WO2019013570A2 - 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법 - Google Patents

인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering phosphoric acid from a fermentation broth or a waste liquid thereof and a method for reusing the recovered phosphoric acid for fermentation.
  • Phosphoric acid may be necessary when producing the desired substance through fermentation.
  • International Patent Publication No. WO 2014/182125 mentions that it is possible to provide a source of phosphoric acid for fermentation of O-phosphocerine, a precursor used in the production of L-cysteine.
  • WO 2014/064244 discloses a method for producing methionine from O-phosphohomoserine through sulfides and converting enzymes. From this, in order to ferment the O-phosphoramoserine precursor It can be seen that phosphate is essential as a phosphorus source. Accordingly, a method of recovering residual phosphorus from a fermentation liquid containing a large amount of phosphate or its waste solution and reusing it as a phosphorus source should be considered.
  • Conventional phosphoric acid recovery process is generally performed by separating phosphoric acid from a mineral substance containing phosphoric acid and extracting it with an organic solvent, and neutralizing the phosphoric acid with a calcium salt, an ammonium salt, a potassium salt, a sodium salt, etc. (US3375068 , US3466141A, US4543239, EP0087323A1, US7687046, US8658117).
  • the organic solvent extraction process is costly due to the complication of the process because of the cost incurred by the use of the solvent and the solvent recovery process.
  • the organic solvent used may be toxic to the fermentation process even in a very small amount.
  • phosphate can be recovered from a fermentation broth or a fermentation waste liquid without using an organic solvent, and when the recovered phosphate is reused for fermentation It was confirmed that an amount of fermentation product similar to that of pure phosphoric acid could be obtained, thus completing the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a method for recovering and reusing phosphoric acid from a fermentation broth or a fermentation waste liquid.
  • Another object of the present invention is to provide a process for the production of phosphoric acid by O-phosphoserine (OPS) fermentation broth; Or a method for recovering and reusing cysteine or a derivative thereof from a fermentation waste liquid from which it has been removed.
  • OPS O-phosphoserine
  • Another object of the present invention is to provide a fermentation broth of O-phosphohomoserine (OPHS); Or a method for recovering and reusing methionine or a derivative thereof from a fermentation waste liquid from which it has been removed.
  • OPHS O-phosphohomoserine
  • the method of recovering and reusing the phosphoric acid of the present invention from the fermentation medium can recover the phosphoric acid from the fermentation broth or the fermentation waste liquid without using an organic solvent and can be reused in the fermentation process and can be used as a toxin in the fermentation process, There is no problem such as a point, an additional cost due to the use of the solvent, and a complicated process due to the addition of the solvent recovery process, so that it can be very usefully used in the fermentation process.
  • FIG. 1 schematically shows a process for recovering phosphate from a fermentation liquid containing phosphoric acid or a fermentation waste liquid.
  • Figure 2 shows a fermentation broth produced using an enzyme conversion reaction from O-phosphoserine (OPS) or O-phosphohomoserine (OPHS) fermentation broth; Or a step of recovering phosphoric acid from the fermentation waste liquid remaining after removing the cysteine, cysteine derivative, methionine or methionine derivative from the fermentation broth and using the phosphoric acid recovery material again for O-phosphocerine or O-phosphoramocerein fermentation .
  • OPS O-phosphoserine
  • OPHS O-phosphohomoserine
  • FIG. 3 shows a fermentation broth produced using an enzyme conversion reaction from O-phosphocerine or O-phosphoramocerelin fermentation broth; Or the cysteine, cysteine derivative, methionine or methionine derivative is removed from the fermentation broth, the phosphoric acid is recovered from the fermentation waste solution in two steps, and the recovered phosphoric acid is again used for O-phosphocerine or O-phosphoramocerein fermentation .
  • a method for producing a fermentation broth comprising: (a) concentrating a fermentation liquid or a fermentation waste liquid containing phosphoric acid (concentration step);
  • the fermentation broth of the step (a) may be a medium obtained by culturing a microorganism producing a fermentation product in a medium containing phosphoric acid, a culture comprising microorganisms cultured together with the medium, Enzyme conversion solution.
  • the kind of the 'fermentation product' is not limited as long as the fermentation liquid contains phosphoric acid, and specifically, it may be a target substance produced by fermentation, a derivative thereof or a precursor thereof.
  • the target substance may be an amino acid, for example, but is not limited to, cysteine or methionine.
  • the derivative of the target substance may be a derivative of an amino acid, specifically, a derivative of cysteine or a derivative of methionine.
  • the derivatives of cysteine include N-acetyl-cysteine, cystine, a metal-cysteine complex (such as zinc cysteine complex, manganese cysteine complex, iron cysteine complex, copper cysteine complex, magnesium cysteine complex) : Cysteine hydrochloride, etc.), but the present invention is not limited thereto.
  • the derivative of methionine may be one or more selected from N-acetyl-methionine, metal-methionine complex (e.g., zinc methionine complex, manganese methionine complex, iron methionine complex, copper methionine complex, magnesium methionine complex) , But is not limited thereto.
  • the precursor of the target substance may be a precursor of amino acid, specifically, a precursor of cysteine or a precursor of methionine. More specifically, it may be, but is not limited to, O-phosphoserine (OPS) or O-phosphohomoserine (OPHS).
  • OPS O-phosphoserine
  • OPHS O-phosphohomoserine
  • the 'fermentation liquid' includes (a) a target substance containing phosphoric acid, a precursor thereof or a derivative thereof, (b) a precursor producing strain of the target substance, a target substance or a derivative thereof produced by the substrate and the converting enzyme; And (c) a microorganism expressing a converting enzyme or a converting enzyme in the precursor fermentation solution of the target substance; And a target substance or derivative thereof produced by adding a substrate; And a fermentation liquid containing phosphoric acid, but is not limited thereto.
  • the fermentation broth comprises (i) an O-phosphocerine fermentation broth containing phosphoric acid, (ii) an O-phosphorohomoserine fermentation broth containing phosphoric acid, or (iii) Enzymes or microorganisms expressing them; And an amino acid or derivative thereof prepared by adding a sulfide; And a fermentation liquid containing phosphoric acid.
  • the fermentation broth can be specifically prepared by adding O-phosphoserine sulfhydrylase (OPSS) or a microorganism expressing the O-phosphoserine sulfhydrylase (OPSS) to an O-phosphocerine fermentation broth.
  • OPS O-phosphoserine sulfhydrylase
  • OPSS microorganism expressing the O-phosphoserine sulfhydrylase
  • the fermentation broth may be supplemented with an OPHS-dependent methionine synthase (O-Phospho-homoserine dependent methionine synthase) or a microorganism expressing the same. And methionine or a derivative thereof prepared by adding a sulfide; And a fermentation liquid containing phosphoric acid.
  • O-Phospho-homoserine dependent methionine synthase O-Phospho-homoserine dependent methionine synthase
  • methionine or a derivative thereof prepared by adding a sulfide; And a fermentation liquid containing phosphoric acid.
  • the term 'fermentation waste liquid' may be a solution in which some or all of the fermentation product is separated and removed from the fermentation broth, but is not limited thereto.
  • the fermentation waste liquid may be a solution in which a part or all of amino acids, derivatives or precursors thereof are separated and removed from an amino acid, a derivative or precursor thereof, and a fermentation broth containing phosphoric acid, but the present invention is not limited thereto.
  • it may be a solution in which a part or all of amino acids or derivatives thereof are separated and removed from a fermentation broth containing an amino acid, a derivative thereof, and phosphoric acid, and may be produced by adding a substrate and a transforming enzyme or a microorganism producing the same to a fermentation liquid of an amino acid precursor Or a derivative in which a part or all of the amino acid or its derivative is separated and removed from the fermentation broth containing the amino acid, the derivative thereof and the phosphoric acid. More specifically, for example, an O-phosphoserine sulfhydrylase (OPSS) or a microorganism expressing O-phosphoserine sulfhydrylase (OPSS) is added to an O-phosphocerine fermentation broth.
  • O-phosphoserine sulfhydrylase OPSS
  • OPSS O-phosphoserine sulfhydrylase
  • OPSS microorganism expressing O-phosphoserine sulfhydrylase
  • cysteine or a derivative thereof prepared by adding a sulfide; And a solution in which some or all of cysteine or a derivative thereof is separated and removed from a fermentation broth containing phosphoric acid.
  • the 'concentration' of the concentration step is not limited as long as the concentration of the phosphate ion contained in the fermentation broth or the fermentation waste liquid can be increased, and can be performed by a method known in the art. Specifically, it may be carried out by, but not limited to, evaporation, heating, decompression, ventilation, freezing and the like.
  • the concentration is carried out in order to increase the phosphorus recovery rate, and the concentration step is carried out in such a manner that the phosphate ion concentration of the pH adjusted concentrate is specifically 60 g / L or more or 70 g / L or more, more specifically 60 g / L to 300 g /
  • the fermentation liquid or the fermentation waste liquid may be concentrated to a concentration of 70 g / L to 250 g / L, but is not limited thereto.
  • the pH of the fermentation broth or the fermentation waste liquid can be adjusted before the concentration step.
  • the pH of the fermentation broth or the fermentation waste liquid can be adjusted to 7 or more, 7.5 or more, 8 or more, 8.5 or more or 9 or more, and more specifically 8 to 11. Adjusting the pH before concentration can reduce the content of ammonium ion impurities in the recovered phosphate.
