HUT64335A

HUT64335A - Process for producing 1,3-oxatiolane-nucleozide analogues and pharmaceutical preparatives containing them

Info

Publication number: HUT64335A
Application number: HU9200302A
Authority: HU
Inventors: Johathan Alan Victor Coates; Ian Martin Mutton; Charles Richard Penn; Richard Storer; Christopher Williamson
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1991-05-02
Publication date: 1993-12-28
Also published as: JP2927546B2; SK283430B6; IL98025A0; RO112616B1; CN1326743A; MY109796A; NO920018L; NO920018D0; WO1991017159A1; US6180639B1; TNSN91029A1; EP1062950A3; KR960007532B1; EP0625150A1; SG46383A1; EG19958A; MD809C2; AP182A; GB9009861D0; HU210803A9

Description

A találmány tárgya eljárás nukleozid analógok előállítására és ezek gyógyszerészeti felhasználására.

Részletesebben, a találmány tárgya eljárás 1,3-oxatiolán-nukleozid analógok előállítására, ezekből készült gyógyszerészeti formált alakok előállítására, valamint ezek felhasználására vírusos fertőzések kezelésében.

Az (I) általános képletű vegyület, amely BCH-189 vagy NGPB-21 néven is ismert, a szakirodalomban leírtak szerint vírusellenes hatású, különösen emberi immunhiány vírus ellenes hatással rendelkezik (HÍV vírus), amely vírus az AIDS immunhiány betegség okozója (5. Anti-Aids Conference, Montreal, Canada, 1989. június 5-9: Abstracts T.C.O.l és M.C.P. 63; Europen Patent Application Publication No 0382562). Az (I) általános képletű vegyület racém keveréke az (1-1) általános képletű és az (1-2) általános képletű enantiomereknek, és a vegyületet racemát formában írták le, valamint ilyen formában végezték a tesztvizsgálatot. Az egyetlen jelenleg engedélyezett vegyület a HÍV vírus által okozott betegségek kezelésére a 3'-azido-3'-deoxi-timidin (AZT, zidovudin, BW 509U). Azonban ez a vegyület jelentős mellékhatásokkal rendelkezik, és így vagy nem alkalmazható vagy amennyiben egyszer alkalmazták, igen gyakran számos betegtől meg kell vonni. Ennek következtében folyamatosan felmerült az az igény, hogy olyan vegyületeket állítsanak elő, amelyek HÍV vírussal szemben hatásosak és jelentősen jobb terápiás indexszel rendel keznek .

• ·

Azt találtuk, hogy meglepően az (I) általános képletű vegyület enantiomerjei ekvipotenciális hatással rendelkeznek HÍV vírussal szemben, de az egyik enantiomer (a (-)-enantiomer) jelentősen alacsonyabb citotoxicitású, mint a másik enantiomer. Ennélfogva a találmány tárgya elsődlegesen a (-)-(vagy balraforgató)-enantiomer (I) általános képletű vegyület, valamint ennek gyógyszerészetileg elfogadható származékai.

A (-)-enantiomer kémiai neve (-)-cisz-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on (a tovvábbiakban (A) általános képletű vegyület). Ennek abszolút sztereokémiája az (1-1) általános képletű vegyületé, amelynek neve (2R,cisz)-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on.

Előnyös (A) általános képletű vegyület lényegében a megfelelő (+)-enantiomertől mentes, ami azt jelenti, hogy 5 tömeg %-nál nem nagyobb mennyiségű ( + )-enantiomert , előnyösen nem több, mint 2 tömegé legelőnyösebben nem több, mint 1 tömeg % ilyen vegyületet tartalmaz. '

A gyógyszerészetileg elfogadható származék elnevezés alatt bármely gyógyszerészetileg elfogadható (A) általános képletű vegyület észtert, sót vagy ilyen észter sóját értjük vagy bármely más olyan vegyületet, amely a betegnek történő adagolás után képes arra (közvetlenül vagy közvetett úton), hogy az (A) általános képletű vegyületet

- 4 vagy vírus ellenesen hatásos metabolit maradékát szolgálI tassa.

A szakember felismeri, hogy az (A) általános képletű vegyület módosítható, és így gyógyszerészetileg elfogadható származékokká alakítható mind a bázikus egység, mind a hidroxi-metil-csoport átalakításával az oxatiolán gyűrűn. Valamennyi ilyen átalakítást beleértjük a találmány tárgykörébe, azonban különösen érdekesek azok a vegyületek, amelyek olyan gyógyszerészetileg elfogadható származékok, amiket az oxatiolán gyűrű 2-hidroxi-metil-csoportjának átalakításával nyerünk.

Az (A) általános képletű vegyület előnyös észterei azok, amelyekben a 2-hidoxi-metil-csoport hidrogénatomját egy R-CO- általános képletű acilcsoporttal szubsztituáljuk, ahol a karbonilcsoportot nem tartalmazó R csoport jelentése az észterben hidrogénatom, egyenes vagy elágazó szénláncú alkilcsoport (például metilcsoport, etilcsoport, n-propil-csoport, terc-butil-csoport, n-butil-csoport), alkoxi-alkil-csoport (például metoxi-metil-csoport), aralkilcsoport (például benzilcsoport), ariloxi-alkil-csoport (például fenoxi-metil-csoport), arilcsoport (például fenilcsoport, amely kívánt esetben halogénatom, 1-4 szénatomszámú alkilcsoport vagy 1-4 szénatomszámú alkoxicsoport szubsztituenst tartalmazhat); továbbá szulfonát észterek, mint például alkil- vagy aralkil-szulfonil-csoportot tartalmazó vegyületek (például metán-szulfonil-csoportot tartalmazó vegyületek); aminosav észterek (például L-valil* · · ·

- 5 -észterek vagy L-izoleucil-észterek), valamint mono-, di- vagy trifoszfát-észterek.

A fenti észterek esetében, hacsak másképp nem jelezzük, az alkilcsoport előnyösen 1-16 szénatomot, különösen előnyösen 1-4 szénatomot tartalmaz. Bármely ilyen észterben jelenlévő arilcsoport előnyösen fenilcsoport.

Részletesebben, az észterek lehetnek 1-16 szénatomszámú alkil-észterek, valamely nem szubsztituált benzil-észtér vagy valamely benzil-észter,amely legalább egy halogénatom (brómatom, klóratom, fluoratom vagy jódatom), 1-6 szénatomszámú alkilcsoport, 1-6 szénatomszámú alkoxicsoport, nitrocsoport vagy trifluor-metil-csoport szubsztituenst tartalmaz.

A találmány szerinti (A) általános képletű vegyület gyógyszerészetileg elfogadható sói a gyógyszerészetileg elfogadható szervetlen és szerves savakból, illetve bázisokból leszármaztatható sók. Alkalmazható savak például a sósav, a hidrogén-bromid, a kénsav, a salétromsav, a perklórsav, a furmársav, a maleinsav, a foszforsav, a glikolsav, a tejsav, a szalicilsav, a borostyánkősav, a toluol-p-szulfonsav, a borkősav, az ecetsav, a citromsav, a metánszulfonsav, a hangyasav, a benzoesav, a malonsav, a naftol-2-szulfonsav, és a benzolszulfonsav. Más savak, mint példul az oxálsav, habár ezek önmagukban nem gyógyszerészetileg elfogadhatók, alkalmazhatók mint közbenső termékek a találmny szerinti vegyületek kinyerésében, illetve gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sóik kinyerésében.

« « ·

- 6 A megfelelő bázisokból képzett sók például az alkálifémsók (például nátriumsó), az alkáliföldfémsók (például magnéziumsó), az ammóniumsók és az NR^⁺-sók (ahol R jelentése 1-4 szénatomszámú alkilcsoport).

A továbbiakban a találmány szerinti vegyületelnevezés alatt az (A) általános képletű vegyületet és ennek gyógyszerészetileg elfogadható származékait értjük.

A találmány szerinti vegyületek vagy önmagukban vírusellenes hatásúak és/vagy metabolizálhatók ilyen hatású vegyületekké. Részletesebben, ezek a vegyületek hatásosan inhibiálják a retrovírusok replikádé ját, beleértve az emberi retrovírusokat, mint például az emberi immunhiány betegség vírusokat (HÍV), amelyek az AIDS szerzett immunhiány betegség okozói.

Ennélfogva, a találmány tárgya továbbá az (A) általános képletű vegyület vagy gyógyszerészetileg elfogadható származéka, és ennek alkalmazása aktív terápiás szerként, különösen vírusellenes szerként, például retrovírus által okozott fertőzés kezelésében.

A találmány tárgya továbbá eljárás vírusos fertőzés kezelésére, különösen retrovírus, mint például HÍV által okozott fertőzés kezelésére emlősökben, az embert is beleértve, melyre jellemző, hogy az (A) általános képletű vegyület vagy gyógyszerészetileg elfogadható származéka hatásos mennyiségét adagoljuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyszerészeti készítmény és gyógyszer előállítására, amely vírusos fertőzés kezelésére alkalmas, azzal jellemezve, hogy az (A) általános képletű vegyületet vagy gyógyszerészetileg elfogadható származékát erre a célra felhasználjuk.

