PL209765B1

PL209765B1 - Pirazynowy analog nukleotydu i jego zastosowanie

Info

Publication number: PL209765B1
Application number: PL368313A
Authority: PL
Inventors: Yousuke Furuta; Hiroyuki Egawa; Kazumi Takahashi; Yasuhiro Tsutsui; Sayuri Uehara; Makoto Murakami
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-08-14
Filing date: 2002-08-13
Publication date: 2011-10-31
Also published as: US20040235761A1; CN1551777A; EP1417967A1; PL368313A1; JP4370164B2; MXPA04001361A; CA2456292A1; BR0211900A; ZA200400925B; KR100894167B1; KR20040030099A; RU2004107499A; JPWO2003015798A1; WO2003015798A1; EP1417967A4; CN100434079C; RU2292894C2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest pirazynowy analog nukleotydu i jego zastosowanie.

Wynalazek niniejszy umożliwia hamowanie wzrostu wirusów i/lub zwalczanie wirusów.

Wirusowe choroby zakaźne (np. zakażenia wirusem grypy, zakażenia wirusem opryszczki, nabyty zespół niedoboru odporności (AIDS), wirusowe zapalenie wątroby, wirusowa gorączka krwotoczna, itd.) uznano za medycznie ważny problem, a zatem w szerokim zakresie prowadzono badania nad ich zwalczaniem, takim jak zapobieganie chorobom przez stosowanie szczepionek lub leczenie z zastosowaniem leków. Obecnie jako środki stosowane do leczenia zakażeń wirusowych opracowano wiele kwasów nukleinowych mających zasady purynowe i pirymidynowe i ich pochodne. Mechanizm działania tych środków polega na tym, że ulegają one trifosforylacji w komórkach i hamują wirusową polimerazę. Przykłady takich środków obejmują azydotymidynę i acyklowir [Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 83, str. 8333 do 8337 (1986); ta sama publikacja, vol. 74, str. 5716 do 5720 (1977)].

Doniesiono ponadto, że aktywna postać związku ma działanie przeciwwirusowe, gdy odpowiadająca zasadom część kwasu nukleinowego ulega konwersji w nienaturalną strukturę chemiczną, jest formą monofosforylowaną otrzymaną w wyniku konwersji związku w komórce, która hamuje dehydrogenazę inozynomonofosforanową (IMPDH) w komórce. Przykłady takich związków mogą obejmować rybawirynę i EICAR [Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 70, str. 1174 do 1178 (1973); The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), vol. 268, str. 24591 do 24598 (1993)].

Ponadto, jako przykład analogów nukleozydu i nukleotydu mających pierścień pirazynowy jako zasadę, znany jest związek o następującym wzorze:

w którym R¹⁶ oznacza atom wodoru, grupę metylową lub grupę decylową. Jednakże, związek ten nie wykazuje działania przeciwwirusowego (brak aktywności przeciwko wirusowi Visna [Nucleosides & Nucleodites, Vol. 15, Nr 11 i 12, str. 1849 do 1861 (1996)].

Z drugiej strony, nie są znane analogi nukleozydów i nukleotydów zawierające pierścień pirazynowy, który jest podstawiony grupą karbamoilową.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczanie wysoce bezpiecznego środka przeciwwirusowego o niskiej toksyczności, który ma nienaturalną strukturę chemiczną w części kwasu nukleinowego odpowiadającej zasadom i jego zastosowania.

Wynalazek dotyczy pirazynowego analogu nukleotydu przedstawionego następującym ogólnym wzorem [1z], lub jego soli:

PL 209 765 B1 w którym R¹ oznacza atom wodoru; atom fluorowca, grupę alkilową lub grupę arylową ; R² oznacza atom wodoru; każdy R³, R⁴, R⁵ i R⁶ jest taki sam lub różny i oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową; R oznacza grupę hydroksylową; A oznacza atom tlenu; a n oznacza liczbę całkowitą 3, pod warunkiem, że wyłączony jest związek, w którym R¹ oznacza atom wodoru; R² oznacza atom wodoru; R³ i R⁵ oznaczają atom wodoru; R⁴ i R⁶ oznaczają grupę hydroksylową; R oznacza grupę hydroksylową; A oznacza atom tlenu, a n oznacza liczbę całkowitą 3. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania pirazynowego analogu nukleotydu przedstawionego ogólnym wzorem [1z] określonego powyżej, lub jego soli, do wytwarzania środka przeciwwirusowego.

Korzystnie pirazynowy analog nukleotydu o wzorze 1z ma działanie hamujące na pochodzącą od wirusa polimerazę RNA o 200 razy lub więcej selektywne niż działanie hamujące na polimerazę RNA pochodzącą od gospodarza.

Korzystnie ten środek przeciwwirusowy hamuje polimerazę RNA, pochodzącą od wirusa grypy, wirusa RS, wirusa AIDS, wirusa brodawczaka, adenowirusa, wirusa zapalenia wątroby A, wirusa zapalenia wątroby B, wirusa zapalenia wątroby C, wirusa zapalenia wątroby E, poliowirusa, echowirusa, wirusa Coxsackie, enterowirusa, wirusa nieżytu nosa, rotawirusa, wirusa choroby Newcastle, wirusa świnki, wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, wirusa wścieklizny, wirusa Lassa, wirusa odry, filowirus, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa żółtej febry, wirusa dengi lub wirusa gorączki zachodniego Nilu, a korzystniej hamuje polimerazę RNA pochodzącą od wirusa grypy lub wirusa zapalenia wątroby C.

Twórcy niniejszego wynalazku zbadali również sposób hydrolizowania lub rozkładu in vivo lub w komórce pirazynowego analogu nukleotydu przedstawionego następującym ogólnym wzorem [2], lub jego soli:

w którym każdy R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ i A mają podane wyżej znaczenia; Y oznacza atom tlenu, a każdy R⁷ i R⁸ w grupie kwasu fosforowego niezależnie oznacza chronioną lub niechronioną, podstawioną lub niepodstawioną grupę hydroksylową, która ulega rozkładowi w warunkach fizjologicznych, a następnie tak otrzymany produkt w wyniku działania kinazy, takiej jak kinaza nukleotydowa, ulega konwersji w trifosforanowy pirazynowy analog nukleotydu o ogólnym wzorze [1z], lub w jego sól, wykazując efekt hamowania polimerazy RNA i w konsekwencji działanie hamujące wzrost wirusów i/lub wirusobójcze.

Powyższy związek in vivo lub w komórce ulega konwersji w trifosforanowy pirazynowy analog nukleotydu przedstawiony następującym wzorem ogólnym [1y]:

10 którym R¹ oznacza atom wodoru atom fluorowca lub grupę alkilową lub grupę arylową; a każdy Z¹⁰, Z¹¹, Z¹² i Z¹³, który może być taki sam lub różny oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową i wyka4

PL 209 765 B1 zuje działanie hamujące polimerazę RNA. Związek przedstawiony poniższym wzorem ogólnym [1x] jest prekursorem inhibitora polimerazy RNA, który in vivo lub w komórce ulega konwersji w związek przedstawiony ogólnym wzorem [1x]:

₁ w którym to wzorze [1x] R¹ oznacza atom wodoru, atom fluorowca, grupę alkilową lub grupę arylową ; R² oznacza atom wodoru; każdy R³, R⁴, R⁵ i R⁶, który może być taki sam lub różny, oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową; A oznacza atom tlenu; Y oznacza atom tlenu; a m oznacza liczbę całkowitą 0 do 2.

Prekursor inhibitora polimerazy RNA, którym jest pirazynowy analog nukleotydu o wzorze [1x] hamuje polimerazę RNA pochodzącą od wirusa z selektywnością o wiele wyższą niż polimerazę RNA pochodzącą od gospodarza. Niniejszy prekursor inhibitora polimerazy RNA może hamować polimerazę RNA pochodzącą od wirusa z selektywnością korzystnie wyższą 200-krotnie lub więcej, bardziej korzystnie 1000-krotnie lub więcej, jeszcze bardziej korzystnie 2000-krotnie lub więcej, niż polimerazę RNA pochodzącą od gospodarza. Ponadto, prekursor inhibitora polimerazy RNA prawie nie hamuje dehydrogenazy inozynomonofosforanowej, a po konwersji in vivo w formę trifosforylowaną hamuje polimerazę wirusową. A zatem, niniejszy prekursor inhibitora polimerazy RNA po konwersji in vivo charakteryzuje się wyjątkowo silnym działaniem hamującym wirusową polimerazę jak również wysoką selektywnością, podczas gdy cytotoksyczność spowodowana przez hamowanie dehydrogenazy inozynomonofosforanowej jest w najwyższym stopniu zmniejszona. Wykorzystując tę wysoką selektywność można otrzymać wysoce bezpieczny środek.

Prekursor inhibitora polimerazy RNA ma wyjątkowo wysoką selektywność wobec polimerazy RNA i dehydrogenazy inozynomonofosforanowej. Dla pirazynowego analogu nukleotydu pirazynowego analogu mononukleotydu o strukturze przedstawionej następującym ogólnym wzorem [1w]:

w którym R¹ oznacza atom wodoru, atom fluorowca, grupę alkilową lub grupę arylową; R² oznacza atom wodoru; każdy z R³, R⁴, R⁵ i R⁶, który może być taki sam lub różny, oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową; Y oznacza atom tlenu; a p oznacza 0 lub 1 stosunek działania hamującego wirusową polimerazę RNA po konwersji prekursora in vivo do działania hamującego dehydrogenazę inozynomonofosforanową pochodzącą z komórek gospodarza korzystnie wynosi 900:1 lub powyżej, bardziej korzystnie 5000:1 lub powyżej, a jeszcze bardziej korzystnie 10 000:1 lub powyżej.

Twórcy niniejszego wynalazku potwierdzili, że gdy każdy R¹, R³ i R⁵ oznacza atom wodoru, a każ dy R^4Z, R^6Z i R^Z oznacza grupę hydroksylową , na przykł ad, jak w pirazynowej pochodnej nukleozydu przedstawionej następującym wzorem ogólnym [3z]:

PL 209 765 B1

w którym każdy R¹, R², R³, R⁵ i Y mają to samo znaczenie jak wyżej podane; R^Z oznacza chronioną lub niechronioną, podstawioną lub niepodstawioną grupę hydroksylową, która rozkłada się w warunkach fizjologicznych; każdy z R^4Z i R^6Z są takie same lub różne i oznaczają atom wodoru lub grupę hydroksylową, która może być podstawiona lub chroniona, albo R^4Z i R^6Z razem oznaczają grupę przedstawioną jako -O-alkileno-O-, która może być podstawiona i gdy związek taki podaje się zwierzęciu, w osoczu krwi zwierzęcia tworzy się 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamid (nomenklatura zastępcza: 3,4-dihydro-3-okso-4-e-D-rybofuranozylo-2-pirazynokarboksamid).

Co więcej, twórcy niniejszego wynalazku potwierdzili, że gdy pirazynowy analog nukleozydu przedstawiony ogólnym wzorem [3z], lub jego sól, taki jak 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamid, podaje się zwierzęciu, wówczas w organizmie zwierzęcia wytwarza się trifosforan {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu.

Tak więc, twórcy stwierdzili, że gdy podaje się ssakom związek przedstawiony ogólnym wzorem [3z] lub jego sól, albo związek przedstawiony ogólnym wzorem [2] lub jego sól, aby in vivo wytworzył się pirazynowy analog nukleotydu o ogólnym wzorze [1z], lub jego sól, uzyskuje się nowe działanie hamujące wzrost wirusów i/lub działanie wirusobójcze, które jest podstawą niniejszego wynalazku.

Sposób wykorzystujący pirazynowy analog nukleotydu jest użyteczny jako sposób leczenia pacjentów zakażonych wirusami i obejmuje on etap podawania pacjentowi zakażonemu wirusami opisanego powyżej pirazynowego analogu nukleotydu lub pirazynowego analogu nukleozydu, albo ich soli, takiego jak związek przedstawiony ogólnym wzorem [3z] lub jego sól. Bardziej korzystnie, sposób ten obejmuje ponadto konwersję powyższego związku lub jego soli w pirazynotrifosforanowy analog nukleotydu przedstawiony ogólnym wzorem [1y].

Ponadto, co jest szczególnie korzystne, w organizmie zakażonego wirusem pacjenta, związek o ogólnym wzorze [3z] ulega konwersji w pirazynotrifosforanowy analog nukleotydu przedstawiony ogólnym wzorem [1y] przez pirazynowy analog nukleotydu przedstawiony ogólnym wzorem [1v]:

w którym R¹ oznacza atom wodoru atom fluorowca, grupę alkilową lub grupę arylową; a każdy z Z¹⁰, Z¹¹, Z¹² i Z¹³, który może być taki sam lub różny, oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową. Pirazynowy analog nukleotydu przedstawiony ogólnym wzorem [1v] charakteryzuje się tym, że zasadniczo

PL 209 765 B1 nie hamuje dehydrogenazy inozynomonofosforanowej pochodzącej z komórek gospodarza. Ponadto, pirazynotrifosforanowy analog nukleotydu przedstawiony wzorem ogólnym [1y] charakteryzuje się tym, że hamuje wirusową polimerazę RNA z selektywnością większą niż polimerazę RNA pochodzącą z komórek gospodarza.

Ponadto, w wyniku intensywnych badań dotyczących bezwodnych postaci 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu, twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że monohydrat 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu ma doskonałą stabilność w procesie wytwarzania preparatu farmaceutycznego. Hydrat ten jest kryształ em, który jest trwał y podczas wytwarzania preparatu farmaceutycznego zwykłymi sposobami i w porównaniu z postaciami bezwodnymi ma mniejszą zdolność do tworzenia proszku i nie przylega do aparatury podczas wytwarzania preparatu. Zatem, umożliwia on dobre mieszanie i granulowanie.

W procesie wytwarzania preparatu farmaceutycznego na ogół stosuje się granulowanie na mokro. Podczas granulacji na mokro zwykle stosuje się wodę i wodny roztwór zawierający substancję wiążącą. Jednakże, jak wiadomo, gdy stosuje się postać bezwodną, w zależności od warunków część jej ulega konwersji w hydrat. Ponadto, wytworzona w takim procesie amorficzna substancja powoduje problem z punktu widzenia przygotowania preparatu farmaceutycznego lub jego stabilności. A zatem, gdy hydrat występuje jako polimorficzny kryształ, do wytworzenia środka farmaceutycznego z postaci bezwodnej wymagane są ścisłe warunki. Jednakże, monohydrat jest kryształem trwałym w typowym procesie wytwarzania preparatu farmaceutycznego, a zatem jest on doskonałym związkiem, który nie stwarza opisanych powyżej problemów.

Ponadto, monohydrat taki nie potrzebuje organicznego rozpuszczalnika w końcowym procesie wytwarzania, ale można go krystalizować z wody. Zatem, ryzyko, że w końcowym krysztale pozostaną rozpuszczalniki organiczne, jest niskie. Ponadto, ponieważ monohydrat nie wymaga organicznego rozpuszczalnika, nie ma potrzeby stosowania wyposażenia odpornego na eksplozję. Zatem, można powiedzieć, że związek ten ma duże zalety w procesie wytwarzania.

Jeśli nie stwierdzono inaczej, stosowane w niniejszym opisie określenie „atom fluorowca” oznacza atom fluoru, atom chloru i atom jodu; „grupa alkilowa” oznacza niższą grupę alkilową, na przykład, grupę C1-5 alkilową, taką jak metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, izobutyl, sec-butyl, tert-butyl i pentyl; „grupa alkoksylowa” oznacza niższą grupę alkoksylową, na przykład, grupę C1-5 alkoksylową, taką jak metoksyl, etoksyl, n-propoksyl, izopropoksyl, n-butoksyl, izobutoksyl, sec-butoksyl, tert-butoksyl i pentyloksyl; „grupa alkoksykarbonylowa” oznacza niższą grupę alkoksykarbonylową, na przykład, grupę C1-5 alkoksykarbonylową, taką jak metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, n-propoksykarbonyl, izopropoksykarbonyl, n-butoksykarbonyl, izobutoksykarbonyl, sec-butoksykarbonyl, tertbutoksykarbonyl, 4-hydroksybutoksykarbonyl i pentyloksykarbonyl; „grupa alkiloaminowa” oznacza, na przykład, grupę mono- lub di-C1-5 alkiloaminową, taką jak grupa metyloaminowa, etyloaminowa, propyloaminowa, dimetyloaminowa, dietyloaminowa i metyloetyloaminowa; „grupa halogenoalkilowa” oznacza, na przykład, grupę halogeno-C1-5 alkilową, taką jak fluorometyl, chlorometyl, bromometyl, dichlorometyl, trifluorometyl, trichlorometyl, chloroetyl, dichloroetyl, trichloroetyl i chloropropyl; „grupa karbamoiloalkilowa” oznacza, na przykład, grupę C1-5 karbamoiloalkilową, taką jak karbamoilometyl, karbamoiloetyl, karbamoilo-n-propyl, karbamoiloizopropyl, karbamoilo-n-butyl, karbamoiloizobutyl i karbamoilopentyl; „grupa karboksyalkilowa” oznacza, na przykł ad, grupę C1-5 karboksyalkilową , taką jak karboksymetyl, karboksyetyl, karboksy-n-propyl, karboksyizopropyl, karboksy-n-butyl, karboksyizobutyl i karboksypentyl; „grupa alkenylowa” oznacza, na przykład, grupę C2-5 alkenylową, taką jak winyl i allil; „grupa cykloalkilowa” oznacza, na przykład, grupę C3-6 cykloalkilową, taką jak cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl i cykloheksyl; „grupa cykloalkiloksylowa” oznacza, na przykład, grupę C3-6 cykloalkiloksylową, taką jak cyklopropyloksyl, cyklobutyloksyl, cyklopentyloksyl i cykloheksyloksyl; „grupa arylowa” oznacza, na przykład, grupę taką jak fenyl i naftyl; „grupa heterocykliczna” oznacza, na przykład, 4- do 6-członową lub skondensowaną grupę heterocykliczną zawierającą co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród atomu tlenu, atomu azotu i atomu siarki, taką jak azetydynyl, tienyl, furyl, pirolil, imidazolil, pirazolil, tiazolil, izotiazolil, oksazolil, izoksazolil, furazanyl, pirolidynyl, pirolinyl, imidazolidynyl, imidazolinyl, pirazolidynyl, pirazolinyl, 1,3,4-oksadiazolil, 1,2,3-tiadiazolil, 1,2,4-tiadiazolil, 1,3,4-tiadiazolil, 1,2,3-triazolil, 1,2,4-triazolil, tiatriazolil, pirydyl, pirazynyl, pirymidynyl, pirydazynyl, piranyl, morfolinyl, 1,2,4-triazynyl, benzotienyl, naftotienyl, benzofuryl, izobenzofuryl, chromenyl, indolizynyl, izoindolil, indolil, indazolil, purynyl, chinolil, izochinolil, ftalazynyl, naftylidynyl, chinoksalinyl, chinazolinyl, cynolinyl, pterydynyl, izochromanyl, chromanyl, indolinyl, izoindolinyl,

PL 209 765 B1 benzoksazolil, triazolopirydyl, tetrazolopirydazynyl, tetrazolopirymidynyl, tiazolopirydazynyl, tiadiazolopirydazynyl, triazolopirydazynyl, benzimidazolil, benzotiazolil, 1,2,3,4-tetrahydrochinolil, imidazo[1,2-b][1,2,4]triazynyl i chinuklidynyl; „grupa alkilenowa” oznacza, na przykład, prostą lub rozgałęzioną grupę C1-5 alkilenową, taką jak metylen, etylen i propylen; „grupa alkilotio” oznacza, na przykład, prostą lub rozgałęzioną grupę C1-5 alkilotio, taką jak grupa metylotio, etylotio, n-propylotio, izopropylotio, n-butylotio, izobutylotio, sec-butylotio, tert-butylotio i pentylotio; „grupa aryloksylowa” oznacza, na przykład, grupę reprezentowaną przez arylo-O-, taką jak fenoksyl i naftoksyl; „grupa arylotio” oznacza, na przykład, grupę reprezentowaną przez arylo-S-, taką jak grupa fenylotio i naftylotio; „grupa aryloaminowa” oznacza, na przykład, grupę fenyloaminową i naftyloaminową; „grupa cykloalkiloaminowa” oznacza, na przykład, grupę C3-6 cykloalkiloaminową, taką jak grupa cyklopropyloaminowa, cyklobutyloaminowa, cyklopentyloaminowa i cykloheksyloaminowa; „grupa acylowa” oznacza, na przykład, grupę C2-6 alkanoilową, taką jak formyl, acetyl lub propionyl, grupę aroilową, taką jak benzoil lub naftoil i heterocykliczną grupę karbonylową, taką jak nikotynoil, tenoil, pirolidynokarbonyl lub furoil; „grupa acyloksylowa” oznacza, na przykład, grupę C2-6 alkanoiloksylową, taką jak acetyloksyl lub propionyloksyl, grupę aroiloksylową, taką jak benzoiloksyl lub naftoiloksyl, oraz heterocykliczną grupę karbonyloksylową, taką jak nikotynoiloksyl, tenoiloksyl, pirolidynokarbonyloksyl i furoiloksyl; „grupa arylosulfonyloksylowa” oznacza, na przykład, grupę taką jak fenylosulfonyloksyl i p-toluenosulfonyloksyl; „grupa alkilosulfonyloksylowa” oznacza, na przykład, prostą lub rozgałęzioną grupę C1-5 alkilosulfonyloksylową, taką jak metylosulfonyloksyl, etylosulfonyloksyl, n-propylosulfonyloksyl, izopropylosulfonyloksyl, n-butylosulfonyloksyl, izobutylosulfonyloksyl, sec-butylosulfonyloksyl, tert-butylosulfonyloksyl i pentylosulfonyloksyl, odpowiednio.

W opisanym tu wzorze ogólnym podstawniki R¹ pierś cienia pirazynowego obejmują grupę wybraną spośród atomu halogenu; grupy alkilowej, grupy arylowej przy czym jedna lub więcej spośród takich grup mogą być podstawione.

Grupy ochronne oraz podstawniki grupy hydroksylowej R^Z we wzorze [3z] obejmują, na przykład, grupę acylową, która może być podstawiona, niższą grupę alkoksykarbonylową oraz grupę acyloksyalkilową, a bardziej konkretnie grupę acylową, która może być podstawiona, taką jak acetyl, propionyl, waleryl, benzoil, piwaloil, 2-aminoacetyl, 2-aminopropionyl, 2-aminowaleryl i 2-aminokaproil; niższą grupę alkoksykarbonylową, taką jak metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, n-propoksykarbonyl, izopropoksykarbonyl, n-butoksykarbonyl, izobutoksykarbonyl, sec-butoksykarbonyl, tert-butoksykarbonyl i 4-hydroksybutoksykarbonyl; oraz grupę acyloksyalkilową, taką jak acetyloksymetyl, propionyloksymetyl, izopropionyloksymetyl, butyryloksymetyl, izobutyryloksymetyl, waleryloksymetyl, izowaleryloksymetyl, piwaloiloksymetyl i 1-piwaloiloksyetyl.

