PL167682B1

PL167682B1 - (1H) -plrymidyn-2-onu PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL167682B1
Application number: PL91293181A
Authority: PL
Inventors: Jonathan A V Coates; Ian M Mutton; Charles R Penn; Richard Storer; Christopher Williamson
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1991-05-02
Publication date: 1995-10-31
Also published as: HU210803A9; NZ238017A; UA40589C2; JP3062475B2; BG60679B1; TW366346B; CN1058214A; IL98025A; EP1062950A2; FI916165A0; US20030004175A1; RO112616B1; EG19958A; BG95705A; NO180377B; JPH1180153A; FI111722B; CA2059263A1; TNSN91029A1; HK1043940A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania (-)-cis-4-amino-1-(2-hydroksymetyIo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)- pirymidyn-2-onu (zwiazku A) i jego farmaceutycznie dopuszczalnej pochodnej, zawierajacych enancjomer ( + ) w ilosci nie wiekszej niz 5% wag., korzystnie nie wiecej niz 2% wag., a bardziej korzystnie mniej niz 1% wag., zwlaszcza zasadniczo wolnego lub wolnego od enancjomeru (+), znamienny tym, ze z mieszaniny zawierajacej takze enancjomer ( + ) wydziela sie enancjomer (-), a wydzielony enancjomer (-) ewentualnie przeprowadza sie w farmaceutycznie dopuszczalna pochodna. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania (-)-cis-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-onu i jego farmacuetycznie dopuszczalnych pochodnych. Związek o wzorze 1

znany także jako BCH-189 lub NGPB-21 jest opisany jako związek o aktywności przeciwwirusowej, zwłaszcza wobec ludzkich wirusów upośledzenia odporności (HIV), czynników wywołujących AIDS (5-ta konferencja anty-AIDS, Montreal Kanada, 5-9 czerwca 1989; Abstract, T.C.O.1 i M.C.P. 63; publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr 382526, które odpowiada polskiemu opisowi patentowymi nr 164785.

167 682 3

Związek o wzorze 1 jest mieszaniną racemiczną dwóch enancjomerów o wzorach 1a i 1b:

i był opisany i zbadany tylko w postaci mieszaniny racemicznej. Jedynym związkiem, który aktualnie nadaje się do leczenia stanów wywołanych przez HIV jest 3'-atzydo-3'-deoksytymidyna (AZT, zydowudyna, BW 509U). Jednak związek ten ma znaczną skłonność do dawania efektów ubocznych, a zatem nie może być stosowany, lub gdy jest stosowany, u wielu pacjentów musi być wycofany. Istnieje zatem ciągłe zapotrzebowanie na związki, które są skuteczne wobec HIV, ale ze znacznie lepszym indeksem terapeutycznym.

Nieoczekiwanie okazało się, że enancjomery związku o wzorze 1 mają równą moc działania wobec HIV, ale jeden z nich, enancjomer (-) ma znacznie niższą cytotoksyczność niż drugi.

Enancjomer (-) ma nazwę chemiczną (-)-cis-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on (dalej określony jako związek (A)). Ma on absolutną stereochemię związku o wzorze la, który ma nazwę (2R,cis)-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan5-ylo)-( 1 H)-pirymidyn-2-on.

Enancjomer (-) związku o wzorze 1 nie został ujawniony w żadnej dotychczasowej publikacji, ani poprzez jego wzór, nazwę chemiczną, ani własności fizyko-chemiczne i terapeutyczne.

Sposobem według wynalazku (-)-cis-'4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)(1H)-pirymidyn-2-on wytwarza się przez wydzielanie enancjomeru (-) z mieszaniny zawierającej także enancjomer (+) i ewentualnie przekształca się go w jego farmaceutycznie dopuszczalne pochodne.

Sposobem według wynalazku związek A otrzymuje się jako zasadniczo wolny od odpowiedniego enancjomeru ( + ), tj. zawierający nie więcej niż około 5%o wag. enancjomeru ( + ), korzystnie nie więcej niż około 2%o, a zwłaszcza mniej niż około 1% wag., a szczególnie jako czysty enancjomer (-).

Jako mieszaninę, z której wydziela się żądany enancjomer (-) stosuje się korzystnie mieszaninę racemiczną.

Rozdzielanie mieszaniny, w tym także mieszaniny racemicznej, przeprowadza się metodą chiralnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), w której stosuje się odpowiednią fazę stacjonarną np. acetylowaną β-cyklodekstrynę lub trioctan celulozy i odpowiedni rozpuszczalnik, np. alkohol, taki jak etanol lub wodny roztwór np. octanu trietyloamonowego. Enancjomer (-) można też wydzielić przez enancjoselektywny katabolizm z udziałem enzymu, stosując odpowiedni enzym, taki jak deaminaza cytydynowa lub przez selektywną enzymatyczną degradację odpowiedniej pochodnej stosując 5'-nukleotydazę. Gdy rozdział prowadzi się enzymatycznie, enzym można stosować w roztworze, lub, bardziej korzystnie w formie unieruchomionej. Enzymy można unieruchomić dowolną metodą znaną w technice, np. przez adsorpcję na żywicy takiej, jak Eupergit C.

Przez farmaceutycznie dopuszczalną pochodną rozumie się dowolną farmaceutycznie dopuszczalną sól, ester lub sól takiego estru, związku (A) lub dowolnego innego związku, który po podaniu pacjentowi, jest zdolny do dostarczenia (bezpośrednio lub pośrednio) związku (A) lub przeciwwirusowo aktywnego metabolitu lub jego reszty.

167 682

Dla fachowca jest oczywiste, że związek (A) może być modyfikowany w celu dostarczenia jego farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych, w grupach funkcyjnych zarówno w części zasadowej, jak i grupie hydroksymetylowej pierścienia oksatiolanowego. Modyfikacja we wszystkich takich grupach funkcyjnych jest włączona w zakres wynalazku. Jednak szczególnie interesujące są farmacuetycznie dopuszczalne pochodne otrzymane przez modyfikację grupy 2-hydroksymetylowej w pierścieniu oksatiolanowym.

Korzystnie estry związku (A) obejmują związki, w których wodór w grupie 2-hydroksymetylowej jest zastąpiony funkcją acylową θ

II

R -· c — , _w k_tó_rej ni_ek_arb_onyl_{owa cz}ęść R estru jest wybrana spośród wodoru, grup prostołańc_uchowych l_ub _rozg_ałęzionych alkilowych (np. metylu, etylu, n-propylu, t-butylu , n-b_utylut, alkok_sy_alkil_owych (np. metoksymetylowe©, arrlkilywych (np. benzylowej), aryloksyalbilowych (^kp. fenoksymetyl owej ), arylowych, (np. fenylowej ewtntualnie podstawionej chlorowcem, grupą C-^alnitową lub Cnalkoksylową); esrty sulfomanowz, tak© ja łp alkilo- lub ara^l0ilotulfyn^glowe (np. metan_osulfonylowe)i estry aminokwasów (np. L-walilowy lub L- iaolzucynowyt i _Ζ^^ι7 _mono_-, di_- lub trifos^ayraoowe.

W odniesizniu do wyżzj opisanych estrów, jeśli niz zaznaczono inaczej, każda znajdująca się _wnich część alkilowa korzystnie zawiera 1 do 16 atomów węgla, zwłaszcza 1 do 4 atomów węgl_a. Każda część arylowa występująca w takich estrach korzystnie obejmuje grupę fenylową.

Zwłaszcza mogą to być estry Ci-ealkilowe, nizpodstawioay zstzr benzylowy lub ester benzylowy podstawiony co najmniej jednym chlorowcem (bromem, chlorem, fluorem lub jodem), gr_upą C₁-6alkilową, C₁-6alkoksylową, nitrową lub triiluorometylową.