A találmány szerinti vegyületek továbbá alkalmasak

AIDS-kapcsolatos betegségek, mint például AIDS-kapcsolatos komplex (ARC), progresszív általános nyirokcsomó megbetegedés (PGL), AIDS-kapcsolatos neurológiai megbetegedések (mint például elmebaj, vagy tropikus paraparesis) anti-HIV antitest pozitív és HIV-pozitív betegségek,Kaposi szarkóma, csökkent trombocitaszám, purpura és kapcsolatos fertőzések mint például Pneumocystis carinii kezelésére.

A találmány szerinti vegyületek továbbá alkalmazhatók a klinikai betegségek kifejlődésének megelőzésére olyan betegekben, akik anti-HIV antitest vagy HIV-antigén pozitívok, illetve alkalmazhatók a HÍV vírussal történő fertőzés megelőzésében .

A találmány szerinti (A) általános képletű vegyületek vagy gyógyszerészetileg elfogadható származékaik továbbá alkalmazhatók fiziológiai folyadékok, mint például vér vagy sperma vírusos fertőzésének in vitro megelőzésére.

A szakember előtt nyilvánvaló,hogy a jelen kezelésbe beleértjük a megelőző kezelést, továbbá a beállt fertőzések vagy kialakult szimptómák kezelését.

A szakember továbbá beleérti, hogy a találmány szerinti vegyület mennyisége, amelynek alkalmazása a kezelésben szükséges, nemcsak az adott vegyület típusától függ, hanem függ az adagolás útjától, a kezelendő betegség típusától és a beteg korától, valamint állapotától is, és ezt a kezelő • · orvos vagy állatorvos határozza meg. Általában azonban alkalmas dózis-érték körülbelül 0,1 - 750 mg/kg testtömeg/nap, előnyösen 0,5 - 60 mg/kg/nap, és legelőnyösebben 1-20 mg/kg/nap érték.

A kívánt dózist alkalmasan egyetlen dózisban adagolhatjuk vagy osztott dózisban, megfelelő időpontokban (például 2, 3, 4 vagy több al-dózis formában, naponta.

A találmány szerinti vegyületeket alkalmasan adagolhatjuk egységdózis formában, például olyan formában, amely 10 - 1500 mg, előnyösen 20 - 1000 mg, legelőnyösebben 50 - 700 mg aktív hatóanyagot tartalmaz egy dózisban.

Ideális esetben az aktív hatóanyagot úgy kell adagolni, hogy a plazmakoncentráció csúcsa az aktív hatóanyagra vonatkoztatva körülbelül 1 - 75/Umól előnyösen körülbelül

- 50/mól legelőnyösebben körülbelül 3 - körülbelül 30 /Umól közötti legyen. Ezt például úgy érhetjük el,hogy intravénás injekció formájában 0,1-5 %-os aktív hatóanyag oldatot adagolunk, kívánt esetben fiziológiás sóoldatban vagy orálisan pilulát adagolunk, amely körülbelül 1 körülbelül 100 mg aktív hatóanyagot tartalmaz. A kívánt vérkoncentrációt úgy tarthatjuk fenn, hogy vagy folytonos infúziót alkalmazunk, amellyel körülbelül 0,01 - körülbelül 5,0 mg/kg/óra aktív hatóanyagot biztosítunk vagy szakaszos infúziót alkalmazunk, amely körülbelül 0,4 - körülbelül 15 mg/kg aktív hatóanyagot tartalmaz.

Ugyan, a terápiás kezelésben a találmány szerinti vegyületet önmagában kémiai formában is adagolhatjuk elő-

- 9 nyösen aktív hatóanyagként gyógyszerészeti készítmény alakban adagoljuk.

Ennélfogva a találmány tárgya továbbá eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az (A) általános képletű vegyületet vagy gyógyszerészetileg elfogadható származékát egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal és kívánt esetben más terápiás és/vagy megelőző hatású hatóanyagokkal gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk. A hordozóanyagok gyógyszerészetileg elfogadhatók kell legyenek, azaz kompatibilisek a készítmény többi alkotóelemével, valamint a befogadó egyedre ne legenek toxikusak.

A gyógyszerészeti készítmények lehetnek például orális, rektális, nazális, helyi (szájba, illetve nyelv alá adagolt), vaginális vagy parenterális (intramuszkuláris, szubkután és intravénás) adagolású formák vagy inhaláció, illetve befúvásos adagolásra alkalmas formák. A gyógyszerészeti készítmények, amennyiben lehetséges, alkalmasan elkülönült egységdózis formák és ezeket a szakirodalomban jól ismert eljárásokkal állíthatjuk elő. Valamennyi eljárás tartalmazza azokat a lépéseket, amelyeknek során az aktív hatóanyagot folyékony hordozóanyagokkal vagy finoman osztott szilárd hordozóanyagokkal vagy mindkettővel elegyítjük, és amennyiben szükséges, a terméket kívánt formává alakítjuk.

Az orális adagolásra alkalmas gyógyszerészeti készítmények alkalmasan lehetnek különálló egységformák, mint például kapszulák, zacskók vagy tabletták, amelyek mindegyike az aktív hatóanyag előre meghatározott mennyiségét tartalmazza, továbbá lehetnek por vagy granulátumformák, oldatformák, szuszpenzió- vagy emulzióformák. Az aktív hatóanyagot ugyancsak formálhatjuk pilula, electuarium vagy kenőcs formává. Az orális alkalmazásra használt tabletta és kapszulaformák szokásos hordozóanyagokat tartalmazhatnak, amelyek lehetnek például kötőanyagok, töltőanyagok, kenőcsök, dezintegráló szerel vagy nedvesítőszerek. A tabletták bevonatokkal láthatók el, szakirodalomban ismert módszerekkel. Az orális adagolásé folyékony gyógyszerkészítmények lehetnek például vizes vagy olajos szuszpenziók, oldatok, emulziók, szirupok vagy elixírek vagy lehetnek száraz termékformájúak, amelyekből a felhasználás előtt vízzel vagy más alkalmas hordozóanyaggal képezhetünk alkalmas gyógyszerkészítményt. Ilyen folyékony gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak szokásos adalékanyagokat, mint például szuszpendálószereket, emulzifikálószereket, nem-vizes hordozóanyagokat (amelyek lehetnek például ehető olajok) vagy tartósítóanygok.

A találmány szerinti vegyületek továbbá kikészíthetők parenterális adagolásra alkalmas gyógyszerészeti készítménynyé (például pilula-títpusú vagy folytonos infúzió formájú injekció) és lehetnek egységdózis forrnájúak ampullában, előre töltött injekcióstűben, kis térfogatú infúzióban vagy több dózisú tartályokban, amelyekhez valamely tartósítóanyagot adagolunk. A gyógyszerkészítmények lehetnek például szuszpenziók, oldatok vagy emulziók, olajos vagy vizes közegben, és tartalmazhatnak kikészítési segédanyagokat, mint például szuszpendálószereket, stabilizálószereket és/vagy diszpergálószereket. Más esetben az aktív hatóanyag por formává alakítható, amelyet steril szilárd anyag aszeptikus izolálásával vagy oldatból történő liofilizálásával nyerünk és amely ezután alkalmazható alkalmas hordozóanyagokkal, például steril, pirogéntől mentes vízzel történő folyékony formává való átalakításra, közvetlenül a felhasználás előtt.

A helyi alkalmazás céljára, amelyet felhámra végzünk, a találmány szerinti vegyületeket kikészíthetjük kenőcs, kenet vagy lemosószer formává, illetve bőrön keresztül felszívódó tapasz formává. Kenőcs vagy krém alakok például készíthetők vizes vagy olajos alapon alkalmas sűrítő és/vagy gélképző ágens adagolásával. A lemosó alak vizes vagy olajos bázissal képezhető, és általában egy vagy több emulzifikáló szert, stabilizálószert, diszpergálószert, szuszpendálószert, sűrítő adalékanyagot vagy színező anyagot tartalmaz .

A helyi alkalmazású, szájban alkalmazható gyógyszerkészítmény lehet például gyógycukor, amely az aktív hatóanyagot egy ízesített alapanyagban tartalmazza, amely általában lehet szukróz és akácia vagy tragakant; továbbá lehet pasztilla, amely az aktív hatóanyagot inért alapanyagban tartalmazza, amely lehet zselatin és glicerin vagy szukróz és akácia; és lehet továbbá szájöblítő víz, amely az aktív hatóanyagot alkalmas folyadék hordozóanyagban tartalmazza.

Rektális adagolásra alkalmas gyógyszerészeti készítmények lehetnek azok, amelyekben a hordozóanyag valamely szilárd anyag, és amely hordozóanyag egységdózis kúp forjájú. Alkalmas hordozóanyagok lehetnek például a kakóvaj és más szakirodalomban általánosan alkalmazott vegyületek, és a kúp formált alakokat általában úgy állíthatjuk elő, hogy az aktív hatóanyagot a megolvasztott vagy meglágyított hordozóanyagokkal elegyítjük, majd a keveréket hűtéssel, illetve alakítással öntőformában lehűtjük.

A vaginális adagolásra alkalmas gyógyszerkészítmények lehetnek például pesszárium, tampon, krém, gél, paszta, hab vagy spray formák, amelyek az aktív hatóanyagon kívül a szakirodalomban ismert alkalmas hordozóanyagokat tartalmaznak.

