FI111723B - Menetelmä valmistaa cis-4-amino-1-(2-hydroksimetyyli-1,3-oksatiolan-5- yyli)-(1H)-pyrimidin-2-onin (-)enantiomeeriä käytettäväksi virustenvastaisena aineena - Google Patents

Description

111723

Menetelmä valmistaa cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onin (-)-enantiomeeriä käytettäväksi virustenvastaisena aineena- Förfarande för framställning av (-)-enantiomeren av cis-4-amino-l-(2-hydroximetyl-l,3-oxatiolan-5-yl)-(lH)-pyrimidin-2-on för att användas som ett 5 antiviralt medel Tämä keksintö koskee menetelmää valmistaa oleellisesti puhdasta cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onin (-)-enantiomeeriä tai sen suolaa, esteriä tai esterin suolaa, käytettäväksi virustenvastaisena aineena.

10 Kaavan (I) mukaista yhdistettä nh2

«AA

hoch2^ox \_7 s ® joka tunnetaan myös nimellä BCH-189 tai NGPB-21, on kuvattu yhdisteenä, jolla * * on virustenvastainen vaikutus erityisesti ihmisen immuunipuutosviruksia (HlV t) vastaan, jotka ovat AIDS-sairautta aiheuttavia aineita (5th Anti-Aids Conference, Montreal, Canada 5th-9th June 1989: Abstracts T.C.O.l ja M.C.P.63; EP-patentti-hakemusjulkaisu nro 0382562). Kaavan (I) mukainen yhdiste on raseeminen seos •" ’ kahdesta enantiomeeristä, joilla on kaavat (I-1) ja (1-2): . . NH, NH2 s Λ Λ

ASJ 0AnJ

- ϋ Ό (1-2) (1-1) 2 111723 ja jotka kuvattiin ja tutkittiin rasemaattinsa muodossa. Ainoa nykyään hyväksytty yhdiste HIV:n aiheuttamien tilojen hoitoon on 3'-atsido-3'-deoksitymidiini (AZT, zidovudiini, BW 509U). Tällä yhdisteellä on kuitenkin merkittävä sivuvaikutustai-pumus eikä sitä joko voida käyttää tai, jos on kokeiltu, on täytynyt lakata käyttämäs-5 tä merkittävällä määrällä potilaita. On siis jatkuva tarve saada yhdisteitä, jotka ovat tehokkaita HIV:tä vastaan, mutta joilla on samanaikaisesti merkittävästi parempi terapeuttinen indeksi.

Tämän keksinnön tekijät ovat nyt havainneet, että yllättäen kaavan (I) mukaisen yhdisteen enantiomeerit ovat samanvaikutteisia HIV:tä vastaan, mutta että yhdellä 10 enantiomeerillä [(-)-enantiomeeri] on merkittävästi alhaisempi sytotoksisuus kuin toisella enantiomeerillä. Niinpä keksinnön mukaisesti on aikaansaatu kaavan (I) mukaisen yhdisteen (-)- (eli vasemmalle kiertävä) -enantiomeeri (I) yhdisteestä sekä sen farmaseuttisesti sopivat johdannaiset.

Tämä keksintö kohdistuu näin ollen menetelmään valmistaa oleellisesti puhdasta 15 cis-4-amino-1 -(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onin (-)- enantiomeeriä tai sen suolaa, esteriä tai esterin suolaa käytettäväksi virustenvastaise- na aineena, jolloin (+)-enantiomeeriä on läsnä enintään 5 paino-%, joka menetelmä käsittää sen, että erotetaan (-)-enantiomeeri seoksesta, jossa on cis-4-amino-l-(2- hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onin (+)- ja (-)-enantio- *.*20 meerejä tai niiden suoloja, estereitä tai estereiden suoloja, erottamisen tapahtuessa . ·. ·. entsyymivälitteisellä enantioselektiivisellä katabolismilla.

• · · • * : : (-)-enantiomeerin kemiallinen nimi on (-)-£is-4-amino-1 -(2-hydroksimetyyli-1,3 -ok- ..!: ‘ satiolan-5-yyli)-( 1 H)-pyrimidin-2-oni (tässä jäljessä yhdiste (A)). Sillä on kaavan (I- : : 1) yhdisteen absoluuttinen avaruuskemia, yhdisteen (1-1) ollessa nimeltään (2R,cis)- :‘:*;2 5 4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-oni.

. . Keksinnön mukaisesti valmistettu yhdiste (A) on olennaisesti puhtaana vastaavasta • · » '; [: (+)-enantiomeeristä, toisin sanoen läsnä ei ole enempää kuin noin 5 paino-% (+)- enantiomeeriä, edullisesti läsnä ei ole enempää kuin noin 2 paino-%, erityisesti alle : noin 1 paino-%.

;·’3 0 Termillä "farmaseuttisesti sopiva johdannainen" tarkoitetaan yhdisteen (A) mitä : ·.. tahansa farmaseuttisesti sopivaa suolaa, esteriä tai tämän esterin suolaa.

Alan ammattimiehille on selvää, että yhdiste (A) voidaan modifioida muodostamaan farmaseuttisesti aktiivisia johdannaisiaan, funktionaalisissa ryhmissä sekä oksatio-laanirenkaan emäsosassa että hydroksimetyyliryhmässä. Erityisen kiinnostavia ovat 3 111723 farmaseuttisesti sopivat johdannaiset, jotka on saatu modifioimalla oksatiolaaniren-kaan 2-hydroksimetyyliryhmä.

Edullisia yhdisteen (A) estereitä ovat yhdisteet, joissa 2-hydroksimetyyliryhmän

vety on korvattu asyylifunktiolla II

R-C- 5 jossa esterin ei-karbonyyliosa R on valittu joukosta: vety, suoraketjuinen tai haarautunut alkyyli (esim. metyyli, etyyli, n-propyyli, t-butyyli, n-butyyli), alkoksialkyyli (esim. metoksimetyyli), aralkyyli (esim. bentsyyli), aryylioksialkyyli (esim. fenoksi-metyyli), aryyli (esim. fenyyli, joka on valinnaisesti substituoitu halogeenilla, Cm-alkyylillä tai Ci-4-alkoksilla); sulfonaattiesterit, kuten alkyyli- tai aralkyylisulfonyyli 10 (esim. metaanisulfonyyli); aminohappoesterit (esim. L-valyyli tai L-isoleusyyli) ja mono-, di- tai trifosfaattiesterit.

Mitä tulee edellä kuvattuihin estereihin, ellei toisin mainita, sisältää mukana oleva alkyyliosa edullisesti 1-16 hiiliatomia, erityisesti 1-4 hiiliatomia. Mikä tahansa aryy-liosa, joka on mukana näissä estereissä, sisältää edullisesti fenyyliryhmän.

15 Erityisesti esteri voi olla Ci-i6-alkyyliesteri, substituoimaton bentsyyliesteri tai bent-syyliesteri, joka on substituoitu ainakin yhdellä halogeenilla (bromi, kloori, fluori tai jodi), Ci-6-alkyyli-, Ci_6-alkoksi-, nitro- tai trifluorimetyyliryhmällä.

• Yhdisteen (A) farmaseuttisesti sopivat suolat ovat sellaisia, jotka on saatu farma-seuttisesti sopivista epäorgaanisista ja orgaanisista hapoista ja emäksistä. Esimerk- :":20 kejä sopivista hapoista ovat vetykloridi-, vetybromidi-, rikki-, typpi-, perkloori-, fu-määri-, maleiini-, fosfori-, glykoli-, maito-, salisyyli-, meripihka-, tolueeni-p-sulfo-: ni-, viini-, etikka-, sitruuna-, metaanisulfoni-, muurahais-, bentsoe-, omena-, nafta- leeni-2-sulfoni- ja bentseenisulfonihapot. Muita happoja, kuten oksaalihappo, vaikka eivät olekaan itse farmaseuttisesti sopivia, voidaan käyttää välituotteina saataessa . ·. :2 5 keksinnön yhdisteitä sekä niiden farmaseuttisesti sopivia happoadditiosuoloja.

Sopivista emäksistä saadut suolat ovat alkalimetalli- (esim. natrium), maa-alkali- • metalli- (esim. magnesium), ammonium-ja NR/ (jossa R on Ci-4-alkyyli) -suoloja.

’ ·; · ’ Viittaukset keksinnön yhdisteeseen tämän jälkeen käsittävät sekä yhdisteen (A) että : sen farmaseuttisesti sopivat johdannaiset eli suolat, esterit tai estereiden suolat.

• · * ’30 Keksinnön yhdisteet ovat joko itse virustenvastaisesti aktiivisia ja/tai ovat metaboli-soitavissa sellaisiksi yhdisteiksi. Erityisesti nämä yhdisteet vaikuttavat inhiboiden 4 111723 retrovimsten replikoitumista, mukaanlukien ihmisen retrovirukset, kuten ihmisen immuunipuutosvirukset (HIV:t), jotka aiheuttavat AIDS:ia.

