TWI821230B - 細胞培養裝置、培養液吸引器及細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
提供一種細胞培養裝置，其係作為適於細胞之大量培養的細胞懸浮培養裝置，而具備具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，與懸浮培養槽之細胞培養裝置，前述培養液吸引器中，前述外管具備使培養液通液之過濾材，前述內管具備經前述過濾材通液之培養液之吸引口，於前述外管對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
Description
本發明係關於細胞培養裝置、培養液吸引器及細胞培養方法。
為了臨床應用使用胚胎幹細胞(ES細胞)及人工多能性幹細胞(iPS細胞)等多能性幹細胞(pluripotent stem cell)之再生醫療，將使用培養皿或燒瓶之實驗室的培養手法予以量的擴大(規模放大)，可將一定以上品質之細胞予以大量且低成本地製造的培養裝置之開發係為必要。欲確立細胞之大量培養製程，氧的供給或培養液的交換之效率化係為重要，亦要求透過生長因子之使用量削減等的低成本化。
作為細胞之培養方法，係有於經細胞外基質或餵養細胞被覆之培養器表面使細胞接著來進行培養之接著培養，與於培養液中使細胞浮游來進行培養之懸浮培養(懸浮培養)。於接著培養中，細胞之最大產量係依培養面積而定，但於懸浮培養中，細胞之最大產量係依培養液體積而定。因此，懸浮培養對規模放大為有利。
多能性幹細胞等之細胞，若懸浮培養則會形成凝集體。非專利文獻1中，揭示使用螺蓋旋轉瓶抑制細胞之過剩的凝集，同時藉由培養液流所致之剪切應力使不會發生細胞死亡地攪拌培養液，使多能性幹細胞安定地增殖的技術。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Olmer R, et al., "Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.", Tissue Eng. Part. C Methods, 2012, 18(10)：772-84.
[發明所欲解決之課題]
於實驗室的培養手法中之培養液的交換，可藉由以離心分離等將細胞自培養液分離，且將經分離之細胞再懸浮於新的培養液來進行。但是，以懸浮培養所為之大量培養中，離心分離等之細胞分離操作的實施困難，因此係藉由使細胞之凝集體自然沈降，將細胞與培養液分離，來進行培養液的交換。該培養液的交換，必需要將培養液之攪拌一時停止來等待細胞之自然沈降的時間，因此耗費勞力，且於該時間時細胞增殖或細胞之性質有產生不安定化及不均質化之虞。
本發明之主要目的為提供適於細胞之大量培養的細胞懸浮培養裝置。
[用以解決課題之手段]
為了解決上述課題，本發明提供以下之[1]~[4h]。
[1] 一種細胞培養裝置，其係具備具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，與懸浮培養槽之細胞培養裝置，
前述培養液吸引器中，
前述外管具備使培養液通液之過濾材，
前述內管具備經前述過濾材通液之培養液之吸引口，
於前述外管對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
[1a] 如[1]之細胞培養裝置，其中將前述培養液吸引器以前述過濾材位於其下方來配置時，前述空氣孔係設置於較前述吸引口更上方。
[1b] 如[1]或[1a]之細胞培養裝置，其中前述內管，對前述懸浮培養槽之插入方向前端係構成為前述吸引口，相反端之管口係連接於泵。
[1c] 如[1b]之細胞培養裝置，其中前述外管，於對前述懸浮培養槽之插入方向前端具備前述過濾材，相反端係構成為前述內管之插入口，
前述插入口中，前述外管之內腔面與前述內管外側面的間隙係構成為前述空氣孔。
[1d] 如[1b]之細胞培養裝置，其中前述外管，於外周面具備前述過濾材。
[2] 如[1]、[1a]-[1d]中任一項之細胞培養裝置，其進一步具備對前述懸浮培養槽供給培養液之培養液供給路。
[2a] 如[1]、[1a]-[1d]、[2]中任一項之細胞培養裝置，其中前述懸浮培養槽，具備用以攪拌培養液之攪拌器。
[2b] 如[2a]之細胞培養裝置，其係構成為前述培養液吸引器作動時，前述攪拌器亦作動。
[3] 一種培養液吸引器，其係具有由外管，與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，
前述外管具備使培養液通液之過濾材，
前述內管具備經前述過濾材通液之培養液之吸引口，
於前述外管對培養液之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
[3a] 如[3]之細胞培養裝置，其中前述內管，對培養液之插入方向前端係構成為前述吸引口，相反端之管口係連接於泵。
[3b] 如[3a]之細胞培養液吸引器，其中前述外管，於對培養液之插入方向前端具備前述過濾材，相反端係構成為前述內管之插入口，
前述插入口中，前述外管之內腔面與前述內管外側面的間隙係構成為前述空氣孔。
[3c] 如[3a]之細胞培養裝置，其中前述外管，於外周面具備前述過濾材。
[3d] 一種如前述之外管，其係構成如[3]、[3a]-[3c]中任一項之細胞培養液吸引器，且可與前述內管組合來使用。
[3e] 一種如前述之內管，其係構成如[3]、[3a]-[3c]中任一項之細胞培養液吸引器，且可與前述外管組合來使用。
[4] 一種細胞培養方法，其係於懸浮培養槽中之細胞培養方法，其包含
使用具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，將前述懸浮培養槽內之培養液排出於前述懸浮培養槽外之流程，
此處，前述培養液吸引器中，
前述外管具備使培養液通液之過濾材，
前述內管具備經前述過濾材通液之培養液之吸引口，
於前述外管之對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
[4a] 如[4]之細胞培養方法，其中於前述流程中，培養液對前述懸浮培養槽之供給係同時地(concurrently)進行。
[4b] 如[4a]之細胞培養方法，其中於前述流程中，一邊對前述懸浮培養槽供給培養液一邊進行排出，藉此交換培養液。
[4c] 一種細胞培養方法，其係於具備培養液之攪拌器的氣密之懸浮培養槽中之細胞培養方法，其包含
使用具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，將前述懸浮培養槽內之培養液排出於前述懸浮培養槽外之流程，
