CZ288499B6

CZ288499B6 - (-)-Cis-4-amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-one intended for use as a medicament and pharmaceutical preparation containing thereof

Info

Publication number: CZ288499B6
Application number: CS19911251A
Authority: CZ
Inventors: Jonathan Alan Victor Coates; Ian Martin Mutton; Richard Storer; Christopher Williamson; Charles Richard Penn
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1991-04-30
Publication date: 2001-06-13
Also published as: CN1036196C; AP9100255A0; JPH05501117A; CA2059263A1; SK283430B6; EP1062950A3; TWI222448B; NO920018D0; CN1326743A; RU2099338C1; JPH1180153A; WO1991017159A1; JP2000128787A; FI916165A0; CS125191A3; AU651345B2; PT97520A; US20030004175A1; KR920702682A; FI111722B

Description

Oblast techniky

Vynález se týká (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-onu, jeho farmaceuticky přijatelné soli, esteru nebo soli tohoto esteru, pro použití jako léčivo. Dále se vynález týká farmaceutického prostředku s antivirovou účinností se sníženou cytotoxicitou, který obsahuje jako účinnou látku (-}-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-on nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ester nebo sůl tohoto esteru, a popřípadě další antivirové činidlo. Popisuje se rovněž použití výše uvedené sloučeniny k výrobě léčiva.

Dosavadní stav techniky

Je popsáno, že sloučenina vzorce I

(I) známá rovněž pod označením BCH-189 nebo NGPF-21, má protivirové účinky, zejména proti virům lidské imunodeficience (HTV), původcům AIDS (5^th Anti-Aids Convefence, Montreal, Kanada, 5. až 9. června 1989; Abstracts T.C.O.l a M.C.P. 63; zveřejněná evropská přihláška vynálezu č. 0382562). Sloučenina shora uvedeného vzorce I je racemickou směsí dvou enantiomerů níže uvedených vzorců 1-1 a 1-2

a byla popsána a testována ve formě racemátu. Jedinou sloučeninou, schválenou v současné době pro léčení stavů, způsobených HIV, je 3'-azido-3'-desoxythymidin (AZT, zidovudine, BW 509W). U této sloučeniny však existuje významné nebezpečí vedlejších účinků, a proto u značeného počtu pacientů buď nemůže být použita nebo po jejím použití může nastat nutnost vysazení. V důsledku toho existuje stálá potřeba sloučenin, která budou účinné proti HTV a současně budou mít významně lepší terapeutický index.

-1 CZ 288499 B6

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že enantiomery sloučeniny vzorce I jsou proti HIV stejně účinné, avšak jeden z nich, (-)-enantiomer (levotočivý), má značně nižší cytotoxicitu než druhý.

Tento (-)-enantiomer lze používat k léčení samotný nebo v kombinaci s dalšími antivirovými činidly.

V souladu s tím je předmětem vynálezu (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-on nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo sůl tohoto esteru pro použití k léčení.

Dále je předmětem vynálezu farmaceutický prostředek s antivirovou účinností se sníženou cytotoxicitou, který obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a jako účinnou látku (—)—cis—4— amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-on nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ester nebo sůl tohoto esteru a popřípadě další terapeutické (antivirové) činidlo, jak je definováno níže.

Výše uvedený (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2on je (-)-enantiomerem cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-onu a je dále označován jako sloučenina A. Má absolutní konfiguraci sloučeniny vzorce I1, kterou je možno nazvat jako (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)(1 H)-pyrimidin-2-on.

Výhodně se sloučenina A získává v podstatě prostá odpovídajícího (+)-enantiomeru, tedy ve formě, v níž je přítomno ne více než asi 5, výhodně ne více než asi 2 a ještě výhodněji méně než asi 1 % hmotnostní (+)-enantiomeru.

Mezi esteiy sloučeniny A patří sloučeniny, v nichž je vodík 2-hydroxymethylové skupiny

O

II nahrazen skupinou R-C-, kde R je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, přímé či rozvětvené alkylové skupiny s 1 až 16 atomy uhlíku (výhodně s 1 až 4 atomy uhlíku, jako je například methylová, ethylová, n-propylová, terc.butylová nebo n-butylová skupina, alkoxyalkylové skupiny s 1 až 16 atomy uhlíku v každé alkylové části (výhodně s 1 až 4 atomy uhlíku v každé alkylové části, jako je například methoxymethylová skupina), fenylalkylové skupiny s 1 až 16 atomy uhlíku v alkylové části (výhodně s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, jako je například benzylová skupina), popřípadě substituované halogenem, alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, nitroskupinou nebo trifluormethylovou skupinou, fenoxyalkylové skupiny s 1 až 16 atomy uhlíku v alkylové části (výhodně s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové Části, jako je například fenoxymethylová skupina) a fenylovou skupinu, popřípadě substituovanou halogenem, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, dále estery s alkylsulfonovými kyselinami s 1 až 16 atomy uhlíku nebo s fenylalkylsulfonovými kyselinami s 1 až 16 atomy uhlíku v alkylové části (jako například s kyselinou methansulfonovou), estery s aminokyselinami (například s L-valinem nebo L-izoleucinem) a mono-, di- nebo trifosfáty.

Výhodně se v případě esterů může jedna o alkylestery s 1 až 16 atomy uhlíku, nesubstituované benzylestery nebo benzylestery substituované alespoň jedním halogenem (bromem, chlorem, fluorem nebo jodem), alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, nitroskupinou nebo trifluormethylovou skupinou.

Mezi farmaceuticky přijatelné soli sloučeniny A patří soli odvozené od farmaceuticky přijatelných anorganických a organických kyselin a bází. Příklady vhodných kyselin zahrnují

-2CZ 288499 B6 kyselinu chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, dusičnou, chloristou, filmařovou, maleinovou, fosforečnou, glykolovou, mléčnou, salicylovou, jantarovou, toluen-p-sulfonovou, vinnou, octovou, citrónovou, methansulfonovou, mravenčí, benzoovou, jablečnou, naftalen-2sulfonovou a benzensulfonovou. Další kyseliny, jako je kyselina šťavelová, které nejsou samy farmaceuticky přijatelné, mohou být použity jako meziprodukty při získávání sloučeniny A a jejích farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinami.

Mez soli odvozené od vhodných bází patří soli s alkalickými kovy (například sodíkem), s kovy alkalických zemin (například hořčíkem), amonné soli a soli s iontem NR4⁺ (kde R je alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku).

Odkazy na sloučeniny podle vynálezu zde zahrnují jak sloučeninu A tak její farmaceuticky přijatelné soli, estery a soli těchto esterů.

Sloučeniny podle vynálezu buď samy mají protivirové účinky, nebo/a jsou na takové sloučeniny metabolizovatelné. Tyto sloučeniny jsou účinné zejména při inhibici replikace retrovirů, včetně lidských retrovirů, jako jsou viry lidské imunodeficience (HIV), původci AIDS.

Vynález se rovněž týká použití (-)-enantiomeru cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-onu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, esteru nebo soli tohoto esteru, v kombinaci s dalším antivirovým činidlem vybraným z 2',3'-dideoxynukleosidů, k výrobě léčiva se sníženou cytotoxicitou, k léčbě virových infekcí, přičemž zde uvedený (-)-enantiomer a uvedené další antivirové činidlo mohou být podávány postupně nebo současně.

Sloučeninu A lze použít rovněž ke snižování toxicity 2',3'-dideoxynukleosidu. Vynález se tudíž týká rovněž farmaceutického prostředku pro použití k léčení infekce HTV u pacienta, který obsahuje 2',3'-dideoxynukleosid v množství inhibujícím růst nebo replikaci HIV u tohoto pacienta, v kombinaci s (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)pyrimidin-2-onem nebo jeho farmaceuticky přijatelnou solí, v množství snižujícím toxicitu a také použití prostředku obsahujícího (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5yl)-(lH)-pyrimidin-2-on nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl a 2',3'-dideoxynukleosid k výrobě léčiva pro zmírnění toxicity spojené s podáváním 2',3'-dideoxynukleosidu.

Sloučeniny podle vynálezu jsou kromě léčení AIDS vhodné rovněž k léčení stavů příbuzných s AIDS, jako je „AIDS-related complex“ (ARC), progresivní generalizovaná lymfadenopatie (PGL), neurologické stavy, spojené s AIDS (jako je demence nebo tropická paraparesa), stavy pozitivní na protilátky proti HIV a HlV-pozitivní stavy, Kaposiho sarkom, thrombocytopenia purpuirea a přidružené oportunní infekce, například způsobené Pneumocystis carinii.

