WO2015122528A1 - 細胞培養装置 - Google Patents

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WO2015122528A1
WO2015122528A1 PCT/JP2015/054222 JP2015054222W WO2015122528A1 WO 2015122528 A1 WO2015122528 A1 WO 2015122528A1 JP 2015054222 W JP2015054222 W JP 2015054222W WO 2015122528 A1 WO2015122528 A1 WO 2015122528A1
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WO
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shaft member
culture
filter
opening
cell culture
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/054222
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English (en)
French (fr)
Inventor
佳奈子 小西
潮 岩元
昌憲 和田
勝久 松浦
清水　達也
岡野　光夫
Original Assignee
旭化成株式会社
エイブル株式会社
学校法人東京女子医科大学
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Publication date
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    • C12M23/08—Flask, bottle or test tube
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture apparatus.
  • the cell culture device described in Patent Document 1 has a disk-like body having at least a part of a filter region that allows a culture solution to pass therethrough but does not allow cells to pass therethrough.
  • This disc-like body has a conduit for taking out the culture solution to the outside, and is provided so as to be rotatable coaxially with the conduit.
  • Examples of cells cultured in the cell culture device include human iPS (induced pluripotent stem) cells.
  • Human iPS cells have the property of being easily killed when the cells are brought into a single cell state or exposed to high shear stress. For this reason, when culturing human iPS cells, the cell culture apparatus should minimize shear stress on the cells as much as possible.
  • a filter for sucking a culture solution is attached to a disc-like body as stirring means.
  • the conventional apparatus is effective in reducing the stress on the cells because there is no obstacle that disturbs the liquid flow as compared with a configuration in which a facility for suctioning the culture medium is separately provided.
  • the suction mechanism and the stirring mechanism rotate at the same time, a structure for ensuring the sealing performance in the rotation mechanism is required, and there is a problem that the structure becomes complicated.
  • a cell culture device includes a culture tank that contains a culture solution containing cells, a shaft member that is at least partially disposed in the culture tank, and a shaft member that is supported by the shaft member and disposed in the culture tank. And a stirring means having a stirring blade that is rotatably provided with the shaft member as a rotation center, and a filter that is provided in contact with the shaft member and that allows the culture medium to permeate but does not allow cells to permeate. Is at least partly hollow, and is provided with an opening for introducing or leading out the culture medium from the inside, and is not rotatable, and the filter has the shaft member as the center of rotation.
  • a filter is provided on a shaft member that is not rotatable.
  • the stirring blade of the stirring means is provided to be rotatable about a shaft member as a rotation center.
  • the stirring blade rotates with respect to the shaft member, and the shaft member and the filter do not rotate. Therefore, in the cell culture device, since the mechanism for sucking and / or supplying the culture solution is not rotated, the configuration can be simplified.
  • the filter that sucks the culture solution from the culture tank and / or supplies the culture solution to the culture tank is positioned inside the movable region of the stirring blade in the shaft member that is the rotation center of the stirring blade.
  • the culture medium is sucked from the culture tank and / or the culture liquid is supplied to the culture tank through the inside of the filter and the shaft member. Therefore, in the cell culture device, the filter is prevented from being disturbed by the liquid flow (laminar flow) generated by the rotation of the stirring blade, and the stress on the cells is reduced with respect to the suction and / or supply of the culture liquid. Can be planned. Therefore, in the cell culture device, cells can be cultured well while realizing a simple configuration.
  • the shaft member may be supported on the bottom of the culture tank.
  • the shaft member has an opening at the lower end and the upper end is closed, and a side surface of the shaft member is provided with an opening communicating with the inside.
  • the filter may be provided on the outer surface of the shaft member so as to cover the opening of the side surface.
  • the filter has a cylindrical shape and may be inserted outside the shaft member so as to cover the opening of the side surface. According to this configuration, the cell culture device can secure the surface area (membrane area) of the filter.
  • the shaft member has a cylindrical shape in which an opening is provided at the lower end and an opening that communicates with the inside is provided at the upper end, and the filter has an opening at the upper end.
  • the shaft member may be provided so as to cover the part.
  • the filter has a bottomed cylindrical shape, and may be inserted outside the shaft member so as to cover the opening at the upper end. According to this configuration, the cell culture device can secure the surface area (membrane area) of the filter.
  • the shaft member may be supported by the lid of the culture tank.
  • the shaft member has a cylindrical shape in which an opening is provided at the upper end and an opening that communicates with the inside is provided at the lower end, and the filter has an opening at the lower end.
  • the shaft member may be provided so as to cover the part.
  • the filter has a bottomed cylindrical shape, and may be inserted outside the shaft member so as to cover the opening at the lower end. According to this configuration, the cell culture device can secure the surface area (membrane area) of the filter.
  • the shaft member has an opening at the upper end and the lower end is closed, and the side of the shaft member is provided with an opening communicating with the inside.
  • the filter may be provided on the outer surface of the shaft member so as to cover the opening of the side surface.
  • the filter has a cylindrical shape and may be inserted outside the shaft member so as to cover the opening of the side surface. According to this configuration, the cell culture device can secure the surface area (membrane area) of the filter.
  • the filter may be a porous body.
  • cells can be cultured well while realizing a simple configuration.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a cell culture system including the cell culture apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a perspective view showing the cell culture device.
  • FIG. 3 is a side view of the culture tank shown in FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing a cross-sectional configuration along the line IV-IV in FIG.
  • FIG. 5 is a side view showing a usage state of the cell culture device.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a modification of the cell culture device of the first embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram showing another embodiment of a cell culture system provided with a cell culture device.
  • FIG. 8 is a diagram showing another embodiment of a cell culture system provided with a cell culture device.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a cell culture system including the cell culture apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a perspective view showing the cell culture device.
  • FIG. 3 is a side view of the culture tank shown in FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing
  • FIG. 9 is a diagram showing a cross-sectional configuration of the cell culture device according to the second embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating a modification of the cell culture device of the second embodiment.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating a modification of the cell culture device according to the second embodiment.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating a modification of the cell culture device according to the second embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating a modification of the cell culture device according to the second embodiment.
  • FIG. 14 is a diagram showing a modification of the cell culture device of the second embodiment.
  • FIG. 15 is a diagram illustrating the cell culture device according to the first embodiment.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating the cell culture device according to the second embodiment.
  • FIG. 17 is a diagram showing a cell culture device according to Comparative Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a cell culture system including the cell culture apparatus according to the first embodiment.
  • the cell is a useful cell such as a mammalian cell.
  • a cell if a cell product is used as a result of culture, a cell that easily produces the substance or a cell into which a specific gene has been introduced can be selected so as to easily produce the target substance.
  • a cell if a specific cell is used as a result of culture, a cell in which a gene is modified so that the cell can be easily proliferated can be used.
  • the cells mature cells and undifferentiated cells can be used without any restriction on the maturity. Therefore, cells collected by enzyme treatment from biological tissues, blood-derived cells, mesenchymal stem cells, ES (Embryonic stem) cells, iPS (induced pluripotent stem) cells, and cells induced to differentiate from these cells Etc. are exemplified. Moreover, it is not limited to an adhesion cell and a floating cell, and the method of culture
  • the suspension culture includes suspension culture of a single cell, suspension culture of a cell condensate, suspension culture with cells supported on a microcarrier, and the like. Furthermore, the cell is not limited to a single type of cell. It can also be used to mix and co-cultivate other cells that produce substances in which the target cells are easy to grow.
  • the cell culture system 1 includes a component adjustment liquid tank 3, a cell culture device 5, and a liquid feeding circuit 7.
  • the component adjustment liquid tank 3 and the cell culture device 5 are connected by a liquid feeding circuit 7.
  • the liquid feeding circuit 7 feeds a culture liquid described later between the component adjustment liquid tank 3 and the cell culture device 5.
  • the liquid feeding circuit 7 includes two tubes 8 and 9 and liquid feeding pumps 10 and 11.
  • the tubes 8 and 9 have a hollow structure, and can send the culture solution aseptically.
  • the tubes 8 and 9 are made of a material such as silicon, urethane, fluororesin, or polyvinyl chloride, for example.
  • the liquid feeding pumps 10 and 11 are provided on the liquid feeding paths of the tubes 8 and 9, respectively, and are pumps capable of continuously feeding the culture solution.
  • the liquid feed pumps 10 and 11 may be general pumps, and examples thereof include a peristaltic pump and a diaphragm pump.
  • the liquid feeding circuit 7 feeds the culture liquid via the tubes 8 and 9 between the component adjustment liquid tank 3 and the cell culture device 5 by driving the liquid feeding pumps 10 and 11.
  • the culture fluid component adjustment film 13 is provided on the tubes 8 and 9 of the liquid feeding circuit 7. Specifically, the culture solution component adjustment film 13 is connected to one end portion of the tube 8 and one end portion of the tube 9, and is disposed in the component adjustment solution tank 3.
  • the culture fluid component adjustment membrane 13 is a semipermeable membrane in which the membrane permeability of the culture fluid component depends on its molecular weight.
  • the pore diameter of the culture solution component adjustment membrane 13 is designed according to the molecular weight of the component to be retained in the cell culture device 5. That is, the culture fluid component adjustment membrane 13 is selected so that the minimum molecular weight substance does not permeate the membrane among the components to be held in the cell culture device 5.
  • a flat membrane shape or a hollow fiber shape can be used, but for the purpose of conveying the culture solution, a hollow fiber shape is preferable. In order to efficiently adjust the components, it is more preferable to use a plurality of hollow fibers in a bundle.
  • a hollow fiber-shaped culture solution component adjustment membrane 13 is illustrated.
  • the material of the culture fluid component adjustment film 13 is not particularly limited, but is preferably a material that does not adsorb, decompose, or the like the component that is desired to be retained in the cell culture device 5.
  • the material of the culture fluid component adjustment film 13 has the characteristic of easily adsorbing the above components, the surface is modified by coating them with another material or using a surface modifier. Thus, it is possible to suppress the adsorption of components.
  • the component adjustment liquid tank 3 is a tank for storing the component adjustment liquid.
  • the component adjustment liquid tank 3 is formed of a material that is inert to the component adjustment liquid component, has no cytotoxicity, and is resistant to sterilization (including decontamination, sterilization, or sterilization) processing.
  • sterilization including decontamination, sterilization, or sterilization
  • glass, synthetic resin, stainless steel and the like can be mentioned.
  • the internal volume and shape of the component adjustment liquid tank 3 are appropriately determined according to the amount of the component adjustment liquid.
  • the component adjustment liquid tank 3 is made of glass, for example, and has a bottomed cylindrical shape.
  • the component adjustment liquid tank 3 is provided with a lid portion 3c that closes an opening (not shown) provided in the upper portion.
  • the component adjustment liquid accommodated in the component adjustment liquid tank 3 is a solution having at least one of the components that can substantially permeate the culture solution component adjustment film 13.
  • the components contained in each of the culture solution and the component adjustment solution are adjusted via the membrane by the molecular weight and the concentration difference between the two solutions.
  • the component whose molecular weight is larger than the pore size of the culture solution component adjustment membrane 13 and cannot substantially permeate the membrane does not move between the two solutions.
  • the concentration of the component whose molecular weight is smaller than the pore size of the culture solution component adjustment membrane 13 and can substantially permeate the membrane is adjusted between the two solutions so that the concentration difference is reduced. Metabolites produced by the cells and accumulated in the culture solution move to the component adjustment solution side to reduce the concentration in the culture solution. At the same time, components that are necessary for cell growth and have a reduced concentration during the culture period are transferred from the component adjustment solution to the culture solution and supplemented.
  • a component adjustment liquid has all the components lost from a culture solution during a cell culture period. More preferably, the concentration of these components is set so that they are not depleted during the culture period.
  • the component adjustment liquid may be designed so as to have a buffering capacity so as to easily maintain a physiological pH, or a pH indicator dye may be mixed so that a change in pH can be easily distinguished by color.
  • a stirring rotor 4 is provided inside the component adjustment liquid tank 3.
  • the stirring rotor 4 is a member that stirs the component adjustment liquid in the component adjustment liquid tank 3, and is driven by a driving source (not shown) disposed at the lower part of the component adjustment liquid tank 3.
