PT97520B

PT97520B - Processo para a preparacao de analogos de nucleosidos derivados de 1,3-oxatiolano e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT97520B
Application number: PT97520A
Authority: PT
Inventors: Richard Storer; Jonathan Alan Victor Coates; Ian Martin Mutton; Charles Richard Penn; Christopher Williamson
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1991-04-30
Publication date: 1998-08-31
Also published as: US20030004175A1; CN1326743A; AU7771991A; MY109796A; CN1154500C; AU651345B2; HU9200302D0; CA2059263A1; NZ238017A; HU210803A9; EP1062950A2; PT97520A; TNSN91029A1; AP9100255A0; KR920702682A; JPH05501117A; RU2099338C1; KR960007532B1; AP182A; BG60679B1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANÃLOGQS DE NUCLEOSIDOS

DERIVADOS DE 1,3-OXATIPLANO E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

QUE OS CONTEM

A presente invenção refere-se a análogos nucleosídicos e à sua utilização em medicina. Mais especificamente a presente in venção diz respeito a análogos nucleosídicos de 1,3-oxatiolano, às suas composições farmacêuticas e à sua utilização no tratamen to de infecções virais.

Os compostos de fórmula (I) nh₂

N

An· (I)

HOCH y°j são também conhecidos como BCH-189 ou NGPB-21 e têm sido descritos como possuindo actividade antiviral principalmente sobre o ví rus da imunodificiência humana (HIV), o agente causador da SIDA (5â conferência anti--AIDS, Montereal·, Canadá 5 a 9 de Junho de 1989: Abstracts T.C.0.1 e M.C.P.63; pedido de patente de invenção euro peia publicação ηθ 0382562) . Os compostos de fórmula (I) constituem uma mistura racémica dos dois enantiómeros de fórmula (I—1) e (1-2):-2-

e foram descritos e ensaiados sob a forma de racemato. 0 único composto correntemente aprovado para o tratamento de doenças cau sadas por HIV é 3’-azido-3¹-desoxitimidina (AZT, zidovina, BW 509v). Contudo, este composto tem uma liabilidade de efeitos indesejados significativos e portanto não pode ser utilizado ou, uma vez uti. lizado, tem que ser suspenso em um número significativo de doen tes. Portanto em consequência existe uma necessidade continuada de se obterem compostos que sejam eficazes sobre HIV mas com um índice terapêutico concomitante, melhor de um modo significativo.

Descobriu-se, surpreendentemente, que os enantiómeros dos compostos de fórmula geral (I) são igualmente potentes sobre HIV, mas que um dos enantiómeros, (0(-)-enantiómero) tem citoxicidade consideravelmente menor do que o outro enantiómero. Portanto, pra porciona-se num primeiro aspecto da presente invenção o enantiõmero levógiro ou (-) do composto de fórmula geral I e os seus de rivados aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

enantiómero levógiro, tem a designação química de (-)-cis-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolano-5-il)-(IH)-pirimidin-2-ona (aqui designado posteriormente como composto (A)). Este possui a estereoquímica absoluta do composto de fórmula geral

(1-1) que tem a designação (2R, cis)(-4-amino-l(2-hidroximetil-1,3oxatiolan-5-il)-(IH)-pirimidin-2-ona.

De preferência o composto A é proporcionado de forma subjs tancialmente livre do enantiómero (+), de preferência com não mais que cerca de 2%, em particular não mais que cerca de 1% p/p.

Por derivado aceitável sob o ponto de vista farmacêutico entende-se qualquer sal, éster ou sal de um·éster do composto de fórmula geral A ou qualquer outro composto que após adminis tração ao doente seja capaz de proporcionar, (directa ou indirectamente) o composto de fórmula geral A ou um seu metabolito ou resíduo com actividade antiviral, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Considera-se que um técnico nesta matéria percebe que o composto (A) pode modificar-se para proporcionar os seus derivados aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, nos grupos fun cionais quer no radical base ou no grupo hidroximetilo do núcleo de oxatiolano. As modificações em qualquer dos grupos funcionais estão incluídas no âmbito da presente invenção. Contudo tem inte resse particular os derivados aceitáveis em farmácia obtidos por modificações do grupo 2-hidroximetílico do núcleo do oxatiolano.

Os ésteres preferidos do composto (A) incluem os compostos em que o átomo de hidrogénio do grupo 2-hidroximetílico ê subs tituido por um grupo funcional R-8- no qual R, representando um grupo não carbonílico do éster representa um átomo ou grupo esco Ihido entre hidrogénio, uma cadeia alquílica linear ou ramificada (por exemplo metil, etil, n-propil, t-butil, n-butil), alcoxi^ alquilo (por exemplo metoximetil), aralquilo (por exemplo benzilo) , ariloxialquilo (por exemplo fenoximetilo), arilo (por exemplo fenilo contendo eventualmente como substituinte um átomo de

halogéneo, um grupo alquilo ou alcoxi C^_^); éster sulfonato tal como alquilo ou aralquilossulfonilo (por exemplo metassul. fonilo); ésteres de aminoácidos (por exemplo L-valilo ou L-isoleu cilo) e ésteres mono-, di- ou tri-fosfato.

No que se refere aos ésteres citados anteriormente, a me nos que especificado de outro modo, um grupo alquilo presente con tém vantajosamente 1 a 16 átomos de carbono, em particular 1 a 4 átomos de carbono. Qualquer grupo arilo presente nestes ésteres contém, de forma vantajosa, um grupo fenilo.

Em particular, os ésteres podem ser um éster alquilo éster benzílico contendo eventualmente como substituinte pelo me nos um átomo de halogêneo (bromo, cloro, flúor ou iodo), um grupo alquilo C^_^, alcoxi C^_^, nitro ou trifluorometilo.

Os sais aceitáveis em farmácia do composto de fórmula (A) incluem os sais derivados de ácidos e bases orgânicos ou inorgânicos aceitáveis em farmácia. Exemplos de ácidos apropriados incluem o ácido clorídrico, ãcido bromidrico, ácido sulfúrico, ãcido nítrico, ãcido perclõrico, ãcido fumárico, ãcido maleico, ãcido fosfórico, ãcido glicólico, ãcido láctico, ãcido salicílico, ãcido succínico, ãcido tolueno-p-sulfónico, ãcido tartãrico, ãcido acético, ãcido cítrico, ãcido metanossulfónico, ãcido fórmico, ãcido benzóico, ãcido malõnico, ãcido naftaleno-2-sulfónico e ãcido benzenossulfónico. Outros ãcidos tais como o ãcido oxãlico, embora eles próprios não sejam aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, podem ser úteis como compostos intermédios para se obterem os compostos da presente invenção e os seus sais de adição de ãcido aceitáveis em farmácia.

Sais derivados de bases apropriadas incluem os sais de me tais alcalinos (por exemplo sódio), metais alcalino terrosos (por exemplo magnésio), sais de amónio e sais de fórmula geral NR^+ (na qual representa um grupo alquilo C^_^) .

Referências posteriores a um composto de acordo com a pre sente invenção incluem o composto (A) e os seus derivados aceita veis em farmácia.

Os compostos da presente invenção propriamente ditos e/ou compostos que são metabolizãveis com formação desses compostos possuem actividade antiviral. Em especial, estes compostos são eficazes para inibirem a replicação de retrovírus, incluindo os retrovírus humanos tais como os vírus da imunodeficiência humana (HIV), os agentes causadores da SIDA.

Deste modo proporciona-se num outro aspecto desta invenção o composto (A) ou um seu derivado aceitável em farmácia para aplicação como agente com actividade terapêutica, em particular como agente antiviral, por exemplo para o tratamento de infecções retrovirais.

Num outro aspecto alternativo proporciona-se um método pa ra o tratamento de uma infecção virai, em particular uma infecção provocada por um retrovírus tal como o HIV, em um mamífero inclu indo os seres humanos, que consiste na administração de uma quan tidade eficaz do composto (A) ou de um seu derivado aceitável em farmácia.