W grupie fosforanowej R⁷ i R⁸ we wzorze [2], oznacza grupę ochronną lub podstawnik grupy hydroksylowej, które rozkładają się w warunkach fizjologicznych, a grupą R we wzorze [1z], która jest rozkładalna w takich warunkach, jest na przykład, grupa ochronna lub podstawnik grupy fosforanowej, jak opisany w publikacjach Progress in Medicinal Chemistry, vol. 34, str. 111-147 (1997), Elsevier Science B.V. oraz Current Medicinal Chemistry, vol. 7, str. 995-1039 (2000). Konkretne przykłady obejmują grupę arylową, taką jak fenyl, chlorofenyl, nitrofenyl, cyjanofenyl, naftyl; grupę cyklosaligenylową, taką jak cyklosaligenyl, 5-metylocyklosaligenyl; grupę amidanową, taką jak metoksyalaninyl i fenoksyalaninyl; grupę halogenoetylow ą , taką jak trichloroetyl; grupę acyloksyalkilową , taką jak acetyloksymetyl, propionyloksymetyl, izopropionyloksymetyl, butyryloksymetyl, izobutyryloksymetyl, waleryloksymetyl, izowaleryloksymetyl, piwaloiloksymetyl i 1-piwaloiloksyetyl; grupę acyloksybenzylową, taką jak acetyloksybenzyl, propionyloksybenzyl, izopropionyloksybenzyl, butyryloksybenzyl, izobutyryloksybenzyl, waleryloksybenzyl, izowaleryloksybenzyl, piwaloiloksybenzyl; grupę s-niższą acylotioalkilową, taką jak acetylotioetyl, propionylotioetyl, izopropionylotioetyl, butyrylotioetyl, izobutyrylotioetyl, walerylotioetyl, izowalerylotioetyl, piwaloilotioetyl i piwaloilotiobutyl; grupę s-wyższą acylotioalkilową, taką jak lauroilotioetyl; grupę s-aroilotioalkilową, taką jak benzoilotioetyl i naftoilotioetyl i grupę ditiodietylową.

Określenie „rozkłada się w warunkach fizjologicznych” oznacza rozkład pod wpływem działania enzymu, takiego jak esteraza, fosfodiesteraza, fosfonoamidaza, hydrolaza, aminohydrolaza, transaminaza lub reduktaza, jak również w warunkach fizjologicznej reakcji utleniania, hydrolizy i/lub redukcji.

Przykłady kinazy obejmują kinazę nukleotydową, kinazę nukleozydową, fosfotransferazę nukleozydową oraz 5'-nukleotydazę.

Określenie „prekursor” oznacza substancję, z której wytwarza się farmakologicznie aktywna substancja na drodze konwersji/rozkładu in vivo.

PL 209 765 B1

Przykłady grupy ochronnej dla grupy karboksylowej obejmują wszystkie grupy, które mogą być stosowane jako zwykłe grupy ochronne dla grupy karboksylowej, na przykład, niższą grupę alkilową, taką jak metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, 1,1-dimetylopropyl, n-butyl oraz tert-butyl; grupę arylową, taką jak fenyl i naftyl; grupę arylo-niższą alkilową, taką jak benzyl, difenylometyl, trityl, p-nitrobenzyl, p-metoksybenzyl i bis(p-metoksyfenylo)metyl; grupę acylo-niższą alkilową, taką jak acetylometyl, benzoilometyl, p-nitrobenzoilometyl, p-bromobenzoilometyl i p-metanosulfonylobenzoilometyl; grupę heterocykliczną zawierającą tlen, taką jak 2-tetrahydro-piranyl i 2-tetrahydrofuranyl; niższą grupę alkilową podstawioną halogenem, taką jak 2,2,2-trichloroetyl; grupę niższą alkilosililoalkilową, taką jak 2-(trimetylosililo)etyl; grupę acyloksyalkilową, taką jak acetoksymetyl, propionyloksymetyl i piwaloiloksymetyl; niższą grupę alkilową podstawioną grupą heterocykliczną zawierającą azot, taka jak ftalimidometyl i sukcynimidometyl; grupę cykloalkilową, taką jak cykloheksyl; grupę niższą alkilową podstawioną niższą grupą alkoksylową, taką jak metoksymetyl, metoksyetoksymetyl i 2-(trimetylosililo)etoksymetyl; grupę arylo-niższą alkoksy niższą alkilową, taką jak benzyloksymetyl; grupę niższą alkilotio-niższą alkilową, taką jak metylotiometyl i 2-metylotioetyl; grupę arylotio-niższą alkilową, taką jak fenylotiometyl; niższą grupę alkenylową, taką jak 1,1-dimetylo-2-propenyl, 3-metylo-3-butynyl; i grupę arylową; oraz podstawioną grupę sililową , taką jak trimetylosilil, trietylosilil, triizopropylosilil, dietyloizopropylosilil, tert-butylodimetylosilil, tert-butylodifenylosilil, difenylometylosilil i tert-butylometoksyfenylosilil.

Przykłady grupy ochronnej dla grupy aminowej i grupy iminowej obejmują wszystkie grupy, które mogą być zwykle stosowane jako grupy ochronne dla grupy aminowej, na przykład, grupę acylową, taką jak trichloroetoksykarbonyl, tribromoetoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl, p-nitrobenzyloksykarbonyl, o-bromobenzyloksykarbonyl, (mono-, di-, tri-)chloroacetyl, trifluoroacetyl, fenyloacetyl, formyl, acetyl, benzoil, tert-amyloksykarbonyl, tert-butoksykarbonyl, p-metoksybenzyloksykarbonyl, 3,4-dimetoksybenzyloksykarbonyl, 4-(fenylazo)benzyloksykarbonyl, 2-furfuryloksykarbonyl, difenylometoksykarbonyl, 1,1-dimetylopropoksykarbonyl, izopropoksykarbonyl, ftaloil, sukcynyl, alanyl, leucyl, 1-adamantyloksykarbonyl i 8-chinoliloksykarbonyl; grupę arylo-niższą alkilową, taką jak benzyl, difenylometyl i trityl; grupę arylotio, taką jak 2-nitrofenylotio i 2,4-dinitrofenylotio; grupę alkano- i arenosulfonylową, taką jak metanosulfonyl i p-toluenosulfonyl; grupę di-niższą alkiloamino-niższą alkilidenową, taką jak N,N-dimetyloaminometylen; grupę arylo-niższą alkilidenową, taką jak benzyliden, 2-hydroksybenzyliden, 2-hydroksy-5-chlorobenzyliden i 2-hydroksy-1-naftylometylen; zawierającą azot heterocykliczną grupę alkilidenową, taką jak 3-hydroksy-4-pirydylometylen; grupę cykloalkilidenową, taką jak cykloheksyliden, 2-etoksykarbonylocykloheksyliden, 2-etoksykarbonylocyklopentyliden, 2-acetylocykloheksyliden i 3,3-dimetylo-5-oksycykloheksyliden; grupę diarylo- lub diarylo-niższą alkilofosforylową, taką jak difenylofosforyl i dibenzylofosforyl; zawierającą tlen heterocykliczną grupę alkilową, taką jak 5-metylo-2-okso-2H-1,3-dioksol-4-ilometyl; oraz grupę sililową podstawioną niższą grupą alkilową, taką jak trimetylosilil.

Przykłady grup ochronnych dla grupy hydroksylowej obejmują wszystkie grupy, które na ogół mogą być stosowane jako grupy ochronne dla grupy hydroksylowej, na przykład, grupę acylową, taką jak benzyloksykarbonyl, 4-nitrobenzyloksykarbonyl, 4-bromobenzyloksykarbonyl, 4-metoksybenzyloksykarbonyl, 3,4-dimetoksybenzyloksykarbonyl, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, tert-butoksykarbonyl, 1,1-dimetylopropoksykarbonyl, izopropoksykarbonyl, izobutyloksykarbonyl, difenylometoksykarbonyl, 2,2,2-trichloroetoksykarbonyl, 2,2,2-tribromoetoksykarbonyl, 2-(trimetylosililo)etoksykarbonyl, 2-(fenylosulfonylo)etoksykarbonyl, 2-(trifenylofosfonio)etoksykarbonyl, 2-furfuryloksykarbonyl, 1-adamantyloksykarbonyl, winyloksykarbonyl, alliloksykarbonyl, S-benzylotiokarbonyl, 4-etoksy-1-naftyloksykarbonyl, 8-chinoliloksykarbonyl, acetyl, formyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, trifluoroacetyl, metoksyacetyl, fenoksyacetyl, piwaloil i benzoil; niższą grupę alkilową, taką jak metyl, tert-butyl, 2,2,2-trichloroetyl i 2-trimetylosililoetyl; niższą grupę alkenylową, taką jak allil; grupę arylo-niższą alkilową, taką jak benzyl, p-metoksybenzyl, 3,4-dimetoksybenzyl, difenylometyl i trityl; grupę heterocykliczną zawierającą tlen i siarkę, taką jak tetrahydrofuryl, tetrahydropiranyl i tetrahydrotiopiranyl; grupę niższą alkoksy- i niższą alkilotio-niższą alkilową, taką jak metoksymetyl, metylotiometyl, benzyloksymetyl, 2-metoksyetoksymetyl, 2,2,2-trichloroetoksymetyl, 2-(trimetylosililo)-etoksymetyl i 1-etoksyetyl; grupę alkilo- i arylo-sulfonylową, taką jak metanosulfonyl i p-toluenosulfonyl; oraz podstawioną grupę sililową, taką jak trimetylosilil, trietylosilil, triizopropylosilil, dietyloizopropylosilil, tert-butylodimetylosilil, tert-butylodifenylosilil, difenylometylosilil i tert-butylometoksyfenylosilil, a w przypadku grupy dihydroksylowej obejmują ponadto niższą grupę alkilidenową, taką jak metylen, benzyliden

PL 209 765 B1 i izopropyliden, grupę niższą alkoksy-niższą alkilidenową, taką jak metoksymetylen oraz grupę sililową podstawioną niższą grupą alkilową, taką jak 1,1,3,3-tetraizopropylodisiloksanyliden.

Przykłady soli związków o ogólnym wzorze [1z] i o ogólnym wzorze [2] obejmują sole znanych grup zasadowych, takich jak grupa aminowa, lub grup kwasowych, takich jak grupa hydroksylowa, fosforylowa, lub karboksylowa. Sole grup zasadowych obejmują, na przykład, sól z kwasem mineralnym, takim jak kwas solny, kwas bromowodorowy i kwas siarkowy; sól z organicznym kwasem karboksylowym, takim jak kwas winowy, kwas mrówkowy i kwas cytrynowy; oraz sól z kwasem sulfonowym, takim jak kwas metanosulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas mezytylenosulfonowy oraz kwas naftalenosulfonowy. Sole grup kwasowych obejmują, na przykład, sól z metalem alkalicznym, takim jak sód i potas; sól z metalem ziem alkalicznych, takim jak wapń i magnez; sól amonową; jak również sól z organiczną zasadą zawierającą azot, taką jak trimetyloamina, trietyloamina, tributyloamina, pirydyna, N,N-dimetyloanilina, N-metylopiperydyna, N-metylomorfolina, dietyloamina, dicykloheksyloamina, prokaina, dibenzyloamina, N-benzylo-e-fenetyloamina, 1-efenamina oraz N,N'-dibenzyloetylenodiamina.

Przykłady wirusów, których wzrost można zahamować i/lub które można zwalczyć z zastosowaniem pirazynowego analogu nukleotydu według wynalazku, obejmują wirus grypy, wirus RS, wirus AIDS, wirus brodawczaka, adenowirus, wirus zapalenia wątroby A, wirus zapalenia wątroby B, wirus zapalenia wątroby C, wirus zapalenia wątroby E, poliowirus, echowirus, wirus Coxsackie, enterowirus, wirus nieżytu nosa, rotawirus, wirus choroby Newcastle, wirus świnki, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, wirus wścieklizny, wirus Lassa, wirus odry, filowirus, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus żółtej febry, wirus dengi lub wirus gorączki zachodniego Nilu. Korzystnie, przykłady takich wirusów obejmują wirus grypy, wirus RS, wirus zapalenia wątroby A, wirus zapalenia wątroby C, wirus zapalenia wątroby E, poliowirus, echowirus, wirus Coxsackie, enterowirus, wirus nieżytu nosa, rotawirus, wirus choroby Newcastle, wirus świnki, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, wirus wścieklizny, wirus Lassa, wirus odry, filowirus, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus żółtej febry, wirus dengi lub wirus gorączki zachodniego Nilu. Szczególnie korzystnie, przykłady wirusów obejmują wirus grypy i wirus zapalenia wątroby C.

Korzystne związki według wynalazku obejmują związki zawierające wymienione poniżej podstawniki.

W każdym z podanych tu ogólnych wzorów korzystne przykłady podstawnika R¹ mogą obejmować atom wodoru, atom fluorowca, niższą grupę alkilową, bardziej korzystnie atom wodoru, atom fluoru i atom chloru, a jeszcze bardziej korzystnie atom wodoru.

Przykłady korzystnego podstawnika dla każdego spośród R³, R⁴, R⁵ i R⁶ mogą obejmować atom wodoru i grupę hydroksylową, która może być podstawiona niższą grupą alkoksykarbonylową, grupą acetylową, grupą benzoilową lub piwaloiloksymetylową, bardziej korzystnie atom wodoru i grupę hydroksylową, która może być podstawiona grupą acetylową lub benzoilową, a jeszcze korzystniej atom wodoru i grupę hydroksylową.

Przykłady korzystnego podstawnika dla każdego spośród R^4Z i R^6Z mogą obejmować te same podstawniki, jak opisane dla R⁴ i R⁶ oraz grupę metylenową, przy czym obydwa R^4Z i R^6Z mogą być podstawione.

Przykłady korzystnego podstawnika R^Z mogą obejmować grupę hydroksylową, która może być podstawiona acylem, który może być podstawiony niższą grupą alkoksykarbonylową lub grupą acyloksyalkilową, bardziej korzystnie grupę hydroksylową, która może być podstawiona grupą izowalerylową, acetylową lub propionylową, która może być podstawiona grupą aminową, która może być zablokowana, grupą benzoilową, grupą piwaloilową, grupą etoksykarbonylową, grupą izopropyloksykarbonylową lub piwaloiloksymetylową, a jeszcze korzystniej obejmują grupę hydroksylową, która może być podstawiona grupą izowalerylową, acetylową lub benzoilową, która może być podstawiona grupą aminową.

Przykłady korzystnego podstawnika dla każdego spośród R⁷ i R⁸ mogą obejmować grupę hydroksylową, która może być podstawiona grupą cyklosaligenylową, piwaloiloksymetylową, 1-piwaloiloksyetylową lub S-piwaloilo-2-tioetylową.

Korzystnym przykładem związku przedstawionego ogólnym wzorem [3z] jest zwłaszcza związek przedstawiony ogólnym wzorem [3z']:

PL 209 765 B1

w którym R^a oznacza atom wodoru lub atom fluorowca; a każdy R^b i R^c, identyczny lub różny, oznacza atom wodoru lub grupę ochronną dla hydroksylu, albo R^b i R^c razem oznaczają grupę alkilenową, która może być podstawiona. Bardziej korzystny jest związek o wzorze [3z'], w którym każdy spośród R^a, R^b i R^c oznacza atom wodoru.

Pirazynowy analog nukleotydu przedstawiony ogólnym wzorem [2], lub jego sól, można wytworzyć znanymi sposobami, sposobami równoważnymi lub stosując kombinację tych sposobów. Przykłady publikacji, w których opisano takie sposoby wytwarzania, obejmują Antiviral Research, vol. 24, str. 69 do 77 (1994); Antiviral Chemistry, vol. 9, str. 389 do 402 (1998); Journal of Chemical Society Perkin Transaction (J. Chem. Soc. PERKIN TRANS.), vol. 1, str. 1239 do 1245 (1993); oraz patent USA nr 5770725. Ponadto, związek o wzorze [2] można również wytworzyć zgodnie ze sposobami wytwarzania 1 do 5, jak opisano poniżej.

[Sposób wytwarzania 1]

2 7 8 1 2 3 4 gdzie każdy R¹, R², R⁷ i R⁸ ma podane wyżej znaczenie; a każdy Z¹, Z², Z³ i Z^{4 * *}, identyczny lub różny, oznacza atom wodoru lub chronioną grupę hydroksylową, jednak gdy Z¹, Z², Z³ i Z⁴ zawierają grupy hydroksylowe związane z dwoma lub więcej różnymi atomami węgla, wówczas atomy tlenu każdej grupy hydroksylowej i atomy węgla, z którymi grupa hydroksylowa jest związana, tworzą razem z grupami ochronnymi pierścień, że mogą być zablokowane.

(a) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [2a], lub jego sól, można otrzymać przez (1) reakcję związku przedstawionego ogólnym wzorem [3a], lub jego soli, z czynnikiem fosforylującym, w obecnoś ci lub bez dodatków, albo (2) przez reakcję powyż szego zwią zku, lub jego soli, z czynnikiem fosfitylującym, w obecności albo bez dodatków, a następnie przez reakcję z czynnikiem utleniającym, zgodnie ze sposobem opisanym np. w publikacji 4^th Jikken Kagaku Koza. vol. 22, str. 313 do 438 (1992).

(b) W sposobie według (1) powyżej, nie ma szczególnych ograniczeń jeśli chodzi o stosowany rozpuszczalnik, o ile nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve, dimetyloksyetan; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; sulfotlenki, takie jak

PL 209 765 B1 sulfotlenek dimetylu; estry kwasu fosforowego, takie jak fosforan trimetylu; oraz pirydynę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

W reakcji tej można stosować każdy czynnik fosforylujący, który powszechnie stosuje się w reakcjach fosforylowania grup hydroksylowych. Przykłady takiego reagenta mogą obejmować diestry kwasu fosforowego, takie jak fosforan dibenzylu; ditioestry kwasu fosforowego, takie jak S,S'-difenylofosforoditionian monocykloheksyloamoniowy; oraz chlorki kwasu fosforowego, takie jak chlorek fosforylu lub P^N-L-alaninian metylochlorofenylofosforylu. Taki czynnik fosforylujący można stosować w ilości równomolowej lub wyższej, a bardziej korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 5,0:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3a] lub jego soli.

Przykłady dodatków stosowanych w tej reakcji mogą obejmować związki azowe, takie jak azodikarboksylan dietylu lub azodikarboksylan diizopropylu, fosfiny, takie jak trifenylofosfina, chlorki allenosulfonylu, takie jak chlorek 2,4,6-triizopropylobenzenosulfonylu, oraz zasady, takie jak pirydyna lub chlorek tert-butylomagnezu. Dodatki te można stosować w kombinacjach. Dodatek stosuje się w ilości równomolowej lub wyższej, a bardziej korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 5,0:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3a] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się zwykle w temperaturze -50°C do 170°C, a korzystnie w temperaturze 0°C do 100°C, w czasie od 1 minuty do 72 godzin, a korzystnie od 5 minut do 24 godzin.

W sposobie opisanym w powyższym punkcie (2) nie ma szczególnych ograniczeń jeśli chodzi o stosowany rozpuszczalnik, o ile nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz pirydynę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

W reakcji tej można stosować dowolny czynnik fosfitylujący, który jest powszechnie stosowany do fosfitylowania grup hydroksylowych. Przykłady takiego reagenta obejmują fosforoamidyty, takie jak fosforoamidyt diallilodiizopropylu lub fosforoamidyt bis(S-piwaloilo-2-tioetylo)N,N-diizopropylu, oraz chlorki fosforu, takie jak fosforochlorek diallilu. Czynnik fosfitylujący można stosować w ilości równomolowej lub wyższej, a bardziej korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 3,0:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3a] lub jego soli.

Przykłady dodatków stosowanych w tej reakcji mogą obejmować zawierające azot pierścieniowe związki heterocykliczne, takie jak 1H-tetrazol, 4-dimetyloaminopirydyna, pirydyna lub kolidyna i można je stosować w kombinacjach. Dodatek taki można stosować w ilości równomolowej lub wyższej, a bardziej korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 5,0:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3a] lub jego soli.

Przykłady czynników utleniających stosowanych w tej reakcji obejmują nadtlenki, takie jak kwas metachloronadbenzoesowy lub wodoronadtlenek tert-butylu, oraz związki halogenowane, takie jak jodyna. Czynnik utleniający można stosować w ilości równomolowej lub wyższej, a bardziej korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 5,0:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3a] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się zwykle w temperaturze od -78°C do 100°C, a korzystnie od -50°C do 50°C, w czasie od 1 minuty do 24 godzin, a korzystnie od 5 minut do 6 godzin.

[Sposób wytwarzania 2]

PL 209 765 B1

2 1 2 3 4 10 11 gdzie każdy z R , R , Z , Z , Z i Z ma wyżej podane znaczenie; każdy R i R , identyczny lub różny, oznacza grupę ochronną dla kwasu fosforowego, która rozkłada się w warunkach fizjologicznych; a X oznacza atom fluorowca.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [2b], lub jego sól, można wytworzyć w reakcji związku przedstawionego ogólnym wzorem [3b], lub jego soli, ze związkiem przedstawionym ogólnym wzorem [6a], sposobem opisanym na przykład w Journal of Medicinal Chemistry, vol. 37, str. 3902 do 3909 (1994).

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń , jeś li chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu lub chloroform; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloacetamid; alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu i wodę. Moż na również stosować kombinacje obejmują ce jeden lub wię cej typów tych rozpuszczalników.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [6a] stosuje się w ilości równomolowej lub wyższej, a bardziej korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 3,0:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3b] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się zwykle w temperaturze 0°C do 170°C, a korzystnie 20°C do 120°C, w czasie od 5 minut do 24 godzin, a korzystnie od 1 do 10 godzin.

[Sposób wytwarzania 3]

gdzie każdy R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, Z¹, Z², Z³ i Z⁴ ma to samo znaczenie jak wyżej podane.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [2c], lub jego sól, można wytworzyć przez poddanie związku przedstawionego ogólnym wzorem [2a] lub jego soli reakcji odblokowania.

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń , jeś li chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloacetamid; alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz wodę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

W reakcji odblokowania moż na stosować dowolny czynnik, który powszechnie stosuje się do odblokowania grup hydroksylowych, a korzystne przykłady takiego reagenta mogą obejmować: zasady, takie jak metanolan sodu, gazowy amoniak, woda amoniakalna, butyloamina lub hydrazyna; kwasy, takie jak kwas mrówkowy, wodny roztwór kwasu octowego, wodny roztwór kwasu trifluorooctowego, kwas solny, bromotrimetylosilan, żywicę jonowymienną Dowex 50WX4-200 lub żywicę jonowymienną Amberlite IR-120; katalizatory oparte na palladzie, takie jak tetrakis(trifenylofosfino)pallad (0); oraz fosfiny, takie jak trifenylofosfina. Reagenty te można stosować w kombinacjach lub można je wytworzyć w układzie reakcyjnym. Czynnik do odblokowania można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,01:1 lub powyżej, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [2a] lub jego soli, i czynnik taki można również stosować jako rozpuszczalnik.

Reakcję odblokowania prowadzi się na ogół w temperaturze -50°C do 170°C, a korzystnie -20°C do 100°C, w czasie od 1 minuty do 100 godzin, a korzystnie od 5 minut do 50 godzin.

PL 209 765 B1

[Sposób wytwarzania 4]

z² Z⁴I2d]

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [2d], lub jego sól można wytworzyć przez reakcję acylowania związku przedstawionego ogólnym wzorem [2a'], lub jego soli, w obecności czynnika odkwaszającego, w obecności lub bez dodatku, zgodnie ze sposobem opisanym, na przykład, w publikacjach 4^th Jikken Kagaku Koza, vol. 22, str. 137 do 151 i 166 do 169 (1992); Journal of Medicinal Chemistry, vol. 44, str. 777 do 786 (2001) albo w JP-A-10-195075.

