,21 (1Н), 7,19 (2Н), 7,81 (1Н).

Пример 4 (-)-цис-4-амино-1-(2-хидроксиметил-1,З-оксатиолан-5-ил)-(1Н)пиримидин-2-он (i) Три 50-милилитрови колби с хранителна среда за микроорганизми (Oxoid Ltd) се заразяват изкуствено всяка с Escherichia coli (ATCC 23848), изстъргани от плоча с хранителен агар. Колбите се инкубират в продължение на една нощ при температура 37°С с разклащане при 250 оборота в минута и след това всяка колба се използва за заразяване на 4л CDD среда (глутаминова киселина, 3 г/л; магнезиев сулфат, 0.2 г/л; калиев сулфат,

2.5 г/л; натриев хлорид, 2.3 г/л; Na2HPO42H2O, 1.1 г/л; МаН2РОд2Н2О 0.6 г/л; цитидин, 1.2 г/л) в седем-литров апарат за ферментация. Културите ферментират при 750 оборота в минута, при температура 37°С и при аерация 4 л/минута. След нарастване в продължение на 24 часа клетките се събират посредством центрофугиране (5000 г, 30 минути), при което се получава добив от г мокро тегло. Клетъчната излета се суспендира отново в /ОС мл 22 мК Трие ЕС1 5у„ ер /рН 7. ~/ и се прекъсва посредством обработкасултразвук ' /1± х цр секунди,·· . Клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране _ζ’3ν, СОС г, 30 минути/ и протеинът се утаява,като се добави амониев сулфат до насищане до 75%· Утайката се събира чрез центрофугиране /50,000 г, 30 минути/ и пе ле та та се суспендира отново з _5 мл НЕР35 буфер /100 м.Ф, рй 7.С/, съдържащ амониев сулрат /73% наситен/. Знзимният разтвор се получава посредством центрофугиране при 12,000 обороти на минута в продължение на 30 минути. Плаващата среда се отстранява и пелетата се разтваря в трис-ЕС1 буфер /рН 7·0;

100 мМ/ до постигане на първоначалния обем.

/П/ Продуктът, получен съгласно описанието в Пример 1, ./115 мг/ се разтваря във вода /100 мл/ и се разбърква. Ензимният разтвор /0.5 мл/ се добавя и сместа се поддържа при постоя:-: но pH чрез непрекъснато добавяне на НС1 /25 мМ/« Преобразуването се контролира посредством чирална HPLC, като това показва, че /+/ енантиоиервгна субстрата се дезамидира избирателно/ предпочитано | След изтичане на 22 часа /+/ енантиомергт на субстрата /КТ 12.5 минути/ се отстранява напълно и разтворът се регулира до pH 10.5 чрез добавяне на концентриран натриев хидроокис.

Така полученият разтвор се елкира през колона от ОДЕ Sephadex /А 25; Pharwacta; ЗС х 1.6 см/, предварително уравновесена до pH 11. Колоната се измива с вода /200 мл/ и след това с НС1 /0.1 М/· фракциите /ДО мл/ се вземат и се анализират посредством HPLC с обратна фаза, фракциите 5-13, съдържащи нереагиралия /-/ енантиомер на субстрата се смесват и се регулират до pH 7*5 ^с помощта на ЕС1 .

2Ϊ

-1 -j-’/ j C В /Ь'ХВГ-^2. ДВ 3 3. 03-ЛИ.В ilj-’C/д к» > ос нзглз.сл до рГ 7.р с разредено, натриева основа. Анализът, получен от чиралната HPLC показва, че този материал е смес, състояща се от един енантиомер /2Т 10.2 минути/ като основен компонент и друг енанткомер /лТ о.р минути/ като по-малък компонент /е.е. са 90%/.

/ТТТ/ Стадий /ti/ по-горе се повтаря з по-голям мащаб.

Съгд.'.::о::::: то, получело съгласно с-л::соч:::.-то в .:.:ср лг <

О . .,'i CJ 0 _rn0·. ---'·**'. -. - ДС. t t С- J — . - t n ДС— < С. 3 0 д , ~ · s , -сб .1J Се ..

както е описано в стадий /1/. След изтичане на 1о и 47 часа се добавят аликвотни части /С.р кз/ ензим. Реакционната смес се разбърква в продължение на 70 часа, след което се оставя да стои за още 64 часа. Анализът от чиралната ЕР1£ показва, че /+/ енантиомервГ на субстрата е напълно дезамидиран и така полученият разтвор се наглася до рЕ 10.щ с помощта на натриева основа.