Também se proporciona ainda num aspecto alternativo a apli cação do composto (A) ou de um seu derivado aceitável em farmácia para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de uma infecção virai.

Os compostos da presente invenção são úteis para o trata mento de doenças relacionadas com a SIDA tal como o complexo relacionado com a SIDA (ARC), com a linfadenopatia generalizada pro gressiva (PGL), situações neurológicas relacionadas com a SIDA (como a demência ou paraparesia tropical) , situações de positiva, dade do anticorpo anti-HIV ou HIV, sarcoma de Kaposi, púrpura trombocitopenia e infecções oportunísticas associadas como por exemplo Pneumocystis carinii.

Os componentes da presente invenção são também úteis na prevenção da progressão de situações clínicas em indivíduos que são positivos ao anticorpo anti-HIV ou antigeno-HIV e para a pro filaxia após a exposição a HIV.

composto (A) ou os seus derivados aceitáveis em farmácia são também utilizados para a prevenção de contaminação virai

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de liquidos fisiológicos tais como o sangue ou o sémen, in vitro.

Um técnico nesta matéria considerará as referências aqui ao tratamento que estas são extensivas à profilaxia assim como ao tratamento de infecções ou sintomas estabelecidos.

Deve ainda considerar-se que a quantidade de um composto da presente invenção necessária para aplicação no tratamento variará não somente com o composto particular escolhido mas também com a via de administração, natureza da doença a tratar, idade e situação do doente e finalmente com o critério do médico ou do veterinário assistente. Em geral contudo uma dose apropriada situar-se-ã entre cerca de 0,1 e cerca de 750 mg/Kg de massa corpo ral por dia de preferência entre 0,5 e 60 mg/Kg/dia, com maior preferência nos limites entre 1 e 20 mg/Kg/dia.

A dose pretendida pode de forma conveniente apresentar-se em dose única ou em doses repartidas administradas com intervalos apropriados, por exemplo, distribuídas por duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia.

composto é administrado de forma conveniente sob uma forma farmacêutica, por exemplo contendo 10 a 1500 mg, mais convenientemente entre 20 a 1000 mg, com maior conveniência entre 50 e 700 mg de componente activo por unidade de forma farmacêuti.

ca.

Teoricamente, o componente activo deve administrar-se pa ra se alcançarem as concentrações plasmáticas máximas de composto activo entre cerca de 1 e 75 pM, de preferência entre cerca de 2 e 50 jiM, com maior preferência entre cerca de 3 e 30 jjM. Ies to pode ser conseguido, por exemplo, mediante injecção endovenosa de uma solução entre 0,1 a 5% de componente activo, eventualmente em solução de cloreto de sódio ou por administração oral

-Ί-

em bolus contendo entre cerca de 1 a cerca de 100 mg de componen te activo. Os níveis sanguíneos desejáveis podem ser mantidos por uma perfusão contínua para proporcionar cerca de 0,01 a cerca de 5,0 mg/Kg/hora ou por perfusões intervenientes contendo cerca de 0,4 a cerca de 15 mg/Kg de componente activo.

Embora seja possível que, para uso terapêutico, um ccmpo£ to da presente invenção se possa administrar sob a forma da subjs tância química tal qual de preferência o componente activo deve estar sob a forma de uma composição farmacêutica.

A presente invenção proporciona também composições farma cêuticas contendo o composto (A) ou um seu derivado aceitável em farmácia conjuntamente com um ou mais veículos aceitáveis em far mãcia e, eventualmente, outros componentes terapêuticos e/ou pro filãcticos. O veículo ou veículos devem ser aceitáveis, no sen tido de serem compatíveis com outros componentes da composição e não prejudicarem o recipiente.

As composições farmacêuticas incluem as composições apro priadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sub-lingual), vaginal ou administração parentérica (incluindo intramuscular, subcutânea e endovenosa) ou sob uma forma apropriada para administração inalatõria ou por insuflação. As composições podem, quando apropriado, serem apresentadas de forma conveniente como doses unitárias separadas e podem ser pre paradas por métodos convencionais. Todos os métodos incluindo a fase de associação do princípio activo com veículos líquidos sólidos finamente divididos ou ambos e então, se necessário, fõrmu lando o produto nas formas de composição pretendidas.

As composições farmacêuticas apropriadas para a administração oral podem ser convenientemente apresentadas sob a forma

de doses unitárias simples tais como cápsulas, hóstias ou compri. midos contendo cada uma, uma quantidade previamente determinada do componente activo; sob a forma de um pó ou grânulos; sob a for ma de uma solução, uma suspensão ou de uma emulsão. 0 componente activo pode também ser apresentado em bolus, sob a forma de electuá rio ou em pasta. Os comprimidos e as cápsulas para administração oral podem conter excipientes convencionais tais como agentes de ligação, cargas, agentes lubrificantes, agentes de desagregação ou agentes humidificantes. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos convencionais. As preparações orais liquidas podem estar sob a forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires e podem ser apre_ sentadas sob a forma de produto seco para reconstituição com ãgua ou com outro veiculo apropriado antes da sua utilização. Estas preparações líquidas podem conter aditivos convencionais tais co mo agentes suspensores, agentes emulsificantes, veículos não aquo sos (que podem incluir óleos comestíveis) ou agentes conservantes .

Os compostos de acordo com a presente invenção podem tam bém ser formulados para administração parentêrica (por exemplo, por injecção em bolus ou por perfusão contínua) e podem apresentar-se sob a forma de dose unitária em ampolas, seringas previamente cheias, perfusão de pequeno volume ou em contentores multi -dose com a adição de um agente conservante. As composições podem apresentar-se sob a forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de composição tais como agentes suspensores, agentes estalificantes e/ou agentes dispersantes. Alternativamente, o componente activo pode estar sob a forma de um pó, obtido por isolamento asséptico de um sólido estéril ou por liofilização a partir de uma solução, para reconstituição com um veículo apropriado, por exemplo, água esté ril isenta de pirogénios, antes da sua utilização.

Para administração tópica na epiderme, os compostos de acordo com a presente invenção, podem apresentar-se sob a forma de pomadas, cremes ou loções ou de pensos transdérmicos. As poma das e os cremes, podem, por exemplo, apresentar-se conjuntamente com uma base aquosa oleosa com a adição de agentes espessantes e/ou de gelificação apropriadas.As loções podem ser compostas com uma base aquosa ou oleosa e, em geral, conterão também um ou mais agentes emulsificantes, agentes estabilizantes, agentes dispersan tes, agentes suspensores, agentes espessantes ou agentes de colo ração.

As composições apropriadas para administração tópica na boca incluem as pastilhas que contêm o componente activo numa ba se apaladada, usualmente com sacarose e acácia ou tragacante; as pastilhas contêm o componente activo numa base inerte tal como a gelatina e a glicerina ou a sacarose e a acácia; as soluções para lavagem bucal contêm o princípio activo num veículo líquido apropriado.

As composições farmacêuticas apropriadas para administra ção rectal, em que o veículo é um sólido, apresentam-se ccm maior preferência sob a forma unitária de supositórios. Veículos apropriados incluem a manteiga de cacau e outros materiais correntemente utilizados e os supositórios podem ser preparados, conven_i entemente, por mistura do composto activo com veículos brandos ou em fusão, seguido de arrefecimento e moldagem em moldes apropria dos.

As composições apropriadas para administração vaginal po

-10χ· dem apresentar-se como pessários, tampões, cremes, geles, pastas, espumas ou sprays contendo além do componente activo, veículos convencionais considerados apropriados.

Para administração intra-nasal, os compostos da presente invenção podem ser utilizados sob a forma de um spray líquido ou de um pó dispersível ou sob a forma de gotas.

As gotas podem ser preparadas com uma base aquosa ou não aquosa contendo também um ou mais agentes dispersantes, agentes solubilizantes ou agentes suspensores. Os sprays líquidos são li. bertados convenientemente através de embalagens pressurizadas.