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń , jeś li chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; węglowodory aromatyczne, takie jak benzen, toluen lub ksylen; halogenowane węglowodory, takie jak dichlorometan, chloroform lub dichloroetan; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; oraz wodę. Rozpuszczalniki te można również stosować w kombinacjach.

Przykłady czynników acylujących do stosowania w tej reakcji mogą obejmować: kwasy karboksylowe, takie jak kwas octowy; chronione aminokwasy, takie jak N-(tert-butoksykarbonylo)-L-walina; halogenki kwasowe, takie jak chlorek kwasu piwalinowego; bezwodniki kwasowe, takie jak bezwodnik octowy; imidazole, takie jak 1,1'-karbonylodiimidazol; karboksylany, takie jak octan metylu; oraz acetale amidów, takie jak acetal dimetylowy N,N-dimetyloacetamidu. Czynniki takie można wytworzyć w układzie reakcyjnym. Czynnik acylujący można stosować w ilości równomolowej lub wyższej, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 2,0:1,0, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [2a'].

Przykłady czynnika odkwaszającego stosowanego w tej reakcji mogą obejmować pirydynę, trietyloaminę, wodorek sodu, tert-butanolan potasu, węglan potasu i wodorowęglan sodu. Czynnik odkwaszający można stosować w ilości równomolowej lub wyższej, a bardziej korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 2,0:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [2a'].

Przykłady dodatków stosowanych w tej reakcji mogą obejmować 1,3-dicykloheksylokarbodiimid, azodikarboksylan dietylu i trifenylofosfinę. Dodatek taki stosuje się w ilości równomolowej lub wyższej, a bardziej korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 2,0:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [2a'].

Reakcje tę prowadzi się na ogół w temperaturze 0°C do 100°C, a korzystnie 20°C do 60°C, w czasie od 5 minut do 24 godzin, a korzystnie od 30 minut do 10 godzin.

[Sposób wytwarzania 5]

[7bJ

O

Podstawienie r^8/ ^0'

R'

[2e]

PL 209 765 B1 gdzie każdy R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ i R⁸ ma wyżej podane znaczenie.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [2e], lub jego sól, można otrzymać przez reakcję związku przedstawionego wzorem ogólnym [7b], lub jego soli, z reaktywnym czynnikiem w obecności lub bez dodatku, zgodnie ze sposobem opisanym np. w publikacji 4^th Jikken Kagaku Koza. vol. 22, str. 371 do 424 (1992) oraz Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), vol. 38, str. 1372 do 1379 (1995).

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń , jeś li chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; moczniki, takie jak N,N'-dimetylopropylenomocznik; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz pirydynę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

W reakcji tej można stosować każdy reaktywny czynnik, który powszechnie stosuje się w reakcji podstawienia grup fosforanowych. Przykłady takich reaktywnych czynników, stosowanych w tej reakcji, mogą obejmować: halogenowane związki alkilowe, takie jak chlorek piwaloiloksymetylu lub chlorek 1-(piwaloiloksy)etylu; alkohole i fenole, takie jak 4-bromofenol, 4-chlorofenol, tiopiwalinian S-(2-hydroksyetylu) lub tioizobutanolan S-(4-hydroksybutylu); oraz aminy, takie jak ester metylowy alaniny. Czynnik reaktywny można stosować w ilości równomolowej lub większej, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 5,0:1,0, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [7b] lub jego soli.

Przykłady stosowanych w tej reakcji dodatków mogą obejmować: związki halogenowane, takie jak pentachlorek fosforu lub jodek sodu; zawierające azot związki heterocykliczne, takie jak 1-metyloimidazol lub 1,1'-karbonylodiimidazol; związki azowe, takie jak azodikarboksylan dietylu lub azodikarboksylan diizopropylu; fosfiny, takie jak trifenylofosfina; chlorki allenosulfonylu, takie jak chlorek 2,4,6-triizopropylobenzenosulfonylu; oraz zasady, takie jak trietyloamina, pirydyna lub chlorek tertbutylomagnezu. Dodatki te można stosować w kombinacjach. Dodatek można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,01:1 do 10:1, a korzystnie w stosunku molowym 0,05:1 do 5,0:1, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [7b] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się na ogół w temperaturze -50°C do 170°C, a korzystnie 0°C do 100°C, w czasie od 1 minuty do 72 godzin, a korzystnie od 5 minut do 24 godzin.

Poniżej opisano sposób wytwarzania związków przedstawionych ogólnym wzorami [3a], [3e] i [3f], albo ich soli.

[Sposób wytwarzania A]

PL 209 765 B1

2 1 2 3 4 12 gdzie każdy R¹, R², Z¹, Z², Z³ i Z⁴ ma wyżej podane znaczenie; R¹² oznacza niższą grupę alkilową lub arylową; R¹³ oznacza atom halogenu, grupę acyloksylową, grupę alkilosulfonyloksylową lub grupę arylosulfonyloksylową; każdy spośród Z⁵, Z⁶, Z⁷ i Z⁸, które są identyczne lub różne, oznacza atom wodoru lub chronioną grupę hydroksylową; Z⁹ oznacza atom wodoru lub grupę ochronną dla grupy hydroksylowej; a każdy spośród Z¹⁰, Z¹¹, Z¹² i Z¹³, które są identyczne lub różne, oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową.

(a) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [3f], lub jego sól, można otrzymać przez (1) konwersję związku przedstawionego ogólnym wzorem [4b], lub jego soli, w związek przedstawiony ogólnym wzorem [4a], lub jego sól, w obecności lub bez dodatku, zgodnie ze stosowanym powszechnie sposobem sililowania, a następnie (2) przez reakcję wytworzonego związku przedstawionego ogólnym wzorem [4a], lub jego soli, ze związkiem przedstawionym ogólnym wzorem [6b], lub jego solą, w obecności lub bez kwasu Lewisa.

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń , jeś li chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu, chloroform lub dichloroetan. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

W powyższej reakcji [1] można stosować dowolny czynnik sililujący, który powszechnie stosuje się do konwersji grupy karbonylowej w eter sililowo-enolowy. Przykłady takiego czynnika sililującego mogą obejmować 1,1,1,3,3,3-heksametylodisilazan, N,O-bis(trimetylosililo)acetamid oraz chlorek trimetylosililu. Taki czynnik sililujący można stosować w ilości równomolowej lub większej, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 10,0:1,0 w odniesieniu do zwią zku przedstawionego ogólnym wzorem [4b] lub jego soli.

W razie potrzeby, przykł adem dodatku stosowanego w tej reakcji jest siarczan amonu. Dodatek taki można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,01:1,0 do 10,0:1.0, a korzystnie 0,05:1,0 do 5,0:1,0, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [4b] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się zwykle w temperaturze 0°C do 200°C, a korzystnie 0°C do 150°C, w czasie od 5 minut do 24 godzin, a korzystnie od 5 minut do 12 godzin.

Związek przedstawiony wzorem ogólnym [6b], lub jego sól, stosowany w reakcji (2) można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,5:1 do 10:1, a korzystnie 0,5:1 do 5:1, w odniesieniu do związku przedstawionego wzorem ogólnym [4a] lub jego soli.

W razie potrzeby, przykłady kwasów Lewisa do stosowania w tej reakcji obejmują trifluorometanosulfonian trimetylosililu, chlorek cyny (IV), chlorek tytanu (IV) oraz chlorek cynku. Kwas Lewisa można stosować w ilości 0,5 mola lub powyżej, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 0,5:1 do 10:1, w odniesieniu do związku przedstawionego wzorem ogólnym [4a] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się na ogół w temperaturze 0°C do 100°C, a korzystnie w temperaturze 0°C do 50°C, w czasie od 1 minuty do 72 godzin, a korzystnie od 5 minut do 24 godzin.

(b) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [3e], lub jego sól, można otrzymać przez reakcję opisaną w sposobie wytwarzania 3, stosując związek przedstawiony ogólnym wzorem [3f], lub jego sól.

(c) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [3a], lub jego sól, można otrzymać przez zablokowanie związku przedstawionego ogólnym wzorem [3e], lub jego soli, stosując reagent w obecności katalizatora opartego na kwasie lub zasadzie, albo bez takiego katalizatora.

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń, jeśli chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloacetamid; alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; ketony, takie jak aceton; oraz wodę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

W reakcji tej można stosować dowolny reagent powszechnie stosowany do ochrony grup hydroksylowych. Korzystne przykłady obejmują 2,2-dimetoksypropan, chlorek acetylu i chlorek benzoilu. Reagenty takie można również wytworzyć w układzie reakcyjnym. Reagent taki stosuje się w ilości

PL 209 765 B1 równomolowej lub większej, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1,0:1,0 do 10:1,0 w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3e] lub jego soli.

Przykłady katalizatora opartego na kwasie lub zasadzie do stosowania w tej reakcji obejmują paratoluenosulfonian pirydyniowy, kwas paratoluenosulfonowy oraz trietyloaminę. Katalizator oparty na kwasie lub zasadzie można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,01:1 do 10:1, a korzystnie w stosunku molowym 0,05:1 do 10:1, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3e] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się na ogół w temperaturze -50°C do 170°C, a korzystnie w temperaturze 0°C do 150°C, w czasie od 1 minuty do 24 godzin, a korzystnie od 5 minut do 10 godzin.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [4b], lub jego sól, jest dostępnym na rynku produktem lub można go wytworzyć znanymi sposobami, sposobami równoważnymi do nich lub stosując kombinacje takich sposobów. Sposoby wytwarzania opisano w publikacjach, takich jak Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc), vol. 71, str. 78 (1949); ta sama publikacja, vol. 78, str. 242 do 244 (1956); Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocycl. Chem.), vol. 15, nr 4. str. 665 do 670 (1978); Journal of Chemical Society (J. Chem. Soc), str. 1379 (1955); patent USA nr 5597823; lub międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 00/10569.

Poniżej opisano sposób wytwarzania związku przedstawionego ogólnym wzorem [3b] lub jego soli.

[Sposób wytwarzania B]

gdzie R⁹ oznacza grupę alkilową, a każdy R¹, R², R¹², R¹³, Z¹, Z², Z³, Z⁴, Z⁵, Z⁶, Z⁷, Z⁸, Z⁹, Z¹⁰, Z¹¹, Z¹², Z¹³ i X ma wyżej podane znaczenie.

(a) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [3h], lub jego sól, można wytworzyć przez reakcję opisaną w sposobie wytwarzania A(a), stosując związek przedstawiony ogólnym wzorem [4d] lub jego sól.

PL 209 765 B1 (b) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [3g], lub jego sól, można wytworzyć przez reakcję opisaną w sposobie wytwarzania 3, stosując związek przedstawiony ogólnym wzorem [3h] lub jego sól.

(c) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [3d], lub jego sól, można wytworzyć przez reakcję opisaną w sposobie wytwarzania A(c), stosując związek przedstawiony ogólnym wzorem [3g] lub jego sól.

(d) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [3c], lub jego sól, można wytworzyć sposobem opisanym, na przykład, w publikacji 4^th Jikken Kagaku Koza. vol. 19, str. 416 do 482 (1992), (1) przez reakcję związku przedstawionego ogólnym wzorem [3d], lub jego soli, z czynnikiem halogenującym, w obecności dodatku lub bez dodatku, albo (2) przez reakcję tego samego związku lub jego soli z czynnikiem sulfonującym, w obecnoś ci czynnika odkwaszającego, a następnie przez reakcję z czynnikiem halogenującym.

W powyższym sposobie (1) nie ma szczególnych ograniczeń, jeś li chodzi o stosowany rozpuszczalnik, o ile nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu, chloroform; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; oraz wodę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

Nie ma ograniczeń odnośnie do stosowanego w tej reakcji czynnika halogenującego, o ile jest to reagent powszechnie stosowany w reakcji halogenowania grup hydroksylowych. Korzystne przykłady takich czynników halogenujących mogą obejmować jod, brom, chlor, kwas jodowodorowy, kwas bromowodorowy, bromek sodu, jodek potasu, chlorek sulfurylu, N-bromosukcynimid, N-chlorosukcynimid, tetrabromek węgla lub związki fosforowe, takie jak jodofosfonian trifenylu. Czynnik halogenujący można stosować w stosunku molowym wynoszącym 1:1 do 50:1, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1:1 do 20:1, w odniesieniu do związku przedstawionego wzorem ogólnym [3d] lub jego soli.

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń, jeś li chodzi o stosowany dodatek i jeśli jest on konieczny, można stosować dowolny dodatek, który powszechnie stosuje się w reakcji halogenowania grup hydroksylowych. Korzystne przykłady takich dodatków obejmują: fosfiny, takie jak trifenylofosfina; związki azowe, takie jak azodikarboksylan dietylu; i silany, takie jak chlorek trimetylosililu lub heksametylodisiloksan. Można stosować kombinacje jednego lub więcej typów takich dodatków. Dodatek można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,01:1 do 10:1, a korzystnie w stosunku molowym 0,1:1 do 10:1, w odniesieniu do związku przedstawionego wzorem ogólnym [3d] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się na ogół w temperaturze -80°C do 170°C, a korzystnie w temperaturze -80°C do 100°C, w czasie od 1 minuty do 72 godzin, a korzystnie od 5 minut do 48 godzin.

W powyż szym sposobie (2) nie ma szczególnych ograniczeń jeś li chodzi o rozpuszczalnik stosowany w reakcji sulfonowania, o ile nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu lub chloroform; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; i wodę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

Nie ma ograniczeń, jeśli chodzi o stosowany w tej reakcji czynnik sulfonujący i można stosować każdy reagent, który powszechnie stosuje się w reakcji sulfonowania grup hydroksylowych. Korzystne przykłady takich czynników sulfonujących obejmują halogenowane związki sulfonylowe, takie jak chlorek metanosulfonylu lub chlorek p-toluenosulfonylu; bezwodniki kwasów sulfonowych, takie jak bezwodnik kwasu trifluorometanosulfonowego; oraz kwasy sulfonowe, takie jak kwas trifluorometanosulfonowy. Czynnik sulfonujący można stosować w stosunku molowym wynoszącym 1:1 do 20:1, a korzystnie w stosunku molowym 1,0:1,0 do 5,0:1,0, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3d] lub jego soli.

Nie ma ograniczeń, jeśli chodzi o stosowany w tej reakcji czynnik odkwaszający i można stosować każdy reagent, który powszechnie stosuje się w reakcji sulfonowania grup hydroksylowych. Korzystne przykłady takich czynników odkwaszających obejmują zasady, takie jak pirydyna, 2,6-luty18

PL 209 765 B1 dyna, trietyloamina lub metanolan sodu i można je stosować w kombinacjach obejmujących jeden lub więcej spośród typów takich czynników odkwaszających. Czynnik odkwaszający można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,01:1 do 20:1, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 0,1:1 do 10:1, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3d] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się na ogół w temperaturze -80°C do 100°C, a korzystnie -20°C do 50°C, w czasie od 1 minuty do 24 godzin, a korzystnie od 5 minut do 12 godzin.

Nie ma szczególnych ograniczeń, jeśli chodzi o rozpuszczalnik stosowany w reakcji halogenowania, o ile nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu lub chloroform; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; ketony, takie jak aceton; alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; i wodę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

Nie ma ograniczeń, jeśli chodzi o stosowany w tej reakcji czynnik halogenujący i można stosować każdy reagent powszechnie stosowany w reakcji halogenowania grup sulfonianowych. Korzystne przykłady takich czynników halogenujących mogą obejmować bromek sodu, jodek sodu, jodek potasu i jodek magnezu. Czynnik halogenujący można stosować w stosunku molowym wynoszącym 1:1 do 50:1, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1:1 do 20:1, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3d] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się na ogół w temperaturze -80°C do 170°C, a korzystnie -80°C do 100°C, w czasie od 1 minuty do 72 godzin, a korzystnie od 5 minut do 12 godzin.

(e) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [3b], lub jego sól, można otrzymać poddając związek przedstawiony ogólnym wzorem [3c] lub jego sól reakcji amonolizy karboksylanu, w obecności katalizatora lub bez katalizatora.

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń, jeśli chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu lub chloroform; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; i wodę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników. Reakcję tę można prowadzić stosując reagent i warunki, które powszechnie stosuje się w reakcjach amonolizy aromatycznych karboksylanów. Korzystnie stosuje się gazowy amoniak, ciekły amoniak lub wodę amoniakalną. Reagent taki można stosować w ilości równomolowej lub większej, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3c] lub jego soli. Ponadto, reagent ten można stosować również jako rozpuszczalnik. Przykłady katalizatorów do stosowania w tej reakcji mogą obejmować: sole kwasu amonowego, takie jak chlorek amonu; zasady, takie jak metanolan sodu lub butylolit; amidki metali alkalicznych, takie jak amidek sodu. Katalizator można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,01:1 do 100:1, a korzystnie w stosunku molowym 0,01:1 do 20:1, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [3c] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się zwykle w temperaturze -100°C do 250°C, a korzystnie w temperaturze -78°C do 100°C, w czasie od 1 minuty do 72 godzin, a korzystnie od 30 minut do 50 godzin.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [4d], lub jego sól można pozyskać przez nabycie produktów dostępnych na rynku, lub można go wytworzyć znanymi sposobami, sposobami równoważnymi lub stosując kombinację tych sposobów. Wytwarzanie związku przedstawionego ogólnym wzorem [4b], jak opisano w powyższej publikacji, która stanowi przykład publikacji opisujących sposoby wytwarzania tego związku.

W dalszej części opisano sposób syntezy chemicznej pirazynowego analogu nukleotydu przedstawionego ogólnym wzorem [1z].

PL 209 765 B1

gdzie każdy R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, Z¹, Z², Z³ i Z⁴ ma to samo znaczenie jak wyżej podane; R¹⁴ oznacza grupę monofosforanową lub grupę chlorku monofosforowego, która może być chroniona; R¹⁵ oznacza grupę kwasu difosforanowego lub grupę trifosforanową, która może być chroniona.

(a) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [5c], lub jego sól, można otrzymać przez przeprowadzenie reakcji zgodnie ze sposobem wytwarzania 1, stosując związek przedstawiony ogólnym wzorem [3v] lub jego sól.

(b) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [5b], lub jego sól, można otrzymać przez przeprowadzenie reakcji zgodnie ze sposobem wytwarzania 3, stosując związek przedstawiony ogólnym wzorem [5c] lub jego sól.

(c) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [5a], lub jego sól, można otrzymać przez reakcję związku przedstawionego ogólnym wzorem [5b], lub jego soli, z czynnikiem fosforylującym, w obecności czynnika kondensującego, lub bez takiego czynnika, zgodnie ze sposobami opisanymi, na przykład, w Chemical Review (Chem. Rev.), vol. 100, str. 2047 do 2059 (2000); Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), vol. 55, str. 1834 do 1841 (1990); lub Acta Biochimica Biophisica Academia Scientiarum Hungaricae (Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung.), vol. 16, str. 131 do 133 (1981).

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń, jeśli chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; estry kwasu fosforowego, takie jak fosforan trimetylu; oraz pirydynę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników.

Jako czynnik fosforylujący w reakcji tej można stosować dowolny czynnik stosowany do fosforylowania grup monofosforanowych. Przykłady takich czynników fosforylujących mogą obejmować fosforany, takie jak fosforan tri-n-butyloamoniowy lub pirofosforan tri-n-butyloamoniowy. Czynniki takie można również wytworzyć w układzie reakcyjnym. Czynnik fosforylujący można stosować w ilości równomolowej lub większej, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1:1 do 10:1, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [5b] lub jego soli. Przykłady czynnika kondensującego mogą obejmować imidazole, takie jak 1,1'-karbonylodiimidazol lub N-metyloimidazol, oraz aminy, takie jak morfolina lub diizopropyloamina. Można również stosować kombinacje takich czynników. Czynnik kondensujący można stosować w ilości równomolowej lub większej, a korzystnie w stosunku molowym wynoszącym 1:1 do 5:1, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [5b] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się na ogół w temperaturze -50°C do 100°C, a korzystnie w temperaturze 0°C do 50°C, w czasie od 1 minut do 72 godzin, a korzystnie od 5 minut do 24 godzin.

PL 209 765 B1 (d) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [5a], lub jego sól, można otrzymać przez przeprowadzenie reakcji zgodnie ze sposobem wytwarzania F(c), stosując związek przedstawiony ogólnym wzorem [5c] lub jego sól.

(e) Związek przedstawiony ogólnym wzorem [5a], lub jego sól, można otrzymać przez reakcję związku przedstawionego ogólnym wzorem [3v], lub jego soli, zgodnie ze sposobem wytwarzania 1, z wytworzeniem zwią zku o wzorze [5c], lub jego soli, a nastę pnie przez reakcję otrzymanego zwią zku lub jego soli w tym samym układzie, zgodnie ze sposobem wytwarzania F(d).

[Sposób wytwarzania K]

gdzie każdy R¹, R² i R⁹ ma wyżej podane znaczenie.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [4b], lub jego sól, można otrzymać przez reakcję kondensacji związku przedstawionego ogólnym wzorem [4i], lub jego soli, z karboksylanem i aminami, takimi jak amoniak lub pierwszorzędowa amina, w obecności katalizatora lub bez katalizatora.

W reakcji tej nie ma szczególnych ograniczeń, jeśli chodzi o stosowany rozpuszczalnik, pod warunkiem, że nie wpływa on na reakcję. Przykłady takich rozpuszczalników mogą obejmować: aromatyczne węglowodory, takie jak benzen, toluen lub ksylen; halogenowane węglowodory, takie jak chlorek metylenu lub chloroform; etery, takie jak dioksan, tetrahydrofuran, anizol, eter dietylowy glikolu dietylenowego lub dimetylocellosolve; nitryle, takie jak acetonitryl; amidy, takie jak N,N-dimetyloformamid lub N,N-dimetyloacetamid; alkohole, takie jak metanol, etanol lub propanol; sulfotlenki, takie jak sulfotlenek dimetylu; i wodę. Można również stosować kombinacje obejmujące jeden lub więcej typów tych rozpuszczalników. Reakcję tę prowadzi się stosując reagent i warunki, które powszechnie stosuje się w reakcji kondensacji aromatycznego karboksylanu z aminami. Przykłady amin korzystnie stosowanych w tej reakcji mogą obejmować amoniak, taki jak gazowy amoniak, ciekły amoniak lub wodę amoniakalną, oraz pierwszorzędowe aminy, takie jak ester dietylowy kwasu L-asparaginowego. Aminę taką można stosować w ilości równomolowej lub większej, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [4i] lub jego soli. Reagenty te można również stosować jako rozpuszczalniki. W razie potrzeby, przykłady katalizatorów do stosowania w tej reakcji mogą obejmować: sole amonowe z kwasami, takie jak chlorek amonu; zasady, takie jak trietyloamina, metanolan sodu lub butylolit; amidki metali alkalicznych, takie jak amidek sodu. Katalizator taki można stosować w stosunku molowym wynoszącym 0,01:1 do 100:1, a korzystnie w stosunku molowym 0,01:1 do 20:1, w odniesieniu do związku przedstawionego ogólnym wzorem [4i] lub jego soli.

Reakcję tę prowadzi się zazwyczaj w temperaturze -100°C do 250°C, a korzystnie -78°C do 100°C, w czasie od 1 minuty do 72 godzin, a korzystnie od 30 minut do 50 godzin.

[Sposób wytwarzania L]

[4J] Ι4Γ']

2a gdzie każdy R¹, R^2a i Y ma to samo znaczenie co podane powyżej.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [4f''], lub jego sól, można otrzymać przez przeprowadzenie reakcji zgodnie ze sposobem wytwarzania 4, stosując związek przedstawiony ogólnym wzorem [4j], lub jego sól.