Sloučeniny podle vynálezu jsou vhodné rovněž k prevenci vývoje klinických příznaků u jedinců, kteří jsou pozitivní na protilátky proti HTV nebo pozitivní na antigen HTV a k profylaxi po expozici HTV.

Sloučeninu A nebo její farmaceuticky přijatelné soli, estery a soli těchto esterů je možno používat rovněž k prevenci virální kontaminace fyziologických tekutin, jako je krev nebo sperma, in vitro.

Odborníkovi je zřejmé, že odkazy na léčení je možno rozšířit na profylaxi, stejně jako na léčbu stabilizovaných infekcí nebo symptomů.

Dále je zřejmé, že množství sloučeniny podle vynálezu, potřebné k léčení, se mění nejen s konkrétní zvolenou sloučeninou, ale také podle způsobu podávání, povahy léčeného stavu a věku a stavu pacienta a konečné rozhodnutí závisí na úvaze ošetřujícího lékaře nebo veterináře. Obecně je vhodná dávka v rozmezí asi 0,1 až asi 750, výhodně 0,5 až 60 a přednostně 1 až 20 mg/kg/den.

-3CZ 288499 B6

Potřebná dávka může být vhodně podávána v jediné dávce nebo v rozdělených dávkách, podávaných v příslušných intervalech, například ve dvou, třech, čtyřech nebo více dávkách za den.

Sloučenina se výhodně podává v jednotkové dávkovači formě, například obsahující 10 až 1500, přednostně 20 až 1000 a zejména 50 až 700 mg účinné složky na jednotkovou dávku.

Ideálně se účinná látka dávkuje tak, aby bylo dosaženo maximální koncentrace účinné složky v plazmě asi 1 až asi 75, výhodně asi 2 až 50 a přednostně asi 3 až asi 30 μΜ. Toho je možno dosáhnout například intravenózními injekcemi 0,1 až 5% roztoku účinné látky, popřípadě v solném roztoku, nebo orálním podáváním bolusu, obsahujícího asi 1 až asi 100 mg účinné látky. Žádoucí koncentraci v krvi je možno udržovat kontinuální infúzí, asi 0,01 až asi 5,0 mg/kg/h nebo přerušovanými infúzemi, obsahujícími asi 0,4 až asi 15 mg/kg účinné látky.

Sloučeninu podle vynálezu je možno k terapeutickým účelům podávat i ve formě surové chemikálie, avšak výhodné je, je-li obsažena ve farmaceutickém prostředku.

Jak již bylo uvedeno výše, obsahuje farmaceutický prostředek podle vynálezu farmaceuticky přijatelný nosič, sloučeninu A nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, ester nebo sůl tohoto esteru, a popřípadě další terapeutické (antivirové) činidlo, jak je definováno níže. Nosič musí být „přijatelný“ ve smyslu kompatibility s ostatními složkami formulace a neškodnosti vůči příjemci.

Farmaceutické prostředky zahrnují formulace vhodné pro orální, rektální, nasální, místní /včetně bukální a sublingvální/, vaginální nebo parenterální /včetně intramuskulámí, subkutánní a intravenózní/ aplikaci nebo formulace ve formě vhodné pro aplikaci inhalací nebo insuflací. Je-li to vhodné, mohou být prostředky aplikovány v oddělených jednotkových dávkách a mohou být připravovány jakýmkoli způsobem, známým v oblasti farmacie. Všechny tyto způsoby zahrnují míšení účinné látky s kapalnými nosiči nebo jemně rozmělněnými pevnými nosiči nebo s oběma těmito typy, a pak, je-li to nutné, tvarování produktu do požadované formy.

Farmaceutické formulace, vhodné pro orální aplikaci, mohou být výhodně podávány v oddělených jednotkových dávkách, jako jsou kapsle, tobolky nebo tablety, obsahující stanovené množství účinné látky, ve formě prášku nebo granulí, ve formě roztoku, suspenze nebo emulze. Účinná látka může být dále podávána jako bolus, elektuarium nebo pasta. Tablety a kapsle pro orální aplikaci mohou obsahovat běžné excipienty, jako jsou pojivá, plniva, maziva, dezintegrační přísady nebo smáčedla. Tablety je možno povlékat známým způsobem. Orální kapalné přípravky mohou mít formu například vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, sirupů nebo elixírů nebo mohou být dodávány v suché formě pro naředění vodou nebo jiným vhodným vehikulem. Takovéto kapalné přípravky mohou obsahovat běžné přísady, jako jsou stabilizátory suspenze, emulgátory, nevodná vehikula /která mohou zahrnovat jedlé oleje/ nebo konzervační přísady.

Sloučeniny podle vynálezu je možno rovněž formulovat pro parenterální aplikaci /například injekční, jako je injekce bolusu, nebo kontinuální infúzi/ a mohou být dodávány v dávkovačích formách v ampulích, předplněných injekčních stříkačkách, maloobjemových infúzních nádobkách nebo v nádobách pro vícenásobné dávky s přídavkem konzervačního prostředku. Přípravky mohou mít formu suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejovém nebo vodném vehikulu, a mohou obsahovat formulační přísady, jako jsou stabilizátory suspenze, stabilizátory a/nebo dispergátory. Účinná složka může být také v práškové formě, získané aseptickou izolací sterilní pevné látky nebo lyofilizací z roztoku, která se před použitím ředí vhodným vehikulem, například sterilní apyrogenní vodou.

Pro místní aplikaci na pokožku mohou být sloučeniny podle vynálezu formulovány jako masti, krémy nebo lotiony nebo jako transdermální náplasti. Masti a krémy mohou být například

-4CZ 288499 B6 formulovány na vodné nebo olejové bázi s přídavkem vhodného zahušťovadla a/nebo želatinačního prostředku. Lotiony mohou být formulovány na vodné nebo olejové bázi a mohou obecně také obsahovat jeden nebo více emulgátorů, stabilizátorů, dispergátorů, stabilizátorů suspenze, zahušťovadel nebo barviv.

Formulace, vhodné pro místní aplikaci v ústní dutině, zahrnují pastilky, obsahující účinnou látku v aromatizovaném základu, obvykle sacharóze s akaciovou nebo tragantovou silicí, tablety, obsahující účinnou látku v inertním základu, jako je želatina a glycerin nebo sacharóza a akaciová silice, a ústní vody, obsahující účinnou látku a vhodný kapalný nosič.

Farmaceutické formulace, vhodné pro rektální aplikaci, kde nosičem je pevná látka, se nejvýhodněji dodávají jako čípky pro jednotkové dávky. Vhodné nosiče zahrnují kakaové máslo a další běžně používané látky, a čípky je možno výhodně vyrábět míšením účinné látky se změklým nebo roztaveným nosičem s následujícím chlazením a tvarováním ve formách.

Formulace, vhodné pro vaginální aplikaci, mohou mít formu pesarů, tamponů, krémů, želé, past, pěn nebo sprejů, obsahujících kromě účinné látky vhodný nosič.

Pro intranasální aplikaci je možno sloučeniny podle vynálezu používat ve formě kapalných sprejů nebo dispergovatelného prášku nebo ve formě kapek.

Kapky mohou být formulovány na vodné nebo nevodné bázi, a mohou dále obsahovat jeden nebo více dispergátorů, solubilizačních přísad nebo stabilizátorů suspenze. Kapalné spreje jsou výhodně aplikovány z tlakových obalů.

Pro aplikaci inhalací jsou sloučeniny podle vynálezu výhodně uvolňovány z insuflátoru, nebulizéru nebo tlakového obalu nebo jiného vhodného zařízení pro uvolňování aerosolových sprejů. Tlakové obaly mohou obsahovat vhodný hnací plyn (propelent), jako je dichlordifluormethan, trichlorfluormethan, dichlortetrafluorethan, oxid uhličitý nebo jiný vhodný plyn. V případě stlačeného aerosolu je možno dávkování zajistit pomocí ventilu uvolňujícího odměřené množství.

Pro inhalační nebo insuflační aplikaci mohou mít sloučeniny podle vynálezu rovněž formu suché práškové směsi, například směsi práškové sloučeniny a vhodné práškové báze, jako je laktóza nebo škrob. Práškové přípravky mohou být dodávány ve formě jednotkových dávek, například v kapslích nebo tobolkách nebo například v želatinových nebo puchýřkových obalech, z nichž může být prášek aplikován pomocí inhalátoru nebo insuflátoru.

Je-li to žádoucí, je možno výše popsané formulace používat ve formě, upravené k dlouhodobému uvolňování účinné látky.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou dále obsahovat antimikrobiální činidla nebo konzervační přísady.

