TWI222448B

TWI222448B - 1,3-oxathiolane nucleoside analogues

Info

Publication number: TWI222448B
Application number: TW088106761A
Authority: TW
Inventors: Jonathan Alan Victor Coates; Ian Martin Mutton; Charles Richard Penn; Richard Storer; Christopher Williamson
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1991-07-19
Publication date: 2004-10-21
Also published as: US20030004175A1; CN1326743A; AU7771991A; MY109796A; CN1154500C; AU651345B2; HU9200302D0; CA2059263A1; NZ238017A; HU210803A9; EP1062950A2; PT97520A; TNSN91029A1; PT97520B; AP9100255A0; KR920702682A; JPH05501117A; RU2099338C1; KR960007532B1; AP182A

Description

1222448 A7 B7 五、發明説明（〗) 本發明係關於核苷類似物，本發明尤其關於1 氧硫五圜核苷類似物。 3 — 亦已知具有BCH - 1 8 9或NGPB — 2 1之名之 @ ( I )化合物

(0 HOCH2 乃被述及具有抗病毒之效力，尤其是具有對抗人類免疫缺乏症病毒之效力，此人類免疫缺乏症病毒乃受滋病之致因 (1 9 8 9年6月5 — 9日於加拿大蒙特羅舉辦之第5屆抗愛滋病會議··摘錄T. C . Ο · 1及M. C · P · 63 ;歐洲專利申請公告第0382526號）。式（I)化合物爲兩種對映體，亦即式（I 一 1 )及（I 一 2)之消旋混合物： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝------訂-----線Ί 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 NH, 〇〆 HOCH, Π (1-2) H〇C^〇：

(1-1) 吾人乃對其消旋體形式加以敘述及測試。如今證實可供治本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4祝格（210 X 297公釐）一 4 一 1222448 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（2 ) 療因Η I V所致病況之僅有化合物爲3 > —疊氮基一 3 > —去氧胸腺嘧啶核苷（AZT, zidovudine, BW 509U)。然而’此化合物具有顯著之副作用傾向，故不能使用，一旦使用，則有顯著數量之病患必需取消此藥。故吾人持續地需要有效以對抗Η I V，但同時具有顯著優良治療指數之化合物。如今吾人意外地發現，式（I )化合物之對映體同樣地有效以對抗Η I V，但對映體中之一著（（一）一對映體）之細胞毒性則顯著地低於另一者，故本發明第一方面係提供式（I)化合物之（-）（或左旋）對映體及其製藥上可接受性衍生物。 (一）對映體之化學名爲（一）一順式一 4 一胺基一 1 一（2羥甲基一 1 ，3 —氧硫五園一 5 —基）一（1Η )一嘧啶一 2 —酮（其後稱之爲化合物（Α))。彼具有式（I 一 1 )化合物之絕對立體化學形式，其名爲（2 R ’順式））一 4 一胺基一 1 一（2 —羥甲基一1，3 —氧硫五圜一 5 —基）一（1Η) —啼1(¾ 一 2 —酮。化合物A最好實質上不含相關之（+ ) —對映體，亦即不超過約5% w/w ( + ) —對映體，最好不超過約 2%，尤其亦於約1% w/w存在。所謂 >製藥上可接受性衍生物'乃意指化合物（A) 或任何其他化合物之任何製藥上可接受性鹽，酯，或此酯之鹽，彼施用至接受者體內後，可提供（直接或間接地）化合物（A)或其有效抗病毒代謝物或徐留物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（210X297公釐） -5 - 1222448 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（3 ) 熟知技藝者已知，化合物（A)可在其兩個主要部分之官能基團上及在氧硫五圜環之羥甲基團上加以改良以獲得其製藥上可接受性衍生物。所有這些官能基團之改良作用亦包括在本發明之範圍內。然而，其中以氧硫五圜環之 2 —羥甲基團經改良後所得之製藥上可接受性衍生物特別重要。理想之化合物（A )之酯類包括化合物其中2 —羥甲 0II 基團之氫乃被醯基官能基R - C所取代，且其中酯之非羰基部分R係由氫，直或支鏈烷基（例如甲基，乙基，正丙基，正丁基，特丁基），烷氧基烷基（例如甲氧基甲基），芳烷基（例如笮基），芳氧基烷基（例如苯氧基甲基），芳基（例如任彼鹵素，C 烷基或C 烷氧基取代之苯基）：磺酸酯諸如烷基或芳烷基磺醯基（例如甲烷磺醯基）：胺基酸酯（例如L 一纈胺醯基，或L 一異白胺醯基）及——，二一或三一磷酸酯中所擇定。有關上述之酯方面，除非另有指示，否則所存在之任何烷基部分最好含有1至1 6個碳原子，尤其爲1至4個碳原子，此些酯中所存在之任何芳基部分最好包括苯基團〇酯類尤其可爲Cl_le烷酯，未經取代之爷酯或被至少一個鹵素（溴，氯，氟或碘）烷基，Ca-e烷氧基，硝基或三氟甲基團取代之笮酯。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（210X297公釐） -6 一 1222448 A7 ____B7 五、發明説明f ) 化合物（A )之製藥上可接受性鹽類包括由製藥上可接受性無機或有機酸及鹼所衍生者，適當酸之實例包括氫氯酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，高氯酸，富馬酸，馬來酸，磷酸，乙醇酸，乳酸，水楊酸，琥珀酸，甲基一對位一磺酸’酒石酸，醋酸，檸檬酸，甲烷磺酸，甲酸，苯甲酸，丙二酸，某- 2 —磺酸及苯磺酸。其它酸類諸如草酸等，雖然本身爲非製藥上可接受性，然可用以作爲製備本發明化合物及其製藥上可接受性酸加成鹽所用之中間體。由適當鹼中所衍出之鹽類包括鹼金屬（例如鈉），鹼土金屬（例如鎂），銨及NR4+(其中R爲（^-4烷基）鹽。其後有關本發明化合物乃包括化合物（A )及其製藥上可接受性衍生物。本發明化合物本身具有抗病毒之效力且/或可使此化合物代謝。這些化合物尤其有效以抑制反錄病毒之複製* 包括人類反錄病毒諸如人類免疫缺乏症病毒（Η I V’S )，亦即愛滋病之致因。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明化合物亦有用以治療愛滋病之相關病況諸如愛滋病相關性複徵（ARC)，進行性全身化淋巴腺病（ PGL)，愛滋病相關性神經病況（諸如痴呆或熱帶性下身輕癱等），抗一HIV抗體陽性及HIV-陽性病況，卡巴西氏瘤，血小板減少性紫瘢及聯合性機會性感染例如 Pneumocystis carinii 0 本發明化合物亦有用以避免使抗- Η I V抗體或本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4祝格（210Χ297公釐） — -7 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) Η I V —抗原陽性之個體之臨床病症產生進展且可預防接續暴露至Η I V上。化合物（A )或其製藥上可接受性衍生物於試管試驗內亦可用以避免生理流體諸如血液或精液等受到病毒污染〇熟知技藝者已知本文有關治療之定義及延伸到預防以及對已確立之感染或症狀之治療。更進一步已知，供治療所需之本發明化合物量不僅依所選擇之特定化合物，亦依施用路徑，待治療病況之特性及病患之年齡及病況而變，最終則由醫師或獸醫判斷。然而，適當之每日劑量通常約在0 · 1至750mg/kg體重之範圍內，最好在0 · 5至60 mg/ kg /天之範圍內，以 1至2 0mg/kg /天最佳。期望之劑量最好以單一劑量存在，或以分離之劑量而於適當之間隔時間施用，例如每天分爲二，三，四或更多之亞劑量。化合物最好以單位劑量形式施用，例如每單位劑量形式含有10至150 0mg，最好爲20至lOOOmg，以 5 0至7 0 Omg之有效成分最佳。有效成分在理想上必需予以施用以使有效化合物獲得約1至75从Μ，最好約2至50从Μ，尤其約3至30 //Μ之尖峰血漿濃度。此目的可藉靜脈內注射〇.1至5 %有效成分溶液（任於鹽水中），或經由口部施入含約1 至1 0 Omg有效成分之丸劑而達成，期望之血液值可藉可本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（210X297公釐） ---; .--裝------訂-----^^線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -8 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _____ B7五、發明説明（6 ) 提供約0 · 0 1至5 · Omg/kg /小時之連續浸劑或藉含約〇 · 4至1 5mg/kg有效成分之間歇性浸劑來保持。雖然供治療所用之本發明化合物可以未加工之化學品形式施用，然而有效成分最好係以藥學組成物之形式存在〇藥學組成物包括適於供口部，直腸部，鼻部，局部（包括頰部及舌下部），陰道部或非經腸部（包括肌內，皮下及靜脈內）施用者或爲適於藉吸入或吹入法施用之形式。如適當的話，組成物可以離散單位劑量存在且可藉由藥學技藝中詳知之任何方法製得，所有方法均包括將有效化合物與液態載體或微分之固態載體或二者結合之步驟，如需要的話，再繼而將產物定形成期望之組成物。適於供口部施用之藥學組成物最好係以離散單位之形式諸如各含預定量有效成分之膠囊，扁囊劑或藥片等；以粉末或顆粒；以溶液，懸浮液或以乳膠之形式存在，有效成分亦可以大丸劑，舐劑或糊之形式存在，供口部施用之藥片及膠囊可含有慣用之賦形劑諸如結合劑，填料，潤滑劑，崩解劑，或濕化劑等。藥片可依技藝中詳知之方法包予糖衣。口服之液體製劑可爲（例如）水性或油性懸浮液，溶液，乳膠，糖漿或酏劑之形式，或可以乾燥產物之形式存在而於使用前以水或其它之適當載色劑構成。此液體製可含有慣用之添加劑諸如懸浮液，乳化劑，非水性載色劑（彼可包括食用油），或防腐劑。本發明化合物亦可予以組成以供非經腸部施用（例如本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·