PL 209 765 B1

Gdy związek otrzymany powyższym sposobem wytwarzania występuje w postaci izomerów (np. izomerów optycznych, izomerów geometrycznych, tautomerów, itd.), można również stosować takie izomery. Ponadto, można również stosować solwaty, hydraty i różne postaci krystaliczne. Ponadto, po zakończeniu reakcji, produkt reakcji będący przedmiotem zainteresowania można stosować bezpośrednio w następnej reakcji bez wyodrębniania.

Gdy związek wytworzony powyższym sposobem zawiera grupę aminową, hydroksylową lub karboksylową, grupy takie można najpierw zablokować zwykłymi grupami ochronnymi, a po zakończeniu reakcji grupy ochronne można usunąć znanymi sposobami.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [1z], lub jego sól, można wyodrębnić, oczyścić lub rekrystalizować znanymi sposobami, takimi jak ekstrakcja, krystalizacja i/lub chromatografia kolumnowa.

Gdy związek według wynalazku stosuje się jako środek farmaceutyczny, ze związku takiego znanymi sposobami można wytworzyć kompozycję farmaceutyczną, stosując nośnik farmaceutyczny, który powszechnie stosuje się w preparacie farmaceutycznym. W typowych środkach farmaceutycznych stosuje się różne typy powszechnie stosowanych nośników, takich jak substancja pomocnicza, substancja wiążąca, substancja ułatwiająca rozpadanie, środek poślizgowy, substancja barwiąca, polepszacz smaku, substancja smakowo-zapachowa lub surfaktant.

Nie ma szczególnych ograniczeń co do postaci użytkowej związku według wynalazku i postać taką dobiera się w zależności od zamierzonego celu terapeutycznego. Bardziej konkretnie, przykłady postaci użytkowych mogą obejmować: środki do podawania pozajelitowego, takie jak środek do iniekcji, czopek lub preparat do podawania zewnętrznego (maść, okład, itd.); aerozole; środki do podawania doustnego, takie jak tabletka, proszek, drobna granulka, granulka, kapsułka, ciecz, pigułka, zawiesina, syrop lub emulsja.

Opisane powyżej różne rodzaje środków farmaceutycznych można wytworzyć znanymi sposobami.

Gdy związek według wynalazku jest w postaci stałego środka farmaceutycznego do podawania doustnego, takiego jak tabletka, proszek, drobna granulka lub granulka, przykłady stosowanych tu nośników obejmują: substancje pomocnicze (laktoza, sacharoza, chlorek sodu, glukoza, skrobia, węglan wapnia, kaolin, krystaliczna celuloza, bezwodny difosforan wapnia, kwas alginowy, itd.); substancje wiążące (syrop prosty, roztwór glukozy, roztwór skrobi, roztwór żelatyny, polialkohol winylowy, eter poliwinylowy, poliwinylopirolidon, karboksymetyloceluloza, szelak, metyloceluloza, etyloceluloza, alginian sodu, guma arabska, hydroksypropylometyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, oraz ich roztwory w wodzie i/lub w etanolu, itd.); substancje uł atwiają ce rozpadanie (skrobia, kwas alginowy, usieciowany poliwinylopirolidon, usieciowana sól sodowa karboksymetylocelulozy, sól wapniowa karboksymetylocelulozy, sól sodowa glikolanu skrobi, itd.); czynniki kontrolujące uwalnianie (wyższe kwasy tłuszczowe, wyższe alkohole tłuszczowe, masło kakaowe, uwodorniony olej, polimer rozpuszczalny w wodzie, polimer rozpuszczalny w soku żołądkowym, polimer rozpuszczalny w soku jelitowym, itd.), substancje ułatwiające absorpcję (surfaktanty, takie jak czwartorzędowa sól amoniowa, laurylosiarczan sodu lub monooleinian sorbitanu); absorbenty (skrobia, laktoza, kaolin, bentonit, kwas krzemowy, bezwodnik, uwodniony ditlenek krzemu, glinometakrzemian magnezu, koloidalny kwas krzemowy itd.); i ś rodki poślizgowe (oczyszczony talk, stearynian, kwasy krzemowe, glikol polietylenowy, itd.).

W razie potrzeby, tabletki moż na powlekać typowymi powłoczkami, na przykład, powłoczką z cukru, żelatyny, lub powłoczką, która jest rozpuszczalna w soku żołądkowym, powłoczką, która jest rozpuszczalna w soku jelitowym, lub powłoczką, która jest rozpuszczalna w wodzie.

Kapsułki można wytworzyć przez zmieszanie związku z wymienionymi powyżej różnymi typami nośników, a następnie przez napełnienie otrzymaną mieszaniną twardej kapsułki żelatynowej, miękkiej kapsułki, itd.

Ciekłym środkiem farmaceutycznym może być zawiesina wodna lub olejowa, syrop lub eliksir. Środki takie można wytwarzać znanymi sposobami stosując typowe dodatki.

Gdy związek według niniejszego wynalazku jest w postaci preparatu do iniekcji, przykłady nośników mogą obejmować: rozcieńczalniki (woda, alkohol etylowy, Macrogol, glikol propylenowy, itd.); czynniki regulujące pH lub bufory (kwas cytrynowy, kwas octowy, kwas fosforowy, kwas mlekowy oraz ich sole, kwas siarkowy, wodorotlenek sodu, itd.); oraz stabilizatory (pirosiarczyn sodu, kwas etylenodiaminotetraoctowy, kwas tioglikolowy, kwas tiomlekowy, itd.). W takim przypadku, w kompozycji farmaceutycznej mogą być obecne typowe sole, glukoza, mannitol lub gliceryna, w ilości wystarczającej do wytworzenia izotonicznego roztworu. Można również dodawać typowe środki solubilizujące, środki uśmierzające lub środki do znieczulenia miejscowego.

PL 209 765 B1

Sposób podawania, dawkę i ilość dawek można dobrać odpowiednio w zależności od wieku pacjenta, ciężaru ciała i objawów. W przypadku dorosłego pacjenta, związek według wynalazku można podawać doustnie lub pozajelitowo (np. w postaci iniekcji, wlewu, przez podawanie doodbytnicze, itd.) w dawce od 0,1 do 1000 mg/kg raz dziennie lub w dawkach podzielonych kilka razy dziennie.

Gdy podaje się związek o wzorze [2] hamuje się wzrost wirusów i/lub niszczy wirusy i obejmuje to następujące etapy.

gdzie każdy R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R^Z, A i Y ma to samo znaczenie jak wyżej podane.

Etap A: pirazynowy analog nukleotydu przedstawiony ogólnym wzorem [2], lub jego sól, ulega konwersji in vivo w związek przedstawiony ogólnym wzorem [2a] lub jego sól.

Etap B: pirazynowy analog nukleozydu przedstawiony ogólnym wzorem [3z], lub jego sól, ulega konwersji in vivo w związek przedstawiony ogólnym wzorem [2a] lub jego sól.

Etap C: (1) pirazynowy analog nukleozydu przedstawiony ogólnym wzorem [3z], lub jego sól, ulega konwersji in vivo, przez działanie enzymu, takiego jako nukleozydaza, w związek przedstawiony ogólnym wzorem [4f], a następnie (2) otrzymany związek ulega konwersji in vivo przez działanie enzymu, takiego jak fosforybozylotransferaza, w związek przedstawiony ogólnym wzorem [2a], lub jego sól.

W etapach B, C(1) i C(2) może również nastąpić konwersja odwrotna in vivo.

Związek przedstawiony ogólnym wzorem [2a], lub jego sól, wytworzony w wyniku powyższych etapów, ulega dalszej konwersji in vivo przez działanie enzymu, takiego jak kinaza nukleotydowa [Advances in Antiviral Drug Design, vol. 2, str. 167 do 172 (1996)] w związek przedstawiony ogólnym wzorem [1b] (pirazynotrifosforan nukleotydu), lub jego sól. Związek ten, lub jego sól, wykazuje działanie hamujące wzrost wirusów i/lub wirusobójcze przez hamowanie polimerazy wirusa. Ponadto, in vivo może wystąpić również konwersja odwrotna.

Ponadto, związek, w którym w powyższych etapach Y oznacza grupę iminową, ulega konwersji in vivo w związek zawierający atom tlenu, i tym samym wykazuje działanie farmakologiczne.

Wynalazek będzie opisany w następujących przykładach badań. Jednakże przykłady te nie ograniczają zakresu wynalazku. W następujących przykładach badań, związek A oznacza 4-[(2R,-3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamid, który otrzymano w przykładzie 29; związek B oznacza 6-chloro-4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamid, który otrzymano w przykładzie referencyjnym 7; a związki wskazane w tablicach z wynikami badań oznaczają produkty otrzymane w przykładach referencyjnych i w przykładach.

Przykład badania 1

Wykrywanie związku fosforanowego w komórce

PL 209 765 B1

Do komórek MDCK, które hodowano jako monowarstwy na 55 cm² płytce hodowlanej, dodano 5 ml pożywki hodowlanej E'-MEM (zawierającej 1% albuminę surowicy bydlęcej i 3% roztwór witaminy), zawierającej związek, 6-fluoro-3-hydroksy-2-[2-¹⁴C]pirazynokarboksamid, który znakowano ¹⁴C w pozycji 2 pierścienia pirazynowego. Po zakończeniu hodowli w warunkach 35°C i 5% CO2 przez 20 godzin, z frakcji komórek wyekstrahowano 6-fluoro-3-hydroksy-2-[2-¹⁴C]pirazynokarboksamid i związek wytworzony w wyniku konwersji, stosując 66,6% roztwór acetonitrylu. Ekstrakt liofilizowano i zatężono, a nastę pnie poddano analizie metodą HPLC w warunkach wskazanych poni ż ej.

W wyniku badania wykryto monofosforan (zwią zek w przykł adzie referencyjnym 15; czas odzysku: 23,3 minuty) oraz trifosforan (związek w przykładzie referencyjnym 16; czas odzysku: 34,0 minuty).

Warunki analizy HPLC

Aparatura

Pompa: HITACHI L-6200

Detektor: HITACHI L-4000

Detektor radioaktywno ś ci: Packard FLO-ONE500

Warunki analizy

Kolumna rozdzielająca: Develosil ODS-MG-5 (4,6 x 250 mm)

Faza ruchoma A: 0,2 M TEAA, pH 6,6

Faza ruchoma B: 10% acetonitryl, 0,2 M TEAA, pH 6,6

Stosunek mieszania: 0 do 10 minut; 5% B do 35 minut: 5% do 75% B (liniowo) do 50 minut: 75% B

Przykład badania 2

Wykrywanie odblokowanego związku w komórce

Do komórek MDCK zawieszonych w zrównoważonym roztworze soli Hanka dodano związku z przykładu 2 i mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Następnie otrzymany produkt umieszczono jako warstwę na oleju silikonowym (KF-99), po czym odwirowano w temperaturze 4°C. Frakcje komórkowe z osadu zawieszono i zamrożono-rozmrożono we wskazanej poniżej fazie ruchomej i otrzymany roztwór analizowano metodą HPLC w warunkach wskazanych poniżej.

Jako odblokowany związek wykryto monofosforan (czas odzysku: 14,3 minuty).

Warunki analizy HPLC

Aparatura

Pompa: HITACHI L-6000 Detektor: HITACHI L-7500

Warunki analizy

Kolumna rozdzielająca: Develosil ODS-MG-5 (4,6 x 250 mm)

Faza ruchoma: 0,02 M roztwór buforu fosforanowego, pH 3,0

Przykład badania 3-1

Badanie hamowania polimerazy (wirus grypy)

Cząstki wirusa grypy potraktowano roztworem rozpuszczającym (100 mM Tris-HCl (pH 8), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,5 mM DTT, 5% glicerolu, 1,5% Triton N101, 1% LPC) i stosowano je jako surowy enzym, polimerazę. Do buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl2 1 mM DTT, 0,25% Triton N101, 0,25 mM ApG, 0,1 mM ATP, 0,05 mM CTP, 0,05 mM UTP, 0,0005 mM GTP, ³²P-GTP, surowy enzym) dodano badane związki w różnych stężeniach, a następnie całość inkubowano w temperaturze 30°C przez 60 minut. Następnie dodano 10% kwasu trichlorooctowego (TCA) i mieszaninę przetrzymywano na lodzie przez 60 minut. Następnie mieszaninę nakroplono na filtr GF/C i filtr przemyto 5% TCA. Filtr wysuszono i dodano koktajlu scyntylacyjnego. Radioaktywność określono stosując ciekły licznik scyntylacyjny. Wartość pomiarów podano jako stężenie hamujące 50%, przy założeniu, że grupa, do której nie dodawano badanych związków, stanowi 100%. Wyniki przedstawiono w Tablicy 1.

T a b l i c a 1

Związek	Stężenie hamujące 50% ^M)
1	2
Przykład referencyjny 16	0,14
Przykład referencyjny 17	0,33

PL 209 765 B1 cd. tabeli 1

1	2
Przykład referencyjny 23	0,25
Przykład referencyjny 25	28

Przykład badania 3-2

Badanie hamowania polimerazy (wirus zapalenia wątroby C (HCV))

W Escherichia coli wytworzono region NS5B wirusa zapalenia wątroby C i stosowano go jako polimerazę HCV do badania. Sposobem transkrypcji in vitro wytworzono sekwencję regionu 3' HCV i stosowano ją jako matrycę RNA do badań.

Do buforu reakcyjnego (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,05 mM MnCl2, 1 mM DTT, 20 jednostek inhibitora RNazy [a-³²P]GTP, po 0,05 mM ATP, CTP i UTP oraz 2 μg/ml matrycy RNA) dodano każdego z badanych związków w różnych stężeniach, a następnie całość inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Następnie, w celu zakończenia reakcji, dodano 10% TCA. Roztwór reakcyjny nakroplono na filtr DE81, po czym filtr przemyto 5% TCA. Filtr wysuszono i dodano koktajlu scyntylacyjnego. Radioaktywność określono stosując ciekły licznik scyntylacyjny. Wartość pomiarów podano jako stężenie hamujące 50%, przy założeniu, że grupa, do której nie dodawano badanych związków, stanowi 100%. Wyniki przedstawiono w Tablicy 1-2.

T a b l i c a 1-2

Związek	Stężenie hamujące 50% (ąM)
Przykład referencyjny 16	0,75
Przykład referencyjny 17	2,7

Przykład referencyjny 23	2,2
Przykład referencyjny 25	1,6

Przykład badania 3-3

Badanie hamowania ludzkiej polimerazy RNA

Jako ludzką polimerazę RNA do badań stosowano ekstrakt jąder komórek Hela (Promega). Plazmid pCMP rozszczepiono enzymami restrykcyjnymi, a następnie oczyszczono i stosowano jako matrycę DNA do badania.

Do buforu reakcyjnego (ekstrakt jąder komórek Hela, 3 mM MgCl2, po 0,4 mM ATP, UTP i CTP, 0,016 mM GTP, 16 μg/ml matrycy DNA, 0,4 mCi/ml [a-³²P]GTP) dodano każdego z badanych związków w różnych stężeniach, po czym całość inkubowano w temperaturze 30°C przez 1 godzinę. Po zakończeniu reakcji roztwór reakcyjny nakroplono na filtr DE81, a następnie filtr przemyto 3 razy 5% roztworem Na2HPO4 przez 30 minut, po czym raz przez 1 minutę przemyto wodą destylowaną. Filtr wysuszono i dodano koktajlu scyntylacyjnego. Radioaktywność określono stosując ciekły licznik scyntylacyjny. Wartość pomiarów podano jako stężenie hamujące 50%, przy założeniu, że grupa, do której nie dodano badanych związków, stanowi 100%. Wyniki przedstawiono w Tablicy 1-3.

T a b l i c a 1-3

Związek	Stężenie hamujące 50% (ąM)
Przykład referencyjny 16	>200
Przykład referencyjny 17	>200

Przykład referencyjny 23	>200
Przykład referencyjny 25	>200

PL 209 765 B1

Przykład badania 4

[Działanie przeciwko grypie]

Komórki MCDK, hodowane do pełnego wzrostu w 6-studzienkowej płytce, zakażono wirusem grypy A/PR/8/34 przy 70 PFU/studzienkę. Po 60 minutach roztwór zakażający usunięto i dodano pożywki hodowlanej E'-MEM zawierającej 0,6% szlachetnego agaru, 1% albuminy surowicy bydlęcej i 3 μg/ml acetylotrypsyny zawierającej 100 μg/ml badanego związku. Mieszaninę pozostawiono do całkowitego zestalenia, a następnie odwrócono. Hodowlę prowadzono przez 3 dni w warunkach 35°C, 100% wilgotności i 5% CO2. Po zakończeniu hodowli, komórki, które przeżyły, zabarwiono 1% czerwienią obojętną, a następnie utrwalono formaliną. Następnie pożywkę agarową usunięto pod bieżącą wodą i policzono ilość łysinek. Stopień hamowania tworzenia się łysinek wyrażono jako procent otrzymany po porównaniu z badaniem kontrolnym, w którym nie stosowano badanych związków. Wyniki przedstawiono w Tablicy 2.

T a b l i c a 2

Związek	Stopień hamowania (%)
Przykład referencyjny 7	42
Przykład referencyjny 12	78
Przykład 2	100
Przykład 6	100
Przykład 11	24
Przykład 22	33
Przykład 29	100
Przykład 31	44
Przykład 32	100

Przykład badania 5

[Działanie przeciwko BVDV]

Komórki MCDK, hodowane do pełnego wzrostu w 6-studzienkowej płytce, zakażono wirusem biegunki bydlęcej (BVDV) NADL przy 70 PFU/studzienkę. Po 60 minutach roztwór zakażający usunięto i do hodowli dodano roztworu (E'-MEM) zawierającej 5% surowicy końskiej i 1% agaru (SeaPlaque Agar), z zawartością 100 μg/ml badanego związku. Mieszaninę pozostawiono do całkowitego zestalenia i hodowlę prowadzono przez 3 dni w warunkach 37°C, 100% wilgotności i 5% CO2. Po zakończeniu hodowli płytkę do badań utrwalono 3% roztworem formaldehydu, pożywkę agarową usunięto pod bieżącą wodą, a następnie wybarwiono 1% roztworem fioletu krystalicznego w celu policzenia ilości łysinek. Stopień hamowania tworzenia się łysinek wyrażono jako procent otrzymany po porównaniu z badaniem kontrolnym, w którym nie stosowano badanych związków. Wyniki przedstawiono w Tablicy 3.

T a b l i c a 3

Związek	Stopień hamowania (%)
Przykład 2	100
Przykład 4	68
Przykład 6	57
Przykład 29	100
Przykład 32	100

Przykład badania 6

Badanie na potwierdzenie obecności formy fosforanu w wątrobie myszy po podaniu związku A Do żyły ogonowej myszy podano związek A w dawce 300 mg/kg. 30 minut po podaniu wycięto

1,6 g wątroby, a następnie rozdrobniono podczas oziębiania lodem i dodano 22,5 ml 70% metanolu, oziębionego uprzednio do temperatury -20°C, w celu wyekstrahowania związku A i formy fosforanu(ów).

PL 209 765 B1 ml supernatantu z ekstraktu odwirowano w temperaturze 4°C przez 10 minut i oczyszczono we wskazanych poniżej warunkach, stosując stałą wkładkę do ekstrakcji (Varian BOND ELUT SAX HF 2 G/12 ml; eluowana 0,01 M do 1,0 M KCl), którą wstępnie potraktowano 12 ml metanolu i po 12 ml 1,0 M i 0,005 M KCl.

Forma fosforanowa zawarta w 5 ml eluatu nr 3 0,05 M KCl i syntetyczny monofosforan (związek otrzymany w przykładzie referencyjnym 30) w badaniach metodą analitycznej HPLC w opisanych warunkach (HPLC-1) miały identyczny czas retencji i widmo UV. Ponadto, forma fosforanowa zawarta w 5 ml eluatu nr 1 0,5 M KCl i syntetyczny disfosforan (związek otrzymany w przykładzie referencyjnym 31) w badaniach metodą analitycznej HPLC w opisanych warunkach (HPLC-2) miały identyczny czas retencji i widmo UV. Również, forma fosforanowa zawarta w 5 ml eluatu nr 2 0,5 M KCl i syntetyczny trifosforan w badaniach metodą analitycznej HPLC w opisanych warunkach (HPLC-3) miały identyczny czas retencji.

Do 4 ml powyższego eluatu nr 3 0,05 M KCl dodano 0,5 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) i 0,5 ml 0,1 M MgCl2, a następnie dodano 0,5 ml alkalicznej fosfatazy, wypreparowanej z jelita cielęcego (EC3.1.3.1., 20 U/ml), po czym całość inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Podobnie, do 4 ml eluatu nr 1 0,5 M KCl dodano 0,5 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) i 0,5 ml 0,1 M MgCl2, a następnie dodano 0,5 ml alkalicznej fosfatazy, wypreparowanej z jelita cielęcego (EC3.1.3.1., 20 U/ml), po czym całość inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Podobnie, do 1,6 ml eluatu nr 2 0,5 M KCl dodano 0,2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) i 0,2 ml 0,1 M MgCl2, a następnie dodano 0,1 ml alkalicznej fosfatazy, wypreparowanej z jelita cielęcego (EC3.1.3.1., 20 U/ml), po czym całość inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę .

Metodą analitycznej HPLC w opisanych warunkach (HPLC-4) potwierdzono, że monofosforan zniknął z eluatu nr 3 0,05 M KCl, a świeżo wytworzony związek i związek A miały identyczny czas retencji i widmo UV. Podobnie, metodą analitycznej HPLC w opisanych warunkach (HPLC-4) potwierdzono, że difosforan zniknął z eluatu nr 1 0,5 M KCl, a świeżo wytworzony związek i związek A miały identyczny czas retencji i widmo UV. Również, metodą analitycznej HPLC w opisanych warunkach (HPLC-4) potwierdzono, że trifosforan zniknął z eluatu nr 2 0,5 M KCl, a świeżo wytworzony związek i zwią zek A miał y identyczny czas retencji i widmo UV.

W oparciu o powyż sze wyniki, potwierdzono, ż e zwią zek A uległ konwersji in vivo do monofosforanu, a następnie do difosforanu, po czym do trifosforanu.

Warunki oczyszczania z zastosowaniem stałej wkładki ekstrakcyjnej

Przemywanie: przemywanie prowadzono stosując następujące 3 rozpuszczalniki w następującej kolejności.

woda (oziębiona lodem) - 12 ml

60% metanol (oziębiony lodem) - 12 ml woda (oziębiona lodem) - 12 ml

Eluowanie: eluowanie przeprowadzono kolejno przy następujących stężeniach. (Do eluowania stosowano objętość 5 ml. „x 2” i „x 3” oznacza, że eluowanie objętością 5 ml przeprowadzono dwa i trzy razy, odpowiednio każdym stężeniem. Frakcje określano kolejno jako eluat nr 1, eluat nr 2 i eluat nr 3).

