RO112616B1

RO112616B1 - Derivat de 1,3-oxatiolan-nucleozida, procedeu pentru prepararea acestuia, compozitie farmaceutica si metoda de tratament

Info

Publication number: RO112616B1
Application number: RO149033A
Authority: RO
Inventors: Jonathan Alan Victor Coates; Ian Martin Mutton; Charles Richard Penn; Richard Storer; Christopher Williamson
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1991-05-02
Publication date: 1997-11-28
Also published as: US20030004175A1; CN1036196C; IE911482A1; NO920018L; RU2099338C1; SK283430B6; KR960007532B1; EP0625150A1; PT97520A; OA09559A; CA2059263A1; HU9200302D0; NZ238017A; CA2059263C; NO920018D0; FI111722B; JP2927546B2; TNSN91029A1; PL293181A1; NO180377B

Description

Prezenta invenție se referă la un derivat de 1,3-oxatiolan-nucleozidă, la un procedeu pentru prepararea acestuia, la o compoziție farmaceutică și la o metodă de tratament al infecțiilor virale.

Este cunoscut compusul cu formula:

NH,

hoch₂ s— sub denumirea de BCH-189 sau NGPB-21, ca având activitate virală, îndeosebi față de virusuri umane imunodeficitare [HIV] sau agenți ce cauzează SIDA.

Compusul cu formula I este un amestec racemic al celor doi enantiomeri cu formulele [1-1] și (I-2):

(1-1) (I-2) și a fost descris și testat sub forma racematului său (EP 382526].

Singurul compus în mod curent acceptat pentru tratamentul simptomelor provocate de HIV este 3'-azido-3'-deoxitimidină (AZT, zidovudină, BW 5O9U). Dar acest compus prezintă 35 efecte secundare și de multe ori este necesar să fie retras de la un număr important de pacienți. In consecință, este mereu necesar să se prevadă compuși eficienți față de HIV, dar care să prezinte concomitent un indice terapeutic mult mai bun.

Sunt cunoscute și alte nucleozide sintetice cu activitate anti-HIV ce includ, de exemplu, 3'-azido-2',3'-dideoxiuridina (AZDU], 3'-azido-2',3'- dideoxicitidina [CS-91], 3'-azido-5-metil-2',3'40 dideoxicitidina, care prezintă, de asemenea, variate efecte secundare (US 5041449, 5047407]

Prezenta invenție lărgește gama analogilor de 1,3-oxatiolan-nucleozidelor cu un derivat de 1,3-oxatiolan-nucleozidă cu formula I, prin aceea că este (-]-c/&4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3oxatiolan-5-il]-(1 H]-pirimidin-2-onă sau un amestec de (-]-enantiomer al c/s-4-amino-1-(245 hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il]-(1 H]-pirimidin-2-onei și (+]-enantiomer al c/s-4-amino-1 -(2hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il]-( 1 H]-pirimidin-2-onei, în care (+]-enantiomerul este prezent într-o cantitate de cel mult 5%, în greutate.

Invenția constă și într-un procedeu de preparare a enantiomerului derivatului de 1,3oxatiolan-nucleozidă cu formula I, dintr-un amestec care conține peste 5%, în greutate, (+]50 enantiomer care este supus catabolismului enantioselectiv mediat fie de HPLC chiral, fie mediat enzimatic, în care HPLC folosește ca fază staționară, β-ciclodextrină acetilată sau triacetat de celuloză, iar enzimă este folosită sub formă imobilizată, enzimă fiind citidindeaminaza sau 5'-nucleotidază.

RO 112616 Bl

Invenția constă și într-o compoziție farmaceutică care cuprinde enantiomerul derivatului de 1,3-oxatiolan-nucleozidă cu formula I, într-o cantitate eficientă terapeutic, împreună cu un 5 5 material de suport, farmaceutic acceptabil.

Invenția constă și într-o metodă de tratament al unei infecții virale la un mamifer, inclusiv omul, care cuprinde administrarea unei cantități eficace de enantiomer al derivatului de 1,3-oxatiolan-nucleozidă cu formula I, într-un interval de la 0,1 mg/kg corp/zi până la 750 mg/kg corp/zi, preferabil într-un interval de la 0,5 până la 60 mg/kg corp/zi și, de 60 preferință, în intervalul de la 1 până la 20 mg/kg corp/zi.

Invenția prezintă avantajul obținerii unui compus care prezintă o citotoxicitate considerabil mai redusă.

(-]-c/'s-4-Amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il-(1 H)-pirimidin- 2-ona (Compus A) prezintă stereochimia absolută a compusului cu formula (1-1), care are denumirea (2R, c/s]-4- 65 amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il-(1 H]-pirimidin-2-onă.

De preferință, compusul A este prevăzut în mod substanțial liber de (+]-enantiomerul corespunzător, adică este prezent nu mai mult de circa 5% greutate/greutate din (+]enantiomerul, de preferință, nu mai mult de circa 2%, în mod special, mai puțin decât circa 1% greutate/greutate. 1Ό

Pentru folosirea în tratamentul de infecții virale sunt incluși derivați farmaceutic acceptabili, înțelegându-se prin aceștia orice fel de sare, ester sau sare a unui astfel de ester farmaceutic acceptabil al compusului A sau orice alt compus care, după administrare, este capabil să furnizeze (direct sau indirect] un compus A sau un metabolit sau un rest al acestui antiviral activ. 7 5

Compusul A poate fi modificat pentru a se obține derivați ai acestuia farmaceutic acceptabili, cu grupe funcționale în cele două jumătăți de bază și cu grupa hidroximetil a inelului de oxatiolan. De interes deosebit sunt derivații farmaceutic acceptabili, obținuți prin modificarea grupei 2-hidroximetil a inelului de oxatiolan.

Esterii preferați ai compusului A includ compușii în care hidrogenul din grupa 2- 80 hidroximetil este înlocuit printr-o grupă funcțională acil R-C-, în care jumătatea R a esterului este aleasă dintre hidrogen, alchil liniar sau ramificat, de exemplu metil, etil, n-propil, terț-butil, n-butil, alcoxi-alchil, de exemplu, metoximetil, aralchil, de pildă benzii, ariloxi-alchil, de pildă fenoximetil, arii, de exemplu, fenil, eventual substituit cu halogen, alchil 0_η-0₄ sau alcoxi C_rC₄; esteri de sulfonat ca alchil- sau aralchilsulfonil, de pildă, metansulfonil; esteri de aminoacid, 85 de pildă, L-valil sau L-izoleucil și esteri de mono-, di- sau trifosfat.

Ținând seama de esterii descriși mai sus, dacă nu se specifică altfel, orice rest de alchil prezent conține în mod avantajos 1 până la 16 atomi de carbon, îndeosebi 1 până la 4 atomi de carbon. Orice rest arii prezent în acești esteri cuprinde în mod avantajos o grupă fenil. 90

In mod deosebit, esterii pot fi un ester alchil C^C^, un ester benzii nesubstituit sau un ester benzii substituit cu cel puțin un halogen (brom, clor, fluor sau iod], grupe alchil Οτ-Οθ, alcoxi C-j-Og, nitro sau trifluorometil.

Sărurile farmaceutic acceptabile ale compusului A cuprind cele derivate de la acizi și baze anorganice și organice, farmaceutic acceptabile. Exemple de acizi convenabili cuprind 95 acizii clorhidric, brom-hidric, sulfuric, azotic, percloric, fumărie, maleic, fosforic, glicolic, lactic, salicilic, succinic, p-toluensulfonic, tartric, acetic, citric, metansulfonic, formic, benzoic, malonic, 2-naftalinsulfonic și benzen-sulfonic. Alți acizi, ca acidul oxalic, care nu sunt farmaceutic acceptabili, pot fi utili ca intermediari pentru obținerea compusului conform invenției și a sărurilor acide de adiție, farmaceutic acceptabile. 100

Sărurile derivate de la baze corespunzătoare cuprind săruri de metal alcalin, de pildă sodiu, de metal alcalino-pământos, de exemplu, magneziu, de amoniu și de NR₄ ⁺ (în care R este alchil CȚ-CJ.