Така полученият разтвор се елкира през същата QA3 колона, както е посочено в стадий /11/. фракциите 2-6, съдържащи смес от остатъчния субстрат и дезамидирания продукт.се събират на куп. ^ракциите 7-13, съдържащи остатъчния субстрат / /-/ енантиомер /, се събират и нагласят до pH 7·3· фракциите 25-26, съдържащи дезамидирания продукт,се събират и неутрализират.

Горепосочените фракции 2-6 се елюират отново през същата QAZ колона, йракциите J-11 от тази втора колона съдържат нереагирал субстрат //-/ енантиомер/. -ракция 70 съдържа дезамидирания продукт.

/1У/ Получените субстратни фракции от стадий /XX/ и /111/ се събират^ заедно и се нагласяват до pH 7·5· Този разтвор се елкира през колона XAD-16 /40 х 2.4 см/ с пълнеж от вода.

Колоната се измива с вода и след тоза се елипса с ацетон: зода /1:4 процентно съотношение на обеми/. _ракциите, съдържани /-/ енантиомера на БСЕ 169 се събират и изсушават чрез сублимация, при което се получава бял прал /4 90 мг·/.

Посочените по-горе не то ок ки и» 9'PLC са г.аг.то следи.'· :

' . Лиялитичйо EPLC о обратно. .·/<.-,

Колона: Capital Cartridge Spheres orb ODS-2 /5ul·/ '50 x 4·6mm

Отмивано средство: Амониев дихидроген+осфат /50 мМ/+ 5%

МеСМ

Поток: 1.5 мл/минута

Откриване: uv, 270 ши

Времена на задържане: БСН 189 5·5 минути дезамидиран ВСН -189 8.1 минута

2. Аналитична чирална НР1С

Колона: Цикловръзка 1 Ацетил 250 х 4.6 мм

Отмиващо средство: 0.2% триетиламониев ацетат /рН 7.2/

Поток: 1.0 мл/минута

Откриване : Uv, 270 Гйм

Времена на задържане: ВСН 189 11.0 и 12.5 мин.

дезамидиран ВСЕ-189 8.5 и 10.2 мин.

/Еиопревръщането се проследява чрез контролиране на загубата на върха при 12.5-та минута и акумулирания продукт при 10.2мннута/.

Пример 5 /-/-цис-4-амино-1.-/2-хидроксиметил-1 тЗ-оксатиолан-5-ил/-/1Н/пиримидин-2-он

В клетки на 3. coll, /АТСС 52848/, изстъргани от подложка с добре отгледан хранителен агар,се използват за посяване в две то. се са

Услов т· от icon το фермеит1-глутаминова киселина магне зие в сулфат калиев сулрат

Ύ·..ί среда

40. ί

COD-среда, сле;

разбъркване при тек г/л

2.5 натриев хлорид

2.3

1.1

Na^IFO,

КаН₂Р0^

Приготвена с дистилирана вода. Стерилизирана при темпеО.о ратура 121°С в продължение на 50 минути. Цитидинът /1.2 г/л/ е филтрово ' стерилизиран ^{и се} добавя преди посязането тъчна паста /150 г/ се разтопява и сусп дира в 750 мл 100 м.. Hepes /М-/2-хидроксйетил/пиперазин-Т1 /2-еуансулфонова киселина// буфер /рН 7»5/, съдържащ 1мМ етилен диаминтетраоцетена’ киселина /натриева сол/ и 1 мМ дитиотрейтол /прекъсващ буфер/. Клетките се разкъсват,като се пусне суспензията през хомогенизатора от типа Manton-Sant tn, работещ при

7500 рбТ. Това се извършва три пъти с охлаждане на суспензията

- -О л до температура приблизително р 0 след всяко пускане през :<омогенпзатора. Уоисгенатьг се прочиства посредством центро”у-

тиране /1'	ί-СО г, 6С минути/. Пи т и дин де зами на злата активност се
абсорбира	върху Q-Sepharose колона /490 мг обем на слоя/ пред-
варително	уравновесен с 50 мК трие /хидроксиметил/ метиламин
/рН 7.5/,	съдържащ 1 мм натриев хлорид. Утаените активни фрак-