Para administração por inalação, os compostos da presente invenção, são libertados convenientemente através de um insuflador, nebulizador ou de uma embalagem pressurizada ou outro meio conveniente para a libertação de um spray sob a forma de aerosol. As embalagens pressurizadas podem conter um agente propelante apropriado tal como o diclorodifluorometano, triclorofluo rometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerosol pressurizado a dose unitária pode ser determinada através de uma válvula, para se libertar uma quantidade controlada.

Alternativamente, para administração por inalação ou insuflação, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser administrados sob a forma de uma composição em pó seco, por exem pio uma mistura em pó do composto com uma base em pó apropriada tal como a lactose ou o amido. As composições em pó podem apresen tar sob formas unitárias posológicas em, por exemplo, cápsulas ou cartuchos ou, por exemplo, embalagens de galatina ou blister a partir das quais o pó se pode administrar com o auxilio de um ina lador ou de um insuflador.

-11Quando apropriado as composições descritas anteriormente adaptam-se para libertação prolongada do componente activo.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente in venção podem também conter outros componentes activos tais como agentes antimicrobianos ou agentes conservantes.

Os compostos da presente invenção podem ainda utilizar-se em associação com outros agentes terapêuticos como por exemplo, outros agentes anti-infecciosos. Em particular, os compostos da presente invenção podem aplicar-se conjuntamente com outros agen tes antivirais.

Deste modo a presente invenção proporciona, em um outro aspecto, uma associação que consiste num composto (A) ou num seu derivado aceitável sob o ponto de vista fisiológico conjuntamente com outro agente com actividade terapêutica, em particular com um agente antiviral.

As associações referidas anteriormente podem, de forma conveniente, ser apresentadas para utilização sob a forma de com posições farmacêuticas e, assim, estas composições farmacêuticas contêm uma associação, como definido anteriormente, com um veícu lo aceitável em farmácia, constituindo portanto um outro aspecto da presente invenção.

Agentes terapêuticos apropriados para utilizar nestas com posições incluem os nucleosidos acíclicos tais como aciclovir ou ganciclovir, interferons tais como ¢(, ou Y-interferon, inibidor de excreção renal tal como o probenecide, inibidor do transporte dos nucleosidos tais como o dipiridamol, 2¹,3’-didesoxinucleosidos tal comoAZT, 2',3’-didesoxicitidina, 2’,3'-didesoxitimidina, 2' , 3 ¹ -didesoxi-2¹ ,3 ' -didesidrotomidina e 2 ’ , 3 ¹ -didesoxi-2¹ ,3 ¹ -di. desidrocitidina, imunomoduladores tais como a interleucina II

(IL2) e factor de estimulação de colónias de macrõfagos granulocíticos (GM-CSF), eritropoetina, ampligeno, timomodulina, timopen tina, foscarnet, ribavirina e inibidores da ligação HIV com os re ceptores CD4, por exemplo CD4 solúvel, fragmentos de CD4, molécu las híbridas de CD4, inibidores de glicosilação tais como a 2-de soxi-D-glucose, castanospermina e 1-desoxinojirimicina.

Os componentes individuais destas associações podem ser administrados sequencial ou simultaneamente em separado ou associados sob a forma de composições farmacêuticas.

Quando um composto (A) ou um seu derivado aceitável em farmácia é utilizado em associação comum segundo agente com acti vidade terapêutica sobre o mesmo vírus a dose de cada composto po de ser igual ou diferir da que se aplica quando o composto é uti. lizado isoladamente. Doses apropriadas serão facilmente determinadas pelos técnicos nesta matéria.

composto (A) e os seus derivados aceitáveis em farmácia podem preparar-se por métodos convencionais destinados ã prepara ção de compostos de estrutura análoga, por exemplo, como descrito no pedido de patente de invenção europeia publicado nQ 0382562.

Os técnicos desta matéria entenderão que para certos métodos escritos posteriormente a esterroquímica do composto A poB de ser obtida quer iniciando-se com um material inicial a_L opticamente puro ou resolvendo-se a mistura racémica em qualquer dos estádios convenientes da sintese. No caso de todos os processos o produto pretendido optieamente puro pode-se obter por resolução do produto final de cada reacção.

Em um destes processos (A) faz-se reagir um 1,3-oxatiola no de fórmula geral (VIII)

R-jO

(VIII) na qual o grupo anomêrico representado por L é um grupo removível, com uma base apropriada. Grupos apropriados representados por L incluem os de fórmula geral -OR na qual R representa um gru po alquilo, por exemplo um grupo alquilo C-[__₆ tal como metilo ou R representa um grupo acilo, por exemplo, um grupo acilo ^c^_q tal como acetilo ou halogêneo, por exemplo iodo, bromo ou cloro.

Os compostos de fórmula geral VIII fazem-se reagir de fo_r ma conveniente com a citosina ou com um precursor básico de piri midina apropriado (previamente sililado com um agente de sililação tal como hexametildi-silazano) num dissolvente compatível tal como o cloreto de metileno utílizando-se um ácido de Lewis, tal como o tetracloreto titânio, compostos de estanho (VI) tal como SnCL^ ou trimetilsililtriflato.

Os 1,3-oxatiolanos de fórmula geral (VIII) podem preparar-se, por exemplo, mediante reacção de um aldeído de fórmula geral (VII) com um mercaptoacetal de fórmula geral (VI), em um dissolvente orgânico compatível, tal como tolueno na presença de um catalisador ãcido, por exemplo, um ãcido Lewis tal como o cio reto de zinco.

hsch₂ch(oc₂h₅)₂ (VI) c₆h₅co₂ch₂cho (VII)

Os mercaptoacetais de fórmula geral (VI) podem preparar-se por métodos conhecidos, por exemplo, como descritos por G. Hesse e I. Jorder, Chem. Ber 85, 924-932 (1952) .

-14Os aldeídos de fórmula geral (VII) podem preparar-se por métodos convencionais, por exemplo como descrito por E. G. Hallo quist e H. Hibbert, Can. J. Research, 8^, 129-136 (1933) . Conveni entemente o aldeído não purificado de fórmula geral (VII) pode purificar-se por conversão em um composto de adição com um bissul fito cristalino e subsequente reconversão no aldeído livre.

Num segundo processo (Β) o composto (A) obtém-se por interconversão básica de um composto de fórmula geral (IX)

(IX) na qual (B) representa uma base convertível em citosina. Esta in terconversão pode efectuar-se ou por transformação química simples, (por exemplo conversão da base de uracil em citosina) ou por uma conversão enzimática utilizando-se uma desoxi-ribosil transferase. Estes métodos e condições para a interconversão básica são conhecidos e descritos na química dos nucleosidos.

Num terceiro processo (C) um composto de fórmula geral (XI)

R.j-0 nh₂ (xi) pode converter-se num composto (A) por conversão do grupo anomérico NH2 na base citosímica por métodos convencionais da química dos nucleosidos.

-15Muitas das reacções descritas anteriormente têm sido mui to bem descritas no contexto da síntese de nucleosidos, por exemplo, em Nucleosido Analogs-Chemistry Biology e Medicai Applications R. T. Walker et al., eds. Plenum Press, New York pgs 165-192 (1979); T. Veda in Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Vol I, LB Townsend ed., Plenum Press, New York pgs 165-192, (1988) cujas descrições são aqui incluidas como referência.