Farmaceutycznie dopuszczalne solz związku (A) obejmują sole pochodzące od farmaceutycznie dopuszczalnych kwasów i zasad nieorganicznych i organicznych. Przykłady odpowizdnich kwasów obejmują kwas solny, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, nadchlorowy, fumarowy, maleinowy, fosforowy, glikolowy, mlekowy, salicylowy, bursztynowy, tolueno-p-sulfonowy, winowy, octowy, cytrynowy, metaaosulfoaowy, mrówkowy, benzoesowy, malonowy, naftalenom sulfonowy i benzenosulfonowy. Inne kwasy, takie jak szczawiowy, mimo że samz nie są farmaceutycznie dopuszczalne, mogą być użyteczne jako półprodukty do wytwarzania związków według wynalazku i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami.

Solz pochodzące od odpowizdnich zasad obejmują solz metali alkalicznych (np. sodu), metali zizm alkalicznych (np. magnezu), amonowy, i sole NR% (w których R oznacza C₁-₄alkil).

W dalszej części opisu odnośniki do związku wytwarzanego sposobem według wynalazku obejmują zarówno związek (A), jak i jzgo farmaceutyczniz dopuszczalne pochodne.

Związki wytwarzany sposobem według wynalazku albo same posiadają aktywność przeciwwil rusową i/albo metabolizują do takich związków. Zwłaszcza związki tz są skuteczne w hamowaniu replikacji rztrowirusów, w tym retrowirusów ludzkich, takich jak ludzkie wirusy upośledzenia odporności (HIV), czynniki wywołujące AIDS.

Związek (A) lub jzgo farmaceutycznie dopuszczalna pochodna znajduje zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia zakażeń wirusowych.

Związki wytwarzany sposobem według wynalazku są także użyteczne w leczeniu stanów związanych z AIDS, takich jak zespół związany z AIDS (ARC), postępujące uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (PGL), objawy neurologiczne związane z AIDS (takie jak demen^a lub niedowład kończyn dolnych), odczyn dodatni badania na przeciwciała anty-HIV i odczyn dodatni badania na HIV, mięsak Kaposiego, plamica małopłytkowa i związane występujące przy okazji infekcje, np. Pneumocystis carinii.

Związki tz nadają się także do zapobiegania postępowi klinicznych objawów u osobników z odczynem dodatnim na przeciwciała anty-HW lub antygeny HIV oraz do stosowania w profilaktyce po ekspozycji na HIV.

Związek (A) lub jzgo farmaceutycznie dopuszczalne pochodne można także stosować do zabezpieczenia in vitro płynów fizjologicznych, takich jak krew lub nasienie, przed zanieczyszczeniem wirusami.

167 682 5

Należy rozumieć, że stosowany tu termin „leczenie rozciąga się też na profilaktykę i leczenie rozpoznanych infekcji lub objawów.

Dalej, należy rozumieć, że ilość związku wytwarzanego sposobem według wynalazku, która jest wymagana do leczenia, będzie zmieniać się nie tylko w zależności od konkretnego wybranego związku, lecz także od sposobu podawania, charakteru objawów, które mają być leczone oraz wieku i stanu pacjenta i ostatecznie będzie ustalona według uznania lekarza lub weterynarza. Zwykle jednak odpowiednia dawka będzie w zakresie od około 0,1 do około 750 mg/kg wagi ciała dziennie, korzystnie w zakresie 0,5 do 60 mg/kg/dzień, najkorzystniej 1 do 20 mg/kg/dzień.

Żądana dawka może dogodnie być w postaci jednej dawki lub w postaci dawek podzielonych podawanych z odpowiednimi przerwami, np. w postaci dwóch, trzech lub czterech lub więcej sub-dawek dziennie.

Związek dogodnie podaje się w postaci użytkowej, np. zawierającej 10 do 1500 mg, dogodnie 20 do 1000 mg, najdogodniej 50 do 700 mg składnika aktywnego w jednej dawce.

Idealnie składnik aktywny powinien być podawany w takiej ilości, aby można było uzyskać pik stężenia związku aktywnego w osoczu od około 1 do około 75μΜ, korzystnie od około 2 do około 50 μΜ, najkorzystniej od około 3 do około 30μM. Można to uzyskać, np. przez iniekcję dożylną 0,1 do 5% roztworu składnika aktywnego, ewentualnie w fizjologicznym roztworze soli, lub podając doustnie w postaci pigułek zawierających około 1 do około 100 mg składnika aktywnego. Żądany poziom we krwi można utrzymywać przez ciągły wlew dostarczając około 0,01 do około 5,0mg/kg/godzinę lub wlewy z przerwami zawierające około 0,4 do około 15 mg/kg składnika aktywnego.

Aczkolwiek w celu leczniczym związek wytwarzany sposobem według wynalazku można podawać jako surowy związek, korzystnie jednak składnik aktywny podaje się jako środek farmaceutyczny.

Środek farmaceutyczny zawiera związek (A) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną pochodną wraz z jednym lub więcej ich farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i, ewentualnie, inne lecznicze i/lub profilaktyczne składniki. Nośnik(i) musi(muszą) być „dopuszczalne, to znaczy kompatybilny z innymi składnikami formulacji i nie zakłócający ich przyswajania.

Preparaty farmaceutyczne obejmują preparaty odpowiednie do podawania doustnego, doodbytniczego, donosowego, miejscowego (w tym dopoliczkowego i podjęzykowego), dopochwowego lub pozajelitowego (w tym domięśniowego, podskórnego i dożylnego) lub w postaci odpowiedniej do podawania przez inhalację lub wdmuchiwanie. Środki mogą, gdy jest to odpowiednie, dogodnie mieć postać dzielonych dawek jednostkowych i mogą być wytwarzane dowolną metodą dobrze znaną w farmacji. Wszystkie metody obejmują etap doprowadzenia do połączenia związku aktywnego z ciekłymi nośnikami lub z subtelnie rozdrobnionymi nośnikami stałymi lub z obydwoma, i następnie, w razie potrzeby, ukształtowanie produktu w żądany preparat.

Preparaty farmaceutyczne odpowiednie do podawania doustnego mogą dogodnie mieć dawkowaną postać, taką jak kapsułki, kołaczyki lub tabletki, zawierające określoną uprzednio ilość związku aktywnego; proszku lub granulek; roztworu, zawiesiny lub emulsji. Składnik aktywny może być także w postaci dużych pigułek, powidełka lub_pasty. Tabletki i kapsułki do podawania doustnego mogą zawierać konwencjonalne zarobki, takie jak środki wiążące, wypełniacze, środki smarujące, rozsadzające lub zwilżające. Tabletki mogą być powlekane dobrze znanymi metodami. Ciekłe preparaty do podawania doustnego mogą być w postaci np. wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, syropów lub eliksirów lub mogą mieć postać suchego produktu do rekonstrukcji z wodą lub innym odpowiednim nośnikiem przed użyciem. Takie ciekłe preparaty mogą zawierać konwencjonalne dodatki, takie jak środki zawieszające, emulgujące, niewodne nośniki (które mogą obejmować oleje jadalne) lub środki konserwujące.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą także być sformułowane do podawania pozajelitowego (np. przez iniekcję, np. przez iniekcję jednej dużej dawki lub wlew ciągły) i mogą być w postaci dawek jednostkowych w ampułkach, uprzednio napełnionych strzykawkach, wlewów o małej objętości lub w pojemnikach wielodawkowych z dodanym środkiem konserwującym. Kompozycje mogą mieć takie postacie, jak zawiesiny, roztwory lub emulsje w olejowym lub wodnym nośniku i mogą zawierać środki formujące, takie jak zawieszające, stabilizujące i/lub dyspergujące. Alternatywnie, składnik aktywny może być w postaci proszku, wytworzonego przez

167 682 aseptyczną izolację jałowego ciała stałego lub przez liofilizację z roztworu, do zrekonstytuowania przed użyciem z odpowiednim nośnikiem, np. jałową, niepirogenną wodą.