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-9 一 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明(7 ) 藉注射，例如大丸藥注或連續浸漬）且可以單位劑量形式存在於含添加防腐劑之安瓿，預填充式注射管，小量浸劑或於多重劑量容器中。組成物可採取諸如懸浮液，溶液，或乳膠（於油性或水性載色劑中）等形式，且可含有組成劑諸如懸浮液，安定劑及/或分散劑等。此外，有效成分可爲粉末形式，彼係藉由無菌固體之無菌分離作用或藉由溶液中低壓凍乾所製得以供於使用前以適當載色劑例如無菌，不含致熱原之水予以構成。供表皮局部施用方面，本發明化合物可組成軟膏，乳膏或洗劑之形式，或爲經皮貼藥之形式。軟膏及乳膏可使用（例如）添加適當稠化劑及/或凝膠劑之水性或油性基質予以組成。洗劑則可使用水性或油性基質予以組成且通常亦可含有一或多種乳化劑》安定劑，分散劑，懸浮液，稠化劑，或著色劑。適於供口內局部施用之組成物包括含有有效成分且於加味基質諸如蔗糖及金合塑膠或黃蓍膠中之錠劑；含有有效成分且於惰性基質諸如凝膠及甘油或蔗糖及金合塑膠中之錠劑；及含有有效成分且於適當液態載體中之漱口劑。適於供直腸部施用且其中載體爲固狀之藥學組成物最適於以單位劑量之坐藥形式存在。適當之載體包括椰子油及技藝中慣用之其它物質，坐藥最好係藉將有效化合物與軟化或熔化之載體混合，繼而於製模中冷卻及定形而形成 0 適於供陰道部施用之組成物可以子宮托，棉塞，乳膏 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4現格（210Χ297公釐） -10 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____ B7__五、發明説明（8 ) ’凝膠，糊，泡沬或噴霧等形式存在，彼等除了含有效成分外，亦含有技藝中已知之適當載體，供鼻內施用方面，本發明化合物可以液態噴霧或可分散性粉末之形式使用或可爲滴液之形式。滴液可使用水性或非水性基質予以組成，彼亦含有一或多種分散劑，溶解劑或懸浮劑。液體噴霧劑最好由加壓之包裝中釋出。供吸入方面，本發明化合物最好由吹入器，噴霧器或加壓包裝或由可釋出氣溶膠噴霧之其他便利器具中釋出，加壓包裝可含有適當推進劑諸如二氯基二氟基甲烷，三氯基氟基甲烷，二氯基四氟基乙烷，二氧化碳或其它適當氣體。如爲加壓之氣溶膠，則單位劑量可藉提供一個可釋出計量之閥來加以測定。此外，供吸入及吹入方面，本發明化合物可採用乾燥粉末組成物之形式，例如化合物及適當粉，末基質諸如乳糖或澱粉等之粉末混合物形式。粉末組成物可以膠囊或藥筒或（例如）凝膠或發泡藥包裝等單位劑量形式存在，粉末則由其內經由吸入器或吹入器之協助而施入。如期望的話，可使用適於使有效成分緩釋之上述組成物。本發明化合物亦可與其它治療劑例如其它抗感染劑結合使用。本發明化合物尤其可與已知之抗病毒劑共同使用〇上述結合劑最好可以藥學組成物之形式存在以供使用本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（210X297公釐） ~ -11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂

線*, 1222448 A7 _____B7 五、發明説明（9 ) ’故本發明亦包括含有上述結合劑與製藥上可接受性載體之藥學組成物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此結合劑中所用之適當治療劑包括無環核苷諸如acy -Cl ovir，干擾素諸如α，沒或r 一干擾素，腎棑泄作用抑制劑諸如羧苯磺胺，核苷傳遞抑制劑諸如潘生丁，2 ’， 3’ 一二去氧核苷諸如ΑΖΤ，2’ ，3’ 一二去氧胞嘧啶核苷，2，，3，一二去氧腺嘌呤核苷，2，，3, 一二去氧次黃嘌呤核苷，2，，3, 一二去氧胸腺嘧啶核苷，2 ’ ，3，一二去氫基一 2·，3, 一二去氫基胸腺嘧啶核苷及 2’，3, 一二去氧基一 2，，3, 一二去氫基胞嘧啶核苷等，免疫調節藥諸如內白來Π ( I L2)及顆粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)，紅血球生成素，amp -ligen ，胸腺調節素，thymopentin, foscarnet, ribav-irin及結合至C D 4接受體上之Η I V抑制劑例如可溶性 CD4，CD4段，CD4雜交分子，葡基化抑制劑諸如 2 -去氧基- D -葡萄糖，栗精胺及1 一去氧野艽黴素等〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製此結合劑之個別組份可以分離或結合之藥學組成物形式接續地或同時施用。當化合物（A )(或其製藥上可接受性衍生物係與有效以對抗相同病毒之第二種治療劑結合使用時，每一化合物之劑量可與其單獨使用時之劑量相同或互異。適當之劑量可由熟知技藝者輕易得知。化合物（A )及其製藥上可接受性衍生物可藉由技藝本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公襲)~ -12 - 1222448 A7 ___B7 五、發明説明（10 ) 中供製備類似結構化合物已知之任何方法製得，例如於歐洲專利申請公告第0 3 8 2 5 6 2號所述者。熟知下文所述某些方法之技藝者已知，化合物（A ) 之期望立體化學結構可藉由光學純質之初始物質開始著手或藉將消旋化合物於合成中之任何適當階段中解析而得。在所有方法中，光學純質之期望產物可藉將每一反應之終產物予以解析而得。其中一方法（A)係令式（珊）之1 ，3 —氧硫五圜 RI 〇—| U°yL ⑺丨丨）其中Ri爲氫或羥基保護基，而異頭物基團L爲可替代基團，與適當之鹼起反應，適當之L基團包括一 OR，其中 R爲烷基團，例如烷基團諸如甲基等或者R爲醯基團例如烷基諸如乙醯基等或鹵素，例如碘，溴或氯〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 或νιπ化合物最好係與胞嘧啶或其適當之嘧啶基元先質 (已事先以甲硅烷基化劑諸如六甲基乙硅烷等予以甲硅烷基化）於可相容之溶劑諸如二氯甲烷中，使用路易斯酸諸如四氯化鈦，錫（IV)化合物諸如SnCj?4等，或三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯起反應。式（ΥΙΠ)之1，3 —氧硫五圜可（例如）藉令式（W )之醛與式（VI)之锍基乙縮於可相容之有機溶劑諸如甲苯中，於酸催化劑例如路易酸諸如氯化鋅之存在下起反應本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^格（210X 297公~~~ -13 - 1222448 Α7 Β7 五、發明説明（11 而製得。 HSCH2CH(OC2H5)