Jak již bylo uvedeno výše, mohou farmaceutické prostředky podle vynálezu společně se sloučeninou A, její farmaceuticky přijatelnou solí, esterem nebo solí tohoto esteru, obsahovat další terapeutická činidla, konkrétně antivirová činidla.

Mezi vhodná další terapeutická činidla pro použití v těchto prostředcích patří acyklické nukleosidy, jako je acyclovir nebo ganciclovir, interferony, jako je α-, β- nebo γ-interferon, inhibitory renální exkrece, jako je probenecid, inhibitory transportu nukleosidů, jako je dipyridamol, 2',3'-dideoxynukleosidy, jako je AZT, 2',3'-dideoxycytidin, 2',3'-dideoxyadenosin, 2',3'-dideoxyinosin, 2',3'-dideoxythymidin, 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidin a 2',3'dideoxy-2',3'-didehydrocytidin, imunomodulátoiy, jako je interleukin II (IL2), a faktor stimulující koloně granulocytových makrofágů (GM-CSF), eiythropoetin, ampligen,

-5CZ 288499 B6 thymomodulin, thymopentin, foscamet, ribavirin a inhibitory HIV, vázající se na CD4 receptory, například rozpustní CD4, fragmenty CD4, hybridní molekuly CD4, inhibitory glykosylace, jako je 2-deoxy-D-glukóza, castanospermin a 1-deoxynojirimycin. Výhodnými dalšími terapeutickými činidly jsou 2',3'-dideoxynukleosidy, zejména AZT, 2',3'-dideoxycytidin, 2',3'dideoxyadenosin, 2',3'-dideoxyinosin, 2',3'-dideoxythymidin, 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidin a 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidin.

Sloučeninu A nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, ester nebo sůl tohoto esteru, a uvedené další terapeutické činidlo, je možné podávat buď postupně nebo současně ve formě kombinovaného farmaceutického prostředku.

Pokud se sloučenina A nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo sůl tohoto esteru používá v kombinaci s dalším terapeutickým činidlem které je účinné proti témuž viru, může být dávka každé ze sloučenin stejná nebo odlišná od dávky, v níž je sloučenina používána samotná. Příslušné dávky snadno určí odborník.

Sloučeninu A a její farmaceuticky přijatelné soli, estery a soli těchto esterů je možno připravovat kterýmkoli známým způsobem pro přípravu sloučenin analogické struktury, například podle zveřejněné evropské přihlášky č. 0 382 562.

Je zřejmé, že při použití někteiých z dále uvedených metod je možno požadované konfigurace sloučeniny A dosáhnout buď tak, že se vychází z opticky čisté výchozí látky, nebo rozštěpením racemické směsi v kterémkoli vhodném stupni syntézy. V případě všech postupů je možno požadovaný opticky čistý produkt získat rozštěpením konečného produktu každé reakce.

Postupem /A/ se 1,3-oxathiolan vzorce VIII

/VIII/, kde anomemí skupina L představuje odštěpitelnou skupinu, nechá reagovat s příslušnou bází. Vhodné skupiny L zahrnují skupiny vzorce -OR, kde R je alkylová skupina, například alkylová skupina s 1 až 6 uhlíkovými atomy, jako je methyl, nebo acylová skupina, například alkanoylová skupina s 1 až 6 uhlíkovými atomy, jako je acetyl, nebo halogen, například jod, brom nebo chlor.

Sloučenina vzorce VIII se výhodně nechá reagovat s cytosinem nebo příslušnou pyrimidinovou bází, která je jeho prekurzorem /v silylované formě působení silylačního činidla, jako je hexamethyldisilazan/, v kompatibilním rozpouštědle, jako je methylenchlorid, s použitím Lewisovy báze, jako je chlorid titaničitý, cíničité sloučeniny, jako je SnCl₄, nebo trimethylsilyltriflátu.

1,3-oxathiolany vzorce VIII je možno připravovat například reakcí aldehydu vzorce VII s merkaptoacetátem vzorce VI v kompatibilním organickém rozpouštědle, jako je toluen, v přítomnosti kyselého katalyzátoru, například Lewisovy kyseliny, jako je chlorid zinečnatý.

HSCH₂CH/OC₂H₅/₂ /VI/,

C₆H₅CO₂CH₂CHO /VII/,

Merkaptoacetáty vzorce Vije možno připravovat známými způsoby, například podle G. Hesse a I. Jordera, Chem. Ber. 85,924-932 /1952/.

-6CZ 288499 B6

Aldehydy vzorce VII je možno připravovat známými způsoby, například podle E. G. Halloquista a H. Hibberta, Can. J. Research 8, 129-136 /1933/. Surový aldehyd vzorce Vlije možno výhodně přečistit převedením na krystalický adukt s bisulfitem a zpětnou konverzí na volný aldehyd.

Druhým postupem /B/ se sloučenina A získá ze sloučeniny vzorce IX

/IX/, kde B je báze, přeměnitelná na cytosin, vzájemnou přeměnou bází. Takovou přeměnu lze uskutečnit buď prostou chemickou transformací /například přeměnou uracilu na cytosin/, nebo enzymatickou přeměnou s použitím deoxyribosyl-transferázy. Metody a podmínky vzájemné přeměny bází jsou v oblasti nukleosidové chemie známy.

Třetím postupem /C/je možno sloučeninu vzorce XI

nh₂ /XI/, převést na sloučeninu A konverzí anomemí skupiny NH2 na cytosin metodami známými v chemii nukleosidů.

Mnohé z výše popsaných reakcí jsou podrobně zmiňovány v souvislosti se syntézou nukleosidů, například vNucleoside Analogs - Chemistry, Biology and Medical Applications, vyd. R. T. Walker a d., Plenům Press, New York /1979/, 165-192, T. Ueda v Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, sv. I, vyd. L. B. Townsend, Plenům Press, New York /1988/, 165-192.

Je zřejmé, že výše uvedené reakce mohou vyžadovat nebo být výhodně aplikovány na výchozí látky s chráněnými funkčními skupinami, a k získání požadované sloučeniny pak může nastat nutnost odstranění chránících skupin jako mezistupně nebo finálního kroku. Navázání a odstranění chránících skupin je možno provádět běžným způsobem. Například aminoskupiny je možno chránit skupinou, zvolenou ze souboru zahrnujícího aralkyl /například benzyl/, acyl, aryl /například 2,4-dinitrofenyl/ nebo silyl; odstranění chránící skupiny se pak popřípadě provádí hydrolýzou, resp. hydrogenolýzou za standardních podmínek. Hydroxylové skupiny je možno chránit kteroukoli chránící skupinou, běžnou pro tento účel, například skupinami popsanými vProtective Groups in Organic Chemistiy, vyd. J. F. W. McOmie, Plenům Press /1973/, nebo vProtective Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene, John Wiley and Sons /1981/. Příklady vhodných chránících skupin pro hydroxyl zahrnují skupiny, zvolené ze souboru obsahujícího alkyl /například methyl, terc.butyl nebo methoxymethyl/, aralkyl /například benzyl, difenylmethyl nebo trifenylmethyl/, heterocyklické skupiny, jako je tetrahydropyranyl, acyl /například acetyl nebo benzoyl/ a silylové skupiny, jako je trialkylsilyl /například terc.butyldimethylsilyl/. Tyto skupiny je možno odstraňovat běžnými metodami. Například alkylové, silylové, acylové a heterocyklické skupiny je možno odstraňovat solvolýzou, například hydrolýzou za kyselých nebo zásaditých podmínek. Aralkylové skupiny, jako je trifenylmethyl, je rovněž možno odstraňovat solvolýzou, například kyselou hydrolýzou. Aralkylové skupiny, jako je benzyl, je možno odštěpit například působením BF₃-etherátu v acetanhydridu, načež se ve vhodném stupni syntézy odstraní takto vzniklé acetátové skupiny. Silylové skupiny je možno

-7CZ 288499 B6 výhodně rovněž odstranit použitím zdroje fluoridových iontů, jako je tetra-nbutylamoniumfluorid.

Výše uvedeným postupem se sloučenina A obvykle získává ve formě směsi cis a trans izomeru, v níž je požadovanou sloučeninou cis izomer.

Tyto izomery je možno rozdělit fyzikálními prostředky, například chromatografií na silikagelu nebo frakční krystalizací, buď přímo nebo přes jejich vhodné deriváty, například acetáty /připravené například reakcí s acetanhydridem/, které se po rozdělení převedou zpět na původní produkty /například deacetylací methanolickým amoniakem/.

Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin podle vynálezu je možno připravit podle US 4 383 114. Například jestliže se požaduje adiční sůl sloučeniny A s kyselinou, je možno produkt kteréhokoli z výše popsaných postupů převést na sůl reakcí získané volné báze s vhodnou kyselinou běžným způsobem. Farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami je možno připravit reakcí volné báze s příslušnou kyselinou, popřípadě v přítomnosti vhodného rozpouštědla, jako je ester /například ethylacetát/ nebo alkohol /například methanol, ethanol nebo izopropylalkohol/. Soli s anorganickými bázemi je možno připravit reakcí původní sloučeniny s vhodnou bází, jako je alkoxid /například methoxid sodný/, popřípadě v přítomnosti rozpouštědla, jako je alkohol /například methanol/. Farmaceuticky přijatelné soli je možno rovněž připravovat běžnými metodami z jiných solí, včetně jiných farmaceuticky přijatelných solí, sloučeniny A.

Sloučeninu A je možno převést na farmaceuticky přijatelný fosfát nebo jiný ester reakcí s fosforylačním činidlem, jako je oxychlorid fosforitý POC1₃, nebo vhodným esterifikačním činidlem, jako je halogenid, resp. anhydrid kyseliny. Ester nebo sůl sloučeniny A je možno na původní sloučeninu převést například hydrolýzou.

Dělení finálního produktu, meziproduktu nebo příslušné výchozí látky je možno provádět kteroukoli vhodnou známou metodou; viz například Stereochemistry of Carbon Compounds, E. L. Eliel, McGrew Hill /1962/, a Tables of Resolving Agents, S. H. Wilen.

Sloučeninu A je tedy možno získat například pomocí chirální vysokoůčinné chromatografie /HPLC/ s použitím vhodné stacionární fáze, například acetylovaného beta-cyklodextrinu nebo triacetátu celulózy, a vhodného rozpouštědla, například alkoholu, jako je ethanol nebo vodný roztok například triethylamoniumacetátu. Jinou možností dělení je enzymaticky zprostředkovaný enantioselektivní ketabolismus s vhodným enzymem, jako je cytidin-deamináza, nebo selektivní enzymatická degradace vhodného derivátu pomocí 5'-enukleotidázy. Provádí-li se štěpení enzymaticky, je možno enzym používat buď v roztoku nebo výhodněji v imobilizované formě. Enzymy mohou být imobilizovány kterýmkoli známým způsobem, například adsorpcí na pryskyřici, jako je Eupergit C.

Příklady provedení vynálezu

Meziprodukt 1

5-methoxy-l,3-oxathiolan-2-methanolbenzoát

K míchanému roztoku 34,2 g merkaptoacetaldehyddimethylacetalu a 48,3 g benzoyloxyacetaldehydu ve 1300 ml toluenu se přidá roztok 1,6 g chloridu zinečnatého v 15 ml horkého methanolu a směs se 30 min zahřívá v dusíkové atmosféře kvaru pod zpětným chladičem. Ochlazená směs se zahustí, zředí malým množstvím toluenu a přefiltruje přes křemelinu. Spojené filtráty s toluenem se promyjí dvakrát nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a pak solným roztokem, suší nad síranem hořečnatým a pak se odpaří za vzniku oleje, který se

-8CZ 288499 B6 podrobí sloupcové chromatografií na 2 kg silikagelu /Měrek 9385/ s elucí chloroformem, čímž se získá 45,1 g titulní sloučeniny ve formě oleje, který je směsí anomerů přibližně 1:1.

'HNMR/DMSO-de/SJ-S^MH/, 3,42/ÓH/, 4,4-4,6/4H/, 5,41/H/, 5,46/lH/, 5,54/lH/, 5,63/lH/,

7.46/4H/, 7,58/2H/, 8,07/4H/, γ max /CHBr₃/1717,6 cm’¹.

Meziprodukt 2 /+/-cis-l-/2-benzoyloxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2,4-dion

Směs 9,62 g jemně mletého uracilu, 50 ml hexamethyldisilazanu a 30 mg síranu amonného se v dusíkové atmosféře zahřívá k varu pod zpětným chladičem do získání čirého roztoku. Pak se ochladí a odpaří na bezbarvý olej, který se v dusíkové atmosféře rozpustí ve 100 ml acetonitrilu. Roztok se přidá k míchanému a ledem chlazenému roztoku 19,43 g 5-methoxy-l ,3-oxathiolan2-methanolbenzoátu /meziprodukt 1/ v 600 ml acetonitrilu a přidá se 14,7 ml trimethylsilyltrifluormethansulfonátu. Ledová lázeň se odstraní a roztok se zahřívá pod dusíkem 45 min k varu pod zpětným chladičem. Po ochlazení a odpaření se zbytek přečistí sloupcovou chromatografií na 1 kg silikagelu /Měrek 9385/ se směsí 9 dílů chloroformu a 1 dílu methanolu jako elučním činidlem. Z příslušných frakcí se ochlazením a odpařením získá surový zbytek. Tento zbytek se podrobí frakční krystalizaci z minimálního množství /cca 1200 ml/ horkého methanolu a získá se 6,32 g titulní sloučeniny ve formě bílých krystalů.

’H NMR /dfiDMSO/ δ 11,36 /IH, bs/, 7,50-8,00 /6H, m/, 6,20 /IH, t/, 5,46 /2H, m/, 4,62 /2H, m/, 3,48 /IH, m/, 3,25/IH, m/.

Meziprodukt 3 /±/-cis-4-amino-l-/2-benzoyloxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-on

Metoda /a/

Suspenze 20,705 g cytosinu a několika mg síranu amonného ve 110 ml hexamethyldisilazanu se smíchá a 2,5 h zahřívá v dusíkové atmosféře k varu pod zpětným chladičem. Po odpaření rozpouštědla se zbylá pevná látka rozpustí ve 350 ml suchého acetonitrilu. Tento roztok se s použitím techniky pružné jehly převede pod dusíkem do míchaného a ledem chlazeného roztoku 43,57 g 5-methoxy-l,3-oxathiolan-2-methanolbenzoátu /meziprodukt/ v 650 ml acetonitrilu. Přidá se 33 ml trimethylsilyltrifluormethansulfonátu, roztok se nechá v průběhu 1,5 h ohřát na teplotu místnosti a pak se přes noc zahřívá k varu pod zpětným chladičem. Zbylá směs se zahustí, zředí 500 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a pak extrahuje 3 x 500 ml ethylacetátu. Spojené extrakty se promyjí 2 x 250 ml vody a pak 250 ml solného roztoku, suší nad síranem hořečnatým, pak odpaří na pěnu, která se podrobí sloupcové chromatografií na 600 g siliky /Měrek 7734/ se směsí ethylacetátu a methanolu jako elučním činidlem, čímž se získá 31,59 g směsi anomerů cca 1:1. Směs se překrystaluje ze 45 ml vody a 9,0 ml ethanolu za vzniku 10,23 g pevné látky, která se překiystaluje ze 120 ml ethanolu a 30 ml vody, čímž se získá 9,26 g titulního produktu ve formě bílé pevné látky.

Xmax /MeOH/ 229,4 mm /E^1%lcm 610/, 272,4 mm /E^1%lcm 293/, ‘H NMR /DMSO dd δ 3,14 /IH/, 3,50 /IH/, 4,07 /2H/, 5,52 /1H/, 5,66 /IH/, 6,28 /IH/, 7,22 /2H/, 7,56 /2H/, 7,72 /2H/, 8,10 /2H/.

Metoda /b/

7,0 ml oxychloridu fosforu se přikape k míchané a ledem chlazené suspenzi 11,65 g 1,2,4triazolu ve 120 ml acetonitrilu a pak se za udržování vnitřní teploty pod 15 °C přikape 22,7 ml triethylaminu. Po 10 min se pomalu přidá roztok 6,27 g /±/-cis-l-/2-benzoyloxymethyl-l,3-9CZ 288499 B6 oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidinr-2,4-dionu /meziprodukt 2/ ve 330 ml acetonitrilu. V míchání se pokračuje přes noc při teplotě místnosti. Pak se směs ochladí ledovou lázní, pomalu se přidá 30 ml triethylaminu a pak 21 ml vody. Získaný roztok se odpaří a zbytek se rozdělí mezi 400 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 3 x 200 ml chloroformu. Spojené chloroformové extrakty se suší nad síranem hořečnatým, přefiltrují a odpaří za vzniku 9,7 g surového zbytku. Zbytek se rozpustí v 240 ml 1,4-dioxanu a přidá se 50 ml koncentrovaného vodného roztoku amoniaku o specifické hmotnosti 0,880. Po 1,5 h se roztok odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu. Tím dojde k vysrážení pevné látky, která se odfiltruje. Matečné louhy se čistí sloupcovou chromatografií na 600 g silikagelu /Měrek 9385/. Shromáždí se příslušné frakce a odpaří za vzniku 2,18 g titulní sloučeniny jako světle hnědé pevné látky, identické s látkou, získanou metodou /a/.