  • the step (b) (adjusting the pH) is a step of adjusting the pH of the concentrate before crystallization of the phosphate.
  • the pH of the concentrate obtained in the concentration step is not limited as long as the phosphate can be crystallized, but the pH of the concentrate can be adjusted from neutral to basic, and specifically, 7 or more, 7.5 or more, 8 or more, 8.5 or more or 9 or more , More specifically, from 8 to 11.
  • the pH adjustment step may be performed by adding a basic substance to the concentrate, specifically, by adding a hydroxide.
  • the hydroxide may be sodium hydroxide or an aqueous solution of sodium hydroxide, but is not limited thereto.
  • the step (c) (crystallization step) is a step of recovering phosphate from the pH-adjusted concentrate obtained in the pH adjusting step.
  • the recovery of phosphate in the present invention is carried out without using an organic solvent, by producing crystals of phosphate from a pH-adjusted concentrate and separating the resulting crystals from the mother liquor.
  • the temperature may be adjusted and / or the crystal nuclei may be added for crystallization of the phosphate, but it is not limited thereto.
  • Specifically for crystallization of phosphate between pH adjusting step and crystallization step; Or cooling the pH-adjusted concentrate to a crystallization step. More specifically, the pH-adjusted concentrate may be left at room temperature, the pH-adjusted concentrate may be cooled before the crystallization step, or the pH-adjusted concentrate may be cooled in the crystallization step.
  • the phosphorus recovery rate may be influenced by the cooling temperature, but the cooling temperature is not limited as long as the phosphate crystals can be produced. Specifically, the cooling temperature may be 50 ⁇ ⁇ or less, specifically 0 to 30 ⁇ ⁇ , more specifically, 10 to 20 ⁇ ⁇ , but is not limited thereto.
  • the method may further include, but is not limited to, adding the phosphate crystals as crystal nuclei between the pH adjustment step and the crystallization step or during the crystallization step for the crystallization of the phosphate.
  • the term 'phosphate' as used herein means a salt of phosphoric acid or a hydrate thereof, and the kind of salt is not limited as long as phosphoric acid can be recovered through crystallization.
  • the phosphate may be at least one selected from trisodium phosphate, disodium hydrogenphosphate, sodium dihydrogenphosphate, and hydrates thereof, and more specifically, disodium hydrogenphosphate or a hydrate thereof, but is not limited thereto.
  • the number of water molecules bound to the hydrate is not limited as long as the phosphate hydrate can be crystallized, but specifically, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, Or 13 or more.
  • the hydrate may specifically be, but is not limited to, disodium hydrogenphosphate monohydrate or disodium hydrogenphosphate dihydrate.
  • Phosphoric acid and phosphate may be used in combination here.
  • the method used to separate the phosphate crystals produced in the present invention is not limited as long as it is a method capable of solid-liquid separation. Specifically, a centrifugal separator, a filter press, a compression filter, a rotary vacuum filter, But is not limited thereto.
  • the mother liquor refers to a liquid obtained by separating the produced phosphate crystals from the pH-adjusted concentrate, and may include, but is not limited to, uncrystallized phosphate ions.
  • a secondary crystallization step of recrystallizing the phosphate from the mother liquor may be additionally included in one aspect of the method of the present invention.
  • the present invention can obtain a high phosphorus recovery rate by adding phosphate crystals (primary recovered phosphate) obtained in the above-described crystallization step and ginseng salt crystals obtained in the secondary crystallization step (secondary recovered phosphate).
  • the secondary crystallization step comprises the steps of (i) concentrating the mother liquor (re-concentrating step), (ii) adjusting the pH of the mother liquor (pH remediation step), and (iii) And crystallizing and separating the phosphate (recrystallization step).
  • the steps (i) to (iii) may be carried out in the same manner as the concentration step, the pH adjustment step and the crystallization step described above. Specifically, the pH of the mother liquor may be adjusted to 7 or more, 7.5 or more, 8 or more, 8.5 or more or 9 or more, and more specifically, 8 to 11.
  • the secondary crystallization step may further include adding phosphate crystals to the mother liquor as crystal nuclei, for example, during the pH remediation step and during the recrystallization step or during the recrystallization step, But the present invention is not limited thereto.
  • the crystallization step may be performed more than two times.
  • the method of the present invention comprises the steps of: adjusting the pH; Or between the pH adjusting step and the crystallization step, adding alcohol.
  • Alcohol has a low solubility in phosphate, so when mixed with a phosphate solution, it reduces the phosphate solubility of the solution and increases the recovery rate of the phosphate.
  • the alcohol may be methanol, ethanol, propanol, butanol, or a combination thereof, although it is not limited as long as it can increase the recovery rate of phosphoric acid.
  • the step (d) (reuse step) herein is a step of using the phosphate crystals recovered in the crystallization step as a phosphoric acid and / or phosphorus source in various fermentation media requiring phosphoric acid and / or phosphorus sources.
  • the fermentation medium of the present application is not limited as long as it is a culture medium used for fermentation requiring a phosphoric acid and / or phosphorus source for the purpose of the present invention.
  • the fermentation medium used for the production of O-phosphocerine or O-phosphoramocerein It can be a badge.
  • O-phosphoserine O-phosphoserine (OPS) using a microorganism in a fermentation medium containing phosphoric acid (OPS fermentation step);
  • step (b) reacting the O-phosphoserine produced in step (a) with a sulfide in the presence of O-Phosphoserine sulfhydrylase (OPSS) or a microorganism expressing the O-phosphoserine sulfhydrylase (Conversion step);
  • O-Phosphoserine sulfhydrylase OPSS
  • Conversion step OPSS
  • the step (a) is a step of producing O-phosphocerine using a fermentation medium and a microorganism containing phosphoric acid.
  • O-phosphoserine is an ester of serine and phosphoric acid, and phosphoric acid is required for the production of O-phosphocerine.
  • the microorganism may be a known microorganism capable of producing O-phosphocerine. Examples of the microorganism include, but are not limited to, microorganisms (WO 2014/182125, WO 2014/182119) Can be used.
  • microorganisms having high O-phosphocerine production ability include, but are not limited to, phosphoerine phosphatase phosphatase (SerB) and / or phosphoglycerate dehydrogenase (SerA) or (WO 03/053794) in which the activity of phosphoserine aminotransferase (SerC) is enhanced (WO 03/053794) can be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the step (b) (conversion step) is a step of converting O-phosphocerine obtained in the OPS fermentation step into a cysteine or a derivative thereof by reacting it with a sulfide under the catalysis of an O-phosphoserine sulfhydrylase enzyme.
  • an O-phosphoserine sulfhydrylase enzyme not only an O-phosphoserine sulfhydrylase enzyme but also a microorganism expressing the enzyme can be used for the conversion reaction.
  • the microorganisms expressing the enzymes and enzymes can be obtained by means and methods known to those skilled in the art.
  • the O-phosphoserine sulfhydrylase enzyme may be an enzyme described in WO 2013/089478, WO 2012/053794, WO 2012/053777, and the like, but is not limited thereto.
  • the sulfide is not limited as long as it is capable of reacting with O-phosphoserine under the catalysis of an O-phosphoserine sulfhydrylase enzyme.
  • the sulfide may be CH 3 SH, Na 2 S, NaSH, (NH 4 ) 2 S, H 2 S and Na 2 S 2 O 3 .
  • steps (c) to (e) are the same as the above-mentioned concentration step, pH adjustment step and crystallization step.
  • step (f) (reuse step) is a step of using the phosphate crystals recovered in the crystallization step as a phosphoric acid and / or phosphorus source in a fermentation medium requiring a phosphate and / or phosphorus source.
  • the fermentation medium may be a fermentation medium used for production of O-phosphocerine, but is not limited thereto.
  • step (b) reacting the O-phosphohomoserine produced in step (a) with a sulfide in the presence of an O-phosphohomoserine dependent methionine synthase or a microorganism expressing the O-phosphohomoserine dependent methionine synthase, Or a derivative thereof (conversion step);
  • the step (a) is a step of producing O-phosphohomoserine using a fermentation medium and a microorganism containing phosphoric acid.
  • O-phosphohomoserine is an ester of threonine and phosphoric acid, and phosphoric acid is required for the production of O-phosphohomoserine.
  • the microorganism may be a known microorganism capable of producing O-phosphohomoserine.
  • step (b) conversion step is a step of converting O-phosphohomoserine obtained in the OPHS fermentation step with a sulfide into methionine or a derivative thereof under the catalysis of an OPHS-dependent methionine synthase.
  • an OPHS-dependent methionine synthase not only an OPHS-dependent methionine synthase but also a microorganism expressing the enzyme can be used for the conversion reaction.
  • the microorganism expressing the enzyme and the enzyme can be obtained through means and methods known to those skilled in the art and can be obtained, for example, by the method disclosed in WO 2014/064244, but not limited thereto .
  • the sulfide is not limited insofar as it can react with O-phosphohomoserine under the catalysis of an OPHS-dependent methionine synthase, it may be CH 3 SH, Na 2 S, NaSH, (NH 4 ) 2 S, H 2 S and Na 2 S 2 O 3 .
  • steps (c) to (e) are the same as the above-mentioned concentration step, pH adjustment step and crystallization step.
  • step (f) (reuse step) is a step of using the phosphate crystals recovered in the crystallization step as a phosphoric acid and / or phosphorus source in a fermentation medium requiring a phosphate and / or phosphorus source.