CeHsCOzCHzCHO (VI )(vn ) 式（VI)之锍基乙縮醛可藉由技藝中例如G. Hesse and I· Jorder, Chem· Ber 85· 9 2 4-9 3 2 ( 1 9 5 2 )中已知之方法製得。式（W)之醛可藉由技藝中例如由E. G. Halloqui -st and H. Hibbert, Can. J. Research, 129-136 (1933)中已知之方法製得。粗製之醛（W)最好藉轉換成晶狀亞硫酸氫鹽加合物，繼而再度轉燥成游離醛而予以純化。第二種方法（B)中，化合物（A)係藉令式（κ) 化合物進行基元互變作用而得。

HOCH

B — 裝-----丨訂-----φβ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (IX) 其中Β爲可轉換成胞嘧啶之基元。此互變作用可藉簡易之化學轉變作用（例如將尿嘧啶基元轉換成胞嘧啶）用去氧核糖替基轉換酶進行酵素性轉換作用而達成，此基元互變作用之方法及狀況已於核苷化學之技藝中詳知。第三種方法（C)中，式（X I )化合物本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -14 - 1222448 A7 B7 五、發明説明（12 ) R.O. '〇、 • Nil, (XI) 請先閱讀背面之注意可使用核苷化學技藝中詳知之方法藉將異頭體nh2基團轉換成胞嘧啶基元而轉換成化合物（A)。上文中之許多反應業已廣泛地公布於核替合成之文獻中，例如 Nucleoside Analogs - Chemistry. Biology and Medical Applications· R· T· Walker a_L. , e- ds,Plenum Press, New York (1979) p. 165-192; T. Ueda 於 Chemistry of Nucleosides and Neeleotides, Vo 1 I, L B Townsend ed. , P1enum Press, New York ( 1 9 88 ) p. 1 6 5- 1 9 2,彼等乃併入本文中以供參考。經濟部中央標準局員工消費合作社印製吾人已知上述反應可能需要（或者最好可予應用）具有保護性官能基團之初始物質，而去保護作用則必需在中間或最終步驟進行。官能基團之保護及去保護作用可使用慣用之方法完成。例如，胺基團可使用芳烷基（例如笮基 )，醯基，芳基（例如2，4 一二硝基苯基）或甲硅烷基加以保護；如期望的話，再繼而使用標準狀況適當地進行水解作用或氫解作用以移去保護基團，羥基團可使用任何慣用之翔基保護基團*例如於 Protective Groups in Organic Chemistry" , Ed. J. F. W. McOmie (Plenum Press, 1973)或’Protective Groups in Organic Syn-thes i s , Theodora W. Greene (John Wiley and Sons 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（210 X 297公釐） -15 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（13 ) 1981)中所述者加以保護。適當之羥基保護基團之實例包括烷基（例如甲基，特丁基或甲氧基甲基），芳烷基（例如爷基，二苯基甲基或三苯基甲基），雜環基團諸如四氫吡喃基，醯基（例如乙醯基或苯醯基）及甲硅烷基團諸如三烷基甲硅烷基（例如特丁基二甲基甲硅烷基）。羥基保護基團可藉由慣用之技術移除。因此，例如，烷基，甲硅烷基，醯基及雜環基團可藉溶劑分解作用，例如藉於酸性或鹼性狀況下進行水解作用而移除。芳烷基團諸如三苯基甲基團則同樣地可藉溶劑分解作用例如藉於酸性狀況下進行水解作用而移除。芳焼基團諸如爷基等可（例如）藉以 B F 3 /醚酸酯及醋酐處理，繼而於合成之適當階段將乙酸酯基團移除而予以裂解。甲硅烷基團最好亦使用氟離子來源諸如四正丁基氟化銨來移除。上述方法中，化合物（A)通常係以順式及反式異構體混合物之形式獲得，其中以順式異構體爲主要之化合物〇這些異構體可藉由物理方法，例如於硅膠上進行色層分析或藉分步結晶作用直接地或於其適當衍生物例如乙酸酯（例如使用醋酐製得）上予以分離，分離後，再倒轉換成母產物（例如藉使用甲醇性氨予以去乙醯基化）。本發明化合物之製藥上可接受性鹽可依美國專利第 4，383，114號所述之方法製得，彼乃併入本文中以供參考，例如，當期望製得化合物（A )之酸加成鹽時，則可使用慣用之方法藉將所得游離鹼以適當之酸處理而 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 16 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（14 ) 使上述任何步驟之產物轉換成鹽，製藥上可接受性酸加成鹽可藉令游離鹼與適當之酸任於適當溶劑諸如酯（例如乙酸乙酯）或醇（例如甲醇，乙醇或異丙醇）之存在下起反應而製得。無機鹼性鹽可藉令母化合物與適當之鹼諸如醇化物（例如甲醇鈉）任於溶劑諸如醇（例如甲醇）之存在下起反應而製得。製藥上可接受性鹽亦可使用慣用之方法由化合物（A)之其它鹽，包括其它製藥上可接受性鹽中獲得。如適當的話，化合物（A)可藉與磷酸化劑，諸如 P 0 C 3 ，或適當酯化劑，諸如酸式鹵化物或酸酐起反應而轉換成製藥上可接受性磷酸酯或其它酯。化合物（A )之酯或鹽可藉（例如）水解作用而轉換成母化合物。最終產物，或供其所用之中間體或初始物質可藉技藝中已知之任何適當方法完成··例如參見E. L. Eliel之 Stereochemistry of Carbon Compounds '及S · H. W i-len Tables of Resolving Agents e 例如，化合物（A )可藉使用適當之靜止相例如乙醯基化之Θ -環糊精或纖維素三乙酸酯等及適當溶劑例如醇諸如乙醇等或（例如）三乙基乙酸銨之水性溶液進行對掌型Η P L C而得。此外，化合物可藉使用適當酵素諸如胞嘧啶核替脫胺酶進行酵素來促成性對映體選擇性分解代謝作用或使用5’ 一核苷酸酶進行適當衍生物之選擇性酵素降解作用予以解析。當解析作用予以酵素化地進行時，酵素可於溶液中使用，最好以固定化之形式使用，酵素可藉本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4祝格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝_