ции /210 мл/ се добавят към фенил-ЗерИарове колона /490 мл обем на слоя/, предварително уравновесен с проба от буфер, съдържащ 5*2 М амониев сулфат. Свързаният ензим се елюира с градиент намаляваща концентрация на амониев сулфат, фракциите, съ държащи цитидиндеааминазната активност,се утаяват /695 мл/ и частично пречистеният ензим след това се утаява с 80% амониев сулфат. След центрофугиране /1400 г, 60 минути/ пелетата се суспендира отново в 54 мл свръхплаваща маса от горепосочената и се съхранява при 4°θ·

6.2 мл от този разтвор се центрофугира /1800 г, 90 минути/ и пелетата се разтваря в 24 мл 0.5 И калиевфосфатен буфер /рН 7.5/· Суалензията се диализира в продължение на една нощ срещу 1 М калиевфосфатен буфер /рИ 7.5/· Задържаната маса /20 мл/ след това се разрежда с еднаквото на нея количество дистилирана вода. Към 35 мл от този разтвор се добавят сухи зърна Eupergkt С /1 г/ и сместа се оставя да престои при стайна температура в продължение на 150-300 часа /определени от измерването на остатъчната цитидиндезаминазна активност в разтвора/. Свързаният ензим се измива със 100 мМ трис/НС1 буфер /рН 7.0/, съдържащ 1 мМ EDTA, 1 мМ D22L, 0,5 И NaCl и 500 ррм р-хидроксибензоен: кисел. .. е'тилов естер /акумулиращ буфер/. Свързаният ензим /2.7 г мокро тегло/ се съхранява в този буфер при 4°С,докато се наложи използването му за биотрансформация.

Продуктът, получен съгласно описанието в Пример 1, /3 г/

се разтвор., в 500 мл дбст:	: ля раи·.·, водя з магнетично развъриза-
но 1-лптроза колба, йиопре	юбразувансто се извъркза при темпера-
тура 52° С в рП-постоянен.	о” се поддъю-а постоянен при 7·0>
като се добавя 1 М оцетна	киселина. 1 г мокро тегло'от свърза-

ни те ензими зърна се измива с дестилирана вода преди да започне реакцията. Преобразуването се контролира чрез чираляа

HPLC, която показва, че /+/ еиактиомергт на субстрата се дезампзира селективно. В и.?, реакцията /7- маса/ ензимните зърна се отцилтрират и филтратът се използва за изолиране на .“е-ания- /-/-енантиомер.

pH на. реакционната смес се наглася до pH 10.5 с помощта на амонячен разтвор /Ш/ и разтворът се нанася върху смола с високо качество t)yo Hte Al 13 по време на цикъла ОЕ /50 мл,

0.4 обема на слой на час/. Уридиновият аналог се абсорбира е

върху смолата, а /-/-енантиомер^Г преминава през нея. Всеки

/-/-енантиомер, който е все оце върху смолата,се отстранява чрез измиване с 0.047 амонячен разтвор /2 обема слой, скорост на потока 0.8 обема слой/час/.

рй на използваните разтвори и ввцивания /600 мл/ се наглася до pH 7.0 с концентрирана сярна киселина и разтворът се нанася към смола от типа XAD16 /50 мл, скорост на потока 1.4 обема олой на час/. Колоната се измива с дестилирана вода /2.5 обема слой, скорост на потока 2 обема слой на час/ и /-/-енантиомергТ се елюира с ацетон:вода 1:5 /скорост на потока е-

1.5 обема слой на час/.

Събраната фракция, съдържаща /-/-енантиомер /4 обема слой/,се концентрира в изпарител Bucht до малък обем,преди да се филтрира през стъклен синтер ?.> 3. Филтрираният разтвор се изсушава чрез сублимация, при което се получават 1.2 г отпродукта, посочен в заглавието, κο'ίτο е идентичен на този, получен съгласно описанието в Пример 4.

Пример 6

Рецептури за таблетки

А. Следната рецептура се получава посредством мокро гра

нулиране на ингредиентите с разтвор на провидон във вода, изсушаване и пресяване, следвани от добавяне на магнезиев стеарат и пре co ване .