Do podawania miejscowego na skórę związki mogą być formułowane jako maści, kremy lub lotiony lub jako środki do podawania drogą śródskórną. Maści i kremy można np. wytwarzać z wodną lub olejową podstawą z dodatkiem odpowiedniego środka zagęszczającego lub żelującego. Lotiony można wytwarzać z wodną lub olejową podstawą i zwykle będą także zawierały jeden lub więcej środków emulgujących, stabilizujących, dyspergujących, zawieszających, zagęszczających lub barwiących.

Środki odpowiednie do miejscowego podawania w ustach obejmują pastylki do ssania zawierające składnik aktywny w smakowo-zapachowej podstawie, zwykle w sacharozie i gumie akacjowej lub tragakantowej; pastylki zawierające składnik aktywny w obojętnej podstawie, takiej jak żelatyna i gliceryna lub sacharoza i guma akacjowa; płukanki do ust zawierające składnik aktywny w odpowiednim ciekłym nośniku.

Środki farmaceutyczne do podawania doodbytniczego, w których stosuje się stały nośnik, najkorzystniej mają postać dawkowanych czopków. Odpowiednie nośniki obejmują masło kakaowe i inne materiały zwykle stosowane w technice, a czopki można wytwarzać konwencjonalnie przez zmieszanie związku aktywnego ze zmiękczonym lub stopionym nośnikiem (nośnikami), następnie ochłodzenie i ukształtowanie w formie.

Środki do stosowania dopochwowego mogą mieć postać krążków macicznych, tamponów, kremów, żeli, past, pianek lub spray'ów zawierających oprócz składnika aktywnego odpowiednie znane nośniki.

Związki do podawania donosowego można stosować w postaci ciekłego spray'u lub proszku zawiesinowego lub w postaci kropli.

Krople można wytwarzać z wodną lub niewodną podstawą zawierającą także jeden lub więcej środków dyspergujących, solubilizujących lub zawieszających. Ciekłe spray'e dogodnie podaje się z ciśnieniowego pojemnika.

Przy podawaniu przez inhalację związki dogodnie dostarcza się z insuflatora, rozpylacza lub opakowania ciśnieniowego lub innego dogodnego urządzenia do dostarczenia rozpylonej substancji. Ciśnieniowe opakowanie może zawierać odpowiedni propelant, taki jak dichlorodifluorometan, trichlorofluorometan, dichlorotetrafluoroetan, dwutlenek węgla lub inny odpowiedni gaz. W przypadku aerozolu rozpylanego pod ciśnieniem dawkę jednostkową można wyznaczyć za pomocą zaworu dostarczającego odmierzoną ilość.

Alternatywnie, związki wytwarzane sposobem według wynalazku do podawania przez inhalację lub insulflację, mogą mieć postać suchej kompozycji proszkowej, np. proszkowej mieszanki związku i odpowiedniej podstawy proszkowej, takiej jak laktoza lub skrobia. Kompozycja proszkowa może mieć dawkowaną postać leku, np. kapsułek lub wkładów, np. żelatynowych lub pęcherzykowych paczuszek, z których można podawać proszek za pomocą inhalatora lub insuflatora.

W razie potrzeby można stosować wyżej opisane formulacje przystosowane do przedłużonego uwalniania składnika aktywnego.

Środki farmaceutyczne mogą także zawierać inne składniki aktywne, takie jak środki przeciwbakteryjne lub konserwujące.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą także być stosowane w kombinacji z innymi środkami leczniczymi, np. innymi środkami przeciwzakaźnymi. Zwłaszcza można je stosować razem ze znanymi środkami przeciwwirusowymi.

Kombinacje zawierające związek (A) lub jego fizjologicznie dopuszczalną pochodną wraz z innym leczniczo aktywnym środkiem, zwłaszcza przeciwwirusowym, dogodnie mogą mieć postać środka farmaceutycznego, a zatem środki farmaceutyczne zawierające określoną powyżej kombinację wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Odpowiednie środki lecznicze do zastosowania w takiej kombinacji obejmują acykliczne nukleozydy, takie jak acyklowir lub gancyklowir, interferony, takie jak α,β lub γ-interferon, inhibitory wydzielania nerkowego, takie jak probenecid, inhibitory przenoszenia nukleozydów, takie jak dipirydamol, 2',3'-dideoksynukleozydy, takie jak AZT, 2',3'-dideoksycytydyna, 2',3'167 682 dideoksyadenozyna, 2',3'-dideoksyinozyna, 2',3'-dideoksytymidyna, 2',3'-dideoksy-2',3'-didehydrotymidyna i 2',3'-dideoksy-2',3'-didehydrocytydyna, immunomodulatory, takie jak interleukina II (IL2) i czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), erytropoetyna, amligen, tymomodulina, tymopentyna, foskarnet, rybowaruna i inhibitory wiązania HIV do receptora CD4, np. rozpuszczalny CD4, fragmenty CD4, cząsteczki hybrydowe CD4, inhibitory glikozylacji, takie jak 2-deoksy-D-glukoza, kastanospermina i 1-deoksynojirymycyna.

Pojedyncze składniki takiej kombinacji można podawać albo kolejno albo równocześnie w oddzielnych lub połączonych formulacjach farmaceutycznych.

Gdy związek (A) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną pochodną stosuje się w kombinacji z drugim środkiem leczniczym aktywnym wobec tego samego wirusa, dawka każdego ze związków może być taka sama albo inna niż dawka w przypadku stosowania samego związku. Odpowiednie dawki będą łatwo ustalone przez fachowców.

Związek o wzorze 1 w postaci mieszaniny izomerów cis i trans można wytworzyć w procesie, w którym 1,3-oksatiolan o wzorze 2

w którym grupa anomeryczna L jest grupą, którą można zastąpić, poddaje się reakcji z odpowiednią zasadą. Odpowiednie grupy L obejmują -OR, w której R oznacza grupę alkilową, np. grupę C1-6alkilową, taką jak metylowa lub R oznacza grupę acylową, np. C1-6acylową, taką jak acetylowa lub oznacza chlorowiec np. jod, brom lub chlor.

Związek o wzorze 2 dogodnie poddaje się reakcji z cytozyną lub z odpowiednim prekursorem zasady pirymidynowej (uprzednio zsililowanymi czynnikiem sililującym takim, jak heksametylodisilazan) w kompatybilnym rozpuszczalniku, takim jak chlorek metylenu, stosując kwas Lewisa, taki jak tetrachlorek tytanu, związek cyny (IV), taki jak SnCU lub trifluorometanosulfonian trimetylosililu.

1,3^oks^^iolany o wzorze 2 można wytwarzać np. przez reakcję aldehydu o wzorze 3 z merkaptoacetalem o wzorze 4 w kompatybilnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak toluen, w obecności kwasowego katalizatora, np. kwasu Lewisa, takiego jak chlorek cynku.

HSCH2CH(OC₂H₅)2 4

C6H5CO2CH2CHO 3

Merkaptoacetale o wzorze 4 można wytwarzać znanymi metodami, np. G. Hesse i I. Jorder, Chem. Ber. 95, 924-932 (1052).

Aldehydy i wzorze 3 można wytwarzać znanymi metodami, np. według E. G. Halloąuist i H. Hibbert, Can. J. Research, 8, 129-136 (1933). Dogodnie, surowy aldehyd o wzorze 3 można oczyszczać przez konwersję do krystalicznego adduktu z wodorosiarczynem i następnie rekonwersję do wolnego aldehydu.