0,01 M KCl (5 ml x 2)

0,01 M KCl (5 ml x 3)

0,1 M KCl (5 ml x 3)

0,5 M KCl (5 ml x 2)

1,0 M KCl (5 ml x 2)

Warunki analizy HPLC

HPLC-1

Kolumna: 4,6 x 250 mm, Nomura Chemical Co., Ltd., Develosil ODS-MG-5 Faza ruchoma: 0,02 M roztwór buforu fosforanowego (pH 7,0)

Wykrywanie: UV 200 do 400 nm

HPLC-2

Kolumna: 4,6 x 250 mm, Whatman Partisil 10-SAX

Faza ruchoma: 0,2 M roztwór buforu fosforanowego (pH 3,5)

Wykrywanie: UV 200 do 400 nm

HPLC-3

Kolumna: 4,6 x 250 mm, Whatman Partisil 10-SAX

Faza ruchoma: 0,6 M roztwór buforu fosforanowego (pH 3,5)

PL 209 765 B1

Wykrywanie: UV 200 do 400 nm

HPLC-4

Kolumna: 4,6 x 250 mm, Nomura Chemical Co., Ltd., Develosil ODS-MG-5 Faza ruchoma: 2% acetonitryl, 0,02 M roztwór buforu fosforanowego (pH 5,0) Wykrywanie: UV 200 do 400 nm

Stosowana aparatura pomiarowa

Diode Array Detector Agilent 1100 Series Quatemary Pump Agilent 1100 Series Autosampler Agilent 1100 Series ChemStation Agilent 1100 Series

Przykład badania 7

Oznaczenie stężenia związku A w osoczu krwi myszy po doustnym podaniu badanego związku

Dwóm myszom (ICR) w grupie doustnie podano dawkę badanego związku. Po 30 minutach po podaniu pobrano krew. Do 200 μΐ odwirowanego osocza dodano 400 μΐ acetonitrylu. Mieszaninę odwirowano i usunięto wytrącone białko. Otrzymany supernatant zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i określono stężenie związku A w osoczu w następujących warunkach HPLC. Wyniki przedstawiono w Tablicy 4.

Warunki HPLC

Kolumna: Develosil ODS-MG-5, 4,6 x 250 mm (Nomura Chemical Co., Ltd.)

Kolumna ochronna: Develosil ODS-MG-5, 4,6 x 10 mm (Nomura Chemical Co., Ltd.) Wykrywanie: UV 350 nm

Faza ruchoma: 2% acetonitryl, 0,02 M roztwór buforu fosfosforanowego (pH 5,0)

Aparatura pomiarowa

Detektor: Shimadzu SPD-6A Pompa: HITACHI L-6000

T a b l i c a 4

Badany związek	Dawka mg/kg	Stężenie związku A w osoczu ąg/ml
Przykład referencyjny 4	200	0,2
Przykład 17	50	1,6
Przykład 19	50	3,5
Przykład 21	50	0,4
Przykład 22	50	3,1
Przykład 28	50	0,3
Przykład 34	50	12,5
Przykład 36	41	5,7

Przykład badania 8

Oznaczenie stężenia związku B w osoczu myszy po doustnym podaniu badanego związku Związek z przykładu referencyjnego 6 podano doustnie dwóm myszom ICR w grupie jeden raz w dawce 200 mg/kg. Po 30 i 60 minutach po podaniu pobrano krew. Przeprowadzono te same operacje jak w przykładzie badania 7 i metodą HPLC określono stężenie związku B w osoczu. Wyniki przedstawiono w Tablicy 5.

Warunki HPLC:

Kolumna: Develosil ODS-MG-5, 4,6 x 250 mm (Nomura Chemical Co., Ltd.)

Kolumna ochronna: Develosil ODS-MG-5, 4,6 x 10 mm (Nomura Chemical Co., Ltd.) Wykrywanie przy długości fali: UV 350 nm

Faza ruchoma: 5% acetonitryl, 0,04 M roztwór buforu fosforanowego (pH 6,0)

T a b l i c a 5

Badany związek	Stężenie związku B w osoczu (ąg/ml)
	30 minut później	60 minut później
Przykład referencyjny 6	1,6	4,6

PL 209 765 B1

Przykład badania 9

Wykrywanie związku fosforanowego w komórce przez dodanie 3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu

Do komórek MDCK, które hodowano jako monowarstwę na 55 cm² płytce hodowlanej, dodano 5 ml pożywki hodowlanej E'-MEM (zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej i 3% roztwór witaminy) zawierającej 3-hydroksy-2-pirazynokarboksamid (końcowe stężenie: 5000 ąM) i hodowlę prowadzono w warunkach 37°C i 5% CO2 przez 24 godziny. 1 ml 70% metanolu oziębiono do temperatury -20°C i podczas oziębiania lodem dodano do frakcji komórek, po czym z frakcji wyekstrahowano 3-hydroksy-2-pirazynokarboksamid, związek A, i fosforan(y). 0,7 ml supernatantu z ekstraktu odwirowano w temperaturze 4°C przez 10 minut i oczyszczono we wskazanych poniżej warunkach, stosując stałą wkładkę ekstrakcyjną (Varian BOND ELUT SAX HF 100 mg/1 ml; eluowana 0,01 M do 1,0 M KCl), którą uprzednio potraktowano 1 ml metanolu i po 1 ml 1,0 M i 0,005 M KCl.

W analizie metodą HPLC (HPLC-5) fosforan zawarty w 1 ml 0,05 M eluatu KCl i syntetyczny monofosforan (związek otrzymany w przykładzie referencyjnym 30) miały identyczny czas retencji i widmo UV. Ponadto, w analizie metodą HPLC (HPLC-6) identyczny czas retencji stwierdzono dla fosforanu zawartego w 1 ml 0,25 M eluatu KCl i syntetycznego difosforanu (związek otrzymany w przykładzie referencyjnym 31). Do 0,8 ml każdego z powyższych eluatów KCl dodano 0,1 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) i 0,1 ml 0,1 M MgCl2. Następnie pobrano 0,8 ml mieszaniny i do porcji tej dodano 0,08 ml alkalicznej fosfatazy wypreparowanej z jelita cielęcego (EC3.1.3.1, 20 U/ml), a następnie całość inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.

Metodą analizy HPLC (HPLC-7) potwierdzono, że z 0,05 M eluatu KCl zniknął monofosforan, a świeżo wytworzony związek i związek A miały identyczny czas retencji. Ponadto, metodą analizy HPLC (HPLC-8) potwierdzono, że świeżo wytworzony związek i związek A miały identyczne widmo UV. Również, metodą analizy HPLC (HPLC-7) potwierdzono, że z 0,25 M eluatu KCl zniknął difosforan, a świeżo wytworzony związek i związek A miały identyczny czas retencji. Ponadto, metodą analizy HPLC (HPLC-8) potwierdzono, że świeżo wytworzony związek i związek A miały identyczne widmo UV. Również, metodą analizy HPLC (HPLC-7) potwierdzono, że z 0,5 M eluatu KCl zniknął trifosforan, a świeżo wytworzony związek i związek A miały identyczny czas retencji.

W oparciu o powyższe wyniki, potwierdzono, że 3-hydroksy-2-pirazynokarboksamid uległ konwersji w komórce w związek A, monofosforan (związek otrzymany w przykładzie referencyjnym 30), następnie w difosforan (związek otrzymany w przykładzie referencyjnym 31), a potem w trifosforan.

Warunki oczyszczania z zastosowanie stałej wkładki ekstrakcyjnej

woda (oziębiona lodem) - 1 ml

60% metanol (oziębiony lodem) - 1 ml woda (oziębiona lodem) - 1 ml

Eluowanie: eluowanie prowadzono kolejno przy następujących stężeniach. (Do eluowania stosowano objętość 1 ml).

0,01 M KCl (1 ml)

0,05 M KCl (1 ml)

0,01 M KCl (1 ml)

0,25 M KCl (1 ml)

0,5 M KCl (1 ml)

1,0 M KCl (1 ml)

Warunki analizy HPLC

HPLC-5

Wykrywanie: UV 200 do 400 nm

Stosowana aparatura pomiarowa

PL 209 765 B1

HPLC-6

Kolumna: 4,6 x 250 mm, Whatman Partisil 10-SAX

Faza ruchoma: 0,75 M roztwór buforu fosforanowego (pH 3,5)

Wykrywanie: UV 350 nm

Stosowana aparatura pomiarowa

Detektor do spektrofotometrii UV Shimadzu SPD-6A Pompa HITACHI L-6000

HPLC-7

Kolumna: 4,6 x 250 mm, Nomura Chemical Co., Ltd., Develosil ODS-MG-5 Faza ruchoma: 5% acetonitryl, 0,02 M roztwór buforu fosforanowego (pH 5,0) Wykrywanie: UV 350 nm

Stosowana aparatura pomiarowa

Detektor do spektrofotometrii UV Shimadzu SPD-6A Pompa HITACHI L-6000

HPLC-8

Stosowana aparatura pomiarowa

Przykład badania 10

Wykrywanie związku trifosforanowego w komórce przez dodanie związku A

Do komórek MDBK, które hodowano jako monowarstwę na 55 cm² płytce do hodowli, dodano ml pożywki hodowlanej E'-MEM (zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej) zawierającej związek A. Hodowlę prowadzono w warunkach 37°C i 5% CO2 przez 20 godziny, po czym hodowlę usunięto stosując skrobaczkę do komórek i pożywkę hodowlaną usunięto przez odwirowanie. Następnie, do otrzymanych frakcji komórek dodano 5% kwasu trifluorooctowego i wyekstrahowano związek, który uległ konwersji. Do ekstraktu dodano równą ilość 20% pentanu zawierającego trioktyloaminę i otrzymaną warstwę wodną zatężono stosując koncentrator wirowy. W powyższym koncentracie wykryto składnik, który według HPLC miał czas retencji zgodny z czasem dla syntetycznego trifosforanu.

Warunki HPLC Aparatura

Pompa: HITACHI L-6000 Detektor: HITACHI L-4000

Warunki analizy:

Kolumna rozdzielająca: Develosil ODS-MG-5 (4,6 x 250 mm)

Faza ruchoma: 7% acetonitryl, 5 mM bromek tetrabutyloamoniowy, 0,1 M roztwór buforu fosforanowego (pH 7,0)

Pomiar przy długości fali: 350 nm

Przykład badania 11

Wykrywanie monofosforanu i difosforanu w komórce przez dodanie związku A

Do komórek MDCK, które hodowano jako monowarstwę na 55 cm² płytce do hodowli, dodano ml pożywki hodowlanej E'-MEM (zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej i 3% roztwór witaminy) zawierającej związek A (końcowe stężenie: 5000 μM) i hodowlę prowadzono w warunkach 37°C i 5% CO2 przez 24 godziny. Do frakcji komórek podczas oziębiania lodem dodano 1 ml 70% metanolu uprzednio oziębionego do temperatury -20°C i związku A, a następnie wyekstrahowano fosforan(y). 0,7 ml supernatantu z ekstraktu odwirowano w temperaturze 4°C przez 10 minut i oczyszczono we wskazanych poniżej warunkach, stosując stałą wkładkę do ekstrakcji (Varian BOND ELUT SAX HF 100 mg/ml; eluowana 0,01 M do 1,0 M KCl), którą uprzednio potraktowano 1 ml metanolu i po 1 ml 1,0 M i 0,005 M KCl.

Zgodnie z analizą HPLC (HPLC-9) fosforan zawarty w 1 ml 0,05 M eluatu nr 1 KCl i syntetyczny monofosforan (związek wytworzony w przykładzie referencyjnym 30) miały identyczny czas retencji i widmo UV. Ponadto, analiza HPLC (HPLC-10) wykazała również identyczny czas retencji dla fosfo30

PL 209 765 B1 ranu zawartego w 1 ml 0,5 M eluatu KCl i syntetycznego difosforanu (związek wytworzony w przykładzie referencyjnym 31).

Do 0,8 ml powyższego 0,05 M eluatu nr 1 KCl dodano 0,1 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) i 0,1 ml 0,1 M MgCl2. Następnie pobrano 0,5 ml tej mieszaniny i do porcji tej dodano 0,06 ml alkalicznej fosfatazy wypreparowanej z jelita cielęcego (EC3.1.3.1., 20 U/ml), po czym całość inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Analiza HPLC (HPLC-11) potwierdziła, że z 0,05 M eluatu KCl zniknął monofosforan, a świeżo wytworzony związek i związek A miały identyczny czas retencji i widmo UV.

W oparciu o powyższe wyniki potwierdzono, że związek A uległ konwersji w komórce w monofosforan (związek otrzymany w przykładzie referencyjnym 30) i w difosforan (związek otrzymany przykładzie referencyjnym 31).

Warunki oczyszczania z zastosowanie stałej wkładki ekstrakcyjnej

woda (oziębiona lodem) - 1 ml

60% metanol (oziębiony lodem) - 1 ml woda (oziębiona lodem) - 1 ml

Eluowanie: eluowanie prowadzono kolejno przy następujących stężeniach. (Do eluowania stosowano objętość 1 ml. „x 2” oznacza, że eluowanie objętością 1 ml prowadzono dwa razy, odpowiednio każdym stężeniem. Frakcje określano kolejno jako eluat nr 1 i eluat nr 2).

0,01 M KCl (1 ml)

0,05 M KCl (1 ml x 2)

0,1 M KCl (1 ml)

0,5 M KCl (1 ml)

1,0 M KCl (1 ml)

Warunki analizy HPLC

HPLC-9

Wykrywanie: UV 200 do 400 nm

Stosowana aparatura pomiarowa

HPLC-10

Kolumna: 4,6 x 250 mm, Whatman Partisil 10-SAX Faza ruchoma: 0,2 M roztwór buforu fosforanowego (pH 3,5)

Wykrywanie: UV 350 nm

Stosowana aparatura pomiarowa

Detektor do spektrofotometrii UV Shimadzu SPD-6A Pompa HITACHI L-6000

HPLC-11

Stosowana aparatura pomiarowa

Przykład badania 12

Badanie hamowania dehydrogenazy inozynomonofosforanowej (IMPDH)

Komórki MDCK hodowane jako monowarstwy na płytce do hodowli zawieszono w 0,05 M TrisHCl (pH 8,0), zawiesinę homogenizowano w homogenizatorze Downs i otrzymano homogenat komórek. Homogenat komórek odwirowano przy 16000 x g i tak otrzymany supernatant stosowano jako roztwór enzymu IMPDH.

PL 209 765 B1

Jako kompozycję do reakcji stosowano 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 M KCl, 30 mM EDTA, 5 mM NAD, 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej i 0,04 mM [8-¹⁴C]-5'-monofosforanu inozyny. Reakcję prowadzono w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, po czym w celu zakończenia reakcji dodano 2 objętości acetonitrylu i produkt reakcji zatężono. Otrzymany koncentrat analizowano metodą HPLC we wskazanych poniżej warunkach. Określono stosunek substratu reakcji, ([¹⁴C]-5'-monofosforanu inozyny) do produktu reakcji ([¹⁴C]-5'-monofosforanu ksantozyny i obliczono szybkość reakcji. Jako związek kontrolny stosowano monofosforan rybawiryny. Wyniki przedstawiono w Tablicy 6.

Warunki analizy HPLC

Kolumna rozdzielająca: Develosil ODS-MG-5 (4,6 x 250 mm)

Faza ruchoma: 20% acetonitryl, 5 mM bromek butyloamoniowy, 0,02 M roztwór buforu fosforanowego (pH 7,0).

Detektor promieniowania: Packard FLO-ONE500

T a b l i c a 6

Związek badany	Stężenie hamujące 50% (ąM)
Przykład referencyjny 30	980
Przykład 37	740
Związek kontrolny	1,9

Związek według wynalazku opisano w następujących przykładach referencyjnych i przykładach, które nie ograniczają zakresu wynalazku.

Stosunki mieszania w eluentach wyrażono jako stosunki objętościowe. Jako podłoże do chromatografii kolumnowej stosowano żel krzemionkowy BW-127ZH (Fuji Silysia Chemical Ltd.); jako nośnik do chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami stosowano YMG GEL ODS-AM 120-S50 (YMC Co., Ltd.); a jako nośnik do chromatografii na kolumnie jonowymiennej stosowano DEAE cellulose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). W przykładach referencyjnych i przykładach stosowano następujące symbole: DMSO-d6: deuterowany sulfotlenek dimetylu, Ms: grupa metanosulfonylowa, Ph: grupa fenylowa i Et: grupa etylowa.

Przykład referencyjny 1

OH

COOMe

O

BzO OBz

1,52 g 3-hydroksy-2-pirazynokarboksylanu metylu zawieszono w 12,2 ml 1,1,1,3,3,3-heksametylodisilazanu i zawiesinę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę. Zawiesinę pozostawiono do oziębienia, po czym rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymaną pozostałość rozpuszczono w 30 ml dichloroetanu w atmosferze azotu. Kolejno dodano 4,98 g

1-octanu-2,3,5-tribenzoesanu β-D-rybofuranozy i 1,73 ml chlorku cyny (IV) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej jeszcze przez 14 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 30 ml chloroformu i 30 ml nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu, osad usunięto przez odsączenie i otrzymano warstwę organiczną. Otrzymaną warstwę organiczną przemyto kolejno wodą i nasyconym roztworem solanki, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:n-heksan:octan etylu = 1:1] i otrzymano 3,4 g 4-{(2R,3R,4R,5R)-3,4-bis(benzoiloksy)-5-[(benzoiloksy)metylo]tetrahydro-2-furanylo}-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu w postaci białej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1734, 1660.

¹H-NMR (CDCI3) δ: 3,96 (3H, s), 4,71 (1H, dd, J = 4,0, 12,4 Hz), 4,8-4,9 (2H, m), 5,8-5,9 (2H, m), 6,45 (1H, d, J = 4,0 Hz), 7,34 (1H, d, J = 4,2 Hz), 7,3-7,6 (9H, m), 7,70 (1H, d J = 4,2 Hz), 7,9-8,0 (4H, m), 8,0-8,1 (2H, m).

PL 209 765 B1

Przykład referencyjny 2

36,3 g 4-{(2R,3R,4R,5R)-3,4-bis(benzoiloksy)-5-[(benzoiloksy)metylo]tetrahydro-2-furanylo}-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu zawieszono w 400 ml metanolu i podczas oziębiania lodem dodano 11,7 g 28% roztworu metanolanu sodu w metanolu. Mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę. pH roztworu reakcyjnego doprowadzono do wartości 4 dodatkiem 2M kwasu solnego, poczym rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym [eluent:acetonitryl:woda = 1:4] i otrzymano 12,6 g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2 pirazynokarboksylanu metylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1740 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 3,6-3,65 (1H, m), 3,75-3,8 (1H, m), 3,83 (3H, s), 3,9-4,0 (3H, m), 5,13 (1H, d, J = 5,2 Hz), 5,29 (1H, t, J = 5,2 Hz), 5,64 (1H, d, J = 2,4 Hz), 5,91 (1H, d, J = 2,4 Hz), 7,48 (1H, d, J =

4,4 Hz), 8,31 (1H, d, J = 4,4 Hz).

Przykład referencyjny 3

0,5 g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu zawieszono w 5 ml acetonu i kolejno dodano 1 ml ortomrówczanu trimetylu i 33 mg monohydratu kwasu paratoluenosulfonowego. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę, po czym rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej [eluent:octan etylu] i otrzymano 0,49 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d]-[1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu w postaci białej substancji stałej. IR (KBr) cm^-1: 1728 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,35 (3H, s), 1,60 (3H, s), 2,55 (1H, t, J = 4,6 Hz), 3,8-3,9 (1H, m), 3,97 (3H, s), 3,95-4,0 (1H, m), 4,4-4,5 (1H, m), 4,97 (1H, dd, J = 3,2, 6,3 Hz), 5,01 (1H, dd, J = 2,4, 6,3 Hz), 5,80 (1H, d, J = 2,4 Hz), 7,49 (1H, d, J = 4,3 Hz), 7,69 (1H, d, J = 4,3 Hz).

Przykład referencyjny 4 _zNv,COOMe ί„ϊ_ο

ΗΟ-ν,Ο^¹ ° _ °x°

M^CONH, „o-JA °X°

6,78 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu rozpuszczono w 68 ml metanolu, a następnie

PL 209 765 B1 podczas oziębiania lodem wprowadzono gazowy amoniak aż do nasycenia. Reakcję prowadzono w tej samej temperaturze przez 1,5 godziny, po czym osadzoną substancję stałą zebrano przez odsączenie i otrzymano 2,34 g 4-[{3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d]-[1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu w postaci jasnożółtej substancji stałej. Przesącz zatężono i otrzymano jeszcze 2,54 g powyższego związku.

IR (KBr) cm^-1: 1701, 1654 ¹H-NMR (DMSO-d6): 1,29 (3H, s), 1,51 (3H, s), 3,5-3,6 (1H, m), 3,6-3,7 (1H, m), 4,3-4,4 (1H, m), 4,74,8 (1H, m), 4,8-4,9 (1H, m), 5,22 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,98 (1H, s), 7,55 (1H, d, J = 4,0 Hz), 7,76 (1H, szer.s), 8,04 (1H, d, J = 4,0 Hz), 8,36 (1H, szer.s).

Przykład referencyjny 5

Do 80 ml zawiesiny N,N-dimetyloformamidu zawierającej 20 g 3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu w temperaturze w zakresie 80°C-90°C wkroplono 15 ml chlorku sulfurylu. Mieszaninę mieszano w temperaturze w zakresie 95-100°C przez 1 godzinę, a następnie przelano do mieszanego roztworu złożonego z 200 ml wody z lodem i 200 ml octanu etylu. Warstwę organiczną oddzielono. Warstwę wodną ekstrahowano 5 razy 100 ml octanu etylu, a następnie połączono z warstwą organiczną. Mieszaninę przemyto nasyconym roztworem solanki. Następnie mieszaninę potraktowano aktywnym węglem i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość zawieszono w 50 ml wody i dodano i rozpuszczono 3,2 g wodorowęglanu sodu. Następnie pH roztworu doprowadzono do wartości 2 dodatkiem stężonego kwasu solnego. Osad zebrano przez odsączenie i otrzymano 4,8 g 6-chloro-3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu w postaci białej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1660 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 8,51 (2H, szer.s), 8,73 (1H, s), 13,60 (1H, szer.s).

Przykład referencyjny 6

ΛΙγΟΗ cr rr conh.

ΟΙ>γΝγΟΟΝΙ-Ι,

AcO^oJ* °

J ' k. i

AcO OAc

7,5 ml zawiesiny 1,1,1,3,3,3-heksametylodisilazanu, zawierającej 1,5 g 6-chloro-3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu, ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 30 minut. Po oziębieniu, zawiesinę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano 5 ml toluenu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie dodano 5 ml toluenu i rozpuszczalnik ponownie usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie, do otrzymanej pozostałości dodano 15 ml acetonitrylu i pozostałość rozpuściła się, po czym podczas oziębiania lodem kolejno dodano β-D-rybofuranozo1,2,3,5-tetraoctanu i chlorku cyny (IV) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 30 ml octanu etylu i 20 ml wody i następnie doprowadzono pH do wartości 7 dodając nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu. Następnie osad usunięto przez odsączenie i oddzielono warstwę organiczną. Warstwę wodną ekstrahowano 3 razy 10 ml octanu etylu, po czym połączono z warstwą organiczną. Otrzymaną mieszaninę przemyto nasyconym wodnym roztworem solanki, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do otrzymanej pozostałości dodano eteru dietylowego, mieszaninę zebrano przez odsączenie i otrzymano 2,8 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-(aminokarbonylo)-5-chloro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-3-furanylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1756, 1733, 1701, 1648 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 2,09 (3H, s), 2,18 (3H, s), 2,23 (3H, s), 4,45 (2H, s), 4,5-4,6 (1H, m), 5,2-5,3 (1H, m), 5,45-5,5 (1H, m), 6,14 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,22 (1H, szer.s), 8,06 (1H, s), 8,84 (1H, s).