мг/таблетка

/а/	активен ингредиент	250
/б/	лактоза В.Р.	210
/в/	провидон В.Р	15
/г/	натриев нишестян гликолат	20
/д/	магнезиев стеарат	5

500

В. Следната рецептура се получава посредством непосред ствено пресоване; лактозата е от тип за непосредствено! г пресо ване .

активен ингредиент лактоза а в и цел магнезиев стегнат мг/таблетка

250

145

1С0

500

В. /Рецептура за контролирано освобождаване/. Формулировката се получава посредством мокро гранулиране на ингредиентите /посочени по-долу/ с разтвор на провидон във вода, зсу и от зявг.не

ОТ ДО JO-ВЯНО Нс'.

/г./ активен ингредиент /б/ кидронскпуолл-кетилцелулоза /Methocel ?4М Prewtwm/ /в/ лактоза Б.Р.

/г/ провидон Б.Р.

/д/ магнезиев стеарат ' I 2

700

Пример 7

Рецептура за капсули

Рецептурата за капсули се получава, чрез смесване на посочените по-долу ингредиенти и запълването с този смес на твърда желатинова капсула, състояща се от две части.

мг/капсула

активен ингредиент	125
	72.5
а ви цел	50
магнезиев стеарат	2.5
	250
Пример с
PeixenTyOa за инжекция

Активен ингредиент 0.200 г

Разтвор на натриев хидроокис, 0.1 М до pH от около .

Стерилизира се вода q.S. до 10 мл. L • У

Активният ингредиент се суспендира в част от водата /коя3Ϋ то може да бъде затоплена/ и рП се наглася до около 11 с раз-

2C2U . г-Ог, температура ч-5 С макс:

лктиз:

добавя към разтопената основа с разбъркване със силно режеща бъркалка, докато се получи гладка, разномер дисперсия. Поддържайки температурата на сместа на 45°С»^се Д°~ бавя останалата част от твърдата мас към суспензията и се разбърква до получаване на хомогенна смес. Цялата суспензия преминава през 250y-tW сито от неръждаема стомана и, без да се прекъсва разбъркването, се оставя да изстине до температура ФО°С. При температура от 5о°С до 40°С 2.02 г от сместа се отливат в подходящи, 2-милилитрови пластмасови форми. Супозитори те се оставят да се охладят до стайна температура.

I Пример 10 | Биологична активност | Антизирусна активност

Антивирусната активност на съединенията,'посочени в Пример2,се определя по отношение на три вида H1V-1 и един вид HIV-2 на следните клетъчни линии.

ЗМ^клетки, полу-развита Т-клетъчна линия, извлечена от пациент с лимфобластична левкемия, заразена с HIV-1 от вида GB8.

- и* . <а η ц· ът ч. i и _· х l .— плетка, разе на с H1V от ви-,π RP и

Λ J.

клетките се опне райето на ооразув преобразуването на рор?:азан,

BI “7 /15/ чр? з анали зиране на антиген, синтезиран в

Резултатите са представени в Таблици 1 и 2, посочени подолу

В______Цитотоксичност

Цитотоксичността на съединенията, описани в Пример 2, рацемичното съединение /ВСЕ-189, Пример ./ и сместа 50/50 от двата енан-хиипсу;. се определя в пет С04 клетъчни линии: Н9, ТЕ, СЕМ, С8166 и U937.

Съединенията, подложени на тест, се разреждат на части с от 100 vir/мл до 0.3 jv/мл /окончателни концентрации/ в микротитрови блюда- с 9S гнезда. 3-5 х 10^ клетки се заразяват във всяко гнездо на · блюдата , включително и с контроли без лекарство. След кикубироне при те г.ература J7°v в продължение иа 5 дш, количеството жизнеспособни Σ', ле тип се определя, като се вземе образец от клетъчната суспензия и се преброяват трипанозомите /trypan blue/ с изключение на клетките в хемоцитометъра.