Pentru prepararea compusului A și a derivaților săi, farmaceutic acceptabili, se va stabili dacă stereochimia dorită a compusului A se poate obține fie prin inițierea cu un 105 material inițial optic pur sau prin separarea amestecului racemic într-una din fazele sintezei. Oricum, produsul dorit, optic pur, se poate obține prin separarea produsului final, rezultat din fiecare reacție.

RO 112616 Bl

(II) în care grupa anomerică L este o grupare deplasabilă, se supune reacției cu o bază corespunzătoare. Grupele convenabile L cuprind -OR, în care R este o grupă alchil, de pildă, o grupă alchil C.,-C₆, ca metil, sau R este o grupă acil, ca acetil sau halogen cum sunt iod, brom sau clor.

Compusul cu formula II reacționează în mod convenabil cu citozină sau cu o bază de pirimidină corespunzătoare, ca precursor al acesteia (sililat în prealabil cu un agent de sililare, ca hexametilendisilasan) într-un solvent compatibil, ca clorură de metilen, folosind un acid Lewis ca tetra-clorură de titan, compus de staniu IV, ca SnCI₄ sau triflat de trimetil-silil.

1,3-Oxatiolanii cu formula II se pot prepara, de exemplu, prin reacția unei aldehide cu formula III:

C₆H₅C0₂CH₂CH0 [III] cu un mercaptoacetal cu formula IV:

HSCH₂CH(OC₂HC)₂ (IV) într-un solvent organic compatibil, în prezența unui catalizator acid, de exemplu, un acid Lewis, ca clorură de zinc.

Mercaptoacetalii cu formula IV se pot prepara prin metode cunoscute. La fel aldehidele cu formula III se pot prepara prin metode cunoscute. In mod convenabil, aldehida brută cu formula III se poate purifica prin conversia la aductul de bisulfit cristalin și prin reconversia în conti-nuare la aldehida liberă.

Intr-un al doilea procedeu (B), compusul A se obține prin intercon-versia de bază a unui compus cu formula V:

hoch₂

(V) în care B este o bază convertibilă la citozină. Această conversie se poate executa fie prin simplă transformare chimică (de exemplu, conversia de la uracil la citozină), fie printr-o conversie enzimatică folosind o trans-ferază de deoxiribozil. Aceste metode și condiții pentru interconversia de bază sunt cunoscute în chimia nucleozidelor.

Intr-un al treilea procedeu (C), un compus cu formula VI:

(VI) se poate transforma în compusul A prin conversia grupei anomerice NH₂ la baza de citozină prin metode cunoscute în chimia nucleozidelor.

In reacțiile de mai sus, care necesită grupe funcționale protejate, protecția și deprotejarea grupelor funcționale se poate executa prin metode obișnuite. Astfel, de pildă,

RO 112616 Bl

165 grupe amino se pot proteja cu o grupă aleasă dintre aralchil (benzii), acil, arii (2,4-dinitrofenil) sau silii; îndepărtarea în continuare a grupei de protecție se execută, la dorință, prin hidroliză sau hidrogenoliză, folosind pentru aceasta condiții cunoscute. Grupele hidroxil se pot proteja folosind orice fel de grupă de protecție de hidroxil convențională. Exemple de grupe de protecție a hidroxilului con-venabile includ grupe alese dintre alchil (de exemplu, metil, terț-butil sau metoximetil), aralchil (de exemplu, benzii, difenilmetil sau trifenil-metil), grupe heterociclice, ca tetrahidropiranil, acil (de exemplu, acetil sau benzoil) și grupe silii, ca trialchilsili (de exemplu, terț-butildimetilsilil). Grupele protectoare pentru hidroxil se pot îndepărta prin metode obișnuite, astfel, de exemplu, alchil, silii, acil și grupe heterociclice se pot îndepărta prin solvoliză, de exemplu, prin hidroliză în condiții acide sau bazice. Grupele aralchil, ca trifenilmetil, se pot îndepărta în mod similar prin solvoliză, de exemplu, prin hidroliză în condiții acide. Grupele aralchil, ca benzii, se pot scinda, de exemplu, prin tratare cu BF₃/ eterat și anhidridă acetică, după care urmează îndepărtarea grupelor acetat astfel formate, la un stadiu corespunzător în sinteză. Grupele silii se pot, de asemenea, îndepărta, în mod convenabil, folosind o sursă de ioni de fluorură, ca fluorură de tetra-n-butilmoniu.

In procedeele de mai sus, compusul A se obține, în general, ca un amestec de izomerii săi cis și trans, din care izomerul cis reprezintă compusul dorit.

Acești izomeri se pot separa prin mijloace fizice, de pildă, cromato-grafie pe silicagel sau prin cristalizare fracționată, fie direct, fie pe un derivat potrivit al acestora, de exemplu, acetați [preparați, de exemplu, cu anhidridă acetică) urmată, după separare, prin conversie înapoi la produsul inițial (de pildă, prin dezacetilare cu soluție metanolică de amoniac).

Sărurile farmaceutic acceptabile ale compusului, conform invenției, se pot prepara în mod cunoscut. Astfel, dacă se dorește prepararea unei sări acide de adiție a compusului A, produsul de la oricare din metodele de mai sus se poate converti la o sare, prin tratarea bazei libere rezultate cu un acid corespunzător, folosind metode convenționale.Sărurile acide de adiție, farmaceutic acceptabile, se pot prepara prin reacționarea bazei libere cu un acid corespunzător, eventual în prezența unui solvent, cum este un ester, ca acetat de etil sau un alcool, ca metanol, etanol sau izopropanol. Sărurile bazice anorganice se pot prepara prin reacționarea compusului inițial cu o bază potrivită, cum este un alcoxid, ca metoxid de sodiu, eventual în prezența unui solvent, de exemplu alcool, cum este metanolul. Sărurile farmaceutic acceptabile se pot, de asemenea, prepara din alte săruri, cuprinzând alte săruri farmaceutic acceptabile ale compusului A, aplicând metode obișnuite.

Compusul A se poate transforma într-un fosfat sau un alt ester farma- ceutic acceptabil, prin reacție cu un agent de fosforilare ca P0CI₃ sau cu un agent corespunzător de esterificare, cum este o halogenură acidă sau o anhidridă. Un ester sau o sare a compusului A se poate converti la compusul inițial, de pildă, prin hidroliză.

Redizolvarea produsului final sau a unui intermediar sau a unui material inițial se poate executa prin orice metodă potrivită, cunoscută în domeniu.

Astfel, de exemplu, compusul A se poate obține prin HPLC chiralic, folosind o fază staționară corespunzătoare, de pildă, β-ciclodextrină acetilată sau triacetat de celuloză și un solvent corespunzător, de pildă, un alcool, ca etanol, sau o soluție apoasă, de pildă, de acetat de trietil-amoniu. In mod alternativ, compușii se pot resolvi prin catabolism enantio-selectiv, mediat prin enzimă, cu o enzimă corespunzătoare, ca deaminază de citidină sau prin degradare enzimatică selectivă a unui derivat potrivit, folosind o 5'-nucleozidază. Dacă resolvarea se execută enzimatic, enzimă se poate folosi fie în soluție sau mai degrabă sub formă imobilizată.Enzimele se pot imobiliza prin orice metodă cunoscută în domeniu, de pildă prin adsorbție pe o rășină, ca Eupergit C.

Se dau în continuare mai multe exemple de realizare a invenției.

Intermediar 1.