PL 209 765 B1

Przykład referencyjny 7

1,8 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-(aminokarbonylo)-5-chloro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-3-furanylu zawieszono w 27 ml metanolu i podczas oziębiania lodem dodano 2,4 g 28% roztworu metanolanu sodu w metanolu i całość mieszano w tej samej temperaturze przez 30 minut. Następnie dodano 0,95 ml kwasu octowego i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 3:1] tak, że otrzymano 0,73 g 6-chloro-4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1693 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 3,35 (3H, szer.s), 3,65 (1H, d, J= 12,0 Hz), 3,8-3,9 (1H, m), 3,9-4,0 (3H, m), 5,81 (1H, s), 7,92 (1H, szer.s), 8,44 (1H, szer.s), 8,70 (1H, s).

Przykład referencyjny 8

0,3 g 6-chloro-4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników obejmującej 0,6 ml acetonu i 1,5 ml N,N-dimetyloformamidu, po czym kolejno dodano 3 ml 2,2-dimetoksypropanu i 0,12 g soli kwasu p-toluenosulfonowego z pirydyną całość mieszano w temperaturze 50°C przez 5 godzin. Po oziębieniu dodano mieszaninę rozpuszczalników obejmującą 5 ml octanu etylu i 5 ml wody i oddzielono warstwę organiczną. Warstwę przemyto wodą i nasyconym roztworem solanki, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, po czym rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 10:1] i otrzymano 0,18 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-6-chloro-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1700 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,29 (3H, s), 1,50 (3H, s), 3,5-3,6 (1H, m), 3,7-3,8 (1H, m), 4,3-4,4 (1H, m), 4,74 (1H, dd, J = 2,9, 6,1 Hz), 4,88 (1H, dd, J = 2,0, 6,1 Hz), 5,37 (1H, t, J = 4,6 Hz), 5,95 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 7,93 (1H, szer.s), 8,32 (1H, s), 8,41 (1H, szer.s).

Przykład referencyjny 9

1,0 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu rozpuszczono w 5,0 ml pirydyny i w temperaturze 10°C dodano 0,36 ml chlorku metanosulfonylu, po czym całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną przelano do mieszanego roztworu zawierającego 20 ml

PL 209 765 B1 octanu etylu i 20 ml wody. Warstwę organiczną oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano 3 razy 20 ml octanu etylu, a następnie połączono z warstwą organiczną. Mieszaninę przemyto nasyconym roztworem solanki, po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Następnie rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano 1,2 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-2,2-dimetylo-6-[(metylosulfonylo)oksy]metylo]tetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu w postaci oleistego bezbarwnego produktu.

IR (KBr) cm^-1: 1734, 1669 ¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,35 (3H, s), 1,58 (3H, s), 3,02 (3H, s), 3,98 (3H, s), 4,51 (2H, s), 4,8-5,2 (3H, m),

5,73 (1H, szer.s), 7,43 (2H, szer.s).

Przykład referencyjny 10

COOMe

O

1,2 g 4-[{3aR,4R,6R,6aR)-2,2-dimetylo-6-[(metylosulfonylo)oksy]metylo]tetrahydrofuro[3,4-d][1,3]-dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu rozpuszczono w 12 ml acetonu. Dodano 2,3 g jodku sodu i mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury pokojowej, a następnie przelano do mieszanego roztworu zawierającego 20 ml octanu etylu i 20 ml wody. Warstwę organiczną oddzielono, a warstwę wodną ekstrahowano 20 ml octanu etylu, a następnie połączono z warstwą organiczną. Mieszaninę przemyto kolejno wodnym roztworem tiosiarczanu sodu, nasyconym roztworem solanki, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:toluen:octan etylu = 2:1] i otrzymano 1,0 g 4-[(3aR,4R,6S,6aR)-6-(jodometylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu w postaci żółtego oleistego produktu.

IR (KBr) cm^-1: 1734, 1670, 1654 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,36 (3H, s), 1,59 (3H, s), 3,3-3,7 (2H, m), 3,98 (3H, s), 4,3-4,5 (1H, m), 4,9-5,1 (2H, m), 5,76 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,5-7,6 (2H, m).

Przykład referencyjny 11 ^ΝγΟΟΟΜβ

A °x° g-NyCONM;

1-Ą0A }~i °x°

0,55 g 4-[(3aR,4R,6S,6aR)-6-(jodometylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu rozpuszczono w 5 ml metanolu i podczas oziębiania lodem wprowadzano gazowy amoniak aż do nasycenia. Po mieszaniu w tej samej temperaturze przez godzinę rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do uzyskanej pozostałości dodano eteru diizopropylowego, osad zebrano przez odsączenie i otrzymano 0,45 g 4-[(3aR,4R,6S,6aR)-6-(jodometylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro-[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihdydro-2-pirazynokarboksamidu w postaci żółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1684, 1654 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,30 (3H, s), 1,51 (3H, s), 3,3-3,5 (2H, m), 4,3-4,4 (1H, m), 4,79 (1H, dd, J = 3,6, 6,4 Hz), 5,13 (1H, dd, J = 1,2, 6,0 Hz), 6,00 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,53 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,76 (szer.s, 1H), 7,90 (1H, d, J = 4,4 Hz), 8,20 (1H, szer.s).

PL 209 765 B1

Przykład referencyjny 12

5,3 g 6-fluoro-3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 53 ml acetonitrylu pod strumieniem azotu i podczas oziębiania lodem dodano 8,4 ml N,O-bis(trimetylosililo)acetamidu, po czym całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Do mieszaniny reakcyjnej podczas oziębiania lodem dodano 53 ml roztworu acetonitrylu zawierającego 9,4 g octanu (2R,3R,4R)-4,5-bis(acetyloksy)-2-(hydroksymetylo)-tetrahydro-3-furanylu, który wytworzono oddzielnie sposobem opisanym w Carbohydrate Research (Carbohydr. Res.), vol. 203, nr 9, str. 324 do 329 (1990), i 7,2 ml chlorku cyny (IV). Tak otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną przelano do mieszanego roztworu zawierającego 100 ml octanu etylu i 300 ml nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu. Warstwy organiczne rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano 700 ml octanu etylu. Warstwy organiczne połączono, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość rozpuszczono w 200 ml metanolu i dodano 100 ml 80% wodnego roztworu kwasu octowego, po czym całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 40:1]. Później dodano chloroformu i eteru diizopropylowego, mieszaninę zebrano przez odsączenie i otrzymano 9,3 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-3-furanylu jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1752, 1686 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 2,04 (3H, s), 2,10 (3H, s), 3,64 (1H, ddd, J = 2,5, 5,0, 13 Hz), 3,86 (1H, ddd, J = 2,5, 5,0, 13 Hz), 4,29 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,35 (1H, t, J = 6,0 Hz), 5,49 (1H, dd, J = 3,0, 5,0 Hz), 5,65 (1H, t, J = 5,0 Hz), 6,11 (1H, d, J = 3,0 Hz), 7,96 (1H, szer.s), 8,42 (1H, d, J = 5,0 Hz), 8,49 (1H, szer.s).

Przykład referencyjny 13

F^N^CONHj

HO-y »

AcO OAc

RyI%_zCONH₂

ΥΥρ-ογΛ \

AcO OAc

1,5 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-3-furanylu i 0,84 g 1H-tetrazolu rozpuszczono w 30 ml acetonitrylu w strumieniu azotu. Następnie podczas oziębiania lodem dodano 20 ml roztworu acetonitrylu zawierającego fosforoamidyt diallilodiizopropylu i mieszaninę mieszano przez 20 minut. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 10 ml roztworu acetonitrylu zawierającego 1,4 g kwasu m-chloronadbenzoesowego i całość mieszano przez 10 minut. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 60 ml octanu etylu i otrzymaną mieszaninę przelano do 60 ml wody. Warstwy organiczne rozdzielono i warstwę wodną ekstrahowano 90 ml octanu etylu. Warstwy organiczne połączono i dodano 30 ml wody. pH mieszaniny doprowadzono do wartości 8 dodatkiem nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu, po czym warstwę wodną oddzielono. Warstwę organiczną przemyto nasyconym roztworem solanki, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 40:1] i otrzymano 1,3 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4PL 209 765 B1

-(acetyloksy)-2-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-5-([[bis(alliloksy)fosforylo]oksy]metylo)-tetrahydro-3-furanylu w postaci żółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1753, 1694 ¹H-NMR (CDCl3) δ: 2,11 (3H, s), 2,15 (3H, s), 4,32-4,35 (1H, m), 4,47-4,52 (2H, m), 4,58-4,64 (4H, m), 5,27 (2H, dt, J = 1,0, 10,5 Hz), 5,37-5,44 (4H, m), 5,90-6,00 (2H, m), 6,28 (1H, d, J = 4,0 Hz), 6,32 (1H, szer.s), 7,99 (1H, d, J = 6,0 Hz), 9,02 (1H, szer.s).

Przykład referencyjny 14

0,23 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-5-([[bis(alliloksy)fosforylo]oksy]metylo)-tetrahydro-3-furanylu rozpuszczono w 4,0 ml metanolu i podczas oziębiania lodem dodano 0,17 g 28% roztworu metanolanu sodu w metanolu, po czym całość mieszano przez 5 minut. Dodano 0,15 ml kwasu octowego i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Tej samej reakcji poddano 1,0 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[3-(aminokarbonylo)- 5 -fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-5-([[bis-(alliloksy)fosforylo]oksy]metylo)tetrahydro-3-furanylu. Mieszaniny reakcyjne połączono i otrzymaną mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 40:1] i otrzymano 0,35 g diallilofosforanu [(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]metylu.

IR (KBr) cm^-1: 1684 ¹H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 3,1-4,7 (9H, m), 5,1-5,5 (4H, m), 5,7-6,2 (3H, m), 7,94 (1H, d, J = 6,0 Hz).

Przykład referencyjny 15

0,82 g diallilofosforanu [(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]metylu rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników zawierającej 8,2 ml metanolu i 8,2 ml tetrahydrofuranu pod strumieniem azotu. Kolejno dodano 0,11 g tetrakis(trifenylofosfino)palladu (0) i 0,28 g trifenylofosfiny i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do mieszaniny reakcyjnej podczas oziębiania wodą dodano 1,9 ml roztworu tetrahydrofuranu zawierającego 0,68 ml kwasu mrówkowego i 8,2 ml roztworu tetrahydrofuranu zawierającego 1,1 ml n-butyloaminy i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze w zakresie 30°C-35°C przez 1 godzinę i w temperaturze w zakresie 40°C-45°C przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 10 ml wody i rozpuszczalnik organiczny usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany roztwór wodny przemyto 20 ml chloroformu i przemywki ekstrahowano 30 ml wody. Wszystkie warstwy wodne połączono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym [eluent:woda] i otrzymano 0,29 g soli n-butyloamoniowych diwodorofosforanu [(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]metylu w postaci żółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1 1685 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 0,75-0,90 (3H, m), 1,25-1,40 (2H, m), 1,45-1,70 (2H, m), 2,70-2,80 (2H, m), 3,3-4,7 (8H, m), 5,33 (1H, d, J = 10 Hz), 5,42 (1H, d, J = 17 Hz), 5,90 (2H, szer.s), 7,95 (1H, szer.s),

8,34 (1H, d, J = 5,0 Hz), 8,63 (1H, szer.s).

PL 209 765 B1

Przykład referencyjny 16

IX nBuNH₃ O-P-O^o .^{N 0}OH \_Z ho' oh

O

II

N^CONH,

F^N^CONH

8 8 XX ηο-ρ-ο-ρ-ο-ρ-οί 07 °

OH OH OH

HO

OH

0,21 g soli n-butyloamoniowych diwodorofosforanu [(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]metylu zawieszono w mieszaninie rozpuszczalników obejmującej 4,2 ml acetonitrylu i 8,4 ml N,N-dimetyloformamidu, następnie dodano 0,15 g 1,1'-karbonylodiimidazolu i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 19 μ metanolu i mieszano przez 30 minut. Dodano 2,0 ml roztworu N,N-dimetyloformamidu zawierającego 0,86 g pirofosforanu tri-n-butyloamoniowego i otrzymaną mieszaninę mieszano jeszcze przez 14 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskaną pozostałość kolejno oczyszczono metodą jonowymiennej chromatografii kolumnowej [eluent: 0,10 mola/l roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego], a następnie metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami [eluent:woda]. Do otrzymanej substancji stałej dodano 0,90 ml metanolu i 4,5 ml roztworu acetonu zawierającego 0,17 g nadchloranu sodu. Osad odwirowano, przemyto acetonem i otrzymano 60 mg soli sodowych trifosforanu [[2R,3S,4R,5R]-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]metylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 3422, 1686, 1252, 1108 ¹H-NMR (D2O) δ: 4,3-4,5 (5H, m), 6,09 (1H, s), 8,41 (1H, d, J = 5,1 Hz).

Przykład referencyjny 17

0,12 g 6-chloro-4-[{2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 1,2 ml fosforanu trimetylu i podczas oziębiania lodem dodano 38 μ tlenochlorku fosforu, po czym całość mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną podczas oziębiania lodem przelano do 3,0 ml roztworu dimetyloformamidu zawierającego 0,30 ml n-tributyloaminy i 0,72 g pirofosforanu n-tributyloamoniowego i otrzymany roztwór mieszano w tej samej temperaturze przez 5 minut. Do mieszaniny reakcyjnej kolejno dodano 10 ml 0,1 mola/l roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego i 10 ml wody i otrzymaną mieszaninę oczyszczono metodą jonowymiennej chromatografii kolumnowej [eluent: 0,07 mola/l roztwór wodorowęglanu trietyloamoniowego] i metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym [eluent:woda] i uzyskano 41 mg substancji stałej obejmującej sole trietyloamoniowe trifosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-chloro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu. 41 mg otrzymanych soli trietyloamoniowych trifosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-chloro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu rozpuszczono w 0,43 ml metanolu i dodano 2,2 ml roztworu acetonu zawierającego 78 mg nadchloranu sodu. Otrzymaną substancję stałą odwirowano, następnie przemyto 2,2 ml acetonu i uzyskano 26 mg soli sodowych trifosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5 chloro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu.

IR (KBr) cm^-1: 1700, 1654 ¹H-NMR (D2O) δ: 4,25-4,5 (5H, m), 6,08 (1H, s), 8,44 (1H, s).

PL 209 765 B1

Przykład referencyjny 21

Substancję wyjściową, 6-fluoro-3-hydroksy-2-[2-¹⁴C] pirazynokarboksamid [czystość radiochemiczna: 99,0%] wytworzono z [2-¹⁴C] malonianu dietylu znanymi sposobami, sposobami równoważnymi lub stosując kombinację tych sposobów Taki sposób wytwarzania opisano, na przykład, w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym, nr publikacji WO 00/10569.

Przykład referencyjny 23

0,06 g soli sodowych trifosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-{aminokarbonylo)-5-metylo-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci białej substancji stałej wytworzono z 0,1 g 4-[{2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-6-metylo-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie referencyjnym 17. IR (KBr) cm^-1: 1684, 1654 ¹H-NMR (D2O) δ: 2,44 (3H, s), 4,31-4,47 (5H, m), 6,12 (1H, s), 8,20 (1H, s).

Przykład referencyjny 24

0,02 g soli sodowych trifosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-5-fenylo-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci żółtej substancji stałej wytworzono z 0,06 g 4-[{2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-6-fenylo-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie referencyjnym 17. IR (KBr) cm^-1: 1684, 1654 ¹H-NMR (D2O) δ: 4,07-4,41 (5H, m), 6,22 (1H, s), 7,47-7,60 (3H, m), 7,99 (2H, d, J = 7,8 Hz), 8,58 (1H, s).

Przykład referencyjny 25

146 mg soli sodowych trifosforanu {(2S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-4-hydoksytetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci białej substancji stałej wytworzono z 128 mg 4-[(2R,3R,5S)-3-hydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie referencyjnym 17.

¹H-NMR (D2O) δ: 2,04-2,18 (2H, m), 4,23-4,29 (1H, m), 4,50-4,58 (2H, m), 4,78-4,88 (1H, m), 6,03 (1H, s), 7,86 (1H, d, J = 3,8 Hz), 8,41 (1H, d, J = 3,8 Hz).

PL 209 765 B1

Przykład referencyjny 26

0,9 g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu zawieszono w 9 ml N,N-dimetyloacetamidu. Dodano 2,3 ml acetalu dimetylowego benzaldehydu i 160 mg p-toluenosulfonianu pirydyny i mieszaninę mieszano w temperaturze 65°C przez 7 godzin. Następnie roztwór reakcyjny przelano do mieszanego roztworu zawierającego 10 ml octanu etylu i 5 ml wody. Wytrąconą substancję stałą zebrano przez odsączenie i otrzymano 0,24 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2-fenylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu w postaci białej substancji stałej. Następnie przesącz oddzielono, otrzymaną warstwę organiczną przemyto kolejno 5 ml wody i 5 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu, po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość przemyto octanem etylu i otrzymano 0,40 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2-fenylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu w postaci białej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 3440, 1731 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 3,61-3,71 (2H, m), 3,83 (3H, s), 4,50-4,53 (1H, m), 4,86 (1H, dd, J = 2,2, 6,6 Hz), 5,01 (1H, dd, J = 2,0, 6,3 Hz), 5,23 (1H, t, J = 4,9 Hz), 5,95 (1H, s), 6,07 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,457,47 (3H, m), 7,49 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,54-7,57 (2H, m), 8,09 (1H, d, J = 4,4 Hz).

Przykład referencyjny 27

0,30 g 3-hydroksy-2-pirazynokarboksylanu metylu rozpuszczono w 1,5 ml sulfotlenku dimetylu, po czym kolejno dodano 0,70 ml trietyloaminy 0,54 g chlorowodorku estru dietylowego kwasu L-asparaginowego i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 godzin. Do roztworu reakcyjnego dodano chloroformu i wody, pH mieszaniny doprowadzono do wartości 2 dodatkiem 2 mol/l kwasu solnego i warstwę organiczną oddzielono. Otrzymaną warstwę organiczną przemyto wodą, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do uzyskanej pozostałości dodano toluenu i n-heksanu, osad zebrano przez odsączenie i otrzymano 0,18 g (2S)-2-{[(3-hydroksy-2-pirazynylo)karbonylo]amino}butanodioanu dietylu.

¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,27 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,30 (3H, t, J = 7 Hz), 2,94 (1H, dd, J = 4,4, 17,2 Hz), 3,15 (1H, dd, J = 4,8, 17,2 Hz), 4,14-4,23 (2H, m), 4,24-4,32 (2H, m), 4,99-5,02 (1H, m), 8,15 (1H, d, J = 2,6 Hz), 8,40 (1H, d, J = 1,5 Hz), 8,78 (1H, d, J = 5,9 Hz), 12,4 (1H, szer.s).

Przykład referencyjny 30

0,2 g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 4 ml acetonitrylu, po czym podczas oziębiania lodem

PL 209 765 B1 dodano 0,2 ml chlorku difosforylu i mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 20 minut. pH roztworu reakcyjnego doprowadzono do wartości 7 dodatkiem 1 mol/l roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego, a następnie roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym [eluent:woda] i otrzymano 0,29 g soli trietyloamoniowych fosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci substancji stałej. ¹H-NMR (D2O) δ: 1,28 (9H, t, J = 7,3 Hz), 3,20 (6H, q, J = 7,3 Hz), 4,15-4,20 (1H, m), 4,28-4,40 (4H, m), 6,11 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,80 (1H, d, J = 4,2 Hz), 8,34 (1H, d, J = 4,2 Hz).

Do 1,4 ml zawiesiny metanolu zawierającej 0,28 g wytworzonych w powyższym etapie soli trietyloamoniowych kwasu monofosforowego w temperaturze pokojowej dodano 7 ml roztworu acetonu zawierającego 0,35 g nadchloranu sodu i mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę. Osad zebrano przez odsączenie, po czym przemyto acetonem i otrzymano 0,19 g soli sodowych fosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1662 ¹H-NMR (D2O) δ: 4,15-4,19 (1H, m), 4,29-4,38 (4H, m), 6,12 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 3,8 Hz), 8,35 (1H, d, J = 3,8 Hz).

Przykład referencyjny 31

0,11 g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 2,0 ml fosforanu trimetylu, po czym podczas oziębiania lodem dodano 0,11 ml tlenochlorku fosforu i mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 2 godziny. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 6,0 ml roztworu dimetyloformamidu zawierającego 1,2 ml tributyloaminy i 1,12 g fosforanu tributyloamoniowego i otrzymaną mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 0,1 mol/l roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego i otrzymaną mieszaninę pozostawiono w temperaturze pokojowej na 12 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii jonowymiennej [eluent: 0,07 mol/l roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego], zebrano obydwie frakcje zawierające sole trietyloamoniowe difosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu i frakcje zawierające sole trietyloamoniowe trifosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu i otrzymano 143 mg substancji stałej i 113 drugiej substancji stałej. 110 mg z 143 mg otrzymanych soli trietyloamoniowych difosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu rozpuszczono w 3,0 ml metanolu, po czym dodano 7,5 ml roztworu acetonu zawierającego 0,28 g nadchloranu sodu. Substancję stałą odwirowano, a następnie przemyto acetonem i otrzymano 64 mg soli sodowych difosforanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}-metylu w postaci białej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 3418, 1682, 1236, 983, 905 ¹H-NMR (D2O) δ: 4,2-4,5 (5H, m), 6,12 (1H, s), 7,83 (1H, d, J = 3,7 Hz), 8,35 (1H, d, J = 3,7 Hz).

P r z y k ł a d 1

PL 209 765 B1 mg 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu, 44 mg 1H-tetrazolu i 10 mg sit molekularnych 4A zawieszono w 2,0 ml acetonitrylu. Podczas oziębiania lodem w porcjach dodano 3,0 ml roztworu acetonitrylu zawierającego 0,16 g fosforoamidytu bis(S-piwaloilo-2-tioetylo)-N,N-diizopropylu, który wytworzono oddzielnie sposobem opisanym w Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), vol. 38, nr 20, str. 3941 do 3950 (1995), i otrzymaną mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 40 minut. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 1,0 ml roztworu acetonitrylu zawierającego 78 mg kwasu m-chloronadbenzoesowego i otrzymaną mieszaninę mieszano jeszcze przez 10 minut w tej samej temperaturze. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 10 ml octanu etylu i 10 ml wody. Warstwy organiczne rozdzielono, a warstwę wodną wyekstrahowano 20 ml octanu etylu. Wszystkie warstwy organiczne połączono i przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 50:1] i otrzymano 68 mg estru S-(2-{[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1 -ylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1 ,3]dioksol-4-ilometoksy]-[2-(2,2-dimetylopropionylosulfanylo)-etoksy]-fosforyloksy}-etylowego kwasu 2,2-dimetylo-tiopropionowego w postaci żółtego oleistego produktu.

IR (nierozcieńczony) cm^-1: 1684 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,22 (9H, s), 1,23 (9H, s), 1,40 (3H, s), 1,65 (3H, s), 3,08 (2H, t, J = 6,9 Hz), 3,10 (2H, t, J = 6,8 Hz), 4,04-4,12 (4H, m), 4,29-4,36 (1H, m), 4,39-4,45 (1H, m), 4,59-4,64 (1H, m), 4,86-4,88 (2H, m), 6,02 (szer.s, 1H), 6,05 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,84 (1H, d, J = 4,3 Hz), 7,87 (1H, d, J = 4,3 Hz), 9,17 (szer.s, 1H).