-17 ~ 1222448 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（15 ) 由技藝中已知之任何方法予以固定，例如藉吸附至樹脂諸如EupergitC上而得。本發明乃更進一步地藉由下列實例說明’這些實例並非限定本發明。所有溫度則均爲攝氏度數。生_間體1 、 5 —甲氬基一 1 ，3 —氣硫五圜一 2 —甲醇，苯甲酸酯。將氯化鋅（1 · 6g)之熱甲醇（15m$)溶液加至已攪拌之毓基乙醛，二甲基乙縮醛（34 · 2g)及苯醯氧基乙醛（48 · 3g)之甲苯（1 3 00m义）溶液中，而後於氮下迴流5 0分鐘，繼而將已冷卻之此混合物濃縮，以一些甲苯稀釋，而後通過硅藻土中予以過濾。再將結合之濾液及甲苯以水性飽和碳酸氫鈉溶液（X 2 )及鹽水清洗，並予乾燥（MgS04)，而後蒸發成油狀物，再令之於硅膠上進行柱色層分離（2kg，Merck 9385) ，並以氯仿洗提，即得油狀之標題產物，彼爲異頭體混合物之形式（約 1 : 1)，1H NMR (DMSO-de) 3·1 - 3·3(4Η)，3·42(6Η)， 4·4 — 4·6(4Η)，5·41(1Η)， 5·46(1Η)5·54(1Η)， 5 . 6 3 ( 1 Η ) ，7·46(4Η)， 7·58(2Η)，8·07(4Η); rmax (CHBr3) 1717.6cm-1。 -裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -18 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 .Μ --_____；__五、發明説明（16 ) 2 丄~ί~_) -順式- 1 -（2 -苯醯氧基甲基- 1 , 3 -氣硫圜一 R - 基）一 (1 Η )—喃陡一 2 - 4 一二酬將精微碾磨尿嘧啶（9· 62g)，六甲基乙硅烷（ 5 Omp )及硫酸銨（3 Omg)之混合物於迴流下於氮下加熱直至得到清澈之溶液爲止。再將之冷卻，並予蒸發成無色油狀物，繼而於氮氣層下，於乙睛（1 0 Omj?)中溶解。而後將溶液加至已攪拌且已以冰冷卻之5 —甲氧基一 1 ，3 —氧硫五圜一 2 —甲醇，苯甲酸酯（中間體1) (19 · 43g)之乙腈（600m又）溶液中，再將三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯（14 . 7mi)加入。繼而移去冰浴，再將溶液於迴流下，於氮下加熱4 5分鐘。冷卻及蒸發後，將餘留物藉於lkg硅膠（Merck 9 3 8 5 )上進行柱色層分離並以氯仿/甲醇9:1洗提而予以純化。而後將適當之部分冷卻及蒸發以得粗製餘留物。再將之由最小量之熱甲醇（約1 2 0 Omj?)中予以分步結晶，即得白色晶狀之標題化合物（6 · 3 2 g )。 1 H NMR(d6DMS0)5 11 . 3 6 ( 1 Η , b s ) 7 . 5 0-8 · 00(6H，m)，6 · 20(1H，t)， 5.46(2H，m) ，4.62(2H，m)， 3.48 (lH，m) ，3.25(lH，m)。中間濃-1- Γ 土）一（順式）一 4 一胺基一 1 一（2 —苯醣氣基甲某本紙張尺度ϋ中國國家標準（cns )八4規格（2丨〇><297公釐） ~ 一 -19 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -^·ϋϋ —ϋβρ ^1ϋ —^ϋ ϋϋ --0J—flu ι_ϋ 1_1

線· 1222448 A7 _B7五、發明説明（17 ) 一 1 ，3 —氣硫五圜一 5 —某）一 (1 Η ) —嘧啶一 2 — 經濟部中央標準局員工消費合作社印製酮方法（a ) 將胞嘧啶（20 · 705g)及硫酸銨（數mg)之六甲基乙硅烷（1 1 0m5 )懸浮液攪拌及於迴流下於氮下加熱2 1 /2小時。再藉蒸發法移去溶劑，並令餘留固體溶於乾乙睛（3 5 Omj?)中，而後使用柔軟針技術將此溶液轉移至於氮下之已攪拌，且已以冰冷卻之5 —甲氧基一 1 ，3 —氧硫五圜一 2 —甲醇，苯甲酸酯（中間體1 )(43.57它）之乙腈（65〇1115)溶液中，繼而加入三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯（3 3mP)，再令此溶液加溫至室溫（1 1/2小時），而後加熱至迴流過夜。繼而將餘留混合物濃縮，以飽和水性碳酸氫鈉溶液 (500m芡）稀釋，而後以乙酸乙酯（3X500) mj?)萃取，再將結合之萃取液以水（2 x 250mj?) 及鹽水（250m$)清洗，並予乾燥（MgS04 )及蒸發成泡沬狀物，繼而令之於硅石（600g，merck 7 7 3 4 )上進行柱色層分離，並以乙酸乙酯一甲醇混合液洗提，即得異頭體混合物（約1 : 1 ，31 · 59g) 。再將混合物由水（45mj?)及乙醇（9 · Omj?)中予以結晶以得固狀物（10· 23g)，其後由乙醇（ 1 2 〇 m $ )及水·（ 3 0 m义）中予以再結晶，即得白色固狀之標題產物（9 · 26g) ; Amax (MeOH) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（21 OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝訂

線.丨 -20 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ---B7 五、發明説明（18 ) 2 2 9 · 4πιιη(Ε1966 1 0);2 7 2 · 4ram(E1%293); lcm 1cm1 H N M R ( D M S 0 d 6 ) 5 3el4(lH)，3.50(lH)， 4 · 0 7 ( 2 H )，5·52(1Η)，5·66(ιη)，6.28(1 H)，7 · 2 2 ( 2 H )，7 · 5 6 ( 2 H )，7·72(2Η)，8·10(2Η)。將磷醯氯（7 · Omj?)逐滴加至已攪拌，已以冰冷之1 ，2，4 一三唑（11 · 65g)之乙腈（120 mj?)懸浮液中，再一面保持內部溫度低於1 5°C，一面將三乙胺（22 · 7m$)逐滴加入。10分鐘後，將（ ±) —順式一 1一（2 —苯醯氧基甲基一 1 ，3 —氧硫五圜一 5 —基）一（1H) —嘧B定一 2，4 一二酮（中間體 2) (6 .27g)之乙腈（3 3 0 mj?)溶液徐緩加入。繼而於室溫下連續攪拌過夜。再使用冰浴將此混合物冷卻，而後徐緩加入三乙胺（30mj?)，再加入水（21 mP)。再將所得溶液蒸發，並令餘留物分界於飽和碳酸氫鈉溶液（400mj?)及氯仿（3x200mj?)間。而後將結合之氯仿萃取後於硫酸鎂上乾燥，再予過濾及蒸發以得粗製餘留物（9 · 7g)，令餘留物溶於1 ，4 一 -裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4祝格（210Χ297公釐） - 21 - 1222448 Α7 Β7 五、發明説明（19 ) 二囉燒（2 4 Omj?)中，再加入濃縮之水性氨溶液（ s · 8 〇-880，5〇111芡）。1 1/2 小時後，將溶液蒸發，再令徐留物溶於甲醇中，此將導致固狀物之沈澱，再將之濾出。母液則藉於硅膠（Merck 9 3 8 5， 6 〇 0 g)上進行柱色層分離予以純化。而後將適當之部分收集並蒸發，即得淡黃褐色固狀之標題化合物（ 2· I8g)，彼與方法（a)所得者相同。實例1 丄^丄一（順式）一 4 一胺基一 1 一（2 —羥甲基一 1 ， 3 —氣硫五圜一 5 —基）一（1H) —嘧啶一 2 —酮將（順式）一 4 一胺基一 1 一（2 —苯醯氧基甲基一 1 ，3 —氧硫五圜—5 —基）一（1H) —嘧啶一 2 —酮 (中間體 3 ) ( 8 · 1 9 g )及 Amberlite I R A - 400 (OH)樹脂（8 · 24g)之甲醇（250m 又 )懸浮液攪拌及加熱至迴流1 1/4小時，繼而藉過濾經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 法移出固體，而後以甲醇清洗。再將結合之濾液蒸發，餘留物則以乙酸乙酯（8 Omj?)碾磨。將所得白色固狀物藉過濾法收集後，即得標題產物（5 · 09g)， 1 H NMR(DMS0 - de) 3 . 0 4 ( 1 Η ) · 3 . 4 0 ( 1 Η )， 3 . 7 3 ( 2 Η )，5.18(1 Η), 5·29(1Η) ，5.73(1 Η)， 6·21(1Η)，7·19(2Η)，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4祝格（210 X 297公釐） -22 - 1222448 A 7 --^____ _B7____ 五、發明説明（20 ) 7 · 8 1 ( 1 η )。宣~^~-2—L (±) —（順式）一4 一胺基一 1 一（2 — 經甲 ^〜1一L 3 —氧硫五圜一 5 —基）一（1 H) —嘧淀一 2 二對映體之對掌型HP L C分離作_ (A)令實例1之消旋產物（2 5mg)於下列狀況下進行製備性Η P L C : 柱： Merck Hibar纖維素三乙酸酯， 250><10醒，10/z 洗提液：乙醇；流速： 3 m又/分；檢視法·· uv，27〇nm; 溫度：室溫。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂

Nly 5 順 I ’ 園 R五 2 硫 C 氧得 I 即 3 t 9 後 1 發 I 蒸基以甲予羥分 I 部 2 當 C 適 I 之 1 集 I 收基所胺將一 4

經濟部中央標準局員工消費合作社印製基 ο 基 I 1 1 甲 2 酮性備製 % 及 Η I 式 I 約啶順圜率嘧，五產一 S 硫， } 2 氧呢物產旋消之： 1 C 例 L 實 P 令 Η 2 5 酮 4 基％

羥 I 約 I 啶率 2 嘧產 c I ， I ) mgl Η 8 I 1 • 基 c 6 胺 I 行進下況狀列下於 mg 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） - 23 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（21 ) 柱： ASTEC cyc 1 obond I acety 1， 2 5 0 x 4 · 6 mm 洗提液： 0 · 2%三乙基乙酸銨（藉將冰醋酸加至 0 · 2%三乙胺之水液中使最終pH爲 7 · 2而製得）；流速： 2 m又/分；檢視法： u v，3 0 0 n m ; 溫度：室溫。將適當之部分予以蒸發後，即得（2R，順式）一 4 一胺基一 1 一（2 —經甲基—1 ’ 3 —氧硫五圜一 5 —基 )—(1H) — 嘧啶一 2 — 酮（5 · Omg，產率約 91% )及（2S，順式）一4 一胺基一 1 一（2 —羥甲基一 1 ，3 —氧硫五圜一 5 —基）一（1 Η ) —嘧啶一 2 —酮（ 7.6 mg，產率約 96%)。實例3 (一）一順式一 4 一胺基一 1 一（2 -羥甲基—1，3-氧硫五圏一 5 -基）一 (1 Η ) 一喃n定一 2 -酮 (i ) (±) —順式一 4 一胺基一 1 一（2 —經甲基一 1 ，3 —氧硫五圜一 5 —基）一（1H) —嘧啶酮，二氤磷酸酯，銨鹽_ 將冷卻（0° )，已攪拌之（±) —順式一 4 一胺基一 1— (2 —經甲基一 1 ’ 3 —氧硫五圜一 5 —基）一（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐) 一 24 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1222448 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 _____B7_五、發明説明(Μ ) 1 Η ) —嘧啶一 2 —酮（1 · 〇〇 g·)(實例1 )之乾磷酸三甲酯（20mj?)懸浮液以磷醯氯（2 · 44m又）處理，再將此混合物於0°下攪拌3 5分鐘，而後於冰水 (6 0 g )中驟冷。繼而藉加入水性N —氫氧化鈉以調整此冷混合物之pH至2 · 5，再施至木炭柱（10g， DARC0)上，並以水及乙醇一水性氨先後洗提。而後結合含有粗製一磷酸酯之諸部分，並予濃縮。繼而將所得溶液施至含 2 5 g D E A E Sephades A — 2 5 ( HC03 —形式）之柱上。再使用水（I20mi)至 0 · 1M — NH4HC03 ( 24〇mj2)，而後 0 · 2 ， 0·3&4Μ N H 3H C 0 3 (分別爲 120，240 ，4 0 Omj?)之梯度洗提。繼而結合適當之諸部分，並予濃縮。再將餘留之溶液以水（4 0 m j?)稀釋，並予凍乾’即得白色固狀（1 · 37g)之標題化合物； Amax (pH6 緩衝液），27 · l〇nm (E 196 1 cm 19 0) ； 1 Η N M R ( D 2 0 ) δ 3 . 2 3 ( 1 Η )，3·55(1Η)， 4·0 - 4·2(2Η)， 5 . 4 3 ( 1 Η )，6·07(1Η)， 6 · 3 3 ( 1 Η ) ，8·08(1Η)。 (钍）~2_Ε ,順式）一 4 一胺基一 1 一（ 2 -經甲基一 1」—3_二氧硫五闻一 5 -某）一（1Η) -喃Β定一 2 -醒 S_…·—谷~lJSM式）—4 —胺基一 1 一（2 -羥甲基一 1 ’ ^氏張尺度適用中國國^5準（〇~5)八4規格（210/297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂

-25 - 1222448 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製五、發明説明（23 ) 3 -氧硫五圜二_5 —基）一（1H) —喃n定一 2 —酮將5 / —核苷酸酶（由響尾蛇毒中取出）〔E C 3 · 1 · 3 · 5〕（60mg，17 單位/ mg)加至（土）一順一 4 一胺基一（2 —羥甲基一 1 ，3 —氯硫五園一5 一基）一（1H) -嘧啶一 2 —酮，6，一二氫磷酸酯，銨鹽（1 · 35g)之緩衝溶液〔30mj?，由甘油（ 5 2 6 mg )及氯化鎂（190mg)於水（lOOmj?)中製得〕中，再將此混合物於37°下保溫2 · 5小時。繼而加入更多酵素（20mg)，再予連續保溫另3 · 5小時，而後將所得混合物施至D E A E Sephadex A — 2 5 ( HC03 —形式）柱上。並使用水（160mj?)，而從 0.1，0.2，0.3及0.41^1 NH4HC03(各 2 0 Omi )洗提。繼而將含有最初洗提出之組份之適當部分結合並予蒸發，再令餘留物於硅石（6 0 g，Mecrk 7 7 3 4 )上進行柱色層分離，並以氯仿-甲醇混合液洗提。將適當之部分由甲醇一乙酸乙酯中蒸發後，即得白色固狀之（+，順式）一 4 一胺基一 1 一（2 —羥甲基一 1 ，3 —氧硫五圜一 5 —基）一（1H) —嘧啶一 2 —酮（ 0.30g)- 〔a〕D21+137。（c.1.04 M e 0 Η )； 1 Η NMR (DMSO) δ 3·04(1Η)，3·40(1Η)， 3 . 7 3 ( 2 Η ) ，5·18(1Η)， 5 . 2 9 ( 1 Η ) ，5·73(1Η)， (請先閱讀背面之注意事 4 項再填· 裝丨— :寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4祝格（210 X 297公釐）一 26 - 1222448 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂五、發明説明（24 ) 6 · 2 1 ( 1 Η )，7 · 1 9 ( 2 Η )， 7 · 8 1 ( 1 Η ) 〇將Sephadex柱中含有第二種洗提出之組份之適當部分結合並予蒸發。再令餘留物溶於水（3 Omj^ )中，以鹼性磷酸酶（由大腸稈菌取得）〔EC 3 · 1 · 3 · 1 〕（1 . 5mj?，416單位/ mj^)處理，而後於 3 7°下保溫一小時。繼而藉蒸發法移去溶劑，再令餘留物於硅石（6 0 g，Merck 7 734)上進行柱色層分離，並以氯仿一甲醇混合液洗提。將適當之部分由甲醇-乙酸乙酯中蒸發後，即得白色固狀之（一，順式）一 4 一胺基一1一（2—羥甲基一1 ，3—氧硫五圜一5—基）一 (1 Η ) — 嘧啶一 2 —酮（0 · 3 2 g ) ; 〔 a〕D21 -132。（c.l.〇8，MeOH)； 1 H NMR (DMSO) δ 3 . 0 4 ( 1 Η ) ，3·40(1Η)， 3·7 3 (2Η)，5·18(1Η)， 5 . 2 9 ( 1 Η )，5·73(1Η)， 6 · 2 1 ( 1 Η )，7 · 1 9 ( 2 Η )， 7 . 8 1 ( 1 Η ) 〇實例4 C 一）一順式一 4 一胺基一 1 一（2-經甲基一 1 ’ 3 -氣硫五圜一 5 —基）一 (1 Η ) 一嘧陡一 2 -耐將各一個白金圈量之由營養瓊脂培養基中所刮出之大 (請先閱讀背面之注意事_ 4 項再填. 裝— :寫本頁) 、1Τ

線' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4祝格（210X297公釐） -27 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（25 ) 腸桿菌（ATCC 23 848)分別種至三個含有營養培養湯之5 Omj?燒瓶（〇xo id有限公司）之一個中。再將燒瓶於3 7 °C下保溫過夜，同時以2 5 0 r ev /分之速搖動，每一個燒瓶乃繼而用以接種於七升醱酵器中之 4又 CDD培養基（谷胺酸；3g/5;MgS04 ，〇.2g/j?；K2S04 ，2.5g/j2;NaCj?， 2 · 3 g / ^ ，Na2HP042H20， 1 · lg/j?， NaH2P0 4 2H20 0 · 6g/5 胞嘧啶核苷， 1·2g/$)上。再將培養物於750rev/分， 3 7 °C下醱酵，同時以4 分之速充氣。生長2 4小時後’藉離心（5000g，30分鐘）收集72g濕重之細胞。令此細胞丸劑再度懸浮於300mj^ 2 0 m Μ T r i s H C j?緩衝液（p H 7 · 5 )中，再藉皂化作用（4x45秒）予以破裂。繼而藉離心（30，000 g，3 0分鐘）移去細胞屑，再藉加入硫酸銨至7 5%飽和度以令上層液中之蛋白質沈澱，而後令丸劑再度懸浮於 2 5mj^含硫酸銨（7 5%飽和度）之HEPES緩衝液 (1 OOmM，pH7 · 0)中，酵素溶液則藉以 1 2 ’ 000 r pm之速離心3 0分鐘而製得。繼而丟棄上層液，再令丸劑溶於Tr i s HCj?緩衝液（pH 7·0;100ιηΜ)中以得初始量。 (ϋ )令實例1產物（i i 5 mg )溶於水（1 〇〇 m义）中，並予攪拌。再將酵素溶液（0 · 5m 5)加入，而後本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) AO見格（210X297公釐）一 28 - (請先閱讀背面之注意事 4 項再填· 裝— :寫本頁)

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1222448 A 7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（26 ) 藉連續加入HC又（2 5mM)以使混合物之pH保持恒定。轉換作用乃藉對掌型HP L C法加以監視，彼顯示基質中之（+ )對映體乃優先脫胺化。2 2小時後，基質中之（+ )對映體（RT 12 · 5分鐘）已先全移除，再藉加入濃氫氧化鈉以調整溶液之pH成1 〇 . 5。令上示所得之溶液通過Q A E Sephadex ( A 2 5 ; Pharmacia; 3 〇xl . 6 cm)(已事先均衡化成 pH 1 1 )中予以洗提。再將此柱以水（2 Ο 0 m $ )及 HCj? (〇 · 1M)先後清洗。繼而收集諸部分（40 m 9.)，再藉逆相HPLC法分析。而後結合第5 — 13 部分（含有基質中未反應之（一）對映體），再使用 HCj2以調整pH成7. 5。第47部分（含有脫胺化之產物）則使用稀NaO Η以調整pH成7 · 5。經由對掌型HP L C分析顯示，此物質乃混合物，彼含有主要組份之一種對映體（RT 1 0 · 2分鐘）及次要組份之另一種對映體（RT 8 · 5分鐘）（產率約90%)。 (iii)大規模地重覆上述第（ii)階段之步驟。將實例1 化合物（3 6 3mg)之2 5 0 mj?水液與酵素溶液（ 0.5mj?)(依階段（i)所述之法製得）共同保溫。再於18及47小時後，另加入整份（0 · 5mj?)酵素，而後將反應混合物攪拌7 0小時，再令之靜置另6 4小時經由對掌型hp 1 c分析指出，基質中之（+ )對映體業已先全脫胺化，再將所餘留溶液以N a OH調整至p Η (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝-----丨訂：-----9, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） -29 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1222448 A7 _____B7___ 五、發明説明（27 ) 10.5。將上示溶液裝載於相同之QAE柱上，並依階段（i )所述之法洗提。再堆集第2 - 6部分（含有餘留基質與脫胺化產物之混合物），其後堆集第7—13部分（含有餘留基質（（一）對映體））並予以調整至PH7 · 5。繼而堆集第2 5 — 2 6部分（含有脫胺化產物）並予中和〇令上述2 — 6部分通過相同之QA E柱中予以再洗提。由此第二支柱中所得之第3—11部分乃含有未反應之基質（（一）對映體）。第70部分則含有脫胺化產物。 (iv)將由階段（U)及（iii)中所得之已解析基質結合，並予調整成PH7 · 5。再令此溶液通過XAD — 16 (40x2 · 4cm)柱（包裝於水中）中予以洗提。繼而將此柱以水清洗，而後以丙酮：水（1 :4v/v)洗提。再堆集含有BCH 1 89 ( -）對映體之諸部分並予凍乾，即得白色粉末（1 9 0 mg )。以上所用之HPLC法如下： 1 ·逆相分析HPLC 柱：Capital Cartridge

Spherisorb 0DS-2 ( 5/z Μ ) 1 5 0 x 4. 6 mm 洗提液：磷酸二氫銨（5DmM) + 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐f 一 30 - -裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11

1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（28 ) 5¾ MeCN 流速：1. 5 m $ /分鐘檢視法：UV, 2 7 0 nm 滯留"時間·· BCH 1 8 9 5. 5分鐘 :脫胺化BCH- 1 8 9 8. 1分鐘 2·對掌型分析HPLC 柱：Cyclobond I Acetyl 2 5 0 x 4. 6 mm 洗提液：0.2%三乙基乙酸銨（ΡΗ7·2) 流速：1.0m5/分鐘檢視法：UV, 2 70 nm 滯留時間：BCH 189 11.0及12.5分鐘 :脫胺化BCH- 1 89 8.5及10.2分鐘 (上述生物體轉換作用係隨監視到尖峰於12.5分喪失後發生，而產物之累積則於1 0 . 2分鐘。）實例5 (一）—順式一 4 一胺基一 1 一（2 -經甲基一 1，3 -氧硫五圜一 5 —基）一（1H) -嘧陡一 2 -酮將一白金圈量之由已充分生長之瓊脂培養基中所刮出之大腸桿菌B細胞（ATCC 328 4 8)接種至兩個各含2 5 〇m$營養湯之平底燒瓶中。再將此培養物於 37 °C下保溫，同時搖動（250 rev /分鐘，5cm 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4現格（210'〆297公釐）， ' " -31 - (請先閱讀背面之注意事' 4 ▼項再填· 裝— :寫本頁)