Резултатите са представени в Таблица 3·

Таблица 1

	Актизирусна активност
Анали з	ФОрмаза!	Задържане образуването на синцити'
Клетки	МТ-4	СЕМ	СЕМ·	СЕМ	JM	С8166
Вирус	HIV-l RF	HIV-2 ROD	HIV-1 RF	HIV-1 0455	HIV-1GB8	HIV-1 RF
^/+/ енантиомер	) 0.28	0.045	0.07	0.006	0.03	0.05
/-/ енантиоме;	³ 0.20	0.055	0.04	0.008	0.05	0.01

Таблица 2

Задържане, синтеза на Н1У р2Д

'50% задържане синтеза на Н1У р2Д /иг/мл/ - · » ··
Клетки	С8166	JM	МТ-4
Вирус	RE	GB8	RF
/+/ енантиомер	0.021	0.033	0.0008
/-< енантиомер	0.016	0.016	0.0004

Ци τ ο τ ο κ с и ч н ο с τ

Таблица 3

	50% цитотоксичност	/рг/мл/
Съединение	СЕМ cells	JM cells	Н9 cells	U937 cells	C8166 cells
/+/ енантиомер	1	1.5	2 --	4	35
/V енантиомер	>100	30	>100	>100	>100
ВСН-189	3	3.5	8	15	90
Т;:1 смес от	2.5	ND*	ND	ND	ND

Не е установено

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. (-)-Цис-4-амино-1-(2-хидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)- (1Н) пиримидин-2-он или негово фармацевтично приемливо производно,.
2. Съединение съгласно претенция 1, което практически . съдържа •само - енантиомера
3. Съединение съгласно претенция 1 или 2, в което (+)-енантиомерът се съдържа в количество не повече от около 5¾ тегло/тегло.

4. Съединение съгласно всяка една от претенциите от 1 до 3, в кое - то (+)-енантиомерът се съдържа в количество не повече от около 2¾ тегло/тегло. 5. Съединение съгласно всяка една от претенциите от 1 ДО 4, в кое-

то (+)-енантиомерът се съдържа в количество по-малко от около 1¾ тегло/тегло.

6. Съединение съгласно претенция 1, което на практика е в чистата си форма.

7. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа съединение съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6, заедно с фармацевтично приемлив носител. ____

8. Приложение на съединение съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6, като ' терапевтично средство.

9. Приложение на съединение съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6 за получаване на лекарствено средство за лечение на вирусни инфекции.

10. Метод за лечение на бозайници, включително и хора, които са болни или които са податливи на вирусни инфекции, характеризиращ се с това, че се приема ефективно количество от съединение съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6.

11. Метод за получаване на съединение съгласно всяка една от претенциите от 1 до 6, характеризиращ се с това, че включва отделянето на (-)-енантиомера от смес, която съдържа и (+)-енантиомера.

12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че сместа от съединения представлява рацемична смес.

13. Метод съгласно претенция 11 или 12, характеризиращ се с това, че разделянето се осъществява чрез хирална високо ефективна течна хроматография.

14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че като неподвижна фаза се използува ацетилиран бета-циклодекстрин или целулозен триацетат.

15. Метод съгласно претенция 11 или 12, характеризиращ се с това, че разделянето се извършва чрез енантиоселективен катаболизъм с използуване на ензими.

16. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че ензимът се използува в имобилизирано състояние.

17. Метод съгласно претенция 15 или 16, характеризиращ се с това, че ензимът е цитидин деаминаза.

18. Метод съгласно претенция 15 или 16, характеризиращ се с това, че ензимът е 5’-нуклеотидаза.

Литература

1. 5-та кюнференция по проблемите на СПИН,Монреал,Канада

5-9 юни 1989,Резюмета

2. Публикация на Европейска патентна заявка £0382562

3. G.Hesse and I. Jorder» Chem.Ber.85, 924-932(1952)
4. E.G.Halloquist and H.Hibbert,Can.J.Research, 8, 129-136(1933)
5. Nucleoside Analogs-Chemistry., Biology and Medical Applications,

R.T.Walker et al.,eds,Plenum Press,New York (1979) 165-192;
6. T.Ueda in Chemistry of Nucleotides,Vpl.T,L B Townsend ed. Plenum Press,New York .(1988) , 165-192
7. Protective Groups in Organic Chemistry,Ed. J.F.W. McOmie Plenum Press (9173)
8. Protective Groups in Organic Synthesis by Theodora W. Greene (Hohn Wiley and Sons, 1981J
9. US Patent Nr.4·,383 114
10.Stereochemistry of Carboa Compounds, by E.L.Eliel)McGraw Hill 1962)
11. Tables of Resolving Agents, by S.H.Wilen;
12. Tochikura et al Virology.,164,542-546»
13. Baba et al, 1987 Biochem Biephys Res Commun,142, 128-134;
14. Mossman (1983) J.Immun Meth. 65 , 55-57