JP2020526207A - リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法 - Google Patents

リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法 Download PDF

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Abstract

本願は、発酵液またはその廃液からリン酸を回収する方法及び回収したリン酸を発酵に再使用する工程に関する。
【選択図】図１

Description

本願は、発酵液またはその廃液からリン酸を回収する方法及び回収したリン酸を発酵に再使用する方法に関する。
発酵を介して目的物質を生産する時にリン酸が必須的に必要な場合がある。その例として、特許文献１では、Ｌ−システインの生産に用いられる前駆体であるＯ−ホスホセリン発酵のためにリン酸供給源を提供しうることを言及している。また、特許文献２では、Ｏ−ホスホホモセリンから硫化物と転換酵素を介してメチオニンを生産する方法を開示しているが、このことから前駆体であるＯ−ホスホホモセリンを発酵的に生産するためにはリン供給源としてリン酸塩が不可欠であることが分かる。そこで、リン酸塩が多量に含まれた発酵液またはその廃液から残留リン酸を回収して、これをリン供給源として再使用する案を講じなければならない。
既存のリン酸の回収工程は、リン酸を含有した鉱石物質から有機溶媒抽出工程でリン酸を分離した後、カルシウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩などで中和する工程を経てリン酸を回収するのが一般的である（特許文献３〜８）。しかし、有機溶媒抽出工程は、溶媒の使用に伴うコスト発生及び溶媒の回収工程が追加されるため、工程が複雑になり、経済性が低下し、使用可能な有機溶媒は微量でも発酵工程に毒素として作用することがあり、発酵工程に適用するには難しい。一方、リン酸含有の鉱石物質ではなく、発酵工程の廃液から有機溶媒抽出方法以外の方法でリン酸を回収または生産する工程に関する特許や参考文献はまだ存在していない。
国際公開特許ＷＯ ２０１４／１８２１２５ 国際公開特許ＷＯ ２０１４／０６４２４４ ＵＳ３３７５０６８ ＵＳ３４６６１４１Ａ ＵＳ４５４３２３９ ＥＰ００８７３２３Ａ１ ＵＳ７６８７０４６ ＵＳ８６５８１１７ 国際公開特許ＷＯ ２０１４／１８２１１９ 国際公開特許ＷＯ ２０１２／０５３７９４ 国際公開特許ＷＯ ２０１３／０８９４７８ 国際公開特許ＷＯ ２０１２／０５３７７７
本発明者らは、発酵液または発酵廃液からリン酸を回収する方法を開発するために鋭意努力した結果、有機溶媒を使用せずに、発酵液または発酵廃液からリン酸塩を回収することができ、前記回収されたリン酸塩を発酵に再使用する場合、純粋なリン酸を用いた場合と同様の量の発酵生成物を得ることができることを確認し、本願を完成した。
本願の一つの目的は、リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法を提供することにある。
本願の他の一つの目的は、リン酸をＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）発酵液；またはシステインまたはその誘導体を除去した発酵廃液から回収及び再使用する方法を提供することにある。
本願のもう一つの目的は、リン酸をＯ−ホスホホモセリン（O-phosphohomoserine、ＯＰＨＳ）発酵液；またはメチオニンまたはその誘導体を除去した発酵廃液から回収及び再使用する方法を提供することにある。
本願のもう一つの目的は、リン酸を含有する発酵廃液からリン酸を回収する方法を提供することにある。
鉱石物質ではなく発酵工程でリン酸を回収する場合、有機溶媒抽出方法以外の方法でリン酸を回収して、発酵工程に再使用する方法を本願で初めて究明した。本願のリン酸を発酵培地から回収及び再使用する方法は、有機溶媒を使用せずに、発酵液または発酵廃液からリン酸を回収して発酵工程に再使用することができ、有機溶媒の問題点である発酵工程に毒素として作用することがある点、溶媒の使用に伴うコストが追加発生する点、及び溶媒回収工程の追加によって工程が複雑になる点などの問題がないため、発酵工程に非常に有用に用いられる。
リン酸を含有する発酵液または発酵廃液からリン酸塩を回収する工程を簡単に示したものである。 Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）またはＯ−ホスホホモセリン（O-phosphohomoserine、ＯＰＨＳ）発酵液からの酵素転換反応を用いて生産された発酵液；または前記発酵液からシステイン、システイン誘導体、メチオニンまたはメチオニン誘導体を除去して残った発酵廃液から、リン酸を回収して、そのリン酸回収物質を再びＯ−ホスホセリンまたはＯ−ホスホホモセリン発酵に用いる工程を簡単に示したものである。 Ｏ−ホスホセリンまたはＯ−ホスホホモセリン発酵液からの酵素転換反応を用いて生産された発酵液；または前記発酵液からシステイン、システイン誘導体、メチオニンまたはメチオニン誘導体を除去して残った発酵廃液から、リン酸を２段階を経て回収し、回収したリン酸を再びＯ−ホスホセリンまたはＯ−ホスホホモセリン発酵に用いる工程を簡単に示したものである。
前記目的を達成するための本願の一つの様態は、（ａ）リン酸を含有する発酵液または発酵廃液を濃縮する段階（濃縮段階）；
（ｂ）前記濃縮された濃縮液のｐＨを８〜１１に調整する段階（ｐＨ調整段階）；
（ｃ）前記ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を結晶化して親液と分離する段階（結晶化段階）；及び
（ｄ）前記結晶化されたリン酸塩を発酵培地でリン酸供給源として用いる段階（再使用段階）を含む、リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法を提供する。
本願で前記（ａ）段階（濃縮段階）の発酵液は、リン酸を含有している培地で発酵生成物を生産する微生物を培養して収得した培地、前記培地と一緒に培養した微生物を含む培養物、またはこれらの酵素転換液を意味してもよい。