、1T

1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2Θ ) 之瑤動）18小時。繼而將彼接種至醱酵器內之 4 〇 CDD培養皿（含胞嘧啶核苷）上。醱酵作用之狀況如下：4 0 L/分鐘之充氣作用， 75 〇 r e v/分鐘之攬拌速度，溫度爲3 7°C，醱酵器內備有三個Rushton葉輪，醱酵作用則於使用Sharpies 連續離心機採收之前進行1 8小時。細胞糊（1 5 0淨重 )則於細胞破壞之前於一 2 0 °C下冷凍。培養基

g / L L 一谷胺酸 3 M g S 〇 4 0.2 K 2 S 0 4 2 · 5 N a C ^ 2 · 3 N a 2 Η P 0 4 1 . 1 N a Η 2 Ρ 〇 4 0 · 6 以蒸餾水製備。於1 2 1°C下滅菌3 0分鐘，胞嘧啶核苷（1 · 2g/L)乃予過濾滅菌，再於接種前加入。將已冷凍之細胞糊（1 5 0 g )解凍，再令之懸浮於含ImM乙二胺四乙酸（鈉鹽）及ImM二硫蘇糖醇（分裂用緩衝液）之75 0 m』 100mM Hepes ( N —〔 2 -羥乙基〕哌嗪一 N>—〔 2 -乙烷磺酸〕）緩衝液（ pH7 · 5)中。再藉令懸浮液通過以7500ps i運轉之Maton-Gaulin均化器中以使細胞破裂。此步驟乃進行本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（210X297公釐） ~ ~ 一 32 - 裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11

1222448 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（30 ) 三次，並於與一次通過均化器之後令懸浮液冷卻至5 °C，而後將均化物藉離心作用（1 4 0 0 g ; 6 0分鐘）淨化。胞嘧啶核苷脫胺酶之活性則予吸附至事先已以含1 mM 氯化鈉之5 0mM Tr i s (羥甲基）甲胺（pH 7 · 5 )均衡化之Q—Sepharose柱（4 9 Omg之床量上 )。將所收集之活性部分（2 1 0 m )加至已事先以含 3 · 2M硫酸銨之樣品緩衝液均衡化之苯基一 Sepharose 柱（4 9 〇m又之床量）上。再將結合之酵素藉由漸降梯度之硫酸銨濃度洗提。繼而收集含胞嘧啶核苷脫胺酶活性之諸部分（ 6 9 5 mg)，再將此已部分純化之酵素以80 %硫酸銨沈澱。離心（140 0 g ; 60分鐘）後，令丸劑再度懸浮於由上所得之5 4mj?上層液中，再於4 °C下貯存。將6 · 2m$之此溶液離心（18000 g，90分鐘），再令丸劑溶於24mj? 〇 · 5M磷酸鉀緩衝液（ PH7 · 5)中，令此懸浮液經由1M磷酸鉀緩衝液（ PH7 · 5)滲析過夜。而後將滯留物（20m又）以等量之蒸餾水稀釋，繼而將乾燥Eupergit C玻璃珠加至 3 5mj^之此溶液中，再令此混合物於室溫下靜置1 5 0 - 3 0 0小時（測定溶液中之胞嘧啶核苷脫胺酶活性）。將固定化之酵素以含ImM EDTA，lmM DTT ，0 · 5M NaC5及500ppm對位一羥基苯甲酸乙酯（貯存用緩衝液）之10 OmM Tr i s/HCi 緩衝液（PH7 · 0)清洗。而後將固定化之酵素（ (請先閱讀背面之注意事_ 4 項再填· 裝-- ，寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 33 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1222448 A7 B7 五、發明説明（31 ) 2 · 7 g濕重）於4 °C下，於此緩衝液中貯存直至需用以進行生物體轉變作用爲止。於磁性攪拌之1升燒瓶內，令實例1產物（3 g)溶於5 〇〇 m 5蒸餾水中。生物體轉換作用則於3 2。(：下，於P Η器中進行。PH乃藉加入1 Μ乙酸而保持恆定於 7 · 0。1 g濕重之固定化酵素玻璃珠則於反應開始之前以蒸餾水清洗。轉換作用乃藉由對掌型HP L C法監視，彼顯示基質中之（+ )對映體係優先脫胺化。反應終止後 (7 2小時），將酵素玻璃珠濾出，濾液則用以分離出期望之（一）對映體。使用氨溶液（1M)將反應混合液之pH調整至 1 〇 · 5，再將溶液施至0H循環形式之Duolite Al 1 3超級樹脂（50m$ ;每小時之0 · 4床量）上。尿嘧啶核苷乃吸附至樹脂上，而（-）-對映體則直線通過。仍留在樹脂上之任何（-）一對映體則藉以 0 · 04%氨溶液（2床量；流速0 . 8床量/小時）清洗而移出。使用濃硫酸將已用過之溶液及清洗液之p Η調整至 7 · 0，再將溶液施至XAD16樹脂（ 5 0m$ ;流速爲每小時1 · 4床量）上。繼而將此柱以蒸餾水清洗（ 2·5床量，流速爲每小時2床量），再使用丙酮；水1 :3 (流速爲每小時1 · 5床量）洗提出（一）一對映體〇將含有洗提部分之大多數（一）一對映體（4床量）本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八如見格（210X297公釐） -裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -34 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1222448 A7 ____ B7 五、發明説明（32 ) 於Buchi蒸發器上濃縮成小量，其後令之通過3號多孔澱土中予以過濾。再將此已過濾之溶液凍乾，即得1.2g 標題化合物，彼與實例4所得者相同。實例6 藥_片組成物 A ·下列組成物係藉將諸成分以聚乙烯基吡咯烷酮之水溶液濕粒化，再予乾燥及篩選，繼而加入硬脂酸鎂並予壓縮而製得。 mg/藥片 (a )有效成分 2 5 0 (b )乳糖 B · P · 2 10 (c)聚乙烯基吡咯烷酮B.P· 15 (d )澱粉乙醇酸鈉 2 0 (e )硬脂酸鎂 5 5 0 0 B·下列組成物係藉由直接壓縮而製得；乳糖乃具有直接壓縮之形式，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） « Λ—aaMi ϋ— —ϋ 111 11-1 I \J·ϋι 1 nn in-— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 了項再填古 -35 ~ 1222448 A7 B7 五、發明説明（33 ) mg /藥片有效成分 2 5 0 乳糖 1 4 5 Av i ce 1 10 0 硬脂酸鎂 5 5 0 0 C .(控釋性組成物）組成物係藉將下列成分以聚乙烯基吡咯烷酮之水溶液濕粒化，再予乾燥及篩選，繼而加入硬脂酸鎂並予壓縮而製得。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、-t 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 1222448 A7 B7五、發明説明（34 ) mg /藥片 (a )有效成分 5 0 0 (b)羥丙基甲基纖維素 (Methocel K4M Premium) 1 1 2 (c )乳糖 B · P · 5 3 (d )聚乙烯基吡咯烷酮B · P · 2 8 (e )硬脂酸鎂 7 7 0 0 實例7 膠囊組成物膠囊組成物係藉將下列成分混合，再填充至兩份式硬凝膠膠囊中而製得。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐）一 37 - 1222448 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ---------B7 五、發明説明（35 ) mg /膠囊有效成分 12 5 乳糖 7 2 · 5 A v i c e 1 5 0 硬脂酸鎂 2 . 5 2 5 0 實例R 1注射性組成物有效成分0 · 200 g 氫氧化鈉溶液，0 · 1M加至pH約達1 1 無菌水加至1 0m5 令有效成分懸浮於一些水（可予加溫）中，再使用氫氧化鈉溶液以調整pH至約11。而後加至指定量，再令之通過滅菌級之膜濾器中予以過濾至無菌1 Omj?玻璃瓶內，並以無菌封塞及密封器密封，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八料見格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 iH . -38 - 1222448 A7 _____B7 五、發明説明（36 ) 實例9 mg /坐藥有效成分 2 5 0 硬脂，Β · Ρ . 17 7 0 2 0 2 0 -裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製將五分之一之硬脂於45 °C之最大溫度下於含濕汽套之盤中熔化。另將有效成分通過2 0 0 篩中予以篩選，而後邊混合（使用髙速攪拌器）邊加至已熔化之基質中直至得到平滑之分散液爲止。一邊保持溫度於4 5 °C下，一邊將餘留之硬脂加至懸浮液中，再予攪拌以確定獲得均質混合物，繼而令整個懸浮液通過2 5 0 /zm不銹鋼篩中，再邊連續攪拌邊令之冷卻至4 0°C。在3 8°C至4 0°C 下，將2 · 02g之此混合物填入適當，2mj?塑模中。繼而令坐藥冷卻至室溫。實例1 0 生物活性抗病毒效力實例2化合物之抗病毒效力係測定其對抗下列細胞系