Deve considerar-se que as reacções citadas anteriormente podem requerer a aplicação, ou de forma conveniente podem ser apli cadas a compostos iniciais contendo grupos funcionais protegidos e ser necessária portanto a desprotecção como uma fase intermédia ou final para se obter o composto desejado. A protecção e despro tecção dos grupos funcionais pode efectuar-se por meios convencio nais. Assim, por exemplo, os grupos aminos podem ser protegidos por um grupo escolhido entre aralquilo (por exemplo benzilo), aci_ lo, arilo (por exemplo 2,4-dinitrofenil) ou sililo; remoção sub sequente do grupo de protecção que se efectua quando desejado, por meio de hidrólise ou de hidrogenolise como apropriado, utili zando-se condições convencionais. Grupos hidróxidos podem ser pro tegidos por quaisquer grupos convencionais de protecção hidroxilo por exemplo, como descrito em Protective Groups in Organic Chemistry, Ed. J. F. W. McOmie (Plenum Press, 1973) or Protective Groups in Organic Synthesis by Theodora W. Greene (John Wiley and Sons, 1981) . Exemplos de grupos de protecção hidroxilo apropriados incluem os grupos escolhidos entre alquilo (por exem pio metilo, t-butilo ou metoximetilo) aralquilo (por exemplo ben zilo, difenilmetilo ou trifenilmetilo), grupos heterocíclicos tais como tetra-hidropiranil, acilo (por exemplo acetil ou benzoilo) e grupos sililo tal como trialquilsililo (por exemplo t-butildi-

metilsililo). Os grupos protectores do grupo hidroxilo podem ser removidos por técnicas convencionais. Assim, por exemplo, os gru pos alquilo, sililo, acilo e heterocíclicos podem ser removidos por solvólise, por exemplo mediante a hidrólise em meio ãcido ou básico. Os grupos aralquilo tais como trifenilmetilo, podem, de modo idêntico, ser removidos por solvólise, por exemplo por hidro lise sob condições ácidas. Os grupos aralquilo tais como benzilo, podem ser separados por exemplo mediante tratamento com trifluoreto de boro/eterato e anidrido acético seguido de remoção dos grupos acetato formados deste modo num estádio apropriado da sín tese. Os grupos sililo também podem ser convenientemente removidos utilizando-se uma fonte de iões flúor, tal como o fluoreto de tetra-n-butilamõnio.

Nos processos citados anteriormente, o composto (A) é obtido geralmente sob a forma de uma mistura dos isómeros cis e trans em que o isômero cis constitui o composto com interesse.

Estes isómeros podem separar-se por meios físicos, por exemplo cromatografia sobre gel de sílica ou por cristalização fraccionada, directamente ou sob a forma de seus derivados apropriados, por exemplo acetatos (preparado por exemplo com anidrido acético) seguido, após a separação, por conversão no produto principal (por exemplo, por desacetilação com amónia metanõlica).

Os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico dos compostos da presente invenção podem preparar-se como descrito na patente de invenção norte americana nQ 4.383.114, que aqui se ci ta como referência. Assim, por exemplo, quando se pretende prepa rar um sal de adição de ácido do composto (A) o produto obtido por qualquer dos processos citados anteriormente pode converter-se em um sal por tratamento da base líquida resultante, com um

s ácido apropriado, aplicando-se métodos convencionais. Os sais de adição de ácido aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico podem preparar-se mediante reacção da base livre com um ácido apro priado eventualmente na presença de um dissolvente apropriado tal como um éster (por exemplo acetato de etilo) ou um álcool (por exemplo metanol, etanol ou isopropanol). Os sais de base inorgânicos podem ser preparados mediante reacção do composto principal com uma base apropriada tal como um alcoxido (por exemplo metoxi do de sódio) eventualmente na presença de um dissolvente tal como um álcool (por exemplo metanol). Os sais aceitáveis sob o pon to de vista farmacêutico, podem ainda preparar-se a partir de ou tros sais, incluindo sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, do composto (A) utilizando-se métodos convencionais.

composto (A) pode converter-se num fosfato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou em outro éster mediante reac ção com um agente de fosforilaçao, tal como tricloreto fosforoso ou mediante um agente de esterificação apropriado, tal como um halogeneto ou um anidrido de ácido, como adequado. Um éster ou um sal de um composto (A) pode converter-se no composto principal, por exemplo por hidrólise.

A resolução do produto final, ou de um seu material inter médio ou inicial pode efectuar-se por métodos convencionais: ver por exemplo, Stereochemistry of Carbon Compounds por E. L. Eliel (McGraw Hill, 1962) and Tables of Resolving Agents by S. H.

Wilen.

Assim, por exemplo o composto (A) pode obter-se por HPLC quiral utilizando-se uma fase estacionária apropriada, por exemplo, j^-ciclodextrina acetilada ou triacetato de celulose e um dis solvente apropriado, por exemplo, um álcool tal como etanol ou

-18/

uma solução aquosa, por exemplo, trietil acetato de amónio. Alternativamente, os compostos podem ser preparados por catabolismo enantiosselectivo mediado por uma enzima com uma enzima apropriada tal como a citidina desaminase ou por degradação enzimáti. ca selectiva de um derivado apropriado utilizando-se uma 5’-núcleo tidase. Quando a separação se efectua por via enzimãtica a enzima pode ser utilizada em solução ou, mais convenientemente, sob a forma imobilizada. As enzimas podem ser imobilizadas por qualquer método convencional, por exemplo, por absorção sobre uma re sina tal como a Eupergit C.

A presente invenção será melhor descrita através dos exem pios seguintes que não se destinam a limitá-la em qualquer senti do. Todas as temperaturas são referidas em graus Celcius. Intermediário 1

Benzoato de 5-metoxi-l,3-oxatiolano-2-metanol

Adicionou-se uma solução de 1,6 g de cloreto de zinco em 15 ml de metanol quente a uma solução homogénea de mercaptoacetal. deido, dimetil acetal (34,2 g) e benzoíloxi acetaldeído (48,3 g) em 1300 ml de tolueno que em seguida se submeteu a aquecimento sob refluxo e atmosfera de azoto durante 50 minutos. A mistura arrefecida concentrou-se, diluíu-se com algum tolueno e em segujL da filtrou-se através de Kiesulguhr. Os filtrados reunidos e o tolueno foram lavados com solução aquosa saturada de carbonato de hidrogénio e sódio (X2) e solução saturada de cloreto de sódio, secaram-se com sulfato de magnésio e em seguida evaporaram-se até à obtenção de um óleo que se submeteu a uma cromatografia em coluna de gel de sílica (2 Kg, Merck 9385) e se eluiu com clorofór mio para se obter o composto em título (45,1 g), sob a forma de um óleo, constituindo uma mistura de anómeros (cerca de 1:1); ÍH

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X

RMN. (DMSO-dg) 3.1-3.3(4H), 3.42(6H), 4.4-4.6 (4H) , 5.41(1H), 5.46 (IH), 5.54 (IH), 5.63 (IH), 7.46 (4H), 7.58 (2H), 8.07 (4H) :ymax (CHBr₃)1717.6cm^-1.

Intermediário 2 (i)-cis-l-(2-benzoiloximetil-l,3-oxatiolan-5-il·)-(IH)-pirimidin-2-4-diona

Uma mistura de 9,62 g de uracilo timamente dividido, 50 ml de hexametil di-silazano e 30 mg de sulfato de amónio, foi aque eido sob refluxo sob atmosfera de azoto até â obtenção de uma solução transparente. Arrefeceu-se esta e em seguida evaporou-se para se obter um óleo incolor que se dissolveu, sob atmosfera de azoto em 100 ml de acetonitrilo. Adicionou-se a solução a uma so lução homogénea arrefecida sobre gelo de 19,43 g de benzoato de 5-metoxi-l,3-oxatiolano-2-metanol (intermediário 1) em 600 ml de acetonitrilo e 14,7 ml de silil trifluorometanossulfonato de trd. metilo. Retirou-se o banho de gelo e submeteu-se a solução a aque cimento sob refluxo e atmosfera de azoto durante 45 minutos. Apõs arrefecimento e evaporação, purificou-se o residuo por cromatografia em coluna sobre 1 Kg de gel de sílica (Merck 9385) e eluiu-se com clorofõrmio/metanol a 9:1. Arrefeceram-se as fracções e evaporaram-se para se obter um resíduo não purificado. Este submeteu-se a cristalização fraccionada a partir de um minimo de me tanol quente (cerca de 1200 ml) para se obterem 6,32 g do compos^ to em título sob a forma de cristais brancos. IH RMN (d DMSO) & 11.36 (lH,bs). 7.50-8.00 (6H,m), 6.20 (lH,t), 5.46 (2H,m), 4.62 (2H,m), 3.48 (lH,m), 3.25 (lH,m).

Intermediário 3 (-)-(cis)-4-amino-l-(2-benzoiloximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona

Método (a)

Uma suspensão de 20,705 g de citosina e de alguns mgs de sulfato de amónio em 110 ml de hexametil di-silazano foi agitada e aquecida sob refluxo durante 2h e 30m, sob atmosfera de azoto. Ela. minou-se o dissolvente por evaporação e dissolveu-se o resíduo sólido em 350 ml de acetonitrilo anidro. Esta solução foi transferida utilizando-se técnicas de agulha flexível para uma solução homogénea, arrefecida com gelo de 43,57 g de benzoato de 5-metoxi-1,3-oxatiolano-2-metanol (intermediário 1) em 650 ml de aceto nitrilo sob atmosfera de azoto. Adicionaram-se 33 ml de trifluorometanossulfonato de trimetilsililo, e a solução permaneceu a retomar a temperatura ambiente durante ÍH e 30m, em seguida aque ceu-se sob refluxo durante a noite. A mistura do resíduo foi con centrada, diluída com solução aquosa saturada de carbonato de hi. drogénio e sódio (500 ml) e em seguida extraída com (3 x 500 ml) de acetato de etilo. Os extractos reunidos lavaram-se com (2 x 250 ml) de água e 250 ml de solução saturada de cloreto de sódio, secaram-se com sulfato de magnésio e em seguida evaporaram-se até à obtenção de uma espuma que foi submetida a cromatografia em co luna de 600 g de gel de sílica (Merck 7734), que se eluiu com mis turas de acetato de etilo/metanol para se obter uma mistura de anómeros (cerca de 1:1) na quantidade de 31,59 g. Cristalizou-se a mistura com 45 ml de água e 9,0 ml de etanol para se obterem 10,23 g de um sólido que se recristalizou com 120 ml de etanol e ml de água para se obter o produto em título sob a forma de ' 1% um solido branco na quantidade de 9,26 g; max (MeOH) 229.4mm (E :ι/

610);

lcm

272.4 mm (E^1% 293); ¹H RMN (DMSO d6) & 3.14 (ÍH), 3.50 (ÍH), lcm

4.07 (2H), 5.52 (ÍH), 5.66 (ÍH), 6.28 (ÍH), 7.22 (2H) , 7.56 (2H), 8.10 (2H).

Método (b)

7,0 ml de oxicloreto de fósforo foram adicionados gota a gota a uma suspensão homogénea arrefecida em gelo de 11,65 g de

1.2.4- triazol em 120 ml de acetonitrilo que em seguida se manteve numa temperatura interna inferior a 15°C e se adicionou com 22,7 ml de trietilamina, gota a gota. Após 10 minutos, adicionou-se uma solução de 6,27 g de (±)-(cis)-1-(2-benzoíloximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2,4-diona (intermediário 2) em 330 ml de acetonitrilo, lentamente. Manteve-se a agitação em seguida du rante a noite ã temperatura ambiente. Arrefeceu-se a mistura em um banho de gelo e adicionaram-se lentamente 30 ml de trietilami na, seguidos de 2,1 ml de ãgua. Evaporou-se a solução resultante e distribuiu-se o resíduo entre 400 ml de solução saturada de car bonato de hidrogénio e sódio e (3 x 200 ml) de clorofórmio. Os ex tractos clorofórmicos reunidos foram secos e em sulfato de magné sio que se filtrou evaporando-se a solução para se obterem 9,7 g de um resíduo não purificado. Dissolveu-se o resíduo em 240 ml de

1.4- dioxano e adicionaram-se 50 ml (s. g. 0,880) de solução de amónia concentrada. Após lh e 30m evaporou-se a solução e disso), veu-se o resíduo em metanol. Provocou-se assim a precipitação de um sólido que se retirou por filtração. Purificaram-se os líquidos mãe por coluna cromatográfica sobre gel de sílica, 600 g (Merck 9385). Reúniram-se as fracções apropriadas e evaporaram-se para se obterem 2,18 g do composto em título sob a forma de um sólido castanho claro, idêntico ao que se obteve aplicando-se

o método (a).

Exemplo 1 (±)-(cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-piri midin-2-ona

Uma suspensão de 8,19 g de (cis)-4-amino-l-(2-benziloximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1H)-pirimidin-2-ona (intermediário 3) e 8,24 g de resina Amberlite IRA-400 (OH) em 250 ml de etanol foi submetida a agitação e aquecimento sob refluxo durante lh e 15m. Retiraram-se os produtos sólidos por filtração e lavaram-se com metanol. Evaporaram-se os filtrados reunidos e triturou-se o resíduo com 80 ml de acetato de etilo. Recolheu-se o sólido branco resultante por filtração para se obterem 5,09 g do produto em tí tulo; ÍH RMN (DMSO-d6) 3.04 (ÍH) , 3.40 (ÍH) , 3.73 (2H) , 5.18 (ÍH), 5.29 (ÍH), 5.73 (ÍH), 6.21 (ÍH), 7.19 (2H), 7.81 (ÍH).

Exemplo 2

Separação por HPLC quirinal dos enantiómeros (i)-(cis)-4-amino-1-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona (A) Submeteram-se 25 mg do produto racémico do exemplo 1 a uma HPLC preparativa sob as condições seguintes:

Coluna: triacetato celulose Merck Hibar, 250 x 10 mm, 10 p;

Eluente: etanol;

Débito: 3 ml/minuto;

Detecçâo: UV, 270 nm;

Temperatura: ambiente.

As fracções apropriadas reunidas forneceram por evaporação 6,8 mg (cerca de 100%) de (2R, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil_ -1,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona e 3,6 mg (cerca de 90%) de (25, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-

-pirimidin-2-ona.

B. Submeteram-se 26 mg do produto racémico do exemplo 1 a uma HPLC preparativa sob as condições seguintes:

Coluna: I acetil ASTEC de ligação cíclica 250 x 4,6 mm;

Eluente: acetato de trietilamõnio a 0,2%(preparado por adição de ácido acético glacial a solução aquo sa de trietilamina a 0,2% com um pH final de 7,2) y

Débito: 2 ml/minuto;

Detecção: UV, 300 nm;

Temperatura: ambiente.

A evaporação das fracções apropriadas fornecem 25 mg do composto não purificado (2R, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il) - (ÍH)-pirimidin-2-ona e 17 mg de ( 25, cis)-4-amino-1-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona, também não purificado. Estas fracções foram submetidas separadamente a outra HPLC preparativa que se desenvolveu sob as condi ções seguintes:

Coluna: I acetil ASTEC, de ligação cíclica 250 x 4,6 mm;

Eluente: acetato de amónio 15 mM, pH 6,8;

Débito: 0,5 ml/minuto;

Detecção: UV, 300 nm;

Temperatura: 5°C.

A evaporação das fracções conjuntas apropriadas forneceu

5,0 mg (cerca de 91%) de (2R, cis) -4-amino-l- (2-hidroximetil-l,3_

-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona e 7,6 mg (cerca de 96%) de (25, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona.

Exemplo 3 (-)-cis-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(IH)-pirimidin-2-ona (i) sal de amónio de di-hidrogenofosfato de (i)-cis-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(IH)-pirimidinona

Uma suspensão homogenea arrefecida a temperatura de 0 C, de 1,00 g de (±)-cis-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(IH)-pirimidin-2-ona (exemplo 1) em 20 ml de trimetilfosfato anidro foi submetida a tratamento com 2,44 ml de oxicloreto de fósforo e a mistura agitada a essa temperatura durante 35 minutos e depois diluída com 60 g de água arrefecida com gelo. A mistura arrefecida foi ajustada para pH de 2,5 mediante adição de solução aquosa de hidróxido de sódio N, e em seguida aplicada a uma colu na de carvão (10 g, DARCO), que se eluiu com ãgua e em seguida com etanol-amónia aquosa. As fracções contendo o monofosfato não purificado foram reunidas e concentradas. A solução resultante aplicou-se a uma coluna contendo 25 g de DEAE Sephadex A-25 (for ma HCO^-). Realizou-se a eluição com um gradiente de 120 ml de ãgua para 240 ml de carbonato de hidrogénio eamónia 0,1 M em seguida com 0,2, 0,3 e carbonato de hidrogénio e amónia 4 M, (120, 240, 400 ml, respectivamente). Reuniram-se as fracções apropriadas e concentraram-se. Diluiu-se a solução residual com 40 ml de ãgua e liofilizou-se para se obter o composto em título sob a for ma de um sólido branco na quantidade de 1,37 g;)tmax (pH6 tampão de 271.Onm (E¹%₁cml90); ¹H RMN (D20)Í3.23 (IH) , 3.55 (IH), 4.0-4.2(2H), 5.43(1H), 6.07 (IH), 6.33(lH), 8.08 (IH).