W drugim procesie związek o wzorze 1 wytwarza się przez interkonwersję zasady w związku o wzorze 5

167 682 w którym B oznacza zasadę przekształcalną w cytozynę. Taką interkonwersję można przeprowadzić albo przez prostą chemiczną transformację (np. konwersję uracylu w cytozynę) lub przez konwersję enzymatyczną stosując transferazę deoksyrybozylową. Takie metody i warunki interkonwersji zasady są dobrze znane w chemii nukleozydów.

W trzecim procesie związek o wzorze 2a

może być przekształcony w związek o wzorze 1 przez konwersję anomerycznej grupy NH 2 w zasadę - cytozynę metodami dobrze znanymi w chemii nukleozydów.

Wiele z wyżej opisanych reakcji szeroko omawiano w kontekście syntezy nukleotydów, np. w Nucleoside Analogs - Chemistry, Biology and Medical Applications, R. T. Walker i wsp., Plenum Press, Nowy Jork (1979), str. 165-192; T. Keada - Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, 1.1, L. B. Townsened wyd. Plenum Press, Nowy Jork (1988), str. 165-192.

Powyższe reakcje oczywiście mogą wymagać użycia materiałów wyjściowych z zabezpieczonymi grupami funkcyjnymi, zatem uzyskanie żądanego związku może wymagać usunięcia grup ochronnych jako przejściowego lub końcowego etapu. Zabezpieczenie i odbezpieczenie grup funkcyjnych można przeprowadzić konwencjonalnymi metodami.

Tak więc np. grupy aminowe można zabezpieczyć grupą wybraną spośród aralkilowych (np. benzylową), acylowych, arylowych (np. 2,4-dinitrofenylową) lub sililowych; następnie usunięcie grupy zabezpieczającej można przeprowadzić w razie potrzeby przez hydrolizę lub hydrogenolizę stosując standardowe warunki.

Grupy hydroksylowe można zabezpieczyć stosując dowolną konwencjonalną grupę zabezpieczającą, np. jak opisane w „Protective Groups in Organie Chemistry, Wyd. J. F. W. McOmie (Plenum Press, 1973) lub Theodora W. Greene „Protective Groups in Organic Synthesis (John Wiley and Sons, 1981). Przykłady odpowiednich grup zabezpieczających grupy hydroksylowe obejmują grupy wybrane z alkilowych (np. metylowa, t-butylowa lub metoksymetylowa), aralkilowych (np. benzylowa, difenylometylowa lub trifenylometylowa), grup heterocyklicznych takich, jak tetrahydropiranylowa, acylowych (np. acetylowa lub benzoilowa), i sililowych takich, jak trialkilosililowa (np. t-butylodimetylosililowa). Grupy zabezpieczające grupy hydroksylowe można usuwać stosując konwensjonalne techniki. Tak więc np. grupy alkilowe, sililowe, acylowe i heterocykliczne można usunąć przez solwolizę, np. przez hydrolizę w warunkach kwaśnych lub zasadowych. Grupy aralikilowe, takie jak trifenylometylowa, można usunąć podobnie przez solwolizę, np.'przez hydrolizę w warunkach kwaśnych. Grupy aralkilowe, takie jak benzylowa, można odszczepiać np. działając BFa/eterat i bezwodnikiem octowym i usuwając tak wytworzone grupy octanowe w odpowiednim etapie syntezy. Grupy sililowe można także dogodnie usuwać stosując źródło jonów fluorkowych, takie jak fluorek tetra-n-butyloamoniowy.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole związków według wynalazku można wytwarzać jak opisano w opisie patentowym USA nr 4 383 114. Tak więc, w przypadku wytwarzania soli addycyjnej z kwasem związku (A), poddaje się go reakcji z odpowiednim kwasem, stosując konwencjonalne metody. Farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasem można wytwarzać przez reakcję wolnej zasady z odpowiednim kwasem ewentualnie w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika takiego, jak ester (np. octan etylu) lub alkoholu (np. metanolu, etanolu lub izopropanolu). Nieorganiczne sole zasadowe można wytwarzać przez reakcje związku macierzystego z odpowiednią zasadą taką, jak alkoholan (np. metanolan sodu) ewentualnie w obecności rozpuszczalnika, takiego, jak alkohol (np. metanol). Farmacuetycznie dopuszczalne sole można wytwarzać także z innych soli, w tym z innych farmaceutycznie dopuszczalnych soli związku (A) stosując konwencjonalne metody.

167 682

Związek (A) można przeprowadzić w farmaceutycznie dopuszczalny fosforan lub inny ester przez reakcję ze środkiem fosforylującym, takim jak POCI3, lub z odpowiednim środkiem estryfikującym, takim jak halogenek lub bezwodnik kwasowy, odpowiednio. Ester lub sól związku (A) można przeprowadzić w związek macierzysty, np. przez hydrolizę.

Wynalazek jest opisany w następujących przykładach, które w żaden sposób nie ograniczają wynalazku. Wszystkie temperatury są w stopniach Celsjusza.

PÓŁPRODUKT 1 Benzoesan 5-metoksy-l,3-oksationalo-2-metanolu.

Roztwór chlorku cynku (1,6 g) w gorącym metanolu (15 ml) dodano do mieszanego roztworu merkaptoacetaldehydu, acetylu dimetylowego (34,2 g) i benzoiloksyacetaldehydu (48,3 g) w toluenie (1300 ml), który następnie ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną pod azotem przez 50 minut. Oziębioną mieszaninę zatężono, rozcieńczono toluenem, następnie przesączono przez ziemię okrzemkową. Połączone przesącze i toluen przemyto wodnym nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (X 2) i solanką, wysuszono (MgSO 4), po czym odparowano do oleju, który poddano chromatografii kolumn owej na krzemionce (2 kg, Merck 9385), eluowano chloroformem i otrzymano produkt tytułowy w postaci olejowej (45,1 g) mieszaniny anomerów (około 1:1), 1H NMR (DMSO-de) 3,1-3,3 (4H), 3,42 (6H), 4,4-4,6 (4H), 5,41 (1H), 5,46 (1H), 5,54 (1H), 5,63 (1H), 7,46 (4H), 7,58 (2H), 8,07 (4H); γ max (CHBra) 1717, 6 cm'¹.

PóŁpRODUKT 2. (±)-cis- 1-(2-benzoiloksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-( 1 H)-pirymidyno2,4-dion

Mieszaninę subtelnie rozdrobnionego uracylu (9,62 g), heksametylodisilazanu (50 ml) i siarczanu amonu (30 mg) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną pod azotem aż do otrzymania przezroczystego roztworu. Roztwór oziębiono, po czym odparowano do bezbarwnego oleju, który rozpuszczono w atmosferze azotu w acetonitrylu (100 ml). Roztwór dodano do mieszanego i oziębionego w lodzie roztworu benzoesanu 5-metoksy-1,3-oksatiolano-2-metanolu (półprodukt 1) (19,43 g) w acetonitrylu (600 ml) i dodano tiifluoiometanosulfonian trimetylosililu (14,8 ml), usunięto -łaźnię lodową, a roztwór ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną pod azotem przez 45 minut. Po oziębieniu i odparowaniu pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na 1 kg żelu krzemionkowego (Merck 9385) eluując układem chloroform/metanol 9:1. Odpowiednie frakcje oziębiono i odparowano uzyskując surową pozostałość. Poddano ją frakcjonowanej krystalizacji z minimalnej ilości gorącego metanolu (około 1200 ml) i otrzymano związek tytułowy (6,32 g) w postaci białych kryształów. 1H NMR (d^eDMSO) δ 11,36 (1H, bs), 7,50-8,00 (6H, m), 6,20 (1H, t),_ 5,46 (2H, m), 4,62 (2H, m), 3,48 (1H, m), 3,25 (1H, m).