  • the drive source is for rotating a magnetic body, for example.
  • the stirring rotor 4 rotates in accordance with the rotational drive of the magnetic body, and stirs the component adjustment liquid.
  • the lid portion 3c of the component adjustment liquid tank 3 may be provided with an air supply / exhaust port 6 and a sampling port (not shown) for sampling the component adjustment liquid.
  • the cell culture device 5 is a device for culturing cells.
  • FIG. 2 is a perspective view showing the cell culture device.
  • FIG. 3 is a side view of the cell culture device.
  • FIG. 4 is a diagram showing a cross-sectional configuration along the line IV-IV in FIG.
  • the cell culture device 5 includes a culture tank 15, a shaft member 17, a stirring mechanism (stirring means) 19, and a filter 21.
  • the culture tank 15 stores (stores) a culture solution in which cells are cultured.
  • the culture solution is a solution having at least various cells and the like, solution components capable of growing the cells, and the environment.
  • the composition and concentration of the culture solution are designed according to the nature of the cells.
  • the culture solution may be designed to have a buffer capacity so that a physiological pH can be easily maintained, or a pH indicator dye may be mixed so that a change in pH can be easily distinguished by color.
  • various commercially available culture solutions may be used as they are, and additional components may be added to them depending on the properties of the target cells.
  • the culture tank 15 is preferably formed of a material that is inert to the culture solution components, has no cytotoxicity, and is resistant to sterilization treatment, such as glass, synthetic resin, stainless steel, and the like. Is mentioned.
  • the content and shape of the culture tank 15 are appropriately determined according to the amount of the culture solution.
  • the culture tank 15 is made of glass, for example, and has a bottomed cylindrical shape.
  • the culture tank 15 has an extraction part 16 for extracting a culture solution containing cells and the like.
  • the extraction part 16 is provided in the side part 15a (refer FIG. 4) of the culture tank 15, and is a cylindrical body extended diagonally upward.
  • a lid portion 16 c is attached to the extraction portion 16.
  • the culture tank 15 is provided with a lid 15c that closes an opening 15o provided at the top.
  • the lid 15c is provided with an air supply / exhaust port 12, a culture solution supply unit for supplying the culture solution to the culture tank 15, an insertion port for a pH sensor, and the like.
  • the other end of the tube 9 is connected to the upper end of the culture solution supply unit.
  • the shaft member 17 is a linear member and has a hollow structure.
  • the shaft member 17 is preferably a material that is inert to the culture fluid components, has no cytotoxicity, and is resistant to sterilization treatment. Examples thereof include synthetic resins and stainless steel.
  • the shaft member 17 has openings 17a and 17b at both ends.
  • One end of the shaft member 17 is disposed in the culture tank 15. Specifically, the shaft member 17 is fixed to the shaft support portion 23.
  • the shaft support portion 23 is provided on the lid portion 15c.
  • the shaft support portion 23 is disposed substantially at the center of the lid portion 15c and is erected on the lid portion 15c.
  • the shaft support portion 23 has a hollow structure, and the shaft member 17 is inserted therein to hold the shaft member 17 so as not to rotate.
  • the other end portion of the shaft member 17 protrudes from the upper end surface of the shaft support portion 23.
  • the other end of the tube 8 is connected to the upper end of the shaft member 17. Thereby, the inside of the shaft member 17 communicates with the tube 8.
  • the stirring mechanism 19 includes a mounting portion 25 and a stirring blade 27.
  • the attachment portion 25 is rotatably attached to the shaft member 17.
  • the attachment portion 25 is inserted through the shaft member 17 and is rotatably supported at a predetermined height position of the shaft member 17.
  • the stirring blade 27 stirs the culture solution.
  • the stirring blade 27 is rotatably provided with the shaft member 17 as a rotation center.
  • the attachment portion 25 is connected to the upper end portion of the stirring blade 27, and the attachment portion 25 is rotatable to the shaft member 17, so that the stirring blade 27 rotates about the shaft member 17.
  • the stirring blade 27 is preferably formed of a plate material that is inactive and resistant to the culture solution, and examples thereof include a thin plate-like synthetic resin, stainless steel (for example, SUS316 having a thickness of 1 mm), and the like.
  • the number of the stirring blades 27 is set by the number of rotations of the stirring mechanism 19, but it is preferable to equip the shaft member 17 at equal intervals from the viewpoint of balance during stirring, and for example, 2 to 4 blades are preferable. In the present embodiment, a configuration with two stirring blades 27 is illustrated.
  • the stirring blade 27 is formed so that a gap with the inner surface of the bottom 15b (see FIG. 4) of the culture tank 15 is small. Therefore, the stirring blade 27 follows the inner surface of the bottom portion 15b when the stirring mechanism 19 rotates. Thereby, the culture solution in the vicinity of the inner surface of the bottom portion 15b is agitated to continuously float cells and cell aggregates in the culture solution, so that precipitation on the inner surface of the bottom portion 15b can be prevented. Further, the stirring blade 27 is formed so that a gap between the inner surface of the side surface portion 15a of the culture tank 15 is small. Therefore, the stirring blade 27 follows the inner surface of the side surface portion 15a when the stirring mechanism 19 rotates. Thereby, the culture solution in the vicinity of the inner surface of the side surface portion 15a can be agitated to form a uniform laminar flow, and cell aggregates and the like having an increased specific gravity with cell proliferation can be prevented from being precipitated.
  • the magnetic stirring member 27 is provided with a magnetic body 30.
  • the magnetic body 30 is disposed at the lower end of the stirring blade 27.
  • the magnetic body 30 is a permanent magnet or the like covered with tetrafluoroethylene or the like.
  • the magnetic body 30 is fixed to a portion that is bent so as to surround the magnetic body 30 at the lower end of the stirring blade 27.
  • the stirring blade 27 rotates by driving the magnetic body 30.
  • a drive motor 34 that rotates a pair of magnetic bodies 32 through a support 33 is disposed below the culture tank 15, and faces the magnetic body 30. With the rotation of the magnetic body 32 arranged, the stirring blade 27 rotates.
  • the shaft of the drive motor 34 is disposed so as to be coaxial with the shaft member 17.
  • the filter 21 is a part in contact with the culture solution, and allows the culture solution to permeate, but does not allow the cells and cell aggregates in the culture solution to permeate.
  • the filter 21 only needs to be capable of separating cells and the culture medium, and the material, shape, number, and the like are not particularly limited and may be appropriately set according to the design.
  • the filter 21 is a porous body. Preferably, it is a sintered body and has a cylindrical shape.
  • the material of the filter 21 include metal, ceramic, glass, resin, fiber, and the like, and preferably a fluororesin and a polyolefin resin.
  • the filter 21 is preferably made of a material that permeates water to some extent, does not adsorb the cells themselves or the microcarriers, and does not decompose or adsorb components that are desired to be retained in the cell culture apparatus 5. If it has the characteristics, it can be made hydrophilic by coating with another material or by using a surface modifier, and the above adsorption and decomposition can be prevented.
  • the filter 21 is provided in contact with the shaft member 17. Specifically, the filter 21 has a bottomed cylindrical shape, and the lower end portion of the shaft member 17 is inserted therein. Accordingly, the filter 21 extends coaxially with the shaft member 17 and is positioned between the stirring blades 27 of the stirring mechanism 19.
  • the filter 21 is located inside the movable region of the stirring blade 27 that rotates about the shaft member 17 as a rotation center, and is provided on the shaft member 17 independently of the stirring blade 27.
  • the culture solution that has passed through the filter 21 is led into the shaft member 17.
  • the culture solution sucked through the filter 21 is introduced into the inside through the opening 17 b of the shaft member 17, led out from the opening 17 a, and led out to the tube 8. Then, the culture solution is sent to the culture solution component adjustment film 13 in the component adjustment solution tank 3 through the tube 8 and returned to the culture vessel 15 through the tube 9.
  • the filter 21 is provided on the shaft member 17 that cannot be rotated.
  • the stirring blade 27 of the stirring mechanism 19 is provided to be rotatable about the shaft member 17 as a rotation center.
  • the stirring blade 27 rotates with respect to the shaft member 17, and the shaft member 17 and the filter 21 do not rotate. Therefore, in the cell culture apparatus 5, since the mechanism for sucking the culture solution is not rotated, the configuration can be simplified.
  • the filter 21 that sucks the culture solution from the culture tank 15 is provided on the shaft member 17 that is the rotation center of the stirring blade 27 so as to be located inside the movable region of the stirring blade 27.
  • the cell culture device 5 can favorably culture cells while realizing a simple configuration.
  • the shaft member 17 is supported by the shaft support portion 23 provided in the lid portion 15c, and the lower end portion of the shaft member 17 is inserted into the filter 21.
  • the device since the mechanism for sucking the culture solution is concentrated on the shaft member 17, and the shaft member 17 does not rotate, the device can be simplified.
  • the filter 21 since the filter 21 has a columnar shape, a film area can be secured in the filter 21. Therefore, the filter 21 can stably suction the culture solution.
  • the structure of the cell culture apparatus 5 which concerns on 1st Embodiment should just be a structure by which a shaft member is supported by the cover part 15c of the culture tank 15, and the structure of a shaft member, a filter, and a stirring mechanism is another form. There may be.
  • FIG. 6 is a diagram showing a modification of the cell culture device according to the first embodiment.
  • the filter 21A may be inserted through the shaft member 17A.
  • the shaft member 17A has a hollow structure, has an opening 17Aa at the upper end, and is closed at the lower end.
  • An opening 17h that communicates the inside and the outside is provided on the side surface of the shaft member 17A.
  • only one opening 17h is shown, but the number, size, and shape of the opening 17h may be appropriately set according to the design.
  • the filter 21A has a cylindrical shape.
  • the filter 21A is inserted through the shaft member 17A, and is provided on the outer surface (outside) of the shaft member 17A so as to cover the opening 17h of the shaft member 17A. Thereby, the culture solution is sucked from the culture tank 15 through the inside of the filter 21A and the shaft member 17A.
  • the filter 21 may have a shape other than the cylindrical shape. As shown in FIG. 6B, the lower end of the filter 21B may have a truncated cone shape. Further, the filter 21 may have a prismatic shape or a triangular prism shape. The filter 21 may have an uneven surface shape in order to ensure a surface area.
  • the filter 21 may be in contact with the bottom 15b of the culture tank 15.
  • the vicinity of the center of the bottom is occupied by the filter 21. Thereby, there is no room for stagnation of the liquid flow in the vicinity of the bottom center due to the rotation of the culture solution, and precipitation near the bottom center of cell aggregates and the like whose specific gravity increases with cell proliferation can be prevented.
  • the cell culture system 1A includes a cell culture device 5, a culture solution tank 3A, and a waste tank 3B.
  • the culture solution tank 3A and the cell culture device 5 are connected by a tube 8 provided with a liquid feed pump 10.
  • the cell culture device 5 and the disposal tank 3B are connected by a tube 9 provided with a liquid feed pump 11.
  • the culture solution is supplied from the culture solution tank 3A to the cell culture device 5, and the culture solution containing metabolites and the like is supplied from the cell culture device 5 to the waste tank 3B.
  • the cell culture system 1B includes a cell culture device 5, a culture solution tank 3A, and a waste tank 3B.
  • the culture solution tank 3A, the waste tank 3B, and the cell culture device 5 are connected by a liquid supply circuit 7A.
  • a three-way cock 14 is provided on the tube 8A.
  • the cell culture device 5 is supplied with the culture solution from the culture solution tank 3A via the three-way stopcock 14, and from the cell culture device 5 the culture solution containing metabolites and the like is supplied to the waste tank 3B via the three-way stopcock 14. Supplied.
  • the flow path of the three-way stopcock 14 is switched according to the supply of the culture solution to the cell culture device 5 and the suction of the culture solution from the cell culture device 5. That is, the three-way stopcock 14 establishes a flow path between the culture solution tank 3A and the cell culture device 5 when the culture solution is supplied from the culture solution tank 3A, and the culture solution is supplied to the waste tank 3B. In the case of performing, the flow path between the cell culture device 5 and the waste tank 3B is established. In the cell culture device 5, the filter 21 sucks the culture solution from the culture vessel 15 and supplies the culture solution to the culture vessel 15 in the filter 21.