Příklad 1 /±/-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-on

Suspenze 8,19 g cis-4-amino-l-/2-benzoyloxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin2-onu /meziprodukt 3/ a 8,24 g pryskyřice Amberlite IRA-400 /OH/ ve 250 ml methanolu se 1,25 g míchá a zahřívá k varu pod zpětným chladičem. Pak se odfiltruje pevný podíl a promyje methanolem. Spojené filtráty se odpaří. Zbytek se trituruje s 80 ml ethylacetátu. Filtrací se získá 5,09 g titulního produktu ve formě bílé pevné látky.

’H NMR /DMSO-de/ 3,04 /1H/, 3,40 /1H/, 3,73 /2H/, 5,18 /1H/, 5,29 /1H/, 5,73 /1H/, 6,21 /1H/, 7,19/2H/, 7,81/1H/.

Příklad 2

Dělení enantiomerů /±/-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l ,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu pomocí chirální HPLC /A/ 25 mg racemického produktu z příkladu 1 se podrobí preparativní HPLC za těchto podmínek:

sloupec: triacetát celulózy Měrek Hibar, 250 x 10 mm, 10 pm eluční činidlo: ethanol průtok: 3 ml/min detekce: UV, 270 nm teplota: místnosti

Odpařením příslušných frakcí se získá 6,8 mg, tj. cca 100%, (-)-cis-4-amino-l-/2hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu a 3,6 mg, tj. cca 80% (+)-cis-4amino-l-/2-hydroxymethyl-l ,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu.

/B/ 26 mg racemického produktu z příkladu 1 se podrobí preparativní HPLC za těchto podmínek:

sloupec: ASTEC eyelobond I acetyl, 250 x 4,6 mm eluční činidlo: 0,2% triethylamoniumacetát /připravený přídavkem ledové kyseliny octové k

0,2 % triethylaminu ve vodě do konečného pH 7,2/ průtok: 2 ml/min detekce: UV, 300 nm teplota: místnosti

Odpařením příslušných frakcí se získá 25 mg surového (-)-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyll,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu a 17 mg surového (+)-cis-4-amino-l-/2-hydroxy-10CZ 288499 B6 methyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu. Tyto frakce se odděleně podrobí opakované preparativní HPLC za těchto podmínek:

sloupec:	ASTEC eyelobond I acetyl, 250 x 4,6 mm
eluční činidlo:	15mM octan amonný, pH 6,8
průtok:	0,5 ml/min
detekce:	UV, 300 nm
teplota:	5 °C

Odpařením příslušných frakcí se získá 5,0 mg, tj. cca 91 %, (-)-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu a 7,6 mg, tj. cca 96 %, (+)-cis-4-aminol-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/IH/-pyrimidin-2-onu.

Příklad 3 /—/—cis—4—amino-1 -/2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl/-/1 H/-pyrimidin-2-on /i/ /±/-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidinon-dihydrogenfosfát ve formě amonné soli

Na chladnou míchanou suspenzi 1,00 g /±/-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu /příklad 1/ ve 20 ml suchého trimethylfosfátu o teplotě 0 °C se působí 2,44 ml oxychloridu fosforitého, směs se míchá 35 min při 0 °C a pak se rychle ochladí 60 g směsi ledu a vody. U chladné směsi se upraví pH na hodnotu 2,5 přídavkem vodného IN hydroxidu sodného a pak se směs uvede na sloupec 10 g aktivního uhlí /DARCO/ a eluuje nejprve vodou a pak směsí ethanolu a vodného amoniaku. Frakce, obsahující surový monofosfát, se spojí a zahustí. Získaný roztok se uvede do kolony, obsahující 25 g DEAE Sephadexu A-25 /HCO₃- forma/. Eluuje se s gradientem 120 ml vody až 240 ml 0,lM NH4HCO3 a pak 120 ml 0,2M NILHCOj, 240 ml 0,3M NH4HCO3 a 400 ml 4M NH4HCO3. Příslušné frakce se spojí a zahustí. Zbylý roztok se zředí 40 ml vody a lyofilizuje, čímž se získá 1,37 g titulního produktu ve formě bílé pevné látky.

Xmax /pufř o pH 6/: 271,0 nm /E^{1 %}j _cm 190/.

’H NMR /D20/: δ 3,23 /1H/, 3,55 /1H/, 4,(M,2 /2H/, 5,43 /1H/, 6,07 /1H/, 6,33 /1H/, 8,08 /1H/.

/ii/ (-)-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-on a (+)cís-4-amino-1 -/2-hydroxymethy 1-1,3-oxathiolan-5-y 1/-/1 H/-pyrimidin-2-on

K roztoku 1,35 g amonné soli /±/-cis-4-amino-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/pyrimidin-2-on-6'-dihydrogenfosfátu ve 30 ml tlumivého roztoku, připraveného z 526 mg glycinu a 190 mg chloridu hořečnatého ve 100 ml vody, se přidá 60 mg /17jedn./mg/ 5nukleotidázy z venomu crotalus atrox [EC 3.1.3.5] a směs se inkubuje 2,5 g při 37 °C. Přidá se dalších 20 mg enzymu a inkubuje se dalších 3,5 h. Získaná směs se uvede na sloupec DEAE Sephadexu A-25 /HCO₃-forma/. Eluuje se 160 ml vody a pak po 200 ml 0,1, 0,2, 0,3 a 0,4M NH4HCO₃. Příslušné frakce, obsahující první eluovanou složku, se spojí a odpaří, zbytek se podrobí sloupcové chromatografii na 60 g siliky /Měrek 7734/ se směsí chloroformu a methanolu jako elučním činidlem. Odpařením příslušných frakcí ze směsi methanolu a ethylacetátu se získá 0,30 g (+)-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu ve formě bílé pevné látky.

[a]_D ²¹ + 137° /c 1,04 MeOH/.

*HNMR /DMSO/ δ 3,04 /1H/, 3,40 /1H/, 3,73 /2H/, 5,18 /1H/, 5,29 /1H/, 5,73 /1H/, 6,21 /1H/, 7,19/2H/, 7,81/1H/.

-11CZ 288499 B6

Příslušné frakce ze sloupce Sephadexu, obsahující druhou eluovanou složku, se spojí a odpaří. Zbytek se rozpustí ve 30 ml vody, přidá se 1,5 ml /416 jedn./ml/ alkalické fosfatázy z Escherichia coli [EC 3.1.3.1] a směs se inkubuje 1 h při 37 °C. Pak se odpaří rozpouštědlo a zbytek se podrobí sloupcové chromatografií na 60 g siliky /Měrek 7734/ se směsí chloroformu a methanolu jako elučním činidlem. Odpařením příslušných frakcí ze směsi methanolu a ethylacetátu se získá 0,32 g (-)-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-onu ve formě bílé pevné látky.

[a]_D ²¹-132°/c 1,08, MeOH/.

'H NMR /DMSO/ δ 3,04 /1H/, 3,40 /1H/, 3,73 /2H/, 5,18 /1H/, 5,29 /1H/, 5,73 /1H/, 6,21 /1H/, 7,19/2H/, 7,81/1H/.

Příklad 4 /-/-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-on /i/ Každá ze tří baněk se živnou půdou /Oxoid Ltd/ se inokuluje očkem Escherichia coli /ATCC 23848/, seškrábnutým z plotny s agarovou živnou půdou. Baňky se inkubují přes noc při 37 °C s třepáním rychlostí 250 otáček za minutu a pak se každá baňka použije k inokulaci 4 1 média CDD /3 g/1 kyseliny glutamové, 0,2 g/1 MgSO₄, 2,5 g/1 K₂SO₄, 2,3 g/1 NaCl, 1,1 g/1 Na₂HPO₄.2H₂O, 0,6 g/1 NaH₂PO₄.2H₂O, 1,2 g/1 cytidinu/ v sedmilitrovém fermentoru. Kultury se fermentují při 37 °C, 750 otáčkách za minutu a s aerací 4 1/min. Po 24 h kultivace se odstředěním při 5000 g po dobu 30 min získá 72 g vlhkých buněk. Získaná peleta se suspenduje ve 300 ml 20mM tris-HCl pufru o pH 7,5 a rozruší působením ultrazvuku 4 x po 45 s. Buněčné stěny se odstředí při 30000 g po dobu 30 min a protein v supematantu se vysráží přídavkem síranu amonného do 75 % nasycení. Sraženina se odstředí při 30000 g po dobu 30 min a suspenduje ve 25 ml lOOmM pufru HEPES o pH 7,0, obsahujícího síran amonný do 75 % nasycení. Roztok enzymu se připraví odstředěním při 12000 otáčkách za minutu po dobu 30 min. Supematant se odstraní a peleta se rozpustí ve lOOmM tris-HCl pufru o pH 7,0 na původní objem.