PÓŁPRODUKT 3. (±)-cis-4-amino-1-(2-benzoiloksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-( 1H)pirymidyn-2-on

Metoda (a). Zawiesinę cytozyny (20,705 g) i siarczanu amonu (kilka mg) w heksametylodisilazanie (110 ml) mieszano i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną do wrzenia przez 2,5 godziny pod azotem. Usunięto rozpuszczalnik, przez odparowanie, a stałą pozostałość rozpuszczono w suchym acetonitrylu (350 ml). Roztwór ten przeniesiono stosując technikę elastycznej igły do mieszanego, oziębionego lodem roztworu benzoesanu 5-metoksy-1,3-oksatiolano-2-metanolu (Półprodukt 1) (43,57 g) w acetonitrylu (650 ml) pod azotem. Dodano trifluorometanosufonian trimetylosililu (33 ml), roztwór pozostawiono do ogrzania się do temperatury otoczenia (1,5 godziny), po czym ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w ciągu nocy. Pozostałą mieszaninę zatężono, rozcieńczono nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (500 ml), następnie wyekstrahowano octanem etylu (3 X 500 ml). Połączone ekstrakty przemyto wodą (2 X 250 ml) i solanką (250 ml), wysuszono (MgSC>4), po czym odparowano do piany, którą poddano chromatografii kolumnowej na krzemionce (600 g, Merck, 7734), eluowano mieszaninami octan etylu-metanol i uzyskano mieszaninę anomerów (ok. 1:1, 31,59 g). Mieszaninę krystalizowano z wody (45 ml) i etanolu (9,0 ml) i otrzymano ciało stałe (10,23 g), które rekrystalizowano z etanolu (120 ml) i wody (30 ml) uzyskując produkt tytułowy w postaci białego ciała stałego (9,26 mg); max (MeOH) 229,4 mm ( E^1% 610); 272,4 mm ( %;_in 293); ¹H NMR (DMSO d⁶) 3,14 (1H), 3,50 (1H), 4,07 (2H), 5,52 (1H), 5,66 (1H),

6,28 (1H), 7,22 (2H), 7,56 (2H), 7,72 (2H), 8,10 (2H).

Metoda (b). Tlenochlorek fosforu (7,0 ml) wkroplono do mieszanej, chłodzonej lodem zawiesiny 1,2,4-triazolu (11,65 g) w acetonitrylu (120 ml), po czym, utrzymując temperaturę wewnętrzną poniżej 15°C, wkroplono trietyloaminę (22,7 ml). Po 10 minutach powoli dodano roztwór (±)-cis10

167 682

1- (2-benzoiloksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyno-2,4-dionu (Półprodukt 2) (6,27g) w acetonitrylu. Mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez całą noc. Mieszaninę oziębiono w łaźni lodowej i powoli dodano trietyloaminę (30 ml), a następnie wodę. Wytworzony roztwór odparowano, a pozostałość rozdzielono pomiędzy nasycony roztwór wodorowęglanu sodu (400 ml) i chloroform (3X200 ml). Połączone ekstrakty chloroformowe wysuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i odparowano uzyskując surową pozostałość (9,7 g). Rozpuszczono ją 1,4-dioksanie (240 ml) i dodano wodny stężony roztwór amoniaku (0,880 g, 50 ml). Po

1,5 godzinie roztwór odparowano, a pozostałość rozpuszczono w metanolu. Spowodowało to wytrącenie się osadu, który odsączono. Ługi macierzyste oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (Merck 9385, 600 g). Zebrano odpowiednie frakcje i odparowano uzyskując związek tytułowy w postaci ciała stałego o zabarwieniu jasno szarawobrązowym (2,18 g) takiego samego, jak otrzymane Metodą (a).

Przykładl. (±)-(cis)-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn2- on.

Zawiesinę (cis)-4-amino-1-(2-benzoiloksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn2-onu (Półprodukt 3) (8,19 g) i żywicy Amberlite IRA-400 (OH) (8,24 g) w metanolu (250 ml) mieszano i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 12,5 godz. Ciało stałe odsączono, po czym przemyto metanolem. Połączone przesącze odparowano. Pozostałość roztarto z octanem etylu (80 ml). Wytworzone białe ciało stałe zebrano przez przesączenie i uzyskano produkt tytułowy (5,09 g), ¹H NMR (DMSO-de) 3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (1H), 5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

Przykład II. Rozdzielanie enancjomerów (±)-(cis)-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-onu na drodze chiralnej HPLC.

(A) Produkt racemiczny z przykładu I (25 mg) poddano preparatywnej HPLC w następujących warunkach:

Kolumna: Merck Hibar trioctan celulozy, 250 X 10 mm, 10pm,

Eluent: etanol,

Przepływ: 3 ml/min.;

Detekcja: uV, 270 nm;

Temperatura: otoczenia.

Odparowanie odpowiednich zebranych frakcji dało (2R,cis)-4-amino-1-(2-hydroksymetylo1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on (6,8 mg, e.e. ok. 100%) i (2S, cis-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on (3,6mg, e.e. ok. 90%).

(B) Produkt racemiczny z przykładu I (26 mg) poddano preparatywnej HPLC w następujących warunkach:

Kolumna: ASTEC cyclobond I acetyl, 250 X 4,6 mm,

Eluent: 0,2% octan trietyloamoniowy (wytworzony przez dodanie lodowatego kwasu octowego do 0,2% trietyloaminy w wodzie, do końcowego pH 7,2);

Przepływ: 2ml/min;

Detekcja: UV, 300 nm,

Temperatura: otoczenia.

Po odparowaniu odpowiednich frakcji uzyskano surowy (2R, cis)-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on (25mg) i surowy (2S, cis)-4-amino-1-(2hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on (17mg). Frakcje te oddzielnie poddano dalszej preparatywnej HPLC w następujących warunkach:

Kolumna: ASTEC cyclobond I acetyl, 250 X 4,6 mm,

Eluent: 15 mM octan amonu, pH 6,8;

Przepływ: 0,5 ml/min,

Detekcja: UV, 300 nm,

Temperatura: 5°.

Po odparowaniu odpowiednich zebranych frakcji otrzymano (2R,cis)-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on (5,0 mg, e.e. ok. 91%) i (2S,cis)-4-ammo-l-(2hydroksymetylo-1,3-oksa.tiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on (7,6mg, e.e. ok. 96%).

167 682 11

Przykład III. (-)-cis-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn2-on.

(i) sól amonowa dwuwodoroortofosforanu (±)-cis-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-( 1 H)-pirymidynonu.

Do zimnej (0°) mieszanej zawiesiny (±)-cis-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5ylo)-(1H)-pirymidyn-2-onu (1,00 g) (przykład I) w suchym trimetylofosforanie (20 ml) dodano tlenochlorek fosforu (2,44 ml) i mieszano mieszaninę w 0°C przez 35 min., po czym gwałtownie oziębiono wodą z lodem (60 g). pH oziębionej mieszaniny doprowadzono do 2,5 dodatkiem 1N wodnego roztworu wodorotlenku sodowego, po czym naniesiono na kolumnę z węglem drzewnym (10 g, DARCO), którą eluowano wodą, następnie układem etanol - wodny roztwór amoniaku. Frakcje zawierające surowy monofosforan połączono i zatężono.

Wytworzony roztwór wprowadzono do kolumny zawierającej 25 g DEAE Sephadex A-25 (forma-HCOa). Przeprowadzono elucję gradientem wody (120 ml) do 0,1 M NH4HCO3 (240 ml), następnie 0,2, 0,3 i 4 M NH4HCO3 (odpowiednio 120, 240,400 ml). Odpowiednie frakcje połączono i zatężono. Pozostały roztwór rozcieńczono wodą (40 ml) i liofilizowano uzyskując produkt tytuipi% 1 łowy w postaci białego ciała stałego (1,37 g); max (pH 6 bufor), 271,0 nm ( E^_m 190); H NMR (D20) 3,23 (1H), 3,55 (1H), 4,0-4,2 (2H), 5,43 (1H), 6,07 (1H), 6,33 (1H), 8,08 (1H).