Benzoat de 5-metoxi-1,3-oxatiolan-2-metanol soluție de 1,6 g clorură de zinc în 15 ml metanol fierbinte se adaugă la o soluție, sub agitare, de 34,2 g mercaptoacetaldehidă dimetil- acetal și 48,3 g benzoiloxi-acetaldehidă în 1300 ml toluen, care apoi se încălzește cu reflux, sub azot, timp de 50 min. Amestecul răcit se concen- trează, se diluează cu puțin toluen, după care se filtrează prin kieselgur. Filtratele reunite și toluenul se spală cu o soluție apoasă saturată de bicarbonat de sodiu, de două ori

170

5

0

185

190

195

200

205

210

215

RO 112616 Β1 și cu saramură, se usucă peste sulfat de magneziu, după care se evaporă la un ulei care se supune cromatografiei în coloană de silicagel, se eluează cu cloroform, obținându-se produsul din titlu, ca 45,1 g ulei, sub formă de amestec de anomeri circa 1:1. 1H RMN (DMS0-d₆): 3,1-3,3 (4H); 3,42 (6H); 4,44,6 (4H); 5,41 (1H); 5,46 (1H); 5,54 [1H); 5,63 (1H); 7,46 (4H); 7,58 (2H); 8,07 [4HJ; _Ymax (CHBr₃): 1717,6 cm’¹.

Intermediar 2 (±]-cis-1 -[2-Benzoiloximetil-1,3-oxatiolan-5-il]-[ 1 H]-pirimidin-2,4-dionă

Un amestec de 9,62 g uracil fin măcinat, 50 ml hexametildisilazan și 30 mg sulfat de amoniu se încălzește la reflux, sub azot, până la obținerea unei soluții limpezi. Aceasta se răcește și apoi se evaporă până la un ulei incolor care se dizolvă, în atmosferă de azot, în 1OO ml acetonitril. Soluția se adaugă la o soluție, sub agitare, răcită cu gheață, de 19,43 g benzoat de 5-metoxi-1,3-oxatiolan-2-metanol (intermediar 1 ] în 600 ml acetonitril și se adaugă 14,7 ml trifluormetansulfonat de trimietilsilil. Baia cu gheață se îndepărtează și soluția se încălzește la reflux, sub azot, timp de 45 min. După răcire și evaporare, rediduul se purifică prin cromatografie în coloană, pe 1 kg de silicagel, eluând cu cloroform/metanol 9:1. Fracțiunile corespunzătoare se răcesc și se evaporă, obținându-se un reziduu brut. Acesta se cristalizează fracționat din minimul de metanol fierbinte, circa 1200 ml, obținându-se 6,32 g compus din titlu, sub formă de cristale albe. 1HRMN (DMSO-d_s]â: 11,36(1H, bs); 7,508,00 (6H, m); 6,20 (1H, t); 5,46 (2H, m); 4,62 (2H, m); 3,48 [1H, m); 3,25 (1H, m).

Intermediar 3 (± )-cis-4-Amino-1 -(2-benzoiloximetil-1,3-oxatiolan-5-ilJ-1 H)-pirimidin-2-onă

Metoda a]

O suspensie de 20,705 g citozină și câteva mg de sulfat de amoniu în 110 ml hexametildisilazan se agită și se încălzește la reflux, timp de 2,5 h, sub azot. Solventul se îndepărtează prin evaporare și solidul rezidual se dizolvă în 350 ml acetonitril. Această soluție se transferă folosind metoda cu ace flexibile, într-o soluție, sub agitare, răcită cu gheață, de 43,57 g benzoat de 5-metoxi-1,3-oxatiolan-2-metanol (intermediar 1 j în 650 ml acetonitril, sub azot.Se adaugă 33 ml trifluormetansulfonat de trimetil-silil, soluția se lasă să se încălzească la temperatura ambiantă, timp de 1,5 h, după care se încălzește la reflux, peste noapte. Amestecul rezidual se concentrează, se diluează cu soluție apoasă saturată de bicarbonat de sodiu, în cantitate de 500 ml, după care se extrage de trei ori cu câte 500 ml acetat de etil. Extractele reunite se spală de două ori cu câte 250 ml apă și 250 ml saramură, se usucă peste sulfat de magneziu, după care se evaporă la o spumă, care se supune cromatografiei în coloană pe silicagel, 600 g, se eluează cu amestec de acetat de etil și metanol, obținându-se un amestec de anomeri (circa 1:1, 31,59 g). Amestecul se cristalizează din 45 ml apă și 9,0 ml etanol, obținându-se 10,23 g de produs solid, care se recristalizează din 120 ml etanol șî 30 ml apă și se obține produsul din titlu, ca 9,26 g solid alb. X_max (MeOH) 229,4 mm (E1% 610); 272,4 mm (E1% 293); ¹H RMN (DMSO-d_s)0: 3,14 (1H); 3,50 (1H); 4,07 (2H); 5,52 (1H); 5,66 (1H); 6,28 (1H); 7,22 (2H); 7,56 (2H); 7,72 (2H); 8,10 (2H).

Metoda b] □ cantitate de 7,0 ml oxiclorură de fosfor se adaugă, în picături, la o suspensie, sub agitare, răcită cu gheață, de 1,65 g de 1,2,4-triazol, în 120 ml acetonitril, apoi, menținând temperatura internă sub 15°C, se adaugă, în picături, 22,7 ml trietilamină. După 10 min, se adaugă lent o soluție de 6,27 g (±)-c/s-1-(2-Benzoiloximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1 H)-pirimidin-2,4dionă (intermediar 2] în 330 ml acetonitril. Apoi, agitarea se continuă peste noapte la temperatura camerei. Amestecul se răcește pe o baie cu gheață și se adaugă lent 30 ml trietilamină, urmată de 21 ml apă. Soluția rezultată se evaporă și reziduul se împarte între 400 ml soluție saturată de bicarbonat de sodiu și cloroform (3 x 200 ml). Extractele cloroformice reunite se usucă peste sulfat de magneziu, se filtrează și se evaporă, dând 9,7 g reziduu brut. Reziduul se dizolvă în 240 ml 1,4-dioxan și se adaugă 0,880 g (50 ml) soluție apoasă, concentrată, de amoniac. După 1,5 h, soluția se evaporă și reziduul se dizolvă în metanol. Aceasta provoacă precipitarea unui produs solid care se separă prin filtrare. Soluțiile mumă se purifică prin cromatografie în coloană peste 600 g silicagel. Fracțiunile corespunRO 112616 Bl zătoare se înmoaie și se evaporă, obținându-se compusul din titlu, ca 2,18 g solid roșiatic, identic cu cel obținut prin metoda a).

Exemplul 1. [±)-(cis)-4-Amino-1 -[2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il]-( 1 H]-pirimidin-2-onă □ suspensie de 8,19 g (±]-c/'s-4-Amino-1-(2-benzoiloximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-1 HJpirimidin-2-onă (intermediar 3) și 8,24 g rășină Amberlit IRA-400 (OH) în 250 ml metanol se agită și se încălzește la reflux timp de 1,25 h. Solidele se îndepărtează prin filtrare și apoi se spală cu metanol. Filtratele reunite se evaporă. Reziduul se triturează cu 180 ml acetat de etil. Produsul solid, alb, rezultat se colectează prin filtrare, obținându-se 5,09 g de compus din titlu. ¹H RMN (DMS0-d₆): 3,04 (1H); 3,40 (1H); 3,73 (2H); 5,18 (1H); 5,29 (1H); 5,75 (1H); 6,21 (1H); 7,19 (2H); 7,81 (1H).