  • FIG. 9 is a diagram showing a cross-sectional configuration of the cell culture device according to the second embodiment.
  • the cell culture device 40 includes a culture tank 42, a shaft member 44, a stirring mechanism 46, and a filter 48.
  • the culture tank 42 is preferably formed of a material that is inactive to the culture solution components, has no cytotoxicity, and is resistant to sterilization (including decontamination, sterilization, or aseptic) treatment. Examples thereof include glass, synthetic resin, and stainless steel.
  • the internal volume and shape of the culture tank 42 are appropriately determined according to the amount of the culture solution.
  • the culture tank 42 is made of, for example, a synthetic resin and has a bottomed cylindrical shape.
  • the culture tank 42 is provided with a lid 42c that closes an opening 42o provided in the upper part.
  • the lid part 42c is provided with an extraction part 43 for taking out a culture solution containing cells and the like, an air supply / exhaust port, a pH sensor 58, and the like.
  • the shaft member 44 is supported by the bottom 42a of the culture tank 42.
  • the shaft member 44 includes a conduit portion 44a and a support portion 44b.
  • the conduit portion 44a is a linear member and has a hollow structure.
  • the conduit portion 44a is preferably a material that is inert to the culture solution components, has no cytotoxicity, and is resistant to sterilization treatment. Examples thereof include synthetic resins and stainless steel.
  • the conduit portion 44 a is supported by the bottom portion 42 a of the culture tank 42. Specifically, the conduit portion 44a is inserted into and supported by a support base 42d provided on the bottom portion 42a.
  • the inside of the conduit portion 44a communicates with a suction port 42e provided on the bottom portion 42a of the culture tank 42.
  • An opening 44h that communicates the inside and the outside is provided in the side wall of the conduit portion 44a. Although only one opening 44h is shown in FIG. 9, the number, size, and shape of the opening 44h may be set as appropriate according to the design.
  • the support part 44b is provided in the upper part of the conduit part 44a.
  • the support portion 44b is disposed so as to close the opening at the upper end portion of the conduit portion 44a.
  • the support portion 44b extends coaxially with the conduit portion 44a.
  • the stirring mechanism 46 includes a mounting portion 50 and a stirring blade 52.
  • the attachment portion 50 is rotatably attached to the support portion 44b of the shaft member 44. Specifically, the attachment portion 50 has the upper end portion of the support portion 44b inserted therein.
  • the stirring blade 52 is provided to be rotatable about the shaft member 44 as a rotation center.
  • the mounting portion 50 is connected to the upper end portion of the stirring blade 52, and the mounting portion 50 is rotatable about the shaft member 44, so that the stirring blade 52 rotates about the shaft member 44 as a rotation center.
  • the stirring blade 52 is preferably formed of a plate material that is inert to the culture medium and has resistance, and examples thereof include a thin plate-shaped synthetic resin, stainless steel (for example, SUS316 having a thickness of 1 mm), and the like.
  • the number of the stirring blades 52 is set by the number of rotations of the stirring mechanism 46, but it is preferable to equip the shaft member 44 at equal intervals from the viewpoint of balance during stirring, and for example, 2 to 4 blades are preferable. In this embodiment, the structure with two stirring blades 52 is illustrated.
  • the stirring blade 52 is provided with a magnetic body 54.
  • the magnetic body 54 is disposed at the lower end of the stirring blade 52.
  • the magnetic body 54 is a permanent magnet or the like covered with tetrafluoroethylene or the like.
  • the magnetic body 54 is fixed to a portion that is bent so as to surround the magnetic body 54 at the lower end of the stirring blade 52.
  • the stirring blade 52 rotates by driving the magnetic body 54.
  • a drive motor 34 that rotationally drives a pair of magnetic bodies 32 via a support 33 is disposed below the culture tank 42 and faces the magnetic body 54. With the rotation of the magnetic body 32 arranged, the stirring blade 52 rotates.
  • the shaft of the drive motor 34 is arranged so as to be coaxial with the shaft member 44.
  • the filter 48 only needs to be capable of separating cells and the culture medium, and the material, shape, number, etc. are not particularly limited, and may be appropriately set according to the design.
  • the filter 48 is a porous body, Preferably, it is a sintered body and has a cylindrical shape.
  • the filter 48 is inserted into the conduit portion 44a of the shaft member 44, and is provided on the outer surface (outside) of the conduit portion 44a so as to cover the opening 44h of the conduit portion 44a. That is, the filter 48 is located inside the movable region of the stirring blade 52 that rotates about the shaft member 44 and is provided on the shaft member 44 independently of the stirring blade 52.
  • the culture solution is sucked from the culture tank 42 through the filter 48 and the inside of the conduit portion 44a.
  • the filter 48 is provided on the shaft member 44 that cannot be rotated.
  • the stirring blade 52 of the stirring mechanism 46 is provided to be rotatable about the shaft member 44 as a rotation center.
  • the stirring blade 52 rotates with respect to the shaft member 44, and the shaft member 44 and the filter 48 do not rotate. Therefore, in the cell culture device 40, since the mechanism for sucking the culture solution is not rotated, the configuration can be simplified.
  • a filter 48 that sucks the culture solution from the culture tank 42 is provided on the shaft member 44 that is the rotation center of the stirring blade 52 so as to be located inside the movable region of the stirring blade 52.
  • the culture solution is sucked from the culture tank 42 through the filter 48 and the shaft member 44. Therefore, in the cell culture device 40, the filter 48 is prevented from being disturbed by the liquid flow (laminar flow) generated by the rotation of the stirring blade 52, and the stress on the cells is reduced with respect to the suction of the culture liquid. be able to. Therefore, in the cell culture device 40, cell culture can be favorably performed while realizing a simple configuration.
  • the shaft member 44 is supported by the bottom 42 a of the culture tank 42, and the shaft member 44 is inserted into the filter 48.
  • the mechanism for sucking the culture solution is concentrated on the shaft member 44, and the shaft member 44 does not rotate, so that the device can be simplified.
  • the configuration of the cell culture device 40 according to the second embodiment may be any configuration as long as the shaft member is supported on the bottom 42a of the culture tank 42, and the configurations of the shaft member, the filter, and the stirring mechanism are other forms. May be.
  • FIG. 10 to FIG. 14 are diagrams showing modifications of the cell culture device of the second embodiment.
  • the shaft member 60 includes a conduit portion 60a and a support portion 60b.
  • the conduit portion 60a is a linear member and has a hollow structure.
  • the conduit portion 60 a is inserted into a support base 42 d provided on the bottom portion 42 a of the culture tank 42 and supported by the bottom portion 42 a of the culture tank 42.
  • An opening 60h is provided at the upper end of the conduit 60a.
  • the filter 62 is provided in the conduit portion 60a so as to cover the opening 60h of the conduit portion 60a.
  • the filter 62 has a bottomed cylindrical shape, and the upper end portion of the conduit portion 60a is inserted therein.
  • the conduit portion 60a is different in configuration from the conduit portion 44a of the above-described embodiment, and does not penetrate through the inside of the filter 62.
  • the support portion 60 b is provided at the upper end portion of the filter 62.
  • the support portion 60 b extends coaxially with the conduit portion 60 a and the filter 62.
  • the attaching part 50 of the stirring mechanism 46 is attached to the support part 60b.
  • the shaft member 70 is supported on the bottom 42 a of the culture tank 42.
  • An opening 70 h is provided at the upper end of the shaft member 70.
  • the filter 71 is provided on the shaft member 70 so as to cover the opening 70 h of the shaft member 70.
  • the filter 71 has a bottomed cylindrical shape, and the upper end portion of the shaft member 70 is inserted therein.
  • the stirring mechanism 72 includes a mounting portion 74 and a stirring blade 76.
  • the attachment portion 74 is rotatably attached to the shaft member 70.
  • the attachment portion 74 is attached to the shaft member 70 at a position below the lower end portion of the filter 71.
  • the lower end side of the stirring blade 76 is connected to the mounting portion 74 and is disposed with the filter 71 interposed therebetween.
  • the stirring blade 76 is provided with a magnetic body 78.
  • the magnetic body 78 is disposed at the lower end of the stirring blade 76.
  • the magnetic body 78 is a permanent magnet or the like covered with tetrafluoroethylene or the like.
  • the stirring blade 76 is rotated by driving the magnetic body 78.
  • a drive motor 34 that rotationally drives a pair of magnetic bodies 32 via a support 33 is disposed below the culture tank 42 and faces the magnetic body 78.
  • the stirring blade 76 rotates with the rotation of the magnetic body 32 arranged.
  • the shaft of the drive motor 34 is disposed so as to be coaxial with the shaft member 70.
  • the structure of the stirring blade 76 is not limited to the structure (shape) shown in FIG.
  • the shaft member 80 includes a conduit portion 80a and a sealing portion 80b.
  • the conduit portion 80a is a linear member and has a hollow structure.
  • the conduit portion 80 a is inserted into a support base 42 d provided on the bottom portion 42 a of the culture tank 42 and supported by the bottom portion 42 a of the culture tank 42.
  • Openings 81a and 81b that communicate the inside and the outside are provided in the side wall of the conduit portion 80a.
  • the openings 81a and 81b are spaced apart from each other in the longitudinal direction of the shaft member 80, and are disposed corresponding to positions of a first filter 82a and a second filter 82b, which will be described later.
  • each of the openings 81a and 81b is shown one by one, but the number, size, and shape of the openings 81a and 81b may be appropriately set according to the design.
  • the sealing portion 80b seals (closes) the opening provided at the upper end portion of the conduit portion 80a.
  • the filter 82 includes a first filter 82a and a second filter 82b. That is, the filter 82 is divided into two parts.
  • the first filter 82a and the second filter 82b have a cylindrical shape.
  • the 1st filter 82a is penetrated by the lower end part side of the conduit
  • the 2nd filter 82b is penetrated by the upper end part side of the conduit
  • the upper end portion of the first filter 82a and the lower end portion of the second filter 82b are separated from each other with a predetermined interval.
  • the attachment portion 74 is disposed between the first filter 82a and the second filter 82b, and is rotatably attached to the conduit portion 80a (shaft member 80).
  • the stirring blade 76 is connected to the mounting portion 74 and is disposed with the filter 82 interposed therebetween.
  • the inner side of the lower end part of the stirring blade 76 shown in FIG. 12 has a shape along the shape of the support base 42d.
  • the shaft member 90 is a linear member and has a hollow structure.
  • the shaft member 90 is inserted into a support base 42d provided on the bottom 42a of the culture tank 42 and supported by the bottom 42a of the culture tank 42.
  • the shaft member 90 is provided with an opening 90a at the upper end thereof, and an opening 90b that connects the inside and the outside is provided on the lower end of the side wall.
  • the filter 92 includes a first filter 92a and a second filter 92b.
  • the first filter 92a has a cylindrical shape.
  • the 1st filter 92a is penetrated by the lower end part side of the shaft member 90, and is provided in the outer surface (outer side) of the shaft member 90 so that the opening part 90b may be covered.
  • the second filter 92 b is provided on the shaft member 90 so as to cover the opening 90 a of the shaft member 90.
  • the second filter 92b has a bottomed cylindrical shape, and the upper end portion of the shaft member 90 is inserted therein.
  • the upper end of the first filter 92a and the lower end of the second filter 92b are spaced apart from each other by a predetermined distance.
  • one opening 90b is shown in FIG. 13, the number, size, and shape of the opening 90b may be set as appropriate according to the design.
  • the attachment portion 74 is disposed between the first filter 92a and the second filter 92b and is rotatably attached to the shaft member 90.
  • the stirring blade 76 is connected to the mounting portion 74 and is disposed with the filter 92 interposed therebetween.
  • the inner side of the lower end part of the stirring blade 76 shown in FIG. 13 has a shape along the shape of the support base 42d.
  • the shaft member 100 has a first conduit portion 110 and a second conduit portion 120.
  • pipe part 120 are linear members, and have a hollow structure.
  • the first conduit part 110 is inserted into a support base 42d provided on the bottom part 42a of the culture tank 42 and supported by the bottom part 42a of the culture tank 42.