(ii) (2R,cis)-4-amino-1 -(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-( 1 H)-pirymidyn-2-on i (2S , cis)-4-a m i n o-1 -(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-( 1 H)-pirymidyn-2-on.

Do roztworu soli amonowej 6'-dwuwodoroortofosforanu (±)-cis-4-amino-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-onu (1,35g) w buforze [30ml, wytworzonym z glicyny (526 mg) i chlorku magnezu (190 mg) w wodzie (100 ml)] dodano 5'-nukleotydazę (z jadu grzechotnika) [EC 3.1. 3.5] (60 mg przy ilości 17jednostek/mg) i inkubowano mieszaninę w 37°C przez 2,5 godziny. Dodano więcej enzymu (20mg) i inkubowano jeszcze przez dalsze 3,5 g. Wytworzoną mieszaninę wprowadzono do kolumny DEAE Sephadex A-25 (forma-HCO3). Eluowano wodą (160 ml), następnie 0,1,0,2,0,3 i 0,4 M NH 4HCO 3 (każdorazowo 200 ml). Odpowiednie frakcje zawierające pierwszy wyeluowany składnik połączono i odparowano, pozostałość poddano chromatografii kolumnowej na krzemionce (60 g, Merck 7734) i eluowano mieszaninami chloroform-metanol.

Po odparowaniu odpowiednich frakcji z octanu etylu - metanolu otrzymano ( + )-(cis)-4amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on w postaci ciała stałego barwy białej (0,30 g) [a] D²¹ + 137° (c. 1,04 MeOH); ¹H NMR (DMSO) δ 3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (1H), 5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

Odpowiednie frakcje z kolumny Sephadex, zawierające drugi wyeluowany składnik, połączono i odparowano. Pozostałość rozpuszczono w wodzie (30 ml), dodano alkaliczną fosfatazę (z Escherichia coli) [EC 3.1.3.1] (1,5 ml przy 416 jednostkach/ml), następnie inkubowano w 37° w ciągu 1 godziny. Rozpuszczalnik usunięto przez odparowanie, a pozostałość poddano chromatografii kolumnowej na krzemionce (60 g, Merck 7734) i eluowano mieszaninami chloroform metanol. Po odparowaniu odpowiednich frakcji z metanolu - octanu etylu otrzymano (-)-(cis)-4amino-1-(2-hydroksymetvlo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-on w postaci białego ciała stałego (0,32 g); [a] D21 -132° (c. 1,08 MeOH); Ή NMR (DMSO) δ 3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (1H), 5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).

Przykład IV. (-)-cis-4-amino-1 -(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-( 1 H)-pirymidyn2-on (i) Każdą z trzeć tr kocb ko-mililitrowych z pożywką (Oxo(d Ltd.) zaszczepiono za pom ocą ezy Escherichia ckli (ATCC 23848) zdrapaną z płytki z agarem (Nutrient Agar). Kolby inkubkwano przez noc w 37°C wytrząsając je z prędkość 250 obr/min., po czym każdą kolbę wykorzystano do zaszczepienia 41 podłoża CDD (3 g/l kwasu glutaminowego, 0,2 g/l MgSO 4,2,5 g/l K2SO4,2,3 g/l NaCl, 1,1 g/l Na₂HPO4 · 2H 2O, 0,6 g/l NaH 2PO4 · 2 H 20, 1,2 g/l cytydyny/ w 7-litrkwym fermentkrce. Harkw-e wrkoadzonk przy 750 obr./min. w 37°C z napowietrzaniem przy 4 l/min. Po 24 godzinach wzrostu komórki zebrano wrzec odwirowanie (5000 g 30 minut) i uzyskano 72 g mokrej masy. Osad komórkowy zawieszono w 300 ml 20 mM buforu Tris HCl (pH 7,5) i rozerwano przez sonikację (4 X 45 sekund) Debris komórkowe usunięto wicec odwirowanie, a białko w supernatancie wytrącono dodatkiem siarczanu amonu do 75% nasycenia. Wytrącony osad zebrano przez

167 682 odwirowanie (30 000 g,-30 minut) i zawieszono w 25 ml bufor HEPES (100 mM, pH 7,0) zawierającego siarczan amonu (75% nasycenia). Roztwór enzymu wytworzono przez odwirowanie przy 12000 obr./min. w ciągu 30 minut. Supernatant odrzucono, a osad rozpuszczono w buforze Tris HC1 (pH 7,0; 100 mM) do początkowej objętości.

(ii) Produkt z przykładu I (115 mg) rozpuszczono w wodzie (100 ml) i mieszano. Dodano roztwór enzymu (0,5 ml) i mieszaninę utrzymywano przy stałym pH przez ciągłe dodawanie HCl (25 mM). Konwersję kontrolowano za pomocą chiralnej HPLC, która wykazała, że enancjomer ( + ) substratu został korzystnie dezaminowany. Po 22 godzinach enancjomer (+) substratu (RT

12.5 min.) został całkowicie usunięty, a pH roztworu doprowadzono do wartości 10,5 dodatkiem stężonego wodorotlenku sodu.

Roztwór, wytworzony jak powyżej, przepuszczono przez kolumnę QAE Sephadex (A25; Pharmacia; 30 X 1,6 cm) wstępnie zrównoważoną do pH 11. Kolumnę przemyto wodą (200 ml), następnie HCl (0,1 M). Pobrano frakcje (40 ml) i poddano analizie metodą HPLC z odwróconymi fazami. Frakcje 5-13, zawierające nieprzereagowany enancjomer substratu, połączono i za pomocą HCl pH doprowadzono do wartości 7,5.

pH frakcji 47, zawierającej deaminowany produkt, doprowadzono do 7,5 za pomocą rozcieńczonego NaOH. Analiza metodą chiralnej HPLC wykazała, że materiał ten był mieszaniną składającą się z jednego enancjomeru (RT 10,2 min.) jako składnika głównego i innego enancjomeru (RT

8.5 min.) jako składnika drugorzędowego (e.e. ok. 90%).

(iii) Powyższy etap (ii) powtórzono w większej skali. Związek z przykładu I (363 mg) w 250 ml wody inkubowano z roztworem enzymu (0,5 ml), wytworzonym jak w etapie (i). Po 18 i 47 godzinach dodano jeszcze próbki (0,5 ml) enzymu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 70 godzin, po czym pozostawiono do odstania na dalsze 64 godziny. Analiza metodą chiralnej HPLC wykazała, że enancjomer (+) substratu został całkowicie zdeaminowany, a wytworzony roztwór; doprowadzono do wartości pH 10,5 za pomocą NaOH.

Powyższy roztwór załadowano do tej samej kolumny QAE i eluowano jak w etapie (i). Połączono frakcje 2-6, zawierające mieszaninę resztkowego substratu i deaminowanego produktu. Frakcje 7-13, zawierające resztkowy substrat (enancjomer (-)) zebrano razem i nastawiono pH na 7,5. Frakcje 25-26, zawierające deaminowany produkt połączono i zobojętniono.

Powyższe frakcje 2-6 były regulowane przez tę samą kolumnę QAE. Frakcje 3-11 z tej drugiej kolumny zawierały nieprzereagowany substrat [enancjomer (-)]. Frakcja 70 zawierała deaminowany produkt.

(iv) Frakcje rozdzielonego substratu z etapu (ii) i (iii) połączono i doprowadzono pH do 7,5. Roztwór ten eluowano przez kolumnę XAD-16 (40X2,4 cm) wypełnioną wodą. Kolumnę przemyto wodą, a następnie eluowano mieszaniną aceton:woda (1:4 obj./obj.).