Keksinnön yhdisteet ovat käyttökelpoisia virustenvastaisena aineena, esimerkiksi retrovimsten, kuten HIV:n aiheuttamien infektioiden hoidossa.

5 Keksinnön yhdisteet ovat myös käyttökelpoisia hoidettaessa AIDS:iin liittyviä tiloja, kuten AIDS:iin liittyvä oireyhtymä (ARC), progressiivinen yleinen imusolmuke-tauti (PGL), AIDS:iin liittyvät neurologiset tilat (kuten dementia tai paikallinen molemminpuolinen alaraajojen lihasheikkous), anti-HIV-vasta-ainepositiiviset ja HIV-positiiviset tilat, Kaposin sarkooma, thrombocytopenia purpurae ja siihen liittyvät 10 opportunistiset infektiot, kuten Pneumocystis carinii.

Keksinnön yhdisteet ovat myös käyttökelpoisia ehkäistäessä sellaisten henkilöiden kliinisen sairauden kehittymistä, jotka ovat anti-HIV-vasta-aine- tai HIV-antigeeni-positiivisia ja ennaltaehkäistäessä siihen liittyvää altistumista HIV:lle.

Yhdistettä (A) tai sen farmaseuttisesti sopivia johdannaisia voidaan myös käyttää 15 ehkäistäessä fysiologisten nesteiden, kuten veren tai siemennesteen viruskontami-naatiota in vitro.

Alan ammattimiehet ymmärtävät, että tässä olevat viittaukset hoitoon käsittävät todettujen infektioiden ja oireiden sekä ennaltaehkäisyn että hoidon.

• ·

Voidaan lisäksi ymmärtää, että hoitoon tarvittava keksinnön yhdisteen määrä vaih-**'•20 telee ei vain valitusta yhdisteestä johtuen vaan myös antotavasta, hoidettavan tilan luonteesta ja potilaan iästä ja tilasta, ja on lopullisesti hoitavan lääkärin tai eläin-: lääkärin ratkaistavissa. Yleensä kuitenkin sopiva annos on alueella noin 0,1 - noin : * · *: 750 mg/kg ruumiinpainosta päivässä, edullisesti alueella 0,5-60 mg/kg, edullisimmin alueella 1-20 mg/kg/päivä.

”2 5 Haluttu annos voidaan mukavasti antaa yhtenä annoksena tai jaettuina annoksina, jotka annetaan sopivin välein, esimerkiksi kaksi, kolme, neljä tai useampia osa-: :'; annoksia päivässä.

* ·; ·' Yhdiste annetaan mukavasti yksikköannosmuodossa; esimerkiksi siten, että se sisäl- !**.. tää 10-1500 mg, sopivasti 20-1000 mg, sopivimmin 50-700 mg vaikuttavaa ainetta ..:30 yksikköannosmuotoa kohden.

» ·

Ideaalisesti vaikuttava aine tulisi antaa siten, että saadaan vaikuttavan yhdisteen huippuplasmakonsentraatiot noin 1 - noin 75 μΜ, edullisesti noin 2-50 μΜ, edulli- 5 111723 simmin noin 3-30 μΜ. Tämä voidaan saavuttaa esimerkiksi injektoimalla suonensisäisesti 0,1-5 % vaikuttavan ainesosan liuosta, valinnaisesti suolaliuoksessa, tai antamalla oraalisesti ruokapalana, joka sisältää noin 1 - noin 100 mg vaikuttavaa ainetta. Halutut veren tasot voidaan säilyttää jatkuvalla tiputuksella, jolloin annetaan 5 noin 0,01 - noin 5,0 mg/kg/tunti, tai ajoittaisella tiputuksella, joka sisältää noin 0,4 -noin 15 mg/kg vaikuttavaa ainetta.

Vaikka on mahdollista terapiakäyttöä varten antaa keksinnön yhdistettä raakakemi-kaalina, on edullista, että vaikuttava aine on farmaseuttisena valmisteena.

Tällainen farmaseuttinen valmiste sisältää yhdistettä (A) tai sen farmaseuttisesti so-10 pivaa johdannaista yhdessä yhden tai useamman farmaseuttisesti sopivan kantajan kanssa, ja valinnaisesti muita terapeuttisia ja/tai ennaltaehkäiseviä ainesosia. Kantajan (-jien) täytyy olla "sopivia" siinä mielessä, että valmiste ei ole haitallista saajalleen.

Farmaseuttisia valmisteita ovat sellaiset, jotka sopivat oraalisesti, rektaalisesti, 15 nenän kautta, paikallisesti (sekä poskeen että kielen alle), emättimen kautta tai parenteraalisesti (sekä lihaksen sisään, ihon alle että suonen sisään) annettaviksi, tai muodossa, joka sopii annettavaksi inhalaationa tai sisään puhallettuna. Valmisteet voidaan sopivassa tilanteessa antaa erillisinä annostusyksikköinä ja ne voidaan valmistaa millä tahansa alalla hyvin tunnetulla farmasian alan menetelmällä. Kaikki \ ;20 menetelmät käsittävät sen, että aktiivinen yhdiste saatetaan kosketuksiin nestemäis-'·.· ten tai hienoksi jauhettujen kiinteiden kantajien tai molempien kanssa, ja tarpeen : : vaatiessa sitten muodostetaan tuote halutuksi valmisteeksi.

: ,·. Oraalisesti annettaviksi sopivat farmaseuttiset valmisteet voidaan sopivasti antaa erillisinä yksikköinä, kuten kapselit, tärkkelyskapselit tai tabletit, jotka jokainen 25 sisältävät ennalta määrätyn määrän vaikuttavaa ainetta; jauheena tai rakeina; liuok-. . sena, suspensiona tai emulsiona. Vaikuttava ainesosa voidaan myös antaa ruokapa- / lana, lääkepuurona tai pastana. Oraalisesti annettavat tabletit ja kapselit voivat sisältää tavanomaisia täyteaineita, kuten sideaineet, täyteaineet, luistoaineet, hajo-: tusaineet tai kostutusaineet. Tabletit voivat olla päällystettyjä alalla hyvin tunnetuil- ; . 3 0 la menetelmillä. Oraaliset nestevalmisteet voivat olla esimerkiksi vesi- tai öljysus- pensioiden, liuosten, emulsioiden, siirappien tai eliksiirien muodossa, tai ne voidaan ; ’' antaa kuivana tuotteena sekoitettavaksi veden tai muun sopivan kantoaineen kanssa ennen käyttöä. Tällaiset nestevalmisteet voivat sisältää tavanomaisia lisäaineita, kuten suspendoivat aineet, emulgaattorit, vedettömät kantoaineet (joita voivat olla 3 5 ruokaöljyt) tai säilöntäaineet.

6 111723

Keksinnön mukaiset yhdisteet voivat olla formuloituja parenteraalisesti annettavaksi (esim. injektoimalla, esim. ruokapalainjektiolla tai jatkuvalla tiputuksella) ja ne voivat olla yksikköannosmuodossa ampulleina, esitäytettyinä ruiskeina, tilavuudeltaan pienenä infuusiona tai moniannossäiliöinä, johon on lisätty säilöntäaine. Koos-5 tumukset voivat olla suspensioiden, liuosten tai emulsioiden muodossa öljy- tai vesi-kantoaineissa, ja ne voivat sisältää koostumusta antavia aineita, kuten suspendoivia, stabiloivia ja/tai dispergoivia aineita. Vaihtoehtoisesti vaikuttava aine voi olla jauheen muodossa, joka on saatu eristämällä aseptisesti steriilistä kiinteästä aineesta tai lyofilisoimalla kiinteästä aineesta, sekoitettavaksi sopivan kantoaineen, esim. 10 steriilin, pyrogeenittoman veden kanssa ennen käyttöä.

Epidermikseen paikallisesti antamista varten keksinnönmukaiset yhdisteet voidaan formuloida lääkevoiteiksi, voiteiksi tai lotioneiksi, tai ihoaläpäiseväksi laastariksi. Lääkevoiteet ja voiteet voidaan esimerkiksi formuloida vesipitoiseen tai öljypohjaan lisäämällä sopivia paksunnos- ja/tai geeliyttämisaineita. Lotionit voidaan formuloida 15 vesipitoisella tai öljypohjalla ja yleensä ne sisältävät yhtä tai useampaa emulgoivaa ainetta, stabiloivaa ainetta, dispergoivaa ainetta, suspendoivaa ainetta, paksunnos-ainetta tai väriainetta.

Suuhun paikallisesti annettaviksi sopivat valmisteet ovat tabletteja, jotka sisältävät vaikuttavan aineen maustetussa pohjassa, tavallisesti sakkaroosissa, ja akaasiaa tai *. * j2 0 tragakanttia; pastilleja, jotka sisältävät vaikuttavaa ainetta inertissä pohjassa, kuten gelatiinissa ja glyserolissa tai sakkaroosissa ja akaasiassa; ja suuvesiä, jotka sisältä-“ ’, vät vaikuttavaa ainetta sopivassa nestemäisessä kantajassa.