  • An opening 110 a is provided at the upper end of the first conduit portion 110.
  • the second conduit 120 is provided with an opening 120a and an opening 120b at the lower end and the upper end, respectively.
  • the filter 130 includes a first filter 130a and a second filter 130b.
  • the first filter 130 a is provided in the first conduit portion 110 and the second conduit portion 120 so as to cover the opening portion 110 a of the first conduit portion 110 and the opening portion 120 a of the second conduit portion 120.
  • the first filter 130a has a cylindrical shape with insertion holes provided at both ends, and the upper end portion of the first conduit portion 110 and the lower end portion of the second conduit portion 120 serve as insertion holes.
  • the 2nd filter 130b is provided in the 2nd conduit
  • the second filter 130b has a bottomed cylindrical shape, and the upper end portion of the second conduit portion 120 is inserted therein.
  • the 1st filter 130a and the 2nd filter 130b are connected by the 2nd conduit
  • the attachment portion 74 is disposed between the first filter 130a and the second filter 130b, and is rotatably attached to the second conduit portion 120.
  • the stirring blade 76 is connected to the mounting portion 74 and is disposed with the filter 130 interposed therebetween.
  • the inner side of the lower end part of the stirring blade 76 shown in FIG. 14 is made into the shape along the shape of the support stand 42d.
  • the stirring blades 27, 52, and 76 have been described as an example, but the shape of the stirring blade is not limited thereto.
  • the shape of the stirring blade is preferably a configuration that can reduce the stress on the cells.
  • Example 1 Control device for cell culture system
  • an 8-linked animal culture apparatus BioJr. 8 BJR-25NA1S-8C, Able Co., Ltd.
  • This control device can control eight 100 mL capacity cell culture devices with one unit.
  • the measurement and control items were stirring speed, temperature, pH, and dissolved oxygen concentration (DO).
  • DO dissolved oxygen concentration
  • Human iPS cells (253G1) were used as cultured cells. The cells were seeded in a culture dish (Corning) coated with vitronectin (Life Technologies), and cultured using Essential-8 as a culture solution. The culture medium was changed every day, and subculture was performed once every 3 to 4 days.
  • Example 1 (Culture of human iPS cells)
  • the cell culture apparatus shown in FIG. 15 was produced.
  • a glass-made dedicated tank (Able Co., Ltd.) was used as the culture tank 15, and the culture solution was 100 mL.
  • the prepared human iPS cells were seeded at 2 ⁇ 10 7 cells (density 2 ⁇ 10 5 cells / mL), and culture was started. This time point was regarded as the 0th culture day.
  • As a culture solution the following components were added to Essential-8 medium (Life Technologies) and used.
  • Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added as a ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase) inhibitor at a concentration of 10 ⁇ M and heparin (Sigma Aldrich) at a concentration of 750 ng / mL. .
  • the culture vessel 15 was provided with a stirring blade 22 and the rotation speed was 60 rpm.
  • the culture tank 15 was provided with a sensor (Able Co., Ltd.) capable of measuring temperature, pH, and dissolved oxygen concentration.
  • the dissolved oxygen concentration was set to be controlled to 40%, and for this purpose, a gas introduction line was installed so that a mixed gas of oxygen, nitrogen, and air would be vented to the culture medium in the culture tank 15 . Furthermore, an outlet line for exhausting gas from the culture tank 15 was installed. The temperature was set at 37 ° C.
  • a stainless steel hollow pipe (outer diameter 3 mm, inner diameter 1.8 mm) was used.
  • a bottomed cylindrical filter made of a polyethylene sintered body having a diameter of 8 mm, a length of 15 mm, and an average pore diameter of 30 ⁇ m was used.
  • the shaft member 17 is fixed to the center of the lid portion of the culture tank 15, and the culture solution that has passed through the filter 21 can be taken out from the culture tank 15 through the hollow portion of the shaft member 17.
  • a mouth capable of returning the culture solution was provided in the culture tank 15.
  • the stirring blade 22 was installed so as to be rotatable around the shaft member 17.
  • the filter 21 was installed at a height at which the upper surface of the cylinder and the liquid level of the culture solution were close.
  • the component adjustment liquid tank used was a 1 L glass sterilization bottle. An aeration line, an inlet for the culture solution, and an outlet line were installed in the lid portion of the component adjustment solution tank. In the component adjustment liquid tank, urethane bonding is performed so that the hollow structure of both ends of the hollow fiber is released so that 400 hollow fibers of Asahi Polysulfone Dialyzer APS (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.) are bundled to have an effective length of 20 cm. What was fixed with the agent was installed as a culture solution component adjustment membrane. The hollow fiber bundle was disposed inside the component adjustment liquid tank, and both ends of the hollow fiber bundle were connected to the culture solution inlet and outlet lines by a circuit. As the component adjustment solution, 1 L of a solution obtained by adding Y-27632 and heparin to Essential-6 (Life Technologies) to the same concentration as the culture solution was used.
  • a silicon tube (inner diameter 1 mm ⁇ , outer diameter 4 mm ⁇ ) was used.
  • Two Perista Pumps RP-23 (Able Co., Ltd.) were used as the culture solution feeding pump. Two pumps were connected to each of the liquid feeding circuits that connect the culture tank 15 and the component adjustment liquid tank, and were installed in a state capable of liquid feeding.
  • bFGF (Life Technologies) is 10 ⁇ g / mL and heparin (Sigma Aldrich) is 250 ⁇ g / mL in a 10 mL syringe (Terumo Corporation). 2 mL was dissolved in the culture solution DMEM / F12 (Life Technologies).
  • the cell culture system shown in FIG. 1 was produced by the method described above. Using this system, a cell mass composed of iPS cells was produced by the following method.
  • Circulation of the culture broth by the feed pump was started from the first day of culture.
  • the circulation rate was 100 mL / day for the first day, 200 mL / day for the second day, 400 mL / day for the third day, and 600 mL / day for the fourth and subsequent days.
  • the flow rates of the two pumps were finely adjusted so that the liquid volume in the culture tank 15 could be maintained at substantially the same level, and the culture was performed while continuously perfusing the culture liquid up to the sixth day.
  • 1 mL of a mixed solution of bFGF and heparin was administered from a 10 mL syringe on the second and fourth days of culture.
  • the cell culture was terminated, and the number of cells and the undifferentiated rate were measured as follows.
  • Undifferentiation rate measurement In order to confirm that human iPS cells maintain an undifferentiated state, the positive rate of SSEA-4, which is an undifferentiated marker, was measured by a flow cytometry method. Anti-human / mouse SSEA-4 monoclonal antibody FAB1435F (R & D Systems) was used as the antibody, and Cell Lab QuantaSC (Beckman Coulter, Inc.) was used as the measurement apparatus. The positive rate of SSEA-4 was defined as the undifferentiated rate.
  • Example 2 In Example 2, as shown in FIG. 16, the filter 21 has the same structure as the cell culture apparatus of Example 1 except that the installation height of the filter 21 is set between the bottom surface of the culture tank 15 and the liquid level. did.
  • Example 1 In Comparative Example 1, as shown in FIG. 17, except that the installation of the filter 21 and the shaft member 17 is outside the rotation range of the stirring blade 22, and the inlet line and outlet line of the culture solution are changed, Example 1 The same structure as that of the cell culture apparatus.
  • Example 1 The culture results of Example 1, Example 2, and Comparative Example 1 are shown in Table 1 below.
  • Example 1 As shown in Table 1, in the cell culture device of Comparative Example 1, cell proliferation was not observed, whereas in the cell culture devices of Example 1 and Example 2, compared with the time of the start of culture. More than 20 times proliferation was realized. Moreover, in the cell culture apparatuses of Example 1 and Example 2, the ratio of SSEA-4 positive undifferentiated cells remained maintained at a high undifferentiation rate of 95% or more. From this, it was shown that the method of this embodiment is effective as a cell culture apparatus for human pluripotent stem cells.

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Abstract

　簡易な構成を実現しつつ細胞の培養を良好に行うことができる細胞培養装置を提供する。細胞培養装置５は、細胞を含む培養液を収容する培養槽１５と、培養槽１５内に少なくとも一部が配置された軸部材１７と、軸部材１７に支持されて培養槽１５内に配置され、軸部材１７を回転中心として回転可能に設けられた少なくとも一対の撹拌翼２７を有する撹拌機構１９と、軸部材１７に接するように設けられ、培養槽１５から培養液の吸引及び／又は培養槽１５への培養液の供給を行うフィルタ２１とを備え、軸部材１７は、少なくとも一部が中空であり、その内部に培養液を導入又は内部から培養液を導出する開口部１７ａ，１７ｂが設けられていると共に、回転不能とされており、フィルタ２１及び軸部材１７の内部を介して、培養槽１５から培養液の吸引及び／又は培養槽１５への培養液の供給を行う。

Description

細胞培養装置
　本発明は、細胞培養装置に関する。
　近年、細胞培養分野、再生医療分野では、細胞を長期間、自動で、安定的に大量培養し、生物製剤等に利用可能な細胞の生産物や、再生組織構築に用いる細胞そのものを得るための技術(細胞培養装置)が求められている。細胞を長期間安定的に培養するためには、培養期間中に培養液を交換及び/又は浄化等を行い、必要成分の補給や不要成分の除去をしなければならない場合が多く、その際、細胞の状態に影響を与えないために、細胞と培養液を分離し、培養液のみを取り出す技術が必要とされている。そのための従来の細胞培養装置として、例えば特許文献１に記載されたものが知られている。特許文献１に記載の細胞培養装置は、培養液は透過するが細胞は透過しないフィルタ領域を少なくとも部分的に有する盤状体を有している。この盤状体は、培養液を外部に取り出す導管を有し、導管と同軸に回転可能に設けられている。
特開昭６０－２２４４８６号公報
　細胞培養装置で培養される細胞としては、例えばヒトｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞がある。ヒトｉＰＳ細胞は、細胞を単細胞の状態にしたり、高いシェアストレスにさらしたりすると死滅し易い特性を有する。そのため、ヒトｉＰＳ細胞を培養するときには、細胞培養装置では、なるべく細胞にシェアストレスを与えないようにしなければならない。上記特許文献に記載の装置では、培養液を吸引するフィルタが撹拌手段である盤状体に装着されている。そのため、従来の装置は、培養液の吸引のための設備を別途備える構成に比べて、液流を乱す障害物がないため、細胞へのストレスを軽減することには有効である。しかしながら、従来の装置では、吸引する機構と撹拌する機構とが同時に回転する構成のため、回転機構においてシール性を確保するための構成が必要となり、構成が複雑化するといった問題がある。
　本発明は、簡易な構成を実現しつつ細胞の培養を良好に行うことができる細胞培養装置を提供することを目的とする。
　本発明の一側面に係る細胞培養装置は、細胞を含む培養液を収容する培養槽と、培養槽内に少なくとも一部が配置された軸部材と、軸部材に支持されて培養槽内に配置され、軸部材を回転中心として回転可能に設けられた撹拌翼を有する撹拌手段と、軸部材に接するように設けられ、培養液は透過させるが、細胞は透過させないフィルタと、を備え、軸部材は、少なくとも一部が中空であり、その内部に培養液を導入又は内部から培養液を導出する開口部が設けられていると共に、回転不能とされており、フィルタは、軸部材を回転中心として回転する撹拌翼の可動領域よりも内側に位置し、撹拌翼とは独立して軸部材に設けられており、フィルタ及び軸部材の内部を介して、培養槽から培養液の吸引及び／又は培養槽への培養液の供給を行う。
　この細胞培養装置では、回転不能とされた軸部材にフィルタが設けられている。撹拌手段の撹拌翼は、軸部材を回転中心として回転可能に設けられている。このように、細胞培養装置では、撹拌翼が軸部材に対して回転し、軸部材及びフィルタは回転しない。したがって、細胞培養装置では、培養液の吸引及び／又は供給のための機構を回転させないため、構成の簡易化を図ることができる。また、細胞培養装置では、培養槽から培養液の吸引及び／又は培養槽への培養液の供給を行うフィルタが撹拌翼の回転中心である軸部材において撹拌翼の可動領域よりも内側に位置して設けられており、フィルタ及び軸部材の内部を介して、培養槽から培養液の吸引及び／又は培養槽への培養液の供給を行う。そのため、細胞培養装置では、撹拌翼の回転により生じる液流（層流）に対してフィルタが乱れを発生させることが抑制され、培養液の吸引及び／又は供給に関して、細胞へのストレスの軽減を図ることができる。したがって、細胞培養装置では、簡易な構成を実現しつつ細胞の培養を良好に行うことができる。
　一実施形態においては、軸部材は、培養槽の底部に支持されていてもよい。
　一実施形態においては、軸部材は、下端部に開口部が設けられていると共に、上端部が閉塞されており、軸部材の側面部には、内部と連通する開口部が設けられており、フィルタは、側面部の開口部を覆うように軸部材の外表面に設けられていてもよい。このように、細胞培養装置では、培養液の吸引及び／又は供給の機構が軸部材に集約され、且つ軸部材は回転しないため、装置の簡易化を図ることができる。
　一実施形態においては、フィルタは、筒状を成しており、側面部の開口部を覆うように軸部材の外側に挿通されていてもよい。この構成によれば、細胞培養装置では、フィルタの表面積（膜面積）を確保することができる。
　一実施形態においては、軸部材は、下端部に開口部が設けられていると共に、上端部に内部と連通する開口部が設けられた筒状を成しており、フィルタは、上端部の開口部を覆うように軸部材に設けられていてもよい。このように、細胞培養装置では、培養液の吸引及び／又は供給の機構が軸部材に集約され、且つ軸部材は回転しないため、装置の簡易化を図ることができる。
　一実施形態においては、フィルタは、有底の筒状を成しており、上端部の開口部を覆うように軸部材の外側に挿通されていてもよい。この構成によれば、細胞培養装置では、フィルタの表面積（膜面積）を確保することができる。
　一実施形態においては、軸部材は、培養槽の蓋部に支持されていてもよい。
　一実施形態においては、軸部材は、上端部に開口部が設けられていると共に、下端部に内部と連通する開口部が設けられた筒状を成しており、フィルタは、下端部の開口部を覆うように軸部材に設けられていてもよい。このように、細胞培養装置では、培養液の吸引及び／又は供給の機構が軸部材に集約され、且つ軸部材は回転しないため、装置の簡易化を図ることができる。
　一実施形態においては、フィルタは、有底の筒状を成しており、下端部の開口部を覆うように軸部材の外側に挿通されていてもよい。この構成によれば、細胞培養装置では、フィルタの表面積（膜面積）を確保することができる。
　一実施形態においては、軸部材は、上端部に開口部が設けられていると共に、下端部が閉塞されており、軸部材の側面部には、内部と連通する開口部が設けられており、フィルタは、側面部の開口部を覆うように軸部材の外表面に設けられていてもよい。このように、細胞培養装置では、培養液の吸引及び／又は供給の機構が軸部材に集約され、且つ軸部材は回転しないため、装置の簡易化を図ることができる。
　一実施形態においては、フィルタは、筒状を成しており、側面部の開口部を覆うように軸部材の外側に挿通されていてもよい。この構成によれば、細胞培養装置では、フィルタの表面積（膜面積）を確保することができる。
　一実施形態においては、フィルタは、多孔質体であってもよい。
　本発明によれば、簡易な構成を実現しつつ細胞の培養を良好に行うことができる。
図１は、第１実施形態に係る細胞培養装置を備えた細胞培養システムを示す図である。 図２は、細胞培養装置を示す斜視図である。 図３は、図２に示す培養槽の側面図である。 図４は、図３におけるＩＶ－ＩＶ線に沿った断面構成を示す図である。 図５は、細胞培養装置の使用状態を示す側面図である。 図６は、第１実施形態の細胞培養装置の変形例を示す図である。 図７は、細胞培養装置を備えた細胞培養システムの他の形態を示す図である。 図８は、細胞培養装置を備えた細胞培養システムの他の形態を示す図である。 図９は、第２実施形態に係る細胞培養装置の断面構成を示す図である。 図１０は、第２実施形態の細胞培養装置の変形例を示す図である。 図１１は、第２実施形態の細胞培養装置の変形例を示す図である。 図１２は、第２実施形態の細胞培養装置の変形例を示す図である。 図１３は、第２実施形態の細胞培養装置の変形例を示す図である。 図１４は、第２実施形態の細胞培養装置の変形例を示す図である。 図１５は、実施例１に係る細胞培養装置を示す図である。 図１６は、実施例２に係る細胞培養装置を示す図である。 図１７は、比較例１に係る細胞培養装置を示す図である。
　以下、添付図面を参照して、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明において同一又は相当要素には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
［第１実施形態］
　図１は、第１実施形態に係る細胞培養装置を備えた細胞培養システムを示す図である。図１に示す細胞培養システム１では、細胞が培養される。細胞は、哺乳動物細胞等の有用細胞である。細胞としては、培養の結果、細胞の産生物を利用するのであれば、その物質を産生し易い細胞や目的の物質を産生し易いように、特定の遺伝子を導入した細胞も選択できる。また、細胞としては、培養の結果、特定の細胞を利用するのであれば、その細胞が増殖し易くなるように遺伝子を改変した細胞等も用いることができる。
　また、細胞としては、その成熟度に関してもいかなる制約もなく、成熟細胞、未分化細胞を用いることが可能である。よって、生体組織から酵素処理をして採取した細胞、血液に由来する細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ（Embryonic stem）細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞や、これらの細胞から分化誘導させた細胞等が例示される。また、接着細胞、浮遊細胞であることや、培養の方法にも限定されない。よって、浮遊培養では、単細胞の浮遊培養、細胞凝縮塊の浮遊培養、微小担体に細胞を担持しての浮遊培養等が例示される。更に、細胞は単一種類の細胞にも限定されない。目的の細胞が生育し易い物質を産生する他の細胞を混合させて共培養するということにも用いられ得る。
　続いて、細胞培養システム１の構成について説明する。図１に示されるように、細胞培養システム１は、成分調整液槽３と、細胞培養装置５と、送液回路７と、を備えている。成分調整液槽３と細胞培養装置５とは、送液回路７により接続されている。送液回路７は、成分調整液槽３と細胞培養装置５との間において、後述する培養液を送液する。送液回路７は、２本のチューブ８，９と、送液ポンプ１０，１１と、を備えている。チューブ８，９は、中空構造を有しており、培養液を無菌的に送液することが可能とされている。チューブ８，９は、例えば、シリコン、ウレタン、フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル等の材質で形成されている。
　送液ポンプ１０，１１は、各チューブ８，９の送液経路上にそれぞれ設けられており、培養液を連続的に送液可能なポンプである。送液ポンプ１０，１１としては、一般的なポンプであればよく、例えば、ペリスタポンプ、ダイヤフラムポンプ等が例示できる。送液回路７は、送液ポンプ１０，１１の駆動により、成分調整液槽３と細胞培養装置５との間で、チューブ８，９を介して培養液を送液する。
　送液回路７のチューブ８，９には、培養液成分調整膜１３が設けられている。詳細には、培養液成分調整膜１３は、チューブ８の一端部とチューブ９の一端部とに接続されており、成分調整液槽３内に配置されている。培養液成分調整膜１３は、培養液成分の膜透過性がその分子量に依存する半透性の膜である。培養液成分調整膜１３の孔径は、細胞培養装置５に保持したい成分の分子量により設計される。すなわち、培養液成分調整膜１３は、細胞培養装置５に保持したい成分のうち、最小分子量物質が膜を透過しないように選択される。培養液成分調整膜１３の形状は、平膜形状、中空糸形状を用いることができるが、培養液を搬送する目的では、中空糸形状であることが好ましい。成分調整を効率的に行うために、中空糸を複数本束状にして使用することがさらに好ましい。図１では、中空糸形状の培養液成分調整膜１３を図示している。
　培養液成分調整膜１３の材質は、特に限定されないが、細胞培養装置５内に保持したい成分が吸着、分解等されない材質であることが好ましい。培養液成分調整膜１３の材質が上記成分を吸着し易い特性を有している場合には、それらを別の材料でコーティングしたり、表面改質剤を用いたりすることで、表面を改質して成分の吸着を抑制することも可能である。
　成分調整液槽３は、成分調整液を収容する槽である。成分調整液槽３は、成分調整液成分に不活性で細胞毒性を有さず、且つ、減菌（除染、除菌又は無菌を含む）処理に対して耐性を有する材料で形成されていることが好ましく、例えば、ガラス、合成樹脂、ステンレス鋼等が挙げられる。成分調整液槽３の内容量及び形状等は、成分調整液の量に応じて適宜決定される。本実施形態では、成分調整液槽３は、例えばガラス製であり、有底の円筒形状を成している。成分調整液槽３には、上部に設けられた開口部（図示しない）を塞ぐ蓋部３ｃが取り付けられている。
　成分調整液槽３に収容される成分調整液は、培養液成分調整膜１３を実質的に透過可能な成分のうちの少なくとも一つの成分を有する溶液である。培養液及び成分調整液がそれぞれ含有する成分は、その分子量と両液間の濃度差により膜を介して調整される。
　分子量が培養液成分調整膜１３の孔径よりも大きく実質的に膜を透過できない成分は、両液間を移動しない。対して、分子量が培養液成分調整膜１３の孔径よりも小さく実質的に膜を透過し得る成分は、その濃度差が少なくなるように両液間で濃度調整される。細胞により産生されて培養液中に蓄積した代謝物は、成分調整液側に移動することにより培養液中の濃度を低下させる。同時に、細胞生育に必要であり培養期間中に濃度が低下した成分については、成分調整液から培養液へ移動して補充される。以上の原理から、成分調整液の内容と濃度を適切に設定することにより、培養液中の環境が維持され細胞の良好な生育環境が維持される。もちろん、培養液をそのまま使用することもできる。よって、成分調整液は、細胞培養期間中に培養液中から失われていく成分を全て有することが好ましい。更に好ましくは、それらの成分の濃度が培養期間中に枯渇しないように濃度設定される。
　成分調整液の量は、細胞代謝物の蓄積防止の観点から、多く設定することが好ましい。好ましくは、培養液の５倍以上、更に好ましくは１０倍以上に設定される。成分調整液の量は、培養コストに影響するため、培養期間と必要細胞数により決定される。成分調整液は、生理的なｐＨを維持し易いように緩衝能を有するように設計されてもよいし、ｐＨの変化を色で判別し易いようにｐＨ指示色素が混合されていてもよい。
　成分調整液槽３の内部には、撹拌回転子４が設けられている。撹拌回転子４は、成分調整液槽３内の成分調整液を撹拌する部材であり、成分調整液槽３の下部に配置された図示しない駆動源により駆動される。駆動源は、例えば磁力体を回転駆動させるものである。撹拌回転子４は、磁力体の回転駆動に応じて回転し、成分調整液を撹拌する。また、成分調整液槽３の蓋部３ｃには、空気の給気・排気ポート６や、成分調整液をサンプリングするためのサンプリングポート（図示しない）等が設けられていてもよい。
　細胞培養装置５は、細胞を培養する装置である。図２は、細胞培養装置を示す斜視図である。図３は、細胞培養装置の側面図である。図４は、図３におけるＩＶ－ＩＶ線に沿った断面構成を示す図である。図２～図４に示されるように、細胞培養装置５は、培養槽１５と、軸部材１７と、撹拌機構（撹拌手段）１９と、フィルタ２１と、を備えている。
　培養槽１５は、細胞が培養される培養液を収容（貯留）する。ここで、培養液は、各種細胞等と、その細胞の生育可能な溶液成分及び環境とを少なくとも有する溶液である。培養液の成分及び濃度は、細胞の性質により設計される。また、培養液は、生理的なｐＨを維持し易いように緩衝能を有するように設計されてもよいし、ｐＨの変化を色で判別し易いようにｐＨ指示色素が混合されていてもよい。培養液は、一般的に市販されている各種培養液をそのまま使用してもよいし、それらに目的細胞の性質に応じて追加の成分を添加してもよい。
　培養槽１５は、培養液成分に不活性で細胞毒性を有さず、且つ、減菌処理に対して耐性を有する材料で形成されていることが好ましく、例えば、ガラス、合成樹脂、ステンレス鋼等が挙げられる。培養槽１５の内容量及び形状等は、培養液の量に応じて適宜決定される。本実施形態では、培養槽１５は、例えばガラス製であり、有底の円筒形状を成している。培養槽１５は、細胞等を含む培養液を取出すための取出部１６を有している。取出部１６は、培養槽１５の側面部１５ａ（図４参照）に設けられており、斜め上方に延在する筒状体である。取出部１６には、蓋部１６ｃが取り付けられている。培養槽１５には、上部に設けられた開口部１５ｏを塞ぐ蓋部１５ｃが設けられている。蓋部１５ｃには、空気の給気・排気ポート１２、培養液を培養槽１５に供給する培養液供給部、ｐＨセンサの挿入ポート等が設けられている。培養液供給部の上端部には、チューブ９の他端部が接続されている。
　軸部材１７は、直線状の部材であり、中空構造を有している。軸部材１７は、培養液成分に不活性で細胞毒性を有さず、且つ、減菌処理に対して耐性を有する材料であることが好ましく、例えば、合成樹脂、ステンレス鋼等が挙げられる。軸部材１７は、両端部に開口部１７ａ，１７ｂをそれぞれ有している。
　軸部材１７は、その一端部側が培養槽１５内に配置されている。具体的には、軸部材１７は、軸支持部２３に固定されている。軸支持部２３は、蓋部１５ｃに設けられている。軸支持部２３は、蓋部１５ｃの略中央部に配置されており、蓋部１５ｃに立設されている。軸支持部２３は、中空構造を有しており、内部に軸部材１７を挿通させて軸部材１７を回転不能に保持する。軸部材１７の他端部は、軸支持部２３の上端面よりも突出している。軸部材１７の上端部には、チューブ８の他端部が接続されている。これにより、軸部材１７の内部とチューブ８とが連通している。
　撹拌機構１９は、取付部２５と、撹拌翼２７と、を備えている。取付部２５は、軸部材１７に回転可能に取り付けられている。取付部２５は、軸部材１７を挿通しており、軸部材１７の所定高さ位置において回転可能に支持されている。
　撹拌翼２７は、培養液を撹拌する。撹拌翼２７は、軸部材１７を回転中心として回転可能に設けられている。詳細には、撹拌翼２７の上端部に取付部２５が連結されており、取付部２５が軸部材１７に回転可能とされていることにより、撹拌翼２７が軸部材１７を回転中心として回転する。撹拌翼２７は、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する板材で形成されていることが好ましく、例えば、薄板状の合成樹脂、ステンレス鋼（例えば、１ｍｍ厚のＳＵＳ３１６）等が挙げられる。撹拌翼２７の数は、撹拌機構１９の回転数により設定されるが、軸部材１７を中心に等間隔に備えることが撹拌時におけるバランスの点で好ましく、例えば２～４枚が好適である。本実施形態では、撹拌翼２７が２枚の構成を例示している。
　撹拌翼２７は、培養槽１５の底部１５ｂ（図４参照）の内面との隙間が小さくなるように形成されている。そのため、撹拌翼２７は、撹拌機構１９が回転するときに、底部１５ｂの内面に沿う。これにより、底部１５ｂの内面付近の培養液を撹拌して細胞及び細胞凝集塊等を培養液中において継続的に浮遊させるため、底部１５ｂの内面に沈殿するのを防止できる。また、撹拌翼２７は、培養槽１５の側面部１５ａの内面との隙間が小さくなるように形成されている。そのため、撹拌翼２７は、撹拌機構１９が回転するときに、側面部１５ａの内面に沿う。これにより、側面部１５ａの内面付近の培養液を撹拌して均一な層流とすることができ、細胞増殖に伴って比重が増大した細胞凝集塊等が沈殿するのを防止できる。
　撹拌翼２７には、磁力体３０が設けられている。磁力体３０は、撹拌翼２７の下端に配置されている。磁力体３０は、テトラフルオロエチレン等で被覆された永久磁石等である。磁力体３０は、撹拌翼２７の下端部において磁力体３０を取り囲むように折り曲げ加工された部分に固定されている。撹拌翼２７は、磁力体３０の駆動により回転する。具体的には、図５に示されるように、培養槽１５の下部には、一対の磁力体３２を支持体３３を介して回転駆動させる駆動モータ３４が配置されており、磁力体３０に対向配置された磁力体３２の回転に伴って撹拌翼２７が回転する。駆動モータ３４の軸は、軸部材１７と同軸となるように配置されている。
　フィルタ２１は、培養液と接する部分であり、培養液を透過させるが、培養液中の細胞及び細胞凝集塊等は透過させない。フィルタ２１は、細胞等と培養液とを分離できるものであればよく、材質、形状、数などは特に限定されず、設計に合わせて適宜設定されればよいが、例えば多孔質体であり、好ましくは焼結体で、円柱形状を成している。フィルタ２１の材質としては、金属、セラミック、ガラス、樹脂、繊維等が例示され、好ましくは、フッ素樹脂、ポリオレフィン系樹脂が例示できる。フィルタ２１は、ある程度水を透過し、細胞そのものや微小担体の吸着、細胞培養装置５内に保持したい成分の分解、吸着が起きない材質のものであることが好ましく、フィルタ２１の材質がこれらの特性を有している場合には、別の材料でコーティングしたり、表面改質剤を用いたりすることで親水化したり、上記の吸着や分解を防いだりすることも可能である。フィルタ２１は、軸部材１７に接するように設けられている。詳細には、フィルタ２１は、有底の円筒形状を成しており、軸部材１７の下端部が挿入されている。これにより、フィルタ２１は、軸部材１７と同軸上に延在し、撹拌機構１９の撹拌翼２７の間に位置している。すなわち、フィルタ２１は、軸部材１７を回転中心として回転する撹拌翼２７の可動領域よりも内側に位置し、撹拌翼２７とは独立して軸部材１７に設けられている。フィルタ２１を透過した培養液は、軸部材１７の内部に導出される。
　細胞培養装置５では、フィルタ２１を透過して吸引された培養液は、軸部材１７の開口部１７ｂからその内部に導入され、開口部１７ａから導出されてチューブ８に導出される。そして、培養液は、チューブ８を介して成分調整液槽３内の培養液成分調整膜１３に送出され、チューブ９を介して培養槽１５に戻される。
　以上説明したように、本実施形態の細胞培養装置５は、回転不能とされた軸部材１７にフィルタ２１が設けられている。撹拌機構１９の撹拌翼２７は、軸部材１７を回転中心として回転可能に設けられている。このように、細胞培養装置５では、撹拌翼２７が軸部材１７に対して回転し、軸部材１７及びフィルタ２１は回転しない。したがって、細胞培養装置５では、培養液の吸引のための機構を回転させないため、構成の簡易化を図ることができる。また、細胞培養装置５では、培養槽１５からの培養液の吸引を行うフィルタ２１が撹拌翼２７の回転中心である軸部材１７において撹拌翼２７の可動領域よりも内側に位置して設けられており、フィルタ２１及び軸部材１７の内部を介して、培養槽１５から培養液の吸引を行う。そのため、細胞培養装置５では、撹拌翼２７の回転により生じる液流（層流）に対してフィルタ２１が乱れを発生させることが抑制され、培養液の吸引に関して、細胞へのストレスの軽減を図ることができる。したがって、細胞培養装置５では、簡易な構成を実現しつつ細胞の培養を良好に行うことができる。
　本実施形態では、軸部材１７が蓋部１５ｃに設けられた軸支持部２３に支持されており、軸部材１７の下端部がフィルタ２１に挿入されている。このように、細胞培養装置５では、培養液を吸引する機構が軸部材１７に集約され、且つ軸部材１７は回転しないため、装置の簡易化を図ることができる。
　本実施形態では、フィルタ２１が柱状を成しているため、フィルタ２１において膜面積を確保することができる。したがって、フィルタ２１では、培養液の吸引を安定して行うことができる。
　なお、第１実施形態に係る細胞培養装置５の構成は、培養槽１５の蓋部１５ｃに軸部材が支持される構成であればよく、軸部材やフィルタ、撹拌機構の構成は他の形態であってもよい。
　図６は、第１実施形態に係る細胞培養装置の変形例を示す図である。図６（ａ）に示されるように、フィルタ２１Ａは、軸部材１７Ａに挿通される構成であってもよい。詳細には、軸部材１７Ａは、中空構造を有しており、上端部に開口部１７Ａａを有すると共に下端部が閉塞されている。軸部材１７Ａの側面部には、内部と外部とを連通する開口部１７ｈが設けられている。なお、図６では、開口部１７ｈを１つだけ図示しているが、開口部１７ｈの数、大きさ、形状は、設計に合わせて適宜設定されればよい。フィルタ２１Ａは、円筒形状を成している。フィルタ２１Ａは、軸部材１７Ａに挿通されており、軸部材１７Ａの開口部１７ｈを覆うように軸部材１７Ａの外表面（外側）に設けられている。これにより、フィルタ２１Ａ及び軸部材１７Ａの内部を介して、培養槽１５から培養液の吸引を行う。
　また、フィルタ２１は、円柱形状以外の形状であってもよい。図６（ｂ）に示されるように、フィルタ２１Ｂは、下端部が円錐台形状を成していてもよい。また、フィルタ２１は、角柱状であってもあってもよいし、三角柱状であってもよい。フィルタ２１は、表面積を確保するために、表面形状が凹凸であってもよい。
　また、フィルタ２１は、培養槽１５の底部１５ｂに接していてもよい。フィルタ２１が底部１５ｂに接することにより、底部中心近傍がフィルタ２１で占められる。これにより、培養液の回転による底部中心近傍の液流のよどみが生じる余地がなく、細胞増殖に伴って比重が増大した細胞凝集塊等の底部中心近傍への沈殿を防止することができる。
　図７及び図８は、細胞培養装置を備えた細胞培養システムの他の形態を示す図である。図７に示されるように、細胞培養システム１Ａは、細胞培養装置５と、培養液槽３Ａと、廃棄槽３Ｂと、を備えている。培養液槽３Ａと細胞培養装置５とは、送液ポンプ１０が設けられたチューブ８により接続されている。細胞培養装置５と廃棄槽３Ｂとは、送液ポンプ１１が設けられたチューブ９により接続されている。細胞培養システム１Ａでは、培養液槽３Ａから細胞培養装置５に培養液が供給され、細胞培養装置５から代謝物等を含んだ培養液が廃棄槽３Ｂに供給される。
　図８に示されるように、細胞培養システム１Ｂは、細胞培養装置５と、培養液槽３Ａと、廃棄槽３Ｂと、を備えている。培養液槽３Ａ及び廃棄槽３Ｂと細胞培養装置５とは、送液回路７Ａにより接続されている。詳細には、チューブ８Ａには、三方活栓１４が設けられている。細胞培養装置５には、三方活栓１４を介して培養液槽３Ａから培養液が供給され、細胞培養装置５からは、三方活栓１４を介して代謝物等を含んだ培養液が廃棄槽３Ｂに供給される。
　三方活栓１４は、細胞培養装置５への培養液の供給、及び、細胞培養装置５からの培養液の吸引に応じて流路が切り替えられる。すなわち、三方活栓１４は、培養液槽３Ａから培養液が供給される場合には、培養液槽３Ａと細胞培養装置５との間の流路を確立し、廃棄槽３Ｂに培養液が供給される場合には、細胞培養装置５と廃棄槽３Ｂとの間の流路を確立する。細胞培養装置５では、フィルタ２１において、培養槽１５から培養液の吸引及び培養槽１５への培養液の供給を行う。
［第２実施形態］
　続いて、第２実施形態について説明する。図９は、第２実施形態に係る細胞培養装置の断面構成を示す図である。図９に示されるように、細胞培養装置４０は、培養槽４２と、軸部材４４と、撹拌機構４６と、フィルタ４８と、を備えている。
　培養槽４２は、培養液成分に不活性で細胞毒性を有さず、且つ、減菌（除染、除菌又は無菌を含む）処理に対して耐性を有する材料で形成されていることが好ましく、例えば、ガラス、合成樹脂、ステンレス鋼等が挙げられる。培養槽４２の内容量及び形状等は、培養液の量に応じて適宜決定される。本実施形態では、培養槽４２は、例えば合成樹脂製であり、有底の円筒形状を成している。培養槽４２には、上部に設けられた開口部４２ｏを塞ぐ蓋部４２ｃが設けられている。蓋部４２ｃには、細胞等を含む培養液を取出すための取出部４３、空気の給気・排気ポート、ｐＨセンサ５８等が設けられている。
　軸部材４４は、培養槽４２の底部４２ａに支持されている。軸部材４４は、導管部４４ａと、支持部４４ｂと、を備えている。導管部４４ａは、直線状の部材であり、中空構造を有している。導管部４４ａは、培養液成分に不活性で細胞毒性を有さず、且つ、減菌処理に対して耐性を有する材料であることが好ましく、例えば、合成樹脂、ステンレス鋼等が挙げられる。導管部４４ａは、培養槽４２の底部４２ａに支持されている。詳細には、導管部４４ａは、底部４２ａに設けられた支持台４２ｄに挿通されて支持固定されている。導管部４４ａの内部は、培養槽４２の底部４２ａに設けられた吸引ポート４２ｅに連通している。導管部４４ａの側壁部には、内部と外部とを連通する開口部４４ｈが設けられている。なお、図９では、開口部４４ｈを１つだけ図示しているが、開口部４４ｈの数、大きさ、形状は、設計に合わせて適宜設定されればよい。
　支持部４４ｂは、導管部４４ａの上部に設けられている。支持部４４ｂは、導管部４４ａの上端部の開口部を塞ぐように配置されている。支持部４４ｂは、導管部４４ａと同軸上に延在している。
　撹拌機構４６は、取付部５０と、撹拌翼５２と、を備えている。取付部５０は、軸部材４４の支持部４４ｂに回転可能に取り付けられている。詳細には、取付部５０は、支持部４４ｂの上端部が挿入されている。
　撹拌翼５２は、軸部材４４を回転中心として回転可能に設けられている。詳細には、撹拌翼５２の上端部に取付部５０が連結されており、取付部５０が軸部材４４に回転可能とされていることにより、撹拌翼５２が軸部材４４を回転中心として回転する。撹拌翼５２は、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する板材で形成されていることが好ましく、例えば、薄板状の合成樹脂、ステンレス鋼（例えば、１ｍｍ厚のＳＵＳ３１６）等が挙げられる。撹拌翼５２の数は、撹拌機構４６の回転数により設定されるが、軸部材４４を中心に等間隔に備えることが撹拌時におけるバランスの点で好ましく、例えば２～４枚が好適である。本実施形態では、撹拌翼５２が２枚の構成を例示している。
　撹拌翼５２には、磁力体５４が設けられている。磁力体５４は、撹拌翼５２の下端に配置されている。磁力体５４は、テトラフルオロエチレン等で被覆された永久磁石等である。磁力体５４は、撹拌翼５２の下端部において磁力体５４を取り囲むように折り曲げ加工された部分に固定されている。撹拌翼５２は、磁力体５４の駆動により回転する。具体的には、培養槽４２の下部には、図５に示されるように、一対の磁力体３２を支持体３３を介して回転駆動させる駆動モータ３４が配置されており、磁力体５４に対向配置された磁力体３２の回転に伴って撹拌翼５２が回転する。駆動モータ３４の軸は、軸部材４４と同軸となるように配置されている。
　フィルタ４８は、細胞等と培養液とを分離できるものであればよく、材質、形状、数などは特に限定されず、設計に合わせて適宜設定されればよいが、例えば多孔質体であり、好ましくは焼結体で、円筒形状を成している。フィルタ４８は、軸部材４４の導管部４４ａに挿通されており、導管部４４ａの開口部４４ｈを覆うように導管部４４ａの外表面（外側）に設けられている。すなわち、フィルタ４８は、軸部材４４を回転中心として回転する撹拌翼５２の可動領域よりも内側に位置し、撹拌翼５２とは独立して軸部材４４に設けられている。細胞培養装置４０では、フィルタ４８及び導管部４４ａの内部を介して、培養槽４２から培養液の吸引を行う。
　以上説明したように、本実施形態の細胞培養装置４０は、回転不能とされた軸部材４４にフィルタ４８が設けられている。撹拌機構４６の撹拌翼５２は、軸部材４４を回転中心として回転可能に設けられている。このように、細胞培養装置４０では、撹拌翼５２が軸部材４４に対して回転し、軸部材４４及びフィルタ４８は回転しない。したがって、細胞培養装置４０では、培養液の吸引のための機構を回転させないため、構成の簡易化を図ることができる。また、細胞培養装置４０では、培養槽４２から培養液の吸引を行うフィルタ４８が撹拌翼５２の回転中心である軸部材４４において撹拌翼５２の可動領域よりも内側に位置して設けられており、フィルタ４８及び軸部材４４の内部を介して、培養槽４２から培養液の吸引を行う。そのため、細胞培養装置４０では、撹拌翼５２の回転により生じる液流（層流）に対してフィルタ４８が乱れを発生させることが抑制され、培養液の吸引に関して、細胞へのストレスの軽減を図ることができる。したがって、細胞培養装置４０では、簡易な構成を実現しつつ細胞の培養を良好に行うことができる。
　本実施形態では、軸部材４４が培養槽４２の底部４２ａに支持されており、軸部材４４がフィルタ４８に挿入されている。このように、細胞培養装置４０では、培養液を吸引する機構が軸部材４４に集約され、且つ軸部材４４は回転しないため、装置の簡易化を図ることができる。
　なお、第２実施形態に係る細胞培養装置４０の構成は、培養槽４２の底部４２ａに軸部材が支持される構成であればよく、軸部材やフィルタ、撹拌機構の構成は他の形態であってもよい。
　図１０～図１４は、第２実施形態の細胞培養装置の変形例を示す図である。図１０に示すように、軸部材６０は、導管部６０ａと、支持部６０ｂと、を備えている。導管部６０ａは、直線状の部材であり、中空構造を有している。導管部６０ａは、培養槽４２の底部４２ａに設けられた支持台４２ｄに挿通されて、培養槽４２の底部４２ａに支持されている。導管部６０ａの上端部には、開口部６０ｈが設けられている。フィルタ６２は、この導管部６０ａの開口部６０ｈを覆うように、導管部６０ａに設けられている。具体的には、フィルタ６２は、有底の円筒形状を成しており、導管部６０ａの上端部が挿入されている。すなわち、導管部６０ａは、上記実施形態の導管部４４ａとは構成が異なり、フィルタ６２の内部を貫通していない。支持部６０ｂは、フィルタ６２の上端部に設けられている。支持部６０ｂは、導管部６０ａ及びフィルタ６２と同軸上に延在している。撹拌機構４６の取付部５０は、支持部６０ｂに取り付けられる。
　図１１に示すように、軸部材７０は、培養槽４２の底部４２ａに支持されている。軸部材７０の上端部には、開口部７０ｈが設けられている。フィルタ７１は、この軸部材７０の開口部７０ｈを覆うように、軸部材７０に設けられている。具体的には、フィルタ７１は、有底の円筒形状を成しており、軸部材７０の上端部が挿入されている。撹拌機構７２は、取付部７４と、撹拌翼７６と、を備えている。取付部７４は、軸部材７０に回転可能に取り付けられている。詳細には、取付部７４は、フィルタ７１の下端部よりも下方の位置において軸部材７０に取り付けられている。撹拌翼７６は、その下端部側が取付部７４に連結されており、フィルタ７１を挟んで配置されている。
　撹拌翼７６には、磁力体７８が設けられている。磁力体７８は、撹拌翼７６の下端に配置されている。磁力体７８は、テトラフルオロエチレン等で被覆された永久磁石等である。撹拌翼７６は、磁力体７８の駆動により回転する。具体的には、培養槽４２の下部には、図５に示されるように、一対の磁力体３２を支持体３３を介して回転駆動させる駆動モータ３４が配置されており、磁力体７８に対向配置された磁力体３２の回転に伴って撹拌翼７６が回転する。駆動モータ３４の軸は、軸部材７０と同軸となるように配置されている。なお、撹拌翼７６の構成は、図１１に示す構成（形状）に限定されない。
　図１２に示すように、軸部材８０は、導管部８０ａと、封止部８０ｂと、を備えている。導管部８０ａは、直線状の部材であり、中空構造を有している。導管部８０ａは、培養槽４２の底部４２ａに設けられた支持台４２ｄに挿通されて、培養槽４２の底部４２ａに支持されている。導管部８０ａの側壁部には、内部と外部とを連通する開口部８１ａ，８１ｂが設けられている。開口部８１ａ，８１ｂは、軸部材８０の長手方向において離間し、後述する第１フィルタ８２ａ及び第２フィルタ８２ｂのそれぞれの位置に対応して配置されている。なお、図１２では、開口部８１ａ，８１ｂをそれぞれ１つずつ示しているが、開口部８１ａ，８１ｂの数、大きさ、形状は、設計に合わせて適宜設定されればよい。封止部８０ｂは、導管部８０ａの上端部に設けられた開口部を封止（閉塞）している。
　フィルタ８２は、第１フィルタ８２ａと、第２フィルタ８２ｂと、を有する。すなわち、フィルタ８２は、２つのパーツに分割されている。第１フィルタ８２ａ及び第２フィルタ８２ｂは、円筒形状を成している。第１フィルタ８２ａは、導管部８０ａの下端部側に挿通されており、開口部８１ａを覆うように導管部８０ａの外表面（外側）に設けられている。第２フィルタ８２ｂは、導管部８０ａの上端部側に挿通されており、開口部８１ｂを覆うように導管部８０ａの外表面（外側）に設けられている。第１フィルタ８２ａの上端部と第２フィルタ８２ｂの下端部とは、所定の間隔をあけて離間している。取付部７４は、第１フィルタ８２ａと第２フィルタ８２ｂとの間に配置され、導管部８０ａ（軸部材８０）に回転可能に取り付けられている。撹拌翼７６は、取付部７４に連結されており、フィルタ８２を挟んで配置されている。なお、図１２に示す撹拌翼７６の下端部の内側は、支持台４２ｄの形状に沿った形状とされている。
　図１３に示すように、軸部材９０は、直線状の部材であり、中空構造を有している。軸部材９０は、培養槽４２の底部４２ａに設けられた支持台４２ｄに挿通されて、培養槽４２の底部４２ａに支持されている。軸部材９０には、その上端部に開口部９０ａが設けられており、側壁部の下端部側には、内部と外部とを連通する開口部９０ｂが設けられている。フィルタ９２は、第１フィルタ９２ａと、第２フィルタ９２ｂと、を有している。第１フィルタ９２ａは、円筒形状を成している。第１フィルタ９２ａは、軸部材９０の下端部側に挿通されており、開口部９０ｂを覆うように軸部材９０の外表面（外側）に設けられている。第２フィルタ９２ｂは、軸部材９０の開口部９０ａを覆うように、軸部材９０に設けられている。具体的には、第２フィルタ９２ｂは、有底の円筒形状を成しており、軸部材９０の上端部が挿入されている。第１フィルタ９２ａの上端部と第２フィルタ９２ｂの下端部とは、所定の間隔をあけて離間している。なお、図１３では、開口部９０ｂを１つ示しているが、開口部９０ｂの数、大きさ、形状は、設計に合わせて適宜設定されればよい。取付部７４は、第１フィルタ９２ａと第２フィルタ９２ｂとの間に配置され、軸部材９０に回転可能に取り付けられている。撹拌翼７６は、取付部７４に連結されており、フィルタ９２を挟んで配置されている。なお、図１３に示す撹拌翼７６の下端部の内側は、支持台４２ｄの形状に沿った形状とされている。
　図１４に示すように、軸部材１００は、第１導管部１１０と、第２導管部１２０と、を有している。第１導管部１１０及び第２導管部１２０は、直線状の部材であり、中空構造を有している。第１導管部１１０は、培養槽４２の底部４２ａに設けられた支持台４２ｄに挿通されて、培養槽４２の底部４２ａに支持されている。第１導管部１１０の上端部には、開口部１１０ａが設けられている。第２導管部１２０は、その下端部及び上端部のそれぞれに、開口部１２０ａ及び開口部１２０ｂが設けられている。
　フィルタ１３０は、第１フィルタ１３０ａと、第２フィルタ１３０ｂと、を有している。第１フィルタ１３０ａは、第１導管部１１０の開口部１１０ａ、及び、第２導管部１２０の開口部１２０ａを覆うように、第１導管部１１０及び第２導管部１２０に設けられている。具体的には、第１フィルタ１３０ａは、両端部に挿入孔が設けられた円柱形状を成しており、第１導管部１１０の上端部、及び第２導管部１２０の下端部が挿入孔に挿入されている。第２フィルタ１３０ｂは、第２導管部１２０の開口部１２０ｂを覆うように、第２導管部１２０に設けられている。第２フィルタ１３０ｂは、有底の円筒形状を成しており、第２導管部１２０の上端部が挿入されている。第１フィルタ１３０ａと第２フィルタ１３０ｂとは、第２導管部１２０により連結されており、所定の間隔をあけて離間している。取付部７４は、第１フィルタ１３０ａと第２フィルタ１３０ｂとの間に配置され、第２導管部１２０に回転可能に取り付けられている。撹拌翼７６は、取付部７４に連結されており、フィルタ１３０を挟んで配置されている。なお、図１４に示す撹拌翼７６の下端部の内側は、支持台４２ｄの形状に沿った形状とされている。
　本発明は、上述した実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能である。
　上記実施形態では、撹拌翼２７，５２，７６を一例に説明したが、撹拌翼の形状はこれに限定されない。撹拌翼の形状は、細胞へのストレスの軽減を図れる構成であることが好ましい。
　以下、実施例によって本実施形態をさらに詳細に説明するが、本実施形態はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
（細胞培養システムの制御装置）
　細胞培養システムの制御装置としては、８連動動物培養装置ＢｉｏＪｒ．８（ＢＪＲ－２５ＮＡ１Ｓ－８Ｃ、エイブル株式会社）を使用した。本制御装置は、１台で８個の１００ｍＬ容量の細胞培養装置を制御可能である。測定及び制御項目は、撹拌速度、温度、ｐＨ、及び溶存酸素濃度（ＤＯ）とした。本制御装置では、各細胞培養装置を独立して制御可能である。
（ヒトｉＰＳ細胞の準備）
　培養細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞（253G1）を用いた。細胞は、ビトロネクチン（ライフテクノロジーズ社）をコートした培養ディッシュ（コーニング社）に播種し、培養液としてEssential-8を用いて培養した。培養液の交換は毎日実施し、３～４日に一度の頻度で継代を実施した。
（ヒトｉＰＳ細胞の培養）
　実施例１においては、図１５に示される細胞培養装置を作製した。培養槽１５としてガラス製の専用槽（エイブル株式会社）を使用し、培養液を１００ｍＬとした。準備したヒトｉＰＳ細胞を、細胞数２×１０７個（密度２×１０５個／ｍＬ）で播種し、培養を開始した。この時点を培養０日目とした。培養液としては、Essential-8培地（ライフテクノロジーズ社）に以下の成分を添加して使用した。すなわち、ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）阻害剤としてY-27632（和光純薬工業株式会社）を１０μＭ、ヘパリン（シグマアルドリッチ社）を７５０ｎｇ／ｍＬの濃度にて添加した。培養槽１５には撹拌翼２２を設置し、回転数は６０ｒｐｍとした。培養槽１５には、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度をそれぞれ計測可能なセンサー（エイブル株式会社）を設置した。また、溶存酸素濃度は４０％に制御される設定とし、そのために、酸素、窒素、及び空気の混合ガスが培養槽１５内の培養液に対して上面通気となるようにガス導入ラインを設置した。さらに、ガスを培養槽１５から排出する導出ラインを設置した。温度は３７℃に設定した。
　軸部材１７としては、ステンレス製の中空パイプ（外径３ｍｍ、内径１．８ｍｍ）を使用した。フィルタ２１としては、ポリエチレンの焼結体からなる直径８ｍｍ、長さ１５ｍｍ、平均孔径３０μｍの有底円筒型フィルタを使用した。軸部材１７は、培養槽１５の蓋部の中心に固定し、フィルタ２１を通過した培養液が該軸部材１７の中空部分を通って培養槽１５から取り出せる構造とした。また、培養槽１５に培養液を返却可能な口を設置した。撹拌翼２２は、上記軸部材１７を中心に回転可能に設置した。フィルタ２１は、その円筒上面と培養液の液面が近くなる高さに設置した。
　成分調整液槽は、容量１Ｌのガラス製滅菌ビンを使用した。成分調整液槽の蓋の部分に、通気ライン、培養液の入口、及び、出口ラインを設置した。成分調整液槽内には、旭ポリスルホンダイアライザーＡＰＳ（旭化成メディカル株式会社）の中空糸を４００本束ねて有効長２０ｃｍとなるように、中空糸両端部の管腔構造が解放されるようにウレタン接着剤にて固定したものを培養液成分調整膜として設置した。中空糸束は、成分調整液槽の内部に配置し、中空糸束の両端部と培養液の入口、出口ラインを回路にて接続した。成分調整液としては、Essential-6（ライフテクノロジーズ社）に培養液と同濃度となるようY-27632とヘパリンを添加した溶液を１Ｌ使用した。
　送液回路としては、シリコン製チューブ（内径１ｍｍφ、外径４ｍｍφ）を用いた。
　培養液の送液ポンプとしては、ペリスタポンプRP-23（エイブル株式会社）を２台使用した。２台のポンプは、培養槽１５と成分調整液槽とを接続する送液回路のそれぞれに接続し、送液可能な状態に設置した。
　閉鎖系回路内に培養槽１５及び成分調整液槽とは独立して１０ｍＬシリンジ（テルモ株式会社）にbFGF（ライフテクノロジーズ社）を１０μｇ／ｍＬ、ヘパリン（シグマアルドリッチ社）を２５０μｇ／ｍＬの濃度で培養液DMEM/F12（ライフテクノロジーズ社）に溶解し２ｍＬ設置した。
　以上説明した方法により、図１に示される細胞培養システムを作製した。本システムを用いて、以下の方法によりｉＰＳ細胞からなる細胞塊を製造した。
　培養液の送液ポンプによる循環は、培養１日目より開始した。循環速度は、１日目は１００ｍＬ／日、２日目は２００ｍＬ／日、３日目は４００ｍＬ／日、４日目以降は６００ｍＬ／日とした。培養槽１５の液容量が実質的に同じレベルを維持できるように２台のポンプ流速を微調整し、６日目まで連続的に培養液を灌流しながら培養を実施した。bFGFとヘパリンの混合液は、培養２日目及び４日目に１０ｍＬシリンジより１ｍＬ投与した。培養６日目に細胞培養を終了し、細胞数の測定と未分化率の測定を以下のようにおこなった。
（細胞数の測定）
　培養６日目に細胞塊を培養槽１５から回収し、細胞分離／分散溶液Accumax（イノベーティブセルテクノロジーズ社）にて１０分間処理し、単細胞の状態とした後、トリパンブルー法にて死細胞を染色して、生細胞のみを計算盤を用いてカウントした。
（未分化率測定）
　ヒトｉＰＳ細胞が未分化状態を維持していることを確認するために、未分化マーカーであるSSEA-4の陽性率をフローサイトメトリー法にて測定した。抗体としては、抗ヒト／マウスSSEA-4モノクローナル抗体FAB1435F（R&Dシステムズ社）を用い、測定装置としては、Cell Lab QuantaSC（ベックマン・コールター株式会社）を用いた。SSEA-4の陽性率を未分化率とした。
［実施例２］
　実施例２では、図１６に示されるように、フィルタ２１の設置高さを、培養槽１５の底面と液面高さとの中間に設置した以外は、実施例１の細胞培養装置と同じ構造とした。
［比較例１］
　比較例１では、図１７に示されるように、フィルタ２１と軸部材１７の設置を、撹拌翼２２の回転範囲の外側とし、培養液の入口ライン及び出口ラインを変更した以外は、実施例１の細胞培養装置と同じ構造とした。
　上記実施例１、実施例２、及び比較例１の培養結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、比較例１の細胞培養装置では、細胞の増殖がみられなかったのに対して、実施例１及び実施例２の細胞培養装置では、培養開始時と比較して２０倍以上の増殖が実現された。また、実施例１及び実施例２の細胞培養装置では、SSEA-4陽性の未分化状態の細胞の比率は、何れも９５％以上の高い未分化率を維持したままであった。このことから、本実施形態の方法は、ヒト多能性幹細胞の細胞培養装置として有効であることが示された。
　５，４０…細胞培養装置、１５，４２…培養槽、１５ｃ…蓋部、１７，４４…軸部材、１７ａ，１７ｂ，１７Ａａ…開口部，１７ｈ，４４ｈ…開口部、１９，４６…撹拌機構、２１，４８…フィルタ、２７，５２，７６…撹拌翼、４２ａ…底部。

Claims (12)

  1. 　細胞を含む培養液を収容する培養槽と、
    　前記培養槽内に少なくとも一部が配置された軸部材と、
    　前記軸部材に支持されて前記培養槽内に配置され、前記軸部材を回転中心として回転可能に設けられた撹拌翼を有する撹拌手段と、
    　前記軸部材に接するように設けられ、前記培養液は透過させるが、前記細胞は透過させないフィルタと、を備え、
    　前記軸部材は、少なくとも一部が中空であり、その内部に前記培養液を導入又は前記内部から前記培養液を導出する開口部が設けられていると共に、回転不能とされており、
    　前記フィルタは、前記軸部材を回転中心として回転する前記撹拌翼の可動領域よりも内側に位置し、前記撹拌翼とは独立して前記軸部材に設けられており、
    　前記フィルタ及び前記軸部材の前記内部を介して、前記培養槽から前記培養液の吸引及び／又は前記培養槽への前記培養液の供給を行う、細胞培養装置。
  2. 　前記軸部材は、前記培養槽の底部に支持されている、請求項１記載の細胞培養装置。
  3. 　前記軸部材は、下端部に前記開口部が設けられていると共に、上端部が閉塞されており、
    　前記軸部材の側面部には、前記内部と連通する開口部が設けられており、
    　前記フィルタは、前記側面部の前記開口部を覆うように前記軸部材の外表面に設けられている、請求項２記載の細胞培養装置。
  4. 　前記フィルタは、筒状を成しており、前記側面部の前記開口部を覆うように前記軸部材の外側に挿通されている、請求項３記載の細胞培養装置。
  5. 　前記軸部材は、下端部に前記開口部が設けられていると共に、上端部に前記内部と連通する開口部が設けられた筒状を成しており、
    　前記フィルタは、前記上端部の前記開口部を覆うように前記軸部材に設けられている、請求項２記載の細胞培養装置。
  6. 　前記フィルタは、有底の筒状を成しており、前記上端部の前記開口部を覆うように前記軸部材の外側に挿通されている、請求項５記載の細胞培養装置。
  7. 　前記軸部材は、前記培養槽の蓋部に支持されている、請求項１記載の細胞培養装置。
  8. 　前記軸部材は、上端部に前記開口部が設けられていると共に、下端部に前記内部と連通する開口部が設けられた筒状を成しており、
    　前記フィルタは、前記下端部の前記開口部を覆うように前記軸部材に設けられている、請求項７記載の細胞培養装置。
  9. 　前記フィルタは、有底の筒状を成しており、前記下端部の前記開口部を覆うように前記軸部材の外側に挿通されている、請求項８記載の細胞培養装置。
  10. 　前記軸部材は、上端部に前記開口部が設けられていると共に、下端部が閉塞されており、
    　前記軸部材の側面部には、前記内部と連通する開口部が設けられており、
    　前記フィルタは、前記側面部の前記開口部を覆うように前記軸部材の外表面に設けられている、請求項７記載の細胞培養装置。
  11. 　前記フィルタは、筒状を成しており、前記側面部の前記開口部を覆うように前記軸部材の外側に挿通されている、請求項１０記載の細胞培養装置。
  12. 　前記フィルタは、多孔質体である、請求項１～１１のいずれか一項記載の細胞培養装置。
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