(ii) (2R, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona e (25, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona

Adicionaram-se 60 mg de 5' nucleotidase proveniente de crotalus atrox venom (EC 3.1.3.5) a 17 unidades/mg a uma solução de 1,35 g do sal de amónio de 6¹ de di-hidrogenofosfato de (±)-cis-4-amino-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona, em 30 ml de tampão preparado com 526 mg de glicina e 190 mg de cloreto de magnésio em 100 ml de água e em seguida incubou

-se a mistura ã temperatura de 37°C durante 2,5 horas. Adicionaram-se mais 20 mg de enzima e continuou-se a incubação por mais

3,5 horas. Aplicou-se a mistura resultante a uma coluna de DEAE

Sephadex A-25 na forma HCO^-. Realizou-se a eluição com 160 ml de água e em seguida com 0,1, 0,2, 0,3 e NH^HCO^ 0,4 M (200 ml de cada). As fracções apropriadas que continham o primeiro componen te que eluiu, reuniram-se e evaporaram-se e submeteu-se o residuo a uma cromatografia em coluna de gel de sílica, (60 g MercK 7734), que seeluiu com misturas de clorofórmio-metanol. A evaporação das fracções apropriadas provenientes do metanol-acetato de etilo for neceram 0,30 g de (2R, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatio lan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona sob a forma de um sólido branco; 21 (0.30 g)-&]^D +1370 (c.1.04 MeOH) ; ¹H RMN (DMSO) £ 3-04 (ÍH) ,

3.40 (ÍH), 3.73 (2M), 5.18 (ÍH), 5.29 (ÍH), 5.73 (ÍH), 6.21 (ÍH), 7.19 (2H), 7.81 (ÍH).

As fracções apropriadas provenientes da coluna de Sephadex que continha o segundo componente que eluiu forma reunidas e evaporadas. O residuo dissolveu-se em 30 ml de água e tratou-se com fosfatase alcalina (proveniente de Escherichia coli [EC 3.1.3.1], na qualidade de 1,5 ml a 416 unidades/ml, incubando-

-se em seguida à temperatura de 37°C durante uma hora. Removeu-se o dissolvente por evaporação e submeteu-se o residuo a uma cromatografia em coluna sobre 60 g de sílica (Merck 7734) eeluiu

-se com mistura de clorofórmio-metanol. A evaporação das fracções apropriadas provenientes de metanol-acetato de etilo forneceram (25, cis)-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pi21 rimidin-2-ona sob a forma de um sólido branco (0,32 g) ; C«3^D -1320(c.1.08, MeOH); ¹H RMN (DMSO) 6 3.04 (ÍH), 3.40 (ÍH), 3.73 (2H), 5.18 (ÍH), 5.29 (ÍH), 5.73 (ÍH), 6.21 (ÍH), 7.19 (2H), 7.81 (ÍH) .

Exemplo 4 (-)-cis-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(ÍH)-pirimidin-2-ona (i) Inocularam-se três frascos de 50 ml com caldo nutriente (Oxoid Ltd) com uma ansa em cada de Escherichia coli (ATCC 23848) retirada de uma placa de nutriente de Agar. Incubaram-se os frascos durante a noite ã temperatura de 37°C com agitação de 250 revolu ções/minuto e em seguida utilizou-se cada um para inocular 4 1 de meio CDD (ácido glutâmico, 3 g/1; sulfato de magnésio 0,2 g/1;

sulfato de potássio 2,5 g/1; cloreto de sódio 2,3 g/1; fosfato de hidrogénio e sódio 2^0 1,1 g/1; di-hidrogenofosfato de sódio, 2H2O 0,6 g/1; citidina, 1,2 g/1) num fermentador de sete litros. As culturas fermentadoras com 750 revoluções/minuto à temperatura de 37°C e arejamento a 4 1/minuto. Após o desenvolvimento das 24 horas recolheram-se as células por centrifugação (5000 g, 30 minutos) para se obterem 72 g em peso húmido. O aglomerado de cê lulas ressuspendeu-se em 300 ml de tampão Tris HCl 20 mM de pH

7,5 e desagregaram-se estas por sonicação (4 x 45 segundos). Re tiraram-se os fragmentos celulares por centrifugação (30.000 g,

* minutos) e precipitou-se o sobrenadante de proteína mediante a adição de sulfato de amónio com uma saturação até 75%. Recolheu -se o precipitado por centrifugação (30.000 g, 30 minutos) e re_s suspendeu-se o aglomerado em 25 ml de tampão HEPES (100 mM, pH 7,0) contendo sulfato de amónio (saturação 75%). Preparou-se aso lução de enzima por centrifugação a 12.000 rpm durante 30 minutos, regeitou-se o sobrenadante e dissolveu-se o aglomerado em tampão Tris HC1 (pH 7,0, 100 mM) para o volume original.

(ii) Dissolveram-se em 100 ml de ãgua 115 mg do produto do exem pio 1 e agitou-se. Adicionaram-se 0,5 ml da solução de enzima e manteve-se a mistura a pH constante por adição contínua de ãcido clorídrico 25 mM. Controlou-se a conversão por HPLC quiral, que mostrou que o enantiómero (+) do substrato foi desaminado preferencialmente. Após 22 horas o enantiómero (+) do substrato (RT,

12,5 minutos) tinha sido completamente removido e a solução foi ajustada para pH 10,5 mediante a adição de hidróxido de sódio con centrado.

A solução obtida anteriormente eluiu-se por meio de uma coluna QAE Sephadex (A 25, Pharmacia, 30 x 1,6 cm) previamente equilibrada para pH 11. Lavou-se a coluna com 200 ml de ãgua e em seguida com ãcido clorídrico 0,1 M. Recolheram-se fracções de 40 ml e analisaram-se por HPLC de fase inversa. As fracções entre 5-13 que continham o enantiómero (-) do substrato por reagir, fo ram reunidas e corrigido o seu pH com ãcido clorídrico para 7,5. A fracção 47, que continha o produto desaminado, foi ajustada pa ra pH 7,5 com hidróxido de sódio diluído. A anãlise por HPLC qui ral mostrou que este material era uma mistura constituída por um enantiómero (RT, 10,2 minutos) como componente principal com o outro enantiómero (RT, 8,5 minutos) como componente menor (cerca

-28-/

de 90%) .

(iii) O estádio anterior (ii) foi repetido para uma maior escala. Incubaram-se 363 mg do composto do exemplo 1 em 250 ml de ãgua com 2,5 ml de soluções de enzima preparada como descrito na alínea (i) . Adicionaram-se mais aliquotas (0,5 ml) após as 18 e as 47 horas. A mistura reaccional foi agitada durante 70 horas e em seguida permaneceu em repouso (RT = ?) durante mais 64 horas. A análise por HPLC quiral indicou que o enantiómero (+) do substrato tinha sido completamente desaminado e a solução resultante foi ajustada para um pH de 10,5 com hidróxido de sódio.