Exemplul 2. Separare chiralică HPLC a enantîomerilor de (±]-[cis)-4-amino-1-(2hidroximetil- 7,3-oxatiolan-5-il)-( 7 H]-pirimidin-2-onă

A] Produsul racemic din exemplul 1, în cantitate de 25 mg, se supune unei HPLC preparativă în următoarele condiții:

Coloană: triaacetat de celuloză, 250 x 10 mm 10p eluant: etanol curent: 3 ml/min detecție: uv , 270 nm temperatură: ambiantă

Prin evaporarea fracțiunilor înmuiate, corespunzătoare, se obțin 6,8 mg, circa 100% de (2R,c/s)-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1 H)-pirimidin-2-onă și 3,6 mg, circa 90% de (2S,c/s)-4-amino-1-(2-hidroxi-metil-1,3-oxatiolan-5-il)-( 1 H)-pirimidin-2-onă.

B] Produsul racemic din exemplul 1, în cantitate de 26 mg, se supune unei HPLC preparativă în următoarele condiții:

Coloană: ASTEC ciclolegătură I acetil, 250 x 4,6 mm eluant: 0,2% acetat de trietilamoniu (preparat prin adăugarea de acid acetic glacial la 0,2% trietilamină în apă până la un pH final de 7,2).

curent: 2 ml/min detecție: uv, 300 nm temperatură: ambiantă

Prin evaporarea fracțiunilor corespunzătoare se obțin 25 mg de(2R,c/s)-4-amino-1-(2hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1 H)-pirimidin-2-onă brută și 17 mg de (2S,c/s)-4-amino-1-(2hidroxi-metil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1H]-pirimidin-2-onă brută. Aceste fracțiuni se supun separat unei HPLC preparative în următoarele condiții:

Coloană: ASTEC ciclolegătură I acetil, 250 x 4,6 mm eluant: 15 mM acetat de amoniu, pH 6,8 curent: 0,5 ml/min detecție: uv, 300 nm temperatură: ambiantă

Prin evaporarea fracțiunilor corespunzătoare din vas se obțin 5,0 mg, circa 91%, de (2R,c/s)-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1H)-pirimidin-2-onă și 7,6 mg, circa 96%, de (2S,c/s)-4-amino-1-(2-hidroxi-metil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1 H)-pirimidin-2-onă.

ExempluI 3. [-)-cis^4-amino-7-[2-hidroximetil- 7,3-oxatiolan-5-il]-(7H]-pirimidin-2-onă. i] [±)-(cis)-4-Amino- 7 -(2-hidroximetil- 7,3-oxatiolan-5-il]-(1 H)-pirimidin-onă, dihidrogenfosfat, sare de amoniu

O suspensie, sub agitare, răcită la 0°C, în cantitate de 1,00 g de (+)-c/s-4-amino-1-(2hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1 H)-pirimidin-2-onă (exemplul 1)în 20 ml trimetilfosfat uscat, se tratează cu 2,44 ml oxi-clorură de fosfor și amestecul se agită la 0°C timp de 35 min, după care se răcește în 60 g apă cu gheață. Amestecul rece se aduce la pH 2,5 prin adăugare de soluție apoasă 1N de hidroxid de sodiu, după care se trece prin coloană de cărbune activ (10 g), care se eluează cu apă, apoi cu etanol-soluție apoasă de amoniac. Fracțiunile ce conțin monofosfat brut se reunesc și se concentrează. Soluția rezultată se trece printr-o coloană ce conține 25 g DEAE Sephadex A-25 (forma HC0₃). Se eluează cu un gradient de apă, 120 ml, la 240 ml de 0,1 M de NH₄HC0₃, apoi cu 120, 240, respectiv 400 ml de 0,20,3 și 4 M de NH₄HC0₃. Fracțiunile corespunzătoare se reunesc și se concentrează.

300

305

310

315

320

325

RO 112616 Bl

Soluția reziduală se diluează cu 40 ml apă și se usucă prin înghețare, obținându-se produsul din titlu, sub formă de solid alb, în cantitate de 1,37 g.

Ă_max (pH 6 tampon] 271,0 nm (E^1% 1 cm 190): ¹H RMN (D20) δ 3,23 [1H); 3,55 (ΊH); 4,0-4,2 (2H); 5,43 (1H); 6,07 (1 H); 6,33 (1 H); 8,08 (1 H). ii] (2R,c/s)-4-amino-1-(2hidroximetil-1,3-oxatio(an-5-il]-(1 H]-pirimidin-2-onă și (2S,c/s)-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3oxatiolan-5-ilH 1 H)-pirimidin-2-onă

5'-Nucleotidază [de la crotalus atrox venom]/EC 3,1,3,5/(60 mg la 17 unități/mg] se adaugă la □ soluție de 1,35 g de (+)-c/s-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il]-(1 H]pinmidin-2-onă, 6’-dihidrogenfosfat, sare de amoniu, în 30 ml tampon preparat din 526 mg glicină si 190 mg clorură de magneziu în 100 ml apă și amestecul se incubează la 37 C, timp de 2.5 h. Amestecul rezultat se rece printr-o coloană de DEAE Sephadex A-25 [forma HC0₃). Se eluează cu 160 ml apă, apoi cu 0,1, 0.2, 0,3 și 0,4 M NH₄C0₃ (200 ml fiecare), iu Fracțiunile corespunzătoare conținând prima componentă eluată se reunesc și se evaporă, reziduul se supune cromatografiei în coloană pe silicagel și se eluează cu amestec de cloroform și metanol. Prin evaporarea fracțiunilor corespunzătoare din metanol-acetat de etil se obțin 0,30 g (-)-c/s-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il]-(1 H)-pirimidin-2-onă, sub formă de solid alb [alfa] D²¹-137°C (c.1,04 MeOH); Ή RMN (DMSO) δ 3,04 (1H); 3,40 (1H); 3,73 (2H); 5,18 (1H); 5,29 (1H); 5,73 (1H); 6,21 [1H); 7,19 (2H); 7,81 [1H).

Fracțiunile corespunzătoare din coloana de Sephadex conținând a doua componentă eluată se reunesc și se evaporă. Reziduul se dizolvă în 30 ml apă, se tratează cu fosfatază alcalină [Escherichia coli] /EC 3.1. 3.1./(1,5 ml la 416 unități/ml), apoi se incubează la 37 C, timp de 1 h. Solventul se îndepărtează prin evaporare și reziduul se supune ; cromatogra-fiei în coloană oe silicagel (60 g) și se eluează cu amestec de cloroform si etanol.

Prin evaporarea fracțiunilor corespunzătoare din metanol și acetat de metil, se obțin 0,32 g (+c/s)-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3- oxatiolan-5-il)-(1 H)-pirimidin-2-onă, sub formă de solid alb [alfa] D²¹ + 132°C(c.1,08 MeOH]; Ή RMN [DMSO] δ 3,04 (1H); 3,40 (1H); 3,73 (2H); 5,18 (1H); 5,29 (1H); 5,73 (1H); 6,21 (1H); 7,19 (2H); 7,81 (1H).

5 5 Exemplul 4. f-)-cis-4-amino-1 -(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-ilJ-( 1 H]-pirimidm-2-onă

i] Trei flacoane de 50 ml cu soluție nutritivă se inoculează cu un prelevator plin cu Escherichia coli,răz.uită de pe o placă de agar nutritiv. Flacoanele se incubează peste noapte la 37°C cu agitare cu 250 turații/min și apoi fiecare flacon se folosește la inoculare de 41 mediu CDD (acid glutamic 3 g/l; MgSO₄ 0,2g/l; K_aSO₄ 2,5 g/l; NaCI 2,3 g/l; Na₂HP0₄.2F^0

36o 1,1 g/l; NaH₂P0₄.2H₂0 0,6 g citidină 1,2 g/l) într-un fermentator de 7 I. Culturile se fermentează cu 750 rev./min 37°C, cu aerare la 4l/min. După dezvoltare timp de 24 h, celulele se colectează prin centrifugare (5000 g, 30 min) obținându-se 72 g masă umedă. Peletele celulare se resuspendă în 300 ml tampon 20 mM de tris HCI, pH 7,5, și se dislocă prin sonificare (4 x 45 sec). Sfărâmăturile de celule se îndepărtează prin centrifugare și 365 proteina în soluția superioară se precipită prin adăugare de sulfat de amoniu la saturație de 75 %. Precipitatul se colectează prin centrifugare (30 000 g, 30 min) și peleta se resuspendă în 25 ml tampon HEPES (100 nM, pH 7,0) conținând sulfat de amoniu (75% saturare). Soluția de enzimă se prepară prin centrifugare Ia 12 000 turații/min, timp de 30 min. Soluția superioară se îndepărtează și peleta se dizolvă în tampon de tris HCI (pH 7,0; 100 mM] la o^-7 o volumul original.

ii] O cantitate de 115 mg din produsul din exemplul 1 se dizolvă în 100 ml apă și se agită. Se adaugă 0,5 ml soluție de enzimă și amestecul se menține la un pH constant, prin adăugare continuă de 25 mM HCI. Conversia se controlează prin HPLC chiralic care arată că (+)enantiomerul din substrat se dezaminează preferențial. După 22 h, (+)enantiomerul din

5 substrat (RT, 12,5 min] este îndepărtat complet și soluția se aduce la pH,5 prin adăugare de soluție concentrată de hidroxid de sodiu.

Soluția produsă mai sus se eluează printr-o coloană de Sephadex de 30 x 1,6 cm, preechilibrată la pH 11. Coloana se spală cu 200 ml apă și apoi cu soluție 0,1M HCI. Fracțiunile, în volum de 40 ml, se separă și se analizează prin HPLC fază reversă. Fracțiunile 3 -o 5-13, conținând (-)-enantiomerul neintrat în reacție din substrat se reunesc si se aduc la pH 7,5 cu Hcl. Fracțiunea 47, conținând produsul dezaminat, se aduce la pH 7,5 cu soluție

RO 112616 Bl diluată de hidroxid de sodiu. Analiza prin HPLC chiralic arată că acest material este un amestec constând dintr-un enantiomer (RT 10,2 min) ca componentă majoră, iar celălalt enantiomer (RT 8,5 min) apare drept componentă minoră (circa 90%).

iii) Reacția de mai sus ii) se repetă la o scară mai mare. 363 mg din compusul din 3? 5 exemplul 1 în 250 ml apă se incubează cu 0,5 ml soluție de enzimă preparată ca în faza (i). După 18 și 47 h se adaugă alte alicote de 0,5 ml enzimă. Amestecul de reacție se agită timp de 70 h, apoi se lasă să stea alte 64 h. Analiza HPLC chiralică indică că (+)enantiomerul din substrat a fost dezaminat complet și soluția rezultată s-a adus la pH 10,5 cu hidroxid de sodiu. 3 9C

Soluția de mai sus se aduce pe aceași coloană și se eluează ca în faza i). Fracțiunile

2-6 conținând un amestec din substratul rezidual și produsul dezaminat formează o masă. Fracțiunile 7-13 conținând (-)enantiomerul rezidual din substrat se reunesc și se aduce la pH

7,5. Fracțiunile 25-27 conținând produsul dezaminat se comasează și se neutralizează.

Fracțiunile 2-6 de mai sus se reeluează prin aceeași coloană. 335

Fracțiunile 3-11 de la aceeași a doua coloană conțin (-)enantiomerul din substrat neintrat în reacție. Fracțiunea 70 conține produsul dezaminat.

iv] Fracțiunile din substrat neresolvite din fazele (ii) și (iii) se reunesc și se aduc la pH

7,5. Această soluție se eluează printr-o coloană XAD-16 (40 x 2,4 cm] și se introduce în apă. Coloana se spală cu apă și apoi se eluează cu acetonă:apă (1:4 vol/vol). Fracțiunile conținând 400 (-)-enantiomerul de BCH 189 se reunesc și se usucă prin înghețare, obtinându-se 190 mg pulbere albă. Metodele de HPLC folosite mai sus sunt următoarele:

1. Fază analitică HPLC reversă

Coloana: Cartuș principal Spherisorb 0DS-2-(5Ă-M) 150x4,6mm

Eluant: Dihidrogenfosfat de amoniu (50 mM)+5%MeCN 405

Curent: 1,5ml/min

Detecție: uv, 270 nm

Timp de retenție: BCH 189 5,5 min

BCH 189 dezaminat 8,1 min

2. HPLC chiralic analitic410

Coloana: Ciclolegătură I acetal 250x4,6mm

Eluant: 0,2% acetat de trietilamoniu (pH 7,2)

Curent: 1,0 ml/min

Detecție: uv, 270 nm

Timp de retenție: BCH 189 11,0 și 12,5 min415

BCH 189 dezaminat 8,5 și 12,5 min (Bioconversia este urmată de controlarea pierderii vârfului la 12,5 min și acumularea produsului la 10,2 min).

Exemplul 5. (-)-cis-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1H]-pirimidin-2-onă

Un prelevator de celule E. coli răzuite de pe o placă de agar nutritiv bine dezvoltat se folosește pentru inocularea a 2 flacoane Florence conținând fiecare 250 ml soluție nutritivă. 420 Cultura se incubează la 37°C cu agitare (250 rev./min, 5 cm aruncare) timp de 18 h. Aceasta se folosește apoi pentru inocularea de 40 I mediu de CDD, cu citidină, într-un fermentator de 70 I.

Condițiile pentru fermentare sunt următoarele: 40 l/min aerare, 750 rev/min viteză de agitare, la o temperatură de 37°C. La fermentator se fixează 3 dispozitive rotative 425 Rushton. Fermentarea se execută timp de 18 h înaintea recoltării, folosind o centrifugă continuă. Placa cu celule de greutate netă 150 g se îngheață la -20°C, înaintea ruperii celulare.

Mediu CDD	aA
Acid glutamic 3
MgS0₄	0,2
K₂S0₄	2,5
NaCI	2,3
Na_aHP0₄	1,1
Preparare cu apă distilată; sterilizare la 121 °C timp de 30 min; 1,2 g/l citidină se

filtrează sterilizată și se adaugă înaintea inoculării.

RO 112616 Bl

150 g pastă celulară congelată se dezgheață și se suspendă în 750 ml 100 mM Hepes (acid N-/2-hidroxietil/piperazin-N'-/2-etansulfonic/] tampon la pH 7,5, conținând 1 mM acid etilendoaminotetraacetic, sub formă de sare de sodiu și 1 mM ditiotreitol, ca 4 4Γ’ tampon de dislocare. Celulele se dislocă prin trecerea suspensiei printr-un omogenizator, ce funcționează la 600 kgf/cm^z. Aceasta se execută de 3 ori cu răcirea suspensiei la circa 5°C, după fiecare trecere prin omogenizator. Cmogenatul se limpezește prin centrifugare (1400 g, 60 min). Activitatea de dezaminare a citidinei se adsoarbe pe o coloană Q-Sefaroză [490 mg volum de pat) preechilibrată cu 50 mM tr/s(hidroximetil)metilamină, la pH 7,5, conținând 415 1 mM clorură de sodiu. Fracțiunile active comasate, 210 ml, se adaugă în coloana de fenilSefaroză (490 mg volum de pat) preechilibrată cu proba de tampon conținând 3,2 M sulfat de amoniu. Enzimă legată se eluează cu un gradient de concentrație descrescândă de sulfat de amoniu. Fracțiunile conținând activitatea de deaminază a citidinei se reunesc, 695 ml și enzimă parțial purificată se precipită apoi cu 80% sulfat de amoniu. După centrifugare, (1400 4 59 g, 60 min] peleta se resuspendă în 54 ml soluție superioară din cele de mai sus și se stochează la 4°C.