P r z y k ł a d 2

mg estru S-(2-{[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilometoksy]-[2-(2,2-dimetylopropionylosulfanylo)-etoksy]-fosforyloksy}etylu kwasu 2,2-dimetylotiopropionowego rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników, 2,4 ml wody i 2,4 metanolu, w porcjach dodano 1,2 g żywicy jonowymiennej Dowex 50WX4-200 (postać H+) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Mieszaninę reakcyjną przesączono, usuniętą żywicę przemyto metanolem i przesącz połączono z przemywkami. Następnie rozpuszczalnik organiczny usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad zebrano przez odsączenie i otrzymano 36 mg estru S-(2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-3,4-dihydroksy-tetra-hydrofuran-2-ylometoksy]-[2-(2,2-dimetylopropionylosulfanylo)-etoksy]-fosforyloksy]-etylu kwasu 2,2-dimetylo-tiopropionowego w postaci białej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1 1677, 1660 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,22 (9H, s), 1,23 (9H, s), 3,11 (4H, t, J = 7,0 Hz), 3,67 (1H, szer.s), 4,05-4,15 (4H, m), 4,25-4,38 (3H, m), 4,44-4,52 (2H, m), 4,67 (1H, szer.s), 6,04 (1H, d, J = 3,7 Hz), 6,10 (szer.s, 1H), 7,90 (1H, d, J = 4,1 Hz), 8,08 (1H, d, J = 4,1 Hz), 8,95 (1H, szer.s).

PL 209 765 B1 mg estru S-(2-{[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(3-karbamoilo-5-chloro-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-2,2-dimetylo-tetrahydrofuro-[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilometoksy]-[2-(2,2-dimetylopropionylosulfanylo)-etoksy]fosforyloksy}-etylu kwasu 2,2-dimetylotiopropionowego, w postaci żółtego oleistego produktu, otrzymano z 40 mg 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-6-chloro-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie 1.

IR (nierozcieńczony) cm^-1: 1687 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,21 (9H, s), 1,22 (9H, s), 1,40 (3H, s), 1,64 (3H, s), 3,07 (2H, dt, J = 7,0, 1,5 Hz),

3,14 (2H, t, J = 6,8 Hz), 4,06-4,16 (4H, m), 4,34-4,39 (1H, m), 4,42-4,47 (1H, m), 4,63-4,65 (1H, m),

4,85 (1H, dd, J = 6,4, 2,2 Hz), 4,89 (1H, d, J = 6,2, 2,8 Hz), 6,04 (1H, d, J = 2,2 Hz), 6,17 (1H, szer.s),

7,98 (1H, s), 9,07 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 4

mg estru S-(2-{[(2R,3S,4R,5R)-5-(3-karbamoilo-5-chloro-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-3,4-dihydroksy-tetrahydrofuran-2-ylometoksy]-[2-(2,2-dimetylo-propionylosulfanylo)-etoksy]-fosforyloksy}-etylowego kwasu 2,2-dimetylotiopropionowego, w postaci żółtego oleistego produktu, otrzymano z 12 mg estru S-(2-{[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(3-karbamoilo-5-chloro-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro-[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilometoksy]-[2-(2,2-dimetylopropionylosulfanylo)-etoksy]-fosforyloksy}-etylowego kwasu 2,2-dimetylotiopropionowego, w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie 2.

IR (nierozcieńczony) cm^-1: 1686, 1654 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,21 (9H, s), 1,23 (9H, s), 3,00 (1H, szer.s), 3,10-3,16 (4H, m), 3,83 (1H, szer.s), 4,05-4,20 (4H, m), 4,25-4,55 (5H, m), 6,02 (1H, d, J = 2,4 Hz), 6,40 (1H, szer.s), 8,15 (1H, s), 8,81 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 5

0,05 g 4-[(3aR,4R,6S,6aR)-6-(jodometylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 2 ml toluenu. Dodano 70 mg soli srebrowych fosforanu bis(2,2-dimetylopropionyloksymetylu), które wytworzono oddzielnie sposobem opisanym w Journal of Medicinal Chemistry (J. Med. Chem.), vol. 37, str. 3902 do 3909 (1994), i mieszaninę mieszano w temperaturze 60°C przez 2 godziny. 0,15 g 4-[(3aR,4R,6S,6aR)-6-(jodometylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu potraktowano w ten sam sposób. Otrzymane mieszaniny reakcyjne połączono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 10:1] i otrzymano 0,12 g estru [(3aR,4R,6R,6aR)-6-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-2,2-dimetylo-tetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilometoksy]-(2,-2-dimetylopropionyloksymetoksy)-fosforyloksymetylowego kwasu 2,2-dimetylopropionowego w postaci żółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1750, 1684, 1654

PL 209 765 B1 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,14 (18H, s), 1,29 (3H, s), 1,51 (3H, s), 3,5-3,7 (2H, m), 4,34 (1H, dd, J = 4,0, 7,2Hz), 4,75 (1H, dd, J = 2,8, 6,0 Hz), 4,86 (1H, dd, J = 2,0, 6,0 Hz), 5,23 (1H, t, J = 4,8 Hz), 5,31 (2H, s), 5,34 (2H, s), 5,97 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,56 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,83 (1H, szer.s), 8,06 (1H, d, J = 4,4 Hz), 8,43 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 6

0,1 g estru [(3aR,4R,6R,6aR)-6-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-2,2-dimetylo-tetrahydrofuro[3,4-d][1,3]-dioksol-4-ilometoksy]-(2,2-dimetylo-propionyloksy-metoksy)-fosforyloksymetylowego kwasu 2,2-dimetylopropionowego rozpuszczono w mieszanym roztworze zawierającym 1,5 ml metanolu i 1,5 ml wody, po czym dodano 5 ml żywicy jonowymiennej Dowex 50WX4-200 (postać H+) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Następnie żywicę usunięto przez odsączenie i przemyto mieszanym roztworem złożonym z 2,5 ml acetonitrylu i 2,5 ml wody. Otrzymane przemywki połączono z przesączem i rozpuszczalnik organiczny usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość liofilizowano i otrzymano 0,07 g estru [(2R,3S,4R,5R)-5-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-3,4-dihydroksytetrahydro-furan-2-ylometoksy]-(2,2-dimetylopropionyloksymetoksy)-fosforyloksymetylowego kwasu 2,2-dimetylo-propionowego w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1751, 1670 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,16 (18H, s), 3,64 (1H, dd, J = 2,0, 12,4 Hz), 3,81 (1H, dd, J = 2,0, 12,4 Hz), 3,9-4,0 (3H, m), 5,46 (2H, s), 5,49 (2H, s), 5,92 (1H, d, J = 2,4 Hz), 7,54 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,75 (1H, szer.s), 8,29 (1H, d, J = 4,4 Hz), 8,35 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 7

0,50 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4 dihydro-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 50 ml pirydyny. Następnie do zawiesiny kolejno dodano 43 ml roztworu tetrahydrofuranu zawierającego 2,2 g P^N-L-alaninianu metylochlorofenylofosforylu, który wytworzono oddzielnie sposobem opisanym w Antiviral Research, vol. 43, str. 37 do 53 (1999), i 1,3 ml N-metyloimidazolu i mieszaninę mieszano tej samej temperaturze przez 3 godziny. Z mieszaniny reakcyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem usunięto rozpuszczalnik. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 40:1] i otrzymano 0,43 g estru metylowego kwasu (2S)-[[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-2,2-dimetylo-tetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilometoksy]-fenoksyfosforyloamino]propionowego w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1749, 1684 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,22, 1,23 (3H, d, J = 7,1 Hz), 1,28, 1,30 (3H, s), 1,50, 1,51 (3H, s), 3,58, 3,60 (3H, s), 3,80-3,88 (1H, m), 4,15-4,34 (2H, m), 4,42-4,45, 4,50-4,54 (1H, m), 4,74, 4,81 (1H, dd, J = 2,0, 6,3 Hz), 4,67, 4,93 (1H, dd, J = 3,0, 6,1 Hz), 5,94-5,97 (1H, m), 6,09-6,15 (1H, m), 7,08-7,20 (3H, m), 7,32-7,39 (2H, m), 7,46, 7,51 (1H, d, J = 4,0 Hz), 7,75-7,80 (1H, szer.s), 7,84-7,87 (1H, m), 8,26-8,32 (1H, m).

PL 209 765 B1

A, -NH .N^CONH, (A f Ύ

Ο-4ΛΫ

N^CONH, K^o r oo

COOMe

NH

HO

COOMe

OH mg estru metylowego kwasu (2S)-{[(2R,3S,4R,5R)-5-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-3,4-dihydroksy-tetrahydro-furan-2-ylometoksy]-fenoksy-fosforyloamino}-propionowego, w postaci białej substancji stałej, otrzymano z 190 mg estru metylowego kwasu (2S)-{[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(3-karbamoilo-2-okso-2H-pirazyn-1-ylo)-2,2-dimetylo-tetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilometoksy]-fenoksy-fosforyloamino}propionowego w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie 2.

IR (KBr) cm^-1: 1735, 1676, 1661 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,21, 1,23 (3H, d, J = 7,2 Hz), 3,57, 3,58 (3H, s), 3,81-3,98 (2H, m), 4,02-4,04 (1H, m), 4,12-4,41 (3H, m), 5,60 (2H, szer.s), 5,91-5,94 (1H, m), 6,10-6,20 (1H, m), 7,15-7,24 (3H, m), 7,34-7,45 (3H, m), 7,73 (1H, szer.s), 7,81, 7,86 (1H, d, J = 4,2 Hz), 8,29 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 10

1,2 g benzoesanu [(2R,3R,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-metylo-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)tetrahydro-2-furanylo]metylu, w postaci żółtego oleistego produktu, otrzymano z 0,43 g 3-hydroksy-6-metylo-2-pirazynokarboksamidu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie referencyjnym 6.

IR (KBr) cm^-1: 1727, 1686, 1654 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 2,15 (3H, s), 4,67 (1H, dd, J = 3,4, 12,7 Hz), 4,85-4,88 (1H, m), 4,99 (1H, dd, J = 2,4, 12,7 Hz), 5,88-5,95 (2H, m), 6,03 (1H, d, J = 3,2 Hz), 6,47 (1H, d, J = 3,9 Hz), 7,36-7,65 (10H, m), 7,93-8,00 (4H, m), 8,10-8,13 (2H, m), 9,12 (1H, d, J = 3,9 Hz).

P r z y k ł a d 11

0,4 g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-6-metylo-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu, w postaci jasnożółtej substancji stałej, otrzymano z 1,05 g benzoesanu [(2R,3R,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-metylo-2-okso-1(2H)pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)tetrahydro-2-furanylo]metylu takim samym sposobem, jak opisano w przykładzie referencyjnym 7. IR (KBr) cm^-1: 1698, 1654 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 2,24 (3H, s), 3,62-3,67 (1H, m), 3,80-3,85 (1H, m), 3,94-4,01 (3H, m), 5,10 (1H, d, J = 5,1 Hz), 5,32 (1H, t, J = 4,8 Hz), 5,62 (1H, d, J = 3,2 Hz), 5,92 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,76 (1H, szer.s), 8,16 (1H, s), 8,48 (1H, szer.s).

PL 209 765 B1

P r z y k ł a d 12

0,5 g benzoesanu [(2R,3R,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-5-fenylo-1(2H)-pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)tetrahydro-2-furanylo]metylu, w postaci żółtego oleistego produktu, otrzymano z 0,35 g 3-hydroksy-6-fenylo-2-pirazynokarboksamidu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie referencyjnym 6.

IR (KBr) cm^-1: 1720, 1717, 1684, 1654 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 4,77 (1H, dd, J = 3,6, 12,4 Hz), 4,90-4,97 (2H, m), 5,93-5,99 (2H, m), 6,03 (1H, d, J = 3,7 Hz), 6,58 (1H, d, J = 4,2 Hz), 7,32-7,68 (14H, m), 7,95-8,05 (6H, m), 8,11 (1H, s), 8,93 (1H, d, J = 3,4 Hz).

P r z y k ł a d 13

0,12 g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-6-fenylo-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu, w postaci żółtej substancji stałej, otrzymano z 0,48 g benzoesanu [(2R,3R,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-5-fenylo-1(2H)-pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)tetrahydro-2-furanylo]metylu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie referencyjnym 7.

IR (KBr) cm^-1: 1685, 1670, 1654 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 3,71-3,75 (1H, m), 3,93-3,97 (1H, m), 4,02-4,15 (3H, m), 5,10 (1H, d, J = 6,6 Hz), 5,67 (1H, t, J = 4,0 Hz), 5,73 (1H, d, J = 4,6 Hz), 5,96 (1H, s), 7,32-7,46 (3H, m), 7,82 (1H, szer.s), 7,88 (2H, d, J = 7,8 Hz), 8,43 (1H, szer.s), 9,07 (1H, s).

P r z y k ł a d 14

0,24 g 3-hydroksy-2-pirazynoksarboksamidu zawieszono w 5 ml 1,1,1,3,3,3-heksametylodisilazanu i zawiesinę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Po oziębieniu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano 5 ml ksylenu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do otrzymanej pozostałości dodano kolejno 12,5 ml acetonitrylu, 0,50 g benzoesanu [(2S,4R)-4,5-bis(acetyloksy)-tetrahydro-2-furanylo]metylu i 0,29 ml chlorku cyny (IV)

PL 209 765 B1 i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do roztworu reakcyjnego dodano wody i rozpuszczalnik organiczny usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie do pozostałości dodano nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu i octanu etylu i nierozpuszczone substancje usunięto przez odsączenie. Warstwę organiczną oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu. Otrzymaną warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 16:1] i otrzymano 0,61 g benzoesanu {(2S,4R,5R)-4-(acetyloksy)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1743, 1706, 1667 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 2,13-2,23 (5H, m), 4,67 (1H, dd, J= 4,0, 12,8 Hz), 4,78-4,85 (2H, m), 5,48 (1H, d, J = 4,0 Hz), 6,05 (1H, s), 6,61 (1H, szer.s), 7,47-7,51 (2H, m), 7,58 (1H, d, J = 4,0 Hz), 7,62-7,66 (1H, m), 7,96 (1H, d, J = 4,0 Hz), 8,02-8,04 (2H, m), 9,06 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 15

1,21 g benzoesanu {(2S,4R,5R)-4-(acetyloksy)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-2-furanylo}metylu rozpuszczono w 36 ml metanolu i podczas oziębiania lodem dodano 1,28 g 28% roztworu metanolanu sodu w metanolu, po czym całość mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę. pH roztworu reakcyjnego doprowadzono do wartości 5 dodatkiem 1 mol/l kwasu solnego, po czym rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent: n-heksan:octan etylu = 4:1 i dodano mieszaninę rozpuszczalników, 2-propanolu i octanu etylu. Osad zebrano przez odsączenie i otrzymano 0,47 g 4-[(2R,3R,5S)-3-hydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w postaci białej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1682, 1654 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,72 (1H, dd, J = 5,2, 13,2 Hz), 1,86-1,93 (1H, m), 3,61-3,66 (1H, m), 3,88-3,93 (1H, m), 4,25 (1H, t, J = 4,0 Hz), 4,43-4,48 (1H, m), 5,28 (1H, t, J = 5,0 Hz), 5,77 (1H, d, J = 4,0 Hz),

5,82 (1H, s), 7,56 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,76 (1H, szer.s), 8,37 (1H, d, J = 4,4 Hz), 8,42 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 16

0,5 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu rozpuszczono w 5 ml N,N-dimetyloformamidu, po czym dodano 0,29 g 1,1'-karbonylodiimidazolu i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodano 0,21 ml 1,4-butanodiolu i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a potem w temperaturze 60°C przez 1 godzinę. Dodano jeszcze 0,29 ml 1,4-butanodiolu i mieszaninę mieszano w temperaturze 60°C przez 3 godziny. Roztwór reakcyjny zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym do koncentratu dodano 30 ml octanu etylu, 30 ml

PL 209 765 B1 wody i 5 ml nasyconego roztworu solanki. Warstwy organiczne oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano 20 ml octanu etylu. Warstwy organiczne połączono, następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent:octan etylu:metanol = 10:1] i otrzymano 0,31 g 4-hydroksybutylowę glanu {(3aR,4R,6R,6aR)-6-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo}metylu w postaci jasnożółtego oleistego produktu.

IR (KBr) cm^-1: 1750, 1684, 1654 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,41 (3H, s), 1,47-1,54 (2H, m), 1,62-1,68 (5H, m), 3,60-3,66 (2H, m), 4,04-4,16 (2H, m), 4,32 (1H, dd, J = 3,2, 12,4 Hz), 4,48 (1H, dd, J = 2,2, 12,2 Hz), 4,73-4,76 (1H, m), 4,79 (1H, dd, J = 2,4, 6,0 Hz), 4,92 (1H, dd, J = 1,8, 6,2 Hz), 5,98 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,31 (1H, d, J = 23,6 Hz), 7,77 (1H, s), 7,75 (1H, s), 8,78 (1H, szer.), 9,25 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 17

1,2 g 4-hydroksybutylowęglanu {(3aR,4R,6R,6aR)-6-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo}metylu rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników, 8 ml metanolu i 60 ml wody, i dodano 19 g żywicy jonowymiennej Dowex 50WX4-200 (postać H+), po czym całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie, żywicę usunięto przez odsączenie i przemyto metanolem, a potem wodą. Otrzymany przesącz połączono z przemywkami i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w wodzie, po czym roztwór liofilizowano. Uzyskaną stałą substancję przemyto acetonitrylem, a następnie chloroformem i otrzymano 0,16 g 4-hydroksy-butylowęglanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci bezbarwnej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1745, 1664 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,45-1,51 (2H, m), 1,64-1,67 (2H, m), 3,40-3,42 (2H, m), 3,90 (1H, d, J = 4,8 Hz), 4,08-4,15 (4H, m), 4,36-4,47 (3H, m), 5,38 (1H, d, J = 5,2 Hz), 5,74 (1H, szer.s), 5,92 (1H, s), 7,50 (1H, d, J = 3,6 Hz), 7,75 (1H, szer.s), 7,81 (1H, d, J = 3,6 Hz), 8,30 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 18

200 mg octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-3-furanylu rozpuszczono w 2 ml pirydyny, dodano 0,1 ml monohydratu hydrazyny i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodano acetonu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent:octan etylu:metanol = 10:1] i otrzymano 42 mg octanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]metylu w postaci białej substancji stałej.

PL 209 765 B1 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 3,20 (3H, s), 3,90 (1H, dd, J= 6,8, 11,5), 4,06-4,09 (1H, m), 4,12-4,17 (1H, m), 4,31 (1H, dd, J = 5,6, 12,7), 4,35 (1H, dd, J = 3,4, 12,7), 5,33 (1H, d, J = 6,6), 5,73 (1H, d, J = 5,1), 5,90 (1H, d, J = 2,0), 7,57 (1H, d, J = 4,4), 7,75 (1H, szer.s), 7,85 (1H, d, J = 4,4), 8,31 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 19

g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)-tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 25 ml bezwodnika octowego i 12,5 ml pirydyny i zawiesinę mieszano w temperaturze 50°C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 70°C przez 1 godzinę. Po oziębieniu zawiesiny do temperatury pokojowej nierozpuszczone substancje usunięto przez odsączenie. Pozostałość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym koncentrat oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent:octan etylu] i otrzymano 1,26 g octanu (2R,3R,4R,5R)-2-[3-[(acetyloamino)karbonylo]-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-4-(acetyloksy)-5-[(acetyloksy)metylo]tetrahydro-3-furanylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1750, 1709 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 2,06 (6H, s), 2,09 (3H, s), 2,17 (3H, s), 4,26-4,42 (3H, m), 5,35 (1H, t, J = 6,1 Hz), 5,50 (1H, dd, J = 3,7, 6,1 Hz), 6,06 (1H, d, J = 3,4 Hz), 7,50 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,83 (1H, d, J = 4,4 Hz), 11,44 (1H, s).

P r z y k ł a d 20

0,2 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 1 ml bezwodnika octowego i 4 ml pirydyny i zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Roztwór reakcyjny zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, do pozostałości dodano 5 ml wody i mieszaninę ekstrahowano 10 razy 5 ml octanu etylu. Warstwy organiczne połączono, dodano 1 ml wody i pH otrzymanego roztworu doprowadzono do wartości 3 dodatkiem 2 mol/l kwasu solnego. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu, po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Następnie, rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 10:1] i otrzymano 0,15 g octanu {(3aR,4R,6R,6aR)-6-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo}-metylu w postaci jasnożółtego oleistego produktu. IR (KBr) cm^-1: 1743, 1685

PL 209 765 B1 ¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,41 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,94 (3H, s), 4,32 (1H, dd, J = 4,4, 12,5 Hz), 4,40 (1H, dd, J = 2,9, 12,5 Hz), 4,68-4,71 (1H, m), 4,76 (1H, dd, J = 2,9, 6,1 Hz), 4,87 (1H, dd, J = 2,1, 6,2 Hz), 5,95 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,17 (1H, szer.s), 7,70 (1H, d, J = 4,2 Hz), 7,80 (1H, d, J = 4,2 Hz), 9,13 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 21 ^N^COOMe θ_γθ

Ph ^N^CONH.

i X ' wyoj )“C °_Y°

Ph

0,5 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2-fenylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksylanu metylu zawieszono w 15 ml roztworu metanolu zawierającego około 5 mol/l suchego amoniaku i zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Osad zebrano przez odsączenie, przemyto metanolem i otrzymano 0,34 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2-fenylotetra-hydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w postaci bezbarwnej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1684 ¹H-NMR (DMSO-d6): 3,61-3,75 (2H, m), 4,52-4,54 (1H, m), 4,87 (1H, dd, J = 2,4, 6,3 Hz), 5,00 (1H, dd, J = 2,2, 6,6 Hz), 5,25 (1H, t, 4,9 Hz), 5,96 (1H, s), 6,10 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,45-7,48 (3H, m), 7,54-7,57 (3H, m), 7,76 (1H, szer.s), 8,06 (1H, d, J = 4,4 Hz), 8,34 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 22 ,Ν^ΟΟΝΗ, i X

N OH

AcO

ΎΖ <?>

OAc

OAc i ΎΖ .N^CONH, i X

AcO

AcO OAc

1,39 g 3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 10 ml 1,1,1,3,3,3-heksametylodisilazanu i zawiesinę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę. Po oziębieniu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie dodano 5 ml toluenu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do otrzymanej pozostałości kolejno dodano 15 ml acetonitrylu, 4,14 g 1,2,3,5-tetraoctanu β-D-rybofuranozy i 1,99 ml trifluorometanosulfonianu trimetylosililu i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie dodano 0,95 g β-D-rybofuranozo-1,2,3,5-tetraoctanu i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej jeszcze przez 1 godzinę. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i dodano chloroformu i wody. Warstwę organiczną oddzielono i przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano octanu etylu, osad zebrano przez odsączenie i otrzymano 1,73 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-3-furanylu.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 2,10 (3H, s), 2,16 (3H, s), 2,17 (3H, s), 4,40-4,52 (3H, m), 5,29 (1H, t, J = 6,2 Hz), 5,48 (1H, dd, J = 3,2, 5,1 Hz), 6,05 (1H, szer.s), 6,16 (1H, d, J = 3,2 Hz), 7,79 (1H, d, J = 4,2 Hz), 7,81 (1H, d, J = 4,2 Hz), 8,98 (1H, szer.s).