.,; I' Rektaalisesti annettaviksi sopivat farmaseuttiset valmisteet, joissa kantaja on kiinteä, ; : ’: ovat edullisimmin yksikköannosperäpuikkoina. Sopivia kantoaineita ovat kaakaovoi : ‘ j' ;2 5 ja muut alalla tavallisesti käytetyt aineet, ja peräpuikot voivat sopivasti olla muodostettuja sekoittamalla vaikuttava yhdiste pehmennetyn tai sulatetun kantoaineen (-ai-: neiden) kanssa ja sen jälkeen jäähdytettyjä muodostettu muoteissa.

Emättimeen annettavaksi sopivat valmisteet voivat olla pessaareina, tamponeina, • voiteina, geeleinä, pastoina, vaahtoina tai suihkeina, jotka sisältävät vaikuttavan .••.30 aineen lisäksi sellaisia kantoaineita, jotka alalla tiedetään sopiviksi.

: ’ ·.. Nenän sisään annettavaksi tarkoitettuja keksinnön yhdisteitä voidaan käyttää neste- :' ·. · suihkeina tai hajautuvana jauheena tai tippojen muodossa.

• » 7 111723

Tipat voidaan formuloida vesipitoiseen tai vedettömään pohjaan, joka myös sisältää yhden tai useamman dispergoivan aineen, liuotusaineen tai suspendoivan aineen. Nestesuihkeet tarjotaan sopivasti painepakkauksista.

Inhalaationa antamista varten keksinnön mukaiset yhdisteet tarjotaan sopivasti lää-5 kepuhaltimella, sumuttimella tai painepakkauksella tai muulla sopivalla keinolla aerosolisuihkeen antamiseksi. Painepakkaukset voivat sisältää sopivan ponneaineen, kuten diklooridifluorimetaani, trikloorifluorimetaani, diklooritetra-fluorietaani, hiilidioksidi tai muu sopiva kaasu. Paineaerosolin tapauksessa annostusyksikkö voidaan määrittää antamalla venttiilin annostella mitattu määrä.

10 Vaihtoehtoisesti inhalaatiolla tai lääkepuhalluksella antamista varten voi keksinnön mukainen yhdiste olla kuivan jauhekoostumuksen muodossa, esimerkiksi jauheseok-sena yhdisteestä ja sopivasta jauhepohjasta, kuten laktoosista tai tärkkelyksestä. Jauhekoostumus voi olla annostusyksikkömuodossa, esimerkiksi kapseleissa tai patruunoissa tai esim. gelatiini- tai kuplapakkauksina, josta jauhetta voidaan antaa 15 inhalaattorilla tai lääkepuhaltimella.

Haluttaessa voidaan käyttää edellä kuvattuja valmisteita, jotka on sovitettu hidastetusti vapauttamaan vaikuttava ainesosa.

Farmaseuttiset koostumukset voivat myös sisältää muita vaikuttavia aineita, kuten . V antimikrobisia aineita tai antiseptisiä aineita.

’ # * .2 0 Keksinnön yhdisteitä voidaan käyttää myös yhdessä muiden terapeuttisten aineiden, . esimerkiksi muiden infektioidenvastaisten aineiden kanssa. Erityisesti keksinnön ; · ·; yhdisteitä voidaan käyttää yhdessä tunnettujen virustenvastaisten aineiden kanssa.

•« « » Tällainen yhdistelmä sisältää yhdisteen (A) tai sen fysiologisesti sopivan johdannaisen yhdessä toisen terapeuttisesti vaikuttavan aineen, erityisesti virustenvastaisen .·. :25 aineen kanssa.

Yhdistelmät, joihin edellä viitataan, voivat sopivasti olla käyttöä varten farmaseutti-• sen valmisteen muodossa, jolloin tällaiset farmaseuttiset valmisteet sisältävät edellä .***. määriteltyä yhdistelmää yhdessä siihen käytetyn farmaseuttisesti sopivan kantajan kanssa.

30 Sopivia terapeuttisia aineita käytettäväksi näissä yhdistelmissä ovat asykliset nuk-leosidit, kuten asykloviiri tai gansikloviiri, interferonit, kuten α-, β- tai τ-interferoni, munuaiserityksen inhibiittorit, kuten probenesidi, nukleosidien kuljetuksen inhibiit- 8 111723 torit, kuten dipyridamoli, 2',3'-dideoksinukleosidit, kuten AZT, 2',3'-dideoksisyti-diini, 2',3'-dideoksiadenosiini, 2',3'-dideoksi-inosiini, 2',3'-dideoksitymidiini, 2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini ja 2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrosytidiini, immuno-modulaattorit, kuten interleukiini II (IL2) ja granulosyyttimakrofaagipesäkkeitä sti-5 muloiva tekijä (GM-CSF), erytropoetiini, ampligeni, tymomoduliini, tymopentiini, foskamet, ribaviriini ja HIV:n sitoutumisen inhibiittorit CD4-reseptoreihin, esim. liukoiseen CD4:ään, CD4-fragmentteihin, CD4-hybridimolekyyleihin, glykosylaa-tioinhibiittorit, kuten 2-deoksi-D-glukoosi, kastanospermiini ja 1-deoksinojirimysii-ni.

10 Näiden yhdistelmien yksittäisiä komponentteja voidaan antaa joko peräkkäin tai samanaikaisesti erillään tai yhdistettyinä farmaseuttisina valmisteina.

Kun yhdistettä (A) tai sen farmaseuttisesti sopivaa johdannaista käytetään yhdessä toisen terapeuttisen aineen kanssa samaa virusta vastaan, voi kummankin yhdisteen annos olla joko sama tai erilainen kuin silloin, kun yhdistettä käytetään yksinään. 15 Sopivat annokset ovat alan ammattimiehen helposti pääteltävissä.

Kaavan (I) mukainen yhdiste ja sen farmaseuttisesti sopivat johdannaiset voidaan valmistaa millä tahansa alalla tunnetulla, rakenteeltaan analogisten yhdisteiden valmistukseen tarkoitetulla menetelmällä, esimerkiksi EP-patenttihakemusjulkaisussa . , nro 0382562 kuvatulla tavalla.

• : V β 0 Eräässä tällaisessa menetelmässä (A) kaavan (VIII) mukaisen 1,3-oksatiolaanin,

H “TA

ΙΪ \ >l : S-' (VIII) jossa anomeerinen ryhmä L on korvattavissa oleva ryhmä, annetaan reagoida sopi-. *. : van emäksen kanssa. Sopivia ryhmiä L ovat -OR -ryhmät, joissa R on alkyyliryhmä, .···. esim. Ci-6-alkyyliryhmä, kuten metyyli, tai R on asyyliryhmä, esim. Ci-6-asyyliryh- * • 25 mä, kuten asetyyli, tai halogeeni, esimerkiksi jodi, bromi tai kloori.

• I »

Kaavan VIII mukaisen yhdisteen annetaan sopivasti reagoida sytosiinin tai sen sopivan pyrimidiiniemäsedeltäjän kanssa (joka on edeltäkäsin silyloitu silyloivalla • aineella, kuten heksametyylidisilatsaanilla) yhteensopivassa liuottimessa, kuten metyleenikloridissa, käyttäen Lewis-happoa, kuten titaanitetrakloridia, tina(IV)- 3 0 yhdistettä, kuten SnCU, tai trimetyylisilyylitriflaattia.

9 111723

Kaavan (VIII) mukaiset 1,3-oksatiolaanit voidaan valmistaa esimerkiksi kaavan (VII) aldehydin reaktiolla kaavan (VI) mukaisen merkaptoasetaalin kanssa yhteensopivassa orgaanisessa liuottimessa, kuten tolueenissa, happokatalyytin, esimerkiksi Lewis-hapon, kuten sinkkikloridin läsnäollessa.

5 HSCH2CH(OC2H5)2 (VI) C6H5C02CH2CH0 (VII)

Kaavan (VI) mukaiset merkaptoasetaalit voidaan valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä, esim. G.Hesse and I.Jorder, Clhem Rer 85 924-932 (1952).

Kaavan (VII) mukaiset aldehydit voidaan valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä, 10 esimerkiksi E.G. Halloquist and H. Hibbert, Can. J. Research, &, 129-136 (1933). Epäpuhdas aldehydi (VII) voidaan sopivasti puhdistaa muuttamalla kiteiseksi bisul-fiittiadditiotuotteeksi ja muuttamalla sen jälkeen uudelleen vapaaksi aldehydiksi.