Introduziu-se a solução anterior na mesma coluna que QAE e eluiu-se como descrito na alínea (i). Juntaram-se as fracções de 2-6 contendo uma mistura de substrato residual e o produto de saminado. As fracções 7 a 13 que continham o substrato residual (enantiómero (-)), foram reunidas e corrigidas para um pH 7,5. As fracções de 25 e 26 contendo o produto desaminado foram reunidas e neutralizadas.

Re-eluiram-se as fracções anteriores 2 a 6 na mesma colu na QAE. As fracções 3 a 11 provenientes desta segunda coluna con tinham substratos sem reagir (enantiómero (-)). A fracção 70 con tinha o produto desaminado.

(iv) As fracções de substrato separadas provenientes das alíneas (ii) e (iii) foram reunidas e corrigido o seu pH para 7,5. Eluiu -se esta solução por meio de uma coluna XAD-16 (40 x 2,4 cm), com pactada com ãgua. Lavou-se a coluna com ãgua e em seguida eluiu-se com acetona: ãgua (l:4-v/v); As fracções que continham enantiómero (-) de BCH189 foram reunidas e liofilizadas para se obte rem 190 mg de um pó branco.

Os métodos HPLC utilizados anteriormente foram os seguin

tes:

1. HPLC analítica de fase inversa

Coluna: cartucho principal spherisorb ODS-2 (5 ^iM) 150 x 4,6 mm Eluente: di-hidrogenofosfato de amónio (50 mM) + 5% de MeCN Débito: 1,5 ml/minuto

Detecção: UV, 270 nm

Tempo de retenção: BCH 189 5,5 minutos

BCH-189 desaminado 8,1 minutos

2. HPLC analítica quiral

Coluna: I acetil de ligação cíclica 250 x 4,6 mm

Eluente: acetato de trietilamónio 0,2% (pH 7,2)

Débito: 1,0 ml/minuto

Detecção: UV, 270 nm

Tempos de retenção: BCH 189 11,0 e 12,5 minutos

BCH-189 desaminado 8,5 e 10,2 minutos (A bioconversão foi controlada por perda do pico a 12,5 minutos e acumulado do produto a 10,2 minutos).

Exemplo 5 (-)-cis-4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolan-5-il)-(IH)-pirimidin-2-ona

Utilizou-se como inócuo uma ansa de células de C. coli B (ATCC 32848) retirada de uma cavidade de uma placa de nutriente de agar de desenvolvimento em dois frascos Florence contendo cada um 250 ml de caldo nutriente. Incubou-se a cultura à temperatura de 37°C e com agitação de (250 voltas/minuto) durante 18 ho ras. Utilizou-se esta para inocular 40 1 de meio CDD com citidina, num fermentador de 70 litros.

As condições de fermentação foram as seguintes: 40 1/mi-

nuto de arejamento, 750 voltas/minuto como velocidade de agitação e 37°C de temperatura. Ligaram-se ao fermentador três rotores Rushton. Realizou-se a fermentação durante 18 horas antes da colheita utilizando-se uma centrífuga contínua Sharples. A pasta de células, com o peso de 150 g, foi congelada para a temperatura de -20°C antes de se destruírem as células.

Meio CDD

L-ãcido glutãmico	g/L 3
MgSO₄	0,2
^K2^SO4	2,5
NaCI	2,3
Na₂HPO₄	1,1
NaH₂PO₄	0,6

Completado com água destilada.Esterilizada à temperatura de 121 C durante 30 minutos. Antes da inoculação adicionaram-se

1,2 g/1 de citidina filtrada e esterilizada.

Descongelou-se a pasta celular congelada (150 g) e suspen deu-se em 750 ml de 100 mM Hepes ácido (N-[2-hidroxietil]-pipera zina-N'-[2-ácido etano sulfónico), tampão pH 7,5 contendo 1 mM de ácido etilenodiaminotetra-acético, (sal de sódio e 1 mM de d_i tiotreitol (tampão de desagregação). Desagregaram-se as células fazendo passar a suspensão através de um homogeneizador Manton-Gaulin a 7.500 psi. Esta foi realizada por três vezes com arrefecimento da suspensão para aproximadamente 5°C após cada passagem no homogeneizador. Clarificou-se o homogeneizador por centri. fugação (1400 g, 60 minutos) . Absorveu-se a actividade de citidi. na desaminase em uma coluna de Q-Sepharose (volume do leito 490 mg) previamente equilibrada com 50 mM Tris (hidroximetílico) me-31^ ζ

* tilamina (pH 7,5) contendo 1 mM de cloreto de sódio. 0 conjunto de fracções activas (210 ml) foi adicionado numa coluna de fenil· -Sepharose (volume de leito 490 mg), previamente equilibrada com tampão de amostra contendo 3,2 M de sulfato de amónio. Eluiu-se a enzima por um gradiente decrescente na concentração de sulfato de amónio. As fracções que continham actividade de citidina desa minase foram reunidas (695 ml) e a enzima parcialmente purificada e em seguida precipitada com 80% de sulfato de amónio. Após centrifugação (1400 g, 60 minutos) ressuspendeu-se o aglomerado em 54 ml do sobrenadante obtido anteriormente e conservou-se à temperatura de 4°C.

Centrifugaram-se 6,2 ml desta solução (18.000 g, 90 minu tos) e dissolveu-se o aglomerado em 24 ml de tampão de fosfato de potássio 0,5 M (pH 7,5). Dializou-se a suspensão durante a noite contra tampão de fosfato de potássio 1 M (pH 7,5) . Diluiram-se em seguida 20 ml do retentado com igual volume de ãgua destilada. Adi cionaram-se a 35 ml desta solução 1 g de pérolas de Eupergit C anidra e manteve-se a mistura à temperatura ambiente entre 150 a 300 horas (determinada por avaliação de actividade de citidina de saminase residual na solução). Lavou-se em enzima imobilizada com tampão 100 mM Tris/HCl (pH 7,0) contendo 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 M NaCl e 500 ppm de éster etílico do ãcido p-hidroxibenzóico (tam pão de conservação). A enzima imobilizada (2,7 g de peso líquido) foi conservada neste tampão à temperatura de 4°C até ser necessã ria para a biotransformação.

Dissolveu-se o produto proveniente do exemplo 1 (3 g), em 500 ml de ãgua destilada em um frasco de um litro com agitador magnético. Realizou-se a bioconversão â temperatura de 32°C num pH de estabilização. Manteve-se o pH constante a 7,0 mediante a

adição de ácido acético 1 M. Lavou-se 1 g de pérolas da enzima imobilizada com água destilada antes do início da reacção. Controlou-se a conversão por HPLC quiral a qual demonstrou que o enan tiómero (+) do substrato foi desaminado preferencialmente. No fim da reacção (72 horas) as pérolas de enzima foram filtradas e o filtrado foi utilizado para isolamento do enantiómero (-) preten dido.

pH da mistura reaccional foi corrigido para 10,5 util_i zando-se solução de amoníaco (1 M) e a solução aplicada a resina Duoiite A113 super em um ciclo de OH (50 ml; volumes de 0,4 por hora). O análogo de uridina absorvido na resina e o enantiómero (-) passaram directamente. 0 restante enantiómero (-) ainda presente foi retirado por lavagem com uma solução de amoníaco a 0,04% (2 volumes; débito 0,8 volumes/hora).

O pH das soluções dispendidas e das lavagens (600 ml) foi corrigido para 7,0 com ãcido sulfúrico concentrado e a solução aplicada em resina XAD16 (50 ml; débito 1,4 volumes por hora). La vou-se a coluna com água destilada (2,5 volumes; débito 2 volumes por hora) e eluiu-se o enantiómero (-) com acetona: ãgua a 1:3 (débito 1,5 volumes por hora).

A fracção que continha o total do enantiómero (-) (4 volumes) foi concentrado num evaporador Buchi para um pequeno volu me antes de se filtrar através de um aglomerado de vidro n° 3. A solução filtrada foi liofilizada para se obter 1,2 g do produto em titulo idêntico ao obtido no exemplo 4.