Frakcje zawierające enancjomer (-) z BCH 189 zebrano razem i poddano liofilizacji i uzyskano biały proszek (190 mg).

Powyżej stosowano następujące metody HPLC:

1. Analityczna HPLC z odwróconymi fazami

Kolumna:

Eluent:

Przepływ: Detekcja: Czas retencji:

ładunek zasadniczy

Spherisorb ODS-2- (5 μΜ)

150X4,6 mm dwuwodoroortofosforan amonowy (50 mM) + 5% MeCN ml/min.

UV, 270 nm

BCH 189 5,5 mm. deammowany BCH - 189, 8,1 min.

2. Chiralna analityczna HPLC

Kolumna: Cyclobond I Acetyl

250X4,6 mm

Eluent: 0,2% octanu trietyloamoniowy (pH 72))

Przepływ: 1,0ml/mm.

Detekcja: UV, 270 nm

Czas retencji: BCH 189 11,0 1 12,5 min . deaminowany BCH 1 189,

8,5 i 10,2 min.

167 682 13 (Biokonwersję śledzono przez kontrolowanie straty piku przy 12,5 min. i akumulowanie produktu przy 10,2 min.).

PrzykładV. (-)-cis-4-amino-1 -(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-( 1 H)-pirymidyn2-on

Ezę komórek B E. coli (ATCC 32848) zdrapanych ze studzienki na płytce z pożywką agarową wykorzystano do zaszczepienia dwóch kolb płaskodennych, z których każda zawierała 250 ml bulionu. Hodowlę inkubowano w 37°C z wytrząsaniem (250 obr./min., skręt 5 cm) przez 18 godzin. Hodowlę tę użyto następnie do zaszczepienia 401 podłoża CDD, z cytydyną, w 701 fermentorze.

Warunki fermentacji były następujące: napowietrzanie 40 l/min., szybkość mieszania 750 obr./min. w temperaturze 37°C. W fermentorze zainstalowano trzy wirniki Rushtona. Fermentacja trwała 18 godzin przed zebraniem komórek, które przeprowadzono wykorzystując ciągłą wirówkę Sharples'a. Pastę komórkową (150 g wagi netto) zamrożono w -20°C przed rozerwaniem komórek.

Podłoże CDD	g/l
Kwas L-glutaminowy	3
MgSO..	0,2
K2SO4	2,5
NaCl	2,3
Na2HPO4	1,1
NaH2PO4	0,6

Pożywkę przygotowano z wodą destylowaną. Wyjałowiono w 121° w ciągu 30 minut. Przed zaszczepieniem dodano jałową cytydynę (1,2 g/l).

Zamrożoną pastę komórek (150 g) rozmrożono i zawieszono w 750 ml 100 mM buforu Hepes (kwas-N-p-hydroksyetylojpiperazyno-N^-etanosulfonowy] (pH 7,5) zawierającego 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (sól sodowa) i 1 mM ditiotreitolu (bufor do rozrywania). Komórki rozrywano przez przepuszczenie zawiesiny przez homogenizator Manton-Gaulina pracujący pod ciśnieniem 51,71 MPa. Etap ten przeprowadzono trzy razy oziębiając zawiesinę do około 5°C po każdym przejściu przez homogenizator. Homogenat sklarowano przez odwirowanie (1400 g; 60 min.). Aktywność dezaminazy cytydynowej zaadsorbowano na kolumnie Q-Sepharose (objętość złoża 490 mg) wstępnie zrównoważonej 50 mM Tris (hydroksymetyro/melaminy/pH 7,5) zawierającej 1 mM chlorku sodu. Zebrane frakcje aktywne (210 ml) dodano na kolumnę fenylSephrose (objętość złoża 490 ml), wstępnie zrównoważoną buforem do próbek zawierającym 3,2 M siarczanu amonu. Związany enyzm eluowano gradientem malejącego stężenia siarczanu amonu. Frakcje zawierające aktywność dezaminazy cytydynowej zebrano (695 ml), po czym wytrącono częściowo oczyszczony enzym za pomocą 80% siarczanu amonowego. Po odwirowaniu (1400 g; 60 min.) osad zawieszono ponownie w 54 ml powyższego supematantu i przechowywano w 4°C.

6,2 ml tego roztworu odwirowano (18 000 g, 90 min.) i osad rozpuszczono w 24 ml buforu 0,5 M fosforanu potasu (pH 7,5). Zawiesinę dializowano w ciągu nocy do buforu 1 M fosforanu potasu. Następnie retentat (20 ml) rozcieńczono równą objętością wody destylowanej. Do 35 ml tego roztworu dodano kuleczki suchego Eupergitu C (1 g) i pozostawiono mieszaninę do odstania w temperaturze pokojowej przez 150-300 godzin (określono mierząc pozostałą aktywność dezaminy cytydynowej w roztworze).

Unieruchomiony enzym przemyto buforem - 100 mM Tris/HCl (pH 7,0) zawierający 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 M NaCl i 500 ppm estru etylowego kwasu p-hydroksybenzoesowego (bufor do przechowywania). Unieruchomiony enzym (2,7 g mokrej masy) przechowywano w tym buforze w 4°C aż do żądanej biotransformacji.

Produkt z przykładu 1 (3 g) rozpuszczono w 500 ml wody destylowanej w 1-litrowej kolbie z mieszaniem magnetycznym. Biokonwersję prowadzono w 32°C w pH-stat. Utrzymywano stałe pH 7,0 za pomocą dodatku 1 M kwasu octowego, 1 g mokrej masy kuleczek unieruchomionego enzymu przemyto wodą destylowaną przed rozpoczęciem reakcji. Konwersję kontrolowano za pomocą chiralnej HPLC, która wykazała, że zdeaminowany został przede wszystkim enancjomer (+) substratu. Po zakończeniu reakcji (72 godziny) kuleczki enzymu odsączono i przesącz użyto do wydzielenia żądanego enancjomeru (-).

167 682 pH mieszaniny reakcyjnej doprowadzono do wartości 10,5 stosując roztwór amoniaku (1 M) i naniesiono mieszaninę na żywicę Duolite Al 13 super w cyklu OH (50 ml; objętości złoża 0,4 na godzinę). Na żywicy zaadsorbowano analog urydyny i przepuszczono przez nią enancjomer (-). Pozostały jeszcze na żywicy enancjomer (-) usunięto przez przemycie 0,04% roztworem amoniaku (2 objętości złoża; szybkość przepływu 0,8 objętości złoża/godzinę).

pH wyczerpanych roztworów i popłuczyn (600 ml) doprowadzono do pH 7,0 za pomocą stężonego kwasu siarkowego i roztwór naniesiono na żywicę XAD16 (50 ml; szybkość przepływu 1,4 objętości złoża na godzinę). Kolumnę przemyto wodą destylowaną (2,5 objętości złoża, szybkość przepływu 2 objętości złoża na godzinę) i eluowano enancjomer (-) mieszaniną aceton:woda 1:3 (szybkość przepływu 1,5 objętości złoża na godzinę).

Połączoną frakcję zawierającą enancjomer (-) (4 objętości złoża) zatężono w wyparce Buchi do małej objętości przed przesączeniem przez filtr ze spiekanego szkła nr 3. Przesączony roztwór liofilizowano i otrzymano 1,2 g produktu tytułowego identycznego, jak produkt otrzymany w przykładzie 4.