Din această soluție, 6,2 ml se centrifughează (18 000 g, 90 min] și peleta se dizolvă în 24 ml 0,5 tampon de fosfat de potasiu, la pH 7,5. Suspensia se dializează peste noapte fată de tampon 1M de fosfat de potasiu, la pH 7,5. 20 ml din produsul rămas se diluează apoi 4 4 4· cu un volum egal de apă distilată. La 35 ml din această soluție se adaugă 1 g de Eupergit C uscat și amestecul se lasă să stea la temperatura camerei, timp de 150-300 h (determinat prin măsurarea activității de deaminază de citidină reziduală în soluție). Enzimă imobilizată se spală cu 100 mM tris/HCI tampon, la pH 7,0, conținând 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 M NaCL și 500 ppm ester etilic de acid p-hidroxibenzoic (tampon de stocare). 2,7 g masă umedă 4*50 de enzimă imobilizată se stochează în acest tampon la 4°C, până ce este necesară pentru biotransformare.

g din produs de la exemplul 1 se dizolvă în 500 ml apă distilată, într-un flacon de

I, agitat magnetic. pH-uf se menține constant la 7,0 prin adăugare de 1 M acid acetic. 1 g masă umedă a paturilor de enzimă imobilizată se spală cu apă distilată înaintea pornirii

65 reacției. Conversia se controlează prin HPLC chiralic care arată că (+)enantiomerul din substrat se desaminează preferențial. La sfârșitul reacției, după 72 h, paturile de enzimă se separă prin filtrare și filtratul se folosește pentru izolarea (-] enantiomerului dorit.

pH-ul amestecului de reacție se aduce la 10,5 folosind soluție 1M de amoniac și soluția se aplică pe rășină Duolite A113 super, în ciclul OH, de 50 ml volume pe pat 0,4 pe 470 oră. Analogul de uridină este adsorbit pe rășină și (-)enantiomerul trecut direct. (]Enantiomerul încă pe rășină se înde-părtează prin spălare cu soluție 0,04% de amoniac (2 volume de pat, rată de curgere 0,8 volume de pat/oră).

La soluțiile folosite și la soluțiile de spălare, în volum de 600 ml, pH-ul se aduce la 7,0 cu acid sulfuric concentrat și soluția se aplică pe rășină XAD 16 (15 ml, rată de curgere 1,4 475 volume de pat pe oră). Coloana se spală cu apă distilată 2,5 volume de pat, rată de curgere volume de pat pe oră) și (-] enantiomerul se eluează cu acetonă: apă 1:3 (rată de curgere 1,5 volume de pat pe oră).

Cantitatea de (-)enantiomer conținând fracțiune (4 volume de pat] se concentrează pe un evaporator, la un volum mic, înaintea filtrării pe un filtru de sticlă nr.3. Soluția filtrată se 480 usucă prin înghețare, obținându- se 1,2 g produs din titlu, identic cu cel obținut în exemplul

4.

Compusul, conform invenției, prezintă fie ca atare activitate anti-virală și/sau este metabolizabil. In mod deosebit este eficace la inhibarea reapariției de retrovirusuri, cuprinzând retrovirusuri umane ca virusuri imunodeficitare umane (HIV), agenți cauzativi pentru SIDA.

85 Astfel, se consideră compusul A sau un derivat al său farmaceutic acceptabil pentru utilizare ca un agent terapeutic activ, mai ales ca un agent antiviral, de exemplu, în tratamentul de infecții retrovirale. In acest sens se prevede și o metodă pentru tratamentul unei infecții virale, îndeosebi a unei infecții provovate de un retrovirus ca HIV, la un mamifer incluzând omul, care cuprinde administrarea unei cantități eficace dintr-un compus A sau dintr-un derivat al său 4?o farmaceutic acceptabil. De asemenea, din compusul A sau un derivat al său farmaceutic acceptabil, se prevede prepararea unui medicament pentru tratamentul unei infecții virale.

RO 112616 Bl

Compușii, conform invenției, sunt, de asemenea, utili în tratamentul simptomelor legate de SIDA, cum ar fi complex legat de SIDA (ARC), limfa- denopatie progresivă generalizată (PGL), simptome neurologice legate de SIDA (cum ar fi demenția sau paraparezis tropicală), simptome anti-HIV anticorp pozitiv și simptome HlV-pozitive, sarcomul Kaposi, 4°=· trombocitopenia purpurea și infecții întâmplător asociate, de pildă pneumocistis carinii.

Compușii, conform invenției, sunt, de asemenea, utili în prevenirea progresiei bolilor clinice ale individului care sunt anti-HIV anticorp pozitiv sau HlV-antigen pozitiv și în profilaxia după expunere la HIV.

Compusul A sau derivații săi farmaceutic acceptabili se pot, de asemenea, folosi pentru 500 prevenirea contaminării virale a fluidelor fiziologice, ca sânge sau spermă, in vitro.

Cantitatea de compus, conform invenției, necesară pentru folosire în tratament, variază nu numai cu compusul special ales, dar, de asemenea, cu calea de administrare, cu natura simptomelor de tratat, cu vârsta și cu condiția pacientului și, la sfârșit, rămâne la aprecierea medicului sau a veterinarului respectiv. 505

In general, însă, o doză convenabilă se va găsi în intervalul de la circa 0,1 la circa 75 mg/kg greutate corporală pe zi, de preferință, în intervalul de la 0,5 la 60 mg/kg/zi și, mai ales, în intervalul de la 1 la 20 mg/kg/zi.

Doza dorită se poate prezenta în mod convenabil ca o doză unitară sau ca doze divizate, administrate la intervale corespunzătoare, de exemplu, ca 2, 3, 4 sau chiar mai 510 multe subdoze pe zi. Compusul se administrează în mod convenabil sub formă de doză unică; de exemplu, conținând 10 la 1500 mg, în mod convenabil 20 la 1000 mg și, mai ales, 50 la 7DO mg substanță activă per formă de doză unică.

In mod ideal, substanța activă ar trebui administrată pentru atingerea concentrațiilor de vârf de plasmă ale compusului activ, de la circa 1 la circa 75 μΜ, de preferință, circa 2 515 la 50 μΜ și, mai ales 3, la circa 30 μΜ. Aceasta se poate face, de pildă, prin injecție intravenoasă a unei soluții 0,1 la 5% din substanța activă, eventual în soluție salină sau prin administrare orală a unui bol conținând circa 1 la circa 100 mg substanță activă. Nivelele dorite ale sângelui se pot menține printr-o continuă infuzie pentru a da circa 0,01 la circa 5,0 mg/kg/h sau prin infuzii intermitente, conținând circa 0,4 la circa 15 mg/kg din substanța 520 activă.

In timp ce este posibil ca, pentru folosire în terapie, un compus, conform invenției, să fie administrat ca substanță chimică brută, este de preferat să se prezinte substanța activă ca o formulare farmaceutică.

O formulare farmaceutică cuprinde compusul A sau un derivat al său, farmaceutic 525 acceptabil, împreună cu unul sau mai multe materiale, farma-ceutic acceptabile și, eventual, alte substanțe terapeutice și/sau profi-lactice. Materialul de suport trebuie să fie acceptabil, în sensul ca fiind compatibil cu celelalte substanțe din formulare și să nu fie nociv pentru receptor.

Formulările farmaceutice cuprind acele formulări potrivite pentru administrare orală, 530 rectală, nazală, topicală (cuprinzând bucală și sub- linguală), vaginală sau parenterală (cuprinzând administrare intramusculară, subcutanată sau intravenoasă] sau sub o formă potrivită pentru administrare prin inhalare sau prin insuflare. Formulările pot,în cazul că sunt corecte, să fie prezentate în mod convenabil în unități de doză separate și pot fi preparate prin metode cunoscute. Toate metodele cuprind faza de aducere în asociație a compusului 535 activ cu materiale de suport lichide sau materiale de suport solide, fin divizate, sau cu ambele, și apoi, la nevoie, formarea produsului în formularea dorită.

Formulările farmaceutice corespunzătoare pentru administrarea orală se pot prezenta în mod convenabil ca unități separate, de exemplu, capsule, cașete sau tablete, conținând fiecare o cantitate predeterminată de substanță activă, sub formă de pulbere sau de granule, 540 sub forma unei soluții, a unei suspensii sau ca o emulsie. Substanța activă se poate prezenta ca un bol, ca electuarium (pudră medicinală) sau pastă. Tabletele și capsulele pentru administrare orală pot conține excipienți obișnuiți ca lianți, materiale de umplutură, lubrifianți, agenți de dezintegrare sau agenți de umectare. Tabletele pot fi glazurate în conformitate cu metode bine cunoscute în domeniu. Preparatele lichide orale pot fi sub formă, de exemplu, de 54 5 suspensii, soluții, emulsii, siropuri sau elixiruri apoase sau uleioase sau se pot prezenta ca un

RO 112616 Bl

C C ,-j	produs uscat pentru constituire cu apă sau alt material de transport potrivit, înaintea folosirii.Aceste preparate lichide pot conține aditivi obișnuiți ca agenți de suspendare, agenți de emulsionare, materiale de transport neapoase (care pot cuprinde uleiuri alimentare] sau materiale de conservare. Compușii, conform invenției de față, pot, de asemenea, fi formulați pentru administrare parenterală (de pildă, prin injecție, și anume injecție cu bol sau infuzie continuă] și se pot prezenta ca doză unică în fiole, seringi preumplute, infuzie de volum mic sau în recipiente de multidoză sau cu un agent de conservare adăugat. Compozițiile pot lua aceste
c c. c	forme ca suspensii, soluții sau emulsii în materiale de transport uleioase sau apoase și pot conține agenți de formulare ca agenți de suspendare, de stabilizare și/sau de dispersare. In mod alternativ, substanța activă poate fi sub formă de pulbere, obținută prin izolare aseptică a solidului steril sau prin liofilizare din soluție, pentru constituire cu un material de transport potrivit, de pildă, apă sterilă, fără pirogen, înaintea folosirii.
C P	Pentru administrare topică, pe epidermă, compușii, conform invenției de față, pot, de asemenea, fi formulați ca unguente, creme sau loțiuni sau ca aplicații transdermale. Unguentele și cremele, de exemplu, se pot formula cu o bază apoasă sau uleioasă, adăugând agenți potriviți de îngroșare și/sau de gelificare. Loțiunile se vor formula cu o bază apoasă sau uleioasă și vor conține, în general, de asemenea, unul sau mai mulți agenți de emulsionare,
565 570	de stabilizare, de dispersare, de suspendare, de îngroșare sau de colorare. Formulările potrivite pentru administrare topică bucală cuprind pastile cu substanță activă într-o bază aromatizată, de obicei zaharoză sau tragacant, pastilele cuprinzând substanță activă într-o bază inertă, ca gelatină și glicerină sau zaharoză și ape de gură cuprinzând substanță activă într-un material de suport lichid, potrivit. Formulările farmaceutice potrivite pentru administrare rectală, în care materialul de suport este solid, se prezintă cel mai bine sub formă de supozitoare de doză unică. Materialele de suport convenabile cuprind butir- cacao și alte materiale folosite curent în domeniu și supozitoarele se pot forma de obicei prin amestecarea compusului activ cu materialul (materialele], înmuiat sau topit, urmată de răcirea și de turnarea în tipare.
57 5	Formulările potrivite pentru administrare vaginală se pot prezenta ca supozitoare, tampoane, creme, geluri, paste, spume sau sprayuri, conți- nând ca adaos la substanța activă acele materiale de suport bine cunoscute în domeniu, ca fiind potrivite. Pentru administrare intranazală, compușii, conform invenției, se pot folosi sub formă de spray lichid sau ca o pulbere dispersabilă sau sub formă de picături.
580	Picăturile se pot formula cu o bază apoasă sau neapoasă cuprinzând, de asemenea, unul sau mai mulți agenți de dispersare, agenți de solubili-zare sau agenți de suspendare. Sprayurile lichide sunt de obicei preluate din pachete presurizate. Pentru administrare prin inhalare, compușii, conform invenției, sunt preluați dintr-un dispozitiv de insuflare,un dispozitiv de ceață sau dintr- un pachet presurizat sau din alte
585	mijloace obișnuite pentru răspândirea de aerosoli. Pachetele presurizate pot cuprinde un propulsor corespunzător, ca diclordifluormetan, triclorfluormetan, diclortetrafluoretan, bioxid de carbon sau un alt gaz potrivit. In cazul unui aerosol presurizat, unitatea de doză se poate determina prin prevederea unui ventil pentru punerea în libertate a unei cantități măsurate. In mod alternativ, pentru administrare prin inhalare sau insuflare, compușii, conform
590	invenției, pot fi sub forma unei compoziții de pulbere uscată, de exemplu, un amestec pulverulent al unui compus și unei baze de pulbere, potrivită, ca lactoză sau amidon. Compoziția pulverulentă se poate prezenta sub formă de doză unitară, de exemplu, în capsule sau în cartușe sau, de exemplu, în pachete de gelatină sau în pilule din care pulberea se poate administra cu ajutorul unui inhalator sau al unui dispo- zitiv de insuflare. La dorință, se
595	pot folosi formulările descrise mai sus, adaptate pentru a da o eliberare susținută a substanței active. Compozițiile faramaceutice, conform invenției, mai pot conține, de asemenea, și alte substanțe active, ca agenți antimicrobieni sau agenți de conservare. Compușii, conform invenției, se pot folosi, de asemenea, în combinație cu alți agenți
600	terapeutici, de pildă,alți agenți antiinfecțioși. In mod deosebit, compușii, conform invenției, se pot folosi împreună cu agenți antivirali cunoscuți.

RO 112616 Bl

Se pot obține compoziții ce cuprind compusul A sau un derivat fizio- logic acceptabil al său împreună cu un alt agent terapeutic activ, îndeosebi un agent antiviral.

Agenții terapeutici potriviți pentru folosire în astfel de compoziții cuprind nucleozide aciclice, ca aciclovir sau ganciclovir, interferon ca a-, β- sau γ-interferon, inhibitori pentru 605 excreție renală, ca probenecid, inhi- bitori de transport de nucleozidă, ca dipiridamol, 2',3'dideoxinucleozide, 2',3'-dideoxiinozină, 2',3'-dideoxitimidină, 2',3'-dideoxi-2',3'-didehidrotimidină și 2',3'-dideoxi-2',3'-didehidrocitidină, imunomodulatori ca interleucin II (IL 2] și un factor stimulator de colonie macrofagă granulocită (GM-CSF), eritropoetină, ampligen, timomodulin, timopentin, foscarnet, rivavirin și inhibitori de HIV, care se leagă de receptori de CD4, de pildă, 610 CD4 solubil, fragmente de CD4, molecule hibride de CD4, inhibitori de glicosilație ca 2-deoxi-Dglucoză, castanospermină și 1-deo-xinojirimicină.

Componentele individuale ale acestor combinații se pot administra fie succesiv, fie simultan, în formulări farmaceutice separate sau combinate.

Dacă compusul A sau un derivat al său farmaceutic acceptabil este folosit în 615 combinație cu un al doilea agent terapeutic activ față de același virus, doza din fiecare compus poate să fie identică sau să difere de aceea când compusul este folosit singur. Dozele corespunzătoare vor fi stabilite de specialiștii în domeniu.

Formulări de tablete

A. Următoarea formulare se prepară prin granularea umedă a ingredientelor cu o 62 0 soluție de providonă în apă, uscare și sitare, urmată de adăugarea de stearat de magneziu și de comprimare:

mg/tabletă (a) ingredient activ250 (b) lactoză B.P.210 (c) providonă B.P.15 (d) glicolat de amidon de sodiu2D (e) stearat de magneziu5

500

B. Formularea următoare se prepară prin comprimare directă, lactoza este de tipul de comprimare directă:

mg/tabletă ingredient activ250 lactoză145

Avicel100 stearat de maqneziu5

500

C. Formulare cu eliberare controlată.

Aceasta se prepară prin granularea umedă a ingredientelor de mai jos cu o soluție de providonă în apă, uscare și sitare, urmate de adăugarea de stearat de magneziu și de comprimare.

630

635

640 (a) ingredient activ (b) hidroxipropilmetilceluloză (methocel K4M premiu) (c) lactoză B.P.

(d) providonă B.P.

(e) stearat de magneziu

Formulare de capsule formulare de capsule se prepară umplerea într-o capsulă de gelatină tare, din ingredient activ lactoză

Avicel mg/tabletă

500

112

700 prin amestecarea ingredientelor de mai jos și două părți.

mg/tabletă

125

72,5

645

650 stearat de magneziu

2,5

250

655

RO 112616 Bl

Formulare injectabilă

Ingredient activ 0,200 g soluție de hidroxid de sodiu 0,1 M q.s. la un pH de circa 11 apă sterilă q.s. la 10 ml

Ingredientul activ se suspendă în puțină apă (care poate fi încălzită] și pH-ul se aduce la circa 11 cu o soluție de hidroxid de sodiu. Șarja se aduce apoi la volum și se filtrează printr-un filtru cu membrană de sterilizare, într-o fiolă de sticlă sterilă de 10 ml și se închide cu dop steril, acoperit cu manșon.

Formulare de supozitoare mg/supozitor

Ingredient activ 250

Grăsime tare B.P. 1770

2020 cincime din grăsimea tare se topește într-o tigaie cu manta de abur la cel mult 45 °C. Ingredientul activ este trecut printr-o sită cu 200 pm și se adaugă la baza topită, cu amestecare, folosind un agitator cu mare viteză, până ce se obține o dispersie uniformă. Menținând amestecul la 45°C, grăsimea tare rămasă se adaugă la suspensie și se agită pentru a asigura un amestec omogen. întreaga suspensie se trece printr-o sită de oțel inoxidabil de 250 pm și, cu agitare continuă, se lasă să se răcească la 40°C. La o temperatură între 38°C până la 40°C, 2,02 g din amestec se toarnă într-un tipar potrivit, de material plastic, de 2 ml. Supozitoarele se lasă să se răcească la temperatura camerei.

Activitate biologică

A. Activitate antivirală

Activitatea antivirală a compușilor din exemplul 2 se determină față de trei tulpini de HIV-1 și o tulpină de HIV-2 pe următoarele linii de celule.

Celule JM, o linie T-celulă semimatură, preluată de la un pacient cu leucemie limfoblastică, infectat cu tulpină GB8 de HIV-1.

Celule C8166, o linie de celulă T-limfoblastoidă umană infectată cu tulpină RF de HIV-1.

Celule MT-4, o line de celule de leucemie T-celulă umană, infectată cu tulpină RF de HIV-1.

Celule CEM, o linie de celulă T-limfoblastoidă umană infectată cu tulpină RF și U455 de HIV-1 sau tulpină ROD de HIV-2.

Activitățile antiviraleîn celule C8166, JM și CEM se determină prin inhibarea formației syncytium și în celule MT-4 prin inhibarea de conversie de formazan. Activitățile antivirale se determină, de asemenea, prin anali- zarea cantității de antigen de HIV p24 sintetizat în prezența și absența de enantiomeri.

Rezultatele sunt date în tabelele 1 și 2 de mai jos.

Tabelul 7 Activitate virală 50% (pg/ml)

Test Formazan Inhibarea formării de syncytium

Celule	MT-4	CEM	CEM	CEM	JM	C8166
Virus (HIV-1 ]	HIV-1 RF	HIV-2 ROD	HIV-1 RF	HIV-1 U455 HIV-1 1GB8	HIV-1 RF
(+)enantiomer	0,28	0,045	0,07	0,006	0,03	0,05
(-)enantiomer	0,20	0,055	0,04	0,008	0,05	0,01

Tabelul 2

Inhibarea sintezei de HIV p24

Inhibarea sintezei de HIV p24 50% (pg/ml]

Celule	C8166	JM	MT-4
Virus	RF	GB8	RF
(+]enantiomer	0,021	0,033	0,0008
(-)enantiomer	0,016	0,016	0,0004

RO 112616 Bl

B. Citotoxicitate

Citotoxicitățile compușilor din exemplul 2, compusul racemic (BCH- 189, exemplul 1) și un amestec 50/50 din cei doi enantiomeri se deter- mină în 5 linii de celule: H9, JM, CEM, 715 C8166 și U937.

Compușii pentru testare se diluează în serie de la 100 pg/ml la 0,3 pg/ml (concentrații finale) în plăci cu 96 orificii microtitrate. 3,6 x 10⁴ celule se inoculează în fiecare orificiu al plăcilor cuprinzând controale libere de medicament. După incubare la 37°C, timp de 5 zile, se determină numărul de celule viabile prin preluarea unei probe de suspensie de 72 0 celule și prin numărarea celulelor excluse de albastru de trypan, într- un hemocitometru.

Rezultatele sunt date în tabelul 3.

Tabelul 3

Citoxicitate

Citoxicitate 50% (pg/ml)

Compus	Celule CEM	Celule JM	Celule H9	Celule U937	Celule 8166
(+]enantiomer	1	1,5	2	4	35
(-)enantiomer	>100	30	>100	>100	>100
BCH-189	3	3,5	8	15	90
1:1 amestec	2,3	ND*	ND	ND	ND

ND* = nedeterminat

Claims

1. Derivat de 1,3-oxatiolan-nucleozidă cu formula I:

NH,

735

740

745 hoch₂ pK s—

O)

750 caracterizat prin aceea că este (-)-c/s-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1 H)pirimidin-2-onă sau un amestec de (-]-enantiomer al c/s4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan5-il)-{1 H)-pirimidin-2-onei și (+)-enantiomer al c/s-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1 H}pirimidin-2-onei, în care (+]-enantiomerul este prezent într-o cantitate de cel mult 5%, în 7 55 greutate.

2. Derivat de 1,3-oxatiolan-nucleozidă, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, (+)-enantiomerul este prezent în amestec într-o cantitate de cel mult 2%, în greutate.

3. Derivat de 1,3-oxatiolan-nucleozidă, conform revendicării 1 sau 2, caracterizat 760 prin aceea că, (+]-enantiomerul este prezent în amestec într-o cantitate de cel mult 1%, în greutate.

4. Procedeu de preparare a enantiomerului derivatului de 1,3-oxatiolan-nucleozidă cu formula I, prezentat în revendicările 1...3, caracterizat prin aceea că, un amestec care conține peste 5%, în greutate, (+]-enantiomer este supus catabolismului enantioselectiv 7 65

RO 112616 Bl mediat fie de HPLC chiral, fie mediat enzimatic, în care HPLC folosește ca fază staționară βciclodextrină acetilată sau triacetat de celuloză, iar enzimă este folosită sub formă imobilizată,enzimă fiind citidin-deaminaza sau 5'-nucleotidază.

5. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin acea că, cuprinde enantiomerul derivatului de 1,3-oxatiolan-nucleozidă cu formula I, într-o cantitate eficientă terapeutic împreună cu un material de suport, farmaceutic acceptabil.

6. Metodă de tratament al unei infecții virale la un mamifer, inclusiv omul, care cuprinde administrarea unei cantități eficace de enantiomer al derivatului de 1,3-oxatiolannucleozidă cu formula I, într-un interval de la 0,1 mg/kg corp/zi până la 750 mg/kg corp/zi, preferabil într-un interval de la 0,5 până la 60 mg/kg corp/zi și, de preferință, în intervalul de la 1 până la 20 mg/kg corp/zi.