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）一 39 - 1222448 A7 B7五、發明説明（37 ) 中之三種Η I V — 1型及一種Η I V — 2型而得知。 JM細胞，由淋巴胚細胞白血病（被Η I V — 1型 GB 8感染）患者所衍出之半成熟Τ 一細胞系。 C8 1 6 6細胞，人類Τ 一類淋巴胚細胞系，被 HIV—1型RF所感染。 Μ 丁一 4細胞，人類Τ 一細胞白血球細胞系，被Η I V 一 1型R F所感染。 C ΕΜ細胞，人類丁一類淋巴胚細胞系，被Η I V — 1型RF及U455，或HIV— 2型ROD感染。 C8166，JM，及CEM細胞之抗病毒效力係藉測定對Syncytium形成之抑制作用（Tochikura et a 1 Virology, 164· 542-546)而Μ T — 4細胞則藉測定對甲臢轉換之抑制作用（Baba et al ： ( 1 987 ) Biochera Biop-hys Res Commun., 142· 128-134; Mossman (1983) J. I mraun Me th ; 6 5 . 55-57)得知，抗病毒效力亦藉分析於對映體之存在及缺乏下所合成之Η I V ρ 2 4抗原之量而得知。結果乃示於下列表1及2中：一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝- 、1Τ JI. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） -40 - 1222448

A

7 B 五、發明説明（38 )Μ_1 5 0%抗病毒效力（β g/m1) 分析甲腊 Syncytium形成之抑制作用細胞 MT - 4 CEM CEM CEM JM C8166 病毒(HIV-1) HIV-l RF HIV-2 _ HIV-1 RF HIV-1 U455 HIV-1GB8 HIV-1 RF ( + )—對映體 0. 28 0. 045 0. 07 0.006 0.03 0. 05 ㈠—對映體 0.20 0. 055 0. 04 0. 008 0.05 0.01 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規;^ ( 210X297公釐）一 41 一 1222448 A7 --^^^_ B7_ 五、發明説明（39 ) 表 2 HI V p24合成之抑制作用 HIV p24合成之50%抑制作用（Wg/ml) 細胞 C8166 JM ΜΤ-4 病毒 RF GB8 RF (+ ) —對映體 0.021 0.033 0.0008 (一）一對映體 0.016 0.016 0.0004 (請先閱讀背面之注意事 I# 項再填，裝-- 寫本頁)

、1T

h細朐盡件將實例2化合物，消旋化合物（BCH — 189 ;實例1 )及兩種對映體之5 0/5 0混合物以五種CD4細經濟部中央標準局員工消費合作社印製胞系測定：H9，】！^1，〇£]^，〇8166及11937 〇於9 6孔式微滴定培養皿中，將待測試之化合物由 l〇〇eg/mj^連續稀釋至〇· 3eg/m5 (最終濃度）。再將3 · 6xl 04個細胞接種至培養皿之每一孔 (包括不含藥物之對照組）中。於3 7°C下保溫5天後，移出細胞懸浮液樣品，再於血球計中計算排除錐虫質之細本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 42 - 1222448 A7 B7五、發明説明（40 ) 胞數而得知活存細胞數。結果乃示於表3中。 _裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 43 - 1222448 A7 B7 五、發明説明（41 表細胞毒性 5 0%細胞毒性（以/1111) 化合物 CEM細胞 JM細胞 H9細胞 U937細胞 C8166細胞 (+)-對映體 1 1.5 2 4 35 (一）一對映體 >100 30 >100 >100 >100 BCH-189 3 3.5 8 15 90 1:1對映體混合物 2.5 ND* ND ND ND ND =未測定 (請先閱讀背面之注意事 J· 項再填· I ϋϋ n —ϋ >1^—— —ϋ TJ ^^^1 mi、ν'口寫本貢) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（210X 297公釐） -44 -

Claims

1222448 ABCD ^hS 六、申請專利範圍附件2a I第8 8 1 067 6 ]號專利申請案中文申請專利範圍無劃線替換本民國9 3年5月25日修正 1 .—種用於治療Η I V感染之藥學組合物，包括：藥學可接受載體；化合物（-）—順式—4 一胺基-1 - (2 —羥甲基—1 ，3 —氧硫五圜—5 —基）—（1Η) k本頁) —嘧啶- 2 —酮或其藥學可接受鹽；及另一種選自2 / ， 3 / -二去氧核苷之治療劑。’ 2 .如申請專利範圍第1項之藥學組合物，其中該其他另一治療劑係選自A Ζ Τ，2 3 / -二去氧胞嘧啶核苷，2 /，3 < -二去氧腺嘌呤核苷，2 / ，3 / —二去氧次黃嘌呤核苷，2 /，3 / —二去氧胸腺嘧啶核苷， :2 / ，3 / —二去氧基一 2 /，3 / —二去氫基胸腺嘧啶核苷及2 / ，-二去氧基—2, / ，3/ —二去氫基胞嘧陡核苔。 3 .如申請專利範圍第1項之藥學組合物，其中該化合物爲（一）—順式—4 —胺基一 1— (2 —淫甲基一 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製，3 —氧硫五圜—5 -基）一（1 Η )—嘧啶一 2 —酮。 4 .如申請專利範圍第2項之藥學組合物，其中該化合物爲（-)—順式—4 —胺基一 1 — ( 2 —羥甲基—1 ，3 —氧硫五_ 一 5 -基）—（1 Η )—嘧啶一 2 —酮。 5 .如申請專利範圍第1項之藥學組合物：其中該組合物含有1 0 — 1 5 0 0 m g之該化合物。 t s( CNS ) AAjlMri 2\OX 297^t~) ~~— 1222448 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8、申請專利乾圍 6 .如申請專利範圍第2項之藥學組合物，其中該組合物含有1 0 - 1 500 mg之該化合物。 7 .如申請專利範圍第3項之藥學組合物，其中該組合物含有1 0 - 1 5 0 Omg之該化合物。 8 .如申請專利範圍第4項之藥學組合物，其中該組合物含有1 0 - 1 500 mg之該化合物。 9 .如申請專利範圍第1項之藥學組合物，其中該組合物含有2 0 — 1 0 0 0 m g之該化合物。 1 〇 .如申請專利範圍第‘ 1項之藥學組合物，其中該組合物含有5 0 - 7 0 Omg之該化合物。 1 1 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之藥學組合物，其中該另一治療劑爲A Z T。 1 2 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之藥學組合物，其中該另一治療劑爲2 /，3 / -二去氧胞嘧啶核甘0 1 3 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之藥學組合物，其中該另一治療劑爲2 /，3 / -二去氧腺嘌呤核 -4-1- 甘0 1 4 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之藥學組合物，其中該另一治療劑爲2 /，3 / -二去氧次黃嘌呤核普。 1 5 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之藥學組合物，其中該另一治療劑爲2 /，3 / -二去氧胸腺嘧啶核苷。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) 1222448 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1 6 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之藥學組合物，其中該另一治療劑爲2/ ，3/-二去氧基一2/ ，3 > -二去氫基胸腺嘧啶核苷。 1 7 。如申請專利範圍第1至8項中任一項之藥學組合物，其中該另一治療劑爲2 /，3 / -二去氧基一 2# ，3 / -二去氫基胞嘧啶核苷。 (請先閱讀背面之注意事本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3-