Formulacje w postaci tabletek

A. Następującą fącmulację wywarza się p rzęz granglowanie na mokro składkików k roztworem providonu w wodria, suszenie, skrining, o następnie dodanie stearynianu magnezu i prasowanie.

mg/tabletkę
a) Składnik aktywny	250
b) Laktoza B. P.	210
c) Pravióooa B. P.	15
d) Glikole sodowy skorbi	20
e) Stekrroiao magnezu	5
	500

B. NastNpującą ή^ητη^ε^ wyfwarza sśę przęz brapoerednie sprasowanie; Sakaozajes- aypu do bezpośredniego prasowania.

mg/tabletkę

Składnik aktywny	250
Laktoza	145
Avicel	100
Stearynian magnezu	5

500

C. o cfgaZowunym oyclmapio). Furmulacrę wcj^r^w się przęz granglowume po mokro składników (poniższych) z roztworem providaoę w wodnie, suszenie i skr^mg, następnie przez dodatek stearynianu magnezu i prasowanie.

mg/tabletkę

a) Składnik aktywny	500
b) Hrórakjycrocylomatylocalęlaza
(Methocel K4M Premium)	112
c) Laktoza B. P.	53
ó) Provióaoa B. P.	28
e) Stasłyoiko magnezu	7

700

167 682

Formulacja w postaci kapsułek

Formulację w postaci kapsułek wytwarza się przez zmieszanie poniższych składników i napełnienie mieszaniną dwuczęściowej twardej żelatynowej kapsułki.

mg/tabletkę
Składnik aktywny	125
Laktoza	72,5
Avicel	50
Stearynian magnezu	2,5
	250

Formulacja do wstrzyknięć

Składnik aktywny 0,200 g 0,1 M roztwór wodorotlenku sodu w ilości do pH około 11

Woda jałowa w ilości uzupełniającej do 10 ml.

Składnik aktywny zawiesza się w pewnej ilości wody (która może być ciepła) i za pomocą wodorotlenku sodu nastawia się pH na około 11. Następnie uzupełnia się do żądanej objętości i sączy się przez filtr membranowy do sterylizacji do wyjałowionej 10-mililitrowej szklanej fiolki i zamyka się sterylnym zamknięciem i plombuje się.

mg/czopek
Składnik aktywny	250
Tłuszcz utwardzony B. P.	1770
	1020

1/5 utwardzonego tłuszczu topi się w panwi z płaszczem parowym w maksymalnej temperaturze 45°C. Składnik aktywny przesiewa się przez sito 200μm i dodaje się do stopionej podstawy mieszając za pomocą mieszadła z wysokim ścinaniem, aż do uzyskania gładkiej dyspersji. Utrzymując mieszaninę w 45°C, do zawiesiny dodaje się pozostały tłuszcz utwardzony i miesza się do otrzymania homogenicznej mieszaniny. Całą zawiesinę przepuszcza się przez 250 μm sito ze stali nierdzewnej i ciągle mieszając pozostawia się do ochłodzenia do 40°C. W temperaturze 38°C do 40°C 2-mililitrowe formy z tworzywa sztucznego napełnia się 2,02 g mieszaniny. Czopki pozostawia się do ochłodzenia do temperatury pokojowej.

Aktywność biologiczna

A. AktyAność n^rzeciwwćrusowa. Oznaczonc aktywność przćciwwćiwsową związków z przykładu II wobec trzech szczepów HIV-1 i jednego szczepu HIV-2 w następujących liniach komórkowych.

Komórki JM, linię półdojrzałych komórek T pochodzących od pacjentów z biłaczką limfoblastyczną, zakażono HIV-1 szczepem GB8.

Komórki C8166, linię ludzkich komórek T-limfoblnstoidnlnynh, zakażono HIV-1 szczepem RF.

Komórki MT-4, linię ludzkich komórek T, zakażono HIV-1 szczepem RG.

Komórki CEM, linię ludzkich komórek T-limfzblnstoidalnynh, zakażono HIV-1 szczepem RF i U455 lub HIV-2 szczepem ROD.

Aktywność przeciwwirusouą w komórkach C8166, JM i CEM oznaczono przez hamowanie tworzenia się. syncytium (Tochikura i wsp., Virology, 164, 542-546), a w komórkach MT-4 przez hamowanie konwersji formazanu (Baba i wsp., (1987) Biochem Biophys Res. Commun., 142, 128-134; Mossman (1983) J. Immun. Meth. 65, 55-57). Aktywność przeciwwirusouą oznaczano także przez analizowanie ilości antygenu HIV p24 syntetyzowanego w obecności i nieobecności enancjomerów.

Wyniki są przedstawione w tabelach 1 i 2 poniżej.

167 682

Tab e 1 a 1

50% aktywności przecioΌirasooej (pl/mg)
Próbka	Forminn		Hamowanie tworzenia się syagyticm
Komórki	MT-4	CEM	CEM	CEM JM	C8166
Wirus (HIV-1)	HIV-1 RF	HIV-2 ROD	HIV-RF	HIV-1 U455 HIV-1 GB8	HIV-1 RF
(+ )^^cjomer	0,28	0,045	0,07	0,006 0,03	0,05
(-^eaaal cjomer	0,20	0,055	0,04	0,008 0,05	0,01

Tabela 2

50% hamowania syntezy HIV p24
Komórki	C8166	JM	MT-4
Wirus	RF	GB8	RF
(+ )-ynaacjomyr	0,021	0,033	0,0008
(l)-enaagjomyr	0,016	0,016	0,0004

B. Cytotokoyoznyjć. ϋνΐΌίοΚονοζΓ^ό owią/lców z wrzypładu II, związliu raceir^iczmigo (BCH-189; przykład I) i mieszaniny 50/50 dwóch eaancjomerów określono w pięciu liniach komórkowych CD4:H9, JM, CEM, C8166 i U937.

Związki do testu rozcieńczano seryjnie od 100pg/ml do 0,3pg/ml (końcowe stężenia) w 96 studzienkach płytek do mikromiareczkowania. Do każdej studzienki płytek, w tym także płytek kontrolnych wolnych od leku, wysrgrepiono 3,6 X 10⁴ komórek. Po inkubacji w 37°C przez 5 dni oznaczono liczbę żyjących komórek przez pobranie próbki zawiesiny komórek i zSigzeniy w hemocytometrze komórek z wyłączeniem komórek zabarwionych błękitem trypanowym.

Wyniki są przedstawione w tabeli 3.

Tabela 3 Cytotoksygzaość

50% gytotoasygraośgi (pg/ml)
Zoiązya	Komórki CEM	Komórki JM	Komórki H9	Komórki U937	Komórki C8166
( + tlyaaacjomyr	1	1,5	2	4	35
(l)-yaaacjomyr	100	30	100	100	100
BCH-189	3	3,5	8	15	90
Mieszanina 1:1	2,5	ND^X	ND	ND	ND

ND = niz określono

DyrartIuyat WyUIoaijto UP RP. NiZIiI 90 egz Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania (-)-cis-4-amino-1-(2-hydroksymetylo-1,3-oksatiolan-5-ylo)-(1H)-pirymidyn-2-onu (związku A) i jego farmaceutycznie dopuszczalnej pochodnej, zawierających enancjomer ( + ) w ilości nie większej niż 5% wag., korzystnie nie więcej niż 2% wag., a bardziej korzystnie mniej' niż 1% wag., zwłaszcza zasadniczo wolnego lub wolnego od enancjomeru ( +), znamienny tym, że z mieszaniny zawierającej także enancjomer ( +) wydziela się enancjomer (-), a wydzielony enancjomer (-) ewentualnie przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalną pochodną.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje mieszaninę racemiczną związków.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że rozdzielanie prowadzi się metodą chiralnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w wysokosprawnej chromatografii cieczowej jako fazę stacjonarną stosuje się acetylowaną β-cyklodekstrynę lub trioctan celulozy.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że rozdzielanie prowadzi się przez katabolizm selektywny wobec enancjomerów z pośrednictwem enzymów.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że enzym stosuje się w postaci unieruchomionej.
7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że jako enzym stosuje się deaminazę cytydynową.
8. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że jako enzym stosuje się 5'-nukleotydazę.