前記「発酵生成物」の種類は、前記発酵液がリン酸を含有している限り制限されないが、具体的には、発酵で生産される目的物質、その誘導体または前駆体であってもよい。また、前記目的物質はアミノ酸であってもよく、例えば、システインまたはメチオニンであってもよいが、これに制限されない。また、前記目的物質の誘導体はアミノ酸の誘導体であってもよく、具体的には、システインの誘導体またはメチオニンの誘導体であってもよい。より具体的には、前記システインの誘導体は、Ｎ−アセチルシステイン、シスチン、金属システイン複合体（例えば、亜鉛システイン複合体、マンガンシステイン複合体、鉄システイン複合体、銅システイン複合体、マグネシウムシステイン複合体など）及びシステイン塩（例えば、システイン塩酸塩など）などの中から選択される１つ以上であってもよいが、これに制限されない。前記メチオニンの誘導体は、Ｎ−アセチルメチオニン、金属メチオニン複合体（例えば、亜鉛メチオニン複合体、マンガンメチオニン複合体、鉄メチオニン複合体、銅メチオニン複合体、マグネシウムメチオニン複合体など）、メチオニン塩などの中から選択される１つ以上であってもよいが、これに限定されない。また、前記目的物質の前駆体は、アミノ酸の前駆体であってもよく、具体的には、システインの前駆体またはメチオニンの前駆体であってもよい。より具体的には、Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）またはＯ−ホスホホモセリン（O-phosphohomoserine、ＯＰＨＳ）であってもよいが、これに制限されない。
また、前記「発酵液」には、（ａ）リン酸を含む目的物質、その前駆体またはそれらの誘導体発酵液、（ｂ）目的物質の前駆体生産菌株、基質及び転換酵素によって生産された目的物質またはその誘導体；及びリン酸を含む発酵液、または（ｃ）目的物質の前駆体発酵液に転換酵素または転換酵素を発現する微生物；及び基質を添加して生産された目的物質またはその誘導体；及びリン酸を含む発酵液も含まれてもよいが、これに制限されない。
より具体的には、前記発酵液は、（ｉ）リン酸を含有しているＯ−ホスホセリン発酵液、（ｉｉ）リン酸を含有しているＯ−ホスホホモセリン発酵液、または（ｉｉｉ）前記発酵液をベースに、転換酵素またはそれを発現する微生物；及び硫化物を添加して製造したアミノ酸またはその誘導体；及びリン酸を含む発酵液であってもよい。また、前記（ｉｉｉ）発酵液は、具体的には、Ｏ−ホスホセリン発酵液にＯ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）またはそれを発現する微生物；及び硫化物を添加して製造したシステインまたはその誘導体；及びリン酸を含有する発酵液であってもよい。また、前記（ｉｉｉ）発酵液は、Ｏ−ホスホホモセリン発酵液にＯＰＨＳ依存性メチオニン合成酵素（O-phospho-homoserine dependent methionine synthase）またはそれを発現する微生物；及び硫化物を添加して製造したメチオニンまたはその誘導体；及びリン酸を含有する発酵液を含んでもよい。
本願で「発酵廃液」は、前記発酵液から発酵生成物の一部または全部が分離除去された液であってもよいが、これに制限されない。具体的には、前記発酵廃液は、アミノ酸、その誘導体または前駆体、及びリン酸を含有する発酵液からアミノ酸、その誘導体または前駆体の一部または全部が分離されて除去された液であってもよいが、これに制限されない。例えば、アミノ酸、その誘導体、及びリン酸を含む発酵液からアミノ酸またはその誘導体の一部または全部が分離されて除去された液であってもよく、アミノ酸前駆体の発酵液に基質及び転換酵素またはそれを生産する微生物によって生産されたアミノ酸、その誘導体、及びリン酸を含む発酵液からアミノ酸またはその誘導体の一部または全部が分離されて除去された液であってもよい。より具体的な例では、Ｏ−ホスホセリン発酵液にＯ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）またはそれを発現する微生物；及び硫化物を添加して製造したシステインまたはその誘導体；及びリン酸を含有する発酵液からシステインまたはその誘導体の一部または全部が分離除去された液であってもよく、Ｏ−ホスホホモセリン発酵液にＯＰＨＳ依存性メチオニン合成酵素（O-phospho-homoserine dependent methionine synthase）またはそれを発現する微生物；及び硫化物を添加して製造したメチオニンまたはその誘導体；及びリン酸を含有する発酵液からメチオニンまたはその誘導体の一部または全部が分離除去された液であってもよいが、これに制限されない。
本願において、前記濃縮段階の「濃縮」は、前記発酵液または発酵廃液に含まれるリン酸イオンの濃度を高める限り、方法に制限されず、当業界に公知された方法により行われてもよい。具体的には、蒸発、加熱、減圧、通風、冷凍方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。
本願において、濃縮はリン酸回収率を高めるために実施するものであり、濃縮段階は、ｐＨが調整された濃縮液のリン酸イオン濃度が具体的には、６０ｇ／Ｌ以上または７０ｇ／Ｌ以上、さらに具体的には、６０ｇ／Ｌ〜３００ｇ／Ｌまたは７０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌになるように発酵液または発酵廃液を濃縮してもよいが、これに制限されない。
また、本願において、前記濃縮段階の前に発酵液または発酵廃液のｐＨを調整してもよい。具体的には、前記発酵液または発酵廃液のｐＨを７以上、７．５以上、８以上、８．５以上または９以上、より具体的には、８〜１１に調整してもよい。濃縮の前にｐＨを調整すると回収されたリン酸塩のアンモニウムイオン不純物の含量を減少させることができる。
本願において、前記（ｂ）段階（ｐＨ調整段階）は、リン酸塩の結晶化前の濃縮液のｐＨを調整する段階である。前記濃縮段階で得られた濃縮液のｐＨはリン酸塩が結晶化されうる限り制限されないが、濃縮液のｐＨは中性から塩基性に調整してもよく、具体的には、７以上、７．５以上、８以上、８．５以上または９以上 、より具体的には、８〜１１に調整してもよい。
また、本願において、前記ｐＨ調整段階は、濃縮液に塩基性物質を添加して行われてもよく、具体的には、水酸化物を添加して行われてもよい。具体的には、前記の水酸化物は、水酸化ナトリウムまたは水酸化ナトリウム水溶液であってもよいが、これに制限されない。
本願において、前記（ｃ）段階（結晶化段階）は、ｐＨ調整段階で得られたｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を回収する段階である。本願でリン酸塩の回収は、有機溶媒を使用せずに、ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩の結晶を生成させ、生成された結晶を親液と分離して行われる。
リン酸塩の結晶化のために温度を調整して/したり結晶核を添加してもよいが、これに制限されない。具体的には、リン酸塩の結晶化のためにｐＨ調整段階と結晶化段階の間；または結晶化段階に前記ｐＨが調整された濃縮液を冷却させる段階をさらに含んでもよい。より具体的には、ｐＨが調整された濃縮液を常温に放置したり、ｐＨが調整された濃縮液を結晶化段階前に冷却したり、または結晶化段階でｐＨが調整された濃縮液を冷却してもよいが、これに制限されない。一方、リン酸回収率は、冷却温度によって影響を受けることがあるが、リン酸塩の結晶が生成されうる限り、冷却温度は制限されない。具体的には、前記冷却温度は、５０℃以下、具体的には、０〜３０℃、より具体的には、１０〜２０℃であってもよいが、これに制限されない。
また、具体的には、リン酸塩の結晶化のために前記ｐＨ調整段階と結晶化段階の間、または結晶化段階の中に、リン酸塩結晶を結晶核として添加する段階をさらに含んでもよいが、これに制限されない。
本願において、前記「リン酸塩」は、リン酸の塩またはその水和物を意味し、結晶化を介してリン酸を回収できる限り、塩の種類は制限されない。具体的には、前記リン酸塩は、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム及びこれらの水和物から選択される１つ以上であってもよく、より具体的には、リン酸水素二ナトリウムまたはその水和物であってもよいが、これに制限されない。前記水和物に結合されている水分子の数は、リン酸塩水和物が結晶化されうる限り制限されないが、具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３以上であってもよい。また、前記水和物は、具体的には、リン酸水素二ナトリウム７水和物またはリン酸水素二ナトリウム１２水和物であってもよいが、これに制限されない。
本願でリン酸とリン酸塩は、混用して用いられてもよい。
本願で生成されたリン酸塩結晶を分離するために用いられる方法は、固液分離できる方法であれば制限されず、具体的には、遠心分離機、フィルタープレス、圧着フィルター、回転式真空フィルター、または膜分離機などを用いてもよいが、これに制限されない。
本願において、前記親液は、生成されたリン酸塩結晶をｐＨが調整された濃縮液から分離除去して収得した液を意味するもので、結晶化されてないリン酸イオンを含んでもよいが、これに制限されない。
リン酸回収率を高めるために、前記親液からリン酸塩を再結晶化する２次結晶化段階を本願の方法の一様態にさらに含んでもよい。本願は、先に説明した結晶化段階で収得したリン酸塩結晶（１次回収リン酸塩）と２次結晶化段階で収得したリン酸塩結晶（２次回収リン酸塩）を加えて、高いリン酸回収率を得ることができる。具体的には、前記２次結晶化段階は、（ｉ）親液を濃縮する段階（再濃縮段階）、（ｉｉ）前記親液のｐＨを調整する段階（ｐＨ再調整段階）、及び（ｉｉｉ）前記ｐＨが調整された親液からリン酸塩を結晶化して分離する段階（再結晶化段階）を含んでもよい。前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）段階は、前述した濃縮段階、ｐＨ調整段階及び結晶化段階と同様の方法で行われてもよい。具体的には、前記親液のｐＨは７以上、７．５以上、８以上、８．５以上または９以上、より具体的には、８〜１１で調整してもよい。
また、具体的には、前記２次結晶化段階は、親液にリン酸塩結晶を結晶核として添加する段階をさらに含んでもよく、例えば、前記ｐＨ再調整段階と再結晶化段階の間、または再結晶化段階の中で、親液にリン酸塩結晶を結晶核として添加する段階をさらに含んでもよいが、これに制限されない。
また、本願は、リン酸回収率を高めるために、結晶化段階を２回以上行ってもよい。
本願の方法は、前記ｐＨ調整段階；またはｐＨ調整段階と結晶化段階の間に、アルコールを添加する段階をさらに含んでもよい。アルコールは、リン酸塩に対する溶解度が低いため、リン酸塩溶液と混合される時には、その溶液のリン酸塩溶解度を減少させてリン酸の回収率を増加させる役割をする。前記アルコールは、リン酸回収率を高める限り制限されないが、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールまたはそれらの組み合わせであってもよい。
本願において、前記（ｄ）段階（再使用段階）は、結晶化の段階で回収したリン酸塩結晶をリン酸及び／またはリン供給源を必要とする様々な発酵培地にリン酸及び／またはリン供給源として用いる段階である。本願の発酵培地は、本願の目的上、リン酸及び／またはリン供給源を必要とする発酵に用いられる培地である限り制限されないが、具体的には、Ｏ−ホスホセリンまたはＯ−ホスホホモセリンの生産に用いられる発酵培地であってもよい。
本願の他の一つの様態は、
（ａ）リン酸を含有する発酵培地で微生物を用いてＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）を生産する段階（ＯＰＳ発酵段階）；
（ｂ）Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）またはこれを発現する微生物の存在下で、前記（ａ）段階で生産されたＯ−ホスホセリンを硫化物と反応させてシステインまたはその誘導体の発酵液を製造する段階（転換段階）；
（ｃ）前記発酵液；または前記発酵液からシステインまたはその誘導体を除去した発酵廃液を濃縮する段階（濃縮段階）；
（ｄ）前記濃縮された濃縮液のｐＨを８〜１１に調整する段階（ｐＨ調整段階）；
（ｅ）前記ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を結晶化して親液と分離する段階（結晶化段階）；及び
（ｆ）前記結晶化されたリン酸塩を発酵培地でリン酸供給源として用いる段階（再使用段階）を含む、リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法を提供する。
本願において、前記（ａ）段階（ＯＰＳ発酵段階）は、リン酸を含有した発酵培地及び微生物を用いてＯ−ホスホセリンを生産する段階である。Ｏ−ホスホセリンはセリン及びリン酸のエステルであって、Ｏ−ホスホセリンの生産にはリン酸が必要である。また、前記微生物は、Ｏ−ホスホセリンを生産しうる公知の微生物を用いてもよく、非限定的な例として、Ｏ−ホスホセリン排出活性が強化された微生物（特許文献１、９）を用いてもよい。また、高いＯ−ホスホセリン生産能を有する微生物の例として、内在的なホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase、ＳｅｒＢ）を弱化させたり／させて、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（phosphoglycerate dehydrogenase、ＳｅｒＡ）及び／またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine aminotransferase、ＳｅｒＣ）の活性が強化された微生物（特許文献１０）を用いてもよいが、これに制限されない。
本願において、前記（ｂ）段階（転換段階）は、Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ酵素の触媒作用下でＯＰＳ発酵段階で収得したＯ−ホスホセリンを硫化物と反応させてシステインまたはその誘導体に転換する段階である。
また、本願でＯ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ酵素だけでなく、前記酵素を発現する微生物を用いて転換反応を行ってもよい。前記酵素及び酵素を発現する微生物は、当業者に公知された手段及び方法を介して得てもよい。具体的には、前記Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ酵素は、特許文献１０〜１２などに記載された酵素を用いてもよいが、これに制限されない。
また、本願において、前記硫化物は、Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ酵素の触媒作用下でＯ−ホスホセリンと反応する限り制限されないが、ＣＨ３ＳＨ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、（ＮＨ４）２Ｓ、Ｈ２Ｓ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３からなる群から選択される１つ以上であってもよい。
本願で前記（ｃ）〜（ｅ）段階は、前述した濃縮段階、ｐＨ調整段階、結晶化段階と同じである。
本願では、前記（ｆ）段階（再使用段階）は、結晶化の段階で回収したリン酸塩結晶をリン酸及び／またはある供給源を必要とする発酵培地にリン酸及び／またはリン供給源として用いる段階である。具体的には、前記発酵培地は、Ｏ−ホスホセリンの生産に使用される発酵培地であってもよいが、これに制限されない。
本願の他の一つの様態は、
（ａ）リン酸を含有する発酵培地で微生物を用いてＯ−ホスホホモセリン（O-phosphohomoserine、ＯＰＨＳ）を生産する段階（ＯＰＨＳ発酵段階）；
（ｂ）Ｏ−ホスホホモセリン依存性メチオニン合成酵素（O-phosphohomoserine dependent methionine synthase）またはそれを発現する微生物の存在下で、前記（ａ）段階で生産されたＯ−ホスホホモセリンを硫化物と反応させてメチオニンまたはその誘導体の発酵液を製造する段階（転換段階）；
（ｃ）前記発酵液；または前記発酵液からメチオニンまたはその誘導体を除去した発酵廃液を濃縮する段階（濃縮段階）；
（ｄ）前記濃縮された濃縮液のｐＨを８〜１１に調整する段階（ｐＨ調整段階）；
（ｅ）前記ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を結晶化して親液と分離する段階（結晶化段階）；及び
（ｆ）前記結晶化されたリン酸塩を発酵培地でリン酸供給源として用いる段階（再使用段階）を含む、リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法を提供する。
本願において、前記（ａ）段階（ＯＰＨＳ発酵段階）は、リン酸を含有した発酵培地及び微生物を用いてＯ−ホスホホモセリンを生産する段階である。Ｏ−ホスホホモセリンは、トレオニン及びリン酸のエステルであって、Ｏ−ホスホホモセリンの生産にはリン酸が必要である。また、前記微生物は、Ｏ−ホスホホモセリンを生産しうる公知の微生物を用いてもよい。
本願において、前記（ｂ）段階（転換段階）は、ＯＰＨＳ依存性メチオニン合成酵素の触媒作用下で、ＯＰＨＳ発酵段階で収得したＯ−ホスホホモセリンを硫化物と反応させてメチオニンまたはその誘導体に転換する段階である。
また、本願でＯＰＨＳ依存性メチオニン合成酵素だけでなく、前記酵素を発現する微生物を用いて転換反応を行ってもよい。具体的には、前記酵素及び酵素を発現する微生物は、当業者に公知された手段及び方法を介して得てもよく、例えば、特許文献２に開示されている方法を介して得てもよいが、これに制限されない。
また、本願において、前記硫化物は、ＯＰＨＳ依存性メチオニン合成酵素の触媒作用下でＯ−ホスホホモセリンと反応できる限り制限されないが、ＣＨ３ＳＨ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、（ＮＨ４）２Ｓ、Ｈ２Ｓ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３からなる群から選択される１つ以上であってもよい。
本願で前記（ｃ）〜（ｅ）段階は、前述した濃縮段階、ｐＨ調整段階、結晶化段階と同じである。
本願において、前記（ｆ）段階（再使用段階）は、結晶化段階で回収したリン酸塩結晶をリン酸及び／またはリン供給源を必要とする発酵培地にリン酸及び／またはリン供給源として用いる段階である。具体的には、前記発酵培地は、Ｏ−ホスホホモセリンの生産に用いられる発酵培地であってもよいが、これに制限されない。
本願の他の一つの様態は、リン酸を発酵廃液から回収する方法を提供する。
具体的には、本願の方法は、（ａ）リン酸を含有する発酵廃液を濃縮する段階（濃縮段階）；
（ｂ）前記濃縮された濃縮液をｐＨ ８〜１１に調整する段階（ｐＨ調整段階）；
（ｃ）前記ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を結晶化する段階（結晶化段階）；及び
（ｄ）前記結晶化されたリン酸塩を親液から分離する段階（分離段階）を含む、リン酸を回収する方法であってもよい。
本願において、前記発酵廃液は、前述した通りであり、酵素転換廃液を含む意味であってもよい。
本願で前記（ａ）〜（ｃ）段階は、前述した濃縮段階、ｐＨ調整段階と結晶化段階と同じである。
本願で前記（ｄ）段階（分離段階）のリン酸結晶を親液から分離する方法は、前述した結晶化段階で説明した通りである。
以下、本願を下記実施例により詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本願を例示するためのものであり、下記実施例により本願の範囲が制限されるものではない。
実施例１．Ｏ−ホスホセリン発酵廃液の濃度に応じたリン酸の回収
実施例１−１．Ｏ−ホスホセリン発酵廃液を用いたリン酸の回収
リン酸を含む発酵培地でＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）を生産できる微生物を培養してＯ−ホスホセリン発酵液を収得した後、前記発酵液をＯ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）を用いて硫化物と反応させ、システインまたはシスチンを含む発酵液を収得した（特許文献１０）。前記発酵液からシステインまたはシスチンを結晶化し、固液分離して発酵廃液を収得した。
前記Ｏ−ホスホセリン発酵廃液のイオン組成（ｇ／Ｌ）は、２４．４ナトリウムイオン、６．４アンモニウムイオン、１４．８塩素イオン、３．４硫酸イオン、３４．３リン酸イオンであった。２０００ｍｌの初期廃液から１６６５ｍｌの水を蒸発させ、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液（３８．０ｍｌ）を、ｐＨが９．００に達するまで添加した。本溶液のリン酸イオンの濃度は１８５．４ｇ／Ｌであった。冷却は１５℃まで行い、リン酸水素二ナトリウム７水和物が得られた。スラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
最終的な生産物の重量は１５９．５ｇであった。最終的な生産品のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１２４．６ナトリウムイオン、５．３アンモニウムイオン、５．４塩素イオン、４．２硫酸イオン、３８８．５リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は４５．７ｗｔ％であった。総リン酸回収率は７９．２ｗｔ％であった。
実施例１−２．Ｏ−ホスホセリン発酵廃液を用いたリン酸の回収
本実施例のＯ−ホスホセリン発酵ベースの工程廃液のイオン組成（ｇ／Ｌ）は、２４．７ナトリウムイオン、６．３アンモニウムイオン、１６．４塩素イオン、３．９硫酸イオン、３５．８リン酸イオンであった。１９４５ｍｌの初期廃液から１５５５ｍｌの水を蒸発させ、５０％水酸化ナトリウム水溶液（４６．５ｍｌ）を、ｐＨが９．００に達するまで添加した。本溶液のリン酸イオンの濃度は１５９．７ｇ／Ｌであった。冷却は１５℃まで行い、リン酸水素二ナトリウム７水和物が得られた。スラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
最終的な生産物の重量は１３２．３ｇであった。最終的な生産品のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１２７．４ナトリウムイオン、１０．９アンモニウムイオン、５．２塩素イオン、３．１硫酸イオン、３５８．６リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は４９．６ｗｔ％であった。総リン酸回収率は６８．０ｗｔ％であった。
実施例１−３．Ｏ−ホスホセリン発酵廃液を用いたリン酸の回収
本実施例のＯ−ホスホセリン発酵ベースの工程廃液イオン組成（ｇ／Ｌ）は、２４．６ナトリウムイオン、６．２アンモニウムイオン、１６．３塩素イオン、３．５硫酸イオン、３５．６リン酸イオンであった。１９７５ｍｌの初期廃液から１３１５ｍｌの水を蒸発させ、５０％水酸化ナトリウム水溶液（４３．０ｍｌ）を、ｐＨが９．０１に達するまで添加した。本溶液のリン酸イオン濃度は９９．９ｇ／Ｌであった。冷却は１５℃まで行い、リン酸水素二ナトリウム１２水和物が得られた。スラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
最終的な生産物の重量は１８６．０gであった。最終的な生産品のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１１０．７ナトリウムイオン、1３．５アンモニウムイオン、２．４塩素イオン、２．８硫酸イオン、２６４．７リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は６０．８ｗｔ％であった。総リン酸回収率は７０．１ｗｔ％であった。
実施例１−４．Ｏ−ホスホセリン発酵廃液を用いたリン酸の回収
本実施例のＯ−ホスホセリン発酵ベースの工程廃液イオン組成（ｇ／Ｌ）は、２４．５ナトリウムイオン、６．２アンモニウムイオン、１６．３塩素イオン、３．７硫酸イオン、３５．６リン酸イオンであった。１９５５ｍｌの初期廃液から９８０ｍｌの水を蒸発させ、５０％水酸化ナトリウム水溶液（４２．０ｍｌ）をｐＨが９．０４に達するまで添加した。本溶液のリン酸イオンの濃度は６８．４ｇ／Ｌであった。冷却は１５℃まで行い、リン酸水素二ナトリウム１２水和物が得られた。スラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
最終的な生産物の重量は１７２．９gであった。最終的な生産品のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１１２．８ナトリウムイオン、２０．２アンモニウムイオン、１．２塩素イオン、２．６硫酸イオン、２５５．９リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は６１．９ｗｔ％であった。総リン酸回収率は６３．６ｗｔ％であった。
これにより、ｐＨが調整された濃縮液のリン酸イオンの濃度が低ければ低いほど、リン酸回収率が低くなることが分かった。
実施例２．冷却温度によるリン酸の回収
本実施例のＯ−ホスホセリン発酵ベースの工程廃液イオン組成（ｇ／Ｌ）は、２３．８ナトリウムイオン、６．５アンモニウムイオン、１５．１塩素イオン、３．４硫酸イオン、３５．０リン酸イオンであった。２０００ｍｌの初期廃液から１６００ｍｌの水を蒸発させ（温度範囲５０℃以上）、５０％水酸化ナトリウム水溶液（３９．５ｍｌ）をｐＨが９．００に達するまで添加した。本溶液のリン酸イオンの濃度は１５９．４ｇ／Ｌであった。これは、実施例１−２と同様の実験条件であった。冷却は２５℃まで進行しており、リン酸水素二ナトリウム７水和物が得られた。スラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
最終的な生産物の重量は１１０．６gであった。最終的な生産品のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１２６．８ナトリウムイオン、１３．８アンモニウムイオン、２．７塩素イオン、２．２硫酸イオン、３９３．９リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は４３．９ｗｔ％であった。総リン酸回収率は６２．２ｗｔ％であった。これらの結果は、高いリン酸回収率のためには低い温度が好ましいことを意味する。
実施例３．濃縮前ｐＨの追加調整に伴うリン酸の回収
本実施例のＯ−ホスホセリン発酵ベースの工程廃液イオン組成（ｇ／Ｌ）は、２３．４ナトリウムイオン、６．４アンモニウムイオン、１４．９塩素イオン、３．５硫酸イオン、３４．７リン酸イオンであった。蒸発工程の前に、５０％水酸化ナトリウム水溶液（３９．５ｍｌ）をｐＨが９．０２に達するまで添加した。その後、２０００ｍｌの初期廃液から１６００ｍｌの水を蒸発させた。アンモニアの蒸発により蒸発後のその工程液のｐＨは７．０６であった。従って、５０％水酸化ナトリウム水溶液（１６．０ｍｌ）をｐＨが９．００に達するまで再添加した。本溶液のリン酸イオンの濃度は１５２．４ｇ／Ｌであった。本濃度条件は実施例１−２と同様であった。冷却は１５℃まで行い、リン酸水素二ナトリウム７水和物が得られた。スラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
最終的な生産物の重量は１４１．６gであった。最終的な生産品のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１５６．８ナトリウムイオン、０．６アンモニウムイオン、１．１塩素イオン、３．２硫酸イオン、３３８．８リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は５１．２ｗｔ％であった。総リン酸回収率は６９．１ｗｔ％であった。この方法は、他の工程よりも回収されたリン酸水素二ナトリウムのアンモニウムイオン不純物の含量を大幅に減少させた。
実施例４．メタノール添加によるリン酸の回収
実施例４−１．１００ｍｌメタノール添加によるリン酸の回収
本実施例のＯ−ホスホセリン発酵ベースの工程廃液イオン組成（ｇ／Ｌ）は、２３．８ナトリウムイオン、６．４アンモニウムイオン、１５．３塩素イオン、６．４硫酸イオン、３７．１リン酸イオンであった。２０００ｍｌの初期廃液から１６００ｍｌの水を蒸発させた。以後、５０％水酸化ナトリウム水溶液（４８．０ｍｌ）をｐＨが９．０７に達するまで添加し、１００ｍｌのメタノールを添加した。本溶液のリン酸イオンの濃度は１３５．２ｇ／Ｌであった。冷却は１５℃まで行い、リン酸水素二ナトリウム７水和物が得られた。スラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
最終的な生産物の重量は１８２．７gであった。最終的な生産品のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１３５．５ナトリウムイオン、２４．９アンモニウムイオン、１３．１塩素イオン、２．２硫酸イオン、３２８．５リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は４９．６ｗｔ％であった。総リン酸回収率は８１．０ｗｔ％であった。
実施例４−２．２００ｍｌメタノール添加によるリン酸の回収
本実施例のＯ−ホスホセリン発酵ベースの工程廃液イオン組成（ｇ／Ｌ）は、２３．９ナトリウムイオン、６．４アンモニウムイオン、１５．３塩素イオン、３．９硫酸イオン、３７．３リン酸イオンであった。２０００ｍｌの初期廃液から１６００ｍｌの水を蒸発させた。以後、５０％水酸化ナトリウム水溶液（４７．０ｍｌ）をｐＨが９．０４に達するまで添加し、２００ｍｌのメタノールを添加した。本溶液のリン酸イオン濃度は１１５．２ｇ／Ｌであった。冷却は１５℃まで行い、リン酸水素二ナトリウム７水和物が得られた。スラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
最終的な生産物の重量は１８２．０gであった。最終的な生産品のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１２２．９ナトリウムイオン、３８．９アンモニウムイオン、１５．９塩素イオン、２．４硫酸イオン、３２８．２リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は４６．６ｗｔ％であった。総リン酸回収率は８０．２ｗｔ％であった。
これにより、ｐＨ調整段階、またはｐＨ調整後にメタノールを添加すると、リン酸回収率が増加することが分かった。
実施例５．２段階結晶化によるリン酸の回収
特許文献１に基づいて、Ｏ−ホスホセリン発酵及びＬ−システイン酵素転換反応を行った。この工程の後、工程廃液のイオン組成（ｇ／Ｌ）は、２１．７ナトリウムイオン、４．４アンモニウムイオン、１６．０塩素イオン、３０．１硫酸イオン、３０．３リン酸イオンであった。２０Ｌの初期廃液から１６．７Ｌの水を蒸発させ、５０％水酸化ナトリウム水溶液（０．４Ｌ）をｐＨが９．００に達するまで添加した。本溶液のリン酸イオンの濃度は１６２．１ｇ／Ｌであった。冷却は１５℃まで行い、リン酸水素二ナトリウム７水和物が得られた。リン酸水素二ナトリウム７水和物のスラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。回収されたリン酸水素二ナトリウム７水和物の重量は１３３９．０gであった。当該物質のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１３３．５ナトリウムイオン、１８．７アンモニウムイオン、５．３塩素イオン、１．３硫酸イオン、３２３．４リン酸イオンであった。最終的な生産品の水分含量は４８．２ｗｔ％であった。
スラリーろ過後、ろ過液のイオン組成（ｇ／Ｌ）は、１３．３ナトリウムイオン、６．８アンモニウムイオン、９８．９塩素イオン、１６．８硫酸イオン、４０．２リン酸イオンであった。残ったろ過液３．２Ｌにリン酸水素二ナトリウム１２水和物（実施例１−３で製造された試料）１．１ｇを添加して、１５℃で４時間撹拌した。リン酸水素二ナトリウム１２水和物のスラリーは、遠心バスケットフィルターでろ過され、純水で洗浄を行った。
回収されたリン酸水素二ナトリウム１２水和物の重量は２９９．０gであった。当該物質のイオン組成（ｇ／ｋｇ）は、１２８．２ナトリウムイオン、６．１塩素イオン、３．８硫酸イオン、２３９．５リン酸イオンであった。水分含量は６１．３ｗｔ％であった。前記２段階工程の最終的なリン酸回収率は８３．２ｗｔ％であった。回収されたリン酸水素二ナトリウム７水和物と１２水和物を混合した後、Ｏ−ホスホセリン発酵の前駆体として再使用したとき、何の問題もなく、発酵工程が行われた。
実施例６．回収したリン酸水素二ナトリウムを用いたＯ−ホスホセリンの製造
特許文献１０のＫＣＣＭ １１１０３Ｐ菌株を用いて５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＹＥ寒天培地プレート（２ｇ／Ｌのグルコース、２ｍＭの硫酸マグネシウム、０．１ｍＭの塩化カルシウム、６ｇ／Ｌのピロリン酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと本願で回収したリン酸水素二ナトリウム３ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１８ｇ／Ｌの寒天）上で３３℃、２４時間培養し、プレート上の１／１０の細胞を１つのプレートから掻き出しバッフル（baffle）フラスコ中に５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有した５０ｍｌのフラスコシード培地（１０ｇ／Ｌのクルコース、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、３ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、０．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１．５ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、1２．８ｇ／Ｌのピロリン酸ナトリウム、１ｇ／Ｌのグリシン）に接種させ、３０℃で２００ｒｐｍで６時間シード培養した。
シード培養が完了した後、本培養培地容積の１６％に相応する容積のシード培養培地を３００ｍｌの本培養培地で満たされた１Ｌの小型発酵槽に接種し、培養を３３℃、ｐＨ７．０で行った。培養物を培養の間にアンモニア水を添加してｐＨ７．０に調整した。培地中のグルコースが枯渇した後、５２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液及び前記本願で回収したリン酸水素二ナトリウム３００ｇ／Ｌを添加して、流加培養を行った。８０時間の培養後、ＨＰＬＣで確認した結果、２９．３ｇ／ＬのＯ−ホスホセリンが測定された。
比較例．純粋なリン酸を用いたＯ−ホスホセリンの製造
ＫＣＣＭ１１１０３Ｐ菌株を、前記実施例６と同様の方法でシード培地と本培地で培養して、グルコースが枯渇した後、５２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液及び純粋なリン酸２００ｇ／Ｌを添加して、流加培養を行った。８０時間の培養後、ＨＰＬＣで確認した結果、２９. ５ｇ／ＬのＯ−ホスホセリンが測定された。
これにより、本願のリン酸を発酵培地から回収及び再使用する方法は、発酵液または発酵廃液からリン酸塩を結晶化して回収することができ、回収されたリン酸塩を発酵に再使用する場合、純粋なリン酸を用いた場合と同様の量の発酵生成物を得ることができることを確認したところ、本願の方法は発酵工程に非常に有用に利用することができる。
以上の説明から、本願が属する技術分野の当業者は、本願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (19)

  1. （ａ）リン酸を含有する発酵液または発酵廃液を濃縮する段階（濃縮段階）；
    （ｂ）前記濃縮された濃縮液のｐＨを８〜１１に調整する段階（ｐＨ調整段階）；
    （ｃ）前記ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を結晶化して親液と分離する段階（結晶化段階）；及び
    （ｄ）前記結晶化されたリン酸塩を発酵培地でリン酸供給源として用いる段階（再使用段階）
    を含む、リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法。
  2. （ａ）リン酸を含有する発酵培地で、微生物を用いてＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）を生産する段階（ＯＰＳ発酵段階）；
    （ｂ）Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、ＯＰＳＳ）、またはこれを発現する微生物の存在下で、前記（ａ）段階で生産されたＯ−ホスホセリンを硫化物と反応させてシステインまたはその誘導体の発酵液を製造する段階（転換段階）；
    （ｃ）前記発酵液；または前記発酵液からシステインまたはその誘導体を除去した発酵廃液を濃縮する段階（濃縮段階）；
    （ｄ）前記濃縮された濃縮液のｐＨを８〜１１に調整する段階（ｐＨ調整段階）；
    （ｅ）前記ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を結晶化して親液と分離する段階（結晶化段階）；及び
    （ｆ）前記結晶化されたリン酸塩を発酵培地でリン酸供給源として用いる段階（再使用段階）
    を含む、リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法。
  3. （ａ）リン酸を含有する発酵培地で、微生物を用いてＯ−ホスホホモセリン（O-phosphohomoserine、ＯＰＨＳ）を生産する段階（ＯＰＨＳ発酵段階）；
    （ｂ）Ｏ−ホスホホモセリン依存性メチオニン合成酵素（O-phosphohomoserine dependent methionine synthase）またはこれを発現する微生物の存在下で、前記（ａ）段階で生産されたＯ−ホスホホモセリンを硫化物と反応させてメチオニンまたはその誘導体の発酵液を製造する段階（転換段階）；
    （ｃ）前記発酵液；または前記発酵液からメチオニンまたはその誘導体を除去した発酵廃液を濃縮する段階（濃縮段階）；
    （ｄ）前記濃縮された濃縮液のｐＨを８〜１１に調整する段階（ｐＨ調整段階）；
    （ｅ）前記ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を結晶化して親液と分離する段階（結晶化段階）；及び
    （ｆ）前記結晶化されたリン酸塩を発酵培地でリン酸供給源として用いる段階（再使用段階）
    を含む、リン酸を発酵液または発酵廃液から回収及び再使用する方法。
  4. （ａ）リン酸を含有する発酵廃液を濃縮する段階（濃縮段階）；
    （ｂ）前記濃縮された濃縮液をｐＨ ８〜１１に調整する段階（ｐＨ調整段階）；
    （ｃ）前記ｐＨが調整された濃縮液からリン酸塩を結晶化する段階（結晶化段階）；及び
    （ｄ）前記結晶化されたリン酸塩を親液から分離する段階（分離段階）
    を含む、リン酸を回収する方法。
  5. 前記発酵液が、（ｉ）Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、ＯＰＳ）発酵液、（ｉｉ）Ｏ−ホスホホモセリン（O-phosphohomoserine、ＯＰＨＳ）発酵液、または（ｉｉｉ）前記発酵液をベースに、転換酵素またはそれを発現する微生物；及び硫化物を添加して製造したアミノ酸またはその誘導体を含む発酵液であり、
    前記発酵廃液は発酵液からアミノ酸またはその誘導体が除去された廃液である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記硫化物が、ＣＨ３ＳＨ、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、（ＮＨ４）２Ｓ、Ｈ２Ｓ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３からなる群から選択される１つ以上である、請求項２または３に記載の方法。
  7. 前記発酵廃液が、発酵液からアミノ酸またはその誘導体が除去された廃液である、請求項１または４に記載の方法。
  8. 前記ｐＨ調整段階が、濃縮液に水酸化物を添加して行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化ナトリウム水溶液である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ｐＨ調整段階と結晶化段階の間、または結晶化段階で、前記ｐＨが調整された濃縮液を冷却する段階をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ｐＨ調整段階と結晶化段階の間、または結晶化段階で、リン酸塩結晶を結晶核として添加する段階をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記リン酸塩が、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム及びこれらの水和物からなる群から選択される１つ以上を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記水和物が、リン酸水素二ナトリウム７水和物またはリン酸水素二ナトリウム１２水和物である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記親液からリン酸塩を結晶化する段階（２次結晶化段階）をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記２次結晶化段階が、（ｉ）親液を濃縮する段階（再濃縮段階）、（ｉｉ）前記親液のｐＨを８〜１１に調整する段階（ｐＨ再調整段階）、及び（ｉｉｉ）前記ｐＨが調整された親液からリン酸塩を結晶化して分離する段階（再結晶化段階）を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ｐＨ再調整段階と再結晶化段階の間、または再結晶化の段階で、親液にリン酸塩結晶を結晶核として添加する段階をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記濃縮段階の前に、発酵液または発酵廃液をｐＨ８〜１１に調整する段階をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ｐＨ調整段階；またはｐＨ調整段階と結晶化段階の間に、アルコールを添加する段階をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールまたはそれらの組み合わせであるものである、請求項１８に記載の方法。
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