此處，前述培養液吸引器中，
前述外管具備使培養液通液之過濾材，
前述內管具備經前述過濾材通液之培養液之吸引口，
於前述外管之對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
[4d] 如[4c]之細胞培養方法，其中於前述流程中係維持前述攪拌器的作動。
[4e] 如[4d]或[4c]之細胞培養方法，其中於前述流程中，培養液對前述懸浮培養槽之供給係同時地(concurrently)進行。
[4f] 如[4e]之細胞培養方法，其中於前述流程中，一邊對前述懸浮培養槽供給培養液一邊進行排出，藉此交換培養液。
[4g] 一種將懸浮培養槽之培養液排出或交換之方法，其包含
使用具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，將前述懸浮培養槽內之培養液排出於前述懸浮培養槽外之流程，
此處，前述培養液吸引器中，
前述外管具備使培養液通液之過濾材，
前述內管具備經前述過濾材通液之培養液之吸引口，
於前述外管之對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
[4h] 一種使多能性幹細胞或來自多能性幹細胞之細胞於懸浮培養層內分化之方法，其包含
將該懸浮培養槽之培養液排出或交換之流程，
於該流程中，係使用具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，將前述懸浮培養槽內之培養液排出於前述懸浮培養槽外，
此處，前述培養液吸引器中，
前述外管具備使培養液通液之過濾材，
前述內管具備經前述過濾材通液之培養液之吸引口，
於前述外管之對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
又，本發明為了解決上述課題，亦提供以下之[5]~[8]。
[5] 一種細胞培養裝置，其係包含懸浮培養槽與培養液吸引器而成之細胞培養裝置，
前述培養液吸引器具有近位端與遠位端，
該近位端之管口係構成為培養液之吸引口，
該遠位端之管口係連接於泵，
前述懸浮培養槽，具備用以攪拌培養液之攪拌器，與使培養液流通之過濾材，
前述過濾材，將前述懸浮培養槽之槽內，區分為配設有前述攪拌器之第一區域，與插入有前述培養液吸引器之第二區域。
[6] 如[5]之細胞培養裝置，其中前述過濾材係於前述懸浮培養槽之槽內呈鉛直或大致鉛直地配設。
[7] 如[5]或[6]之細胞培養裝置，其係構成為前述培養液吸引器作動時，前述攪拌器亦作動。
[8] 如[5]-[7]中任一項之細胞培養裝置，其進一步具備對前述懸浮培養槽供給培養液之培養液供給路。
本說明書中，「培養」或「進行培養」，意指於組織外或體外，例如於細胞培養皿、燒瓶或培養槽(容槽)中使細胞維持、持續、增殖且/或分化。較佳為，「培養」或「進行培養」，意指於組織外或體外，於培養槽(容槽)中使細胞分化。
作為別的態樣，較佳為，「培養」或「進行培養」，意指於組織外或體外，於培養槽(容槽)中使細胞維持或增殖。
本說明書中，「多能性(pluripotency)」意指可分化為具備各種不同形態或功能之組織或細胞，且係不管對3胚層之何種系統之細胞均可分化的能力。「多能性(pluripotency)」，於不可分化為胚盤，因此無形成個體的能力之點，與可分化為包含胚盤之生體的任何組織之「全能性(totipotency)」有所區別。
本說明書中，「多能性(multipotency)」意指可分化為複數個限定數量之系統的細胞之能力。例如，間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞為multipotent，但非pluripotent。
[發明之效果]
藉由本發明，提供適於細胞之大量培養的細胞懸浮培養裝置。
以下，一邊參照圖式一邊說明用以實施本發明之適合的形態。再者，以下所說明之實施形態，為顯示本發明之代表性的實施形態之一例者，並非藉此狹義解釋本發明之範圍。
[細胞培養裝置(第1發明)]
本發明之細胞培養裝置，具備具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，與懸浮培養槽。培養液吸引器中，前述外管，具備使培養液通液之過濾材。又，前述內管具備經前述過濾材通液之培養液之吸引口，於前述外管對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。再者，此處所稱之「外管之外部」，於培養液吸引器對懸浮培養槽之插入時，亦可相當於培養槽內之氣相。
圖1顯示本發明之細胞培養裝置的構成。細胞培養裝置A，具備本發明之第一實施形態之培養液吸引器1，與貯留細胞與培養液之氣密的懸浮培養槽2。培養液吸引器1，係用以將懸浮培養槽2內之培養液排出於外部而發揮功能。圖中符號3表示培養液供給路、符號4表示空氣供給路。培養液供給路3，係用以對懸浮培養槽2內供給培養液而發揮功能。空氣供給路4，係用以對懸浮培養槽2內供給空氣而發揮功能。符號5為攪拌器，具備攪拌子51。攪拌器5，係藉由使攪拌子51旋轉或上下動來攪拌懸浮培養槽2內之培養液。培養液吸引器1，亦可兼為培養供給路。
參照圖1-圖3說明本發明之第一實施形態之培養液吸引器1的構成。培養液吸引器1，具有由外管11，與插入於外管11之內腔111的內管12所構成之二重管構造。外管11具有遠位端與近位端，具有自遠位端至近位端之內腔111。將近位端定義為培養液吸引器1對懸浮培養槽2之插入方向下側(圖下方)、遠位端定義為該上側(圖上方)。內管12亦同樣地具有遠位端與近位端，具有自遠位端至近位端之內腔。
外管11，具備不使細胞之凝集體透過，使培養液通液之過濾材13。外管11中之過濾材13的配設位置，只要係對懸浮培養槽2之插入時可浸漬於培養液中的部位，則無特別限定，例如可如圖所示般設置於對懸浮培養槽2之插入方向前端。
外管11之材質，可適合地使用以往細胞之培養所用的金屬、玻璃、聚苯乙烯及聚丙烯等之樹脂材料。於此等之材料，亦可施以用以防止細胞或蛋白質之附著的被覆。被覆劑可列舉2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸化膽鹼(MPC)聚合物、Pluronic F127、聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)(PMEA)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(pHEMA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)等，較佳為MPC聚合物。