  • the fermentation medium may be a fermentation medium used for production of O-phosphohomoserine, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention provides a method for recovering phosphoric acid from a fermentation waste liquid.
  • the method of the present invention comprises the steps of: (a) concentrating a fermentation waste liquid containing phosphoric acid (concentration step);
  • the fermentation waste liquid is as described above, and can be encompassed by an enzyme conversion waste liquid.
  • the steps (a) to (c) are the same as the concentration step, the pH adjustment step and the crystallization step described above.
  • the method of separating the phosphate crystals of the step (d) (separation step) from the mother liquor is as described in the above-mentioned crystallization step.
  • Example 1-1 Recovery of Phosphorus from O-Phosphorus Fermentation Waste Liquor
  • a microorganism capable of producing O-phosphoserine can be cultured in a fermentation medium containing phosphoric acid to obtain an O-phosphopererine fermentation broth.
  • the fermentation broth is then cultured in an O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) to obtain a fermentation broth containing cysteine or cystine (International Patent Publication No. WO 2012/053794). Cystine or cystine was crystallized from the fermentation broth and solid-liquid separation was carried out to obtain a fermentation waste liquid.
  • the ion composition (g / L) of the O-phosphocellin fermentation waste liquid was 24.4 sodium ion, 6.4 ammonium ion, 14.8 chloride ion, 3.4 sulfate ion and 34.3 phosphate ion. 1665 ml of water was evaporated from 2000 ml of the initial waste solution and a 50% (w / w) aqueous sodium hydroxide solution (38.0 ml) was added until the pH reached 9.00. The phosphate ion concentration of this solution was 185.4 g / L. Cooling proceeded to 15 ° C and disodium hydrogen phosphate heptahydrate was obtained. The slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the weight of the final product was 159.5 g.
  • the ion composition (g / kg) of the final product was 124.6 sodium ion, 5.3 ammonium ion, 5.4 chlorine ion, 4.2 sulfate ion, and 388.5 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 45.7 wt%. Total phosphorous recovery was 79.2 wt%.
  • the ion composition (g / L) of the waste solution of the O-phosphocellin fermentation-based process of this example was 24.7 sodium ion, 6.3 ammonium ion, 16.4 chlorine ion, 3.9 sulfate ion and 35.8 phosphate ion.
  • 1555 ml of water was evaporated from 1945 ml of the initial waste solution, and 50% sodium hydroxide aqueous solution (46.5 ml) was added until the pH reached 9.00.
  • the phosphate ion concentration of this solution was 159.7 g / L. Cooling proceeded to 15 ° C and disodium hydrogen phosphate heptahydrate was obtained.
  • the slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the final product weighed 132.3 g.
  • the ion composition (g / kg) of the final product was 127.4 sodium ion, 10.9 ammonium ion, 5.2 chlorine ion, 3.1 sulfate ion, and 358.6 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 49.6 wt%.
  • the total phosphoric acid recovery was 68.0 wt%.
  • the ion composition (g / L) of the waste solution of the O-phosphocellin fermentation-based process of this example was 24.6 sodium ion, 6.2 ammonium ion, 16.3 chloride ion, 3.5 sulfate ion and 35.6 phosphate ion. 1315 ml of water was evaporated from 1975 ml of the initial waste solution, and 50% aqueous sodium hydroxide solution (43.0 ml) was added until the pH reached 9.01. The phosphate ion concentration of this solution was 99.9 g / L. Cooling proceeded to 15 ⁇ , and disodium hydrogen phosphate 12 hydrate was obtained. The slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the weight of the final product was 186.0 g.
  • the ion composition (g / kg) of the final product is 110.7 sodium ion, 13.5 ammonium ion, 2.4 chlorine ion, 2.8 sulfate ion, and 264.7 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 60.8 wt%. Total phosphorous recovery was 70.1 wt%.
  • the ionic composition (g / L) of the waste solution of the O-phosphocellin fermentation-based process of this example was 24.5 sodium ion, 6.2 ammonium ion, 16.3 chloride ion, 3.7 sulfate ion and 35.6 phosphate ion.
  • 980 ml of water was evaporated from the initial wastewater of 1955 ml and a 50% aqueous sodium hydroxide solution (42.0 ml) was added until the pH reached 9.04.
  • the phosphate ion concentration of this solution was 68.4 g / L. Cooling proceeded to 15 ⁇ , and disodium hydrogen phosphate 12 hydrate was obtained.
  • the slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the weight of the final product was 172.9 g.
  • the ion composition (g / kg) of the final product was 112.8 sodium ion, 20.2 ammonium ion, 1.2 chloride ion, 2.6 sulfate ion, and 255.9 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 61.9 wt%. Total phosphorous recovery was 63.6 wt%.
  • the ionic composition (g / L) of the waste solution of the O-phosphocellin fermentation-based process of this example was 23.8 sodium ion, 6.5 ammonium ion, 15.1 chloride ion, 3.4 sulfate ion and 35.0 phosphate ion. 1600 ml of water was evaporated (temperature range 50 ° C or higher) in 2000 ml of the initial waste solution, and a 50% aqueous sodium hydroxide solution (39.5 ml) was added until the pH reached 9.00. The phosphate ion concentration of this solution was 159.4 g / L. This was an experimental condition similar to that of Example 1-2. Cooling proceeded to 25 DEG C, and disodium hydrogen phosphate heptahydrate was obtained. The slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the weight of the final product was 110.6 g.
  • the ion composition (g / kg) of the final product was 126.8 sodium ion, 13.8 ammonium ion, 2.7 chlorine ion, 2.2 sulfate ion, and 393.9 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 43.9 wt%.
  • the total phosphoric acid recovery was 62.2 wt%.
  • the ion composition (g / L) of the waste solution of the O-phosphocellin fermentation-based process of this example was 23.4 sodium ion, 6.4 ammonium ion, 14.9 chloride ion, 3.5 sulfate ion and 34.7 phosphate ion.
  • a 50% aqueous sodium hydroxide solution (39.5 ml) was added until the pH reached 9.02. Thereafter, 1600 ml of water is evaporated from 2000 ml of the initial waste liquid. Due to the evaporation of ammonia, the pH of the process solution after evaporation was 7.06. Therefore, a 50% aqueous solution of sodium hydroxide (16.0 ml) was added again until the pH reached 9.00.
  • the phosphate ion concentration of this solution was 152.4 g / L. This concentration condition was similar to that of Example 1-2. Cooling proceeded to 15 ° C and disodium hydrogen phosphate heptahydrate was obtained. The slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the weight of the final product was 141.6 g.
  • the ion composition (g / kg) of the final product was 156.8 sodium ion, 0.6 ammonium ion, 1.1 chloride ion, 3.2 sulfate ion, and 338.8 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 51.2 wt%.
  • Total phosphorous recovery was 69.1 wt%. This method significantly reduced the content of ammonium ion impurities in disodium hydrogenphosphate recovered than other processes.
  • Example 4-1 Recovery of phosphoric acid by addition of 100 ml methanol
  • the ionic composition (g / L) of the waste solution of the O-phosphocellin fermentation-based process of this example was 23.8 sodium ion, 6.4 ammonium ion, 15.3 chloride ion, 6.4 sulfate ion, and 37.1 phosphate ion. 1600 ml of water is evaporated from 2000 ml of the initial waste liquid. Then, a 50% aqueous solution of sodium hydroxide (48.0 ml) was added until the pH reached 9.07, and 100 ml of methanol was added. The phosphate ion concentration of this solution was 135.2 g / L. Cooling proceeded to 15 ° C and disodium hydrogen phosphate heptahydrate was obtained. The slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the weight of the final product was 182.7 g.
  • the ion composition (g / kg) of the final product was 135.5 sodium ion, 24.9 ammonium ion, 13.1 chloride ion, 2.2 sulfate ion and 328.5 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 49.6 wt%. Total phosphorous recovery was 81.0 wt%.
  • the ion composition (g / L) of the waste solution of the O-phosphocellin fermentation-based process of this example was 23.9 sodium ion, 6.4 ammonium ion, 15.3 chloride ion, 3.9 sulfate ion and 37.3 phosphate ion. 1600 ml of water is evaporated from 2000 ml of the initial waste liquid. Then, a 50% aqueous solution of sodium hydroxide (47.0 ml) was added until the pH reached 9.04, and 200 ml of methanol was added. The phosphate ion concentration of this solution was 115.2 g / L. Cooling proceeded to 15 ° C and disodium hydrogen phosphate heptahydrate was obtained. The slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the weight of the final product was 182.0 g.
  • the ion composition (g / kg) of the final product was 122.9 sodium ion, 38.9 ammonium ion, 15.9 chloride ion, 2.4 sulfate ion and 328.2 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 46.6 wt%. Total phosphoric acid recovery was 80.2 wt%.
  • the ionic composition (g / L) of the process waste solution was 21.7 sodium ion, 4.4 ammonium ion, 16.0 chloride ion, 30.1 sulfate ion and 30.3 phosphate ion.
  • 16 L of water was evaporated from 20 L of the initial waste solution and 50% aqueous sodium hydroxide solution (0.4 L) was added until pH reached 9.00.
  • the phosphate ion concentration of this solution was 162.1 g / L. Cooling proceeded to 15 ° C and disodium hydrogen phosphate heptahydrate was obtained.