Toisessa menetelmässä (B) kaavan (I) mukainen yhdiste saadaan kaavan (IX) mukaisen yhdisteen emäsinterkonversiolla HOCH, *.*.15 S-f (IX) '·* jossa kaavassa B on emäs, joka on muutettavissa sytosiiniksi. Tällainen interkon-: : versio voidaan saada aikaan joko yksinkertaisella kemiallisella transformaatiolla (esim. urasiiliemäksen muutos sytosiiniksi) tai entsymaattisella muutoksella käyt- • 11 j täen deoksiribosyylin käänteiskopioijaentsyymiä. Nämä menetelmät ja olosuhteet : ’: ’ ;2 0 emäksen interkonversiolle ovat nukleosidikemian alalla hyvin tunnettuja.

. , Kolmannessa menetelmässä (C) kaavan (XI) mukainen yhdiste .·*·. Ri° o r·; (xi) * *» : ’ ·.. voidaan muuttaa kaavan (I) mukaiseksi yhdisteeksi muuttamalla anomeerinen NH2-: * ·, j ryhmä sytosiiniemäkseksi nukleosidikemian alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä.

» I

2 5 Monia tässä edellä kuvattuja reaktioita on laajalti esitelty nukleosidisynteesien yhteydessä, esim. julkaisussa Nucleoside Analogs - Chemistry Riology and Medical 10 111723

Applications R.T. Walker et al., eds. Plenum Press, New York (1979), sivuilla 165-192; T. Ueda julkaisussa Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Voi I, L B Townsend ed., Plenum Press, New York (1988), sivuilla 165-192, jotka esitykset on liitetty tähän yhteyteen viitteiksi.

5 On huomattava, että edellä olevat reaktiot saattavat vaatia, tai niihin voidaan sopivasti käyttää, lähtöaineita, joissa on suojattuja funktionaalisia ryhmiä, ja tällöin voidaan tarvita suojauksen poistoa väli- tai lopullisena vaiheena halutun yhdisteen saamiseksi. Funktionaalisten ryhmien suojaus tai suojauksen poisto voidaan toteuttaa käyttäen tavanomaisia keinoja. Niinpä esimerkiksi aminoiyhmät voidaan suojata 10 ryhmällä, joka on valittu aralkyylin (esim. bentsyylin), asyylin, aryylin (esim. 2,4-dinitrofenyylin) tai silyylin joukosta; myöhemmin tapahtuvan suojaryhmän poiston tapahtuessa haluttaessa hydrolyysillä tai hydrauksella sopivasti käyttäen standardi-olosuhteita. Hydroksyyliryhmät voidaan suojata käyttäen mitä tahansa tavanomaista hydroksyylin suojaryhmää, esimerkiksi sellaista, joka on kuvattu julkaisussa 15 "Protective Groups in Organic Chemistry", Ed. J.F.W. McOmie (Plenum Press, 1973) tai "Protective Groups in Organic Synthesis", Theodora W. Greene (John Wiley and Sons, 1981). Esimerkkejä sopivista hydroksyylin suojaryhmistä ovat ryhmät, jotka on valittu seuraavien joukosta: alkyyli (esim. metyyli, t-butyyli tai metok-simetyyli), aralkyyli (esim. bentsyyli, difenyylimetyyli tai trifenyylimetyyli), hetero-2 0 sykliset ryhmät, kuten tetrahydropyranyy 1 i, asyyli (esim. asetyyli tai bentsoyyli) ja . V silyyliryhmät, kuten trialkyylisilyyli (esim. t-butyylidimetyylisilyyli). Hydroksyylin : V: suojaryhmät voidaan poistaa tavanomaisilla menetelmillä. Niinpä esimerkiksi alkyy- : · ·: li, silyyli, asyyli ja heterosykliset ryhmät voidaan poistaa solvolyysillä, esim. hyd- .:. rolyysillä happamissa tai emäksisissä olosuhteissa. Aralkyyliryhmät, kuten trifenyy- • •tl : .*.25 limetyyli, voidaan samoin poistaa solvolyysillä, esim. hydrolyysillä happamissa .···[ olosuhteissa. Aralkyyliryhmät, kuten bentsyyli, voidaan irrottaa esimerkiksi käsittelemällä BF3/eteraatilla ja etikkahappoanhydridillä, minkä jälkeen näin muodostuneet . . asetaattiryhmät poistetaan sopivassa synteesin vaiheessa. Silyyliryhmät voidaan ’· myös mukavasti poistaa käyttäen fluoridi-ionilähdettä, kuten tetra-n-butyyliammo-...*30 niumfluoridia.

* * * > » ·

Edellä olevissa menetelmissä kaavan (I) mukainen yhdiste saadaan yleensä cis- ja •; · hms-isomeerien seoksena, jossa cis-isomeeri on kiinnostava yhdiste.

• · • *» ; Nämä isomeerit voidaan erottaa fysikaalisin keinoin, esim. kromatografialla sili-kageelillä tai fraktiokiteytyksellä, joko suoraan tai sopivina johdannaisina, esim. 35 asetaatteina (valmistetaan esimerkiksi etikkahappoanhydridillä, joka jälkeenpäin, 111723 π kun erotus on suoritettu, muutetaan jälleen takaisen emotuotteeksi (esim. deasety-loimalla ammoniakin metanoliliuoksella).

Keksinnön yhdisteiden farmaseuttisesti sopivat suolat voidaan valmistaa kuten US-patentissa nro 4 383 114 on kuvattu, tämän esityksen ollessa liitetty tähän yhteyteen 5 viitteeksi. Niinpä esimerkiksi haluttaessa valmistaa yhdisteen (A) happoadditiosuola minkä tahansa edellä olevan menetelmän tuote voidaan muuttaa suolaksi käsittelemällä saatu vapaa emäs sopivalla hapolla käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Farmaseuttisesti sopivat happoadditiosuolat voidaan valmistaa antamalla vapaan emäksen reagoida sopivan hapon kanssa valinnaisesti sopivan liuottimen, kuten esterin (esim. 10 etyyliasetaatti) tai alkoholin (esim. metanoli, etanoli tai isopropanoli) läsnäollessa. Epäorgaaniset emäksiset suolat voidaan valmistaa antamalla emäyhdisteen reagoida sopivan emäksen, kuten alkoksidin (esim. natriummetoksidi) kanssa valinnaisesti liuottimen, kuten alkoholin (esim. metanoli) läsnä ollessa. Farmaseuttisesti sopivat suolat voidaan myös valmistaa yhdisteen (A) muista suoloista, kuten muista farma-15 seuttisesti sopivista suoloista, käyttäen tavanomaisia menetelmiä.

Yhdiste (A) voidaan muuttaa farmaseuttisesti sopivaksi fosfaatiksi tai muuksi esteriksi reaktiolla fosforyloivan aineen, kuten POCLm kanssa, tai sopivan esteröi-vän aineen kanssa, kuten happohalogenidi tai -anhydridi, kumpi paremmin sopii. Yhdisteen (A) esteri tai suola voidaan muuttaa emäyhdisteeksi esimerkiksi hydro-•.*.2 0 lyysillä.

Lopullisen tuotteen tai sen välituotteen tai lähtöaineen resoluutio voidaan toteuttaa ·'· millä tahansa sopivalla alalla tunnetulla menetelmällä: katso esimerkiksi « .,,'f "Stereochemistry of Carbon Compounds", E.L. Eliel (McGraw Hill, 1962) ja ! "Tables of Resolving Agents", S.H. Wilen.

• · · * 2 5 Niinpä keksinnön mukaisesti yhdiste (A) saadaan erottamalla yhdisteet entsyymivä- litteisellä enantioselektiivisellä katabolismilla sopivalla entsyymillä, kuten sytidiini- • # » deaminaasi, tai sopivan johdannaisen selektiivisellä entsymaattisella hajotuksella käyttäen 5'-nukleotidaasia. Kun resoluutio toteutetaan entsymaattisesti, entsyymiä ; ‘. voidaan käyttää joko liuoksena tai sopivammin immobilisoituna. Entsyymit voidaan * · I · ,••.3 0 immobilisoida millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä, esimerkiksi adsorboi- * ' maila hartsiin, kuten Eupergit C:hen.

• ·

» M

:' . · Keksintöä kuvataan edelleen seuraavien esimerkkien avulla, joiden ei ole tarkoitus * · rajoittaa keksintöä millään tavalla. Kaikki lämpötilat ovat Celsius-asteina.

,2 111723 Välituote 1 5-metoksi-1,3-oksatiolaani-2-metanoli, bentsoaatti

Sinkkikloridin (1,6 g) liuos kuumassa metanolissa (15 ml) lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli merkaptoasetaldehydiä, dimetyyliasetaalia (34,2 g) ja bentsoyy-5 lioksiasetaldehydiä (48,3 g) tolueenissa (1300 ml), joka sitten kuumennettiin palau-tusjäähdytyslämpötilaan typessä 50 minuutiksi. Jäähdytetty seos konsentroitiin, laimennettiin pienellä määrällä tolueenia ja suodatettiin Kieselguhrin läpi. Yhdistetyt suodokset ja tolueeni pestiin natriumbikarbonaatin kylläisellä vesiliuoksella (x2) ja suolaliuoksella, kuivattiin (MgSCYi), haihdutettiin sitten öljyksi, jolle suoritettiin 10 pylväskromatografia silikageelillä (2 kg, Merck 9385) eluoimalla kloroformilla, jolloin saatiin otsikon tuote öljynä (45,1 g) anomeeriseoksena (n. 1:1), *H NMR (DMSO-cL) 3,1-3,3(4H), 3,42(6H), 4,4-4,6 (4H), 5,41 (1H), 5,46 (1H), 5,54 (1H), 5,63 (1H), 7,46 (4H), 7,58 (2H), 8,07 (4H); ymax (CHBr3) 1717 cm1.