外管11之形狀或直徑、長度並無特別限定。形狀可為圓柱或多角柱，一部分或全部亦可形成為錐狀。直徑(內徑)及長度，可依懸浮培養槽2之容積(亦即培養規模)適當設定。
例如懸浮培養槽2之容積為250mL時，直徑為0.5cm左右、長度為5-10cm左右。該容積為2000L時，直徑為10cm左右、長度為200-250cm左右。因此，外管11之直徑例如為0.5-10cm、長度為5-250cm。外管11之長度，相對於培養液之深度D(圖1參照)而言，係長5%以上、較佳為長10%以上、更佳為長15%以上、又更佳為長20%以上、特佳為長25%以上。
過濾材13可適合使用以往細胞之分離所用的耐綸及聚酯等之樹脂製網目或膜。過濾材13之材質，除樹脂外，亦可為金屬、玻璃及纖維等。對此等之材料，亦可施以用以防止細胞或蛋白質之附著的被覆。被覆劑可列舉2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸化膽鹼(MPC)聚合物、Pluronic F127、聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)(PMEA)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(pHEMA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)等，較佳為MPC聚合物。網目尺寸或孔隙尺寸，可依作為培養目標之細胞與該細胞所形成的凝集體之尺寸來適當設定。過濾材13之形狀或直徑、厚度並無特別限定。形狀可為圓形或多角形。直徑例如配合外管的直徑，可為0.5-10cm，亦可較外管11之直徑更小。為了提高培養液交換之效率，如後述第二實施形態般，過濾材13亦可配設於外管11之外周面。厚度例如為0.05~2mm左右。過濾材13可配設為能夠交換。過濾材13亦可與外管11之一部分或全部成為一體，而構成立體形狀(例如球體、球體之扭棱立體、圓錐、截圓錐、多面體)。
本發明中，作為培養目標之細胞中，可廣為包含可於懸浮培養下增殖而形成凝集體的細胞。此處所稱之「凝集體」，除細胞外，亦可包含該細胞接著之載體。可附著細胞之懸浮培養用的載體，係稱為微載體，市售有由聚苯乙烯、纖維素及葡聚糖等所構成的粒子。作為本發明之培養目標之細胞中，亦可廣為包含具有對此等之載體的接著能力，可於對載體之接著狀態懸浮培養的細胞。
作為培養目標之細胞，可為1種或2種以上。
例如，可列舉多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、多能性幹細胞(multipotent stem cell)、來自多能性幹細胞之細胞、癌細胞，及細胞株等。
「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」，係指胚胎幹細胞(ES細胞)及潛在地具有與其同樣之分化多能性，亦即分化為生物體之各種組織(內胚層、中胚層、外胚層全部)的能力之細胞。具有與ES細胞同樣之分化多能性的細胞，可列舉「人工多能性幹細胞」(本說明書中亦有稱為「iPS細胞」者)。
作為「ES細胞」，若為小鼠ES細胞，可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化學研究所)等所建立的各種小鼠ES細胞株，若為人類ES細胞，可利用美國威斯康辛大學Thomson等人、美國NIH、理研、京都大學、Cellartis公司所建立的各種人類ES細胞株。例如，人類ES細胞株，可利用NIH之CHB-1~CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1~HUES28株等、WisCell Research之H1株、H9株、理研之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
「人工多能性幹細胞」，係指藉由對哺乳動物體細胞或未分化幹細胞導入特定因子(核初始化因子)並重編程所得之細胞。目前，「人工多能性幹細胞」係有各種者，可使用山中等人藉由對小鼠纖維母細胞導入Oct3/4･Sox2･Klf4･c-Myc之4個因子所建立的iPS細胞(Takahashi K, Yamanaka S., Cell,(2006)126：663-676)，此外亦可使用將同樣之4個因子導入於人類纖維母細胞所建立的來自人類細胞之iPS細胞(Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell,(2007)131：861-872.)、上述4個因子導入後，以Nanog表現為指標篩選所建立的Nanog-iPS細胞(Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S.(2007). Nature 448, 313-317.)、以不含c-Myc之方法所製作的iPS細胞(Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology,(2008)26, 101 - 106)、以無病毒法導入6個因子所建立的iPS細胞(Okita K et al. Nat. Methods 2011 May；8(5)：409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3)：458-66.)。又，亦可使用Thomson等人所製作的導入OCT3/4･SOX2･NANOG･LIN28之4個因子所建立的人工多能性幹細胞(Yu J., Thomson JA. et al., Science(2007)318：1917-1920.)、Daley等人所製作的人工多能性幹細胞(Park IH, Daley GQ. et al., Nature(2007)451：141-146)、櫻田等人所製作的人工多能性幹細胞(日本特開2008-307007號)等。
此外，已公開的全部論文(例如Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell,(2008)Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature,(2008)454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology,(2008)26, No 7, 795-797)，或專利(例如日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)所記載的該領域中公知之人工多能性幹細胞均可使用。
人工多能性細胞株，可利用NIH、理化學研究所(理研)、京都大學等所建立的各種iPS細胞株。例如，若為人類iPS細胞株，可列舉理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、CDI公司之MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。
可容易獲得之人工多能性細胞株，係有NIH、理研、京都大學等所建立的各種iPS細胞株。例如，若為人類iPS細胞株，可列舉理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。
來自多能性幹細胞之細胞，係表示由多能性幹細胞所分化誘導之細胞，並無特別限定，可列舉心肌細胞、胚體內胚層細胞、原腸管細胞、後前腸細胞、胰臟前驅細胞、神經前驅細胞、肝細胞及血管內皮細胞等。
癌細胞並無特別限定，可列舉來自肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、攝護腺癌、多形神經膠母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌及食道癌等之癌細胞。
細胞株並無特別限定，可列舉MRC-5、GL37、Vero及CHO等。
此等之細胞之尺寸，通常為10~20μm左右。細胞凝集體之尺寸，通常為20~1000μm左右，依培養目的特別是20-400μm左右。
因此，若將網目尺寸或孔隙尺寸設定為較作為目標之細胞凝集體尺寸更小，則於過濾材13中，可不使作為目標之尺寸以上的大小之細胞凝集體透過地，來將未達目標尺寸的大小之細胞凝集體與非凝集細胞及培養液通液。非凝集細胞中可能含有死細胞。使用膜時，其孔隙尺寸，例如為15-995μm左右，以15、50、100、150、200、250、300、350、395、450、500、550、600、650、700、750、800、850、995μm為例，較佳為15-395μm左右、特別是15-40μm左右。或者，孔隙尺寸較佳為較作為目標之細胞凝集體尺寸小5μm左右。關於網目尺寸(孔徑)，亦可與孔隙尺寸為相同尺寸。
內管12，具備將經過濾材13通液之培養液吸引的吸引口121。自吸引口121係一併吸引經過濾材13通液之培養液，以及未達目標尺寸之細胞凝集體及非凝集細胞、細胞碎片(debris)。自吸引口121所吸引之培養液、未達目標尺寸之大小之細胞凝集體及非凝集細胞，係流通過內管12之內腔，排出於懸浮培養槽2之外部。內管12中之吸引口121的配設位置，只要係對懸浮培養槽2之插入時可浸漬於使過濾材13通液之培養液中的部位則無特別限定，較佳為設置於對懸浮培養槽2之插入方向前端(近位端)。
吸引口121之形狀或直徑並無特別限定。形狀可為圓孔或多角孔。直徑(內徑)例如為0.01-3cm左右。
內管12之材質，可與外管11之材質相同，適宜使用金屬、玻璃、聚苯乙烯及聚丙烯等之樹脂材料。對此等之材料，亦可施以用以防止細胞或蛋白質之附著的被覆(例如MPC塗覆)。
內管12之形狀或直徑、長度並無特別限定。形狀可為圓柱或多角柱，一部分或全部亦可形成為錐狀。直徑(內徑)例如為0.04-3cm左右。配設於外管11之近位端的過濾材13，與配設於內管12之近位端的吸引口121之距離h(參照圖3)，並無特別限定，較佳為外管之長度的1/10~1/50左右。
內管12之與吸引口121的相反端(遠位端)，係連接於作為用以吸引培養液等之負壓源的泵。泵可採用於細胞培養裝置中以往用於將培養液送液者。以泵所進行之培養液的吸引，可依懸浮培養槽2之容積(培養規模)來適當設定。例如懸浮培養槽2之容積為250mL時係每分鐘0.1-10ml左右，2000L時係每分鐘0.8-80L左右。以泵所進行之培養液的吸引，可連續或間歇地進行。
外管11，係於對懸浮培養槽2之插入方向遠位，具有連絡內腔111與外部之空氣孔112。空氣孔112，係用於將外管11之內腔111內的負壓釋放於外部(懸浮培養槽2內之氣相)而發揮功能。
空氣孔112之形狀或大小並無特別限定。形狀可為四角形、多角形、圓形或橢圓形。大小只要係用於使外管11之內腔111內的負壓釋放於外部所足夠的大小即可。
外管11與內管12，係結合為不妨礙外管11之內腔111內的空氣之流通。例如，如圖3所示般，外管11與內管12之結合可於內管12貫通外管11之上部端面的部位進行。或者，亦可自外管11朝向內腔111突出地設置支持構件，並使內管11結合於該支持構件。
作為別的態樣，外管11與內管12亦可不結合，例如，如圖1所示般，外管11亦可結合於懸浮培養槽2之底面，且內管12於內管12貫通懸浮培養槽2之上側面的部位結合於懸浮培養槽2之上側面。
藉由自內管12之吸引口121吸引培養液等，對外管11之內腔111施加過剩負壓時，有透過過濾材13之培養液等之吸引壓變得過大，網目尺寸或孔隙尺寸以上的大小之細胞凝集體堵塞於過濾材13之虞。於過濾材13產生堵塞時，培養液之交換變得無法進行，或於過濾材整面之均一過濾變得無法進行，使培養液之交換遲滯。藉由使內腔111內之負壓由空氣孔112釋放至外部，可防止對內腔111施加過剩負壓。藉此，可抑制網目尺寸或孔隙尺寸以上的大小之細胞凝集體堵塞於過濾材13，同時使未達目標尺寸之細胞凝集體及非凝集細胞通過於過濾材13，僅使目標尺寸大小之細胞凝集體殘留於懸浮培養槽2。又，即使於過濾材13產生堵塞，僅以停止內管12所致之吸引，空氣由空氣孔112流入內腔111內而消除內腔111內之負壓，因此可不進行於使用通常的過濾材之培養液交換中為了消除堵塞所必要的反流作業，即可消除堵塞。
外管11中之空氣孔112的配設位置，只要係外管11對懸浮培養槽2之插入時可位於懸浮培養槽2內之氣相的部位(未浸漬於培養液中之部位)則無特別限定。將培養液吸引器1以過濾材13位於其下方來配置時，空氣孔112必需設置於較吸引口121更上方。進一步地，於外管11中過濾材13被設置於對懸浮培養槽2之插入方向前端(近位端)時，過濾材13與空氣孔112之距離(參照圖3中符號H)，較佳為相較於懸浮培養槽2中之培養液的深度D(參照圖1)而言為充分大。距離H相對於培養液之深度D而言係大105%以上、較佳為110%以上、更佳為115%以上、又更佳為120%以上、特佳為125%以上。
空氣孔112，如圖4所示，亦可構成為外管11中之內管12的插入口。此時，於插入口之外管11之內腔面與內管12之外側面的間隙係作為空氣孔112而發揮功能。
參照圖5及圖6說明本發明之第二實施形態之培養液吸引器6的構成。培養液吸引器6，相較於第一實施形態之培養液吸引器1而言，於過濾材63配設於外管61之外周面的這點上不同。以下無特別指明的培養液吸引器6的構成，係可與培養液吸引器1的構成相同。
過濾材63可為貼附於設於外管61之開口窗者。未達目標尺寸之大小之細胞凝集體及非凝集細胞、細胞碎片(debris)係通過過濾材63而導入於內腔611中，自內管62之吸引口621被吸引，而流通於內管62之內腔，排出至外部。
外管61及內管62之材質、形狀或直徑、長度，係與第一實施形態之培養液吸引器1相同。
外管61中之過濾材63的配設位置，只要係對懸浮培養槽2插入時可浸漬於培養液中之部位則無特別限定。過濾材63，於外管61之外周面中，可於對懸浮培養槽2之插入方向前端(近位端)與空氣孔612的配設位置之間的任意區域設置任意面積。過濾材63可於外管61之外周面上配設1個或2個以上。佔外管61之外周面的過濾材63的合計面積之比例，例如為10%、20%、30%，較佳為40%、50%、60%，更佳為70%、80%，特佳為90%、95%。過濾材63之形狀或厚度亦無特別限定。形狀可為圓形或多角形。厚度例如為0.1~2mm左右。
內管62中之吸引口621的配設位置，只要係對懸浮培養槽2之插入時可浸漬於經過濾材63通液之培養液中的部位則無特別限定，較佳為設置於對懸浮培養槽2之插入方向前端(近位端)。吸引口621之形狀或直徑，係與第一實施形態之培養液吸引器1相同。
外管61中之空氣孔612的配設位置，只要係外管61對懸浮培養槽2之插入時可位於懸浮培養槽2內之氣相的部位(未浸漬於培養液中之部位)則無特別限定。將培養液吸引器6，以過濾材63位於其下方來配置時，空氣孔612必需設置於較吸引口621及過濾材63更上方。
再者，對懸浮培養槽2之插入時，可能有過濾材63之一部分未浸漬於培養液中，而是位於懸浮培養槽2內之氣相的情況。例如，伴隨培養液之排出而培養液之液面下降時，過濾材63中之上方部會露出於懸浮培養槽2內之氣相。如此地，過濾材63之一部分未浸漬於培養液中，而露出於懸浮培養槽2內之氣相時，過濾材63之該部分，與空氣孔612同樣地，可用於使外管61之內腔611內的負壓釋放至外部(懸浮培養槽2內之氣相)而發揮功能。
懸浮培養槽2，為具有將細胞與培養液貯留之功能的氣密之容槽(再參照圖1)。
培養液供給路3，係用於將新的培養液對懸浮培養槽2內連續或間歇地供給而發揮功能。較佳為，培養液供給路3，係連續地供給培養液者。此時，細胞培養槽A，可構成為藉由培養液吸引器1自懸浮培養槽2內排出培養液，同時將同量之新的培養液藉由培養液供給路3供給至懸浮培養槽2內的灌流(perfusion)培養裝置。
空氣供給路4，係用於對懸浮培養槽2內供給空氣而發揮功能。空氣供給路4，較佳為沿著懸浮培養槽2之底面延伸設置，構成為自接近該底面處向上方吐出氣泡。
攪拌器5，可採用例如藉由使攪拌子51旋轉或上下動來攪拌懸浮培養槽2內之培養液的構成者。
懸浮培養槽2、培養液供給路3、空氣供給路4及攪拌器5，可適當採用以往細胞培養所用之容槽或管、機器，只要可發揮上述功能之機器等，即可廣為採用。
此等以外，細胞培養裝置A，亦可具有用以控制懸浮培養槽2內之培養液的溫度之過冷卻手段(熱噴射流)，或用以檢測培養液之溫度或氧濃度、營養因子等之濃度等的探針。又，亦可具有接受自探針之輸出，基於以探針所得之溫度的檢測值進行過冷卻手段之控制的系統單元。系統單元，亦可為接受自探針之輸出，基於以探針所得之氧濃度或營養因子等之濃度的檢測值，來控制以空氣供給路4之空氣供給量，或控制以培養液供給路3與培養液吸引器1之培養液的供給/排出量者。
本發明之細胞培養裝置A中，可抑制網目尺寸或孔隙尺寸以上的大小之細胞凝集體堵塞於過濾材13，同時使未達目標尺寸之細胞凝集體及非凝集細胞、細胞碎片(debris)通過過濾材13，自懸浮培養槽2去除，僅使目標尺寸的大小之細胞凝集體殘留於懸浮培養槽2，而交換培養液。因此，本發明之細胞培養裝置A中，即使於大量培養時亦不需要為了培養液交換而將攪拌器5一時停止來等待細胞自然沈降的時間，可縮短培養液交換所耗費的時間，且亦可抑制細胞增殖或細胞性質之不安定化及不均質化產生。特別是若依照本發明之細胞培養裝置A，可抑制以往將培養液之攪拌一時停止期間所產生的細胞之過剩的凝集(較目標尺寸更過大之凝集體形成)。
[細胞培養裝置(第2發明)]
本發明(第2發明)之細胞培養裝置，包含懸浮培養槽與培養液吸引器而成。前述培養液吸引器具有近位端與遠位端，該近位端之管口係構成為培養液之吸引口，該遠位端之管口係連接於泵。前述懸浮培養槽，具備用以攪拌培養液之攪拌器，與使培養液流通之過濾材。前述過濾材，將前述懸浮培養槽之槽內，區分為配設有前述攪拌器之第一區域，與插入有前述培養液吸引器之第二區域。
參照圖7說明本發明(第2發明)之細胞培養裝置B的構成。細胞培養裝置B，具備將細胞與培養液貯留之懸浮培養槽7，與將懸浮培養槽7內之培養液排出於外部之培養液吸引器9。
圖中符號3為培養液供給路、符號4表示空氣供給路。培養液供給路3，係用於將新的培養液連續或間歇地供給至懸浮培養槽7內而發揮功能。較佳為，培養液供給路3，係連續地供給培養液者。此時，細胞培養槽B，可構成為藉由培養液吸引器9自懸浮培養槽7內將培養液排出，同時將同量之新的培養液藉由培養液供給路3供給至懸浮培養槽7內之灌流培養裝置。空氣供給路4，係用於對懸浮培養槽7內供給空氣而發揮功能。空氣供給路4，較佳為沿著懸浮培養槽7之底面延伸設置，構成為自接近該底面處向上方吐出氣泡。
符號5為攪拌器，具備攪拌子51。攪拌器5係藉由使攪拌子51旋轉或上下動來攪拌懸浮培養槽7內之培養液。
培養液供給路3、空氣供給路4、攪拌器5及培養液吸引器9，可適當採用以往用於細胞培養之管或機器，只要係可發揮上述功能之機器等則可廣為採用。
培養液吸引器9，可為具有單一的管狀構造者。培養液吸引器9具有遠位端與近位端，且具有自遠位端至近位端之內腔。將近位端定義為培養液吸引器9對懸浮培養槽7之插入方向下側(圖下方)、遠位端定義為該上側(圖上方)。
培養液吸引器9，具備吸引培養液之吸引口91。自吸引口91係一併吸引培養液，以及未達目標尺寸之細胞凝集體及非凝集細胞、細胞碎片(debris)。自吸引口91所吸引之培養液、未達目標尺寸之大小之細胞凝集體及非凝集細胞、細胞碎片(debris)，係流通過培養液吸引器9之內腔而排出至懸浮培養槽7之外部。培養液吸引器9中之吸引口91的配設位置，只要係對懸浮培養槽7之插入時可浸漬於培養液中之部位則無特別限定，較佳為設置於對懸浮培養槽7之插入方向前端(近位端)。
吸引口91之形狀或直徑並無特別限定。形狀可為圓孔或多角孔。直徑(內徑)，例如為0.01-3cm左右。
培養液吸引器9之與吸引口91的相反端(遠位端)，係連接於作為用於培養液等之吸引的負壓源之泵。泵可採用於細胞培養裝置中以往用於將培養液送液者。以泵所進行之培養液的吸引，可依懸浮培養槽7之容積(培養規模)來適當設定。例如懸浮培養槽7之容積為250mL時係每分鐘0.1-10ml左右，2000L時係每分鐘0.8-80L左右。以泵所進行之培養液的吸引，可連續或間歇地進行。
培養液吸引器9之材質，可適合使用以往細胞之培養所用的金屬、玻璃、聚苯乙烯及聚丙烯等之材料。對此等之材料，亦可施以用以防止細胞或蛋白質之附著的被覆。被覆劑可列舉2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸化膽鹼(MPC)聚合物、Pluronic F127、聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)PMEA)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(pHEMA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)等，較佳為MPC聚合物。
培養液吸引器9之形狀或直徑、長度並無特別限定。形狀可為圓柱或多角柱，一部分或全部亦可形成為錐狀。直徑(內徑)及長度，可依懸浮培養槽7之容積(亦即培養規模)來適當設定。直徑(內徑)例如為0.04-3cm左右。
懸浮培養槽7，為具有貯留細胞與培養液之功能的容槽。懸浮培養槽7，具備不使細胞之凝集體透過，使培養液通液之過濾材8。過濾材8，將懸浮培養槽7之槽內，區分為配設有攪拌器5之第一區域71，與插入培養液吸引器9之第二區域72。培養液供給路3及空氣供給路4，亦可構成為對第一區域71或第二區域72分別供給培養液及空氣，較佳構成為對第一區域71分別供給培養液及空氣。過濾材8係以於對懸浮培養槽7填充培養液時產生浸漬於培養液之部分與未浸漬之部分的方式，向上下方向伸展設置，較宜如圖示般呈鉛直或大致鉛直配設。
過濾材8，可適合使用以往用於細胞分離的耐綸及聚酯等之樹脂製網目或膜。過濾材8之材質，除樹脂外，亦可為金屬、玻璃及纖維等。對此等之材料，亦可施以用以防止細胞或蛋白質之附著的被覆。被覆劑可列舉2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸化膽鹼(MPC)聚合物、Pluronic F127、聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)PMEA)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(pHEMA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)等，較佳為MPC聚合物。網目尺寸或孔隙尺寸，可依作為培養目標之細胞與該細胞所形成的凝集體之尺寸來適當設定。過濾材8之形狀，可依懸浮培養槽7之形狀來適當設計。過濾材8之厚度，並無特別限定，例如為0.05~2mm左右。過濾材8可配設為能夠交換。
如上所述，細胞之尺寸，通常為10~20μm左右。細胞凝集體之尺寸，通常為20~1000μm左右，依培養目的，特別係20-400μm左右。
因此，若將網目尺寸或孔隙尺寸設定為較作為目標之細胞凝集體尺寸更小，則於過濾材8中，可不使作為目標之尺寸以上的大小之細胞凝集體透過地，來將未達目標尺寸之大小之細胞凝集體與非凝集細胞及培養液通液。非凝集細胞中可能含有死細胞。使用膜時，其孔隙尺寸，例如為15-995μm左右，以15、50、100、150、200、250、300、350、395、450、500、550、600、650、700、750、800、850、995μm為例，較佳為15-395μm左右、特別是15-40μm左右。或者，孔隙尺寸較佳為較作為目標之細胞凝集體之尺寸小5μm左右。關於網目尺寸(孔徑)，亦可為與孔隙尺寸相同尺寸。
過濾材8當中未浸漬於培養液之部分(圖7中相當於符號V之部分)，係用於使第二區域72之負壓釋放於第一區域71，使第二區域72內之壓力與第一區域71內之壓力平衡化而發揮功能。
為了促進空氣流通，亦可於過濾材8設置貫通孔。貫通孔係設置於不會被培養液浸漬之位置，較佳為設置於懸浮培養槽7之上側面近處。此時，貫通孔之形狀或大小並無特別限定。形狀可為四角形、多角形、圓形或橢圓形。大小只要係用以將第二區域72之負壓釋放於第一區域71所足夠的大小即可。
藉由自培養液吸引器9之吸引口91吸引培養液等而對第二區域72施加過剩的負壓時，係有透過過濾材8的培養液等之吸引壓變得過大，網目尺寸或孔隙尺寸以上的大小之細胞凝集體堵塞於過濾材8之虞。於過濾材8產生堵塞時，培養液之交換變得無法進行，或於過濾材整面之均一過濾變得無法進行，使培養液之交換遲滯。藉由使第二區域72之負壓透過過濾材8當中未浸漬於培養液之部分而釋放於第一區域71，可防止對第二區域72施加過剩的負壓。藉此，可抑制網目尺寸或孔隙尺寸以上的大小之細胞凝集體堵塞於過濾材8，同時使未達目標尺寸之細胞凝集體及非凝集細胞通過於過濾材8，僅使目標尺寸的大小之細胞凝集體殘留於第一區域71。
細胞培養裝置B，亦可具有用以控制懸浮培養槽7內之培養液的溫度之過冷卻手段(熱噴射流)，或用以檢測培養液之溫度或氧濃度、營養因子等之濃度等的探針。又，亦可具有接受自探針之輸出，基於以探針所得之溫度的檢測值進行過冷卻手段之控制的系統單元。系統單元，亦可為接受自探針之輸出，基於以探針所得之氧濃度或營養因子等之濃度的檢測值，來控制以空氣供給路4之空氣供給量，或控制以培養液供給路3與培養液吸引器9之培養液的供給/排出量者。
本發明之細胞培養裝置B中，可抑制網目尺寸或孔隙尺寸以上的大小之細胞凝集體堵塞於過濾材8，同時使未達目標尺寸之細胞凝集體及非凝集細胞通過至第二區域72，僅使目標尺寸的大小之細胞凝集體殘留於第一區域71，而交換培養液。因此，本發明之細胞培養裝置B中，即使於大量培養時亦不需要為了培養液交換而將攪拌器5一時停止來等待細胞自然沈降的時間，可縮短培養液交換所耗費的時間，且亦可抑制細胞增殖或細胞性質之不安定化及不均質化產生。亦可抑制本發明之細胞培養裝置B，可抑制以往將培養液之攪拌一時停止期間所產生的細胞之過剩的凝集(較目標尺寸更過大之凝集體形成)。
[細胞培養方法]
又，本發明亦提供使用上述之細胞培養裝置或培養液吸引器的細胞培養方法。本發明之細胞培養方法，於自使用上述培養液吸引器的懸浮培養槽內排出培養液上具有特徵，其詳情可參照關於上述之細胞培養裝置或培養液吸引器之記載。
本發明之細胞培養方法中，即使於大量培養時亦不需將培養液之攪拌一時停止來等待細胞之自然沈降，可在使攪拌器作動之下來進行培養液交換。因此，可縮短培養液交換所耗費的時間，可有效率地製造大量之細胞。又，特別是若依本發明之細胞培養方法，可抑制以往將培養液之攪拌一時停止期間所產生的細胞之過剩的凝集(較目標尺寸更過大之凝集體形成)。因此，可抑制因過剩之細胞凝集而產生細胞增殖之阻礙，或細胞性質之不安定化及不均質化產生，而製造高品質之細胞。又，本發明之細胞培養方法，即使不攪拌即進行大量之培養基交換(例如50-95%之培養基交換)時，亦只要使細胞凝集體某程度地沈降即可進行，故可縮短時間。
該細胞培養方法，可為藉由培養液吸引器自懸浮培養槽內排出培養液，同時將新的培養液供給至懸浮培養槽內之灌流培養。灌流培養中，係一邊供給培養液一邊排出，藉以交換培養液。灌流培養中之培養液之供給量與排出量較佳為相等。
不以灌流培養進行時，係藉由培養液吸引器自懸浮培養槽內排出一定量之培養液後，將新的培養液供給至懸浮培養槽內。排出量可列舉懸浮培養槽內之培養液量的例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，較佳為60%、更佳為70%、特佳為80%。一次之排出量過大時，有引起非預期的細胞凝集之可能性。培養液之供給量，較佳與排出量相等。
本發明之細胞培養方法，可適合地應用於使多能性幹細胞或來自多能性幹細胞之細胞於懸浮培養層內維持或分化。依照本發明之細胞培養方法，即使於大量培養時亦可有效率地、安定且均質地培養目標尺寸大小之多能性幹細胞的凝集體，因此可有效率地、安定且均質地製造大量之未分化細胞或分化細胞。為了製造分化細胞，可應用以往公知之分化誘導手法，例如後述實施例中，係由多能性幹細胞誘導DE(胚體內胚層)細胞，亦可將該DE細胞進一步誘導為胰臟前驅細胞。由多能性幹細胞誘導為胰臟前驅細胞，可藉由以下4個步驟進行(Nature Biotechnology, 2014, Vol.32, No.11, p.1121-1133)。
步驟1：由人類多能性幹細胞分化誘導胚體內胚層細胞。
步驟2：由胚體內胚層細胞分化誘導原腸管細胞。
步驟3：由原腸管細胞分化誘導後前腸細胞。
步驟4：由後前腸細胞分化誘導胰臟前驅細胞。
本發明中一般所使用之培養液，例如可列舉BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM培養基、Improved MEM(IMEM)培養基、Improved MDM(IMDM)培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM培養基(High glucose、Low glucose)、DMEM/F12培養基、Ham培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基，及此等之混合培養基。
用於ES細胞或iPS細胞之培養液，例如，可列舉含有10~15%FBS之DMEM、DMEM/F12或DME培養液(此等之培養液中可進一步適當含有LIF、penicillin /streptomycin、puromycin、L-麩醯胺、非必須胺基酸類、β-巰基乙醇等)或市售之iPS細胞用培養液，例如小鼠ES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、Thromb X公司)、靈長類ES細胞培養用培養液(靈長類ES/iPS細胞用培養液、ReproCELL公司)、無血清培養基(mTESR、Stemcell Technology公司)、iPS/ES細胞增殖用培養基/再生醫療用培養基(StemFit(註冊商標)、Ajinomoto Healthy Supply Co., Inc.)。其他亦例示有使用不含有血清之培養基來培養之方法(Sun N, et al.(2009), Proc Natl Acad Sci USA. 106：15720-15725)。
本發明中所使用之培養液中，於上述成分以外，亦可依需要添加胺基酸、L-麩醯胺、GlutaMAX(製品名)、非必須胺基酸、維生素、抗生素(例如Antibiotic-Antimycotic(本說明書中有稱為AA者)、盤尼西林、鏈黴素，或此等之混合物)、抗菌劑(例如兩性黴素B)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。
又，本發明之培養液中，亦可含有分化誘導劑。
懸浮培養中，藉由攪拌或振盪將培養液成分及培養液內氧濃度均一化，透過凝集體形成來使細胞增殖。適宜的攪拌速度，係依細胞密度與培養容器之大小來適當設定，但過度的攪拌或振盪會對細胞賦予物理壓力，阻礙細胞凝集體形成。因此，係以可將培養液成分及培養液內氧濃度均一化，且不阻礙凝集體形成的方式來控制攪拌或振盪速度。
培養溫度，並無特別限定，係於30~40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度例如為5%左右。
[實施例]
[實施例1]
使用本發明之細胞培養裝置，由以下條件進行人類iPS細胞之培養與對DE(胚體內胚層)細胞之分化誘導。本實施例中，係使用圖5、圖6所示之細胞培養裝置與培養液吸引器。
細胞：人類iPS細胞Ff-I14s04株
懸浮培養槽內之培養液容積：250 ml
攪拌器：HiD 4X4(佐竹化學機械工業)、攪拌翼上下動振幅20 mm、速度100 mm/s
吸引器
外管：金屬製、長度8.5 cm、直徑1 cm
過濾材：MPC塗覆聚酯膜(孔隙尺寸27μm、厚度0.05 mm)、佔外管之外側面的面積為2880 cm2
空氣孔：於外管之上端(遠位端)以面積50 cm2
設置。
內管：金屬製、長度146 mm、直徑6.35 mm
吸引口：於距外管之下端(近位端)0.4 cm之位置以直徑6.35 mm設置。
於對填充於懸浮培養槽之StemFit(註冊商標)(AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY)添加有Y-27632(CAS RN：129830-38-2)的培養液250 ml中播種iPS細胞(2×105
cells/ml)，1日培養後(培養第1日)，以吸引器吸引懸浮培養槽內之培養液的40%量，排出於懸浮培養槽外。將相同量之分化誘導用培養液添加於懸浮培養槽內後，再度、以吸引器吸引懸浮培養槽內之培養液的40%量，排出於懸浮培養槽外。將相同量之分化誘導用培養液添加於懸浮培養槽內後，再開始培養。分化誘導用培養液，係使用含有文獻(Nature Biotechnology, 2014, Vol.32, No.11, p.1121-1133)等記載之分化誘導因子的培養基。
培養第2日以後亦持續對DE(胚體內胚層)細胞之分化。於培養第2日及第3日係與上述同樣地進行培養液交換操作，合計進行4日培養。於培養第4日確認到產生對DE細胞之分化。培養第4日以後進一步將DE細胞分化誘導為胰島素產生細胞。
採取培養第1日、第2日及第3日之正要交換培養液前之細胞，以及培養第4日之細胞，以相位差顯微鏡進行觀察。細胞之相位差顯微鏡像示於圖8。又，為了確認堵塞，亦觀察培養第1日、第2日及第3日之培養液交換後的過濾材。
由培養第4日之細胞的顯微鏡照片，使用影像解析軟體計測細胞凝集體之尺寸分布(直徑)。結果示於圖10。
於培養第1日之iPS細胞的維持培養中，未確認到細胞之過剩凝集。
培養2-4日為實施分化誘導的階段，於培養第4日時，細胞凝集體主要分布於30-90 μm之範圍，以60 μm為中心的尺寸分布之凝集體的集團佔絕大多數，超過150 μm之過大凝集體的比例少。細胞凝集體尺寸之平均值為65 μm，標準差為25 μm。培養第1-4日之所有的時間點，均確認到細胞係作為適當尺寸之凝集體而被培養。
又，未見到細胞凝集體對過濾材之堵塞。可確認到若依本發明之細胞培養裝置，不需為了交換培養液而將培養液之攪拌一時停止，即可安定且均質地培養作為目標之尺寸之細胞凝集體。
[比較例1]
使用安裝有用後即丟的50 ml吸量管之電動吸量管作為培養液吸引器，且於培養交換時將攪拌一時停止，除此以外係以與實施例1同樣條件進行細胞之懸浮培養。
於填充於懸浮培養槽之培養液250 ml中播種細胞(2×105
cells/ml)，1日培養後(培養第1日)，將培養液之攪拌停止，使細胞自然沈降。以吸引器吸引懸浮培養槽內之培養液的80%量，排出於懸浮培養槽外。將相同量之培養液添加於懸浮培養槽內後，再開始培養。於培養第2日及第3日進行同樣之培養液交換操作，合計進行4日培養。於培養第4日確認到產生對DE細胞之分化。培養第4日以後進一步將DE細胞分化誘導為胰島素產生細胞。
採取培養第1日、第2日及第3日之正要交換培養液前之細胞，以及培養第4日之細胞，以相位差顯微鏡進行觀察。細胞之相位差顯微鏡像示於圖9。
由培養第4日之細胞的顯微鏡照片，使用影像解析軟體計測細胞凝集體之尺寸分布。結果示於圖10。
於培養第1日開始產生細胞之過剩凝集，隨著培養日數經過，細胞凝集體進一步變得過大，於培養第4日可見170 μm以上的尺寸之細胞凝集體之集團。細胞凝集體尺寸之平均值為109 μm。細胞凝集體尺寸的標準差為60 μm，尺寸分布之偏差為大。可認為在使培養液之攪拌一時停止的期間，產生了過剩的細胞凝集。
藉由本發明，可在不產生過剩的細胞凝集，不需培養基交換之勞力下，以3維培養來實施細胞之維持培養及分化誘導。
A‧‧‧細胞培養裝置
B‧‧‧細胞培養裝置
1‧‧‧培養液吸引器
11‧‧‧外管
111‧‧‧內腔
112‧‧‧空氣孔
12‧‧‧內管
121‧‧‧吸引口
13‧‧‧過濾材
2‧‧‧懸浮培養槽
3‧‧‧培養液供給路
4‧‧‧空氣供給路
5‧‧‧攪拌器
51‧‧‧攪拌子
6‧‧‧培養液吸引器
61‧‧‧外管
611‧‧‧內腔
612‧‧‧空氣孔
62‧‧‧內管
621‧‧‧吸引口
63‧‧‧過濾材
7‧‧‧懸浮培養槽
71‧‧‧第一區域
72‧‧‧第二區域
8‧‧‧過濾材
9‧‧‧培養液吸引器
91‧‧‧吸引口
[圖1]說明本發明之細胞培養裝置的構成之圖。
[圖2]說明本發明之第一實施形態之培養液吸引器的構成之斜視圖。
[圖3]說明本發明之第一實施形態之培養液吸引器的構成之截面圖(圖2中P-P截面)。
[圖4]說明本發明之第一實施形態之培養液吸引器之變化例的構成之截面圖。
[圖5]說明本發明之第二實施形態之培養液吸引器，特別是外管的構成之圖。
[圖6]說明本發明之第二實施形態之培養液吸引器，特別是內管的構成之圖。
[圖7]說明本發明(第2發明)之細胞培養裝置的構成之圖。
[圖8]顯示實施例1之培養第4日之細胞的相位差顯微鏡像。
[圖9]顯示比較例1之培養第4日之細胞的相位差顯微鏡像。
[圖10]顯示實施例1及比較例1之培養第4日之細胞凝集體的尺寸分布。
1‧‧‧培養液吸引器
2‧‧‧懸浮培養槽
3‧‧‧培養液供給路
4‧‧‧空氣供給路
5‧‧‧攪拌器
51‧‧‧攪拌子
A‧‧‧細胞培養裝置
D‧‧‧培養液之深度
Claims (5)
- 一種細胞培養裝置，其係具備懸浮培養槽，與具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造且將前述懸浮培養槽內之培養液排出至前述懸浮培養槽外的培養液吸引器之細胞培養裝置，前述培養液吸引器中，前述外管具備不使目標尺寸以上的大小之細胞凝集體通過，且使未達目標尺寸的大小之細胞凝集體與非細胞凝集體及培養液通液之過濾材，前述內管具備經前述過濾材通液之未達目標尺寸的大小之細胞凝集體與非細胞凝集體及培養液之吸引口，於前述外管對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
- 如請求項1之細胞培養裝置，其進一步具備對前述懸浮培養槽供給培養液之培養液供給路。
- 一種培養液吸引器，其係具有由外管，與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造且將懸浮培養槽內之培養液排出至前述懸浮培養槽外的培養液吸引器，前述外管具備不使目標尺寸以上的大小之細胞凝集體通過，且使未達目標尺寸的大小之細胞凝集體與非細胞凝集體及培養液通液之過濾材， 前述內管具備經前述過濾材通液之未達目標尺寸的大小之細胞凝集體與非細胞凝集體及培養液之吸引口，於前述外管對培養液之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
- 一種細胞培養方法，其係於懸浮培養槽中之細胞培養方法，其包含使用具有由外管與插入於該外管之內腔的內管所構成之二重管構造的培養液吸引器，將前述懸浮培養槽內之培養液排出於前述懸浮培養槽外之流程，此處，前述培養液吸引器中，前述外管具備不使目標尺寸以上的大小之細胞凝集體通過，且使未達目標尺寸的大小之細胞凝集體與非細胞凝集體及培養液通液之過濾材，前述內管具備經前述過濾材通液之未達目標尺寸的大小之細胞凝集體與非細胞凝集體及培養液之吸引口，於前述外管之對前述懸浮培養槽之插入方向遠位，設置有連絡該外管之內腔與外部的空氣孔。
- 如請求項4之細胞培養方法，其中於前述流程中，同時進行對前述懸浮培養槽之培養液的供給。
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