Exemplo 6

Composições de comprimidos

A. Preparou-se a composição seguinte por granulação por via húmida dos componentes comuma solução de povidona em água, se-Ζ³cagem e passagem por rede seguida da adição de estearato de magnésio e compressão.

	mg/comprimido
(a) Componente activo	250
(b) Lactose B.P.	210
(c) Povidona B.P.	15
(d) Glicolato de amido e sódio	20
(e) Estearato de magnésio	5 500

B. Preparou-se a composição seguinte por compressão directa; a lactose é do tipo de compressão directa.

	♦ mg/comprimido
Componente activo	250
Lactose	145
Avicel	100
Estearato de magnésio	5
	500

C. (Composição de libertação controlada) . Preparou-se a compos_i ção por meio de granulação por via húmida dos componentes c.i tados (posteriormente) com uma solução de povidona em água, secagem e tamisação seguida por adição de estearato de magné sio e compressão.

— 34y

	mg/comprimido
(a) Componente activo	500
(b) Hidroxipropilmetilcelulose
(Metocel K4M Premium)	112
(c) Lactose B.P.	53
(d) Povidona B.P.	28
(e) Estearato de magnésio	7 700

Exemplo 7

Cápsulas

Preparou-se uma composição para cápsulas por meio de mi_s tura dos componentes citados posteriormente e enchimento em cápsu las de gelatina dura constituída por duas partes.

	mg/comprimido
Componente activo	125
Lactose	72,5
Avicel	50
Estearato de magnésio	2,5
	250

Exemplo 8

Fórmula injectável

Componente activo 0,200 g

Solução de hidróxido de sódio, 0,1 M, q.b.p. para um pH de cerca de 11

Âgua esterilizada q.b.p. 10 ml *>

Suspendeu-se o componente activo numa parte da água (que se pode aquecer) e corrigiu-se o pH para 11 com a solução de hidróxido de sódio. Em seguida completou-se o volume e filtrou-se através de uma membrana de filtração esterilizante, para um fras^ co ampola de 10 ml esterilizado, com fecho estéril e capsulou-se. Exemplo 9

	mg/supositório
Componente activo	250
Excipiente gordo, B.P.	1770 2020

Fundiu-se um quinto do excipiente gordo num recipiente aquecido por vapor a uma temperatura mãxima de 45°C. Fez-se passar o componente activo através de uma rede de 200 jim e adicicnou-se à base fundida por meio de mistura utilizando-se um agita dor de alta velocidade até se obter uma dispersão fina, manteve-se a mistura â temperatura de 45°C e adicionou-se o restante do excipiente gordo a esta suspensão e agitou-se até se obter homogeneização total. Fez-se passar esta suspensão por uma rede de ãcido inoxidável de 250 ^im sob agitação contínua e deixou-se arrefecer para a temperatura de 40°C. Introduziu-se a mistura em moldes de plástico de 2 ml a uma temperatura compreendida entre 38° e 40°C. Deixaram-se arrefecer os supositórios à temperatura ambiente.

Exemplo 10

Actividade biológica

Actividade antiviral

Determinou-se a actividade antiviral dos compostos citados no exemplo 2 sobre três estirpes de HIV-1 e uma estirpe de

HIV-2 com as linhas de células seguintes:

Células JM, uma linha de células T semi-natural proveniente de um doente com leucemia linfoblástica, infectado com HIV-1 da estirpe GB8.

Células C8166, uma linha de células T linfoblastoide humana, infectada com HIV-1 de estirpe RF.

Células MT-4, uma linha de células de leucemia de células T huma na, infectadas com HIV-1 de estirpe RF.

Células CEM, uma linha de células linfoblastoide T humana infecta da com HIV-1 das estirpes RF e U455 ou HIV-2 da estirpe ROD.

Determinaram-se as actividades antivirais sobre as células C8166, JM. e CEM por inibição na formação de sincicios (Tochi. kura et al Virology, 164, 542-546) e nas células MT-4 por inibição da conversão Baba et al; Biochem Biophys Res Commun., 142, 128-134 (1987); Mossman J. Immun Meth, _65, 55-57 (1983). Também se determinaram as actividades antivirais analizando-se a quanti. dade de antigénio HIV p24 sintetizado na presença e na ausência de enantiómeros.

Os resultados apresentam-se nos quadros 1 e 2 seguintes:

³⁷X

CQuadro

		LO IO **d ffl o	k k rd 1 > H M	0,05	0,01
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-38/

Quadro 2

Inibição da Síntese de HIV p24

Inibição em 50% da Sintese de HIV p24 (jig/ml)
Células	C8166	JM	MT-4
Vírus	RF	GB 8	RF
(+)-enantiómero	0,021	0,033	0,0008
(-)-enantiómero	0,016	0,016	0,0004

B citotoxicidade

Determinaram-se as citotoxicidades dos compostos descritos no exemplc--2, o composto racémico (BCH-189; exemplo 1) e de uma mistura a 50/50 dos dois enantiómeros em cinco linhas de células CD4: H9, JM, CEM, C8166 e U937.

Os compostos foram testados com diluições em série de 100 jig/ml até 0,3 jag/ml (concentrações finais) em placas microtitula 4 doras de 96 cavidades. Inocularam-se 3,6 x 10 células em cada ca vidade das placas incluindo os controlos isentos de fãrmaco. Após incubação ã temperatura de 37°C por um período de 5 dias, determinou-se a contagem de células viáveis removendo-se uma amostra da suspensão celular e contagem das células de exclusão de azul de Trypan num hemocitómetro.

Os resultados apresentam-se no quadro 3.

Α

Quadro 3

Citotoxicidade

	Citotoxicidade de 50% (pg/ml)
Composto	Células CEM	Células JM	Células H9	Células U937	Células C8166
(+)-enantiomero	1	1,5	2	4	35
(-)-enantiomero	> 100	30	y 100	y 100	> 100
BCH-189	3	3,5	8	15	90
Mistura a 1:1 de	2,5	ND*	ND	ND	ND

* ND - Não Determinado

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Processo para a preparação de (-)-cis-4-amino-1-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolano-5-il)-(IH)-pirimidin-2-ona ou de um seu derivado aceitável sob o ponto de vista far macêutico [Composto(A)], caracterizado pelo facto de se sepa rar o enantiómero sob a forma (-) da mistura que contém também o enantiómero sob a forma (+).
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se obter o Composto (A) praticamente livre do enantiómero (+) correspondente.

/41-
3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo, facto de o enantiómero ( + ) se encontrar presente no Composto (A) resultante em uma quantidade inferior a, aproximadamente, 5% (p/p).
4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o enantiómero (+) se encontrar presente no Composto (A) resultante em uma quantidade não superior a, aproximadamente, 2% (p/p) .
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o enantiómero {+) se encontrar presente no Composto (A) resultante em uma quantidade inferior a, aproximadamente, 1% (p/p).
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de. se obter o Composto (A) sob uma forma pra ticamente pura.
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se separar o enantióme ro sob a forma (-) de uma. mistura que contém também o enantiõmero ( + ) .
8.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindi( •42cações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se obter uma mistura racémica.
9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de se realizar a separação por HPLC qui-rãlica.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se utilizar como fase estacionária no ensaio de HPLC ^-ciclodextrina acetilada.ou triacetato de celulose.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 8, caracterizado pelo facto de se realizar a separação por catabolismo enantio-selectivo mediado por enzimas.
12. - Process de-acordo com a reivindicação 11, carac terizado pelo facto de se- utilizar a enzima na forma imobilizada.
13. - Processo.de acordo com .as reivindicações 11 ou 12, caracterizado pelo facto de se utilizar como enzima a citidina-desaminase.
14.- Processo de acordo com as reivindicações 11 ou

12, caracterizado pelo facto de se utilizar como enzima a 5’-nucleotidase.
15,- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de infecções virais, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz, como princípio activo, de um composto preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, com um veículo ou ingrediente aceitável em farmácia.
16.- Método para o tratamento de infecções virais em mamíferos, incluindo o homem, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz, geralmente compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de 750 mg/Kg de peso do corpo e .por dia, de um composto preparado pelo processo de.acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.