  • the disodium hydrogenphosphate monohydrate slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the recovered disodium hydrogenphosphate heptahydrate weighed 1339.0 g.
  • the ion composition (g / kg) of the material was 133.5 sodium ion, 18.7 ammonium ion, 5.3 chloride ion, 1.3 sulfate ion, and 323.4 phosphate ion.
  • the moisture content of the final product was 48.2 wt%.
  • the ionic composition (g / L) of the filtrate was 13.3 sodium ion, 6.8 ammonium ion, 98.9 chlorine ion, 16.8 sulfate ion, and 40.2 phosphate ion.
  • To 3.2 liters of the remaining filtrate was added 1.1 g of disodium hydrogenphosphate 12 hydrate (the sample prepared in Example 1-3) and the mixture was stirred at 15 DEG C for 4 hours.
  • the disodium hydrogenphosphate 12 hydrate slurry was filtered through a centrifugal basket filter and rinsed with pure water.
  • the weight of the recovered disodium hydrogen phosphate 12 hydrate was 299.0 g.
  • the ion composition (g / kg) of the material was 128.2 sodium ion, 6.1 chloride ion, 3.8 sulfate ion, and 239.5 phosphate ion.
  • the moisture content was 61.3 wt%.
  • the final phosphoric acid recovery rate in the above two step process was 83.2 wt.
  • MMYE agar plate (containing 2 g / L of glucose, 2 mM of magnesium sulfate, 0.1 mM of calcium chloride, 6 g / L of glucose) containing 50 mu g / ml of spectinomycin using KCCM 11103P strain of WO- L of sodium hypophosphate, sodium pyrophosphate, sodium chloride of 0.5 g / L and disodium hydrogenphosphate of 3 g / L recovered in this application, 10 g / L of yeast extract, 18 g / L of agar) at 33 DEG C for 24 hours, Cells were scraped from one plate and placed in a baffle flask in a 50 ml flask seed culture medium containing 10 ⁇ g / ml of spectinomycin (10 g / L of Cloce, 0.5 g / L of magnesium sulfate, 3 g / L of L of yeast extract, 0.5 g / L of sodium chloride, 1.5 g
  • a seed culture medium of a volume corresponding to 16% of the volume of the present culture medium was inoculated into a 1 L small-sized fermenter filled with 300 ml of the present culture medium, and the culture was carried out at 33 ° C at pH 7.0.
  • the culture was adjusted to pH 7.0 by the addition of ammonia water during the culture.
  • an aqueous glucose solution of 520 g / L and 300 g / L of disodium hydrogen phosphate recovered in the present invention were added to perform oil-field cultivation. After culturing for 80 hours, it was confirmed by HPLC that 29.3 g / L of O-phosphocerine was measured.
  • KCCM 11103P strain was cultured in a seed medium and a main culture medium in the same manner as in Example 6, and glucose was depleted, followed by addition of glucose aqueous solution of 520 g / L and 200 g / L of pure phosphoric acid. After culturing for 80 hours, it was confirmed by HPLC that 29.5 g / L of O-phosphocerin was measured.
  • the method of recovering and reusing phosphoric acid from the fermentation medium can be carried out by crystallizing and recovering the phosphate from the fermentation broth or the fermentation waste liquid.
  • the recovered phosphate is reused for fermentation, a similar amount of fermentation product .
  • the method of the present invention can be very usefully used in a fermentation process.

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Abstract

본원은 발효액 또는 이의 폐액으로부터 인산을 회수하는 방법 및 회수한 인산을 발효에 재사용하는 공정에 대한 것이다.

Description

인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법
본원은 발효액 또는 이의 폐액으로부터 인산을 회수하는 방법 및 회수한 인산을 발효에 재사용하는 방법에 대한 것이다.
발효를 통해 목적 물질을 생산 시 인산이 필수적으로 필요한 경우가 있다. 그 예로, 국제공개특허 WO 2014/182125에서는, L-시스테인의 생산에 사용되는 전구체인 O-포스포세린 발효를 위해 인산 공급원을 제공할 수 있음을 언급하고 있다. 또한, 국제공개특허 WO 2014/064244에서는 O-포스포호모세린으로부터 황화물과 전환효소를 통해 메티오닌을 생산하는 방법을 개시하고 있는데, 이로부터 전구체인 O-포스포호모세린을 발효적으로 생산하기 위하여는 인 공급원으로서 인산염이 필수적임을 알 수 있다. 이에, 인산염이 다량 포함된 발효액 또는 이의 폐액으로부터 잔류 인산을 회수하여 이를 인 공급원으로 재사용하는 방안이 강구되어야 한다.
기존의 인산 회수 공정은 인산을 함유한 광석 물질로부터 유기 용매 추출 공정으로 인산을 분리한 후, 칼슘염, 암모늄염, 칼륨염, 나트륨염 등으로 중화하는 공정을 거쳐 인산을 회수하는 것이 일반적이다(US3375068, US3466141A, US4543239, EP0087323A1, US7687046, US8658117). 하지만 유기용매 추출 공정은 용매사용에 따른 비용발생 및 용매 회수공정이 추가되기 때문에 공정이 복잡해져 경제성이 떨어지며, 사용가능한 유기 용매는 미량으로도 발효 공정에 독소로 작용할 수 있어서 발효공정에 적용하기에는 어렵다. 한편, 인산 함유　광석 물질이 아닌 발효 공정 폐액에서 유기용매 추출 방법 이외의 방법으로 인산을 회수 또는 생산하는 공정에 대한 특허나 참고문헌은 아직까지 존재하지 않는다.
본 발명자들은 발효액 또는 발효 폐액에서 인산을 회수하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 유기 용매를 사용하지 않고, 발효액 또는 발효 폐액으로부터 인산염을 회수할 수 있고, 상기 회수된 인산염을 발효에 재사용하는 경우 순수 인산을 사용한 경우와 유사한 양의 발효 생성물을 얻을 수 있음을 확인하여, 본원을 완성하였다.
본원의 하나의 목적은 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본원의 다른 하나의 목적은 인산을 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 발효액; 또는 시스테인 또는 이의 유도체를 제거한 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 하나의 목적은 인산을 O-포스포호모세린(O-phosphohomoserine, OPHS) 발효액; 또는 메티오닌 또는 이의 유도체를 제거한 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 하나의 목적은 인산을 함유하는 발효 폐액으로부터 인산을 회수하는 방법을 제공하는 것이다.
광석 물질이 아닌 발효 공정에서 인산을 회수하는 경우, 유기용매 추출 방법 이외의 방법으로 인산을 회수하고, 발효 공정에 재사용하는 방법을 본원에서 처음으로 규명하였다. 본원의 인산을 발효 배지로부터 회수 및 재사용하는 방법은 유기 용매를 사용하지 않고, 발효액 또는 발효 폐액으로부터 인산을 회수하여 발효 공정에 재사용할 수 있어, 유기 용매의 문제점인 발효 공정에 독소로 작용할 수 있는 점, 용매 사용에 따른 비용이 추가 발생하는 점, 및 용매 회수공정 추가로 인해 공정이 복잡해지는 점 등의 문제가 없으므로, 발효 공정에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1 은 인산을 함유하는 발효액 또는 발효 폐액에서 인산염을 회수하는 공정을 간략하게 나타낸 것이다.
도 2는 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 또는 O-포스포호모세린(O-phosphohomoserine, OPHS) 발효액으로부터 효소 전환 반응을 이용하여 생산된, 발효액; 또는 상기 발효액에서 시스테인, 시스테인 유도체, 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 제거하고 남은, 발효 폐액으로부터, 인산을 회수하고, 해당 인산 회수 물질을 다시 O-포스포세린 또는 O-포스포호모세린 발효에 사용하는 공정을 간략히 나타낸 것이다.
도 3은 O-포스포세린 또는 O-포스포호모세린 발효액으로부터 효소 전환 반응을 이용하여 생산된, 발효액; 또는 상기 발효액에서 시스테인, 시스테인 유도체, 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 제거하고 남은, 발효 폐액으로부터, 인산을 2 단계에 걸쳐 회수하고, 회수한 인산을 다시 O-포스포세린 또는 O-포스포호모세린 발효에 사용하는 공정을 간략히 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본원의 하나의 양태는, (a) 인산을 함유하는 발효액 또는 발효 폐액을 농축하는 단계(농축 단계);
(b) 상기 농축된 농축액의 pH를 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 조정 단계);
(c) 상기 pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 결정화하여 모액과 분리하는 단계(결정화 단계); 및
(d) 상기 결정화된 인산염을 발효 배지에서 인산 공급원으로 사용하는 단계(재사용 단계)를 포함하는, 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법을 제공한다.
본원에서 상기 (a) 단계(농축 단계)의 발효액은 인산을 함유하고 있는 배지에서 발효 생성물을 생산하는 미생물을 배양하여 수득한 배지, 상기 배지와 함께 배양한 미생물을 포함하는 배양물, 또는 이들의 효소 전환액을 의미할 수 있다.
상기 '발효 생성물'의 종류는 상기 발효액이 인산을 함유하고 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로, 발효로 생산되는 목적물질, 이의 유도체 또는 전구체일 수 있다. 또한, 상기 목적물질은 아미노산일 수 있으며, 예를 들어 시스테인 또는 메티오닌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 목적물질의 유도체는 아미노산의 유도체일 수 있으며, 구체적으로는 시스테인의 유도체 또는 메티오닌의 유도체일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 시스테인의 유도체는 N-아세틸-시스테인, 시스틴, 금속-시스테인 콤플렉스 (예: 아연 시스테인 콤플렉스, 망간 시스테인 콤플렉스, 철 시스테인 콤플렉스, 구리 시스테인 콤플렉스, 마그네슘 시스테인 콤플렉스 등) 및 시스테인 염(예: 시스테인 염산염, 등) 등 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 메티오닌의 유도체는 N-아세틸-메티오닌, 금속-메티오닌 콤플렉스 (예: 아연 메티오닌 콤플렉스, 망간 메티오닌 콤플렉스, 철 메티오닌 콤플렉스, 구리 메티오닌 콤플렉스, 마그네슘 메티오닌 콤플렉스 등), 메티오닌 염 등 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 목적물질의 전구체는 아미노산의 전구체일 수 있으며, 구체적으로는 시스테인의 전구체 또는 메티오닌의 전구체일 수 있다. 보다 구체적으로, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 또는 O-포스포호모세린(O-phosphohomoserine, OPHS)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 '발효액'에는 (a) 인산을 포함하는 목적물질, 이의 전구체 또는 이들의 유도체 발효액, (b) 목적물질의 전구체 생산 균주, 기질 및 전환효소에 의해 생산된, 목적물질 또는 이의 유도체; 및 인산을 포함하는 발효액, 또는 (c) 목적물질의 전구체 발효액에 전환효소 또는 전환효소를 발현하는 미생물; 및 기질을 첨가하여 생산된, 목적물질 또는 이의 유도체; 및 인산을 포함하는 발효액도 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더욱 구체적으로, 상기 발효액은 (i) 인산을 함유하고 있는, O-포스포세린 발효액, (ii) 인산을 함유하고 있는, O-포스포호모세린 발효액, 또는 (iii) 상기 발효액을 기반으로, 전환효소 또는 이를 발현하는 미생물; 및 황화물을 첨가하여 제조한, 아미노산 또는 이의 유도체; 및 인산을 포함하는 발효액일 수 있다. 또한, 상기 (iii) 발효액은 구체적으로, O-포스포세린 발효액에, O-포스포세린 설피드릴라제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물; 및 황화물을 첨가하여 제조한, 시스테인 또는 이의 유도체; 및 인산을 함유하는 발효액일 수 있다. 또한, 상기 (iii) 발효액은 O-포스포호모세린 발효액에, OPHS 의존성 메티오닌 합성효소(O-Phospho-homoserine dependent methionine synthase) 또는 이를 발현하는 미생물; 및 황화물을 첨가하여 제조한, 메티오닌 또는 이의 유도체; 및 인산을 함유하는 발효액을 포함할 수 있다.
본원에서 '발효 폐액'은 상기 발효액으로부터 발효 생성물의 일부 또는 전부가 분리 제거된 액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 발효 폐액은 아미노산, 이의 유도체 또는 전구체, 및 인산을 함유하는 발효액으로부터 아미노산, 이의 유도체 또는 전구체의 일부 또는 전부가 분리되어 제거된 액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 아미노산, 이의 유도체 및 인산을 포함하는 발효액으로부터 아미노산 또는 이의 유도체의 일부 또는 전부가 분리되어 제거된 액일 수 있고, 아미노산 전구체의 발효액에, 기질 및 전환효소 또는 이를 생산하는 미생물에 의해 생산된 아미노산, 이의 유도체 및 인산을 포함하는 발효액으로부터 아미노산 또는 이의 유도체의 일부 또는 전부가 분리되어 제거된 액일 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, O-포스포세린 발효액에 O-포스포세린 설피드릴라제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물; 및 황화물을 첨가하여 제조한, 시스테인 또는 이의 유도체; 및 인산을 함유하는 발효액으로부터 시스테인 또는 이의 유도체의 일부 또는 전부가 분리 제거된 액일 수 있으며, O-포스포호모세린 발효액에 OPHS 의존성 메티오닌 합성효소(O-Phospho-homoserine dependent methionine synthase) 또는 이를 발현하는 미생물; 및 황화물을 첨가하여 제조한, 메티오닌 또는 이의 유도체; 및 인산을 함유하는 발효액으로부터 메티오닌 또는 이의 유도체의 일부 또는 전부가 분리 제거된 액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 상기 농축 단계의 '농축'은 상기 발효액 또는 발효 폐액에 함유된 인산 이온의 농도를 높일 수 있는 한 방법에 제한이 없으며, 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로 증발, 가열, 감압, 통풍, 냉동 방법 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 농축은 인산 회수율을 높이기 위해 실시하는 것이며, 농축 단계는 pH 조정된 농축액의 인산 이온 농도가 구체적으로, 60g/L 이상 또는 70g/L 이상, 더욱 구체적으로, 60g/L 내지 300g/L 또는 70g/L 내지 250g/L가 되도록 발효액 또는 발효 폐액을 농축할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에서 상기 농축 단계 전에, 발효액 또는 발효 폐액의 pH를 조정할 수 있다. 구체적으로, 상기 발효액 또는 발효 폐액의 pH를 7 이상, 7.5 이상, 8 이상, 8.5 이상 또는 9 이상, 더욱 구체적으로, 8 내지 11로 조정할 수 있다. 농축 전에 pH를 조정하면 회수된 인산염 내의 암모늄 이온 불순물의 함량을 감소시킬 수 있다.
본원에서 상기 (b) 단계(pH 조정 단계)는 인산염의 결정화 전 농축액의 pH를 조정하는 단계이다. 상기 농축 단계에서 수득한 농축액의 pH는 인산염이 결정화될 수 있는 한 제한되지 않으나, 농축액의 pH는 중성에서 염기성으로 조정할 수 있으며, 구체적으로, 7 이상, 7.5 이상, 8 이상, 8.5 이상 또는 9 이상, 더욱 구체적으로, 8 내지 11로 조정될 수 있다.
또한, 본원에서 상기 pH 조정 단계는 농축액에 염기성 물질을 첨가하여 수행될 수 있으며, 구체적으로는 수산화물을 첨가하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 수산화물은 수산화나트륨 또는 수산화나트륨 수용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 상기 (c) 단계(결정화 단계)는 pH 조정 단계에서 수득한, pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 회수하는 단계이다. 본원에서 인산염의 회수는 유기 용매를 사용하지 않고, pH 조정된 농축액으로부터 인산염의 결정을 생성시키고, 생성된 결정을 모액과 분리하여 수행된다.
인산염의 결정화를 위해 온도를 조정하고/하거나 결정핵을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 인산염의 결정화를 위해, pH 조정 단계와 결정화 단계 사이; 또는 결정화 단계에, 상기 pH 조정된 농축액을 냉각시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, pH 조정된 농축액을 상온에 방치하거나, pH 조정된 농축액을 결정화 단계 전 냉각하거나, 또는 결정화 단계에서 pH 조정된 농축액을 냉각할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 인산 회수율은 냉각 온도에 의해 영향을 받을 수 있으나, 인산염의 결정이 생성될 수 있는 한, 냉각 온도는 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 냉각온도는 50℃ 이하, 구체적으로는 0 내지 30℃, 더욱 구체적으로는 10 내지 20℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 구체적으로, 인산염의 결정화를 위해 상기 pH 조정 단계와 결정화 단계 사이 또는 결정화 단계 중에, 인산염 결정을 결정핵으로 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 상기 '인산염'은 인산의 염 또는 이의 수화물을 의미하며, 결정화를 통해 인산을 회수할 수 있는 한, 염의 종류는 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 인산염은 인산삼나트륨, 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨 및 이들의 수화물에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 인산수소이나트륨 또는 이의 수화물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 수화물에 결합되어 있는 물 분자의 수는 인산염 수화물이 결정화될 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 이상일 수 있다. 또한, 상기 수화물은 구체적으로, 인산수소이나트륨 7수화물 또는 인산수소이나트륨 12수화물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 인산과 인산염은 혼용되어 사용될 수 있다.
본원에서 생성된 인산염 결정을 분리하기 위해 사용되는 방법은 고액 분리할 수 있는 방법이라면 제한되지 않으며, 구체적으로, 원심분리기, 필터 프레스, 압착여과기, 회전식 진공여과기, 또는 막분리기 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 상기 모액은 생성된 인산염 결정을 pH 조정된 농축액으로부터 분리 제거하여 수득한 액을 의미하는 것으로, 결정화되지 않은 인산 이온을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
인산 회수율을 높이기 위하여, 상기 모액으로부터 인산염을 재결정화하는, 2차 결정화 단계를 본원의 방법의 일 양태에 추가적으로 포함할 수 있다. 본원은 앞서 설명된 결정화 단계에서 수득한 인산염 결정(1차 회수 인산염)과 2차 결정화 단계에서 수득한 인삼염 결정(2차 회수 인산염)을 더해 높은 인산 회수율을 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 2차 결정화 단계는 (i) 모액을 농축하는 단계(재농축 단계), (ii) 상기 모액의 pH를 조정하는 단계(pH 재조정 단계), 및 (iii) 상기 pH 조정된 모액으로부터 인산염을 결정화하여 분리하는 단계(재결정화 단계)를 포함할 수 있다. 상기 (i) 내지 (iii) 단계는 전술한 농축 단계, pH 조정 단계 및 결정화 단계와 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 모액의 pH는 7 이상, 7.5 이상, 8 이상, 8.5 이상 또는 9 이상, 더욱 구체적으로, 8 내지 11로 조정될 수 있다.
또한, 구체적으로, 상기 2차 결정화 단계는 모액에 인산염 결정을 결정핵으로 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 예들 들어 상기 pH 재조정 단계와 재결정화 단계 사이 또는 재결정화 단계 중에, 모액에 인산염 결정을 결정핵으로 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원은 인산 회수율을 높이기 위하여, 결정화 단계를 2차 이상 수행할 수 있다.
본원의 방법은 상기 pH 조정 단계; 또는 pH 조정 단계와 결정화 단계 사이에, 알코올을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 알코올은 인산염에 대한 용해도가 낮기 때문에, 인산염 용액과 혼합될 시, 해당 용액의 인산염 용해도를 감소시켜 인산의 회수율을 증가시키는 역할을 한다. 상기 알코올은 인산 회수율을 높일 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이들의 조합일 수 있다.
본원에서 상기 (d) 단계(재사용 단계)는 결정화 단계에서 회수한 인산염 결정을 인산 및/또는 인 공급원을 필요로 하는 다양한 발효 배지에 인산 및/또는 인 공급원으로 사용하는 단계이다. 본원의 발효 배지는 본원의 목적상 인산 및/또는 인 공급원을 필요로 하는 발효에 사용되는 배지인 한 제한되지 않으나, 구체적으로, O-포스포세린 또는 O-포스포호모세린의 생산에 사용되는 발효 배지일 수 있다.
본원의 다른 하나의 양태는,
(a) 인산을 함유하는 발효 배지에서, 미생물을 이용하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 생산하는 단계(OPS 발효단계);
(b) O-포스포세린 설피드릴라제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 (a) 단계에서 생산된 O-포스포세린을 황화물과 반응시켜 시스테인 또는 이의 유도체의 발효액을 제조하는 단계(전환 단계);
(c) 상기 발효액; 또는 상기 발효액으로부터 시스테인 또는 이의 유도체를 제거한 발효 폐액을 농축하는 단계(농축 단계);
(d) 상기 농축된 농축액의 pH를 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 조정 단계);
(e) 상기 pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 결정화하여 모액과 분리하는 단계(결정화 단계); 및
(f) 상기 결정화된 인산염을 발효 배지에서 인산 공급원으로 사용하는 단계(재사용 단계)를 포함하는, 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법을 제공한다.
본원에서 상기 (a) 단계(OPS 발효단계)는 인산을 함유한 발효 배지 및 미생물을 이용하여 O-포스포세린을 생산하는 단계이다. O-포스포세린은 세린 및 인산의 에스터로서, O-포스포세린의 생산에는 인산이 필요하다. 또한, 상기 미생물은 O-포스포세린을 생산할 수 있는 공지의 미생물을 이용할 수 있으며, 비제한적인 예로, O-포스포세린 배출 활성이 강화된 미생물(국제공개특허 WO 2014/182125, WO 2014/182119)을 이용할 수 있다. 또한, 높은 O-포스포세린 생산능을 갖는 미생물의 예로, 내재적인 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)를 약화시키거나/시키고, 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는/및 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 강화된 미생물(국제공개특허 WO 2012/053794)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 상기 (b) 단계(전환 단계)는 O-포스포세린 설피드릴라제 효소의 촉매 작용 하에 OPS 발효단계에서 수득한 O-포스포세린을 황화물과 반응시켜 시스테인 또는 이의 유도체로 전환하는 단계이다.
또한, 본원에서 O-포스포세린 설피드릴라제 효소뿐만 아니라 상기 효소를 발현하는 미생물을 이용하여 전환 반응을 할 수 있다. 상기 효소 및 효소를 발현하는 미생물은 당업자에게 공지된 수단 및 방법을 통해 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 O-포스포세린 설피드릴라제 효소는 국제공개특허 WO 2013/089478, WO 2012/053794, WO 2012/053777 등에 기재된 효소를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에서 상기 황화물은 O-포스포세린 설피드릴라제 효소의 촉매 작용 하에 O-포스포세린과 반응할 수 있는 한 제한되지 않으나, CH3SH, Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본원에서 상기 (c) 내지 (e) 단계는, 전술한 농축 단계, pH 조정 단계, 결정화 단계와 동일하다.
본원에서, 상기 (f) 단계(재사용 단계)는 결정화 단계에서 회수한 인산염 결정을 인산 및/또는 인 공급원을 필요로 하는 발효 배지에 인산 및/또는 인 공급원으로 사용하는 단계이다. 구체적으로, 상기 발효 배지는 O-포스포세린의 생산에 사용되는 발효 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원의 다른 하나의 양태는,
(a) 인산을 함유하는 발효 배지에서, 미생물을 이용하여 O-포스포호모세린(O-phosphohomoserine, OPHS)을 생산하는 단계(OPHS 발효 단계);
(b) O-포스포호모세린 의존성 메티오닌 합성효소(O-phosphohomoserine dependent methionine synthase) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 (a) 단계에서 생산된 O-포스포호모세린을 황화물과 반응시켜 메티오닌 또는 이의 유도체의 발효액을 제조하는 단계(전환 단계);
(c) 상기 발효액; 또는 상기 발효액으로부터 메티오닌 또는 이의 유도체를 제거한 발효 폐액을 농축하는 단계(농축 단계);
(d) 상기 농축된 농축액의 pH를 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 조정 단계);
(e) 상기 pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 결정화하여 모액과 분리하는 단계(결정화 단계); 및
(f) 상기 결정화된 인산염을 발효 배지에서 인산 공급원으로 사용하는 단계(재사용 단계)를 포함하는, 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법을 제공한다.
본원에서 상기 (a) 단계(OPHS 발효 단계)는 인산을 함유한 발효 배지 및 미생물을 이용하여 O-포스포호모세린을 생산하는 단계이다. O-포스포호모세린은 쓰레오닌 및 인산의 에스터로서, O-포스포호모세린의 생산에는 인산이 필요하다. 또한, 상기 미생물은 O-포스포호모세린을 생산할 수 있는 공지의 미생물을 이용할 수 있다.
본원에서 상기 (b) 단계(전환 단계)는 OPHS 의존성 메티오닌 합성 효소의 촉매 작용 하에, OPHS 발효 단계에서 수득한 O-포스포호모세린을 황화물과 반응시켜 메티오닌 또는 이의 유도체로 전환하는 단계이다.
또한, 본원에서 OPHS 의존성 메티오닌 합성 효소뿐만 아니라 상기 효소를 발현하는 미생물을 이용하여 전환 반응을 할 수 있다. 구체적으로, 상기 효소 및 효소를 발현하는 미생물은 당업자에게 공지된 수단 및 방법을 통해 얻을 수 있으며, 예를 들어 국제공개특허 WO 2014/064244에 개시되어 있는 방법을 통해 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에서 상기 황화물은 OPHS 의존성 메티오닌 합성 효소의 촉매 작용 하에 O-포스포호모세린과 반응할 수 있는 한 제한되지 않으나, CH3SH, Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본원에서 상기 (c) 내지 (e) 단계는, 전술한 농축 단계, pH 조정 단계, 결정화 단계와 동일하다.
본원에서, 상기 (f) 단계(재사용 단계)는 결정화 단계에서 회수한 인산염 결정을 인산 및/또는 인 공급원을 필요로 하는 발효 배지에 인산 및/또는 인 공급원으로 사용하는 단계이다. 구체적으로, 상기 발효 배지는 O-포스포호모세린의 생산에 사용되는 발효 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원의 다른 하나의 양태는 인산을 발효 폐액으로부터 회수하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본원의 방법은 (a) 인산을 함유하는 발효 폐액을 농축하는 단계(농축 단계);
(b) 상기 농축된 농축액을 pH 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 조정 단계);
(c) 상기 pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 결정화하는 단계(결정화 단계); 및
(d) 상기 결정화된 인산염을 모액으로부터 분리하는 단계(분리 단계)를 포함하는, 인산을 회수하는 방법일 수 있다.
본원에서 상기 발효 폐액은 전술한 바와 같으며, 효소 전환 폐액을 포함하는 의미일 수 있다.
본원에서 상기 (a) 내지 (c) 단계는, 전술한 농축 단계, pH 조정 단계 및 결정화 단계와 동일하다.
본원에서 상기 (d) 단계(분리 단계)의 인산염 결정을 모액으로부터 분리하는 방법은 전술한 결정화 단계에서 설명한 바와 같다.
이하 본원을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본원을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본원의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. O-포스포세린 발효 폐액의 농도에 따른 인산회수
실시예 1-1. O-포스포세린 발효 폐액을 이용한 인산 회수
인산을 포함하는 발효 배지에서 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 생산할 수 있는 미생물을 배양하여 O-포스포세린 발효액을 수득한 후, 상기 발효액을 O-포스포세린 설피드릴라제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)를 이용하여 황화물과 반응시켜, 시스테인 또는 시스틴을 포함하는 발효액을 수득하였다(국제공개특허 WO 2012/053794). 상기 발효액으로부터 시스테인 또는 시스틴을 결정화하고, 고액분리하여 발효 폐액을 수득하였다.
상기 O-포스포세린 발효 폐액의 이온 조성 (g/L)은 24.4 나트륨 이온, 6.4 암모늄 이온, 14.8 염소 이온, 3.4 황산 이온, 34.3 인산 이온이었다. 2000 ml의 초기 폐액에서 1665 ml의 물을 증발시키고, 50% (w/w) 수산화나트륨 수용액 (38.0 ml)을 pH가 9.00에 도달할 때까지 첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 185.4 g/L였다. 냉각은 15℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 7수화물이 얻어졌다. 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
최종 생산물의 무게는 159.5 g이었다. 최종 생산품의 이온 조성 (g/kg)은 124.6 나트륨 이온, 5.3 암모늄 이온, 5.4 염소 이온, 4.2 황산 이온, 388.5 인산 이온이었다. 최종 생산품의 수분 함량은 45.7 wt%였다. 총 인산 회수율은 79.2 wt% 이었다.
실시예 1-2. O-포스포세린 발효 폐액을 이용한 인산 회수
본 실시예의 O-포스포세린 발효 기반 공정 폐액 이온 조성 (g/L)은 24.7 나트륨 이온, 6.3 암모늄 이온, 16.4 염소 이온, 3.9 황산 이온, 35.8 인산 이온이었다. 1945 ml의 초기 폐액에서 1555 ml의 물을 증발시키고, 50% 수산화나트륨 수용액 (46.5 ml)을 pH가 9.00에 도달할 때까지 첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 159.7 g/L였다. 냉각은 15℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 7수화물이 얻어졌다. 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
최종 생산물의 무게는 132.3 g이었다. 최종 생산품의 이온 조성 (g/kg)은 127.4 나트륨 이온, 10.9 암모늄 이온, 5.2 염소 이온, 3.1 황산 이온, 358.6 인산 이온이었다. 최종 생산품의 수분 함량은 49.6 wt%이었다. 총 인산 회수율은 68.0 wt% 였다.
실시예 1-3. O-포스포세린 발효 폐액을 이용한 인산 회수
본 실시예의 O-포스포세린 발효 기반 공정 폐액 이온 조성 (g/L)은 24.6 나트륨 이온, 6.2 암모늄 이온, 16.3 염소 이온, 3.5 황산 이온, 35.6 인산 이온이었다. 1975 ml의 초기 폐액에서 1315 ml의 물을 증발시키고, 50% 수산화나트륨 수용액 (43.0 ml)을 pH가 9.01에 도달할 때까지 첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 99.9 g/L였다. 냉각은 15℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 12수화물이 얻어졌다. 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
최종 생산물의 무게는 186.0 g이었다. 최종 생산품의 이온 조성 (g/kg)은 110.7 나트륨 이온, 13.5 암모늄 이온, 2.4 염소 이온, 2.8 황산 이온, 264.7 인산 이온이다. 최종 생산품의 수분 함량은 60.8 wt%이었다. 총 인산 회수율은 70.1 wt% 이었다.
실시예 1-4. O-포스포세린 발효 폐액을 이용한 인산 회수
본 실시예의 O-포스포세린 발효 기반 공정 폐액 이온 조성 (g/L)은 24.5 나트륨 이온, 6.2 암모늄 이온, 16.3 염소 이온, 3.7 황산 이온, 35.6 인산 이온이었다. 1955 ml의 초기 폐액에서 980 ml의 물을 증발시키고, 50% 수산화나트륨 수용액 (42.0 ml)을 pH가 9.04에 도달할 때까지 첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 68.4 g/L였다. 냉각은 15℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 12수화물이 얻어졌다. 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
최종 생산물의 무게는 172.9 g이었다. 최종 생산품의 이온 조성 (g/kg)은 112.8 나트륨 이온, 20.2 암모늄 이온, 1.2 염소 이온, 2.6 황산 이온, 255.9 인산 이온이었다. 최종 생산품의 수분 함량은 61.9 wt%이었다. 총 인산 회수율은 63.6 wt% 이었다.
이를 통해, pH가 조정된 농축액의 인산 이온 농도가 낮으면 낮을 수록, 인산 회수율이 낮아짐을 알 수 있었다.
실시예 2. 냉각 온도에 따른 인산 회수
본 실시예의 O-포스포세린 발효 기반 공정 폐액 이온 조성 (g/L)은 23.8 나트륨 이온, 6.5 암모늄 이온, 15.1 염소 이온, 3.4 황산 이온, 35.0 인산 이온이었다. 2000 ml의 초기 폐액에서 1600 ml의 물을 증발시키고(온도 범위 50℃ 이상), 50% 수산화나트륨 수용액 (39.5 ml)을 pH가 9.00에 도달할 때까지 첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 159.4 g/L였다. 이는 실시예 1-2와 유사한 실험 조건이었다. 냉각은 25℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 7수화물이 얻어졌다. 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
최종 생산물의 무게는 110.6 g이었다. 최종 생산품의 이온 조성 (g/kg)은 126.8 나트륨 이온, 13.8 암모늄 이온, 2.7 염소 이온, 2.2 황산 이온, 393.9 인산 이온이었다. 최종 생산품의 수분 함량은 43.9 wt%였다. 총 인산 회수율은 62.2 wt% 였다. 이러한 결과는 높은 인산 회수율을 위해서는 낮은 온도가 선호된다는 것을 의미한다.
실시예 3. 농축 전 pH의 추가 조정에 따른 인산 회수
본 실시예의 O-포스포세린 발효 기반 공정 폐액 이온 조성 (g/L)은 23.4 나트륨 이온, 6.4 암모늄 이온, 14.9 염소 이온, 3.5 황산 이온, 34.7 인산 이온이었다. 증발 공정 전, 50% 수산화나트륨 수용액 (39.5 ml)을 pH가 9.02에 도달할 때까지 첨가하였다. 그 후, 2000 ml의 초기 폐액에서 1600 ml의 물을 증발시킨다. 암모니아의 증발로 인하여 증발 후의 해당 공정액의 pH는 7.06이었다. 그러므로, 50% 수산화나트륨 수용액 (16.0 ml)을 pH가 9.00에 도달할 때까지 재첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 152.4 g/L 였다. 본 농도 조건은 실시예 1-2와 유사하였다. 냉각은 15℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 7수화물이 얻어졌다. 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
최종 생산물의 무게는 141.6 g이었다. 최종 생산품의 이온 조성 (g/kg)은 156.8 나트륨 이온, 0.6 암모늄 이온, 1.1 염소 이온, 3.2 황산 이온, 338.8 인산 이온이었다. 최종 생산품의 수분 함량은 51.2 wt%였다. 총 인산 회수율은 69.1 wt% 였다. 이 방법은 다른 공정보다 회수된 인산수소이나트륨 내의 암모늄 이온 불순물의 함량을 대폭 감소시켰다.
실시예 4. 메탄올 첨가에 따른 인산 회수
실시예 4-1. 100 ml 메탄올 첨가에 따른 인산 회수
본 실시예의 O-포스포세린 발효 기반 공정 폐액 이온 조성 (g/L)은 23.8 나트륨 이온, 6.4 암모늄 이온, 15.3 염소 이온, 6.4 황산 이온, 37.1 인산 이온이었다. 2000 ml의 초기 폐액에서 1600 ml의 물을 증발시킨다. 이후, 50% 수산화나트륨 수용액 (48.0 ml)을 pH가 9.07에 도달할 때까지 첨가하고, 100 ml 메탄올을 첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 135.2 g/L였다. 냉각은 15℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 7수화물이 얻어졌다. 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
최종 생산물의 무게는 182.7 g이었다. 최종 생산품의 이온 조성 (g/kg)은 135.5 나트륨 이온, 24.9 암모늄 이온, 13.1 염소 이온, 2.2 황산 이온, 328.5 인산 이온이었다. 최종 생산품의 수분 함량은 49.6 wt%였다. 총 인산 회수율은 81.0 wt% 였다.
실시예 4-2. 200 ml 메탄올 첨가에 따른 인산 회수
본 실시예의 O-포스포세린 발효 기반 공정 폐액 이온 조성 (g/L)은 23.9 나트륨 이온, 6.4 암모늄 이온, 15.3 염소 이온, 3.9 황산 이온, 37.3 인산 이온이었다. 2000 ml의 초기 폐액에서 1600 ml의 물을 증발시킨다. 이후, 50% 수산화나트륨 수용액 (47.0 ml)을 pH가 9.04에 도달할 때까지 첨가하고, 200 ml 메탄올을 첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 115.2 g/L였다. 냉각은 15℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 7수화물이 얻어졌다. 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
최종 생산물의 무게는 182.0 g이었다. 최종 생산품의 이온 조성 (g/kg)은 122.9 나트륨 이온, 38.9 암모늄 이온, 15.9 염소 이온, 2.4 황산 이온, 328.2 인산 이온이었다. 최종 생산품의 수분 함량은 46.6 wt%였다. 총 인산 회수율은 80.2 wt% 였다.
이를 통해, pH 조정 단계에서 또는 pH 조정 후에 메탄올을 첨가하면, 인산 회수율이 증가함을 알 수 있었다.
실시예 5. 2 단계 결정화에 따른 인산 회수
국제공개특허 WO 2014/182125에 기초하여, O-포스포세린 발효 및 L-시스테인 효소전환반응을 진행하였다. 해당 공정 이후, 공정 폐액의 이온 조성 (g/L)은 21.7 나트륨 이온, 4.4 암모늄 이온, 16.0 염소 이온, 30.1 황산 이온, 30.3 인산 이온이었다. 20 L의 초기 폐액에서 16.7 L의 물을 증발시키고, 50% 수산화나트륨 수용액 (0.4 L)을 pH가 9.00에 도달할 때까지 첨가하였다. 본 용액의 인산 이온 농도는 162.1 g/L였다. 냉각은 15℃까지 진행했으며, 인산수소이나트륨 7수화물이 얻어졌다. 인산수소이나트륨 7수화물 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다. 회수된 인산수소이나트륨 7수화물의 무게는 1339.0 g이었다. 해당 물질의 이온 조성 (g/kg)은 133.5 나트륨 이온, 18.7 암모늄 이온, 5.3 염소 이온, 1.3 황산 이온, 323.4 인산 이온이었다. 최종 생산품의 수분 함량은 48.2 wt%였다.
슬러리 여과 후, 여과액의 이온 조성 (g/L)은 13.3 나트륨 이온, 6.8 암모늄 이온, 98.9 염소 이온, 16.8 황산 이온, 40.2 인산 이온이었다. 남은 여과액 3.2 L에 인산수소이나트륨 12수화물 (실시예 1-3에서 제조된 시료) 1.1 g을 첨가하여 15℃에서 4시간 동안 교반하였다. 인산수소이나트륨 12수화물 슬러리는 원심 바스켓 필터로 여과되었으며, 순수한 물로 세척을 진행하였다.
회수된 인산수소이나트륨 12수화물의 무게는 299.0 g이었다. 해당 물질의 이온 조성 (g/kg)은 128.2 나트륨 이온, 6.1 염소 이온, 3.8 황산 이온, 239.5 인산 이온이었다. 수분 함량은 61.3 wt%였다. 위의 2 단계 공정의 최종 인산 회수율은 83.2 wt였다. 회수된 인산수소이나트륨 7수화물과 12수화물을 혼합 후, O-포스포세린 발효의 전구체로 재사용하였을 때, 아무런 문제 없이 발효 공정이 진행되었다.
실시예 6. 회수한 인산수소이나트륨을 이용한 O-포스포세린의 제조
국제공개특허 WO 2012/053794의 KCCM 11103P 균주를 이용해서 50㎍/㎖의 스펙티노마이신을 함유하는 MMYE 한천 배지 플레이트(2g/L의 글루코스, 2mM의 황산마그네슘, 0.1mM의 염화칼슘, 6g/L의 피로인산나트륨, 0.5g/L의 염화나트륨과 본원에서 회수한 인산수소이나트륨 3g/L, 10g/L의 효모추출물, 18g/L의 한천)상에서 33℃, 24시간 배양하고, 플레이트 상의 1/10의 세포를 하나의 플레이트로부터 긁어내어 배플(baffle) 플라스크 중에 50㎍/㎖의 스펙티노마이신을 함유한 50ml의 플라스크 씨드 배지(10g/L의 클루코스, 0.5g/L의 황산마그네슘, 3g/L의 인산이수소칼륨, 10g/L의 효모추출물, 0.5g/L의 염화나트륨, 1.5g/L의 염화암모늄, 12.8g/L의 피로인산나트륨, 1g/L의 글리신)에 접종시켜 30℃에서 200rpm으로 6시간 동안 씨드 배양하였다.
씨드 배양이 완료된 후 본배양 배지 용적의 16%에 상응하는 용적의 씨드 배양 배지를 300ml의 본배양 배지로 채워진 1L 소형 발효기에 접종하고, 배양을 33℃에서 pH 7.0에서 수행하였다. 배양물을 배양 동안에 암모니아수를 첨가하여 pH 7.0으로 조정했다. 배지 중 글루코스가 고갈된 후 520g/L의 글루코스 수용액 및 상기 본원에서 회수한 인산수소이나트륨 300g/L을 첨가하여 유가 배양을 수행하였다. 80시간의 배양 후, HPLC로 확인한 결과, 29.3g/L의 O-포스포세린이 측정되었다.
비교예. 순수 인산을 이용한 O-포스포세린의 제조
KCCM 11103P 균주를 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 씨드 배지와 메인 배지에서 배양하여, 글루코스가 고갈된 후 520g/L의 글루코스 수용액 및 순수 인산 200g/L를 첨가하여 유가 배양을 수행했다. 80시간의 배양 후 HPLC로 확인한 결과, 29.5g/L의 O-포스포세린이 측정되었다.
이를 통해, 본원의 인산을 발효 배지로부터 회수 및 재사용하는 방법은 발효액 또는 발효 폐액으로부터 인산염을 결정화하여 회수할 수 있고, 회수된 인산염을 발효에 재사용하는 경우 순수 인산을 사용한 경우와 유사한 양의 발효 생성물을 얻을 수 있음을 확인한바, 본원의 방법은 발효 공정에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. (a) 인산을 함유하는 발효액 또는 발효 폐액을 농축하는 단계(농축 단계);
    (b) 상기 농축된 농축액의 pH를 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 조정 단계);
    (c) 상기 pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 결정화하여 모액과 분리하는 단계(결정화 단계); 및
    (d) 상기 결정화된 인산염을 발효 배지에서 인산 공급원으로 사용하는 단계(재사용 단계)
    를 포함하는, 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법.
  2. (a) 인산을 함유하는 발효 배지에서, 미생물을 이용하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)을 생산하는 단계(OPS 발효단계);
    (b) O-포스포세린 설피드릴라제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 (a) 단계에서 생산된 O-포스포세린을 황화물과 반응시켜 시스테인 또는 이의 유도체의 발효액을 제조하는 단계(전환 단계);
    (c) 상기 발효액; 또는 상기 발효액으로부터 시스테인 또는 이의 유도체를 제거한 발효 폐액을 농축하는 단계(농축 단계);
    (d) 상기 농축된 농축액의 pH를 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 조정 단계);
    (e) 상기 pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 결정화하여 모액과 분리하는 단계(결정화 단계); 및
    (f) 상기 결정화된 인산염을 발효 배지에서 인산 공급원으로 사용하는 단계(재사용 단계)
    를 포함하는, 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법.
  3. (a) 인산을 함유하는 발효 배지에서, 미생물을 이용하여 O-포스포호모세린(O-phosphohomoserine, OPHS)을 생산하는 단계(OPHS 발효 단계);
    (b) O-포스포호모세린 의존성 메티오닌 합성효소(O-phosphohomoserine dependent methionine synthase) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 (a) 단계에서 생산된 O-포스포호모세린을 황화물과 반응시켜 메티오닌 또는 이의 유도체의 발효액을 제조하는 단계(전환 단계);
    (c) 상기 발효액; 또는 상기 발효액으로부터 메티오닌 또는 이의 유도체를 제거한 발효 폐액을 농축하는 단계(농축 단계);
    (d) 상기 농축된 농축액의 pH를 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 조정 단계);
    (e) 상기 pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 결정화하여 모액과 분리하는 단계(결정화 단계); 및
    (f) 상기 결정화된 인산염을 발효 배지에서 인산 공급원으로 사용하는 단계(재사용 단계)
    를 포함하는, 인산을 발효액 또는 발효 폐액으로부터 회수 및 재사용하는 방법.
  4. (a) 인산을 함유하는 발효 폐액을 농축하는 단계(농축 단계);
    (b) 상기 농축된 농축액을 pH 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 조정 단계);
    (c) 상기 pH 조정된 농축액으로부터 인산염을 결정화하는 단계(결정화 단계); 및
    (d) 상기 결정화된 인산염을 모액으로부터 분리하는 단계(분리 단계)
    를 포함하는, 인산을 회수하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 발효액은 (i) O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 발효액, (ii) O-포스포호모세린(O-phosphohomoserine, OPHS) 발효액, 또는 (iii) 상기 발효액을 기반으로, 전환효소 또는 이를 발현하는 미생물; 및 황화물을 첨가하여 제조한 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하는 발효액이고,
    상기 발효 폐액은 발효액으로부터 아미노산 또는 이의 유도체가 제거된 폐액인, 방법.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 황화물은 CH3SH, Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 방법.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 발효 폐액은 발효액으로부터 아미노산 또는 이의 유도체가 제거된 폐액인, 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH 조정 단계는 농축액에 수산화물을 첨가하여 수행되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수산화물은 수산화나트륨 또는 수산화나트륨 수용액인, 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH 조정 단계와 결정화 단계 사이 또는 결정화 단계에서, 상기 pH 조정된 농축액을 냉각시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH 조정 단계와 결정화 단계 사이 또는 결정화 단계에, 인산염 결정을 결정핵으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산염은 인산삼나트륨, 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨 및 이들의 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 수화물은 인산수소이나트륨 7수화물 또는 인산수소이나트륨 12수화물인, 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모액으로부터 인산염을 결정화하는 단계(2차 결정화 단계)를 추가적으로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 2차 결정화 단계는, (i) 모액을 농축하는 단계(재농축 단계), (ii) 상기 모액의 pH를 8 내지 11로 조정하는 단계(pH 재조정 단계), 및 (iii) 상기 pH 조정된 모액으로부터 인산염을 결정화하여 분리하는 단계(재결정화 단계)를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 pH 재조정 단계와 재결정화 단계 사이 또는 재결정화 단계에, 모액에 인산염 결정을 결정핵으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 단계 전에, 발효액 또는 발효 폐액을 pH 8 내지 11로 조정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH 조정 단계; 또는 pH 조정 단계와 결정화 단계 사이에, 알코올을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
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