/ii/ 115 mg produktu příkladu 1 se rozpustí ve 100 ml vody a míchá. Přidá se 0,05 ml roztoku enzymu a směs se udržuje na konstantním pH stálým přídavkem 25mM kyseliny chlorovodíkové. Konverze se sleduje chirální HPLC, která ukazuje, že přednostně je v substrátu deaminován /+/enantiomer. Po 22 h je /+/-enantiomer /retenční čas, RT 12,5 min/ ze substrátu zcela odstraněn a pH roztoku se upraví na 10,5 přídavkem koncentrovaného hydroxidu sodného.

Takto připravený roztok se uvede na sloupec 30 x 1,6 cm QAE Sephadexu /A25, Pharmacia/, preekvilibrovaný na pHll. Sloupec se promyje 200ml vody a pak 0,lM kyselinou chlorovodíkovou. Odebírají se frakce po 40 ml a analyzují HPLC s reverzními fázemi. Frakce 5 až 13, obsahující nezreagovaný /-/-enantiomer substrátu, se spojí a kyselinou chlorovodíkovou upraví na pH 7,5. Frakce 47, obsahující deaminovaný produkt, se zředěným hydroxidem sodným upraví na pH 7,5. Analýza chirální HPLC ukazuje, že tato látka je směsí, kde jeden enantiomer /RT 10,2 min/je hlavní složkou /tj. tvoří asi 90 %/ a druhý enantiomer /RT 8,5 min/je vedlejší složkou.

/iii/ Stupeň /ii/ se opakuje ve větším měřítku. 363 mg sloučeniny podle příkladu 1 ve 250 ml vody se inkubuje s 0,5 ml roztoku enzymu, připraveného podle stupně /i/. Další alikvotní díly 0,5 ml enzymu se přidají po 18 a 47 h. Reakční směs se míchá 70 h, pak se ponechá 64 g stát. Analýza chirální HPLC ukazuje, že /+/-enantiomer substrátu je kompletně deaminován. Získaný roztok se hydroxidem sodným upraví na pH 10,5.

Tento roztok se uvede na stejný sloupec QAE a eluuje jako ve stupni /i/. Frakce 2 až 6, obsahující směs zbylého substrátu a deaminovaného produktu, se spojí. Frakce 7 až 13, obsahující zbylý

-12CZ 288499 B6 substrát, tj. /-/-enantiomer, se spojí a upraví na pH 7,5. Frakce 25 až 26, obsahující deaminovaný produkt, se spojí a zneutralizují.

Frakce 2 až 6 se znovu uvedenou na stejný sloupec. Frakce 3 až 11 z tohoto druhého průchodu obsahují nezreagovaný substrát, tj. /-/-enantiomer. Frakce 70 obsahuje deaminovaný produkt.

/iv/ Rozštěpené frakce substrátu ze stupňů /ii/ a /iii/ se spojí a upraví na pH 7,5. Tento roztok se uvede do kolony XAD-16 40 x 2,4 cm, plněné vodou. Kolona se promyje vodou a pak eluuje směsí 1 objemového dílu acetonu a 4 objemových dílů vody. Frakce, obsahující /-/-enantiomer o BCH 189, se spojí a lyofilizují, čímž se získá 190 mg bílého prášku.

V příkladech jsou použity tyto chromatografické metody:

1. Analytická HPLC s reverzními fázemi

kolona	Capital Cartridge Spherisorb ODS-2 /5 pm/
eluent	50mM dihydrogenfosforečnan amonný + 5% MeCn
průtok	1,5 ml/min
detekce	UV, 270 nm
retenční časy	BCH 189 deaminovaný BCH-189	5,5 min 8,1 min
2. Chirální analytická HPLC
kolona	Cyclobond I Acetyl 250 x 4,6 mm
eluent	0,2% triethylamoniumacetát /pH 7,2/
průtok	1,0 ml/min
detekce	UV, 270 nm
retenční časy	BCH 189 deaminovaný BCH-189	11,0 a 12,5 min 8,5 a 10,2 min

/Po biokonverzi se sleduje úbytek píku při 12,5 min a akumulace produktu při 10,2 min/.

Příklad 5 /-/-cis-4-amino-l-/2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl/-/lH/-pyrimidin-2-on

Očka B buněk E. coli /ATCC 23848/, seškrábnutých z dobře narostlé agarové plotny, se použijí k inokulaci dvou florentských baněk, obsahujících po 250 ml živné půdy. Kultura se inkubuje při 37 °C za třepání po dobu 18 h při 250 otáčkách za minutu a výchylce 5 cm. Touto kulturou se pak inokuluje 40 1 média CDD s cytidinem v 701 fermentoru.

Fermentace se provádí za těchto podmínek: aerace 40 1/min, míchání 750 otáček za minutu, teplota 37 °C. K fermentoru se připevní tři rychloběžná míchadla Rushton. Fermentace probíhá 18 h a odběr se provádí kontinuální odstředivkou Sharpless. Buněčná pasta o čisté hmotnosti 150 g se před rozrušením buněk zmrazí na -20 °C.

-13CZ 288499 B6 médium CDD

	g/1
kyselina L-glutamová	3
MgSO₄	0,2
K₂SO₄	2,5
NaCl	2,3
Na₂HPO₄	Li
NaH₂PO₄	0,6

Doplní se destilovanou vodou. Sterilizuje se 30 min při 121 °C. Před inokulací se přidá 1,2 g/1 cytidinu, sterilizovaného filtrací.

150 g zmrazené buněčné pasty se nechá roztát a suspenduje se v 750 ml lOOmM HEPES /N-[2hydroxymethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonová kyselina]/ pufru o pH 7,5, obsahujícím lmM ethylendiamintetraoctovou kyselinu /sodnou sůl/ a lmM dithithreitol /pufr/. Buňky se rozruší průchodem suspenze Manton-Gaulinovým homogenizátorem, pracujícím s tlakem 51,7 MPa. Tato operace se provádí třikrát a po každém průchodu homogenizátorem se suspenze ochladí na přibližně 5 °C. Homogenizát se vyčeří odstředěním při 1400 g po dobu 60 min. Cytidindeaminázová aktivita se adsorbuje na sloupec Q-Sepharosy /objem lože 490 mg/, preekvilibrovaný 50mM tris/hydroxymethyl/methylaminem o pH 7,5, obsahujícím lmM chlorid sodný. 210 ml spojených aktivních frakcí se nanese na sloupec fenyl-Sepharosy /objem lože 490 mg/, preekvilibrovaný zásobním pufrem, obsahujícím 3,2M síran amonný. Navázaný enzym se eluuje gradientem klesající koncentrace síranu amonného. Shromáždí se 695 ml frakcí, obsahujících cytidin-deaminázovou aktivitu, a částečně přečištěný enzym se vysráží 80% síranem amonným. Po odstředění při 1400g po dobu 60min se peleta resuspenduje v 54ml supematantu zvýše uvedené operace a uchovává při 4 °C.

6,2 ml tohoto roztoku se odstředí při 18000 g po dobu 90 min a peleta se rozpustí v 24 ml pufru, obsahujícím 0,5 M fosforečnan draselný o pH 7,5. Suspenze se dialyzuje přes noc proti pufru na bázi 1M fosforečnanu draselného o pH 7,5. 20 ml retentátu se pak zředí stejným objemem destilované vody. K 35 ml tohoto roztoku se přidá 1 g suchých perliček Eupergit C a směs se nechá stát při teplotě místnosti 150 až 300 h /stanoveno měřením reziduální cytidin-deaminázové aktivity v roztoku/. Imobilizovaný enzym se promyje lOOmM tris/HCL pufrem o pH 7,0, obsahujícím 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5M NaCl a 500 ppm ethylesteru kyseliny phydroxybenzoové /zásobní pufr/. Imobilizovaný enzym o čisté hmotnosti 2,7 g se v tomto pufru uchovává při 4 °C až do použití k biotransformaci.

g produktu příkladu 1 se rozpustí v 500 ml destilované vody v 11 baňce s magnetickým míchadlem. Biokonverze se provádí při 32 °C v pH-statu. pH se udržuje na konstantní hodnotě 7,0 přidáváním 1M kyseliny octové, 1 g vlhkých perliček s mobilizovaným enzymem se před započetím reakce promyje destilovanou vodou. Konverze se sleduje chirální HPLC, která ukazuje, že je přednostně deaminován /+/-enantiomer substrátu. Na konci reakce /72 h/ se perličky enzymu odfiltrují a filtrát se použije k izolaci požadovaného /-/-enantiomerů.