Välituote 2 15 (+)-cis-l-(2-bentsoyylioksimetyyH-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2,4-dioni

Seosta, jossa oli hienoksi jauhettua urasiilia (9,62 g), heksametyylidisilatsaania • « (50 ml) ja ammoniumsulfaattia (30 mg), kuumennettiin palautusjäähdytyksessä typessä kunnes saatiin kirkas liuos. Tämä liuos jäähdytettiin ja haihdutettiin sitten •"120 värittömäksi öljyksi, joka liuotettiin typpiatmosfäärissä asetonitriiliin (100 ml).

Liuos lisättiin sekoitettuun, jäillä jäähdytettyyn liuokseen, jossa oli 5-metoksi-l,3- i oksatiolaani-2-metanolia, bentsoaattia (välituote 1) (19,43 g) asetonitriilissä : i‘: (600 ml) ja lisättiin trimetyylisilyylitrifluorimetaanisulfonaattia (14,7 ml). Jäähaude » poistettiin, ja liuosta kuumennettiin palautusjäähdytyksessä typessä 45 minuuttia. ,·. ;25 Jäähdytyksen ja haihdutuksen jälkeen jäännös puhdistettiin pylväskromatografialla tL.‘ 1 kg:llä silikageeliä (Merck 9385) eluoimalla kloroformin ja metanolin seoksella t * Γ 9:1. Sopivat fraktiot jäähdytettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin epäpuhdas jäännös.

!;1 | Tämä fraktio kiteytettiin minimimäärällä kuumaa metanolia (n. 1200 ml), jolloin h,,: saatiin otsikon yhdiste (6,32 g) valkoisina kiteinä.

I I · »

> I

· f I f i3 111723 Välituote 3 (±)-(cis)-4-amino-l-(2-bentsoyylioksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimi- din-2-oni

Menetelmä (a) 5 Sytosiinin (20,705 g) ja ammoniumsulfaatin (muutama mg) suspensiota heksame-tyylidisilatsaanissa (110 ml) sekoitettiin ja kuumennettiin palautusjäähdytyksessä typessä 2,5 tuntia. Liuotin poistettiin haihduttamalla ja jäännökseksi saatu kiinteä aine liuotettiin kuivaan asetonitriiliin (350 ml). Tämä liuos siirrettiin taipuisan neulan menetelmää käyttäen sekoitettuun, jäillä jäähdytettyyn liuokseen, jossa oli 5-10 metoksi-l,3-oksatiolaani-2-metanolia, bentsoaattia (välituote 1) (43,57 g) asetonit-riilissä (650 ml) typessä. Trimetyylisilyylitrifluorimetaanisulfonaattia (33 ml) lisättiin, liuoksen annettiin lämmetä ympäristön lämpötilaan (1,5 h) ja kuumennettiin sitten palautusjäähdytyksessä yön yli. Jäännösseos konsentroitiin, laimennettiin kyllästetyllä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (500 ml), uutettiin sitten etyyli-15 asetaatilla (3 x 500 ml). Yhdistetyt uutteet pestiin vedellä (2 x 250 ml) ja suolaliuoksella (250 ml), kuivattiin (MgSCL) ja haihdutettiin sitten vaahdoksi, jolle suoritettiin pylväskromatografia silikageelillä (600 g, Merck 7734), eluoitiin etyyliasetaatin ja metanolin seoksilla, jolloin saatiin anomeeriseos (n. 1:1, 31,59 g). Seos . . kiteytettiin vedestä (45 ml) ja etanolista (9,0 ml), jolloin saatiin kiinteä aine • · *2 0 (10,23 g), joka uudelleenkiteytettiin etanolista (120 ml) ja vedestä (30 ml), jolloin • · · ' · * · ’ saatiin otsikon yhdiste valkoisena kiinteänä aineena (9,26 g), ^max (MeOH) 229,4 mm (E\l 610); 272,4 mm (E\L 293); !H NMR (DMSO d6) δ : 3,14 (1H), 3,50 (1H), 4,07 (2H), 5,52 (1H), 5,66 (1H), 6,28 (1H), 7,22 (2H), 7,56 (2H), 7,72 (2H), 8,10 (2H).

25 Menetelmä (b)

Fosforioksikloridia (7,0 ml) lisättiin pisaroittani sekoitettuun, jäillä jäähdytettyyn , suspensioon, jossa oli 1,2,4-triatsolia (11,65 g) asetonitriilissä (120 ml) ja sen jälkeen pitäen sisälämpötilaa alle 15 °C:ssa lisättiin pisaroittani trietyyliamiinia (22,7 ml). 10 minuutin kuluttua lisättiin hitaasti liuos, jossa oli (±)-cis-l-(2-30 bentsoyylioksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2,4-dionia (välituote : 2) (6,27 g) asetonitriilissä (330 ml). Sekoittamista jatkettiin sitten huoneenlämmössä yön yli. Seos jäähdytettiin jäähauteessa ja lisättiin hitaasti trietyyliamiinia (30 ml) ja sen jälkeen vettä (21 ml). Saatu liuos haihdutettiin, ja jäännös jaettiin kyllästettyyn 14 111723 natriumbikarbonaattiliuokseen (400 ml) ja kloroformiin (3 x 200 ml). Yhdistetyt kloroformiuutteet kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin epäpuhdas jäännös (9,7 g). Jäännös liuotettiin 1,4-dioksaaniin (240 ml) ja konsentroitua ammoniakin vesiliuosta (om.paino 0,880, 50 ml) lisättiin. 5 1,5 h.n kuluttua liuos haihdutettiin ja jäännös liuotettiin metanoliin. Tämä aiheutti kiinteän aineen saostumisen, joka suodatettiin pois. Emäliuokset puhdistettiin pylväskromatografialla silikageelillä (Merck 9385, 600 g). Sopivat fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin otsikon yhdiste ruskeankeltaisena kiinteänä aineena (2,18 g), identtisenä menetelmällä (a) saadun aineen kanssa.

10 Esimerkki 1 (±)-(cis)-4-amino-l-(2-hydroksimetyyIi-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pynmid«n-2- oni

Suspensiota, jossa oli (cis)-4-amino-l-(2-bentsoyylioksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onia (välituote 3) (8,19 g) ja Amberlite IRA-400 (OH) 15 hartsia (8,24 g) metanolissa (250 ml), sekoitettiin ja kuumennettiin palautusjäähdy-tyksessä 1 1/4 tuntia. Kiinteät aineet poistettiin suodattamalla ja pestiin sitten meta-nolilla. Yhdistetyt suodokset haihdutettiin. Jäännös trituroitiin etyyliasetaatin kanssa (80 ml). Saatu valkoinen kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla, jolloin saatiin . . otsikon yhdiste (5,09 g), :V20 'H NMR (DMSO de) 3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,73 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (1H), 5,29 :··: (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

* · *

Esimerkki 2 • · · • · · • * · # :T: (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2- oni • · * * * ’;, /2 5 0) (±)-cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidi- •; · ’ noni, divetyfosfaatti, ammoniumsuola

Kylmää (0°), sekoitettua suspensiota, jossa oli (±)-cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyy-•y’ li)-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onia (1,00 g) (esimerkki 1) kuivassa • * · · trimetyylifosfaatissa (20 ml), käsiteltiin fosforioksikloridilla (2,44 ml), ja seosta se- :*\.:30 koitettiin 0°:ssa 35 minuuttia ja jäähdytettiin sitten jäävedessä (60 g). Kylmän seoksen pH säädettiin arvoon 2,5 lisäämällä N-natriumhydroksidin vesiliuosta, levitettiin puuhiilikolonniin (10 g, DARCO), joka eluoitiin vedellä ja sitten etanolin 111723 ja ammoniakin vesiliuoksen seoksella. Epäpuhdasta monofosfaattia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin. Saatu liuos vietiin kolonniin, joka sisälsi 25 g DEAE Sephadex A-25:ttä (HC03-muoto). Eluointi suoritettiin gradientilla vedestä (120 ml) 0,1 M NH4HC03:een (240 ml), sitten 0,2, 0,3 ja 4 M NH4HC03:lla (120, 5 240, 400 ml, vastaavasti). Sopivat fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin. Jäännösliuos laimennettiin vedellä (40 ml) ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin otsikon tuote valkoisena kiinteänä aineena (1,37 g); ax (pH 6 puskuri), 271,0 mm (KL 190); *H NMR (D20) δ 3,23 (1H), 3,55 (1H), 4,0-4,2 (2H), 5,43 (1H), 6,07 (1H), 6,33 (1H), 8,08 (1H).

10 (ii) (+)-(cis)-4-amino-l-(2-hydroksimetyyIi-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimi- din-2-oni ja (-)-(cis)-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-oni 5'-nukleotidaasia (saatu crotalus atrox venomista) [EC 3.1.3.5] (60 mg arvolla 17 yksikköä/mg) lisättiin liuokseen, jossa oli (±)-cis-4-amino-(2-hydroksimetyyli-l,3-15 oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onia, 6'-divetyfosfaattia, ammoniumsuolaa (1,35 g) puskurissa [30 ml, valmistettu glysiinistä (526 mg) ja magnesiumkloridista (190 mg) veteen (100 ml)] ja seosta inkuboitiin 37°:ssa 2,5 tuntia. Entsyymiä lisättiin enemmän (20 mg) ja inkuboimista jatkettiin vielä 3,5 tuntia. Saatu seos vietiin DEAE Sephadex A-25-kolonniin (HC03-muoto). Eluointi suoritettiin vedellä .-.-.20 (160 ml), sitten 0,1, 0,2, 0,3 ja 0,4 M NH4HC03:lla (200 ml kutakin). Ensimmäisek- • si eluoitunutta komponenttia sisältävät sopivat fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin, jäännökselle suoritettiin pylväskromatografia silikageelillä (60 g, Merck 7734), ; · ·; eluoimalla kloroformin ja metanolin seoksilla. Sopivien fraktioiden haihdutus me- ·;; ; tanolin ja etyyliasetaatin seoksesta antoi (+)-(cis)-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli- • ’ -25 l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onia valkoisena kiinteänä aineena (0,30 g), : (a)D21+137° (c.1,04 MeOH); lU NMR (DMSO) δ 3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,37 (2H), .···.* 5,18 (1H), 5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

: Sephadex-kolonnista saadut sopivat fraktiot, jotka sisälsivät toiseksi eluoitunutta komponenttia, yhdistettiin ja haihdutettiin. Jäännös liuotettiin veteen (30 ml), ,,· 3 0 käsiteltiin alkaalisella fosfataasilla (Escherichia colista) [EC 3.1.3.1] (1,5 ml arvolla '' 416 yksikköä/ml), ja inkuboitiin sitten 37°:ssa yksi tunti. Liuotin poistettiin ' · '' haihduttamalla ja jäännökselle suoritettiin pylväskromatografia silikageelillä (60 g, Merck 7734), eluoimalla kloroformi-metanoliseoksilla. Haihduttamalla sopivat fraktiot metanolin ja etyyliasetaatin seoksesta saatiin (-)-(cis)-4-amino-l-(2-hydrok- 16 111723 simetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pynmidin-2-onia valkoisena kiinteänä aineena (0,32 g); (a)D21+132° (c. 1,08 MeOH); *H NMR (DMSO) δ 3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,37 (2H), 5,18 (1H), 5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

5 Esimerkki 3 (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyIi-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2- oni (i) Kolme 50 ml:n pulloa ravintolihalientä (Oxoid Ltd) siirrostettiin kukin silmu-kallisella Escherichia colia (ATCC 23848), joka oli raaputettu Nutrient Agar-1° levyltä. Pulloja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa ravistaen nopeudella 250 rev/min, ja sitten jokaista pulloa käytettiin siirrostamaan 4 1 CDD-kasvualustaa (glutamiinihap-po 3 g/1, MgS04 0,2 g/1; K2S04 2,5 g/1; NaCl 2,3 g/1, Na2HP04 2H20 1,1 g/1; Na2H2P04 2H20 0,6 g/1; sytidiini 1,2 g/1) seitsemän litran fermenttorissa. Viljelmiä fermentoitiin 750 rev/min:ssa, 37 °C ilmastamalla 4 1/min. 24 tunnin kasvatuksen 15 jälkeen solut kerättiin talteen sentrifugoimalla (5000 g, 30 minuuttia), jolloin saatiin 72 g:n märkäpaino. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 300 ml:aan 20 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,5) ja hajotettiin sonikoimalla (4 x 45 sekuntia). Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla (30.000 g, 30 minuuttia) ja supematantissa oleva proteiini . V saostettiin lisäämällä ammoniumsulfaattia 75 % kyllästysasteeseen asti. Sakka kerät- : : 20 tiin sentrifugoimalla (30.000 g, 30 minuuttia) ja pelletti suspendoitiin uudelleen :··: 25 ml.aan HEPES-puskuria (100 mM, pH 7,0), joka sisälsi ammoniumsulfaattia ··:· (75 % kyllästymisaste). Entsyymiliuos valmistettiin sentrifugoimalla kierrosnopeu- ; della 12.000 rpm 30 minuuttia. Supematantti heitettiin pois ja pelletti liuotettiin

• t « I

. : ·. Tris-HCl-puskuriin (pH 7,0; 100 mM) alkuperäiseen tilavuuteen.

25 (n) Esimerkin 1 tuote (115 mg) liuotettiin veteen (100 ml) ja sekoitettiin. Entsyymi- • · liuos (0,5 mg) lisättiin ja seosta pidettiin vakio-pH:ssa lisäämällä jatkuvasti HCLää (25 mM). Muutosta seurattiin kiraalisella HPLC:llä, joka osoitti, että substraatin (+)-: enantiomeeri deaminoitui ensisijaisesti. 22 tunnin kuluttua substraatin (+)-enantio- meeri (RT 12,5 min) oli täysin poistunut ja liuoksen pH säädettiin arvoon 10,5 lisää-30 mälläkonsentroitua natriumhydroksidia.

.·, : Edellä valmistettu tuote eluoitiin QAE Sephadex -kolonnin läpi (A25; Pharmacia; 30 x 1,6 cm), esitasapainotettiin pH-arvoon 11. Kolonni pestiin vedellä (200 ml) ja sitten HCf.llä (0,1 M). Otettiin fraktiot (40 ml) ja analysoitiin käänteisfaasi-HPLCillä. Fraktiot 5-13, jotka sisälsivät reagoimatonta substraatin (-)-enantiomee- 17 111723 riä, yhdistettiin ja niiden pH säädettiin arvoon 7,5 HCl:llä. Fraktio 47, joka sisälsi deaminoitua tuotetta, säädettiin pH-arvoon 7,5 laimealla NaOH:lla. Analyysi kiraa-lisella HPLC:llä osoitti, että tämä aine oli seos, joka koostui yhdestä enantiomeeristä (RT 10,2 min) pääkomponenttina yhdessä toisen enantiomeerin kanssa (RT 8,5 min) 5 pienimääräisempänä komponenttina (virheet poislukien n. 90 %).

(iii) Edellä oleva vaihe (ii) toistettiin suuremmassa mittakaavassa. Esimerkin 1 yhdistettä (363 mg) 250 ml:ssa vettä inkuboitiin entsyymiliuoksen (0,5 ml) kanssa, joka oli valmistettu samoin kuin vaiheessa (i). Lisäerät (0,5 ml) entsyymiä lisättiin 18 ja 47 tunnin kuluttua. Reaktioseosta sekoitettiin 70 tuntia, ja jätettiin sitten 10 seisomaan vielä 64 tunniksi. Kiraalisella HPLC:llä suoritettu analyysi osoitti, että substraatin (+)-enantiomeeri oli täysin deaminoitunut, ja saadun liuoksen pH säädettiin arvoon pH 10,5 NaOH:lla.

Edellä oleva liuos ladattiin samaan QAE-kolonniin ja eluoitiin kuten vaiheessa (i). Fraktiot 2-6, jotka sisälsivät seoksen jäännössubstraatista ja deaminoidusta tuot-15 teestä, yhdistettiin. Fraktiot 7-13, jotka sisälsivät jäännössubstraatin ((-)-enantio-meeri), yhdistettiin ja pH säädettiin arvoon 7,5. Fraktiot 25-26, jotka sisälsivät deaminoidun tuotteen, yhdistettiin ja neutraloitiin.

Edellä olevat fraktiot 2-6 eluoitiin uudelleen saman QAE-kolonnin läpi. Fraktiot 3-. . 11 tästä toisesta kolonnista sisälsivät reagoimatonta substraattia ((-)-enantiomeeri).

·. ; *2 0 Fraktio 70 sisälsi deaminoitua tuotetta.

: * * i (iv) Hajotetut substraattifraktiot vaiheesta (ii) ja (iii) yhdistettiin ja pH säädettiin *· arvoon 7,5. Liuos eluoitiin XAD-16-kolonnin läpi (40 x 2,4 cm), pakattuna veteen.

• · · · : Kolonni pestiin vedellä ja eluoitiin sitten asetoni:vesi-seoksella (1:4 v/v). Fraktiot, .*:·! jotka sisälsivät (-)-enantiomeeriä BCH 189:stä, yhdistettiin ja pakastekuivattiin, 2 5 jolloin saatiin valkoista jauhetta (190 mg).

:: Edellä käytetyt HPLC-menetelmät olivat seuraavat: « I · I « · » · · 18 111723

1. Analyyttinen käänteisfaasi-HPLC

Kolonni : Capital Cartridge Spherisorb ODS-2 (5 μΜ) 150 x 4,6 mm

Eluentti : Ammoniumdivetyfosfaatti (50 mM) + 5 % MeCN

5 Virtaus : 1,5 ml/min

Detektio : UV, 270 nm

Retentioajat : BCH 189 5,5 min : deaminoitu BCH-189 8,1 min

2. Kiraalinen analyyttinen HPLC

10 Kolonni : Cyclobond I Acetyl 250x4,6 mm

Eluentti : 0,2 % trietyyliammoniumasetaatti (pH 7,2)

Virtaus : 1,0 ml/min

Detektio : UV, 270 nm

Retentioajat : BCH 189 11,0 ja 12,5 min 15 : deaminoitu BCH-189 8,5 ja 10,2 min (Biokonversion jälkeen seurattiin piikin häviämistä 12,5 minuutissa, ja tuotteen akkumuloitumista 10,2 minuutissa).

Esimerkki 4 • · · (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-* *2 0 oni : Silmukallinen E. coli B-soluja (ATCC 32848), jotka oli raaputettu hyvin kasva- neesta ravintoagarlevystä, käytettiin siirrostamaan kaksi Florence-pulloa, joista I · · kumpikin sisälsi 250 ml ravintolihalientä. Viljelmää inkuboitiin 37°:ssa ravistaen . . (250 rev/min, 5 cm:n heilahdus) 18 tuntia. Tätä käytettiin sitten siirrostamaan 40 1 ’; /2 5 CDD-kasvualustaa sytidiinin kanssa 70 l:n fermenttorissa.

• : ‘ Fermentaatio-olosuhteet olivat seuraavat: 40 1/min ilmastus, 750 rev/min sekoitusno- peus lämpötilassa 37 °C. Fermenttoriin oli kiinnitetty kolme Rushtonin sekoitinta. ;·' Fermentaatiota suoritettiin 18 tuntia ennen sadonkorjaamista käyttäen Sharplesin

; *·. jatkuvaa sentrifugia. Solupasta (nettopaino 150 g) pakastettiin lämpötilassa -20 °C

:-.-30 ennen solujen rikkomista.

i9 111723 CDD-kasvualusta m L-glutamiinihappo 3 MgS04 0,2 5 K2S04 2,5

NaCl 2,3

Na2HP04 1,1

NaH2P04 0,6

Tehty tislattuun veteen. Steriloitu 121 °C:ssa 30 minuuttia. Sytidiini (1,2 g/1) suoda-10 tettiin steriloituna ja lisättiin ennen siirrostamista.

Pakastettu solupasta (150 g) sulatettiin ja suspendoitiin 750 ml:aan 100 mM Hepes-puskuria (N-[2-hydroksietyyli]piperatsiini-N'-[2-etaanisulfonihappoa]) (pH 7,5), joka sisälsi 1 mM etyleenidiamiinitetra-etikkahappoa (natriumsuolaa) ja 1 mM ditiotreitolia (hajotuspuskuri). Solut hajotettiin kuljettamalla suspensio läpi Manton-15 Gaulin-homogenisaattorin toimimalla n. 5,2 kPa:n paineessa (7500 psi). Tämä suoritettiin kolme kertaa jäähdyttäen suspensiota suunnilleen 5°:een jokaisen homogeni-saattorissa käynnin jälkeen. Homogenaatti kirkastettiin sentrifugoimalla (1400 g; 60 min). Sytidiinin deaminaasiaktiivisuus adsorboitiin Q-Sepharose-kolonniin . . (pedin tilavuus 490 ml), joka oli esitasapainotettu 50 mM Tris (hydroksimetyyli) •t ;^2 0 metyyliamiinilla (pH 7,5), joka sisälsi 1 mM natriumkloridia. Yhdistetyt aktiiviset • · · '·*·’ fraktiot (210 ml) lisättiin fenyyli-Sepharose-kolonniin (pedin tilavuus 490 ml), :esitasapainotettiin puskurinäytteellä, joka sisälsi 3,2 M ammoniumsulfaattia. Sitou-tunut entsyymi eluoitiin gradientilla, jossa oli laskeva ammoniumsulfaattikonsent-: : : raatio. Sytidiinin deaminaasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin (695 ml) ja ; * i *;2 5 osittain puhdistettu entsyymi saostettiin sitten 80 % ammoniumsulfaatilla. Sentri-fugoinnin jälkeen (1400 g; 60 min) pelletti suspendoitiin uudelleen 54 ml:aan super-.·. : natanttia, joka oli saatu edellä, ja säilytettiin 4 °C:ssa.

6,2 ml tätä liuosta sentrifugoitiin (18000 g, 90 min) ja pelletti liuotettiin 24 ml:aan • 0,5 M kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5). Suspensiota dialysoitiin yön yli 1 M

.”‘.30 kaliumfosfaattipuskuria vastaan (pH 7,5). Jäämä (20 ml) laimennettiin sitten samalla tilavuudella tislattua vettä. 35 ml:aan tätä liuosta lisättiin kuivia Eupergit C -helmiä : ‘‘ (1 g) ja seoksen annettiin seistä huoneenlämmössä 150-300 tuntia (määritettiin ” mittaamalla jäännössytidiinideaminaasiaktiivisuus liuoksessa). Immobilisoitu entsyymi pestiin 100 mM Tris/HCl-puskurilla (pH 7,0), joka sisälsi 1 mM EDTA, 35 1 mM DTT, 0,5 M NaCl ja 500 ppm p-hydroksibentsoehapon etyyliesteriä (säilytys- 20 111723 puskuri). Immobilisoitu entsyymi (märkäpaino 2,7 g) säilytettiin tässä puskurissa 4 °C:ssa, kunnes sitä tarvittiin biotransformaatioon.

Esimerkin 1 tuote (3 g) liuotettiin 500 ml:aan tislattua vettä magneettisekoittajalla varustetussa 1 l:n pullossa. Biokonversio suoritettiin 32 °C:ssa pH-stat-faasissa. pH 5 pidettiin vakiona 7,0:ssa lisäämällä 1 M etikkahappoa. Märkäpainoltaan 1 g immo-bilisoituja entsyymihelmiä pestiin tislatulla vedellä ennen reaktion alkamista. Muutosta seurattiin kiraalisella HPLC.llä, joka osoitti, että substraatin (+)-enantio-meeri deaminoitui ensisijaisesti. Reaktion lopussa (72 h) entsyymihelmet suodatettiin pois ja suodosta käytettiin halutun (-)-enantiomeerin eristämiseen.

10 Reaktioseoksen pH säädettiin arvoon 10,5 käyttämällä ammoniakkiliuosta (1 M) ja liuos vietiin Duolite AI 13 -superhartsiin OH-kiertoon (50 ml; 0,4 pedin tilavuutta tunnissa). Uridiinianalogi adsorboitui hartsiin ja (-)-enantiomeeri kulkeutui suoraan läpi. Hartsiin jäänyt (-)-enantiomeeri poistettiin pesemällä 0,04 % ammoniakki-liuoksella (2 pedin tilavuutta; virtausnopeus 0,8 pedin tilavuutta tunnissa).

15 Käytettyjen liuosten ja pesuliuosten (600 ml) pH säädettiin arvoon 7,0 konsentroidulla rikkihapolla ja liuos vietiin XAD16 -hartsiin (50 ml; virtausnopeus 1,4 pedin tilavuutta tunnissa). Kolonni pestiin tislatulla vedellä (2,5 pedin tilavuutta, virtausnopeus 2 pedin tilavuutta tunnissa), ja (-)-enantiomeeri eluoitiin asetoni :vesi-seok- . . sella (1:3) (virtausnopeus 1,5 pedin tilavuutta tunnissa).

« • : 20 (-)-enantiomeerimassaa sisältävä fraktio (4 pedin tilavuutta) konsentroitiin Buchin :··: haihduttimessa pieneen tilavuuteen ennen suodatusta lasisintterin nro 3 läpi.

··· Suodatettu liuos pakastekuivattiin, jolloin siitä saatiin 1,2 g otsikon tuotetta, joka oli M t * : identtistä esimerkissä 3 saadun tuotteen kanssa.

• t · * • · · **' ’ Esimerkki 5 * · ·2 5 Tablettiformulaatiot ♦ · · « · • · ·;·' A. Seuraava formulaatio valmistetaan märkägranuloimalla ainesosat liuoksen : kanssa, joka sisältää providonia vedessä, kuivataan ja seulotaan, minkä jälkeen : ” *; lisätään magnesiumstearaattia ja puristetaan.

21 111723 mg/tabletti (a) Vaikuttava aine 250 (b) Laktoosi B.P. 210 (c) Providoni B.P. 15 5 (d) Natriumtärkkelysglykolaatti 20 (e) Magnesiumstearaatti 5 500 B. Seuraava formulaatio valmistetaan suoraan puristamalla; laktoosi on suoraan puristettavaa laatua.

10 mg/tabletti

Vaikuttava aine 250

Laktoosi 145

Avicel 100

Magnesiumstearaatti 5 15 500 C. (Formulaatio, jossa on kontrolloitu vapautuminen). Formulaatio valmistetaan märkägranuloimalla ainesosat (alla) liuoksen kanssa, jossa on providonia vedessä, kuivaamalla ja seulomalla, jonka jälkeen lisätään magnesiumstearaattia ja puriste- . . taan.

2 0 mg/tabletti :": (a) Vaikuttava aine 500 ··· (b) Hydroksipropyylimetyylisellu- • · · · : loosa (Methocel K4M Premium) 112 (c) Laktoosi B.P. 53 25 (d) Providoni B.P. 28 . . (e) Magnesiumstearaatti 7 700 < * » : L, Esimerkki 6 :...: Kapseliformulaatio ·’ ‘‘30 Kapseliformulaatio valmistetaan sekoittamalla jäljempänä olevat ainesosat ja < · » ' · ': jakamalla kaksiosaiseen kovagelatiinikapseliin.

22 1 11723 mg/kapseli

Vaikuttava aine 125

Laktoosi 72,5

Avicel 50 5 Magnesiumstearaatti 2,5 250

Esimerkki 7

Injektoitava formulaatio

Vaikuttava aine 0,200 g 10 Natriumhydroksidiliuos, 0,1 M q.s. pH-arvoon noin 11.

Steriili vesi q.s. 10 ml:aan

Vaikuttava aine suspendoidaan pieneen määrään vettä (joka voi olla lämmitettyä) ja erän tilavuus tehdään määrätyn suuruiseksi ja suodatetaan steriloitua laatua olevan membraanisuodattimen läpi steriiliin 10 ml:n lasiampulliin ja suljetaan steriileillä 15 sulkijoilla ja sulkijakapseleilla.

Esimerkki 8 . . Peräpuikkoformulaatio • « ’,V mg/peräpuikko : · · * V aikuttava aine 250 *••20 Kova rasva, B.P. 1770 2020 * * * *11 * • < · ’·* * Viidesosa kovasta rasvasta sulatetaan höyryvaippakattilassa korkeintaan 45 °C:n lämpötilassa. Vaikuttava aine siivilöidään 200 μΐη:η siivilän läpi ja lisätään sulatet-

• I

:: tuun pohjaan sekoittamalla käyttäen suuren leikkausvoiman omaavaa sekoitinta, '' ’ t’ :2 5 kunnes saadaan pehmeä dispersio. Pitäen lämpötilaa 45 °C:ssa lisätään jäljellä oleva ; kova rasva suspensioon ja sekoitetaan kunnes saadaan homogeeninen seos. Koko i i · suspensio viedään ruostumattomasta teräksestä valmistetun 250 μΐη:η siivilän läpi ja y’ jatkuvasti sekoittaen annetaan jäähtyä 40 °C:een. Lämpötilassa 38-40 °C 2,02 g • '·· seosta täytetään sopiviin, 2 ml:n muovisiin muotteihin. Peräpuikkojen annetaan : ‘1,: 3 0 jäähtyä huoneenlämpötilaan.

23 1 1 1723

Esimerkki 9 Biologinen aktiivisuus Virustenvastainen aktiivisuus

Esimerkin 2 yhdisteiden virustenvastainen aktiivisuus määritettiin kolmea HIV-1 5 kantaa ja yhtä HlV-2-kantaa vastaan seuraavissa solulinjoissa.

JM-solut, puolikypsä T-solulinja, joka on saatu lymfoblastista leukemiaa sairastavalta potilaalta ja infektoitu HIV-1-kannalla GB8.

C1866-solut, ihmisen T-lymfoblastisolulinja, infektoitu HIV-1-kannalla RF.

MT-4-solut ihmisen T-soluleukemiasolulinja, infektoitu HIV-1-kannalla RF.

10 CEM-solut, ihmisen T-lymfoblastisolulinja, infektoitu HIV-1-kannoilla RF ja U455 tai HIV-2-kannalla ROD.

Virustenvastainen aktiivisuus C8166:ssa, JM:ssäja CEM:ssä määritettiin solusitkok-sen muodostumisen inhiboitumisena (Tochikura et ai. Virology, 164; 542-546) ja MT-4-soluissa formatsaanikonversion inhiboitumisena (Baba et ai., (1987) Biochem 15 Biophys Res Commun., 142 128-134; Mossman (1983) J. Immun Meth; 65, 55-57).

. . Virustenvastaiset aktiivisuudet määritettiin myös analysoimalla HIV p24 -antigeenin *. ' määrä, joka oli syntetisoitunut enantiomeerien läsnä- ja poissaollessa.

:·: Tulokset on annettu taulukoissa 1 ja 2 jäljessä: * · · J'\‘ Taulukko 1 : · ;__50 % virustenvast.aktiivisuus ^Lg/ml)_

Koe__Formatsaani__Solusitkoksen muodostumisen inhiboituminen_

Solut_MT-4_CEM CEM CEM JM_C8166

Virus flHV-11 HIV-1 RF HTV-2 ROD HIV-1 RF HTV-1 IJ455 HIV-1 GR8 HTV-1 RF

l+l-enantiom. 0.28_ 0045 0-07 0,006 0.03_005 ..." M-enantiom 0.20__0,055__0.04_ 0.008_0,05__0.01_ : λ 20 * * » > · ♦ · 24 111723

Taulukko 2 HIV p24:n synteesin inhiboituminen 50 % HIV p24-synteesin __inhiboituminen tjig/mll_

Solut_C8166 I JM MT-4

Virus_RF_GB8 RF

t+Venantiom. 0.021_ 0.033 0.0008 t-Venantiom. 0.016_ 0.016 0.0004 B. Sytotoksisuus 5 Esimerkin 2 yhdisteiden, raseemisen yhdisteen (BCH-189; Esimerkki 1) ja kahden enantiomeerin 50/50-seoksen sytotoksisuudet määritettiin viidessä CD4-solulinjas- sa: H9, JM, CEM, C8166jaU937.

Koeyhdisteet laimennettiin sarjassa 100 pg/ml.sta 0,3 μ^ιηΐ^βη (lopulliset konsent-raatiot) 96-kammioisille mikrotiitterilevyille. 3,6 x 104 solua siirrostettiin levyjen 10 kuhunkin kammioon sekä lääkkeettömille kontrollilevyille. Kun oli inkuboitu 37 °C:ssa 5 päivää, elinkykyisten solujen lukumäärä määritettiin ottamalla solusus-pensionäyte ja laskemalla trypaanisinisen ulkopuolelle jäävät solut hemosytometris- ·.·. sä.

• · • ·

Tulokset on esitetty taulukossa 3.

:’1:15 Taulukko 3 ;: · Sytotoksisuus • · ___50 % sytotoksisuus (jig/ml)__

Yhdiste CEM-solut JM-solut H9-solut U937-solut r8i66-snlnf ί+1-enantiom. 1__LJ_2__4__35_ f-Venantiom. >100__30_>100_>100_>iqq_ BCH-189 3_3J_8_\5_90_ 1:1-seos__2Ji_ND1_ND_ND_ND_ • · · : ND = ei määritetty 20 • 1 ·

Claims (8)

25 1 1 1723

1. Menetelmä valmistaa oleellisesti puhdasta cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli- l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onin (-)-enantiomeeriä tai sen suolaa, esteriä tai esterin suolaa käytettäväksi virustenvastaisena aineena, jolloin (+)-enan-5 tiomeeriä on läsnä enintään 5 paino-%, tunnettu siitä, että erotetaan (-)-enantio-meeri seoksesta, jossa on cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)-(lH)-pyrimidin-2-onin (+)- ja (-)-enantiomeerejä tai niiden suoloja, estereitä tai este-reiden suoloja, erottamisen tapahtuessa entsyymivälitteisellä enantioselektiivisellä katabolismilla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (+)-enan- tiomeeriä on saadussa tuotteessa enintään 2 paino-%.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (+)-enantiomeeriä on saadussa tuotteessa enintään 1 paino-%.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 15 saatu tuote on puhdasta (-)-cis-4-amino-l-(2-hydroksimetyyli-l,3-oksatiolan-5-yyli)- (lH)-pyrimidin-2-onia tai sen suolaa, esteriä tai esterin suolaa.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että . . erotettavien yhdisteiden seos on raseeminen seos. v.;

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että :**i20 entsyymiä käytetään immobilisoidussa muodossa.

• « · !“! 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ';;,' entsyymi on sytidiinideaminaasi.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että :'·,· entsyymi on 5-nukleotidaasi. '•••’25 I I | t · » « « « · 1 • · » » 26 1 1 1723