A találmány szerinti vegyület intranazális adagolás céljára alkalmazható gyógyszerkészítmény alakjai folyékony spray vagy diszpergálható por-formák lehetnek vagy orrcsepp formák.

Az orrcsepp alakot úgy állítjuk elő, hogy vizes vagy nem-vizes alakot alkalmazunk, amely továbbá egy vagy több diszpergálószert, oldódást elősegítő szert vagy szuszpendálószert tartalmaz. A folyékony spray alakot szokásosan nyomás alatti csomagolásban állítjuk elő.

Az inhalációs adagolás céljára készített gyógyszerkészítményekben a találmány szerinti vegyületeket valamely befúvató berendezésben, aerosol-készülékben vagy nyomás alatti csomagolásban formáljuk, illetve más alkalmas aerosol spray adagolásra alkalmas berendezést használunk. A nyomás alá helyezett csomagolási alak tartalmazhat alkalmas propellens anyagot, mint például diklór-difluor-metánt, triklór-fluor-metánt, diklór-tetrafluor-etánt, széndioxidot vagy más alkalmas gázt. A nyomás alatti aerosol forma esetében a dózisegységet például alkalmas szelep segítségével állíthatjuk be, amely előre meghatározott mennyiséget bocsát ki.

Más eljárás szerint,a találmány szerinti vegyületeket inhalációs vagy befúvásos alkalmazás céljára, száraz por gyógyszerészeti készítményre alakíthatjuk, például porkeverék formává, amely a találmány szerinti vegyületet és alkalmas alap-port, mint például laktózt vagy keményítőt tartalmaz. A por gyógyszerészeti készítményt egységdózis formává alakíthatjuk, például kapszula vagy patron vagy például zselatin vgy hólyag csomagolásban, amelyből a por valamely belégző vagy befúvó berendezés segítségével adagolható.

Amennyiben kívánatos, a fent leírt gyógyszerkészítményt olyan formává alakíthatjuk, hogy az aktív hatóanyag fenntartott kibocsátását biztosítsuk.

A találmány sezrinti eljárással előállított gyógyszerészeti készítmények továbbá tartalmazhatnak más, aktív hatóanyagokat, mint például mikróbaellenes szereket, vagy tartósítóanyagokat.

A találmány szerinti vegyületek továbbá alkalmazhatók más terápiás szerekkel együtt, például más fertőzés-ellenes szerekkel együttesen. Részletesebben, a találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók együttesen más, ismert vírusellenes szerekkel.

A találmány tárgya ennélfogva, eljárás az (A) általános képletű vegyület vagy gyógyszerészetileg elfogadható származéka és valamely más, terápiásán aktív hatóanyag, különösen vírusellenes szer kombinációjának előállítására.

A kombinált formák, amelyek fent leírtak, előnyösen gyógyszerészeti készítmények és így a találmány tárgya ennélfogva, eljárás gyógyszerészeti készítmények előállítására, melyet az jellemez,hogy a fenti kombinációkat gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokkal gyógyszerkészítménnyé feldogozzuk.

Az ilyen kombinációkban alkalmazható terápiás szerek például aciklusos nukleozidok, mint például aciklovír vagy granciklovír, interferonok, mint például alfa,béta vagy gamma-interferon, renális kiválasztás inhibitorok, mint például probenecid, nukleozid transzport inhibitorok, mint például dipiridamol, 2',3'-dideoxi-nukleozidok, mint például AZT, 2',3'-dideoxi-citidin, 2',3'-dideoxi-adenozin, 2',3¹-dideoxi-inozin, 2',3'-dideoxi-timidin, 2¹,3'-dideoxi-2',3¹-didehidro-timidin és 2',3'-dideoxi-2¹,3¹-didehidro-citidin, immunomodulátorok, mint például interleukin II (IL2) és leukocita makrofág kolónia stimuláló faktor (GM-CSF), eritropoetin, ampligen, timomodulin, timopentin, foscarnet, ribavirin és CD4 receptorokhoz történő HÍV kötés inhibitorok, például oldható CD4, CD4 fragmensek, CD4 hibridmolekulák, glikozilezés inhibitorok, mint például 2-deoxi-D-glükóz, kasztanospermin és 1-deoxi-nojirimicin.

Az ilyen kombinációk egyes komponenseit akár egymást követően, akár párhuzamosan alkalmazhatjuk külön vagy kombinált gyógyszerészeti készítményben.

Amennyiben a találmány szerinti(A) általános képletű vegyületet vagy gyógyszerészetileg elfogadható származékát kombinációban alkalmazzuk egy második terápiás szerrel, amely ugyanazon vírussal szemben aktív, az egyes vegyületek dózisa azonos lehet vagy eltérhat attól a dózistól, amelyet akkor alkalmazunk, ha az adott vegyületet önmagában használjuk. Alkalmas dózisok a szakember által könnyen meghatározhatók .

A találmány szerinti (A) általános képletű vegyületek és gyógyszerészetileg elfogadható származékaik a szakirodalomban ismert eljárások szerint állíthatók elő, például, amelyeket analóg szerkezetű vegyületek előállítására alkalmaznak, és például a 0 382 562 számú európai szabadalmi bejelentésben írtak le.

A szakember felismeri, hogy az alább leírt eljárások közül egyesekben az (A) általános képletű vegyület kívánt sztereokémiáját vagy úgy alakíthatjuk ki, hogy optikailag tiszta kiindulási anyagokat alkalmazunk, vagy úgy, hogy bármely alkalmas szintézislépésben a racém keveréket reszolváljuk. Valamennyi eljárás során az optikailag tiszta kívánt terméket nyerhetjük úgy, hogy a végterméket az egyes reakciókban reszolváljuk.

Az egyik ilyen eljárás során (A) egy (VIII) általános képletű 1,3-oxotiolán vegyületet, ahol az L-anomer helyettesíthető csoport, megfelelő bázissal reagáltatjuk. Alkalmas ilyen L-csoport lehet például -OR általános képletű csoport, ahol R jelentése alkilcsoport, mint például 1-6 szénatomszámú alkilcsoport, például metilcsoport, vagy R jelentése acilcsoport, például 1-6 szénatomszámú acilcsoport, mint(például acetilcsoport vagy halógénatom, például jódatom, brómatom vagy klóratom.

A (VIII) általános képletű vegyület alkalmasan reagáltatható citozinnal vagy megfelelő pirimidin prekurzorával (amely előzetesen szililezőszer segítségével szililezett, amely lehet például hexametil-diszilazán) alkalmas kompatibilis oldószerben, mint például diklór-metánban, Lewis-sav jelenlétében, amely lehet például titántetraklorid, ón(IV) vegyület, mint például SnCl^ vagy trimetil-szilil-triflát.

A (VIII) általános képletű 1,3-oxatiolán vegyületeket úgy állíthatjuk elő, hogy egy (VII) képletű aldehidet reagáltatunk egy (VI) általános képletű merkapto-acetállal kompatibilis szerves oldószerben, mint például toluolban, savkatalizátor, mint például Lewis-sav jelenlétében, amely lehet például cinkklorid.

A (VI) képletű merkapto-acetálokat szakirodalomban ismert eljárásokkal állíthatjuk elő, mint például G.Hesse és I. Jorder, Chem. Bér. 85, 924-932 (1952) közleményében leírt eljárás.

A (VII) képletű aldehideket szakirodalomban ismert eljárásokkal állíthatjuk elő, mint például E.G.Halloquist és H.Hibbert, Can. J. Research, 8, 129-136 (1933) közleménye. Előnyösen a nyers (VII) képletű aldehidet úgy tisztíthatjuk, hogy kristályos biszulfit addukttá alakítjuk, majd a szabad aldehidet ebből felszabadítjuk.

Egy másik eljárásban (B) az (A) általános képletű vegyületet a (IX) általános képletű vegyületből nyerhetjük bázis átalakítással, ahol az általános képletben B jelentése valamely bázis, amely citozinná alakítható. Ezt az átalakítást akár egyszerű kémiai átalakítással végezhetjük (például az uracil bázist citozinná alakítjuk) vagy enzimes konverziót alkalmazhatunk, amelyben deoxiribozil transzferázt használunk. Az ilyen bázis-átalakításra alkalmazott eljárások és reakciókörülmények a nukleozid kémiában a szakirodalomban jól ismertek.

Egy harmadik eljárásban (C) egy (XI) általános képletű vegyületet alakíthatunk át (A) általános képletű vegyületté úgy, hogy az anomer aminocsoportot citozin bázissá alakítjuk a szakirodalomban a nukleozid kémiában jól ismert eljárásokkal.

Számos fent leírt reakciót részletesen leírtak a nukleozid szintézissel kapcsolatosan például az alábbi közleményekben: Nucleoside Analogs - Chemistry, Biology and Medical Applications, R.T. Walker és munkatársai, Plenum Press, New York (1979) 165-192. oldal; T. Ueda, Chemistry of Nucleosides és Nucleotides, I. L B Townsend, Plenum Press, New York (1988) 165-192 oldal, amelyeket referenciaként adunk meg.

• · « · • · « · · · ·« · « ··· « · · ··· • · » · · ·

- 18 Természetesen beleértendő, hogy a fenti reakciók megkövetelhetik, hogy ezeket védőcsoporttal ellátott funkciós csoportot tartalmazó kiindulási anyagokon hajtsuk végre, és így a védőcsoport eltávolítása ugyancsak kívánatos lehet a szintézis közbenső vagy végső lépésében, hogy a kívánt vegyületet nyerjük. A funkciós csoportok védőcsoporttal történő ellátását, illetve a védőcsoportok eltávolítását szokásos eljárásokkal végezhetjük. így például az aminocsoportok védhetők például aralkilcsoport segítségével (például benzilcsoport), acilcsoport segítségével, arilcsoport segítségével (például 2,4-dinitro-fenil-csoport) , vagy szililcsoport segítségével; a védőcsoportok későbbi eltávolítását - amennyiben kívánatos - hidrolízis vagy hidrogenolízis segítségével végezhetjük igény szerint, standard körülményeket alkalmazva. A hidroxilcsoportok védésére bármely szokásos hidroxilcsoport védőcsoportot alkalmazunk, amelyeket például az alábbi szakirodalmakban leírtak: Protective Groups in Organic Chemistry,

J.F. W. McOmie (Plenum Press, 1973) vagy Protective Groups in Organic S ynthesis^ Theodora W. Greene (John Wiley és Sons, 1981). Alkalmas hidroxilcsoport védőcsoportok lehetnek például alkilcsoport (például metilcsoport, terc-butil-csoport vagy metoxi-metil-csoport), aralkilcsoport (például benzilcsoport, difenil-metil-csoport vagy trifenil-metil-csoport), heterociklusos csoportok, mint például tetrahidro-piranil-csoport, acilcsoport (például acetilcsoport vagy benzoilcsoport) és szililcsoportok, mint pél19 dául trialkil-szilil-csoport (például terc-butil-dimetil-szilil-csoport) . A hidroxilcsoport védőcsoportokat szokásos eljárásokkal távolíthatjuk el, így például az alkilcsoport, a szililcsoport, az acilcsoport és a heterociklusos csoport védőcsoportokat szolvolizis segítségével távolíthatjuk el, amely lehet például savas vagy bázisos körülmények között végzett hidrolízis. Az aralkilcsoport védőcsoportokat, mint például a trifenil-metil-csoportot, hasonlóan szolvolizis segítségével távolíthatjuk el,például ez lehet savas körülmények között végzett hidrolízis.

Az aralkilcsoportokat, mint például a benzilcsoportot például bórtrifluorid-éterát és ecetsavanhidrid segítségével végzett reakcióval távolíthatjuk el, amely reakció után a szintézis megfelelő lépésében bevezetett acetátcsoportokat is eltávlítjuk. A szililcsoportokat ugyancsak szokásosan úgy távolíthatjuk el, hogy fluoridion forrást alkalmazunk amely lehet például tetra-n-butil-ammónium-fluorid.

A fenti eljárásokban az (A) általános képletű, találmány szerinti vegyületet általában cisz- és transz-izomer keverék formájában nyerjük, amelyek közöl a cisz-izomer a kívánt vegyület.

Ezeket az izomereket fizikai elválasztási módszerekkel, például szilikagélen végzett kromatográfia vagy frakcionált kristályosítás segítségével választhatjuk el egymástól. Az elválasztást végezhetjük közvetlenül a vegyületeken vagy alkalmas származékaikon, például acetátszármazékaikon (amelyeket például ecetsavanhidrid segítségével «··* ·· · · ··· · · · * ♦ » • ··« ♦ * · ··· • 4 · · · ·

- 20 állítunk elő), amely utóbbi esetben az elválasztás után az alapvegyületté történő visszaalakítást is elvégezzük (például metanolos ammónia segítségével dezacetilezést végzünk).

A találmány szerinti vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sóit a 4 383 114 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírt eljárással állíthatjuk elő, amelyet referenciaként adunk meg. így például, amennyiben az (A) általános képletű vegyület savaddiciós sóját kívánjuk előállítani, bármely fenti eljárásban kapott termék átalakítható ilyen sóvá úgy, hogy a kapott szabad bázist alkalmas savval reagálhatjuk szokásos eljárások alkalmazásával. Gyógyszerészetileg elfogadható savaddiciós sók nyerhetők úgy, hogy a szabad bázist kívánt savval reagáltatjuk, kívánt esetben alkalmas oldószer, mint például valamely észter (például etil-acetát) vagy valamely alkohol (mint például metanol, etanol vagy izopropanol) jelenlétében. Szervetlen bázikus sók állíthatók elő úgy, hogy az alapvegyületet alkalmas bázissal, mint például valamely alkoxiddal (például nátrium-metoxiddal) reagáltatjuk, kívánt esetben oldószer, mint például valamely alkohol (például metanol) jelenlétében. Gyógyszerészetileg elfogadható sókat továbbá előállíthatunk az (A) általános képletű vegyület más sóiból, beleértve más gyógyszerészetileg elfogadható sókat is, amely előállítást szokásos eljárásokkal végezzük.

Az (A) általános képletű vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható foszfáttá vagy más észterré is átalakíthatjuk, • ·· ··*« ·· ♦· • ··« · · · ··· • * · · · · ··« ·· · ♦· ·· i

- 21 foszforilezőszer segítségével, amely lehet például foszfor-oxi-klorid, POCl^ vagy alkalmas észterező reagens, mint például savhalogenid vagy savanhidrid, a kívánt termék szerint. Az (A) általános képletű vegyület észter vagy só származékát az alapvegyületté alakíthatjuk át,például hidrolízis segítségével.

A végtermék vagy valamely közbenső termék vagy kiindulási anyag reszolválásátbármely szakirodalomban ismert alkamas eljárásokkal végezhetjük: lásd például a Stereochemistry of Carbon Compounds> E.L. Eliel /McGraw Hill,(1962) és Tables of Resolving Agensts, S.H. Wilen/ közleményben leírt eljárásokat.

így például az (A) általános képletű vegyületet nyerhetjük királis nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével-alkalmas stacionárius fázist - mint például acetilezett béta-ciklodextrint vagy cellulóz-triacetátot és alkalmas oldószert, mint például valamely alkoholt, mint például etanolt vagy valamely vizes oldatot, mint például trietil-ammónium-acetát oldatot alkalmazva. Más eljárás szerint a vegyületeket reszolválhatjuk enzim segítségével végzett enantioszelektív katabolizmus segítségével, amelyben alkalmas enzimet, mint például citidin-deaminázt alkalmazunk, vagy szelektív enzimes lebontás segítségével, amelyet alkalmas származékon végzünk, és amelyben egy 5'-nukleotidázt alkalmazunk. Amennyiben enzimes reszolválást alkalmazunk, az enzimet vagy oldatban vagy előnyösebben rögzített formában alkalmazzuk. Az enzimeket a szakirodalomban ismert eljárással rögzíthetjük,például gyantára <♦* történő adszorpció segítségévei, amely gyanta lehet például Eupergit C.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk,a_mely példák nem korlátozzák a találmány tárgykörét.

1. Közbenső termék

5-Metoxi-l,3-oxatiolán-2-metanol benzoát

1,6 g cinkklorid 15 ml forró metanolban készült oldatát 34,2 g merkapto-acetaldehid-dimetil-acetál és 48,3 g benzoiloxi-acetaldehid 1300 ml toluolban készült, kevert oldatához adagoljuk, majd az elegyet 50 percen át nitrogén atmoszférában visszafolyatás mellett forraljuk. A lehűtött elegyet bepároljuk, majd kevés toluollal hígítjuk és ezután Kieselgél szűrési segédanyagon leszűrjük. Az egyesített szürletet és a mosó toluolt egyesítjük, majd kétszer telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, és telített sóoldattal mossuk. Ezután a szerves oldatot magnézium-szulfáton mgszárítjuk és bepároljuk. Az olajos maradékot szilikagélen (2 kg, Merek 9385) kloroform eluens alkalmazásával oszlopkromatográfia segítségével tisztítjuk. 45,1 g olajos, cím szerinti terméket kapunk, amely körülbelül 1 : 1 arányú keveréke az anomereknek.

¹H-NMR-spektrum (DMSO-dg), delta:

3,1 - 3,3 (4H), 3,42 (6H), 4,4 - 4,6 (4H), 5,41 (1H), 5,46 (1H), 5,54 (1H), 5,63 (1H), 7,46 (4H),

7,58 (2H), 8,07 (4H).

Y (CHBr_): 1717 cm'^{* 1}.

⁰ max 3 • ·

. Közbenső termék (+)-cisz-1-/2-(Benzoiloxi-metil)-1,3-oxatiolán-4-il/-lH-pirimidin-2,4-dion

9,62 g finoman porított uracil 50 ml hexametil-diszilazán és 30 mg ammóniumszulfát elegyét nitrogénatmoszférában visszafolyatás mellett forraljuk, ameddig tiszta oldatot nem nyerünk. Az oldatot lehűtjük, majd bepároljuk és színtelen olajos maradékot kapunk, amelyet nitrogénatomoszférában 100 ml acetonitrilben oldunk. Az oldatot hozzáadagoljuk 19,43 g egy közbenső termék,5-metoxi-l,3-oxatiolán-2-metanol-benzoát jegesen hűtött, kevert oldatához , amelyet 600 ml acetonitrilben készítettünk. Ezután az elegyhez 14,7 ml trimetil-szilil-trifluor-metánszulfonátot adagolunk. A jeges fürdőt eltávolítjuk, majd az oldatot 45 percen át nitrogénatmoszférában visszafolyatás mellett forraljuk. A reakcióelegyet lehűtjük, az oldószert elpárologtatjuk, és a maradékot 1 kg szilikagélen (Merek 9385) kloroform/metanol 9 : 1 eluens alkalmazásával oszlopkromatográfia segítségével tisztítjuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, majd bepároljuk és így nyers maradékot kapunk. A nyers maradékot frakcionáltan kristályosítjuk, minimális mennyiségű forró metanolból (körülbelül 1200 ml) és így 6,32 g fehér, kristályos cím szerinti vegyületet nyerünk. ^Η-NMR-spektrum (DMSO-dg), delta:

11,36 (1H, széles), 7,50 -8,00 (6H, m), 6,20 (1H, t), 5,46 (2H, m), 4,62 (2H, m), 3,48 (1H, m), 3,25 (1H, m).

• ·♦ ···« «· ·« • · ♦ · · ♦ * · · « ♦·· · 4 · ··· • « « « · · «·· ·· · · · ··

- 24 3. Közbenső termék (+)-cisz-4-Amino-l-/2-(benzoiloxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on

a) eljárás

20,705 g citozin, néhány mg ammóniumszulfát 110 ml hexametil-diszilazánban készült szuszpenzióját keverés közben nitrogénatmoszférában, 2,5 órán át visszafolyatás mellett forraljuk. Ezután az oldószert elpárologtatjuk, és a maradék szilárd anyagot 350 ml száraz, acetonitrilben oldjuk. Az oldatot nitrogénatmoszférában rugalmas tű segítségével 43,57 g 1.közbenső termék 5-metoxi-l,3-oxatiolán-2-metanol benzoát 650 ml acetonitrilben készített, jegesen hűtött, kevert oldatához adagoljuk. Ezután az elegyhez 33 ml trimetil-szilil-trifluor-metánszulfonátot adagolunk, az oldatot hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni (1,5 óra), majd éjszakán át visszafolyatás mellett forraljuk. A kapott elegyet bepároljuk, majd a maradékot 500 ml telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal hígítjuk, majd 3x500 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumokat 2x250 ml vízzel, majd 250 ml telített sóoldattal mossuk, ezt követően magnézium-szulfáton megszárítjuk, és bepároljuk. A kapott habos maradékot oszlopkromatográfia segítségével 600 g szilikagélen (Merek 7734) etil-acetát-metanol keverék eluens alkalmazásával tisztítjuk. 31,59 g anomer elegyet nyerünk (körülbelül 1 : 1). Az elegyet 45 ml víz és 9,0 ml etanol oldószerelegyből kristályosítjuk, és így 10,23 g szilárd terméket kapunk, amelyet

120 ml etanol és 30 ml víz elegyéből átkristályosítunk és így 9,26 g fehér, szilárd cím szerinti vegyületet nyerünk.

ÜV-spektrum X (MeOH): 229,4 mm (E^° 1 cm 610).

ΓΠ3.Χ

272,4 mm (E^1% 1 cm 293).

'’H-NMR-spektrum (DMSO-dg), delta:

3,14	(1H) ,	3,50 (1H),	4,07	(2H), 5,52 (1H),	5,66
(1H) ,	6,28	(1H), 7,22	(2H)	, 7,56 (2H), 7,72
(2H) ,	8,10	(2H) .
b) eljárás
11,65	g 1,2	, 4-triazol	120	ml acetonitrilben	készült,

jegesen hűtött szuszpenziójához keverés közben 7,0 ml foszforoxi-kloridot csepegtetünk. A beadagolást úgy végezzük el, hogy a belső hőmérséklet 15°C érték alatt maradjon.

Ezután ugyanezen a hőmérsékleten 22,7 ml trietil-amint csepegtetünk az elegyhez. 10 perc elteltével lassan az elegyhez adagoljuk 6,27 g 2. közbenső termék (+)-cisz-l/2-(benzoiloxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2,4-dion 330 ml acetonitrilben készült oldatát. A reakcióelegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd jeges fürdővel lehűtjük és lassan 30 ml trietil-amint, majd lassan 21 ml vizet adagolunk hozzá. A kapott oldatot bepároljuk, és a maradékot 400 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát oldat és 3x200 ml kloroform között megosztjuk.

Az egyesített kloroformos extraktumot magnézium-szulfáton megszárítjuk, leszűrjük, majd bepároljuk, és így 9,7 g nyersterméket kapunk. A nyersterméket 240 ml 1,4-dioxánban «« «·4·

- 26 oldjuk, majd 50 ml telített vizes ammóniaoldatot adunk hozzá (sg 0,880). 1,5 óra után az oldatot bepároljuk, és a maradékot metanolban oldjuk. Szilárd csapadék válik ki, amelyet leszűrünk. Az anyalúgot oszlopkromatográfia segítségével szilikagélen (Merek 9385, 600 g ) tisztítjuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, így

2,18 g sárgás-barna, szilárd cím szerinti vegyületet nyerünk. Ez megfelel az a) eljárásban kapott terméknek.

1. példa (+)-cisz-4-Amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on

8,19 g 3. közbenső termék cisz-4-amino-l-/2-(benzoiloxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on és 8,24 g Amberlite IRA-400 (OH) gyanta 250 ml metanolban készült szuszpenzióját keverés közben 1,25 órán át visszafolyatás mellett forraljuk. Ezután a szilárd anyagot leszűrjük, majd metanollal mossuk. Az egyesített szürletet bepároljuk, majd a maradékot 80 ml etil-acetáttal eldolgozzuk.A kapott

szilárd anyagot	leszűrjük, és	így	5,09	g cím	szerinti ve-
gyületet nyerünk	•
³H-NMR-spektrum	(DMSO-	•dg) , dél	ta:
3,04 (1H),	3,40	(1H), 3,	73	(2H) ,	5,18	(1H) ,
5,29 (1H),	5,73	(1H) , 6,	21	(1H) ,	7,19	(2H) ,

7,81 (1H).

2. példa (+)-cisz-4-Amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on enantiomerek királis HPLC segítségével végzett szétválasztása

A) Az 1. példában nyert racém terméket (25 mg) preparatív HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) elválasztásnak vetjük alá az alábbi feltételek mellett:

Oszlop: Merek Hibar cellulóz-triacetát, 250 x 10 mm, /U.

Eluens: etanol:

Áramlási sebesség: 3 ml/perc.

Detektálás: UV, 270 nm.

Hőmérséket: szobahőmérséklet.

A megfelelő egyesített frakciók bepárlásával 6,8 mg (e . e .· körülbelül 100 %) (2R,cisz)-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-ont és 3,6 mg (e.e.; körülbelül 90 %) (2S,cisz)-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-ont nyerünk.

B) Az 1. példában nyert 26 mg racém terméket preparatív HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) elválasztásnak vetjük alá az alábbi körülmények alkalmazásával.

Oszlop: ASTEC ciklobond I acetil, 250x4,6 mm.

Eluens: 0,2 %-os trietil-ammmónium-acetát (amelyet úgy állítunk elő, hogy 0,2 %-os vizes trietil-amin oldathoz jégecetet adagolunk, míg a végső pH értéke 7,2) .

Áramlási sebesség: 2 ml/perc.

Detektálás: UV, 300 nm.

Hőmérséklet: szobahőmérséklet.

A megfelelő frakciók bepárlásával 25 mg nyers (2R,cisz)-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil) -1,3-oxatiolán-5-il/-lH-p^J.rimidin-2-ont vegyületet, és 17 mg nyers (2S,cisz)-4-amino-l-/2-(hidoxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on vegyületet nyerünk. Ezeket a frakciókat külön-külön újabb preparatív HPLC elválasztásnak vetjük alá az alábbi körülmények alkalmazásával:

Oszlop: ASTEC ciklobond I acetil, 250x4,6 mm.

Eluens: 15 mM ammónium-acetát, pH = 6,8.

Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc.

Detektálás: UV, 300 nm.

Hőmérséklet: 5°C.

A megfelelő frakciók bepárlásával 5,0 mg (e.e.: kb.

%) (2R,cisz)-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on vegyületet és 7,6 mg (e.e.: kb. 96 %) (2S,cisz)-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on vegyületet nyerünk.

3. példa (-)-cisz-4-Amino-l-/2-(hidroxi-metil)-l,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on

i) (+)-cisz-4-Amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-

-5-il/-lH-pirimidinon dihidrogén-foszfát ammónium-só « ·· ··*· ·4 *· ···· · < · · · • ··· · · · ··· • · · < ♦ · ··· 4» · ·· ··

1,00 g (1. példa) (+)-cisz-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on 20 ml száraz trimetil-foszfátban készült 0°C hőmérsékletű, kevert szuszpenziójához 2,44 ml foszforoxi-kloridot adagolunk, majd az elegyet 35 percen át O°C hőmérsékleten keverjük. Ezután a reakciót 60 g jeges víz hozzáadásával leállítjuk, majd a hideg keverék pH-értékét vizes 1 n nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával 2,5 értékre állítjuk be. Ezután az elegyet 10 g aktívszén - oszlopra visszük (DARCO) és az oszlopot vízzel, majd etanolos vizes-ammóniaoldattal extraháljuk. A nyers monofoszfátot tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A kapott oldatot 25 g DEAE Sephadex A-25 (HCO^-forma) oszlopra visszük. Az eluálást gradiens eluens alkamazásával végezzük, amelyben sorrendben 120 ml vizet .móly

- 240 ml 0,1 rammónium-hidrogén-karbonát) NH^HCO^ oldatot, majd sorrendben 120 ml,240 ml, illetve 400 ml 0,2 mól, 0,3 mól, illetve 4 mól ammónium-hidrogén-karbonát NH^HCO^ oldatot alkamazunk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A maradék oldatot 40 ml vízzel hígítjuk, majd fagyasztva szárítjuk, és így fehér porszerű 1,37 g cím szerinti vegyületet nyerünk.

Ί 9UV-spektrum 4 ^: (pH=6, puffer), 271,0 nm (E ⁰ 1 cm 190).

ΓΠ3Χ ^H-NMR-spektrum (D₂q)< delta:

3,23 (1H), 3,55 (1H), 4,0 - 4,2 (2H), 5,43 (1H, 6,07 (1H), 6,33 (1H), 8,08 (1H).

ii) (2R,cisz)-4-Amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1, 3-oxatiolán-

-5-il/-lH-pirimidin-2-on és (2S,cisz) -4-Amino-l-/2- (hidroxi-meti])-l, 3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on mg 5'-nukleotidáz enzimet (17 egység/mg) (csörgőkígyó méregből nyert) (EC 3.1.3.5) adagolunk 1,35 g (+)-cisz-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on “ 6'-dihidrogén-foszfát ammóniumsó 30 ml pufferben készült oldatához (amely puffért 526 mg glicin és 190 mg magnézium-klorid 100 ml vízben történő oldásával állítunk elő). Az elegyet 2,5 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután további 20 mg enzimet adunk hozzá, majd az inkubálást további 3,5 órán át folytatjuk. A kapott elegyet ezután

DEAE Sephadex A-25 (hco₃ forma) oszlopra visszük. Az eluálást sorrendben 160 ml vízzel, majd egyenként 200-200 ml

0,1 mól, 0,2 mól, 0,3 mól és 0,4 mól ammónium-hidrogén-kar bonát NH^HCO^) oldattal végezzük. A megfelelő frakciókat, amelyek az első eluált komponenst tartalmazzák, egyesítjük és bepároljuk. A maradékot oszlopkromatográfia segítségével g szilikagélen (Merek 7734) kloroform-metanol elegy eluens alkalmazásával tisztítjuk. A megfelelő frakciókat, amelyeket metanol-etil-acetátból nyerünk bepároljuk, és így fehér szilárd anyagként 0,30 g (2R,cisz)-4--amino-l-/2-(hidroxi

-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-ont nyerünk. /alfa/³¹ = + 137° (c = 1,04 MeOH).

1J ·

- 31 ^Η-NMR-spektrum (DMSO), delta:

3,04 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (1H), 5,29 (1H), '5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

A Sephadex oszlopróljnyert megfelelő, a második eluált komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A maradékot 30 ml vízben oldjuk, majd 1,5 ml alkálikus foszfatázt adunk hozzá (amely 416 egység/ml tartalmú) (Esherichia coli-ból nyert) (EC 3.1.3.1). Ezután az elegyet 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd az oldószert bepároljuk, és a maradékot szilikagélen (60 g, Merek 7734) oszlopkromatográfia segítségével tisztítjuk, eluensként kloroform-metanol elegyet alkalmazunk.A megfelelő frakciókat, amelyeket metanol-etil-acetátból nyerünk bepároljuk, és így fehér szilárd 0,32 g (2S,cisz)-4-amino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on vegyületet nyerünk.

/alfa/J^ -132° (c = 1,08, MeOH) .

^Η-NMR-spektrum (DMSO), delta:

3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (1H),

5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H),

7,81 (1H).

4. példa (-)-cisz-4-Araino-l-/2-(hidroxi-metil)-1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-οη

i)

350 ml térfogatú táptalajt tartalmazó (Oxoid Ltd) edényt inokulálunk kacsnyi Escherichia coli (ATCC 23848) baktériummal, amelyet táptalaj agar lemezről kaparunk le.

Az edényeket 37°C hőmérsékleten éjszakán át inkubáljuk úgy, hogy 250 ford./perc rázást alkalmazunk. Ezután minden egyes edényt arra alkalmazunk, hogy 41 CDD táptlajt (glutaminsav 3g/l; MgSO^ 0,2 g/1; ^K ₂ ^SO4 ^2,5 NaCl

2,3 g/1; Na₂HPO₄.2H₂O 1,1 g/1; NaH₂PO₄-2H₂O 0,6 g/1; citidin 1,2 g/1) 7 literes fermentorban inku^láljuk. A kultúrákat 750 ford./perc rázatás mellett 4 liter/perc levegőztetés alkalmazásával 37°C hőmérsékleten fermentáljuk. 24 órán át végzett fermentáció után a sejteket centrifugálás segítségével elválasztjuk (5000 g, 30 perc) és így 72 g nedves tömegű sejtet kapunk. A sejt labdacsot 300 ml 20 mmól Tris-HCl pufferben (pH = 7,5) újra szuszpendáljuk, ultrahangos kezeléssel szétroncsoljuk (4x45 másodperc). A sejttöredékeket centrifugálással elválasztjuk ( 30000 g, 30 perc) és a felúszóban található proteint ammónium-szulfát hozzáadásával lecsapjuk, amelyet 75 %-os telítésig adagolunk az elegyhez. A levált csapadékot centrifugálás segítségével elválasztjuk (30000 g, 30 perc), majd a labdacsot 25 ml HEPES pufferben újraszuszpendáljuk ( 100 mmól, pH = 7,0), amely puffer 75 %-os telítésig ammónium-szulfátot tartalmaz. Enzimoldatot állítunk elő centrifugálás segítségével, amelyet 12000 ford./perc 30 perc alkalmazással végzünk. A felúszót eldobjuk és a labdacsot Tris-HCl pufferben oldjuk (pH = = 7,0; 100 mmól) úgy, hogy az eredeti térfogatot nyerjük vissza.

ii) 115 mg, 1. példa szerinti terméket oldunk 100 ml vízben és az oldatot keverjük, majd ehhez 0,5 ml enzimoldatot adunk. A keveréket konstans pH-értéken tartjuk úgy,hogy folyamatosan sósavat adagolunk hozzá (25 mmól). Az átalakulást királis HPLC (nagynyomsú folyadékkromatográfia segítségével követjük, amely azt mutatja, hogy elsősorban a (+)-enantiomer deaminálása történik meg. 22 óra elteltével a (+)-enantiomer (R_t= 12,5 perc) teljesen eltávolított, és ekkor az oldat pH-értékét tömény nátrium-hidroxid adagolással 10,5 értékre állítjuk be.

Az így fent nyert oldatot QAE Sephadex (A25;

Pharmacia; 30x1,6 cm) oszlopon eluáljuk, amelyet előzetesen pH 11 értékre egyensúlyba állítottunk. Az oszlopot 200 ml vízzel, majd 0,1 mól sósavval mossuk. 40 ml térfogatú frakciókat gyűjünk, amelyeket reverz fázisú HPLC segítségével analizálunk. Az 5-13. frakciókat, amelyek a nem-reagált (-)-enantiomer formát tartalmazzák gyűjtjük, majd pH-értéküket sósav segítségével 7,5 értékre állítjuk be. A 47 frakció, amely deaminált terméket tartalmaz, pH-értékét híg nátrium-hidroxid segítségével 7,5 értékre állítjuk be. A királis HPLC analízis azt mutatja, hogy ez az anyag keverék, amely fő komponensként az egyik enantiomert (R = 10,2 perc) és kis komponensként a másik enantiomertR = 8,5 perc) tartalmazza (e.e.: kb. 90 %).

iii) Az ii) folyamatot nagyobb mennyiségű anyaggal megismételtük. 363 mg 1. példa terméket 250 ml vízben 0,5 ml

i) lépésben előállított enzimoldattal inkubálunk. További

0,5 ml enzimet adagolunk a 18. és 47. órákban. A reakcióelegyet 70 órán át keverjük, majd további 64 órán át állni hagyjuk, a királis HPLC analízis azt mutatja, hogy a (+)-enantiomer tökéletesen deaminálódott és ekkor a kapott oldat pH-értékét nátrium-hidroxid segítségével 10,5 értékre állítjuk be.

A fent kapott oldatot ugyanolyan QAE oszlopra visszük és ati) lépés szerint eluáljuk. A 2-6. frakciókat, amelyek a maradék szubsztrátot és a deaminált terméket tartalmazzák, egyesítjük. A 7-13. frakciókat, amelyek a maradék szubsztrátot /(-)-enantiomer/ tartalmazzák egyesítjük, és pH-értéküket 7,5 értékre állítjuk be. A 25-26. frakciókat, amelyek a deaminált terméket tartalmazzák egyesítjük, és semleges pH-értékre állítjuk be.

A 2-6. frakciókat, amelyeket a fentiek szerint egyesítettünk azonos QAE oszlopon ismét eluáljuk. A 3-11. frakciókat erről a második oszlopról egyesítjük és ezek a nem-ragált szubsztrátot /(-)-enantiomer/ tartalmazzák. A 70. frakció tartalmazza aídeaminált terméket.

iv) Az ii) és az iii) lépésekben nyert reszolvált szubsztrát frakciókat egyesítjük és pH-értéküket 7,5 értékre állítjuk be. Az oldatot vízzel töltött XAD-16 (40x2,4 cm) oszlopon eluáljuk.Az oszlopot vízzel mossuk, majd aceton:víz 1:4 tf/tf eleggyel eluáljuk. A BCH 189 (-)-enantiomert tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, így 190 mg fehér, porszerű anyagot kapunk.

A fentiekben alkalmazott HPLC eljárások az alábbiak voltak:

1. Reverz fázisú analitikai HPLC:

Oszlop: Capital Cartridge Speherisorb ODS-2 (5 ^um)

150x4,6 mmól.

Eluens: ammónium-dihidrogén-foszfát (50 mmól + 5 % MeCN).

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.

Detektálás: UV, 270 nm.

Retenciós idők: BCH 189 =5,5 perc, deaminált BCH 189 = 8,1 perc.

2. Királis analitikai HPLC:

Oszlop: Ciklobond I acetil

250x4,6 mm ól.

Eluens: 0,2 % trietil-ammónium-acetát (pH = 7,2).

Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc.

Detektálás: UV, 270 nm.

Retenciós idők: BCH 189 = 11,0 és 12,5 perc.

deaminált BCH 189 = 8,5 és 10,2 perc.

(A biológiai konverziót úgy követjük, hogy a 12,5 perc értéknél megjelenő csúcs csökkenését vizsgáljuk, illetve a 10,2 perc értéknél jelentkező termék növekedését követjük).

5. példa (-)-cisz-4-Amino-l-/2-(hidroxi-metil) - l,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on

Jól növekedett táp agar lemezről lekapart kacsnyi E.coli B sejtet (ATCC 32848) alkalmazunk arra, hogy két

Florence edényben található táptalajt (250 ml) inokuláljunk. A kultúrát 18 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk 250 ford./perc, 5 cm táv rázatás alkalmazásával. Ezt a kultúrát alkalmazzuk ezután 40 liter CDD-táptalaj, amely citidint tartalmaz 70 literes fermentorben történő beoltására .

A fermentáció körülményei az alábbiak:

liter/perc levegőztetés, 750 ford./perc keverési sebesség és 37°C hőmérséklet. A fermentorhoz három Rushton keverőlapátot illesztünk. A fermentációt 18 órán át végezzük mielőtt folyamatos Sharples centrifuga segítségével a kapott anyagot kinyerjük. A sejttömeget (150 g nedves tömeg) -20 C hőmérséklere fagyaszjuk a sejtroncsolás előtt.

CDD táptalaj g/liter

L-glutaminsav	3
MgSO₄	0,2
k₂so₄	2,5
NaCl	2,3
Na₂HPO₄	1,1
NaH₂PO₄	0,6

A táptalajt desztillált vízzel készítjük,120°C hőmérsékleten 30 peren át sterilizáljuk. A citidint (1,2 g/liter) szűrőn sterilizáljuk, és az inokulálás előtt adjuk a táptalajhoz. A 150 g fagyasztott sejttömeget megolvasztjuk, és 750 ml 100 mmól HEPES /N-(2-hidroxi-etil)-piperazin-N'-(2-etánszulfonsav)/ pufferben(pH = 7,5) oldjuk, amely puffer 1 mmól etilén-diamin-tetraecetsav nátriumsót és mmól ditiotreitolt tartalmaz ( sejtbontási puffer).

A sejtroncsolást úgy végezzük, hogy a szuszpenziót Manton-Gaulin homogenizálón bocsátjuk keresztül, amely 7500 psi értéken működik. Ezt a sejtroncsolást háromszor elvégezzük úgy,hogy az egyes homogenizálón történő átbocsátások után a szuszpenziót mindig körülbelül 5°C hőmérsékletre visszahűtjük. A homogenátumot centrifugálás segítségével tiszta oldattá alakítjuk (1400 g; 60 perc.) A citidin deamináz aktivitástQ-Sepharose oszlopon (490 mg ágytérfogat) adszorbeáljuk, amelyet előzetesen 50 mmól Tris (hidroxi-metil)-metilamin (pH = 7,5) oldattal egyensúlyba hozunk, amely oldat 1 mmól nátrium-kloridőt tartalmaz. Az egyesített 210 ml aktív frakciót egy fenil-Sepharose oszlopra visszük (490 ml ágytérfogat), amelyet előzetesen a minta.pufferrel egyensúlyba állítunk, amely puffer 3,2 mól ammónium-szulfátot tartalmaz. A megkötött enzimet gradiens eluenssel eluáljuk, amelynek ammónium-szulfát koncentrációja egyre csökken. A deamináz aktivitást tartalmazó frakciókat gyűjtjük (695 ml), majd a részben tisztított enzimet 80 %-os ammónium-szulfát segítségével csapadékként leválasztjuk.

Az elegyet centrifugáljuk (1400 g; 60 perc), majd a labadacsot 54 ml fenti felúszóban újra szuszpendáljuk, és 4°C hőmérsékleten tároljuk.

6,2 ml ilyen oldatot centrifugálunk (18000 g, 90 perc) és a labadacsot 24 ml 0,5 mól kálium-fősz fát pufferben oldjuk (pH= 7,5). A szuszpenziót éjszakán át dializáljuk 1 mól *· · ·

- 38 kálium-foszfát pufferrel szemben (pH = 7,5). A visszatartott oldatot (20 ml) ezután azonos térfogatú desztillált vízzel hígítjuk. 35 ml ilyen oldathoz 1 g száraz Eupergit C anyagot adunk, majd az elegyet 150-300 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk (amelyet az oldatban maradó citidindeamináz aktivitás alapján határozunk meg). A megkötött enzimet 100 mmól Tris/HCl pufferrel (pH = 7,0) mossuk, amely puffer 1 mmól EDTA, 1 mmól DTT, 0,5 mól NaCl és 500 ppm p-hidroxi-benzoesav-etilészter tartalmú (tárolási puffer). A megkötött enzimet (2,7 g nedves tömeg) ebben a pufferben 4°C hőmérsékleten tároljuk, míg bioátalakításra fel nem használjuk.

g 1. példa szerinti terméket 1 literes mágneses keverővel ellátott edényben, 500 ml vízben oldunk. A biokonverziót 32°C hőmérsékleten pH-stabilizáló mellett hajtjuk végre. A pH-értéket 7,0 értéken tartjuk 1 mól ecetsav beadagolással. 1 g nedves tömegű megkötött enzimet mosunk desztillált vízzel a reakció megkezdése előtt. A konverziót királis HPLC segítségével követjük, amely azt mutatja, hogy elsősorban a (+)-enantiomer deaminálása történik. A reakció befejeződésekor (72 óra) a szilárd hordozóra kötött enzimet leszűrjük, majd a szürletet használjuk fel a kívánt (-)-enantiomer izolálásra.

-t

A reakcióelegy pH-érékét 1 mól ammónaioldat segítségével 10,5 értékre állítjuk be, majd az oldatot Duolite A 113 szupergyantára visszük, amely OH ciklusú (50 ml;

0,4 ágytérfogat/óra). Az uridin analóg a gyantához kötődik • · * . - 39 a (-)-enantiomer az oszlopon áthalad. Bármely, a gyantán maradó (-)-enantiomert 0,04 %-os ammóniaoldat segítségével végzett mosással eltávolítjuk ( 2 ágytérfogat; áramlási sebesség 0,8 ágytérfogat/óra).

Az áthaladó oldatok és mosófolyadék (600 ml) pH-értékét tömény kénsav segítségével 7,0 értékre állítjuk be, majd az oldatot XAD16 gyantára visszük (50 ml; áramlási sebesség 1,4 oszloptérfogat/óra). Az oszlopot desztillált vízzel mossuk (2,5 oszloptérfogat, áramlási sebesség 2 oszloptérfogat/óra) és a (-)-enantiomert aceton: víz 1 : 3 elue nssel eluáljuk (áramlási sebesség 1,5 oszloptérfogat/óra).

A (-)-enantiomert tartalmazó frakciókat (4 oszloptérfogat) egyesítjük, majd Buchi bepárlón bepároljuk kis térfogatra és ezt követően hármas méretű üvegszűrőn leszűrjük. A szűrt oldatot fagyasztva szárítjuk és így 1,2 g cím szerinti vegyületet nyerünk, amely azonos a 4. példa termékével.

6. példa

Tabletta gyógyszerkészítmény

A/ Az alábbi gyógyszerkészítményt állítjuk elő nedves granulálással az alkotóelemekből, amelyet Providone vízbeni odatával, majd a granulátum szárításával és szitálásával, ezt követően magnézium-sztearát adagolással és préseléssel végzünk.

• · » · ·

mg/tabletta

a)	aktív hatóanyag	250
b)	laktóz B.P.	210
c)	Providone B.P.	15
d)	nátrium-keményítő-
	-glikolát	20
e)	magnézium-sztearát	5

500 .

B/ Az alábbi gyógyszerkészítményt állítjuk elő közvetlen préselés segítségével; a laktóz közvetlen préselés-típusú.

mg/tabletta

aktív hatóanyag	250
laktóz	145
Avicel	100
magnézium-sztearát	5
	500

C/ (Szabályozott hatóanyag kibocsátású gyógyszerkészítmény). A gyógyszerkészítményt az alábbi alkotóelemek vízben készült Providone oldattal végzett nedves granulálásával, majd a granulátum szárításával és szűrésével, és ezt követően magnézium-sztearát adagolással és préseléssel állítjuk elő.

mg/tabletta

a) aktív hatóanyag 5qq

b) hidroxi-propil-metil-

-cellulóz (Methocel

K4M Prémium) 112

c)	laktóz B.P.	53
d)	Providone B.P.	28
e)	magnézium-sztearát	7
		700.
7 .	példa

Kapszula gyógyszerkészítmény

Kapszula gyógyszerkészítményt állítunk elő az alábbi alkotóelemek elegyítésével és ezek kétrészes kemény zselatin kapszulába való töltésével.

mg/kapszula aktív hatóanyag125 laktóz72,5

Avicel50 magnézium-sztearát2,5

250

8. példa

Injektálható gyógyszerkészítmény aktív hatóanyag 0,200 g nátrium-hidroxid oldat 0,1 mól pH = körülbelü 11 érték beállításához steril víz 10 ml térfogatra kiegészítő mennyiség.

Az aktív hatóanyagot a víz egy részében szuszpendáljuk (amelyet melegíthetünk), majd pH-értékét körülbelül 11 értékre állítjuk be nátrium-hidroxid-oldattal. Ezután kiegészítjük a térfogatot a kívánt értékre, és sterilizáló szűrőn leszűrjük steril 10 ml ampullákba, majd az ampullákat • ·

sterilen lezárjuk.

9. példa
	mg/kúp
aktív hatóanyag	250
kemény zsír B.P.	1770
	2020 .

A kemény zsír egyötödét megolvasztjuk egy gőzzel fűtött edényben maximálisan 45°C hőmérsékleten. Az aktív hatóanyagot 200 ^um szitán szitáljuk, majd hozzáadjuk az olvasztott alapanyaghoz keverés közben.Ennek során nagy nyíróerejű keverőt alkalmazunk, és a keverést addig folytatjuk míg egyenletes diszperziót nem nyerünk. A hőmérsékletet 45°C értéken tartva, a maradék kemény zsírt hozzáadjuk a szuszpenzióhoz és homogén keveréket állítunk elő a teljes szuszpenziót bocsátjuk keresztül

250 Ium folyamatos keverés közben, majd hagyjuk 40°C hőmérsékletre hülni. 38°C

40°C hőmérsékleten 2,02 g mennyiségű elegy egységeket töltünk alkamas 2 ml-es műanyag formákba. A kúp-formákat hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni.

10. példa

Biológiai aktivitás

Vírusellenes aktivitás

A 2. példában nyert vegyületek vírusellenes aktivitását mértük három HIV-1 és egy HIV-2 törzssel szemben, az alábbi sejtvonalakon.

JM sejtek, félig érett T-sejtvonal, amelyet HIV-1 GB8 törzssel fertőzött nyirokszövet leukémiában szenvedő betegből nyertek.

C8166 sejtek, emberi T-nyirokszövet daganat sejtvonal, HIV-1 RF törzzsel fertőzött.

MT-4 sejtek, emberi T-sejt leukémia sejtvonal, HIV-1 RF törzzsel fertőzött.

CEM sejtek, emberi T-nyirokszövet daganat sejtvonal, amely HIV-1 RF törzsekkel és U455 törzsekkel vagy HIV-2 ROD törzzsel fertőzött.

A C8166, a JM és a CEM sejteken kifejtett vírusellenes hatást úgy határozzuk meg, hogy milyen mértékben történik syncytioma-képződés inhibiálás (Tochikura és munkatársai Virology, 164, 542-546) az MT-4 sejteken pedig a formazan konverzió inhibiálásával határozzuk meg /Baba és munkatársai; (1987) Biochem Biophys Rés Commun., 142, 128-134; J.Immun Meth; 65 , 55-57/. A vírusellenes hatást továbbá úgy is meghatározzuk, hogy analizáljuk az enantiomerek jelenlétében, illetve jelenléte nélkül képződött HÍV p24 antigén mennyiségét.

Az eredményeket az alábbi I. és II. táblázatokban mutatjuk be.

·»« tó tó

kO	f—1	m	t—1
kO	1	o	o
r—1	>	*.	*>
00	H	o	o
o	K

00
	pq
	0	m	m
	r-l	o	o
	1		K.
	P>	o	o
s	H
b	w

Eh < Ν '< tó

CQ

Eh

Η

ω '(Ö tó (Ö tó ω

Φ Π φ

0) ω

Μ Ή >

ο\°

Ο

LT) rö ω -rö I—ι -rö Ή tó -Η tó c •Η

in
in P		00
	ko	o
rH	o	o
1	«k	·»
>	o	o
H tó

ω -Φ Ό «Ο

Ν tó 'φ tó rö ε ο •Η tó >1

Ο

Ö tó ω

S

Η

Ο

l-M tó
r-H	r-
1	o	o
>	·<
Hl	o	o
tó

Q
O
tó	LO	in
		in
CM	o	o
1		»>
>	o	o

Η

ΗτΗ k-i-<

C rö Ν rö g Μ Ο tó tó

Φ r—d tó tó w Ή tó tó Φ tó •m

Q) ω

I

Eh

S

tó
tó	00	r*
	C\1	m
ι—1	kk	*.
1 > H tó	o	o

i >

H ω tó tó ^KrH >

tó

Φ g o •r4 tó tó rö tó

O

I +~ tó φ g o •H tó tó rö tó

I

II. TÁBLÁZAT

HÍV p24 szintézis inhibiálása % HÍV p24 szintézis inhibiálás (/ug/ml)

Sejtek	C8166	JM	MT-4
Vírus	RF	GB 8	RF
(+)-enantiomer	0,021	0,033	0,0008
(-)-enantiomer	0,016	0,016	0,0004

B/ Citotoxicitás

A 2. példa szerinti vegyület_? a racém vegyület (BCH-189; 1. példa) és a két enantiomer 50 : 50 arányú elegyének citotoxicitását határoztuk meg CD-4 sejtvonalon: H9, JM, CEM, C8166 és U937.

A tesztvizsgálati vegyületekből sorozathígítást készítettünk 100 /Ug/ml - 0,3 /Ug/ml (végkoncentráció) értékben 96 üreges mikrotitráló lemezen. Minden egyes üregbe a lemezen a hatóanyagot nem tartalmazó kontrollt is beleertve 3,6 xlO sejtet inokulálunk. A lemezt 5 napon át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd az életképes sejtszámot határozzuk meg úgy, hogy a sejtszuszpenzióból mintát veszünk és tripan-kék kizáró sejtszámlálást végzünk egy vörösvértest számlálóban.

Az eredményeket a III. táblázatban adjuk meg.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (-) -cisz-4-Amino-l-/(2-hidroxi-metil) -1,3-oxatiolán-5-il/-lH-pirimidin-2-on vagy gyógyszerészetileg elfogadható származéka.
2. Az 1. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy mentes a megfelelő (+)-enantiomertől.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy benne a (+)-enantiomer nem több, mint körülbelül 5 tömeg% mennyiségben van jelen.
4. Az 1-3. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy benne a (+)-enantiomer nem több, mint körülbelül 2 tömeg% mennyiségben van jelen.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy benne a (+)-enantiomer nem nagyobb, mint körülbelül 1 tömeg% mennyiségben van jelen.
6. Az 1. igénypont szerinti vegyület,azzal jellemezve, hogy lényegében tiszta formájú.
7. Eljárás gyógyszerészetileg elfogadható készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal gyógyszerkészítménnyé feldogozzuk.
8. Eljárás az 1-6. igénypont bármelyike szerinti vegyület terápiában való alkalmazására.
9. Eljárás az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vegyületek felhasználására gyógyszer előállítására, amelyet • «4 ···· ·««« ·· · « · 4 · ·· • ··· * ♦ · ♦·· • 9 · · ·· ··· ·· · ·· ·♦ vírusos fertőzés kezelésében alkalmaznak.
10. Eljárás emlős - az embert is beleértve - kezelésére, amely virális fertőzésre érzékeny vagy virálisan fertőzött, azzal jellemezve,hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület hatásos mennyiségét adagoljuk.
11. Eljárás az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a (-)-enantiomert elválasztjuk egy keveréktől, amelyja ( + )-enantiomert is tartalmazza.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztott vegyületek keveréke racém keverék.
13. A 11. vagy 12. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztást királis nagynyomású folyadékkromatográfia, HPLC segítségével hajtjuk végre.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HPLC eljárásban álló fázisként acetilezett béta-ciklodextrint vagy cellulóz-triacetátot alkalmazunk.
15. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztást enzimes enantioszelektív katabolizmus segítségével végezzük.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimet rögzített formában alkalmazzuk.
17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként citidin deaminázt alkalmazunk .

·· ··«
18. A 15. vagy 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként 5'-nukleotidázt alkalmazunk .