1M roztokem amoniaku se pH reakční směsi upraví na 10,5 a roztok se aplikuje na pryskyřici Duplite A113 super v OH cyklu /50 ml, 0,4 objemů lože/h/. Analog uridinu se adsorbuje na pryskyřici a /-/-enantiomer projde. Zbylý /-/-enantiomer v pryskyřici se odstraní promytím 0,04% roztokem amoniaku /2 objemy lože, průtok 0,8 objemů lože/h/.

Hodnota pH spotřebovaných roztoků a promývacích kapalin o objemu 600 ml se upraví na 7,0 koncentrovanou kyselinou sírovou a roztok se aplikuje na 50 ml pryskyřice XAD16 s průtokem 1,4 objemu lože/h. Kolona se promyje destilovanou vodou /2,5 objemu lože, průtok 2 objemy

-14CZ 288499 B6 lože/h/ a /-/-enantiomer se eluuje směsí 1 dílu acetonu a 3 dílů vody s průtokem 1,5 objemu lože/h.

Celková frakce obsahující /-/-enantiomer /4 objemy lože/, se zahustí v Buchiho odparce na malý objem, načež se přefiltruje přes skleněnou fritu č. 3. Z přefiltrovaného roztoku se lyofilizací získá 1,2 g titulní sloučeniny identické jako v příkladu 4.

V příkladech 6-9 níže „účinná látka“ znamená (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3oxathiolan-5-yl)-( 1 H)-pyrimidin-2-on.

Příklad 6

Tabletové přípravky

A. Mokrou granulací složek s roztokem providonu ve vodě, sušením a prosíváním a pak přídavkem stearátu hořečnatého a lisováním se připraví tento přípravek:

	mg/tableta
/a/ účinná látka	250
/b/ laktóza B.P.	210
/c/ Providone B.P.	15
/d/ natriumglykolát škrobu	20
/e/ stearát hořečnatý	5
	500

B. Přímým lisováním se připraví následující přípravek. Použije se laktóza pro přímé lisování:

	mg/tableta
účinná látka	250
laktóza B.P.	145
Avicel	100
stearát hořečnatý	5
	500

C. /Přípravek s kontrolovaným uvolňováním./ Přípravek se připravuje mokrou granulací dále uvedených složek s roztokem providonu ve vodě, sušením a prosíváním, načež se přidá stearát hořečnatý a provede se lisování:

	mg/tableta
/a/ účinná látka	500
/b/ hydroxypropylmethylcelulóza/Methocel K4M Prémium/	112
/c/ laktóza B.P.	53
lál Providone B.P.	28
/e/ stearát hořečnatý	7
	700

-15CZ 288499 B6

Příklad 7

Kapsle

Směs pro kapsle se připravuje smísením dále uvedených složek a plní se do dvoudílných kapslí z tvrdé želatiny:

	mg/tableta
účinná látka	125
laktóza	72,5
Avicel	50
stearát hořečnatý	2,5
	250

Příklad 8

Injekční přípravek účinná látka 0,200 g roztok hydroxidu sodného, 0,1 M, q.s. na pH asi 11 sterilní voda, q.s. do 10 ml

Účinná látka se suspenduje v malém množství vody /která může být ohřátá/ a pH se upraví roztokem hydroxidu sodného na asi 11. Šarže se pak doplní na daný objem a přefiltruje se přes membránový filtr do sterilní lOml skleněné nádobky, která se sterilně uzavře a utěsní.

Příklad 9

	mg/čípek
účinná látka	250
tvrdý tuk B.P.	1770
	2020

Jedna pětina tvrdého tuku se roztaví v parou vyhřívané pánvi při maximálně 45 °C. Účinná látka se prošije přes síto 200 pm a přidá se za míchání k roztavenému základu s použitím míchadla s vysokým střihem do získání hladké disperze. Při udržování teploty na 45 °C se přidá zbývající tuk a suspenze se míchá do dosažení homogenní směsi. Celá suspenze se nechá projít nerezovým sítem 250 pm a pak se za stálého míchání nechá vychladnout na 40 °C. Při teplotě 38 až 40 °C se směs plní po 2,02 g do vhodných plastových forem o objemu 2 ml. Čípky se nechají zchladnout na teplotu místnosti.

Příklad 10

Biologická účinnost

Protivirová účinnost

Protivirová účinnost sloučeniny podle příkladu 2 byla stanovována proti třem kmenům HIV-1 a jednomu kmenu HTV-2 v dále uvedených buněčných liniích.

-16CZ 288499 B6

Buňky JM, polopřirozená buněčná linie T, odvozená od pacienta s lymfoblastickou leukémií, infikovaného kmenem HIV-1 GB8.

Buňky C8166, buněčná linie lidského T-lymfoblastoidu, infikovaného kmenem HTV-1 RF.

Buňky MT-4, buněčná linie lidských leukemických T-buněk, infikovaných kmenem HIV-1 RF.

Buňky CEM, buněčná linie lidského T-lymfoblastoidu, infikovaného kmeny HIV-1 RF a U455 nebo kmenem HIV-2 ROD.

Protivirová účinnost u buněk C8166, JM a CEM byla stanovena pomocí inhibice tvorby syncytia /Tochikura a d., Virology 164, 542-546/ a u buněk MT-4 pomocí inhibice konverze formazanu /Baba a d./ 1987/ Biochem. Biophys. Res. Commun. 142, 128-134, Mossman /1983/ J. Immun. Meth. 65, 55-57/. Protivirová účinnost byla rovněž stanovována analýzou množství p24 antigenu HTV, syntetizovaného v přítomnosti a nepřítomnosti enantiomerů.

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2:

Tabulka 1

	50% protivirová účinnost /pg/ml/
pokus	formazan	inhibice tvorby syncytia
buňky	MT-4	CEM	CEM	CEM	JM	C8166
virus /HTV-1/	HTV-1 RF	HIV-2 ROD	HTV-1 RF	HTV-1 U455	HIV-1 GB8	HTV-1 RF
/+/-enantiomer	0,28	0,045	0,07	0,006	0,03	0,05
/-/-enantiomer	0,20	0,055	0,04	0,008	0,05	0,01

Tabulka 2. Inhibice syntézy HIV p24

50% inhibice syntézy HTV p24 /gg/ml/
buňky	C8166	JM	MT-4
virus	RF	GB8	RF
/+/-enantiomer	0,021	0,033	0,0008
/-/-enantiomer	0,016	0,016	0,0004

Tabulka 3. Cytotoxicita

	50% cytotoxicita /pg/ml/
sloučenina	buňky CEM	buňky JM	buňky H9	buňkyU937	buňkyC8166
/+/-enantiomer	1	1,5	2	4	35
/-/-enantiomer	> 100	30	> 100	> 100	> 100
BCH-189	3	3,5	8	15	90
směs 1:1	2,5	nestanoveno		nestanoveno

Cytotoxicita

Cytotoxicita sloučenin podle příkladu 2, racemické sloučeniny (BCH-189, příklad 1) a směsi obou enantiomerů v poměru 50:50 byla stanovena pro pět buněčných linií: H9, JM, CEM, C8166 aU937.

-17CZ 288499 B6

Na mikrotitrových plotnách s 96 prohlubněmi byly testované sloučeniny postupně zředěny na konečné koncentrace 100 až 0,3 pg/ml. Do každé prohlubně ploten, obsahujících kontrolní vzorky bez léčiva, bylo inokulováno 3,6.10⁴ buněk. Po inkubaci, trvající 5 dní při 37 °C, byl odebráním vzorku suspenze a spočítáním buněk vylučujících trypan blue v hemocytometru stanoven počet aktivních buněk.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Příklad 11

Tabletové formulace

A. Mokrou granulací složek s roztokem providonu ve vodě, sušením a prosetím a pak přidáním stearátu hořečnatého a lisováním se připraví prostředek následujícího složení:

	mg/tableta
(a) účinná látka 1	150
(b) účinná látka 2	300
(c) laktóza B.P.	210
(d) providon B.P.	15
(e) natriumglykolát škrobu	20
(f) stearát hořečnatý	5
celková hmotnost	700

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = AZT (3'-azido-3'-deoxythymidin).