PL 209 765 B1

P r z y k ł a d 23

< **

AcO OAc

0,40 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-3-furanylu zawieszono w tetrahydrofuranie, po czym do zawiesiny podczas oziębiania lodem kolejno dodano 0,06 g wodorku sodu (60% zawiesina w oleju mineralnym) i 0,14 ml chlorku piwaloilu. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie dodano jeszcze 0,06 g wodorku sodu (60% zawiesina w oleju mineralnym) i 0,14 ml chlorku piwaloilu i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Dodano jeszcze 0,06 g wodorku sodu (60% zawiesina w oleju mineralnym) i 0,14 ml chlorku piwaloilu i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Do roztworu reakcyjnego dodano octanu etylu i wody. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto wodą i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent:n-heksan:octan etylu = 3:1] i otrzymano 0,14 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-{[(2,2-dimetylo-propanoilo)amino]karbonylo}-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-3-furanylu w postaci żółtej substancji stałej.

¹H-NMR (CDCl3) δ: 1,30 (9H, s), 2,13 (3H, s), 2,16 (6H, s), 4,39-4,49 (2H, m), 4,52-4,55 (1H, m), 5,29 (1H, t, J = 5,9 Hz), 5,48 (1H, dd, J = 3,7, 5,6 Hz), 6,22 (1H, d, J = 3,4 Hz), 7,84 (1H, d, J = 4,2 Hz), 7,86 (1H, d, J = 4,2 Hz), 11,82 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 24

0,16 g (2S)-2-{[(3-hydroksy-2-pirazynylo)karbonylo]amino}butanodioanu dietylu zawieszono w 2 ml 1,1,1,3,3,3-heksametylodisilazanu i zawiesinę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę. Po oziębieniu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano 1 ml toluenu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do otrzymanej pozostałości kolejno dodano ml acetonitrylu, 0,24 g 1,2,3,5-tetraoctanu β-D-rybofuranozy- i 0,11 ml trifluorometanosulfonianu trimetylosililu i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Dodano chloroformu i wody i oddzielono warstwę organiczną. Otrzymaną warstwę organiczną przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 40:1] i otrzymano 0,25 g (2S)-2-([(4-{(2R,3R,4R,5R)-3,4-bis(acetyloksy)-5-[(acetyloksy)metylo]tetrahydro-2-furanylo}-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynylo)karbonylo]amino}butanodioanu dietylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,25 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,28 (3H, t, J = 7,2 Hz), 2,10 (3H, s), 2,15 (3H, s), 2,17 (3H, s), 2,98 (1H, dd, J = 4,8, 17,2 Hz), 3,11 (1H, dd, J = 4,8, 17,2 Hz), 4,13-4,18 (2H, m), 4,21-4,28 (2H, m), 4,40-4,47 (2H, m), 4,49-4,51 (1H, m), 5,09-5,12 (1H, m), 5,26-5,28 (1H, m), 5,43-5,44 (1H,

m), 6,27 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,77 (1H, d, J = 4,0 Hz), 7,79 (1H, d, J = 4,0 Hz), 10,13 (1H, d, J = 8,1 Hz).

PL 209 765 B1

P r z y k ł a d 25

0,21 g (2S)-2-{[(4-{(2R,3R,4R,5R)-3,4-bis(acetyloksy)-5-[(acetyloksy)metylo]tetrahydro-2-furanylo}-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynylo)karbonylo]amino}butanodioanu dietylu rozpuszczono w etanolu, po czym podczas oziębiania lodem dodano 75 mg etanolanu sodu i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu mieszania mieszaninę pozostawiono w temperaturze pokojowej na noc. Kolejno dodano 0,13 ml kwasu octowego i 1 ml wody i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent:chloroform:metanol = 40:1]. Do otrzymanej pozostałości dodano octanu etylu i n-heksanu, osad zebrano przez odsączenie i otrzymano 39 mg (2S)-2-([(4-{(2R,3R,4S,5R)-5-[(acetyloksy)-metylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynylo)karbonylo]amino}butanodioanu dietylu w postaci żółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1739, 1670 ¹H-NMR (DMSO-d6): 1,18 (6H, t, J = 6,8 Hz), 2,10 (3H, s), 2,89 (2H, szer.s), 3,90 (1H, szer.s), 4,074,15 (6H, m), 4,30-4,38 (2H, m), 4,87-4,92 (1H, m), 5,30-5,34 (1H, m), 5,77-5,79 (1H, m), 5,91 (1H, s), 7,70 (1H, d, J = 3,4 Hz), 7,96 (1H, d, J = 3,4 Hz), 9,83 (1H, d, J = 7,6 Hz).

P r z y k ł a d 26

0,31 g 4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroksymetylo)-2,2-dimetylotetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu rozpuszczono w 2 ml N,N-dimetyloformamidu, po czym kolejno dodano 0,33 g N-(t-butoksykarbonylo)-L-waliny, 12 mg 4-dimetyloaminopirydyny i 0,41 g 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Do mieszaniny dodano 0,5 ml kwasu octowego i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie dodano octanu etylu i wody i substancje nierozpuszczone usunięto przez odsączenie. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto 1 mol/l kwasu solnego i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym [eluent:octan etylu] i otrzymano 0,40 g (2S)-2-[(tert-butoksy-karbonylo)amino]-3-metylobutanianu {(3aR,4R,6R,6aR)-6-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-2,2-dimetylotetra-hydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo}metylu w postaci żółtej substancji stałej.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 0,83-0,86 (6H, m), 1,30 (3H, s), 1,38 (9H, s), 1,52 (3H, s), 1,86-1,95 (1H, m), 3,79 (1H, t, J = 7,2 Hz), 4,27-4,34 (2H, m), 4,46 (1H, szer.s), 4,78-4,80 (1H, m), 5,03 (1H, d, J = 6,1 Hz), 6,00 (1H, s), 7,24 (1H, d, J = 7,2 Hz), 7,54 (1H, d, J = 4,3 Hz), 7,77 (1H, szer.s), 7,86 (1H, d, J = 4,3 Hz), 8,28 (1H, szer.s).

PL 209 765 B1

P r z y k ł a d 27 jN^CONH,

V/^N ° ⁰ A H jN^CONH, °X°

Η 0 'N'O * Χ°γ^Νγ^Αο^ζΑ0Γ

HO OH

0,26 g (2S)-2-[(tert-butoksy-karbonylo)amino]-3-metylobutanianu {(3aR,4R,6R,6aR)-6-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-2,2-dimetylotetra-hydrofuro[3,4-d][1,3]dioksol-4-ilo}metylu rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników, 3 ml metanolu i 3 ml wody, po czym dodano 2,6 g żywicy jonowymiennej Dowex 50WX4-200 (postać H+) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie żywicę usunięto przez odsączenie, przemyto metanolem, a potem wodą. Otrzymany przesącz połączono z przemywkami i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano 2 ml toluenu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano 70 mg (2S)-2-[(tertbutoksykarbonylo)amino]-3-metylobutanianu {(2R,3S,4R,6R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 0,87-0,91 (6H, m), 1,38 (9H, s), 1,97-2,05 (1H, m), 3,53 (2H, szer.s), 3,85-3,93 (2H, m), 4,07 (1H, szer.s), 4,19 (1H, szer.s), 4,31-4,35 (1H, m), 4,39-4,42 (1H, m), 5,92 (1H, s), 7,32 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,60 (1H, d, J = 4,1 Hz), 7,76 (1H, szer.s), 7,87 (1H, d, J = 4,1 Hz), 8,32 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 28

14,1 g 3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 150 ml toluenu i zawiesinę mieszano pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę, po czym odwodniono przez destylację azeotropową. Po oziębieniu do temperatury pokojowej rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano 42,3 ml 1,1,1,3,3,3-heksametylodisilazanu i otrzymaną mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano 45 ml toluenu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Czynność tę powtórzono 2 razy, stosując 45 ml toluenu. Pozostałość rozpuszczono w 40 ml acetonitrylu, po czym mieszaninę dodano do 100 ml roztworu acetonitrylu zawierającego 48,4 g 1-octanu-2,3,5-tribenzoesanu β-D-rybofuranozy. Do mieszaniny w temperaturze pokojowej wkroplono 25 g chlorku cyny (IV). Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 50°C przez 4,5 godziny. Po oziębieniu do temperatury pokojowej roztwór dodano do mieszanego roztworu obejmującego 100 g wodorowęglanu sodu, 500 ml wody i 280 ml chlorku metylenu. Nierozpuszczone substancje odsączono i oddzielono warstwę organiczną. Otrzymaną warstwę organiczną przemyto 50 ml wody i 50 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do otrzymanej pozostałości dodano 280 ml octanu etylu i 30 ml wody i mieszaninę ogrzewano do temperatury 50°C, a następnie oziębiono do temperatury 5°C. Osad zebrano przez odsączenie i otrzymano 40,9 g benzoesanu [(2R,3R,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)tetrahydro-2-furanylo]metylu w postaci szarawo-białej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1729, 1683 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 4,69-4,78 (2H, m), 4,88-4,92 (1H, m), 5,97-6,05 (2H, m), 6,34 (1H, d, J = 2,4 Hz), 7,40-7,54 (7H, m), 7,62-7,71 (3H, m), 7,80 (1H, szer.s), 7,84-7,86 (2H, m), 7,95-8,03 (5H, m), 8,22 (1H, m).

PL 209 765 B1

P r z y k ł a d 29

Do 330 ml zawiesiny metanolu zawierającego 35 g benzoesanu [(2R,3R,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)tetrahydro-2-furanylo]metylu w temperaturze pokojowej dodano 17,5 ml wody zawierającej 2,2 g wodorotlenku sodu. Mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 2 godziny, po czym oziębiono do temperatury 5°C. Otrzymany osad zebrano przez odsączenie i uzyskano 12,5 g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w postaci jasnożółtej substancji stałej (zawartość wody: 0,4%).

IR (KBr) cm^-1: 3406, 1654 ¹H-NMR (DMSO-d6): 3,65 (1H, ddd, J = 2,6, 5,1, 12,5 Hz), 3,81 (1H, ddd, J = 2,2, 4,8, 12,1 Hz), 3,964,00 (2H, m), 4,01-4,03 (1H, m), 5,10 (1H, d, J = 5,9 Hz), 5,28 (1H, t, J = 4,9 Hz), 5,64 (1H, d, J = 4,8 Hz), 5,93 (1H, d, J = 2,6 Hz), 7,54 (1H, d, J = 4,0 Hz), 7,74 (1H, s), 8,29 (1H, d, J = 4,0 Hz), 8,36 (1H, s).

P r z y k ł a d 29 (2) g 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)-tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu, wytworzonego w przykładzie 29, rozpuszczono w 300 ml wody (45°C), dodano 1,1 g aktywowanego węgla i całość mieszano przez 10 minut. Aktywowany węgiel odsączono i przemyto dwukrotnie 20 ml wody. Przesącz połączono z przemywkami i dodano 1,1 g aktywowanego węgla, a następnie całość mieszano przez 10 minut. Aktywowany węgiel odsączono, przemyto dwukrotnie 20 ml wody, a następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Do koncentratu dodano 90 ml, mieszaninę przesączono i otrzymano 9,35 g monohydratu 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w postaci bezbarwnego kryształu (zawartość wody: 6,8%).

IR (KBr) cm^-1: 3578, 3399, 3091, 2929, 1674 ¹H-NMR (DMSO-d6): 3,65 (1H, ddd, J= 2,6, 5,1, 12,5 Hz), 3,81 (1H, ddd, J = 2,2, 4,8, 12,1 Hz), 3,964,00 (2H, m), 4,01-4,03 (1H, m), 5,10 (1H, d, J = 5,9 Hz), 5,28 (1H, t, J = 4,9 Hz), 5,64 (1H, d, J = 4,8 Hz), 5,93 (1H, d, J = 2,6 Hz), 7,54 (1H, d, J = 4,0 Hz), 7,74 (1H, s), 8,29 (1H, d, J = 4,0 Hz), 8,36 (1H, s).

P r z y k ł a d 30

0,47 g benzoesanu [(2R,3R,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)tetrahydro-2-furanylo]metylu, w postaci jasnożółtej substancji stałej, wytworzono z 0,23 g 6-fluoro-3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie przygotowawczym 6.

IR (KBr) cm^-1: 1726, 1690 ¹H-NMR (DMSO-d6): 4,6-5,0 (3H, m), 5,9-6,1 (2H, m), 6,33 (1H, s), 7,3-8,2 (17H, m), 8,53 (1H, szer.s).

PL 209 765 B1

P r z y k ł a d 31

7,37 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-3-furanylu, w postaci jasnożółtej substancji stałej, wytworzono z 4,0 g 6-fluoro-3-hydroksy-2-pirazynokarboksamidu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie przygotowawczym 6.

IR (KBr) cm^-1: 1748, 1715, 1662 ¹H-NMR (CDCI3) δ: 2,04 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,18 (3H, s), 4,47-4,58 (3H, m), 5,20-5,34 (1H, m), 5,51 (1H, dd, J = 2,3, 5,0 Hz), 6,16 (1H, d, J = 2,2 Hz), 6,41 (szer.s, 1H), 7,95 (1H, d, J = 5,6 Hz), 8,94 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 32

0,15 g benzoesanu [(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)-tetrahydro-2-furanylo]metylu rozpuszczono w 2,0 ml metanolu, po czym podczas oziębiania lodem dodano 0,14 g 28% roztworu metanolanu sodu w metanolu. Otrzymaną mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 20 minut, a następnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 0,75 ml 1 mol/l kwasu solnego i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej [eluent:chloroform:metanol = 5:1], a następnie dodano izopropanolu i eteru dietylowego. Mieszaninę przesączono i otrzymano 40 mg 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-6-fluoro-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu.

IR (KBr) cm^-1: 1686.

P r z y k ł a d 33

NH

AcO OAc

0,20 g 3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu i 10 mg siarczanu amonu zawieszono w 2,0 ml 1,1,1,3,3,3-heksametylodisilazanu i zawiesinę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 10 minut pod strumieniem azotu. Dodano 9,0 mg siarczanu amonu i mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną jeszcze przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną oziębiono i rozpuszczalnik

PL 209 765 B1 usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość rozpuszczono w 4,0 ml acetonitrylu i kolejno dodano 0,46 g e-D-rybofuranozo-1,2,3,5-tetraoctanu i 0,34 ml chlorku cyny (IV), po czym całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 10 μl kwasu trifluorooctowego i 1,0 ml wody i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Tę samą reakcję powtórzono stosując 0,05 g 3-okso-3,4-dihydro-2-pirazyno-karboksamidu i otrzymano mieszaninę reakcyjną. Otrzymane mieszaniny reakcyjne połączono, a następnie oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym [eluent:acetonitryl:woda = 1:4] i otrzymano 0,34 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-[amino(imino)metylo]-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetrahydro-3-furanylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 3392, 1750, 1685 ¹H-NMR (CDCI3): 2,11 (3H, s), 2,16 (6H, s), 4,4-4,7 (3H, m), 5,31 (1H, t, J = 5,4 Hz), 5,5-5,6 (1H, m), 6,22 (1H, d, J = 3,0 Hz), 7,8-8,0 (1H, m), 8,1-8,3 (1H, m), 8,67 (szer.s, 1H), 10,45 (2H, szer.s).

P r z y k ł a d 34

Do 5,0 ml 25% wody amoniakalnej podczas oziębiania lodem dodano 0,10 g octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-[amino(imino)metylo]-2-okso-1(2H)-pirazynylo]tetradydro-3-furanylu i mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 2 godziny. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 4,9 ml kwasu octowego i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Tę samą reakcję prowadzono stosując 20 mg octanu (2R,3R,4R,5R)-4-(acetyloksy)-2-[(acetyloksy)metylo]-5-[3-[amino(imino)metylo]-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-tetrahydro-3-furanylu. Otrzymane mieszaniny reakcyjne połączono i oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym [eluent:woda]. Do uzyskanej substancji stałej dodano 5,0 ml 1 mol/l kwasu solnego i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano jeszcze 5,0 ml 1 mol/l kwasu solnego i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do otrzymanej pozostałości dodano etanolu, substancję stałą zebrano przez odsączenie i otrzymano 30 mg chlorowodorku 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 3374, 3281, 1690 ¹H-NMR (DMSO-d6): 3,7-3,9 (2H, m), 3,9-4,2 (3H, m), 5,1-5,3 (1H, m), 5,3-5,6 (1H, m), 5,6-5,8 (1H, m), 5,90 (1H, s), 7,85 (1H, d, J = 4,0 Hz), 8,76 (1H, d, J = 4,0 Hz), 9,44 (4H, szer.s).

P r z y k ł a d 35

mg benzoesanu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}-metylu otrzymano z 200 mg benzoesanu {(2R,3R,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-bis(benzoiloksy)tetrahydro-2-furanylo}metylu w taki sam sposób, jak opisano w przykładzie 18.

PL 209 765 B1 ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 4,06 (1H, dd, J = 6,6, 12,7), 4,12-4,15 (1H, m), 4,28-4,32 (1H, m), 4,59 (1H, dd, J = 5,1, 12,2), 4,67 (1H, dd, J = 2,7, 12,5), 5,40 (1H, d, J = 6,3), 5,76 (1H, d, J = 4,9), 5,91 (1H, d, J = 2,0), 7,37 (1H, d, J = 4,4), 7,57 (2H, t, J = 7,8), 7,71 (1H, dd, J = 7,1, 7,6), 7,75 (1H, szer.s), 7,85 (1H, d, J = 4,2), 8,01 (2H, dd, J = 1,0, 7,4), 8,30 (1H, szer.s).

P r z y k ł a d 36

100 mg (2S)-2-[(tert-butoksykarbonylo)amino]-3-metylobutanianu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników, 1 ml kwasu trifluorooctowego i 0,1 ml wody, i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Kwas trifluorooctowy usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i dodano wody. pH mieszaniny doprowadzono do wartości 8 nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu, po czym mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym [eluent: 10% wodny roztwór acetonitrylu], a następnie przez destylację azeotropową z etanolem i otrzymano 59 mg (2S)-2-amino-3-metylobutanianu {(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo}metylu w postaci białej substancji stałej.

IR (KBr) cm^-1: 1724, 1670, 1653 ¹H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 0,84 (3H, d, J = 6,6 Hz), 0,89 (3H, d, J = 6,6 Hz), 1,82-1,90 (1H, m), 3,22 (1H, d, J = 5,2 Hz), 3,88-3,94 (1H, m), 4,09 (1H, s), 4,17-4,20 (1H, m), 4,36-4,38 (2H, m), 5,91 (1H, s), 7,58 (1H, d, J = 4,0 Hz), 7,90 (1H, d, J = 4,0).

P r z y k ł a d 37

mg 4-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo)tetrahydro-2-furanylo]-6-fluoro-3-okso-3,4-dihydro-2-pirazynokarboksamidu zawieszono w 1 ml fosforanu trimetylu, a następnie podczas oziębiania lodem dodano kolejno 37 μl pirydyny i 49 μl tlenochlorku fosforu i mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę. Dodano 3 ml 1 mol/l wodnego roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego i mieszaninę mieszano przez 15 minut. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono metodą jonowymiennej chromatografii kolumnowej [eluent; 0,1 mol/l wodnego roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego]. Następnie mieszaninę oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej z odwróconymi fazami na żelu krzemionkowym [eluent:woda] i otrzymano 39 mg soli trietyloamoniowych fosforanu [(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]metylu.

Do 0,5 ml zawiesiny metanolu zawierającej sole amoniowe kwasu monofosforowego w temperaturze pokojowej dodano 3 ml roztworu acetonu zawierającego 0,14 g nadchloranu sodu i mieszaninę mieszano przez 30 minut. Osad zebrano przez odsączenie, przemyto acetonem i otrzymano 27 mg soli sodowych fosforanu [(2R,3S,4R,5R)-5-[3-(aminokarbonylo)-5-fluoro-2-okso-1(2H)-pirazynylo]-3,4-dihydroksytetrahydro-2-furanylo]metylu w postaci jasnożółtej substancji stałej.

¹H-NMR (D2O) δ: 4,13-4,18 (1H, m), 4,29-4,40 (4H, m), 6,10 (1H, s), 8,46 (1H, d, J = 4,9 Hz).

PL 209 765 B1

ZASTOSOWANIE W PRZEMYŚLE

Na podstawie powyższych przykładów badań stwierdzono, że trifosforanowy pirazynowy analog nukleotydu w badaniach na hamowanie polimerazy wirusa ma aktywność swoiście hamującą polimerazę wirusową, że nukleotyd pirazynokarboksamidowy, zmodyfikowany podstawnikiem podanym w niniejszym wynalazku, dociera do komórki i wykazuje w komórce działanie przeciwwirusowe, aczkolwiek jak było ogólnie wiadomo, nukleotyd nie mógł dotrzeć do komórki przez błonę komórkową, oraz że nukleozyd pirazynowy ulega konwersji w organizmie zwierzęcia, któremu podano taki nukleozyd, w trifosforanowy pirazynowy analog nukleotydu. A zatem, sposób hamowania wzrostu wirusów i/lub zwalczania wirusów według wynalazku, w którym stosuje się pirazynowy analog nukleotydu lub pirazynowy analog nukleozydu wytworzony w wyniku działania kinazy, takiej jak kinaza nukleotydowa, lub jego sól, jest sposobem skutecznym do leczenia zakażenia wirusowego. Ponadto, nowy pirazynowy analog nukleotydu lub pirazynowy analog nukleozydu, lub ich sól, według wynalazku jest użyteczny jako środek do zapobiegania i/lub leczenia zakażenia wirusowego.

Claims

1. Pirazynowy analog nukleotydu przedstawiony następującym ogólnym wzorem [1z], lub jego sól:

12 w którym R¹ oznacza atom wodoru; atom fluorowca, grupę alkilową lub grupę arylową; R² oznacza atom wodoru; każdy R³, R⁴, R⁵ i R⁶ jest taki sam lub różny i oznacza atom wodoru lub grupę hydroksylową; R oznacza grupę hydroksylową; A oznacza atom tlenu; a n oznacza liczbę całkowitą 3, pod warunkiem, że wyłączony jest związek, w którym R¹ oznacza atom wodoru; R² oznacza atom wodoru; R³ i R⁵ oznaczają atom wodoru; R⁴ i R⁶ oznaczają grupę hydroksylową; R oznacza grupę hydroksylową; A oznacza atom tlenu, a n oznacza liczbę całkowitą 3.

2. Zastosowanie pirazynowego analogu nukleotydu przedstawionego ogólnym wzorem [1z] określonego jak w zastrz. 1, lub jego soli, do wytwarzania środka przeciwwirusowego.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że pirazynowy analog nukleotydu o wzorze 1z ma działanie hamujące na pochodzącą od wirusa polimerazę RNA o 200 razy lub więcej selektywne niż działanie hamujące na polimerazę RNA pochodzącą od gospodarza.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wirusem, od którego pochodzi polimeraza RNA, jest wirus grypy, wirus RS, wirus AIDS, wirus brodawczaka, adenowirus, wirus zapalenia wątroby A, wirus zapalenia wątroby B, wirus zapalenia wątroby C, wirus zapalenia wątroby E, poliowirus, echowirus, wirus Coxsackie, enterowirus, wirus nieżytu nosa, rotawirus, wirus choroby Newcastle, wirus świnki, wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, wirus wścieklizny, wirus Lassa, wirus odry, filowirus, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus żółtej febry, wirus dengi lub wirus gorączki zachodniego Nilu.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że wirusem, od którego pochodzi polimeraza RNA, jest wirus grypy lub wirus zapalenia wątroby C.