B. Přímým lisováním se připraví prostředek následujícího složení, přičemž se použije laktóza pro přímé lisování:

	mg/tableta
(a) účinná látka 1	150
(b) účinná látka 2	300
(c) laktóza	145
(d) avicel	100
(e) stearát hořečnatý	5
celková hmotnost	700

C. (Prostředek s řízeným uvolňováním účinné látky). Mokrou granulací níže uvedených složek s roztokem providonu ve vodě, sušením a prosetím a pak přidáním stearátu hořečnatého a lisováním se připraví prostředek následujícího složení:

-18CZ 288499 B6

	mg/tableta
(a) účinná látka 1	150
(b) účinná látka 2	300
(c) hydroxypropylmethylcelulóza (Methocel K4M Prémium)	112
(d) laktóza B.P.	53
(e) providon B.P.	28
(f) stearát hořečnatý	7
celková hmotnost	700

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl}-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = AZT (3'-azido-3'-deoxythymidin).

Příklad 12

Tabletové formulace

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxycytidin.

-19CZ 288499 B6

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl)-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxycytidin.

Příklad 13

Tabletové formulace

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxyadenosin.

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on,

-20CZ 288499 B6 účinná látka = 2',3'-dideoxyadenosin.

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl}-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxyadenosin.

Příklad 14

Tabletová formulace

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxyinosin.

-21CZ 288499 B6 účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxyinosin.

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathioIan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxyinosin.

Příklad 15

Tabletové formulace

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxythymidin.

-22CZ 288499 B6

Příklad 16

Tabletové formulace

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidin.

-23CZ 288499 B6

účinná látka = 1 (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidin.

Příklad 17

Tabletové formulace

B.

-24CZ 288499 B6 účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidin.

účinná látka 1 = (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin2-on, účinná látka 2 = 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidin.

Příklad 18

Antivirová účinnost kombinace (-)-enantiomeru cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3oxathiolan-5-yl)-(lH}-pyrimidin-2-onu a AZT

Pacientům vykazujícím 200 až 500 buněk CD4+ na mm³ bylo podáváno 150 mg (-)-enantiomeru cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-onu dvakrát denně v jednotkové dávce 150 mg a 200 mg AZT třikrát denně (Eron a kol. N. Engl. J. Med. 1995; 333: 1662-1669).

Léčení kombinací (-)-enantiomeru cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)(lH)-pyrimidin-2-onu s AZT je dobře tolerováno a vyvolává větší zlepšení při imunologických

-25CZ 288499 B6 a virologických měřeních než léčení samotným (-)-enantiomerem cis-4-amino-l-(2hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-onu nebo samotným AZT.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-on nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, ester nebo sůl tohoto esteru, kde estery se rozumí sloučeniny,

O

II v nichž je vodík 2-hydroxymethylové skupiny nahrazen skupinou R-C-, kde R je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, přímé či rozvětvené alkylové skupiny s 1 až 16 atomy uhlíku, alkoxyalkylové skupiny s 1 až 16 atomy uhlíku v každé alkylové části, fenylalkylové skupiny s 1 až 16 atomy uhlíku v alkylové části, popřípadě substituované halogenem, alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, nitroskupinou nebo trifluormethylovou skupinou, fenoxyalkylové skupiny s 1 až 16 atomy uhlíku v alkylové části a fenylovou skupinu, popřípadě substituovanou halogenem, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, dále estery s alkylsulfonovými kyselinami s 1 až 16 atomy uhlíku nebo s fenylalkylsulfonovými kyselinami s 1 až 16 atomy uhlíku v alkylové části, estery s aminokyselinami a mono-, di- nebo trifosfáty, pro použití k léčení.
2. Farmaceutický prostředek santivirovou účinností se sníženou cytotoxicitou, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a jako účinnou látku (-)-cis-4amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-on nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ester nebo sůl tohoto esteru podle nároku 1.
3. Farmaceutický prostředek podle nároku2, vyznačující se tím, že obsahuje ne více než 5 % (hmotnost/hmotnost) (+)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5yl)-( 1 H)-pyrimidin-2-onu.
4. Farmaceutický prostředek podle libovolného znároků 2 nebo 3, vyznačující se t í m, že obsahuje 10 až 1500 mg uvedené účinné látky na jednotkovou dávku.
5. Farmaceutický prostředek podle libovolného znároků 2 nebo 3, vyznačující se t í m, že obsahuje 20 až 1000 mg uvedené účinné látky na jednotkovou dávku.
6. Farmaceutický prostředek podle libovolného z nároků 2 nebo 3, vyznačující se t í m, že obsahuje 50 až 700 mg uvedené účinné látky na jednotkovou dávku.
7. Farmaceutický prostředek podle libovolného z nároků 2 až 6 pro použití k léčení savců, včetně lidí, trpících infekcí HTV.
8. Farmaceutický prostředek podle libovolného z nároků 2až 7, vyznačující se tím, že dále obsahuje další antivirové činidlo.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že další antivirové činidlo je vybráno z 2',3'-dideoxynukleosidů.
10. Farmaceutický prostředek podle nároku9, vyznačující se tím, že 2',3'dideoxynukleosid je vybrán ze skupiny zahrnující AZT, 2',3'-dideoxycytidin, 2',3'-dideoxy-26CZ 288499 B6 adenosin, 2',3'-dideoxyinosin, 2',3'-dideoxythymidin, 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidin a

2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidin.
11. Farmaceutický prostředekpodle nároku 10, vyznačující se tí m , že 2',3'-dideoxynukleosidem je AZT.
12. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxycytidin.
13. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxyadenosin.
14. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxyinosin.
15. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vy z n a č uj í c í se tím , že 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxythymidin.
16. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vy z n a č uj í c í se t í m , že 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidin.
17. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vy z n a č uj íc í se t í m, že 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidin.
18. Farmaceutický prostředek podle nároku 9 pro použití k léčení infekce HIV u pacienta, vyznačující se tím, že obsahuje 2',3'-dideoxynukleosid v množství inhibujícím růst nebo replikaci HTV u tohoto pacienta a (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-on nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl podle nároku 1 v množství snižujícím toxicitu.
19. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že uvedeným 2',3'-dideoxynukleosidem je AZT, 2',3'-dideoxycytidin, 2',3'-dideoxyadenosin, 2',3'-dideoxyinosin, 2',3'-dideoxythymidin, 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidin nebo 2',3'-dideoxy-2',3'didehydrocytidin.
20. Použití (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2onu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, esteru nebo soli tohoto esteru podle nároku 1 k výrobě léčiva se sníženou cytotoxicitou k léčbě virových infekcí.
21. Použití (-}-cis-4-amino-1 -(2-hydroxymethyl-l ,3-oxathiolan-5-yl}-( 1 H)-pyrimidin-2onu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, esteru nebo soli tohoto esteru podle nároku 1 k výrobě léčiva snižujícího toxicitu 2',3'-dideoxynukleosidu při léčení savce trpícího infekcí HTV nahrazením části tohoto 2',3'-dideoxynukleosidu (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3oxathiolan-5-yl)-( 1 H)-pyrimidin-2-onem.
22. Použití (-)-enantiomeru cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)pyrimidin-2-onu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, esteru nebo soli tohoto esteru podle nároku 1 k výrobě léčiva k léčbě virové infekce, která je spojena s nižší cytotoxicitou než léčba odpovídajícím (+)-enantiomerem.
23. Použití (-}-enantiomeru cis-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-(lH)pyrimidin-2-onu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, esteru nebo soli tohoto esteru podle

-27CZ 288499 B6 nároku 1 v kombinaci s dalším antivirovým činidlem vybraným z 2',3'-dideoxynukleosidů, k výrobě léčiva se sníženou cytotoxicitou k léčbě virových infekcí.
24. Použití podle nároku 23, kde jsou uvedený (-)-enantiomer a uvedené další antivirové 5 činidlo určeny k postupnému podávání.
25. Použití podle nároku 23, kde jsou uvedený (-)-enantiomer a uvedené další antivirové činidlo určeny k současnému podávání.

10
26. Použití podle nároku 23, kde 2',3'-dideoxynukleosid je vybrán ze skupiny zahrnující AZT,

2',3'-dideoxycytidin, 2',3'-dideoxyadenosin, 2',3'-dideoxyinosin, 2',3'-dideoxythymidin, 2',3'dideoxy-2',3 '-didehydrothymidin a 2',3 '-dideoxy-2',3 '-didehydrocytidin.
27. Použití podle nároku 26, kde 2',3'-dideoxynukleosidem je AZT.
28. Použití podle nároku 26, kde 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxycytidin.
29. Použití podle nároku 26, kde 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxyadenosin.

20
30. Použití podle nároku 26, kde 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxyinosin.
31. Použití podle nároku 26, kde 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxythymidin.
32. Použití podle nároku 26, kde 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydro25 thymidin.
33. Použití podle nároku 26, kde 2',3'-dideoxynukleosidem je 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidin.